JP2010537634A - 体細胞を再プログラミングすることにおけるwnt経路の刺激 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書に記載される発明は、全体または一部で、RJに対する助成金5−RO1−HDO45022、5−R37−CA084198および5−RO1−CA087869、ならびにNational Institute of HealthからのNIH助成金HG002668によって支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
この出願は、2007年8月31日に出願された米国仮特許出願第60/967,028号および2008年8月6日に出願された米国仮特許出願第61/188,190号(これらの両方は、参考として本明細書に援用される)に対する優先権の利益を主張する。
哺乳類体細胞を再プログラミングする方法を提供する。特定の実施形態において、方法は細胞が多能性となるように誘導されるように体細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、Wnt馴化細胞培養培地はWnt3a馴化培地(Wnt3a−CM)を含む。
本発明は体細胞を再プログラミングするための、例えばインビトロで体細胞を多能性となるように再プログラミングするための組成物および方法に関する。本発明は体細胞を低分化状態に再プログラミングするための方法を提供する。結果として生じる細胞を本明細書においては「再プログラミングされた体細胞」(RSC)と称するか、または一部の実施形態においては、多能性状態に再プログラミングされれば、誘導多能性幹(iPS)細胞と称する。「体細胞」という用語は、生殖細胞以外の何れかの細胞、移植前の胚中に存在するか、それより得られる細胞、またはインビトロのそのような細胞の増殖から生じる細胞を指す。一部の実施形態においては、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは胚中に存在したり、あるいはそれより得られるものではなく、そしてそのような細胞のインビトロの増殖から生じない体細胞を意味する。一部の実施形態においては、体細胞は「成体体細胞」であり、これは胚または胎仔以外の臓器中に存在するか、それより得られる、あるいはインビトロのそのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する。特段の記載が無い限り、低分化状態に細胞を再プログラミングするための方法はインビトロで実施され、すなわち、それらは培養物中に維持された単離された体細胞を用いて実施される。
本発明はWnt経路の活性化は体細胞を再プログラミングする場合に有用であるという認識を提供する。本発明は、Wnt経路を活性化することは、体細胞の再プログラミングの効率を、例えばそのような細胞を少なくとも一部の細胞の再プログラミングをもたらす場合がある処理に付す場合に、上昇させるという追加的認識を提供する。「再プログラミングの効率を上昇させる」とは、細胞集団を再プログラミング処理に付す場合に再プログラミングを起こす細胞の割合の上昇をもたらし、典型的には所定期間の後再プログラミングされた細胞の個々のコロニー数の増大をもたらすことを意味する。本発明の一部の実施形態においては、本発明に従ってWnt経路を活性化することは再プログラミングされた細胞の数、および/または、再プログラミングされた細胞のコロニーの数、および/または、再プログラミングを起こす細胞の割合を増大させる。本発明はさらに、Wnt経路の活性化はc−Mycのような癌遺伝子の自身による発現を増大するように遺伝子的に組み換えされていない体細胞の再プログラミングを可能とするという認識を提供する。すなわち本発明は、別様にc−Mycを発現するように細胞を操作することを含む体細胞を再プログラミングする何れかの方法におけるc−Mycの操作された発現の代替となる方法を提供する。本発明の一部の実施形態においては、Wnt経路を活性化することは別様には再プログラミングが起こらない条件下での再プログラミングを可能とするために十分である。
本発明で有用な体細胞は初代細胞(非不朽化細胞)、例えば動物から新たに単離されたものであってよく、あるいは、培養物中での長期増殖(例えば3ヶ月超)または無期限の増殖(不朽化細胞)が可能である細胞系統から誘導してよい。成体の体細胞は個体、例えばヒト対象から得てよく、そして当業者が使用できる標準的な細胞培養プロトコルに従って培養してよい。細胞は対象からのその単離の後に細胞培養物中に維持してよい。特定の実施形態においては、細胞は、個体からそれらを単離した後、1回以上(例えば2〜5、5〜10、10〜20、20〜50、50〜100回、またはそれ以上)継代した後に本発明の方法においてそれらを使用する。それらは凍結し、その後、解凍した後に使用してよい。一部の実施形態においては、細胞は、個体からそれらを単離した後、1、2、5、10、20、または50回以下継代されているものとなり、その後、本発明の方法においてそれらを使用する。
本発明はまた、単独で、または1つ以上の他剤と組み合わせて、体細胞を低分化状態に再プログラミングする薬剤を同定するための方法を提供する。本発明はさらに方法により同定される薬剤を提供する。1つの実施形態において、方法は体細胞をWnt経路活性化物質および候補薬剤に接触させること、および、候補薬剤の存在が、細胞を候補薬剤に接触させていない場合に生じると考えられるものに対して、増強された再プログラミング(例えば再プログラミング速度の増大および/または効率)をもたらすかどうかを調べることを含む。一部の実施形態においては、Wnt活性化物質および候補薬剤は細胞培養培地中に共に存在し、他の実施形態においてはWnt活性化物質および候補薬剤は共に存在しない(例えば細胞は逐次的に薬剤に曝露される)。細胞は例えば少なくとも3日間、少なくとも5日間、10日間まで、15日間まで、30日間まで等、培養物中に維持してよく、その間、期間の全体または部分において、それらをWnt活性化物質および候補薬剤と接触させる。一部の実施形態においては、薬剤は、細胞がその薬剤と接触していなかった場合よりも該期間の後に再プログラミングされた細胞または主に再プログラミングされた細胞よりなるコロニーの数が少なくとも2倍、5倍、または10倍存在していれば、細胞を再プログラミングする薬剤として認識される。
本発明は本発明の方法により製造された誘導多能性幹細胞(iPS細胞)を包含する再プログラミングされた体細胞(RSC)を提供する。これらの細胞は、医学、農業、および他の目的の分野において多数の用途を有し、その一部は本明細書に記載する通りである。
本明細書に開示した再プログラミング方法は種々の動物種のためのRSC、例えばiPS細胞を形成するために使用してよい。形成されたRSCは所望の動物を作成するために有用である場合がある。動物は例えば、鳥類および哺乳類、ならびに絶滅危惧種である何れかの動物を包含する。例示される鳥類は家禽類を包含する(例えばウズラ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、およびホロホロチョウ)を包含する。例示される哺乳類はネズミ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよび非ヒト霊長類を包含する。これらのうち、好ましいメンバーは家畜動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、乳牛、ウサギ、モルモット、ヒツジ、およびヤギを包含する。
本発明は自身の発現が再プログラミングされた細胞の形成を阻害する遺伝子を同定するための方法を提供する。1つの方法は(i)体細胞におけるWnt経路を活性化すること;(ii)RNAiにより候補遺伝子の発現を低減すること;(iii)候補遺伝子の発現を低減することが再プログラミングの上昇した効率をもたらすかどうか調べること、そしてそうであれば、自身の発現が体細胞の再プログラミングを阻害するものとして候補遺伝子を同定すること、を含む。1つの方法は(i)Wnt馴化培地中で体細胞を培養すること;(ii)RNAiにより候補遺伝子の発現を低減すること;(iii)候補遺伝子の発現を低減することが再プログラミングの上昇した効率をもたらすかどうか調べること、そしてそうであれば、自身の発現が体細胞の再プログラミングを阻害するものとして候補遺伝子を同定すること、を含む。場合により、体細胞はOct4、Sox2、Nanog、Lin28、およびKlf4から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現するように操作する。場合により細胞はWnt経路モジュレーターと接触させる。方法において有用なshRNAおよびsiRNAのライブラリは市販されている。同定された遺伝子は細胞再プログラミングを増強するための阻害の標的となる。遺伝子を阻害する薬剤(RNAi剤または他の薬剤、例えば小分子の何れか)は例えばWnt活性化物質と組み合わせて体細胞を再プログラミングするために使用できる。
細胞培養、ウィルス感染、遺伝子発現の誘導。細胞を15%FBS、DMEM−KO、Penn/Step、グルタミン、非必須アミノ酸、β−ME、およびLIF中で培養した。内因性Oct4遺伝子座に挿入されたOct4−IRES−eGFP構築物を有するマウス胚線維芽細胞(MEF)(Meissner,A.ら、Nature Biotechnology、Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells. オンライン出版、2007年8月27日、doi:10.1038/nbt1335)を、Oct4、Sox2、Klf4およびc−Mycまたは単独のOct4、Sox2、およびKlf4のドキシサイクリン誘導発現を駆動するレンチウィルスベクターで感染させた。ベクターはtet誘導プロモーターを包含するように改変されたFUGWレンチウィルスベクター骨格に基づくものとした(Lois C.ら、Science 2002;295:868−872)。感染2日後、細胞を分割し、Wnt3a馴化培地(2xLIFを含有する通常のES培地で1:1希釈して使用)の存在下または非存在下にドキシサイクリンで誘導した。細胞は第13日および再度第20日にフローサイトメトリーによりGFP発現に関してモニタリングした。平行して、コラーゲン遺伝子座から発現させたドキシサイクリン誘導Oct4および内因性Oct4遺伝子座内に挿入されたOct4−IRES−(neo耐性)を有するMEFをSox2、Klf4およびc−MycまたはSox2およびKlf4の何れかの過剰発現を駆動するレンチウィルスで感染させた。再度、感染後2日に、細胞を分割し、Wnt3a馴化培地の存在下または非存在下にドキシサイクリンで誘導した。これらの細胞の別個のプレートをそれぞれ第7日および第13日にG418で選択した。G418選択の少なくとも1種間の後、耐性コロニーを検査して計数した。
本発明者らは可溶性因子を使用したWnt経路の刺激が体細胞において多能性を誘導する効率をモジュレートできるという仮説を立てた。本実施例は再プログラミングに対するWnt経路刺激の作用を調べるために実施した初期の実験を説明するものである。Oct4−IRES−eGFPまたはOct4−IRES−neo構築物を含有する細胞を上記した通り何れかの3つまたは4つの因子をコードするレンチウィルスベクターで感染させた。多能性因子の発現は第2日に誘導した。一部の実験においては、細胞は、第2〜13日には図4A(上)に示す通りWnt3a馴化培地または非馴化培地中で培養した。GFP発現は第13および20日にFACSにより分析した。他の実験においては、細胞は第2〜13または2〜20日には図4A(下)に示す通りWnt3a馴化培地または非馴化培地中で培養した。G418選択は第7および13日に実施した。生存コロニーは第20日に計数した。
上記した所見は少なくとも2つの主要な理由に関して有意である。第1に癌遺伝子c−Myc転写因子のウィルス組み込みを有さないiPS細胞を形成することには多大な利益が存在する。Mycを用いて作成したiPS細胞を有するキメラマウスはc−Mycウィルスの体性再活性化に関連する癌を高い比率で示す。インビトロであっても、本発明者らは、c−Mycウィルスで形成したiPS細胞系統は、一部の細胞が形態学的には遥かにES細胞に似た外観を有し、他の細胞は形質転換された癌性の細胞に類似した生育を示す混合型の集団を含有していることを観察している。これまでに得られた本発明者らの結果は、Wnt3a馴化培地中でc−Mycを伴うことなく作成されたiPS系統はそれらの形態においてより均質にES様の外観を呈することを示している。第2に、Wnt3a馴化培地は大型の均質なコロニーの形成に好都合な選択作用を発揮すると考えられる。すなわち、Wnt3a馴化培地またはWnt3a経路活性化物質の使用は、初期の体細胞の遺伝子的組み換えを必要とする選択工程を余儀なくするよりはむしろ代替の選択プロセスとして使用できる。すなわち再プログラミングの間のWnt3a馴化培地またはWnt3a経路活性化物質の使用は現在当該分野で公知である、または将来開発される体細胞を再プログラミングする何れかの方法に価値ある進歩をもたらすと考えられる。
細胞培養
V6.5(C57BL/6−129)ネズミES細胞およびiPS細胞を照射されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)に対する典型的なES条件下に生育させた。DOX誘導レンチウィルスによる感染において使用したトランスジェニックMEF(T.Brambrink,R.Foreman, Cell Stem Cell 2,151−159(2008))を13.5dpcで採取し、そしてOct4−IRES−GFPneo/Oct4誘導ES細胞の胚盤胞注入後の胚から2ug/mlピューロマイシン上で選択(M.Wernig,A.Meissner,Nature448,318−324(2007))するか、または、R26−M2rtTAマウス(C.Beard,K.Hochedlinger,Genesis44,23−28(2006))およびOct4−GFPマウス(A.Meissner,M.Wernig,Nat.Biotechnol25,1177−1181(2007))との間のF1交配動物から採取した。ウインドウ馴化培地および対照の馴化培地を標準的なプロトコル(ATCC)(K.Willert,J.D.Brown,Nature 423,448−452(2003),上記)に従って作成し、そして標準的なES細胞培地と1:1の比で使用した。Wnt阻害剤ICG−001を0.1Mの保存溶液濃度にまでDMSO中に溶解した。Wnt阻害剤の最終ワーキング濃度は4uMとした。
Oct4、Klf4、Sox2およびc−Mycに関するcDNAを発現するテトラサイクリン誘導レンチウィルス構築物を以前に報告されている通り使用した(Brambrink,上出)。ウィルスはウィルスプラスミドとウィルスパッケージング機能およびVSV−Gタンパク質を発現するパッケージング構築物の混合物(Fugene,Roche)でHEK293T細胞をトランスフェクトすることにより作成した。培地はトランスフェクション後24時間に交換し、そしてウィルス上澄みを48時間および72時間に収集した。濾過後、上澄みを合わせ、そして2.5x105MEFを24時間1:1の比のウィルス上澄みおよび新鮮培地と共にインキュベートした。次に感染細胞をゼラチンコーティング10cm皿上に1:5〜1:12の比で分割した。分割の1日後、ES培地に2ug/mlのDOX、そして該当する皿には馴化培地および/または阻害化学物質を補給した。
奇形腫の形成は以前に報告されている通り試験した。慨すれば、細胞をトリプシン処理し、そして5x105個の細胞をSCIDマウスに皮下注射した。14〜21日の後、
奇形腫を切除し、10%リン酸塩緩衝ホルマリン中に一夜固定し、その後Tissue−TekVIP包埋装置(Miles Scientific,Naperville,IL)およびThermo Shandon Histocenter2(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)を用いてパラフィンワックス中に包埋した。切片はLeicaRM2065(Leica,Wetzlar,Germany)を用いて2μmの厚みに切り出し、そしてヘマトキシリン・エオシン染色した(K.Hochedlinger,Y.Yamada,Cell 121,465−477(2005))。
再プログラミングに対するWnt3aの作用をさらに明確化するために、本発明者らはドキソルビシン(DOX)誘導Oct4 cDNA(Hochedlinger,2005)を保有するMEFをSox2、Klf4、およびc−MycをコードするDOX誘導レンチウィルスベクター(Brambrinkら、2008)に感染させた。これらの細胞はiPS細胞の薬剤選択を可能にする内因性Oct4遺伝子座におけるG418耐性カセットも含有していた(Meissnerら、2007)。
近年、iPS細胞はc−Mycレトロウィルスを用いることなく(Myc[−])形成されているが、内因性c−Mycの非存在下においては再プログラミングの効率および動態は顕著に低減する(Nakagawaら、2008;Wernigら、2008)。本発明者らはWnt3a−CMがOct4再活性化に関する選択の非存在下においてiPS細胞の形成にやはり寄与するかどうか試験した。このために、内因性Oct4プロモーターにより駆動されるGFPを有する細胞を利用した(Meissnerら、2008)。Wnt3a−CM処理を伴うおよび伴わないOct4/Sox2/Klf4感染細胞をDOX誘導語第10日、15日および20日にフローサイトメトリーによりGFP発現に関して分析した。GFP陽性細胞は第10日および第15日ともにWnt3a−CM処理の有無に関わらず存在していなかった。第20日までには、GFP発現細胞の小集団がWnt3a−CM中培養の細胞では検出されたが、標準的なES細胞培地では検出されなかった(図1g)。Wnt3a−CM曝露培養物はESまたはiPS細胞に典型的な形態を有するGFP発現コロニーを形成していた(図1h)。しかしながら、選択を行うことなく増殖させた場合に高度に不均質な細胞集団を通常は形成する4因子による形質導入細胞とは異なり、Oct4/Sox2/Klf4/Wnt3a−CMコロニーは以前に報告されたMyc[−]iPSクローン(Nakagawaら、2008)と同様に均質にES様の外観を呈していた。
Wnt3a−CM処理により誘導されたMyc[−]iPS細胞の成長潜在能力を特性化するために数種の試験を実施した。免疫細胞化学的試験によれば、多能性のマーカー、例えば、核因子Nanog(図2aおよび2b)および表面糖タンパク質SSEA1(図2cおよび2d)の発現が確認された。機能試験によれば、ES細胞と同様にこれらのiPS細胞が多能性であることが確認された。SCIDマウスに皮下注射した場合に、Myc[−]iPS細胞は3つの胚葉全てに分化する細胞の組織学的証拠を有する奇形腫を生じさせた(図2e、2fおよび2g)。より重要な点は、Wnt3a−CM処理で誘導したMyc[−]iPS細胞はキメラマウスにおける分化した組織の形成に寄与していた(図2h)。これらの結果はWnt3a−CM処理Myc[−]クローンがES細胞とは形態学的および機能的に区別不可能な多能性細胞であることを示している。
Wnt3a−CMの作用を定量するために、Oct4/Sox2/Klf4誘導、G418選択のMEFに対して3連の実験を実施した(図3a)。G418は感染後第15日に培養物に添加し、Oct4遺伝子座を再活性化している細胞に関して選択した。感染後第28日において採点した場合、僅かなMyc[−]G418耐性コロニー(各10cmプレート上に0〜3コロニーが形成)のみが標準的なES細胞培養条件では検出された。これとは対照的に、Wnt3a−CM処理細胞に対してG418選択を開始した場合には約20倍高値の薬剤耐性コロニーが形成され、Wnt経路の活性化が再プログラミングを増強するという結論と合致していた。当然ながらWnt3aの過剰発現を欠いている対照線維芽細胞に由来する馴化培地もまた標準的なES培地に対してG418耐性コロニーの数の中等度の増大を誘発しており、正常な線維芽細胞が再プログラミングを誘発するおそらくはWnt3aを包含する因子を分泌する場合があることを示唆している。
再プログラミングを増強または阻害する自身の能力に関して試験すべき候補再プログラミング剤をWnt3a−CMに加えてさらに培地が含有するように実施例3を変更する。一部の実施形態においては、細胞はそれらが以下の3つの再プログラミング因子、Oct4、Klf4、およびSox2のうち2つのみを発現するように感染させる。再プログラミングされた細胞の形成を増強する(例えば再プログラミングの速度または効率を上昇させる)薬剤を同定する。プロセスを反復することにより体細胞の再プログラミングにおいてOct4、Klf4、および/またはSox2の操作された発現を置換できる薬剤を同定する。
Wnt3a−CM培地がさらに候補再プログラミング剤を含有するように実施例3を変更する。一部の実施形態においては、細胞はそれらが以下の再プログラミング因子、Oct4、Lin28、Sox2、およびNanogのうち1つまたは2つのみ(例えばOct4のみ、Oct−4とSox2)を発現するように感染させる。再プログラミングされた細胞の形成を増強する薬剤を同定する。プロセスを反復することにより体細胞の再プログラミングにおいてOct4、Lin28、Sox2、および/またはNanogの操作された発現を置換できる薬剤を同定する。
Wnt3a−CMを使用する代わりに、小分子Wnt経路活性化物質を含有するES細胞培地を使用する以外は、実施例3を反復する。
Claims (65)
- 哺乳類体細胞を、該細胞が再プログラミングされるように、Wnt経路をモジュレートする薬剤に接触させることを含む、哺乳類体細胞を再プログラミングする方法。
- 前記細胞を再プログラミングすることが、該細胞を多能性状態に再プログラミングすることを含む、請求項1記載の方法。
- 接触させることが、前記薬剤を含有する培養培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項1記載の方法。
- 接触させることが、少なくとも10日間前記薬剤を含有する培養培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記Wnt経路をモジュレートする薬剤に前記体細胞を接触させることが、少なくとも5倍ES様細胞コロニーの数を増強する、請求項1記載の方法。
- 前記Wnt経路をモジュレートする薬剤に前記体細胞を接触させることが、少なくとも10倍ES様細胞コロニーの数を増強する、請求項1記載の方法。
- 前記方法が、Wnt馴化培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記方法が、Wnt3a馴化培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記細胞が終末分化した細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記細胞が線維芽細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記体細胞が、その型の体細胞において通常存在するよりも高レベルで少なくとも1つの再プログラミング因子を発現するか含有するように改変される、請求項1記載の方法。
- 前記体細胞が遺伝的に改変されない、請求項1記載の方法。
- 前記体細胞が、その細胞型の体細胞において通常存在するよりも高レベルでc−Mycを発現するように遺伝的に改変されない、請求項1記載の方法。
- 前記細胞をさらにWnt経路をモジュレートする第2の薬剤と接触させる、請求項1記載の方法。
- 外因性の可溶性で生物学的に活性なWntタンパク質を含有する培地中で前記細胞を培養する、請求項1記載の方法。
- 前記Wntタンパク質がWnt3aである、請求項16記載の方法。
- 前記再プログラミングされた細胞が多能性であることを確認することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が形態学的基準によりES様細胞を同定することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が再プログラミングされた細胞を選択するための化学的選択を実施することを含まない、請求項1記載の方法。
- 前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が多能性状態に再プログラミングされる細胞を多能性状態に再プログラミングされない細胞から分離することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記再プログラミングされた細胞を対象に投与することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記細胞を再プログラミングした後に該細胞を所望の細胞型にインビトロで分化させることをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記分化した細胞を対象に投与することをさらに含む、請求項23記載の方法。
- 下記工程:
(a)個体から体細胞を得ること;
(b)請求項1記載の方法に従って該体細胞の少なくとも一部分を再プログラミングすること;および、
(c)場合により該細胞を1つ以上の所望の細胞型に分化させた後に、該個体に該再プログラミングされた細胞の少なくとも一部分を投与すること;
を含む、治療を要する個体を治療する方法。 - 前記個体がヒトである、請求項25記載の方法。
- 前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が多能性状態に再プログラミングされる細胞を多能性状態に再プログラミングされない細胞から分離することをさらに含む、請求項25記載の方法。
- 前記細胞をインビトロで分化させること、および、場合により、細胞療法が有用である状態に対する治療を要する個体に該分化した細胞を投与することをさらに含む、請求項25記載の方法。
- (i)改変または処理を行わない場合よりも高いレベルで少なくとも1つの再プログラミング因子を発現または含有するように改変または処理を受けている哺乳類体細胞;および、(ii)Wnt経路の活性を増大させ、そして該体細胞を多能性細胞に再プログラミングすることに寄与する薬剤を含む、組成物。
- 前記体細胞が、その型の体細胞に通常存在するよりも高レベルで少なくとも1つの再プログラミング因子を発現または含有するように改変される、請求項29記載の組成物。
- 前記薬剤がWnt3aタンパク質である、請求項29記載の組成物。
- 前記体細胞が遺伝的に改変されない、請求項29記載の組成物。
- 前記体細胞が、その型の体細胞において通常存在するよりも高レベルでc−Mycを発現するように遺伝的に改変されない、請求項29記載の組成物。
- 前記体細胞が、その型の体細胞において通常存在するよりも高レベルで少なくとも1つの再プログラミング因子を発現するか含有するように改変される、請求項29記載の組成物。
- 下記工程:
(a)Wnt経路の活性をモジュレートする薬剤および候補薬剤を含有する培地中で哺乳類体細胞の集団を培養すること;
(b)適当な時間の後、適当な時間に亘って培養物中に該細胞およびその子孫を維持した後にES細胞の1つ以上の特徴を有する細胞が存在するかどうかを決定すること;
を含む、哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用である薬剤を同定する方法であって、該培地が該候補薬剤を含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでES細胞の1つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ES様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該候補薬剤を同定する、方法。 - 前記特徴がコロニー形態、ES細胞により選択的に発現される内在性遺伝子の発現、ES細胞により選択的に発現される遺伝子の発現制御配列に作動可能に連結した検出可能なマーカーの発現、免疫無防備状態のマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、および分娩まで生存するキメラの形成に関与する能力から選択される、請求項35記載の方法。
- 前記細胞が少なくとも1つの再プログラミング因子を発現するように改変されている、請求項35記載の方法。
- 前記培地がWnt馴化培地である、請求項35記載の方法。
- 前記培地がWnt3a馴化培地である、請求項35記載の方法。
- 前記Wnt経路の活性をモジュレートする薬剤がWnt3aタンパク質である、請求項35記載の方法。
- 前記候補薬剤が小分子である、請求項35記載の方法。
- 前記方法が、哺乳類体細胞の再プログラミングを増強するために有用である薬剤を同定することを含み、前記培地が前記候補薬剤を含有していない場合に予測されるものより高値のレベルでES細胞の1つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ES様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングを増強するために有用であるものとして該候補薬剤を同定する、請求項35記載の方法。
- 工程(b)が適当な時間に亘って培養物中に前記細胞およびその子孫を維持した後にES細胞コロニーの1つ以上の特徴を有する細胞コロニーが存在するかどうかを決定することを含み、前記培地が前記候補薬剤を含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでES細胞コロニーの1つ以上の特徴を有する細胞コロニーが存在するとき、ES様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該候補薬剤を同定する、請求項35記載の方法。
- 前記細胞が少なくとも1つの再プログラミング因子を発現する、請求項35記載の方法。
- 下記工程:
(a)Wnt経路の活性を増大させる薬剤および候補薬剤に哺乳類体細胞の集団を接触させること;
(b)適当な時間に亘り細胞培養系中に該細胞を維持すること;および、
(c)ES細胞の1つ以上の特徴を有する細胞が該培養系中に存在するかどうかを決定することを含む、ES様状態に哺乳類体細胞を再プログラミングするために有用な薬剤を同定する方法であって、該細胞を該候補薬剤に接触させていなかった場合に予測されるものよりも高値のレベルでES細胞の1つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ES様状態に哺乳類体細胞を再プログラミングするために有用であるものとして該薬剤を同定する、方法。 - 前記特徴が、コロニー形態、ES細胞により選択的に発現される内在性遺伝子の発現、ES細胞により選択的に発現される遺伝子の発現制御配列に作動可能に連結した検出可能なマーカーの発現、免疫無防備状態のマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、および分娩まで生存するキメラの形成に関与する能力から選択される、請求項45記載の方法。
- 前記Wnt経路の活性を増大させる薬剤がWnt3aタンパク質である、請求項45記載の方法。
- 前記候補薬剤が小分子である、請求項45記載の方法。
- 前記細胞が少なくとも1つの再プログラミング因子を発現する、請求項45記載の方法。
- 工程(b)が適当な時間に亘って培養物中に前記細胞およびその子孫を維持した後にES細胞コロニーの1つ以上の特徴を有する細胞コロニーが存在することを決定することを含み、前記培地が前記候補薬剤を含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでES細胞コロニーの1つ以上の特徴を有する細胞コロニーが存在するとき、ES様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該候補薬剤を同定する、請求項45記載の方法。
- 細胞が再プログラミングされるように細胞外シグナリング分子の存在下に該細胞を培養することを含む、哺乳類体細胞の再プログラミング方法。
- 前記細胞外シグナリング分子が、細胞受容体の細胞外ドメインへのその分子の結合が細胞内のシグナル伝達経路を開始または改変する分子である、請求項51記載の方法。
- 前記シグナル伝達経路がWnt経路である、請求項52記載の方法。
- 下記工程:
(a)Wnt経路モジュレーターを含有する培地中で哺乳類体細胞の集団を培養すること;
(b)適当な時間の後、適当な時間に亘って培養物中に該細胞およびその子孫を維持した後にES細胞の1つ以上の特徴を有する細胞が存在するかどうかを決定すること;
を含む、多能性状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用なWnt経路モジュレーターを同定するための方法であって、該培地が該Wnt経路モジュレーターを含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでES細胞の1つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ES様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該Wnt経路モジュレーターを同定する、方法。 - 前記方法が、(i)少なくとも10のWnt経路モジュレーターを試験すること;および(ii)該Wnt経路モジュレーターのうちの1つ以上を、他の試験したWnt経路モジュレーターの少なくとも50%よりも再プログラミングの速度または効率に対して有意に高い作用を有するものとして同定することを含む、請求項54記載の方法。
- 前記方法が、少なくとも20のWnt経路モジュレーターを試験することを含む、請求項54記載の方法。
- 前記方法が、前記Wnt経路モジュレーターのうちの1つ以上を、他の試験したWnt経路モジュレーターの少なくとも75%よりも再プログラミングの速度または効率に対して有意に高い作用を有するものとして同定することを含む、請求項54記載の方法。
- 前記Wnt経路モジュレーターが小分子である、請求項54記載の方法。
- 適当な時間の後、前記培地が前記Wnt経路モジュレーターを含有していない場合に予測されるものよりも多い数でES細胞の1つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ES様状態へ細胞を再プログラミングする速度または効率を上昇させるために有用であるものとして該Wnt経路モジュレーターを同定する、請求項54記載の方法。
- 下記成分:
(a)Wnt経路モジュレーターを含有する細胞培養培地;および、
(b)複数の哺乳類体細胞であって、ここで(i)該細胞が1つ以上の再プログラミング因子を発現するように遺伝的に改変されているか、もしくは一過性にトランスフェクトされているか;(ii)該細胞が、内因性の多能性遺伝子のためのプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーをコードする核酸配列を含有するように遺伝的に改変されているか;または(iii)該細胞培養培地が、c−Myc以外の再プログラミング因子を代替する1つ以上の小分子、核酸、またはポリペプチドを含有する、哺乳類体細胞;
を含有する、組成物。 - 前記細胞培養培地がWnt−3aCMを含む、請求項60記載の組成物。
- 前記1つ以上の再プログラミング因子がOct4、Nanog、Sox2、Lin28、およびKlf4から選択される、請求項60記載の組成物。
- iPS細胞およびWnt経路を活性化する薬剤を含む、組成物。
- 前記Wnt経路を活性化する薬剤がWnt3aタンパク質である、請求項63記載の組成物。
- 哺乳類体細胞を再プログラミングするための医薬の製造におけるWnt経路をモジュレートする薬剤の使用。
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