JP2012500005A - iPS細胞を生成するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に幹細胞の分野に関する。より詳細には、体細胞の再プログラムに関する。
一般に幹細胞は、一連の成熟した機能細胞を生じうる未分化細胞である。例えば造血幹細胞は、最終分化した血液細胞の様々な型のいずれをも生じうる。胚性幹(ES)細胞は、胚由来であり、多能性であり、したがっていかなる器官もしくは組織型または少なくとも潜在的には完全な胚に発生する能力を有する。
体細胞性、または完全に分化したヒト細胞を多能性または「幹細胞」状態に戻すように駆動する能力は、胚由来幹細胞の使用への多くの重要な科学的および社会的な課題を克服し、再生医療の可能性の実現に役立つであろう。しかし現在の再プログラムプロセスは、非効率的であり、それによりその適用を妨げている。本発明は、改善された効率を有する誘導多能性幹細胞の生成において現在の再プログラム技術に伴ういくつかの主要な問題を克服する。一般に胚性幹細胞様形態だけに基づく選択を使用する従来法とは対照的に、これらの方法の特定の態様は、選択を精密化し、かつ細胞の再プログラム化効率を最適化するために再プログラム因子に加えてレポーターをコードする多シストロン性転写物を発現しているベクターを使用する。本発明のさらなる実施形態および有利点は以下に記載される。
「再プログラム」は、培養中またはin vivoのいずれでも、再プログラムを行わない他は同じ条件下で有するのと比べて少なくとも1つの新たな細胞型の後代を形成するための測定可能な程度に増大した能力を、細胞に与えるプロセスである。より具体的には再プログラムは、体細胞に多能性ポテンシャルを与えるプロセスである。これは十分な増殖後に、再プログラム化前にはそのような後代が本質的に形成できない場合、測定可能な割合の後代が新たな細胞型の表現型特徴を有し、そうでなければ新たな細胞型の特徴を有する割合が再プログラム前を測定可能な程度超えていることを意味する。特定の条件下で新たな細胞型の特徴を有する後代の割合は、好ましさが増加する順で少なくとも約1%、5%、25%またはそれを超える場合がある。
本発明の特定の実施形態において、レポーターおよび再プログラム因子の両方をコードする多シストロン性転写物を発現している再プログラムベクターでの体細胞の再プログラム方法が開示される。例えばこれらの細胞は、形質転換された細胞を濃縮するために最初にレポーター遺伝子の発現について選択されることができ、その後、誘導多能性幹細胞に関するレポーター遺伝子の抑制についてそれらの後代が選択されうる。胚性幹細胞の特徴の理解は、これらの方法に加えて誘導多能性幹細胞を選択することに役立ちうる。幹細胞再プログラム研究から公知の再プログラム因子は、これらの新規方法に使用されうる。これらの誘導多能性幹細胞が、胚性幹細胞に替わって治療的および研究的な応用のために潜在的に使用されうることは、後者を使用する倫理的障害によりさらに検討される。
幹細胞は、全てではないがほとんどの多細胞生物において見出される細胞である。それらは、有糸細胞***および特殊化した細胞型の多様な範囲への分化を通じてそれら自体を再生する能力によって特徴付けられる。哺乳動物の幹細胞の2つの広範な種類は:胚盤胞に見出される胚性幹細胞、および成体組織に見出される成体幹細胞である。発生中の胚において幹細胞は、特殊化する胚組織の全てに分化できる。成体において幹細胞および前駆細胞は、特殊化した細胞を補充している身体のための修復系として作用するが、血液、皮膚または腸組織などの再生器官の通常の代謝回転も維持する。
胚性幹細胞系(ES細胞系)は、胚盤胞の内部細胞塊(ICM)の胚盤葉上層組織または初期桑実胚状態の胚由来の細胞の培養物である。胚盤胞は、初期状態(ヒトではおよそ4〜5日後)の胚であり、細胞50〜150個からなる。ES細胞は多能性であり、発生中に3つの主要な胚葉、外胚葉、内胚葉および中胚葉の全ての派生物を生じる。言い換えると、それらは、特定の細胞型用に十分かつ必要な刺激を与えられた場合に、成体の200を超える細胞型のそれぞれに発生できる。それらは、胚体外膜または胎盤には寄与しない。
iPS細胞の生成には、誘導のために使用される遺伝子が非常に重要である。以下の因子またはそれらの組合せは、本発明において開示されるベクター系において使用されうる。特定の態様においてSoxおよびOct(好ましくはOct3/4)をコードしている核酸は、再プログラムベクターに含まれる。例えば再プログラムベクターは、Sox2、Oct4、Nanogおよび場合によりLin−28をコードしている発現カセットまたはSox2、Oct4、Klf4および場合によりc−mycをコードしている発現カセットを含みうる。これらの再プログラム因子をコードしている核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じ再プログラムベクターまたは異なる再プログラムベクターに含まれうる。
典型的にはiPS細胞は、成体線維芽細胞などの非多能性細胞への特定の幹細胞関連遺伝子のトランスフェクションによって誘導される。典型的にはトランスフェクションは、現在のやり方ではレトロウイルスなどのウイルスベクターの組込みを通じて達成される。トランスフェクトされる遺伝子は、主要な転写制御因子Oct−3/4(Pouf51)およびSox2を含むが、他の遺伝子が誘導の効率を増強することが示唆される。臨界期後に、トランスフェクトされた細胞の少数が形態学的および生化学的に多能性幹細胞に類似し始め、典型的には形態学的選定、倍加時間を通じてまたはレポーター遺伝子および抗生物質感染を通じて単離される。
本発明の特定の態様において、このIRES依存性多シストロン性系に由来する適用性および効率的発現は、その有利点の根拠となり、iPS細胞産生の効率を増強するための有用な手段としてそれを確立する。この系の多数の変更として、これだけに限らないが(例えば図1を参照されたい)、1)使用するレポーターの変更(例えばシアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質など)、2)レポーター遺伝子の他の再プログラム遺伝子への置換(合成される必要のあるウイルスが少なくなる)、または3)LTRがOct4 IRES Sox−2 IRES eGFPの発現を駆動するような2つのIRESを有するカセットの作製が挙げられる。
多シストロン性転写物の産生を可能にするためにIRES配列は、本発明に含まれる。これは、本発明の発現系が単一の転写物単位から複数の再プログラム因子を産生すること、または融合タンパク質を作製することなく、もしくは追加的遺伝子の発現を調節するための追加的制御エレメントの必要性がなく多シストロン性転写物にレポーターを容易に組み込むことを可能にする。
本発明の特定の実施形態は、形質転換の成功を示すためにレポーター遺伝子を利用する。例えばレポーター遺伝子は、発現カセット内で、同時発現のための再プログラム遺伝子のコード領域に通常は付随する制御エレメントの調節下に位置付けられうる。レポーターは、再プログラムベクターを含有する細胞が、それらを薬物もしくは他の選択圧の下に置くことなくまたはそうでなければ細胞生存率を危険にさらすことなく単離されることを可能にする。追加的有利点は、抑制されたレポーター発現を有する誘導多能性幹細胞を濃縮することである。
特定の実施形態において再プログラムベクターは、ウイルスベクター、例えば細胞内でこれらの再プログラム因子を発現するためのレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターでありうる。これらの方法の新規特性は、上に記載の多シストロン性転写物の使用であり、形質転換された細胞および誘導多能性細胞の選択を促進する。これらのベクターの構築および送達方法の詳細は、下に記載されている。
当業者は、標準的組換え技術(例えばSambrookら、2001年およびAusubelら、1996年を参照されたい、どちらも参照により本明細書に組み込まれる)を通じてベクターを構築する態勢が十分に整っている。ベクターとして、これだけに限らないがプラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス)ならびにレトロウイルスベクター(例えばモロニーマウス白血病ウイルスベクター(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNVなどに由来)、レンチウイルスベクター(例えばHIV−1、HIV−2、SIV、BIV、FIVなどに由来)、複製能力を有するもの、複製欠損およびそのガットレス形態を含むアデノウイルス(Ad)ベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、サルウイルス40(SV−40)ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターなどの人工染色体(例えばYAC)が挙げられる。
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来性遺伝物質を移行し、広域スペクトルの種および細胞型に感染し、特定の細胞系にパッケージされるそれらの能力により遺伝子送達ベクターとしての将来性がある(Miller、1992年)。
レンチウイルスは複合レトロウイルスであり、共通のレトロウイルス遺伝子gag、polおよびenvに加えて制御および構造的機能を有する他の遺伝子を含有する。レンチウイルスベクターは、当技術分野において周知である(例えばNaldiniら、1996年;Zuffereyら、1997年;Blomerら、1997年;米国特許第6,013,516号および第5,994,136号を参照されたい)。
ベクターは、遺伝子送達および/もしくは遺伝子発現をさらに調節する、または他に標的細胞へ有益な特性をもたらす他の成分または機能性も含みうる。そのような他の成分として、例えば細胞への結合および標的化に影響を与える成分(細胞型または組織特異的結合を調節する成分を含む);細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分;取り込み後の細胞でのポリヌクレオチドの局在性に影響を与える成分(核局在化を介在する薬剤など);およびポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分が挙げられる。
「プロモーター」は、転写の開始および速度が調節されている核酸配列の領域である調節配列である。それは、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの制御タンパク質および分子が核酸配列の特定の転写を開始するために結合する場合がある遺伝エレメントを含有できる。語句、「機能的に位置した」、「機能的に連結した」、「調節下」および「転写調節下」は、プロモーターが、転写開始および/またはその配列の発現を調節するために核酸配列に関連して正確な機能的位置にあるおよび/または方向にあることを意味する。
特定の開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳のために必要である場合がある。これらのシグナルとして、ATG開始コドンまたは隣接配列が挙げられる。ATG開始コドンを含む外来性翻訳調節シグナルは、提供される必要がある場合がある。当業者は、これを容易に決定でき、必要なシグナルを提供できる。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列の読み枠と共に「インフレーム」でなければならないことは周知である。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれであっても良い。発現効率は、適切な転写増強エレメントの包含によって増強されうる。
ベクターは、多重制限酵素部位を含有する核酸領域であり、任意のそれはベクターを消化するために標準的組換え技術と共に使用されうる多重クローニング部位(MCS)を含みうる(例えば参照により本明細書に組み込まれるCarbonelliら、1999年、Levensonら、1998年およびCocea、1997年を参照されたい)。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特定の位置にだけに作用する酵素での核酸分子の触媒的切断を意味する。これらの制限酵素の多くは、商業的に入手できる。そのような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしばベクターは、外来性配列をベクターに連結できるようにするためにMCS内を切断する制限酵素を使用して直線化または断片化される。「連結」は、相互に近接できるまたはできない2つの核酸断片間でのホスホジエステル結合の形成プロセスを意味する。制限酵素および連結反応に関与する技術は組換え技術の当業者に周知である。
転写された真核生物性RNA分子のほとんどは、1次転写物からイントロンを除去するためにRNAスプライシングを受ける。真核生物のゲノム配列を含有するベクターは、タンパク質発現のための転写物の正常なプロセシングを確実にするために供与体および/または受容体スプライシング部位を必要とする場合がある(例えば参照により本明細書に組み込まれるChandlerら、1997年を参照されたい)。
本発明のベクターまたは構築物は、少なくとも1つの終結シグナルを含みうる。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写の特異的終結に関与するDNA配列からなる。したがって特定の実施形態においてRNA転写物の産生を止める終結シグナルが計画される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにin vivoにおいて必要な場合がある。
発現、特に真核生物での発現において、転写物の正常なポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナルが典型的には含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に不可欠ある考えられず、任意のそのような配列が使用されうる。好ましい実施形態は、好都合であり、種々の標的細胞において十分に機能することが公知であるSV40ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増大させうるか、または細胞質間輸送を促進できる。
本発明での再プログラムベクターの体細胞への導入は、本明細書に記載のとおりまたは当業者に公知であるとおり、細胞の形質転換のための核酸送達用の任意の適切な方法を使用できる。そのような方法として、これだけに限らないがex vivoトランスフェクションによる(Wilsonら、1989年、Nabelら、1989年)、マイクロインジェクション(HarlandおよびWeintraub、1985年、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,789,215号)を含むインジェクションによる(それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号および第5,580,859号)、電気穿孔法による(参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,384,253号、Tur−Kaspaら、1986年;Potterら、1984年)、リン酸カルシウム沈殿法による(GrahamおよびVan Der Eb、1973年;ChenおよびOkayama、1987年;Rippeら、1990年)、DEAEデキストランに続いてポリエチレングリコールを使用することによる(Gopal、1985年)、ダイレクトソニックローディングによる(Fechheimerら、1987年)、リポソーム介在性トランスフェクション(NicolauおよびSene、1982年;Fraleyら、1979年;Nicolauら、1987年;Wongら、1980年;Kanedaら、1989年;Katoら、1991年)および受容体介在性トランスフェクションによる(WuおよびWu、1987年;WuおよびWu、1988年)、微粒子銃による(それぞれ参照により本明細書に組み込まれるPCT出願 WO94/09699および95/06128、米国特許第5,610,042号、第5,322,783号、第5,563,055号、第5,550,318号、第5,538,877号および第5,538,880号)、炭化ケイ素繊維での撹拌による(Kaepplerら、1990年;それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,302,523号および5,464,765号)、アグロバクテリウム介在形質転換による(それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,591,616号および第5,563,055号)、プロトプラストのPEG介在形質転換による(Omirullehら、1993年;それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,684,611号および第4,952,500号)、乾燥/阻害介在DNA取り込みによる(Potrykusら、1985年)などのDNAの直接送達およびそのような方法の任意の組合せが挙げられる。これらなどの技術の応用を通じて、(1つもしくは複数の)細胞小器官、(1つもしくは複数の)細胞、(1つもしくは複数の)組織または(1つもしくは複数の)生体は安定的にまたは一過的に形質転換されうる。
本発明の特定の実施形態において核酸は、例えばリポソームなどの脂質複合体中に捕捉されうる。リポソームは、リン脂質二重膜および内側の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造物である。多層状リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水性溶液中に懸濁される場合に自発的に形成する。脂質成分は、閉じた構造の形成前に自己再構成を受け、水を捕捉し、溶質を脂質二重層の間に溶解する(GhoshおよびBachhawat、1991年)。同様に計画されるのは、リポフェクタミン(Gibco BRL)またはスーパーフェクト(Qiagen)と複合体化した核酸である。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質および使用される細胞に応じて変動する場合があり、例えば細胞100〜1000万個当たりベクターDNA約5〜約20μgが計画されうる。
本発明の特定の実施形態において核酸は、電気穿孔法を介して細胞に導入される。電気穿孔法は、細胞およびDNAの懸濁物の高電圧放電への暴露を含む。レシピエント細胞は、機械的損傷によって形質転換により感受性であるように作製されうる。使用されるベクターの量も使用される細胞の性質に応じて変動する場合があり、例えば細胞100万〜1000万個当たりベクターDNA約5〜約20μgで計画されうる。
本発明の他の実施形態において核酸は、リン酸カルシウム沈殿法を使用して細胞に導入される。ヒトKB細胞は、この技術を使用してアデノウイルス5 DNA(GrahamおよびVan Der Eb、1973年)でトランスフェクトされている。同様にこの方法でマウスL(A9)、マウスC127、CHO、CV−1、BHK、NIH3T3およびHeLa細胞は、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ(ChenおよびOkayama、1987年)、ラット肝細胞は種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた(Rippeら、1990年)。
他の実施形態において核酸は、DEAE−デキストランに続くポリエチレングリコールを使用して細胞に送達される。この方法でレポータープラスミドは、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された(Gopal、1985年)。
本発明の追加的実施形態は、ダイレクトソニックローディングによる核酸の導入を含む。LTK−線維芽細胞は、ソニケーションローディングによってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされている(Fechheimerら、1987年)。
さらに核酸は、受容体介在送達ビヒクルを介して標的細胞へ送達されうる。これらは、標的細胞において生じる受容体介在エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みの有利点を利用する。種々の受容体の細胞型特異的分布を考慮して、この送達方法は別の範囲の特異性を本発明に加える。
微粒子銃技術は、少なくとも1つの細胞小器官、細胞、組織または生体に核酸を導入するために使用されうる(米国特許第5,550,318号、米国特許第5,538,880号、米国特許第5,610,042号およびPCT出願 WO94/09699それぞれ参照により本明細書に組み込まれる)。この方法は、DNAをコートしたマイクロプロジェクタイルを高速に加速して細胞を殺すことなく細胞膜を貫通し細胞に進入することを可能にする能力に依る(Kleinら、1987年)。当技術分野において公知の多種多様な微粒子銃技術が存在し、その多くは本発明に適用できる。
本発明の特定の態様において、再プログラムベクターが体細胞に導入された後、これらの細胞は増大のために培養される。細胞は、トランスフェクトされた細胞を濃縮するためにレポーターまたは選択マーカーなどのベクター要素の存在について選択されうる。再プログラムベクターは、これらの細胞において再プログラム要素を発現し、細胞***と共に複製および分配する。これらの発現される再プログラム因子は、体細胞ゲノムを自律的多能性状態を確立するために再プログラムし、ベクターの存在についての正の選択が除かれる間または後に、外来性遺伝性要素は、徐々に失われる。導入遺伝子発現のこの抑制は、レポーター遺伝子発現の遮断単独に関してまたは、(それらが多能性胚性幹細胞と実質的に同一であると予測されることから)他の胚性幹細胞特徴についての選択と組み合わせてでの誘導多能性幹細胞の選択を可能にする。
本発明の再プログラムベクターを導入された細胞は、レポーターおよび再プログラム因子を同時に発現でき、様々な時点でのレポーター遺伝子発現の存在または不在について選択されうる。例えば細胞は、レポーターの存在について選択されることができ、トランスフェクションはレポーターを使用することによって最適化されうる。誘導多能性幹細胞は、導入遺伝子が再プログラムの際に抑制されることからレポーターの消失について選別されうる。そのような選択または選別は、導入遺伝子発現の指標としてのレポーター遺伝子の発現によって生成される検出可能なシグナルに基づく。
先行する研究から生成に成功したiPSCは、天然から単離された多能性幹細胞(マウスおよびヒトの胚性幹細胞、それぞれmESCおよびhESCなど)に、以下に関して顕著に類似しており、したがってiPSCの天然から単離された多能性幹細胞との同一性、確実性および多能性を確認した。したがって、本発明において開示される方法から生成される誘導多能性幹細胞は、レポーター遺伝子発現の存在の有無に加えて1つまたは複数の以下の幹細胞特徴に基づいて選別されうる。
形態学:iPSCは、形態学的にESCに類似している。各細胞は、円形、大型の核および乏しい細胞質を有する場合がある。iPSCのコロニーもESCのそれに類似している場合がある。ヒトiPSCはhESCと同様にはっきりした縁の、扁平な、密集したコロニーを形成し、マウスiPSCはmESCと同様にhESCのものよりもあまり扁平でなく、より凝集したコロニーを形成する。
プロモーター脱メチル化:メチル化は、メチル基のDNA塩基への、典型的にはメチル基のCpG部位の(隣接シトシン/グアニン配列)シトシン分子への転移である。遺伝子の広範なメチル化は、発現タンパク質の活性を抑止し、または発現を妨げる酵素を補充することによって発現を妨げる。したがって遺伝子のメチル化は、転写を阻止することによってそれを効果的に抑制する。Oct−3/4、Rex1およびNanogを含む内在性多能性関連遺伝子のプロモーターは、iPSCにおいて脱メチル化される場合があり、それらのプロモーター活性およびiPSC中の多能性関連遺伝子の活発な促進および発現を示す。
開示の方法を使用して体細胞が再プログラムベクターを導入された後、これらの細胞は多能性を維持するために十分な培地中で培養されうる。本発明において生成される誘導多能性幹(iPS)細胞の培養は、米国特許出願第20070238170号および米国特許出願第20030211603号に記載のとおり霊長類多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された種々の培地および技術を使用できる。
レトロウイルスベクターの構築
再プログラム遺伝子および選択マーカーが導入された親レトロウイルスベクターは、Kennedyら(2003年)において既に言及されている。簡潔には、ミニマルベクターは5’および3’MMLV末端反復領域(LTR)を含有し、5’LTRは再プログラムおよび選択のために必要な遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーターを含有する(図1)。好都合にも、5’LTRのすぐ上流に位置してサイトメガロウイルスプロモーターも存在することからレトロウイルスプラスミドは一過的トランスフェクションのために使用されることができ、プラスミドがウイルス合成のための鋳型として使用される場合には非機能的なままになる。
レトロウイルスベクターを使用するウイルスの生成
レトロウイルスベクターをウイルスを生成するために以下の方法において使用した。最初に、Sox−2、Oct4、NanogまたはLin−28をコードする4つのレトロウイルスベクターのそれぞれを別々のトランスフェクション物として調製した。各レトロウイルスベクター10マイクログラムを水疱性口内炎ウイルス偽型糖タンパク質(1μg)、Gagポリメラーゼ(3ug)およびNFkB(1ug)をコードするDNAと別々に混合した。次いでDNAを、500ul OptiMemと混合した。別にポリエチレンイミン(1mg/ml)40マイクロリットルをOptiMem 500μlと混合した。DNA/OptiMem混合物およびPEI/OptiMem混合物は、次いで室温で5分間インキュベートするために置き、次いで合わせて、室温で少なくとも20分間インキュベートされるべきであるおよそ1mlの溶液を得た。
細胞の感染およびプレーティング
再プログラムの実行を可能にする感染および環境への移行に関与する手順は、2つの方法のうちの1つに従った。1つの方法は、感染ならびに感染したおよび感染していない細胞の再プログラム用の照射MEF上へのプレーティングを含み、他の方法は、再プログラム化の効率を増強する目的でMEFへの選別法による感染した細胞だけのプレーティングを含んだ。
IMR−90細胞は、感染のためのレシピエント宿主として使用され成功しているが、この手順は初代皮膚細胞および造血細胞などの代替えの細胞型の感染に適応可能である。感染の72時間前にIMR−90細胞およそ50000個を6ウエルプレートの各ウエルに接種した。細胞の追加的プレートを各ウイルスについての感染効率の決定における使用のために調製した。例えば1つのウエルの細胞を複数のウイルスよりも単一のウイルスに対するレシピエントにした。感染は、トランスフェクションした293T細胞から新たに収集したウイルスを用いて1〜10の範囲の感染多重度(MOI)で実行した。MOIの範囲は、ウイルス産生のための感染から感染への固有の変動性に依る。
感染は、感染の前に2つの6ウエルプレート全体を1ウエル当たりIMR−90細胞5×104個で接種したことを除いて方法1に示したとおり実施した。感染細胞のより大きなプールは、選別を促進し、選別後の生存率も増強する。選別のための調製においてIMR−90細胞を含有する全てのウエルをトリプシンによって収集し、方法1に示すとおり感染の3日後にプールした。プールした細胞を凝集塊を除くために濾過し、選別まで氷上に保存した。
再プログラム細胞の選択
再プログラムされた細胞をまず形態学およびeGFPおよびmRFP発現の消失によって同定した。コロニーは拡大した核および複数の核小体を有する、高度に密集した細胞を含有した。ここで本発明者らは、感染後20〜40日間の範囲の時間枠でコロニーを取った。コロニーは、手作業で取り、照射MEF(1ml当たり細胞7.5×104個)を含有するウエル(48、24から6ウエル)に移した。移した翌日はそれらに補充しないままにし、次いでコロニーが分割および冷凍のために十分な数に増大するまで毎日のCMでの補充を再開した。iPSクローンを、細胞表面マーカー(すなわちSSEA 3、SSEA 4、TRA−1−60、SSEA 1およびOct4)および染色体中の任意の異常を同定するための核型を使用してさらに特徴付けた。
以下の参照文献は、本明細書において説明するものを捕捉してそれらが例示的手順または他の詳細を提供する範囲において、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
Claims (36)
- (a)転写制御エレメント、ならびに
(b)前記転写制御エレメントに機能的に連結した第1および第2コード配列であって、前記第1コード配列が再プログラム因子をコードし、かつ前記第2コード配列が第2再プログラム因子またはレポーターをコードする、第1および第2コード配列
を含む多シストロン性発現カセットを含む再プログラムベクター。 - 前記転写制御エレメントが末端反復配列領域(LTR)を含む、請求項1に記載の再プログラムベクター。
- 前記第2コード配列がレポーターをコードする、請求項1に記載の再プログラムベクター。
- 前記第2コード配列が第2再プログラム因子をコードする、請求項1に記載の再プログラムベクター。
- 前記発現カセットが前記転写制御エレメントに機能的に連結した第3コード配列をさらに含み、前記第3コード配列が再プログラム因子、レポーターまたは選択マーカーをコードする、請求項1に記載の再プログラムベクター。
- 前記第3コード配列が選択マーカーをコードする、請求項5に記載の再プログラムベクター。
- 前記選択マーカーが抗生物質耐性マーカーである、請求項6に記載の再プログラムベクター。
- 前記レポーターが細胞表面マーカー、蛍光タンパク質、エピトープ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼである、請求項1に記載の再プログラムベクター。
- 前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)または黄色蛍光タンパク質(YFP)である、請求項8に記載の再プログラムベクター。
- コードされる前記再プログラム因子がSox、Oct、Nanog、Lin28、Klf4またはc−Mycである、請求項1に記載の再プログラムベクター。
- SoxがSox−1、Sox−2、Sox−3、Sox−15またはSox−18である、請求項10に記載の再プログラムベクター。
- OctがOct−4である、請求項10に記載の再プログラムベクター。
- 前記再プログラム因子がNanog、Lin28、Klf4またはc−Mycである、請求項10に記載の再プログラムベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項1に記載の再プログラムベクター。
- 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項14に記載の再プログラムベクター。
- 前記レトロウイルスベクターがマウス白血病ウイルス(MLV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、Akv−MLVまたはSL−3−3−MLVである、請求項15に記載の再プログラムベクター。
- 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項14に記載の再プログラムベクター。
- 前記発現カセットが1つまたは複数のIRESをさらに含む、請求項1に記載の再プログラムベクター。
- 前記IRESが、脳心筋炎ウイルスIRES、ピコルナウイルスIRES、***ウイルスIRES、A型肝炎ウイルスIRES、C型肝炎ウイルスIRES、ヒトライノウイルスIRES、ポリオウイルスIRES、ブタ水疱病ウイルスIRES、カブモザイクポティウイルスIRES、ヒト線維芽細胞増殖因子2 mRNA IRES、ペスチウイルスIRES、リーシュマニアRNAウイルスIRES、モロニーマウス白血病ウイルスIRES、ヒトライノウイルス14 IRES、アフトウイルスIRES、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質mRNA IRES、Drosophila Antennapedia mRNA IRES、ヒト線維芽細胞増殖因子2 mRNA IRES、G型肝炎ウイルスIRES、トバモウイルスIRES、血管内皮増殖因子mRNA IRES、コクサッキーB群ウイルスIRES、c−myc癌原遺伝子mRNA IRES、ヒトMYT2 mRNA IRES、ヒトパレコウイルス1型ウイルスIRES、ヒトパレコウイルス2型ウイルスIRES、真核生物開始因子4GI mRNA IRES、Plautia stali腸管ウイルスIRES、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスIRES、ウシエンテロウイルスIRES、コネキシン43 mRNA IRES、ホメオドメインタンパク質Gtx mRNA IRES、AML1転写因子mRNA IRES、NFカッパB抑制因子mRNA IRES、X連鎖アポトーシス抑制物質mRNA IRES、コオロギ麻痺ウイルスRNA IRES、p58(PITSLRE)プロテインキナーゼmRNA IRES、オルニチンデカルボキシラーゼmRNA IRES、コネキシン−32 mRNA IRES、ウシウイルス性下痢症ウイルスIRES、インスリン様増殖因子I受容体mRNA IRES、ヒト免疫不全ウイルス1型gag遺伝子IRES、ブタコレラウイルスIRES、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスIRES、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択される短いIRES、ジェンブラナ病ウイルスIRES、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子1 mRNA IRES、Rhopalosiphum padiウイルスIRES、カチオン性アミノ酸輸送体mRNA IRES、ヒトインスリン様増殖因子IIリーダー2 mRNA IRES、ジアルジアウイルスIRES、Smad5 mRNA IRES、ブタテッショウウイルス−1 talfan IRES、Drosophila Hairless mRNA IRES、hSNM1 mRNA IRES、Cbfa1/Runx2 mRNA IRES、エプスタイン−バーウイルスIRES、ハイビスカスクロロティック輪斑ウイルスIRES、ラット下垂体バソプレシンV1b受容体mRNA IRESおよびヒトhsp70 mRNA IRESからなる群から選択される、請求項18に記載の再プログラムベクター。
- 前記IRESが脳心筋炎ウイルスIRESである、請求項19に記載の再プログラムベクター。
- 誘導多能性幹(iPS)細胞集団を産生するための方法であって、前記方法は、
(a)請求項1から20に記載の1つまたは複数の再プログラムベクターを得るステップ、および
(b)体細胞の集団の細胞に前記再プログラムベクターを導入してiPS細胞集団を提供するステップ
を含む、方法。 - (c)前記集団を増大させるために前記細胞を培養するステップ、および
(d)増大させた前記集団の後代細胞を選択するステップであって、前記後代細胞が胚性幹細胞の1つまたは複数の特徴を有する、ステップ
をさらに含む、請求項21に記載の方法。 - ステップc)が前記体細胞の集団を選択するステップをさらに含み、選択された前記体細胞が前記レポーターを発現する、請求項22に記載の方法。
- ステップc)における前記選択が蛍光励起細胞分取(FACS)、CATアッセイまたは発光アッセイを含む、請求項22に記載の方法。
- (e)選択された前記後代細胞を培養して、前記iPS細胞集団を提供するステップ
をさらに含む、請求項22に記載の方法。 - 前記1つまたは複数の再プログラムベクターがSoxおよびOctを含む再プログラム因子をコードするコード配列を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の再プログラムベクターがリポソームトランスフェクション、電気穿孔法、微粒子銃、リン酸カルシウム、ポリカチオンまたはポリアニオンによって前記細胞に導入される、請求項21に記載の方法。
- 前記体細胞が哺乳動物体細胞である、請求項21に記載の方法。
- 前記体細胞がヒト体細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記体細胞が線維芽細胞、造血細胞または間葉細胞である、請求項21に記載の方法。
- 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項30に記載の方法。
- 前記特徴が前記レポーターの本質的な消失、未分化形態、胚性幹細胞特異的マーカーまたは多能性である、請求項22に記載の方法。
- 前記特徴が前記レポーターの発現の本質的な消失である、請求項22に記載の方法。
- 前記特徴が蛍光励起細胞分取(FACS)、CATアッセイまたは発光アッセイによって選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記特徴が未分化形態である、請求項22に記載の方法。
- 前記特徴が、SSEA−3、SSEA−4、Tra−1−60またはTra−1−81、Tra−2−49/6E、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4およびhTERTからなる群から選択される1つまたは複数の胚性幹細胞特異的マーカーである、請求項22に記載の方法。
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