ES2538038T3 - Análisis multiplexado de muestras de ensayo - Google Patents

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Abstract

Un método de detección de una molécula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el método: (a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptámero que tiene una afinidad específica por la molécula diana, formándose un complejo de afinidad de aptámero mediante la interacción de un aptámero con su molécula diana, si dicha molécula diana está presente en dicha muestra de ensayo, en donde un complejo de afinidad de aptámero es un complejo no covalente formado por la interacción de un aptámero con su molécula diana; (b) tras la formación del complejo de afinidad de aptámero de la etapa (a), introducir una molécula competidora en la muestra de ensayo y/o capturar el complejo de afinidad de aptámero sobre un soporte sólido, seguido del lavado posterior con una solución con una molécula competidora presente en la solución, seleccionándose la molécula competidora entre un oligonucleótido, un polianión, un polidextrano o varios dNTP; y (c) detectar y/o cuantificar el aptámero del complejo de afinidad de aptámero o el complejo de afinidad de aptámero separado del resto de la muestra de ensayo.

Description

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la sonda pueden incluir grupos reactivos adecuados que, tras la asociación del marcador con la sonda, estén lo suficientemente próximos entre sí para someterse a una reacción química que produzca un enlace covalente. La reacción puede ocurrir espontáneamente o puede requerir la activación, tal como, por ejemplo, la fotoactivación o activación química. En una realización ilustrativa, el marcador incluye un resto dieno y la sonda incluye un dienófilo,
5 y la formación del enlace covalente se produce como consecuencia de una reacción de conjugación espontánea de Diels-Alder del dieno y dienófilo. Se puede usar cualquier química complementaria apropiada tal como, por ejemplo, la reacción de N-Mannich, la formación de disulfuro, la reacción de Curtius, la condensación aldólica, la formación de base de Schiff y la adición de Michael.
En otra realización, el marcador se asocia indirectamente con una sonda, tal como, por ejemplo, a través de una molécula enlazadora, como se describe más adelante. En dicha realización, el marcador puede incluir una secuencia de polinucleótido que sea complementaria a una determinada región o componente de una molécula enlazadora. El marcador se configura de manera general y la reacción de hibridación se lleva a cabo de manera que el marcador no se hibride con una secuencia de polinucleótido distinta de la secuencia de polinucleótido incluida en la molécula
15 enlazadora.
Si el marcador incluye un polinucleótido, el polinucleótido puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos. En una realización, un marcador incluye al menos aproximadamente 10 nucleótidos. En otra realización, el marcador incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleótidos. En otra realización más, el marcador incluye al menos aproximadamente 30 nucleótidos. Diferentes marcadores que incluyen un polinucleótido pueden incluir ya sea el mismo número de nucleótidos o un número diferente de nucleótidos.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" representa una modificación o variación irrelevante de los valores numéricos de manera que la función básica del elemento al que el valor numérico se
25 refiere no varía.
Como se usa en el presente documento, "asociado", "asociados" y cualquier variación de los mismos se refiere a una interacción o complejación entre un marcador y una sonda que produce un complejo suficientemente estable con el fin de permitir la separación de los materiales “no asociados" o no unidos, tal como, por ejemplo, los componentes no unidos de una muestra de ensayo, del complejo de marcador-sonda en condiciones de complejación o reacción dadas. Un marcador y una sonda se pueden asociar directamente entre sí mediante la interacción y la unión entre sí con especificidad. Un marcador y una sonda también se pueden asociar entre sí indirectamente de modo que su complejación esté mediada por una molécula enlazadora.
35 Como se usa en el presente documento, "sonda" se refiere a una molécula que está configurada para asociarse, ya sea directa o indirectamente, con un marcador. Una "sonda" es un conjunto de copias de un tipo de molécula o un tipo de estructura multimolecular que es capaz de inmovilizar un aptámero a un soporte sólido mediante la asociación, ya sea directa o indirectamente, con un marcador. "Sondas" se refiere a más de una de dicho conjunto de moléculas. Una sonda puede ser un polinucleótido, un polipéptido, un ácido nucleico peptídico, un ácido nucleico bloqueado, un oligosacárido, un polisacárido, un anticuerpo, un aficuerpo, un mimético de anticuerpo, un receptor celular, un ligando, un lípido, cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combinación de los anteriores o cualquier otra estructura con la que un marcador (o molécula enlazadora) se puede diseñar o configurar para unirse o asociarse de otra manera con especificidad. Una sonda se puede unir a un soporte sólido, ya sea covalente o no covalentemente, mediante cualquier método conocido en la técnica.
45 En una realización, la sonda incluye un polinucleótido que tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia de marcador de polinucleótido. En dicha realización, la secuencia de sonda se configura de manera general y la reacción de hibridación se lleva a cabo en condiciones tales que la sonda no se hibrida con una secuencia de nucleótidos distinta del marcador para el que la sonda incluye la secuencia complementaria (es decir, la sonda se configura de manera general y la reacción de hibridación se lleva a cabo en condiciones tales que la sonda no se hibrida con un marcador diferente o un aptámero).
En otra realización, la sonda se asocia indirectamente con un marcador, por ejemplo, a través de una molécula enlazadora. En dicha realización, la sonda puede incluir una secuencia de polinucleótido que sea complementaria a
55 una región o un componente particular de una molécula enlazadora. La sonda se configura de manera general y la reacción de hibridación se lleva a cabo de manera que la sonda no se hibrida con una secuencia de polinucleótido distinta de la secuencia de polinucleótido incluida en la molécula enlazadora.
Si una sonda incluye un polinucleótido, el polinucleótido puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos. En una realización, una sonda incluye al menos aproximadamente 10 nucleótidos. En otra realización, una sonda incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleótidos. En otra realización más, una sonda incluye al menos aproximadamente 30 nucleótidos. Diferentes sondas que incluyen un polinucleótido pueden incluir ya sea el mismo número de nucleótidos o un número diferente de nucleótidos.
65 Como se usa en el presente documento, "molécula enlazadora" se refiere a una o más moléculas que están configuradas para mediar en la asociación de un marcador con una sonda. En general, la molécula enlazadora es
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rodillo, partícula, incluyendo esferas, tubos, pocillos y similares. Normalmente, el material es relativamente plano, tal como, por ejemplo, un portaobjetos, aunque puede ser esférico, por ejemplo, una esfera, o cilíndrico (por ejemplo, una columna). En muchas realizaciones, en general, el material tiene forma de un sólido rectangular. Es posible sintetizar múltiples disposiciones predeterminadas tales como, por ejemplo, matrices de sondas, sobre una lámina,
5 que luego se troquelan, es decir, se cortan a lo largo de líneas marcadas en sustratos de matriz individuales. Los ejemplos de soportes sólidos que se pueden usar incluyen pocillos de microtitulación, portaobjetos de microscopio, membranas, perlas paramagnéticas, papel cargado, películas de Langmuir-Blodgett, microplacas de obleas de silicio, microplacas de flujo continuo y microperlas.
Normalmente, la superficie del soporte sólido es la parte externa del material de sustrato que forma el soporte sólido. La superficie del soporte sólido sobre la que se unen las sondas puede ser lisa o sustancialmente plana, o tener irregularidades tales como depresiones, surcos, elevaciones u otras texturas. La superficie se puede modificar con una o más capas diferentes de compuestos que sirven para modificar las propiedades de la superficie de una manera deseada. En diversas realizaciones, dichas capas de modificación de la superficie, cuando están presente,
15 en general, pueden variar de espesor de un espesor monomolecular a aproximadamente 1 mm, o de un espesor monomolecular a aproximadamente 0,1 mm, o de un espesor monomolecular a aproximadamente 0,001 mm.
Las capas de modificación de la superficie de interés incluyen capas inorgánicas y orgánicas, tales como metales, óxidos metálicos, polímeros, moléculas orgánicas pequeñas, y similares. Las capas poliméricas de interés incluyen copolímeros de metacrilato, poliacrilamidas, polisacáridos, fosfolípidos, poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietilenaminas, sulfuros de poliarileno, polisiloxanos, poliimidas, poliacetatos, y similares, donde los polímeros pueden ser homo-o heteropoliméricos y pueden no tener restos funcionales separados unidos a los mismos (por ejemplo, restos conjugados). Otras modificaciones de la superficie de interés incluyen redes tridimensionales tales como hidrogeles, por ejemplo. Se puede usar cualquier hidrogel adecuado conocido en la
25 técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2003/0218130 titulada "Biochips with Surfaces Coated with Polysaccharide-Based Hydrogels", la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Nº 20050147994 titulada "Method for Immobilizing a Biologic in a Polyurethane-Hydrogel Composition, a Composition Prepared from the Method, and Biomedical Applications", la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2005005908 titulada "Photocrosslinked Hydrogel Blend Surface Coatings", y cualquiera de las referencias citadas en estas publicaciones.
En una realización, la superficie de un soporte sólido incluye un hidrogel. El hidrogel puede comprender, por ejemplo, una matriz de polímero. El hidrogel se puede unir químicamente a la superficie del soporte sólido y puede incluir una funcionalidad de unión que sea capaz de unir, ya sea directa o indirectamente, una sonda al hidrogel. Las
35 funcionalidades de unión ilustrativas incluyen un grupo hidrófobo, un grupo hidrófilo, grupos reactivos tales como aldehídos, epoxi, carbonatos y similares, un carboxilo, un tiol, un sulfonato, un sulfato, un amino, un amino sustituido, un fosfato, un grupo quelante de metales, un tioéter, una biotina, un boronato, etc.
También se puede usar cualquier superficie adecuada para la expresión de genes o el análisis de SNP, incluyendo los sustratos y las superficies ofrecidos, por ejemplo, por Affymetrix, General Electric (por ejemplo, CodeLink), Agilent y Schott Nexterion, ya sea como sustratos y superficies o como componentes de productos que comprenden además otros componentes.
Una sonda se puede unir a la superficie del soporte sólido de cualquier manera adecuada, siempre y cuando la
45 sonda no deje de estar unida durante las etapas de incubación y procesamiento posteriores de acuerdo con los métodos desvelados, tales como el lavado de la superficie para eliminar los complejos no específicos , por ejemplo. La sonda se puede unir estando unida no covalentemente, por ejemplo, adherida, absorbida, adsorbida, o estando unida covalentemente a la superficie del soporte sólido. En el caso de una unión covalente de la sonda al soporte sólido, la superficie del soporte sólido contendrá un grupo funcional que se une a la sonda. La naturaleza del/ de los grupo/s funcional/es usado/s depende de la naturaleza de la sonda. Se ha informado de varios métodos para la unión covalente de moléculas a una superficie. Por lo general, estas reacciones se llevan a cabo mediante la reacción de un grupo funcional activo en una molécula con un grupo funcional activado en la superficie. Como ejemplo, un compuesto que contiene amina se puede unir a un ácido carboxílico que contenga superficie mediante la formación de un éster activado del ácido carboxílico, tal como un derivado de N-hidroxisuccinimida. La amina
55 reacciona fácilmente con este éster activado para formar un enlace de amida estable. Esta reacción es útil en condiciones en las que la reacción con la amina deseada es significativamente más rápida que con otros nucleófilos del sistema.
Los ejemplos de métodos que se han descrito previamente en la técnica incluyen la activación de superficies con bromuro de cianógeno, ésteres de N-hidroxisuccinimida, carbonildiimidazol, carbodiimidas, azlactonas, cloruros cianúricos, cloruros de sulfonilo orgánicos, divinilsulfona, ésteres de nitrofenilo, yodoacetilo, maleimida, epoxi, hidrazida, aminación reductora, sales de diazonio y condensaciones de Mannich. Las moléculas que reaccionan con la superficie activada incluyen aminas, alcoholes, ácidos carboxílicos, tioles, carbonilos y compuestos que contienen hidrógenos activos.
65 En una realización, las sondas se unen a la superficie del soporte sólido en una disposición o un patrón espacial
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interno, es decir, un compuesto de concentración conocida que se introduce en la muestra de ensayo que se va a analizar. Los patrones internos ideales tendrán características de elución y de ionización similares a las de la molécula diana, pero generarán iones con diferentes proporciones de masa-carga. Un patrón interno común es una versión marcada con isótopo estable de la molécula diana. En una realización, como patrón interno, se añade una
5 versión marcada con isótopo estable de la molécula diana a la muestra de ensayo. A continuación, se comparan los picos espectrales correspondientes a los diversos componentes de la muestra de ensayo con la altura o superficie del pico del patrón interno, permitiéndose así la cuantificación de la molécula diana.
En otra realización, la cuantificación de la molécula diana se lleva a cabo mediante la comparación de la altura del pico o de la superficie de los picos espectrales correspondientes a la molécula diana con aquellos picos espectrales generados a partir de un conjunto de muestras con concentraciones conocidas de la molécula diana. Las alturas de los picos o las superficies de los picos espectrales obtenidas de las muestras que tienen concentraciones conocidas de la molécula diana constituyen una curva patrón a partir de la cual se puede calcular la concentración desconocida de la molécula diana en la muestra de ensayo.
15 En otra realización, el complejo de afinidad de aptámero (o complejo covalente de aptámero opcional) se detecta y/o cuantifica usando Q-PCR. Como se usa en el presente documento, "Q-PCR" se refiere a una reacción de PCR realizada de manera y en condiciones controladas que los resultados del ensayo son cuantitativos, es decir, el ensayo es capaz de cuantificar la cantidad o la concentración de aptámero presente en la muestra de ensayo. Con referencia a la Fig. 1B, en un método ilustrativo para la detección y/o cuantificación de una molécula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, se pone en contacto una muestra de ensayo con un aptámero que puede incluir un marcador y tiene una afinidad específica por una molécula diana. Se permite la formación de un complejo de afinidad de aptámero que incluye un aptámero unido a su molécula diana. En general, si la muestra de ensayo contiene la molécula diana, se formará un complejo de afinidad de aptámero en la muestra de ensayo. El
25 complejo de afinidad de aptámero se convierte opcionalmente, usando un método apropiado para el aptámero que se esté empleando, en un complejo covalente de aptámero que incluye un aptámero unido covalentemente a su molécula diana. Como se describe además en el presente documento, tras la formación de un complejo de afinidad de aptámero y cualquier conversión opcional a un complejo covalente de aptámero, cualquier aptámero libre que pueda estar presente en la muestra de ensayo se separa después del complejo de afinidad de aptámero (o complejo covalente de aptámero opcional). El complejo de afinidad de aptámero (u complejo covalente de aptámero opcional) se cuantifica después usando técnicas conocidas para la replicación cuantitativa de polinucleótidos.
En una realización, la cantidad o la concentración del complejo de afinidad de aptámero (o complejo covalente de aptámero opcional) en la muestra de ensayo se determina usando PCR TaqMan®. Esta técnica, en general, se basa
35 en la actividad exonucleasa 5'-3' de la enzima oligonucleotídica en replicación para generar una señal a partir de una secuencia diana. La sonda TaqMan se selecciona basándose en la secuencia del aptámero que se va a cuantificar y, en general, incluye un flúor de extremo 5', tal como 6-carboxifluoresceína, por ejemplo, y un inactivador de extremo 3' tal como, por ejemplo, una 6-carboxitetrametilfluoresceína, para generar la señal a medida que la secuencia de aptámero se amplifica usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como las copias de polimerasa de la secuencia de aptámero, la actividad exonucleasa libera el flúor de la sonda, que se hibrida corriente abajo de los cebadores de PCR, generando de esta manera la señal. Se producen los aumentos de señal como producto replicado. La cantidad de producto de PCR depende tanto del número de ciclos de duplicación realizados, como de la concentración de partida del aptámero.
45 En otra realización, la cantidad o concentración de un complejo de afinidad de aptámero (o complejo covalente de aptámero opcional) se determina usando un colorante fluorescente de intercalación durante el proceso de replicación. El colorante de intercalación, tal como, por ejemplo, SYBR® verde, genera una potente señal fluorescente en presencia de ADN de doble cadena en comparación con la señal fluorescente generada en presencia de ADN monocatenario. A medida que se forma el producto de doble cadena de ADN durante la PCR, la señal producida por el colorante aumenta. La magnitud de la señal producida depende tanto del número de ciclos de PCR como de la concentración de partida del aptámero.
En otra realización, la cantidad o la concentración del complejo de afinidad de aptámero (o complejo covalente de aptámero opcional) se determina usando una "baliza molecular" durante el proceso de replicación (véase, por 55 ejemplo, Tyagi et al, Nat. Biotech. 16:49 53, 1998; patente de EE.UU. Nº 5.925.517). Una baliza molecular es una sonda de ácido nucleico específica que se pliega en un bucle de horquilla y contiene un flúor en un extremo y un inactivador en el otro extremo de la estructura de horquilla, de manera que poca o ninguna señal es generada por el flúor cuando se forma la horquilla. La secuencia del bucle es específica de una secuencia de polinucleótido diana y, al hibridarse con la secuencia de aptámero, la horquilla se despliega y, de ese modo, genera una señal fluorescente.
Se puede utilizar un programa informático para llevar a cabo una o más etapas de cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento. Otro aspecto de la presente divulgación es un producto de programa informático que comprende un medio de almacenamiento legible por ordenador que tiene un programa informático almacenado en el mismo que, cuando se carga en un ordenador, realiza o colabora en la realización de cualquiera
65 de los métodos desvelados en el presente documento. Un aspecto de la divulgación es un producto de cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, en
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