CN111735869A - 一种蛋白质的检测试剂及检测方法 - Google Patents

一种蛋白质的检测试剂及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111735869A
CN111735869A CN202010477365.9A CN202010477365A CN111735869A CN 111735869 A CN111735869 A CN 111735869A CN 202010477365 A CN202010477365 A CN 202010477365A CN 111735869 A CN111735869 A CN 111735869A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mass
capture element
support
probe
reaction platform
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010477365.9A
Other languages
English (en)
Inventor
陈若虹
陈保卫
栾天罡
刘洪涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
National Sun Yat Sen University
Original Assignee
National Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Sun Yat Sen University filed Critical National Sun Yat Sen University
Priority to CN202010477365.9A priority Critical patent/CN111735869A/zh
Publication of CN111735869A publication Critical patent/CN111735869A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4044—Concentrating samples by chemical techniques; Digestion; Chemical decomposition
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本申请公开了一种蛋白质的检测试剂及检测方法。本申请的检测试剂和建立的检测方法，其具有预浓缩和信号放大双重效果，具有良好的特异性和可重复性，同时，线性范围宽，灵敏度高，可用于临床分析。

Description

一种蛋白质的检测试剂及检测方法
技术领域
本申请属于分析检测领域，具体涉及一种蛋白质的检测试剂及检测方法。
背景技术
近年来，老年人口和年轻人中肿瘤的发病率呈上升趋势。然而，常规的临床方法不能满足对肿瘤和相关临床研究的快速和精确诊断的迫切需求。一些生物学标志物已被报道可以用于临床筛查肿瘤。因此，通过快速，高通量和对患者友好，同时兼具定量和特异性的分析方法来测定生物学标志物，可以使肿瘤的早期诊断成为可能。
仪器检测之前，必须有一种高效且选择性的预浓缩技术，才能灵敏地检测目标物。基于膜的技术因其在蛋白质富集方面的高效率而被用于电泳，电化学和微流体。靶蛋白主要通过非特异性吸附附着在膜上，这在很大程度上取决于分子量(MWs)和膜成分的离子电荷。因此，改善膜对蛋白质抗原的选择性仍然是本领域迫切解决的问题之一。
虽然多种分析检测方法已经被报道应用在分析生物样品中的药物，蛋白质，代谢物和细菌等目标物，然而，准确确定针对生物样品中复杂基质的低水平目标物仍然是巨大的挑战。
发明内容
一方面，本申请提供了一种反应平台，包括支持物，所述支持物直接或间接载有捕获元件。
在一些实施方案中，所述支持物与捕获元件之间还载有富集元件。所述的富集元件可以是有一个或多个，也可以指相互配合具有富集效果的一组/套试剂或构件。“富集”既可以指一次富集，也可以指多重/次富集。
在一些实施方案中，所述富集元件选自生物素、链霉亲和素、抗生物素蛋白中的至少一种。
在一些实施方案中，所述富集元件选自生物素、链霉亲和素中的至少一种。
在一些实施方案中，所述富集元件选自生物素和链霉亲和素。
在一些实施方案中，所述捕获元件选自抗体或适配体中的至少一种。
捕获元件包括那些可以对目标物质(如抗原)进行捕获的试剂或构件。在一些实施方案中，这种捕获包括特异性的捕获。
在一些实施方案中，所述反应平台上的捕获元件包括抗体。
在一些实施方案中，所述支持物上带有或经修饰后带有以下基团中的至少一种：氨基、羧基、醛基、环氧基；优选地，所述支持物上带有或经修饰后带有氨基。
在一些实施方案中，所述支持物选自尼龙、静电防丝、纤维素纸、玻璃、芯片、铝箔、不锈钢薄片中的至少一种。
在一些实施方案中，所述支持物选自尼龙。
在一些实施方案中，所述尼龙选自Biodyne B尼龙。现有技术中，由于Biodyne B尼龙自身带有电荷，通常被用于对核酸的富集。在本申请的一个实施例中，发明人意外发现，Biodyne B尼龙可以作为本申请反应平台支持物的选择之一，以其为载体构建的反应平台，通过对Biodyne B尼龙的功能化修饰，可以实现对蛋白(例如***特异性抗原)的特异性捕获和/或富集，克服现有基于膜的技术对于靶蛋白吸附的非特异性问题。
在一些实施方案中，制备好的功能化反应平台，其带有的富集元件和捕获元件可以对待测样品中的靶蛋白(例如***特异性抗原)同时实现特异性捕获和富集两种效果。
一方面，本申请提供了一种探针，包括连接有质量标签和捕获元件的金属纳米颗粒。
在一些实施方案中，通过对质量标签的信号强度的检测实现对样品中靶蛋白浓度的检测。
在一些实施方案中，所述质量标签选自具有巯基的化合物。在一些实施方案中，所述质量标签与金属纳米颗粒通过“金属-S”键连接。
在一些实施方案中，所述质量标签选自三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)、N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸、2-巯基乙烷磺酸钠、3-巯基-1-丙磺酸钠、4-巯基苯硼酸、3-巯基-3-甲基-1-丁醇、4-巯基苯酚、3-巯基苯甲酸、3-巯基丙酸异辛酯、3-巯基丙酸丁酯、巯基乙酸异辛酯、6-巯基吡啶-3-羧酸中的至少一种。
在一些实施方案中，所述质量标签选自三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)。
在一些实施方案中，所述探针上的捕获元件选自抗体或适配体中的至少一种。
在一些实施方案中，所述探针上的捕获元件选自适配体。
在一些实施方案中，所述适配体的序列为：5'-SH-(CH2)6-TTT ATT AAA GCT CGCCAT CAA ATA GCT TT-3'。
在一些实施方案中，所述金属纳米颗粒选自选自金纳米颗粒、银纳米颗粒或铂纳米颗粒中的至少一种。
在一些实施方案中，所述金属纳米颗粒选自金纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述金属纳米颗粒的大小为20-50nm；更优选30nm。
在一些实施方案中，所述金属纳米颗粒的数量与质量标签、捕获元件的浓度的比例为(1.8-2.5)×1011：(1.25-250):1；优选地，比例为2×1011：200:1。
一方面，本申请还提供了一种蛋白质的检测试剂盒或试剂，包括所述的反应平台，和/或所述的探针。在一些实施方案中，样品经过所述试剂盒或试剂检测后，用质谱进行分析。
本申请还提供了一种蛋白质的检测方法，包括以下步骤：
S1.将所述的反应平台置于待测样品中，室温下反应1-2小时；
S2.步骤S1完成后，与所述的探针混合，继续反应1-2小时；
S3.将步骤S2制备的反应平台直接进行质谱分析。
在一些实施方案中，用上述方法处理的待测样品，样品中的靶蛋白在反应平台上被特异性富集，同时经过探针上的捕获元件特异性结合而带上了质量标签，此时的反应平台可以直接进行质谱检测分析。将整个反应平台直接进样检测，保留了待测样品前处理的原始状态，避免了引入其它干扰因素的可能，同时兼具特异性，富集作用进一步提升了检测方法的灵敏度。
在一些实施方案中，所述质谱选自敞开式质谱(AMS)。
在一些实施方案中，所述敞开式质谱选自纸喷雾敞开式质谱。
在一些实施方案中，所述纸喷雾敞开式质谱的喷雾溶剂中含有过氧化氢、柠檬酸或DL-二硫苏糖醇中的至少一种。
在一些实施方案中，所述喷雾溶剂中含有DL-二硫苏糖醇。
在一些实施方案中，所述喷雾溶剂通过直接滴加的方式施加。
在一些实施方案中，所述喷雾溶剂中还含有碱金属盐。
在一些实施方案中，所述碱金属盐选自NH4OH；优选地，NH4OH的浓度为0.1-3M；更优选2M。
在一些实施方案中，所述方法还包括反应平台和探针的制备步骤；
在一些实施方案中，所述反应平台的制备包括以下步骤：
1)将支持物与富集元件接触，得到载有富集元件的支持物；
2)将步骤1)制得的支持物与捕获元件接触，得到同时载有富集元件和捕获元件的支持物；
3)将步骤3)制得的支持物在封闭剂中孵育。
在一些实施方案中，所述支持物选自至少有一个角的形状；优选地，所述角的角度选自20°-150°；优选地，所述角的角度选自50°-120°；更优选60°。所述支持物可以是本身就具有上述形状，也可以是通过加工得到的上述形状。
在一些实施方案中，所述封闭剂选自牛血清白蛋白、无脂肪酸的牛血清白蛋白或脱脂奶粉中的至少一种。在反应平台制备的最后加入封闭剂，以减少非特异性的吸附，对于避免探针与反应平台之间的非特异性相互作用非常重要。
在一些实施方案中，所述封闭剂选自无脂肪酸的牛血清白蛋白。
在一些实施方案中，所述探针的制备包括以下步骤：
a)激活捕获元件；
b)将捕获元件连接至金属纳米颗粒上；
c)将质量标签连接至步骤b)制备的金属纳米颗粒上。
在一些实施方案中，探针中的捕获元件为核酸适配体。核酸适配体是一段寡核苷酸序列，其发挥捕获作用需要先将双链中的S-S键打开，这一步需要用于激活其功能的激活剂。
在一些实施方案中，步骤a)中用激活剂激活捕获元件。
在一些实施方案中，所述激活剂选自三(2-羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)。
在一些实施方案中，所述激活剂激活捕获试剂的时间为1-30分钟；优选5分钟。
在本发明的一个实施例中，当使用TCEP激活适配体时，出人意料地缩短了激活时间。现有技术大多以1小时作为TCEP激活适配体的激活时间。而发明人意外发现，在此激活时间下，金纳米颗粒变成紫色并聚集，而更短的激活时间(例如，30分钟以下)有效避免金纳米颗粒的聚集。金属纳米颗粒的聚集将导致探针失效，同时宣告探针的制备失败。本申请的探针仅需要更短的时间(30分钟以内)就可以完成适配体的激活。这是与本发明独特的探针设计有关的。
本申请还提供了所述的反应平台，或所述的探针，或所述的试剂或试剂盒，或所述的检测方法在检测蛋白质中的应用。
在一些实施方案中，检测针对的样品选自血液、尿液、组织液、淋巴液、脑脊液、房水中的至少一种。
在一些实施方案中，所述血液包含血清、血浆。
在一些实施方案中，所述蛋白质选自氨基酸、多肽、糖蛋白的至少一种。
在一些实施方案中，所述蛋白质选自***特异性抗原、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原125(CA125)、甲胎蛋白、重组人神经元特异性烯醇化酶、糖链抗原153(CA153)、鳞状细胞癌抗原、P53蛋白、人附睾蛋白4中的至少一种。
在一些实施方案中，所述蛋白质选自***特异性抗原。
在一个具体的实施例中，通过反应平台上的特异性富集，探针上质量标签的信号放大，对于***特异性抗原检测的检测限可以低至4.0pg mL-1，同时在10pg mL-1到50ngmL-1的宽浓度范围内，具有良好的线性相关性。在临床诊断中，如果血清中PSA浓度大于4ngmL-1，则患者可能有***癌的风险。该实施例的检测限比临床诊断的阈值线更低3个数量级，表明该方法可用于临床病例，以测量痕量蛋白质生物标志物，指导癌症的早期诊断。
附图说明
图1为本申请的一个实施例中，与PSI-MS串联的膜反应平台的图示。(a)在膜上合成预富集功能的生物素-链霉亲和素支架；(b)制备Apt-AuNPs-TPTM探针；(c)PSA的免疫测定和MS检测。DC：直流电；MS inlet：质谱仪进样口；IS：内标；
图2为本申请的一个实施例中，反应平台的制备方法示意图；
图3为本申请的一个实施例制备的反应平台(即尼龙膜)对PSA富集效果评估结果图，其中，(a)不同处理方法的膜的ECL结果；(b)比较膜上质量标签的MS信号强度；(c-d)功能化膜(c)和裸膜(d)释放的分析物的MS谱；
图4为本申请的一个实施例中，不同的PBR对PSA分析的影响；
图5为本申请的一个实施例中，不同质量标签的浓度对质谱信号强度的影响；
图6为本申请的一个实施例中TCEP与适配体反应时间的不同对质谱信号强度的影响；
图7为本申请的一个实施例制备的探针的表征。(a)裸金纳米粒子的TEM图像；(b)适配体修饰的AuNPs的TEM图像；(c)适配体修饰的AuNPs的UV-Vis光谱；
图8为本申请的一个实施例中，不同处理方式对质量标签从AuNP解离的影响；
图9为本申请的一个实施例中，使用高分辨率MS的TPTM和IS质谱图；
图10为本申请的一个实施例中，优化PSI-MS的喷雾溶剂和解吸性能结果。(a)喷雾溶剂中NH4OH浓度对MS信号输出的影响；(b)直接滴加DTT的MS信号模式：将尼龙膜夹在架子上，然后添加5μL喷雾溶剂(0.1M DTT，2M NH4OH，1mM IS的乙腈(ACN)溶液)并直接电离；(c)DTT预先滴加于尼龙膜上的MS信号模式：将2μL等量的DTT预先滴加在尼龙膜上，使其在室温下变干，然后将尼龙膜夹在架子上并加入5μL喷雾溶剂(2M NH4OH和1mM IS的ACN溶液)；
图11为本申请的一个实施例中，PSA检测的特异性和交叉反应性测试结果；
图12为本申请的一个实施例中，PBST中PSA的校准曲线；通过分析含50ng mL-1PSA的PBST获得PSA的***MS谱图；PBST中加标的PSA的浓度为0.01、0.1、1、5、10、50ng mL-1；
图13为本申请的一个实施例制备的尼龙膜的重复性和稳定性评估结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本申请的技术方案，具体实施例不代表对本申请保护范围的限制。其他人根据本申请理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本申请的保护范围。
“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本申请的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本申请的范围内。
本申请中，“样本”同“标本”。
试剂和仪器
尼龙膜(Biodyne B)获自颇尔生命科学公司(美国纽约州华盛顿港)。平均直径为31.1nm(2×1011个颗粒每mL-1)的金纳米颗粒(AuNPs)购自BBI Solutions(英国卡迪夫)。牛血清白蛋白(BSA)和不含脂肪酸的BSA购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。链霉亲和素(SA)，生物素(biotin)，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，DL-二硫苏糖醇(DTT)，过氧化氢，NH4OH，柠檬酸，NaOH，K2CO3，NaCl，Na2HPO4，KH2PO4，乙腈，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，亚乙基二三氟四乙酸(EDTA)，ECL发光试剂和三(2-羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP，≥98％)购自生工公司(中国上海)。三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)和季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)购自百灵威(中国北京)。***特异性抗原(PSA)和生物素化的抗PSA小鼠单克隆抗体，以及癌胚抗原(CEA)和糖链抗原125(CA125)购自Linc-Bio Science(中国上海)。巯基修饰的PSA适配体由生工公司合成。适配体(Apt)通过质谱法确认，其序列如下：5'-SH-(CH2)6-TTT ATT AAA GCT CGC CAT CAA ATA GCT TT-3'。磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.4)购自Gibco(Waltham，UK)，磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST，pH 7.4)通过向PBS中添加0.1％Tween-20获得。本申请使用的退火缓冲液如下：在pH7.5-8.0的去离子水中的10mM Tris，50nM NaCl和1mM EDTA。用Millipore(美国麻萨诸塞州贝德福德)的Milli-QA10纯化***纯化去离子水(18MΩcm)。
透射电子显微镜(TEM)图像是在Tecnai G2 Spirit电子显微镜(FEI公司)上完成的，通过将样品分散在铜网上以120kV进行。UV-Vis吸收光谱是在Nanodrop分光光度计(美国，Thermo)上以1μL收集的。
实施例1反应平台的制备
首先，通过定制钢模将尼龙膜切成等腰三角形形状，其内部基底为5mm，高度为10mm。随后，将三角形膜分别在0.1M NaOH和去离子水中冲洗3次。然后，将表面带有–NH2残基的膜在含有15mg L-1生物素的新鲜制备的EDCI溶液(150mg L-1)中轻轻摇动20分钟，从而将生物素固定在膜上。
之后，将生物素标记的膜用去离子水洗涤两次，并用PBST洗涤一次，并与链霉亲和素(10mg L-1的PBST溶液)温和摇动孵育30分钟。用PBST洗涤三遍以去除多余的链霉亲和素后，将膜与生物素化的抗PSA小鼠单克隆抗体在室温(RT)下孵育30分钟。
最后，将膜用PBST洗涤3次，然后与封闭剂在PBST中于室温孵育1小时，以减少非特异性吸附。除去残留的封闭剂后，将抗体包埋的膜在4℃的PBST中保存以备进一步使用。
实施例2探针的制备
适配体(Apt)和带有-SH基团的质量标签均通过Au-S键串联固定在AuNPs上。由于合成的寡聚物是单链DNA，通过退火可以形成可以特异性识别PSA的空间结构。将巯基修饰的线性适配体溶解在最高100μM的退火缓冲液中，并在94℃下孵育2分钟以进行初始变性，然后缓慢冷却至室温以形成空间结构。
首先，使用新鲜制备的TCEP(10mM)还原适配体5分钟以破坏S-S键，然后在室温下轻柔混匀过夜以形成Au-S键将其固定在AuNPs上。随后，在2小时内将PBS逐渐添加到适配体修饰的AuNP中，直到总NaCl浓度达到0.05M，然后将混合物在室温下老化36小时。然后，将质量标签三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)(TPTM)添加到上述混合物中轻柔混匀12小时以形成Apt-TPTM标记的AuNP。加入封闭剂BSA至终浓度为1％(m v-1)，并孵育1h以封闭AuNPs表面上未结合的结合位点。之后，将混合物在4℃下于9000g离心15分钟以去除过量的试剂。最后，将离心后的物质，即制备所得的Apt-AuNPs-TPTM探针溶于含有0.5％BSA的PBST中，并保存在4℃下。在整个过程中，混合物的pH值保持在7-8范围内，以避免AuNP发生团聚。
实施例3PSA在反应平台上的免疫反应
将实施例1制备的抗体包埋的膜在含有一系列PSA的PBST中于室温温育振摇1小时，然后用PBST冲洗3次。之后，将结合有PSA的膜底物与实施例2制备的检测探针孵育，以形成夹心免疫测定法1h。最后，将反应过的膜用PBST洗涤3次，然后放入去离子水中进行PSI-MS测定。
实施例4直接PSI-MS
通过正离子或负离子检测模式在Orbitrap Elite质谱仪(Thermo FisherScientific，San Jose，CA)上获取质谱。以60,000的质量分辨率获得了精确的质量测量值，并记录了200-800范围内的质荷比(m/z)。Xcalibur 2.2软件(Thermo Fisher Scientific，美国)用于实验控制和数据采集。
质量标签TPTM(三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯))和内标IS(季戊四醇四(3-巯基丙酸酯))的质谱确认信息如表1所示。
表1
Figure BDA0002516253630000071
反应平台上的免疫反应完成后，将尼龙膜放置在约5mm的距离内，其尖端指向MS入口。之后，通过金属夹向膜施加3kV的正电离或2.3kV的负电离的高压。随后，将5μL含有2MNH4OH，1mM内标(IS)和0.1M还原/氧化/酸性试剂的喷雾溶剂添加到膜上。质量标签和IS从膜上解吸，随后电离进入MS入口。
实施例5MS信号和定量
使用MS高分辨率扫描模式进行定量，以区分目标信号和矩阵信号。作为TPTM的同类物，季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)用作IS来计算TPTM的浓度。涉及响应因子(RF)的定量是根据Deng等[1]计算的。RF＝(CTPTM/CIS)/(ITPTM/IIS)，其中CTPTM是MS预先测量的TMTP浓度，CIS是将IS加标到喷雾溶剂中，ITPTM和IIS是TPTM和IS的MS单强度。分析样品时，质量标签的浓度计算为Cmass标签＝(Imass标签/IIS)×CIS×RF，其中Imass标签是从样品传输的TPTM的MS强度。
实施例6临床样品分析
根据当地伦理委员会的规定，从广东省妇女儿童医院获得了两名***癌患者和几名健康人的人血清样品(用作对照血清)，并在-80℃下冷冻保存直至使用。使用前，将样品在冰上融化。通过用PBST稀释将PSA添加到对照血清样品中来制备加标样品。通过化学发光微粒免疫分析(CMIA)方法在ARCHITECT i2000SR免疫分析仪(美国Abbott)上分析了用于评估结果的实际样品。使用PSA质量控制样品(7K70-10)以确保PSA测量的准确性。
结果如表2所示。
表2不同稀释度的实际人血清样品的分析结果
Figure BDA0002516253630000081
实施例7生物素-链霉亲和素支架的合成及其对PSA预浓缩的影响
进行膜上测定，以电化学发光(ECL)强度作为信号输出，以确定膜上生物素-SA支架的形成。
用生物素固定后，膜被SA包埋，随后与过量的HRP标记的生物素反应以显色。颜色越深表明嵌入了HRP标记的生物素的数量越多，也间接反映了已建立的膜平台上生物素化PSA抗体的水平。图3a显示，用生物素和链霉亲和素处理的膜(D)比对照(A，B和C)的颜色更深。该结果表明生物素-链霉亲和素支架被成功合成并与膜连结，这为随后的PSA预浓缩和免疫测定奠定了关键基础。
通过使用PSI-MS对质量标签进行直接分析，评估了具有生物素-链霉亲和素支架的膜平台对PSA的富集作用。结果显示，在负载有支架的膜上(即：链霉亲和素和PSA抗体修饰的生物素的处理)，质量标签的信号强度比仅附着有PSA抗体处理的生物素的裸膜的信号强度高5倍以上(图3b，3c和3d)。说明实施例1制备的经过生物素-链霉亲和素处理的尼龙膜(即反应平台)对PSA具有优异的富集效果。
实施例8尼龙膜封闭剂的效果比较
在检测PSA之前，反应平台的封闭对于避免含适配体的探针与膜之间的非特异性相互作用非常重要。发明人比较了几种常用的蛋白质封闭剂(PBR)对膜封闭的作用，包括BSA，无脂肪酸的BSA和脱脂奶粉。
质谱结果中，质量标记的信号越低，表明未检测PSA之前，膜封闭效果越好。图4显示，无脂肪酸的BSA在三种PBR中具有最佳的封闭性能。
实施例9探针制备的对比和表征
本申请设计的探针对PSA的信号放大依赖于金纳米颗粒上质量标签的负载。发明人还对比了AuNPs表面的质量标签与适配体的不同比例对于信号输出的影响。可以理解，与AuNP结合的越多的质量标签，则信号放大的效果越佳。但是，如果附着在AuNPs上的过多质量标签也可能阻碍探针与PSA2c之间的免疫结合。
用含有0.1nmol适配体的1mL AuNPs(约2×1011颗粒)进行优化，质量标签的浓度从0.125到25nmol不等。图5显示，质谱信号在20nmol的质量标签用量下最高。在随后的分析中，使用0.1nmol的适配体，20nmol的质量标签和1mL的AuNPs合成探针。
还对比了TCEP激活适配体的时间，该时间影响了适配体与AuNP的结合。TCEP可以减少适配体的S-S键与-SH键的结合，从而使适配体与AuNPs的结合更容易。本申请测试了文献2b中报道的1h激活时间，出乎意料的是AuNPs变成紫色并聚集。因此，发明人尝试缩短了激活时间(1、5、15和30分钟)，意外发现即使在较短的激活时间处理下，仍然可以避免AuNP发生团聚。图6显示，激活时间可以为1-30，与文献中报道的1小时的激活时间相比，显著缩短。其中当激活时间短至5分钟时，质量标签的信号最强。这可能是与本申请使用的特定颗粒大小的AuNP(30nm)及特定序列的适配体有关。
使用TEM对制成的探针进行表征，以观察Au和Au-Apt颗粒的外观，并用UV-Vis进一步确认Apt修饰的AuNP。TEM图像显示，与裸露的AuNPs相比，组装了Apt的Au-Apt颗粒更好地分散在水溶液中(图7a和7b)。UV-Vis光谱显示AuNP与适配体之间的共轭导致最大吸收从524nm移至532nm发生红移(图7c)。这些结果表明，适配体确实结合到AuNPs的表面上。与Apt-AuNPs相比，在所制备的Apt-AuNPs-TPTM探针中也观察到了从532nm到536nm的红移，该结果表明，质量标签确实结合到了Au-Apt上。
实施例10质谱的影响因素对比
质量标签(TPTM)与AuNP的有效解离对于实现良好的分析性能也很重要。
本申请设计的反应平台的主要组成部分之间的连接，例如生物素-链霉亲和素-生物素支架，抗体对PSA，PSA和特异性适配体的免疫亲和力以及探针中Apt-AuNP和TPTM-AuNP的Au-S键。这些连接在进行MS分析之前要保持稳定。例如，生物素与链霉亲和素的解离常数低至飞摩尔水平3，从一方面保证了这样的稳定性。
因此，在进样时为了使探针释放质量标签，可以通过破坏上述任意两个组成部分之前的连接。发明人选择通过破坏AuNP和质量标签之间的Au-S键来定量释放质量标签。由于探针和PSA之间强烈的共价键相互作用，因此质量标签无法仅靠高压电离。发明人尝试比较了在喷雾溶剂中加入不同物质以使得探针更容易地释放。
发明人比较了还原剂(DDT)，氧化剂(H2O2)，酸(柠檬酸)3种不同的处理。
图8显示，与氧化(H2O2)和酸化(柠檬酸)处理的效果相比，还原处理(DDT)效率最高，TPTM的MS信号更强。喷雾溶剂中的DDT通过氢化过程对质量标签进行离解。
此外，在质量标签的信号模式中，比较了膜的两种DDT滴加方式(直接滴加和预滴加)。图10b显示，直接滴加可以持续数分钟的稳定MS信号输出。相比之下，预滴加于膜上的信号仅保持10秒钟(图10c)。尽管预滴加方式可为DTT和TPTM留出足够的反应时间，但也可能导致DTT氧化，从而降低质量标签从探针的解离效率。
发明人还对比了在质谱的正离子电离模式下，影响质量标签还原释放的离子化加合产物。
发明人发现，碱金属盐(例如，NH4OH)促进了包含质量标签单体的加合物的产生，从而提高了灵敏度。图9显示TPTM和IS都能够与NH4 +阳离子相互作用形成[M+NH4]+加合物，并且[M+NH4]+加合物的强度明显高于相应的[M+Na]+和[M+H]+加合物。进一步优化了喷雾溶剂中添加的NH4OH的浓度，以实现最佳的电离性能。图10a表明，质量标签的信号强度在NH4OH浓度为2M时最高。结果表明，向喷雾溶剂中添加适量的NH4OH有助于质量标签的检测，而过量的NH4OH则会降低信号强度。
实施例11
1.特异性和交叉反应性
本申请还对比了有其他类型癌症相关抗原的真实血清样品中的PSA分析，以评估该方法的特异性和交叉反应性。
选择了临床分析中常用的两种血清糖蛋白抗原(CEA和CA125)，并将具有相同浓度的PSA，CEA或CA125抗原单独或组合添加到血清样品中。
图11显示，单独的PSA信号强度与混合了CEA或CA125的PSA信号强度相当，单独的CEA或CA125的信号强度低。这些结果表明，即使在其他抗原共存的情况下，本申请构建的反应平台对PSA也具有良好的选择性和特异性。
2.线性范围、检测限、重现性
在从10pg mL-1到50ng mL-1的宽浓度范围内，几乎在三个数量级上都观察到了强度比与PBST缓冲液中PSA浓度之间的良好线性相关性(R2＝0.998)(图12)。根据IUPAC的建议，即，三倍空白测量的标准偏差，LOD低至约4.0pg mL-1。在临床诊断中，如果血清中PSA浓度大于4ng mL-1，则患者可能有***癌的风险。因此，本申请的方法完全能够满足PSA测量的临床诊断需求。
用具有不同存储期限(在4℃下1到30天)的膜来评估已建立的膜上反应平台的可重复性和稳定性。图13显示，所有膜的分析结果至少连续30天一致，相对标准偏差为3.9％(1ng mL-1)和1.8％(10ng mL-1)。
3.加标回收率
将不同水平的PSA在人血清中进行的加标回收，获得了在94％至102％之间的加标回收率，结果如表3，表明本申请的方法并不会受到人血清的复杂基质的影响。
表3PSA的血清加标回收结果
Figure BDA0002516253630000101
Figure BDA0002516253630000111
对比例1
如表4所示，将本申请的方法在对PSA的分析性能方面与以前文献中报道的其他方法进行了比较。本申请的方法的线性范围和LOD与大多数分析方法相当，并且比基于MS的方法要好得多。尽管一些基于电极的方法具有良好的灵敏度，但昂贵的电极限制了这些方法在疾病生物标志物临床分析中的应用。除了低成本之外，本申请的实施例中基于尼龙膜的反应平台比常规PSI-MS中常用的纤维素纸具有更好的耐久性和稳定性。
表4不同PSA免疫检测方法的性能对比
Figure BDA0002516253630000112
a表示相应数据在文献中未提及。
鉴于可以应用所公开的发明的原理的许多可能的实施例，应当认识到，所示的实施例仅是本申请的优选示例，而不应视为限制本申请的范围。相反，本申请的范围由所附权利要求书限定。因此，我们要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的发明。
参考文献
1.Deng,J.W.；Yang,Y.Y.；Fang,L.；Lin,L.；Zhou,H.Y.；Luan,T.G.,CouplingSolid-Phase Microextraction with Ambient Mass Spectrometry Using SurfaceCoated Wooden-Tip Probe for Rapid Analysis of Ultra Trace PerfluorinatedCompounds in Complex Samples.Analytical Chemistry 2014,86(22),11159-11166.
2.(a)Xu,S.T.；Ma,W.；Bai,Y.；Liu,H.W.,Ultrasensitive Ambient MassSpectrometry Immunoassays:Multiplexed Detection of Proteins in Serum and onCell Surfaces.Journal of the American Chemical Society 2019,141(1),72-75；(b)Du,R.J.；Zhu,L.N.；Gan,J.R.；Wang,Y.N.；Qiao,L.；Liu,B.H.,Ultrasensitive Detectionof Low-Abundance Protein Biomarkers by Mass Spectrometry Signal AmplificationAssay.Analytical Chemistry 2016,88(13),6767-6772；(c)Zhong,X.Q.；Qiao,L.；Gasilova,N.；Liu,B.H.；Girault,H.H.,Mass Barcode Signal Amplification forMultiplex Allergy Diagnosis by MALDI-MS.Analytical Chemistry 2016,88(12),6184-6189.
3.Haes,A.J.；Van Duyne,R.P.,A nanoscale optical blosensor:Sensitivityand selectivity of an approach based on the localized surface plasmonresonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles.Journal of theAmerican Chemical Society 2002,124(35),10596-10604.
4.Garcia-Cortes,M.；Fernandez-Arguelles,M.T.；Costa-Fernandez,J.M.；Sanz-Medel,A.,Sensitive prostate specific antigen quantification usingdihydrolipoic acid surface-functionalized phosphorescent quantumdots.Analytica Chimica Acta 2017,987,118-126.
5.Gutierrez-Zuniga,G.G.；Hernandez-Lopez,J.L.,Sensitivity improvementof a sandwich-type ELISA immunosensor for the detection of differentprostate-specific antigen isoforms in human serum using electrochemicalimpedance spectroscopy and an ordered and hierarchically organizedinterfacial supramolecular architecture.Anal Chim Acta 2016,902,97-106.
6.Wei,Y.Y.；Wang,D.N.；Zhang,Y.Z.；Sui,J.H.；Xu,Z.R.,Multicolor andphotothermal dual-readout biosensor for visual detection of prostate specificantigen.Biosensors&Bioelectronics 2019,140,48-56.
7.Chong,J.；Chong,H.；Lee,J.H.,A chemiluminescent dual-aptasensorcapable of simultaneously quantifying prostate specific antigen and vascularendothelial growth factor.Anal Biochem 2019,564-565,102-107.
8.E.W.Klee,O.P.Bondar,M.K.Goodmanson,S.A.Trushin,R.J.Singh,N.L.Anderson,G.G.Klee,American Journal of Clinical Pathology 2014,141,527-533.
9.Lang,R.；Leinenbach,A.；Karl,J.；Swiatek-de Lange,M.；Kobold,U.；Vogeser,M.,An endoglycosidase-assisted LC-MS/MS-based strategy for theanalysis of site-specific core-fucosylation of low-concentrated glycoproteinsin human serum using prostate-specific antigen(PSA)as example.Clinica ChimicaActa 2018,480,1-8.
10.Chen,Y.T.；Tuan,L.P.；Chen,H.W.；Wei,I.A.；Chou,M.Y.；Chen,H.M.；Tyan,Y.C.；Chen,S.F.,Quantitative Analysis of Prostate Specific Antigen IsoformsUsing Immunoprecipitation and Stable Isotope Labeling MassSpectrometry.Analytical Chemistry 2015,87(1),545-553.
11.Florentinus-Mefailoski,A.；Marshall,J.G.,Pyridoxamine-5-phosphateenzyme-linked immune mass spectrometric assay substrate for linear absolutequantification of alkaline phosphatase to the yoctomole range applied toprostate specific antigen.Anal Chem 2014,86(21),10684-91.

Claims (10)

1.一种反应平台，其特征在于，包括支持物，所述支持物直接或间接载有捕获元件。
2.如权利要求1所述的反应平台，其特征在于，所述支持物与捕获元件之间还载有富集元件；
优选地，所述富集元件选自生物素、链霉亲和素、抗生物素蛋白中的至少一种；
优选地，所述富集元件选自生物素、链霉亲和素中的至少一种；
优选地，所述富集元件选自生物素和链霉亲和素。
3.如权利要求1所述的反应平台，其特征在于，所述捕获元件选自抗体或适配体中的至少一种；
优选地，所述捕获元件包括抗体；
优选地，所述支持物上带有或经修饰后带有以下基团中的至少一种：氨基、羧基、醛基、环氧基；优选地，所述支持物上带有或经修饰后带有氨基；
优选地，所述支持物选自尼龙、静电防丝、纤维素纸、玻璃、芯片、铝箔、不锈钢薄片中的至少一种；
优选地，所述支持物选自尼龙；优选地，所述尼龙选自Biodyne B尼龙。
4.一种探针，其特征在于，包括连接有质量标签和捕获元件的金属纳米颗粒。
5.如权利要求4所述的探针，其特征在于，所述质量标签选自具有巯基的化合物；
优选地，所述质量标签选自三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)、N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸、2-巯基乙烷磺酸钠、3-巯基-1-丙磺酸钠、4-巯基苯硼酸、3-巯基-3-甲基-1-丁醇、4-巯基苯酚、3-巯基苯甲酸、3-巯基丙酸异辛酯、3-巯基丙酸丁酯、巯基乙酸异辛酯、6-巯基吡啶-3-羧酸中的至少一种；
优选地，所述质量标签选自三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)；
优选地，所述捕获元件选自抗体或适配体中的至少一种；
优选地，所述捕获元件选自适配体；
优选地，所述适配体的序列为：5'-SH-(CH2)6-TTT ATT AAA GCT CGC CAT CAA ATA GCTTT-3'；
优选地，所述金属纳米颗粒选自选自金纳米颗粒、银纳米颗粒或铂纳米颗粒中的至少一种；
优选地，所述金属纳米颗粒选自金纳米颗粒；
优选地，所述金属纳米颗粒的大小为20-50nm；更优选30nm；
优选地，所述金属纳米颗粒的数量与质量标签、捕获元件的浓度的比例为(1.8-2.5)×1011：(1.25-250):1；优选地，比例为2×1011：200:1。
6.一种蛋白质的检测试剂盒或试剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的反应平台，和/或权利要求4-5任意所述的探针。
7.一种蛋白质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将权利要求1-3任一所述的反应平台置于待测样品中，室温下反应1-2小时；
S2.步骤S1完成后，与权利要求2-5任一所述的探针混合，继续反应1-2小时；
S3.将步骤S2制备的反应平台直接进行质谱分析。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述质谱选自敞开式质谱；
优选地，所述敞开式质谱选自纸喷雾敞开式质谱；
优选地，所述纸喷雾敞开式质谱的喷雾溶剂中含有过氧化氢、柠檬酸或DL-二硫苏糖醇中的至少一种；
优选地，所述喷雾溶剂中含有过氧化氢或DL-二硫苏糖醇；
优选地，所述喷雾溶剂中含有DL-二硫苏糖醇；
优选地，所述喷雾溶剂通过直接滴加的方式施加；
优选地，所述喷雾溶剂中还含有碱金属盐；
优选地，所述碱金属盐选自NH4OH；优选地，NH4OH的浓度为0.1-3M；更优选2M。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括反应平台和探针的制备步骤；
优选地，所述反应平台的制备包括以下步骤：
1)将支持物与富集元件接触，得到载有富集元件的支持物；
2)将步骤1)制得的支持物与捕获元件接触，得到同时载有富集元件和捕获元件的支持物；
3)将步骤3)制得的支持物在封闭剂中孵育；
优选地，所述支持物选自至少有一个角的形状；优选地，所述角的角度选自20°-150°；
优选地，所述角的角度选自50°-120°；更优选60°；
优选地，所述封闭剂选自牛血清白蛋白、无脂肪酸的牛血清白蛋白或脱脂奶粉中的至少一种；
优选地，所述封闭剂选自无脂肪酸的牛血清白蛋白；
优选地，所述探针的制备包括以下步骤：
a)激活捕获元件；
b)将捕获元件连接至金属纳米颗粒上；
c)将质量标签连接至步骤b)制备的金属纳米颗粒上；
优选地，步骤a)中用激活剂激活捕获元件；
优选地，所述激活剂选自三(2-羧乙基)磷化氢盐酸盐；
优选地，所述激活剂激活捕获试剂的时间为1-30分钟；优选5分钟。
10.如权利要求1-3所述的反应平台，或权利要求1-5所述的探针，或权利要求6所述的试剂或试剂盒，或权利要求7-9所述的检测方法在检测蛋白质中的应用；
优选地，检测针对的样品选自血液、尿液、组织液、淋巴液、脑脊液、房水中的至少一种；
优选地，所述血液包含血清、血浆；
优选地，所述蛋白质选自氨基酸、多肽、糖蛋白的至少一种；
优选地，所述蛋白质选自***特异性抗原、癌胚抗原、糖链抗原125、甲胎蛋白、重组人神经元特异性烯醇化酶、糖链抗原153、鳞状细胞癌抗原、P53蛋白、人附睾蛋白4中的至少一种；
优选地，所述蛋白质选自***特异性抗原。
CN202010477365.9A 2020-05-29 2020-05-29 一种蛋白质的检测试剂及检测方法 Pending CN111735869A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010477365.9A CN111735869A (zh) 2020-05-29 2020-05-29 一种蛋白质的检测试剂及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010477365.9A CN111735869A (zh) 2020-05-29 2020-05-29 一种蛋白质的检测试剂及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111735869A true CN111735869A (zh) 2020-10-02

Family

ID=72648083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010477365.9A Pending CN111735869A (zh) 2020-05-29 2020-05-29 一种蛋白质的检测试剂及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111735869A (zh)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030119021A1 (en) * 2001-07-16 2003-06-26 Hubert Koster Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
WO2006119435A2 (en) * 2005-05-04 2006-11-09 Invitrogen Corporation Identification of cancer biomarkers and phosphorylated proteins
US20070099256A1 (en) * 2005-10-28 2007-05-03 Narayan Sundararajan Chemical derivatization, detection, and identification of peptide and protein modifications
CN101374965A (zh) * 2006-01-17 2009-02-25 私募蛋白质体公司 测试样品的多元化分析
CN101605909A (zh) * 2006-12-05 2009-12-16 塞昆纳姆股份有限公司 使用质谱法的生物分子检测和定量
CN101802225A (zh) * 2007-07-17 2010-08-11 私募蛋白质体公司 检测样品的多元分析
CN101943703A (zh) * 2010-06-28 2011-01-12 首都医科大学 一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法
CN101990638A (zh) * 2008-04-10 2011-03-23 普罗彼翁有限公司 新的质量分析信号的放大技术
WO2011100669A2 (en) * 2010-02-15 2011-08-18 North Carolina State University Office Of Technology Transfer Lable-free multiplexing bioassays using fluorescent conjugated polymers and barcoded nanoparticles
CN102906275A (zh) * 2010-02-10 2013-01-30 加利福尼亚大学董事会 肺癌检测的唾液生物标记
CN106404945A (zh) * 2016-08-30 2017-02-15 中山大学 一种段塞流微萃取‑纸基电喷雾质谱联用技术
CN107407666A (zh) * 2015-03-09 2017-11-28 株式会社岛津制作所 使用质谱分析的单克隆抗体的检测方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030119021A1 (en) * 2001-07-16 2003-06-26 Hubert Koster Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
WO2006119435A2 (en) * 2005-05-04 2006-11-09 Invitrogen Corporation Identification of cancer biomarkers and phosphorylated proteins
US20070099256A1 (en) * 2005-10-28 2007-05-03 Narayan Sundararajan Chemical derivatization, detection, and identification of peptide and protein modifications
CN101374965A (zh) * 2006-01-17 2009-02-25 私募蛋白质体公司 测试样品的多元化分析
CN101605909A (zh) * 2006-12-05 2009-12-16 塞昆纳姆股份有限公司 使用质谱法的生物分子检测和定量
CN101802225A (zh) * 2007-07-17 2010-08-11 私募蛋白质体公司 检测样品的多元分析
CN101990638A (zh) * 2008-04-10 2011-03-23 普罗彼翁有限公司 新的质量分析信号的放大技术
CN102906275A (zh) * 2010-02-10 2013-01-30 加利福尼亚大学董事会 肺癌检测的唾液生物标记
WO2011100669A2 (en) * 2010-02-15 2011-08-18 North Carolina State University Office Of Technology Transfer Lable-free multiplexing bioassays using fluorescent conjugated polymers and barcoded nanoparticles
CN101943703A (zh) * 2010-06-28 2011-01-12 首都医科大学 一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法
CN107407666A (zh) * 2015-03-09 2017-11-28 株式会社岛津制作所 使用质谱分析的单克隆抗体的检测方法
CN106404945A (zh) * 2016-08-30 2017-02-15 中山大学 一种段塞流微萃取‑纸基电喷雾质谱联用技术

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN-WEI CHU等: "Nanoparticle-Based LDI-MS Immunoassay for the Multiple Diagnosis of Viral Infections", 《ACS SENSORS》, pages 1543 *
PEI-HUA LAI等: "Comparison of gampi paper and nanofibers to chromatography paper used in paper spray-massspectrometry", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》, pages 14 - 17 *
SHUTING XU等: "Ultrasensitive Ambient Mass Spectrometry Immunoassays: Multiplexed Detection of Proteins in Serum and on Cell Surfaces", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》, pages 72 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Label-free electrochemiluminescence immunosensor for cardiac troponin I using luminol functionalized gold nanoparticles as a sensing platform
Yang et al. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for carbohydrate antigen 19-9 using Au/porous graphene nanocomposites as platform and Au@ Pd core/shell bimetallic functionalized graphene nanocomposites as signal enhancers
Qu et al. A novel electrochemical immunosensor based on colabeled silica nanoparticles for determination of total prostate specific antigen in human serum
Liu et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes
Terenghi et al. Multiplexed determination of protein biomarkers using metal-tagged antibodies and size exclusion chromatography− inductively coupled plasma mass spectrometry
Agoston et al. Rapid isolation and detection of erythropoietin in blood plasma by magnetic core gold nanoparticles and portable Raman spectroscopy
US20090159458A1 (en) Method for Determination of Test Substance
Du et al. An ultrasensitive detection of 17β-estradiol using a gold nanoparticle-based fluorescence immunoassay
Yuan et al. A simultaneous electrochemical multianalyte immunoassay of high sensitivity C-reactive protein and soluble CD40 ligand based on reduced graphene oxide-tetraethylene pentamine that directly adsorb metal ions as labels
Wang et al. Signal amplification for multianalyte electrochemical immunoassay with bidirectional stripping voltammetry using metal-enriched polymer nanolabels
US20140251832A1 (en) Electrochemical Assay
Wu et al. A universal and enzyme-free immunoassay platform for biomarker detection based on gold nanoparticle enumeration with a dark-field microscope
Gupta et al. Electrochemical studies of lateral flow assay test results for procalcitonin detection
CN109738629B (zh) 一种基于新型sers探针的拉曼免疫检测方法
Ge et al. Simultaneous immunoassay of phosphorylated proteins based on apoferritin templated metallic phosphates as voltammetrically distinguishable signal reporters
Nan et al. Lateral flow immunoassay for proteins
US20160341723A1 (en) Au nanoparticles encapsulated in nanocompoites and applications thereof in rapid detection of an analyte
Rajeev et al. Magnetic nanoparticles enhance Pore blockage-based electrochemical detection of a wound biomarker
JP2010530966A (ja) 分析物の検出方法
Deng et al. A novel potentiometric immunoassay for carcinoma antigen 15-3 by coupling enzymatic biocatalytic precipitation with a nanogold labelling strategy
WO2018146534A1 (en) Methods and biosensors for tumor detection
Li et al. A simple unlabeled human chorionic gonadotropin biosensor based on a peptide aptamer
JP5369172B2 (ja) 新たな質量分析信号の増幅技術
CN111735869A (zh) 一种蛋白质的检测试剂及检测方法
Chen et al. Osmotic processor for enabling sensitive and rapid biomarker detection via lateral flow assays

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination