TWI816692B - 將核酸探針固定於一固體支撐的方法 - Google Patents
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Abstract
一種核酸探針、將該核酸探針固定於一固體支撐的方法以及包括使用UV光固定探針的固體支撐。 核酸探針包括終端錨鏈部分,及捕捉部分,其中該終端錨鏈部分包括至少18個核苷酸的序列或與其至少90%相似性的序列,該序列由多達5個X型鹼基的核苷酸與胞嘧啶(C)型鹼基的中間核苷酸及視需要的鳥嘌呤型鹼基的一個核苷酸的延伸部組成,其中各X型鹼基彼此獨立地指定為胸腺嘧啶(T)型鹼基或尿嘧啶(U)型鹼基。
Description
本發明一般而言係關於將核酸探針固定於一固體基材的方法,如為流體匣。該等核酸探針可有利地用於捕捉目標組分及/或用於雜交分析目的。
使用於生物分子的研究及/或偵測的檢測裝置為非常重要的工具。近年已開發及市售載有雜交檢測用的經固定探針的不同型裝置。
已建議數種嘗試用以改良檢測裝置及用以固定化所期望的探針。一些先前技術方法包含將核苷酸序列直接合成至支撐結構。其他及更有效的方法包含例如藉由自天然來源將其單離或藉由合成而首先提供核酸探針。
A.B. Steel et al. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0006-3495(00)76351-X; “Immobilization of Nucleic Acids at Solid Surfaces: Effect of Oligonucleotide Length on Layer Assembly”. Biophysical Journal Vol. 79, August 2000 p.975-981揭示DNA長度的功效及錨基團的存在對於金表面預先合成的寡核苷酸的組裝的研究。該研究顯示硫醇錨基團強力地增強寡核苷酸固定,但該增強對於較常股長度為降低的。對於長度超過24鹼基的股,開始表面覆蓋而隨著探針長度顯著減低。
Anke Pierik et al. DOI: 10.1021/ac902561w; “Immobilization of Oligonucleotides with Homo-oligomer Tails onto Amine-Functionalized Solid Substrates and the Effects on Hybridization”. Anal. Chem., 2010, 82 (4), pp 1191–1199揭示光化學(254 nm UV)DNA固定至胺官能性化基材的研究。該文獻結論尿嘧啶、胸腺嘧啶以及在一定程度上的鳥嘌呤之短的同源寡聚物序列(尾),附接至雜交序列,改良固定。其推想解釋該等核苷酸對胺官能性化基材的接枝的可能機制。
相似的固定方法揭示於EP 2334810。本發明所揭露的重點在於使用較長波長固定核酸,亦即300至500nm且咸信使用長波長的光會降低對核酸造成損傷的風險。所揭露的方法包含下述步驟: (a) 提供具有僅一種型鹼基核苷酸的延伸部的核酸,其中該僅一種型鹼基的核苷酸的延伸部係位於至少該核酸的3’或5’終端;及 (b) 使用光藉由交聯將該核酸固定於固體支撐,其中使用光的交聯係以約300至500nm的波長進行,較佳以365nm的波長,其中該僅一種型鹼基核苷酸的延伸部具有長度由約7至約100個核苷酸,以及該交聯係使用能量範圍由約0.5 Joule/cm2
至約10 Joule/cm2
的量進行。
本發明的目的係提供將核酸探針固定於固體基材的替代方法,該方法為簡便且有效。
一具體例中,目的係提供核酸探針固定於固體基材的方法,其中該基材不需要前處理,該前處理包含該固體支撐的胺官能性化或硫醇官能性化及較佳地該基材為熱塑膠及可注射可鑄模材料,藉由注射鑄模製造後不需要任何表面官能性化。
一具體例中,目的係提供將核酸探針固定於固體支撐的方法,其中該基材藉由UV光固定化後不需要清洗。藉此,可以降低的成本製造帶有經固定探針的最終裝置支撐。
本發明的目的係提供一種包含以高有效性用於將核酸探針固定於基材的終端錨鏈部分的探針以及其中該基材有利地不需要前處理。
該等目的已藉由本發明或其具體例完成如同申請專利範圍及後文所揭示者。
本發明提供將核酸探針固定於一固體支撐之新穎及有效的方法。本發明之發明者們以發現一新穎錨定改變用以將核酸探針固定於一固體支撐,其中該固定化有效性令人意外的高且對於核酸探針之非期望損傷的風險非常低。
將核酸探針固定於一固體支撐的方法,該方法包含 ․ 提供探針以包含終端錨鏈部分及捕捉部分 ․ 施用該核酸探針於固體支撐的表面,及 ․ 藉由使其接受UV光將核酸探針的錨鏈部分錨定至該固體支撐。
核酸探針的終端錨鏈部分包含N核苷酸序列或與其具有至少90%相似性的序列,該N核苷酸序列由具有胞嘧啶(C)型鹼基的中間核苷酸及視需要的鳥嘌呤(G)型鹼基的一個核苷酸的X型鹼基核苷酸的延伸部組成。X型鹼基核苷酸的延伸部各自包含1至5個核苷酸。N為至少18及各X型鹼基各自獨立地指定為胸腺嘧啶(T)型鹼基或尿嘧啶(U)型鹼基。一具體例中,N為至少20。
一具體例中,該終端錨鏈部分具有至多1個或無G型鹼基核苷酸。
百分比相似性係藉由計算與自具有C型鹼基中間核苷酸的X型鹼基的1至5個核苷酸延伸的組成物為不同的N核苷酸序列中的n核苷酸數而測定且計算相似性百分比100*(N-n)/N。
用語一特定型鹼基核苷酸,如各別之胞嘧啶(C)型鹼基、胸腺嘧啶(T)型鹼基或尿嘧啶(U)型鹼基,本文中係使用於包括核苷酸,該核苷酸包含該特定型鹼基以及其化學衍生物為所屬技術領域中具有通常知識者習知其能與互補鹼基交互作用,包括其功能性均等衍生物或修飾物。用語「功能性均等」關於鹼基與互補鹼基建立非共價連結的能力,其為化學性相似於其所衍生自的核苷酸或鹼基的非-共價連結。該功能性均等或修飾鹼基可仍能與互補鹼基進行雜交結合。
用語「終端錨鏈部分」、「多尾」或僅「錨變化」於本文中可互換使用。
用語「目標組分」意指可藉由捕捉部分捕捉及/或於捕捉部分合成的任何組分,例如,藉由雜交、引子延長或其他反應。
用語「遠端」及「近端」應解讀為相關於光學轉換裝置或與微創手術連結使用的任何其他裝置的定向。
用語「約」通常係使用於包括測定不確定性者為何。本文中當於範圍使用該用語 「約」應為意指包括於該範圍中之測定不確定性者。
應強調用語「包含/包含著」當使用於本文中,解讀為開放用語,亦即,應為意指特定化所陳述的具體特徵,如元件、單位、整數、步驟、組份及其組合的存在,但不排除所陳述的其他一或多種特徵的存在或添加。
除非指名或由本文清楚可知,用語「實質上地」意指傳統的測定不確定性,或包含產品變動或耐受度,端視何者較大。
用語「主要地」於本文中應意指包括與實際目的無關的變動。
本說明書或申請專利範圍全文中,單數涵蓋多數,除非文中另行指明。
片語「一具體例」應解讀為包括本發明之實例,該實例包含所述及具體例的特徵。
如本文所述之本發明所有特徵及本發明具體例,包括範圍及較佳範圍,於本發明的範疇內可以各種方式組合,除非有具體理由不包組合該等特徵。
藉由提供本發明之新穎核酸探針,本發明之發明者們對於將核酸固定於固體基材的技術領域已製造大且有價值的貢獻。本發明者們所提供的方法具有數種非常有價值的有利處,下文將進一步說明。
一具體例中,該核酸探針終端錨鏈部分包含N核苷酸序列,該序列由具有胞嘧啶(C)型鹼基中間核苷酸的X型鹼基核苷酸的延伸部組成。X型鹼基及C型鹼基的組合已顯示對於獲得高固定有效性為非常有利。因此,一具體例中,至少約90%,如至少約95%,如N核苷酸各者彼此獨立地為X型鹼基或C型鹼基。
X型鹼基核苷酸的延伸部,對於各延伸部包含至少一個X型鹼基核苷酸。X型鹼基核苷酸的延伸部可具有相等或不同的長度。一具體例中,某些,如X型鹼基核苷酸延伸部之每第二個或每第三個具有第一長度,及某些其他,如X型鹼基核苷酸之每第二個或每第三個延伸部具有第二較長長度。
已發現,當核酸探針包含X型鹼基核苷酸的一個或多個延伸部,該X型鹼基核苷酸的延伸部包含探針分離風險的2至5個核苷酸時,可以大大降低產生假陰性。
有利第,N核苷酸序列包含少於10%,較佳少於5%的核苷酸具有嘌呤核鹼基,如1或0個核苷酸具有嘌呤核鹼基。
具有嘌呤核鹼基的核苷酸為腺嘌呤(A)及尿嘌呤(G)。已發現具有嘌呤核鹼基的核苷酸通常降低核酸探針的固定有效性。咸信此可能係因為核酸探針的高固定有效性係藉由嘧啶的C=C雙鍵的反應之共價鍵的形成所引起。因此,具有嘌呤核鹼基的核苷酸不藉由此反應鍵合至固體支撐。
有利地,N核苷酸序列包含只具有嘧啶核鹼基的核苷酸。
一具體例中,核酸探針的終端錨鏈部分包含至少N核苷酸序列,該序列由具有C型鹼基的中間核苷酸的X型鹼基的2至5個核苷酸的延伸部所組成。
終端錨鏈部分的N核苷酸數有利地應為不過低,因為此可能造成終端錨鏈部分及固體支撐之間過於弱的鍵結。然而,亦期望核酸探針的核苷酸總數不過長,此乃因其可能造成每單位面積的經固定化核酸探針數為低或造成核酸探針彼此部分封阻從而造成相對弱的固定。有利地,N為至少6,如至少30、如至少34、如至少38、如至少40。
一般而言,咸信增加終端錨鏈部分的N核苷酸數至約60,不造成進一步增加固定有效性。一具體例中,終端錨鏈部分的N核苷酸數少於50。
有利地,X型鹼基核苷酸的延伸部彼此獨立地藉由1至4個C型鹼基核苷酸彼此分開。
一具體例中,X型鹼基核苷酸的延伸部為相等長度,較佳為2個X型鹼基核苷酸長度、3個X型鹼基核苷酸長度、4個X型鹼基核苷酸長度。
已發現,終端錨鏈部分包含X型鹼基核苷酸及C型鹼基核苷酸的重複亞序列時,可獲得非常高的固定有效性且經固定之核酸探針的脫離風險非常低,即使進行溫度偏移亦然,如將其等提供於熱循環製程如應用於用以擴增DNA段的PCR(聚合酶鏈鎖反應)中的熱循環。
一高度適合的具體例中,N核苷酸序列包含下式型鹼基核苷酸之重複亞序列 (-(X)Y
-(C)Z
-)M
, 其中 Y為1至5的整數,Z為1至5的整數, Y≥Z及M為4至20的整數。
有利地,Y為2至5的整數,Z 為1至4的整數,Y>Z及M為4至20的整數。
一具體例中,Z=1。一具體例中,Z=2。一具體例中,Y=2及M≥10, 如M≥12,如M≥ 14。一具體例中,Y=3及M≥ 6,如M≥ 8,如M≥ 10。一具體例中,Y=4及M≥ 4,如M≥ 6,如M≥ 8。
另一高度適合的具體例中,N核苷酸序列包含下式型鹼基核苷酸的重複亞序列 (-(X)Y2
-(C)Z-
(X)Y2
-)M
, 其中, Y2
為1至4的整數,Z 為1至4的整數,及M為4至20的整數。
較佳地,Y2
為2至3的整數,Z為1至3的整數。一具體例中,Y2
≥Z,較佳地Y2
>Z。一具體例中,Y2
=2 及M≥10,如M≥12,如M≥ 14。一具體例中,Y2
=3及M≥ 4,如M≥6,如M≥ 8。
已發現具體例其中X型鹼基數大於C型鹼基數為較佳以獲得非常高及安定的固定有效性。
一具體例中, Y或Y2
的數大於Z的數,較佳地Y或Y2
的數至少為Z數的二倍。
一具體例中, X型鹼基核苷酸的延伸部為T型鹼基核苷酸的延伸部。
一具體例中, X型鹼基核苷酸的延伸部為U型鹼基核苷酸的延伸部。
由於終端錨鏈部分對固體支撐的鍵結,咸信為藉由定位於嘧啶的C=C雙鍵的反應形成共價連結所引起的鍵結,咸信U型鹼基核苷酸將具有鍵結有效性對應於T型鹼基核苷酸的鍵結有效性。
一具體例中,X型鹼基核苷酸的延伸部包含T型鹼基核苷酸及U型鹼基核苷酸二者,如交替之T型鹼基核苷酸及U型鹼基核苷酸。
終端錨鏈部分的N核苷酸序列可位於核酸探針的任一端。一具體例中,終端錨的N核苷酸序列位於5’-端。 一具體例中,終端錨的N核苷酸序列位於3’-端。
一具體例中,核酸探針於其5’-端或於其3’-端二者具有終端錨,其中於各別5’-端及3’-端的N核苷酸序列可彼此相等或不同。
核酸探針的捕捉部分可包含DNA、RNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA;其寡核苷酸、其區分;或其任何組合。
一具體例中,捕捉部分包含2’O-甲基 RNA,其為通常使用之RNA類似物,其中甲基係經加成至核苷的核糖部分體的2’-羥基而藉此形成甲氧基。
DNA可為形式例如,A-DNA、B-DNA 或Z-DNA。RNA可為形式例如p-RNA,亦即吡喃糖基-RNA或 結構修飾形如髮夾RNA或莖-環RNA。
用語「PNA」意指肽核酸,其為使用於生物研究及醫藥處置的類似於DNA或RNA的人工合成的聚合物 ,但其未知於天然發生。PNA骨架可由藉肽鍵鏈結的重複N-(2-胺基乙基)-甘胺酸單元所組成。
用語「HNA」意指己醇核酸,亦即由標準核鹼基及磷酸化1,5-去氫己醇骨架所構成的DNA類似物。
用語「LNA」意指鎖核酸。典型地,鎖核酸為經修飾且因而難以接近RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分體可例如以額外的橋接連接2’及4’碳而經修飾。
用語「ANA」意指***糖核酸或其衍生物。
用語「CNA」意指胺基環己基乙烷核酸。再者,關於環戊烷核酸的用語,亦即包含例如2’-去氧碳鳥苷(deoxycarbaguanosine)的核酸分子。
一具體例中,核酸探針的捕捉部分可包含DNA、RNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA或其區分的任一者的組合。
一具體例中,核酸探針的捕捉部分,如本文所定義之核酸分子可呈形式為短寡核苷酸、長寡核苷酸或多核苷酸。
一具體例中,核酸探針的捕捉部分為單股。一具體例中,核酸探針的捕捉部分為雙股。
一具體例中,核酸探針係由天然來源獲得或全部或部分合成。
一般而言,期望至少核酸探針的終端錨鏈部分為至少部分合成,較佳地為全部合成。
一具體例中,全體核酸探針為單股。
一具體例中,核酸探針至少於其長度的一部分為雙股,如於其捕捉部分的一部分。
捕捉部分原則上可為能捕捉標靶組份的任何種類的部分體。
一具體例中,捕捉部分包含引子,如適用於引子延長的引子。引子延長係使用於例如RNA的5’端序列映射(mapping)的技術。引子延長可使用於例如測定轉錄的起始位點。
一具體例中,捕捉部分包含具核苷酸序列的雜交鏈部分,如適用於雜交標靶核酸探針的互補區域的核苷酸序列及/或適用於進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)測試的核苷酸序列。當由引子/經固定於一固體支撐的探針進行PCR時,其亦可稱為固相PCR或SP-PCR。
一具體例中,捕捉部分適用於黏合互補標靶DNA配合如微陣列雜交、PCR、LAMP、WEA(全基因體擴增)、HAD、固相PCR的應用。
恆溫環式擴增(LAMP) 使用辨識標靶DNA的6至8個不同區域的4至6個引子。股置換DNA聚合酶起始合成及引子之二者形成環結構以助於後續的擴增運作。LAMP為快速的,且擴增為非常強力的而反應期間目視可見焦磷酸鎂的產生,使得LAMP非常適合於現場診斷。
股置換擴增(SDA)依賴於股置換DNA聚合酶,典型地為 Bst DNA聚合酶,大片段或Klenow片段 (3’-5’ exo–),於由股限定限制核酸內切酶或缺口製造酵素於含有引子的位點所創造的缺口(nick)起始。缺口位點係於各聚合酶置換步驟產生,造成指數式擴增。SDA典型地使用於臨床診斷。
螺旋酶依賴型擴增(HDA)利用螺旋酶的雙股DNA解旋活性將股分開,使引子能黏合及藉由股置換DNA聚合酶延長。如同PCR,此系統僅需要二個引子。HDA已應用於樹種診斷裝置及FDA核准的試驗。
缺口製造酵素擴增反應 (NEAR)利用固置換DNA聚合酶於由缺口製造酵素所創造的缺口起始,由標靶序列快速地製造許多短的核酸。此步驟為極端快速且敏感,能於分鐘間偵測小的標靶量。NEAR通常是用於臨床及生物安全應用上的病原偵測。
實時聚合酶鏈鎖反應(Real-Time PCR),亦已知為定量聚合酶鏈鎖反應 (qPCR),為基於聚合酶鏈鎖反應(PCR)的怎生物學實驗室技術。其餘PCR期間偵測標靶DNA分子的擴增,亦即,實時的,而非如同傳統PCR於其終點偵測。
有利地,捕捉部分包含多至約200核苷酸,較佳為較短的核苷酸鏈。一具體例中,捕捉部分包含具有由約4至約100核苷酸的核苷酸鏈,如由約10至約50核苷酸,如由約20至約30核苷酸。
捕捉部分可直接連結至終端錨鏈部分。
一具體例中,捕捉部分係經由間隔子,如無鹼基間隔子,如重複樹目的間隔子,連結至終端錨鏈部分。
間隔子的實例包括Spacer C3、PC (光可裂解)間隔子、己二醇間隔子、Spacer 9、Spacer 18、1’,2’ -二去氧核糖(dSpacer)、及核苷酸(A, T, G, C)間隔子。
Spacer C3為使用於將短的間隔子帶至併入寡核苷酸的3-碳間隔子。 如果需要較長的間隔子,Spacer C3可以連續的加成方式併入。Spacer 9為9個原子(6個碳+3個氧)長的三乙二醇鏈,且係使用於將間隔子帶至併入寡核苷酸。 當需要較長的間隔子,Spacer 9可以連續的加成方式併入。Spacer 18為18個原子(12個碳+6個氧)長的六乙二醇鏈,且係使用於將長的間隔子帶至併入寡核苷酸。當需要較長的間隔子,Spacer 18可以連續的加成方式併入。
此等及其他適合的間隔子例如可由Gene Link, Inc. NY, USA 或Bio-Synthesis Inc. TX USA購得。
一具體例中,終端錨鏈部分係位於核酸探針的5’-端或3’-端及捕捉部分H係位於5’-端或3’-端的另一者。
一具體例中,核酸探針包含於5’-端及3’-端二者的終端錨鏈部分及捕捉部分係位在介於視需要具有介於其中的間隔子的終端錨鏈部分之間。
對於某些應用,期望核酸碳針包含標記。其他應用或相同應用中,該標靶組份帶有標記。當二者帶有標記,可期望標記為不同。標記原則上可為任何種類的標記。
一具體例中,核酸探針包含標記,如放射活性標記或螢光標記,如菁染料,例如,Cy3 (1,1’-雙(3-羥基丙基)-3,3,3’,3’-四甲基吲哚碳菁)或Cy5(1,1’-雙(3-羥基丙基)-3,3,3’,3-四甲基吲哚二碳菁)。
菁染料係於可見光波長顯現強力及安定的螢光的寡核苷酸的重要的化學修飾物。菁染料具有尖銳的吸收帶、高激發係數、優異的光褪色耐性且使DNA及其他寡聚物具有高度螢光,甚至可吸收單一分子。
核酸探針可藉由如點位(spotting)的任何方法設置於固體支撐的表面。
用語「點位」及「印刷」於本文中可交換使用。
有利地,點位包含將溶劑中的核酸碳針點位至固體支撐的表面。
點位例如可使用自動點位機及/或噴墨印刷機進行,例如如同電腦印刷機使用相同技術噴出奈升(nanoliter)至微微升(picoliter)容積的探針溶液液滴,替代印墨,至固體支撐的表面。替代地,該等探針可與針應用,直接至該固體支撐表面的特定位置。
有利地,該核酸探針係於溶劑中設置於固體支撐。溶劑中核酸探針的最適濃度大幅地取決於核酸探針的長度。然而,已發現當使用具有如上文所述的較佳終端錨鏈部分時,核酸探針的濃度可增加。
一具體例中,核酸探針係於溶劑中以濃度多至100 µM點位,如以濃度由約1 µM至約 80 µM,如由約3 µM 至約70 µM,如由約 5 µM 至約 60 µM。一具體例中,核酸探針係於溶劑中以濃度多至約800 ng/µL點位,如由約1 ng/µL 至約500 ng/µL。
各別點位,例如可具有容積由約0.1 nL至約1 nL,如由約0.05 nL 至約1 nL,如由約0.1 nL至約0.8 nL,如由約0.3 nL至約0.6 nL。
合適溶劑的實例包括SSC(生理鹽水檸檬酸鈉)、DMSO(二甲基亞碸)、NaHPO4 (磷酸二氫鈉)、SDS(硫酸十二烷基鈉)及NaOH(氫氧化鈉)。進一步的實例包括 Triton X-100與SSC組合。
點位於固體支撐後,例如,藉由使其乾燥將核酸探針乾燥。之後,將包含核酸探針的固體支撐進行UV處理。
實際上,固體支撐可為任何種類的材料或其組合。有利地,個體支撐為聚合物支撐或玻璃支撐,較佳地該支撐包含聚苯乙烯(PS)、環狀烯烴共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚-甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或包前述聚合物之一種或多種的混合物。
固體支撐可為層合支撐。
一較佳具體例中,固體支撐包含或為聚苯乙烯(PS)。較佳地,酯少核酸探針點位處之固體支撐的表面為PS表面。一般而言,期望基材為非發泡的,且通常具有低摩擦及平滑的表面。
固體支撐可有利地為注射模鑄固體支撐。注射模鑄固體支撐視需要地可接受模鑄後表面修飾,利用富含氧的電漿於固體支撐的表面導入極性基團。此特別有利的為該表面適合於疏水性特徵。
由於核酸的固定有效性,可不需要製造任何前處理或加成任何官能基至固體支撐。
因此一具體例中,固體支撐表面主要地無胺基、亞甲基、硫醇基、環氧基、重氮基或醯胺基之一者或多者,較佳地該支撐表面無胺基、亞甲基、硫醇基、環氧基、重氮基或醯胺基之全體。
固體支撐可有利地為匣、ELISA分析盤、測試管、微孔盤、或其任何組合,或形成其等之一部分。
該等分析裝置通常為習知且主要地其任一者可形成固體支撐。
一具體例中,固體支撐為匣或形成匣之一部分,該匣包含通道其具有定義該通道之通道表面,其中該固體基材的表面形成該通道表面的至少一部分。
一具體例中,該通道包含反應段及該方法包含將核酸探針固定於該通道的反應段內的表面。該反應可為通道的長度段。
一具體例中,反應段包含至少一光學元件。該光學元件有利地可構築為重新導向或較佳地準平行於螢光標記(螢光團)所發出的光或連結至經固定的核酸探針。
一具體例中,光學元件包含透鏡結構及/或超臨界角螢光結構 (SAF結構),該SAF結構較佳地具有頂表面及該方法包含將核酸探針固定於該頂表面。
光學元件有利地具有錐、截頭錐型,如下文進一步說明。
有利地,固體基材為或形成試驗裝置的一部分,如下文進一步說明。
固體支撐可有利地為微流體匣,如揭示於WO17133741的流體匣,該文獻以參考方式併入本文。一具體例中,固體支撐係藉由WO17133741 所揭示的SAF結構提供及核酸探針係固定於SAF結構的頂表面。
已發現核酸探針可適用低劑量的UV光固定於固體支撐,藉此確保損傷核酸探針的捕捉部分的風險相對為低或甚至可避免。
一具體例中,核酸的錨鏈部分係藉由使其接受包含波長範圍由約250nm至500nm的UV光錨定至固體支撐,較佳地包含波長至少約254nm、約265nm及/或約365nm者。
一具體例中,核酸的錨鏈部分係藉由使其接受使用非常低劑量的能量的UV光錨定至固體支撐,例如由約0.2 Joule/cm2
至約1 Joule/cm2
,如約 0.3 Joule/cm2
或更多。
一具體例中,核酸的錨鏈部分係解由使其接受能量的量由約0.4 Joule/cm2
至約15 Joule/cm2
的UV光錨定至固體支撐,如由約1 Joule/cm2
至約10 Joule/cm2
,如由約1.5 Joule/cm2
至約6 Joule/cm2
,如由約1.6 Joule/cm2
至約3 Joule/cm2
,如由約1.7 Joule/cm2
至約2 Joule/cm2
。
一具體例中,藉由將帶有經點位及經乾燥的核酸探針的固體支撐暴露於UV照射至少30秒固定核酸探針,如由約1至約8 分鐘,如由約2 至約6 分鐘。UV照射,可藉由例如UV發射器提供,如3至12 W UV發射器,如5至10 W UV 發射器。
所發射的UV光僅有小量到達及影響核酸探針。因此,當計算能量的量時,固體支撐係取決於UV發射器及固體支撐之間的距離的每面積單位,以及必須考慮發射光束的分歧。
本發明亦包含藉由上述方法所獲得之包含經固定的核酸探針的固體支撐。
咸信紫外光藉由位於C=C雙鍵的反應而誘發共價鏈結的形成。嘧啶二聚物係經由光化學反應由DNA的胸腺嘧啶或胞嘧啶形成損害所形成的分子損害。所以理論上,DNA分子本身的損傷實際上創造核酸與PS之間的鍵結。
如上文所解釋的,核酸探針的終端錨鏈部分造成對如PS固體支撐之固體支撐的固定有效性增加。推論此係因為UV光藉由位於C=C雙鍵的反應而誘發共價鏈結的形成。如下文實施例所示,相較於20T10
C10
多為尾,42TTCCTT7
多尾增加至少18倍固定有效性。多尾的命名係如下所述。第1個數字指稱終端錨鏈部分(多尾)的總長度,文字指稱核苷酸型及上標的數字指示所述核苷酸序列的重複次數。
於固體支撐的表面的結構及鍵結,可使用例如X射線光電頻譜學的表面分析,例如揭示於”SURFACE CHARACTERIZATION OF POLYMERS BY XPS AND SIMS TECHNIQUES” 作者Janez Kova, Materials and technology 45 (2011) 3, 191—197,予以檢測。
本發明亦包含如上文所述的核酸探針。
新穎的核酸探針係能固定至固體支撐具有增加的固定有效性。核酸探針包含終端錨鏈部分及捕捉部分,其中該核酸探針的終端錨鏈部分包含N核苷酸序列或與其至少90%相似性的序列,該N核苷酸序列由具有胞嘧啶(C)型鹼基的中間核苷酸的X型鹼基核苷酸的延伸部組成,其中該X型鹼基核苷酸的延伸部彼此獨立地包含2至5個核苷酸,其中N為至少18。
較佳的核酸探針係如上文所述的核酸探針。
特別較佳的核酸探針為其中N核苷酸序列包含下式型鹼基核苷酸的重複亞序列的核酸探針 (-(X)Y
-(C)Z
-)M
, 其中,Y、Z及M係如上文所述。
另一特別較佳的核酸探針為其中N核苷酸序列包含下式型鹼基核苷酸的重複亞序列的核酸探針 (-(X)Y2
-(C)Z-
(X)Y2
-)M
, 其中, Y、Z及M係如上文所述。
本發明亦關於測試裝置,其適合使用於上述方法。
測試裝置包含固體支撐,該固體支撐可為上文所述之固體支撐。固體支撐包含至少一超臨界角螢光結構 (SAF結構)。SAF結構具有錐、截頭錐型具有截頭錐角α、頂表面、頂直徑D及高度h。
最適截頭錐角正常將等於螢光團發射其最多光的角度。此角度取決於各別的SAF結構與圍繞且接觸SAF結構的介質的二個折射率,亦即空氣或樣品流體,如水或水性流體,其正常具有相等於水的折射率。已發現對於水/PS介面最佳為60度,而對於空氣/PS介面較佳為50度。
截頭錐角α例如可為由約 40o
至約70o
,如由約55o
至約65o
,如約60o
。
一般而言,期望截頭錐角α為由約30o
至約70o
,如由約35至約65,如由約40o
至約60o
,如約40o
或約60o
。 一具體例中,其中SAF結構為聚苯乙烯且其適用於使用空氣圍繞且於SAF結構的表面形成空氣/聚苯乙烯介面,截頭錐角α有利地為由約35o
至約55o
。 一具體例中,其中SAF結構為聚苯乙烯且其適用於使用水(例如,水性樣品流體)圍繞且於SAF結構的表面形成空氣/聚苯乙烯介面,截頭錐角α有利地為由約55o
至約65o
。
使用核酸探針可點位至SAF結構的頂表面及乾燥,例如本文他處所述者。
有利地,SAF結構的高度為至少約0.2 mm,如由約0.25 mm至約0.5 mm,如由約0.3 mm至約0.35 mm。已發現為了獲得最適信號,高度為重要的。
有利地,頂直徑為由約0.05 mm至約0.5 mm,如由約0.1 mm至約0.3 mm,一般而言,期望一個或較佳為多個SAF結構為相對小,因為此將使得於相同的測試裝置有更多的SAF結構。藉此,其中頂直徑為非常小的某些核酸探針可點位於頂表面的邊緣或甚至頂表面側。因此,具有非常小的頂直徑的SAF結構,例如其中D為小於約0.2,可具有低穩健性的點位。
已發現藉由確保至少一個SAF結構相較於其頂直徑為非常高,所獲得的讀出信號具有非常好的強度。有利地,SAF結構具有頂直徑對高度的縱寬比D/h,為約1.1或更小,如約1.05或更小,如約1或更小。
固體支撐較佳地可為聚合物支撐或玻璃支撐。較佳地,支撐包含聚苯乙烯(PS)、環狀烯烴共聚物(COC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或包含前述聚合物之一者或多者的混合物或組合。
支撐材料有利地可為至少對於信號波長為透明的,該信號波長係期望讀出或用於激發。
例如, Cy3綠黃色螢光(~550 nm 激發,~570 nm發射
),而Cy5係紅色區域螢光 (~650激發,670 nm發射)。
一具體例中,支撐材料對於可見光範圍內及外的一或多個波長為特明的。
一具體例中,SAF結構為具有縱寬比D/h,為約1.1或更小的PS SAF結構。
一具體例中,至少一個SAF結構的頂表面具有頂表面凹部。已發現該頂表面凹部可改良SAG結構的點位穩健性及確保經點位的核酸探針如所期望的為於SAF結構中心。由此可降低損失信號的風險。
頂表面凹部有利地為圓形。然而,其可為其他形狀如卵形或角形。
有利地,頂表面凹部具有中心軸,其係平行於SAF結構的中心軸。凹部中心軸有利地最多偏移約0.2mm,如由SAF結構的中心軸最多偏移約0.1 mm 。較佳地,該表面凹部的中心軸重合於SAF結構的中心軸。
有利地,凹部具有實質平的凹部底板。凹部例如可具有直徑d,其為約頂直徑D的10%或更大,如頂直徑D的由約15 %至約80 %,如由約20 %至約50。凹部直徑d通常期望由約0.01至約0.2,如由約0.25至約0.1
有利地,於頂表面圍繞凹部的邊緣具有寬度至少0.01 mm。實際上,製造具有頂表面凹部及具有寬度低於0.005的圍繞邊緣的SAF結構可能為高價的。另一方面, 非常大的邊緣寬度,如0.1或更大或甚至0.2或更大,可能造成非常小的凹部直徑d,對於某些應用可能為非期望的。
已發現凹度有利地應不過高而此可降低讀出信號。期望凹部高度h1較佳地應小於SAF高度h的25%,如小於SAF高度h的20%。
一具體例中,凹部高度h1為約0.05或更小,如約0.02或更小。
凹部邊緣可為尖的或圓形。一具體例中,凹部具有圓形凹部邊緣,較佳地該凹部邊緣為具有圓形半徑R的圓形,該半徑為約0.1 mm 或更小,如介於 0.01及0.8 mm之間。
一較佳具體例中,凹部具有錐、截頭錐形具有由底板所形成的表面所形成的頂表面。因此,凹部錐、截頭錐形相對於SAF錐、截頭錐形為上下翻轉。
較佳地,凹部錐、截頭錐形具有凹部截頭錐角θ,其為由約40o
至約70o
,如由約55o
至約65o
,如約60o
。已發現凹部截頭錐角θ接近截頭錐角α處,信號增加,如多達 5度差異,較佳多達 2度差異。較佳地,凹部截頭錐角θ係時直上相等於截頭錐角α。
較佳地,測試裝置為匣或匣之一部分,該匣包含通道具有定義該通道之通道表面,其中該固體基材包含至少一SAF結構形成於該通道表面的至少一部分。
匣可有利地為揭示於WO 2017/133741的微流體匣,與本文所述的SAF結構具有差異。
本發明之上述及/或其他的目的、特徵及有利點將參照隨附圖式,藉由下述本發明之具體例及實施例的說明及非限制性的敘述進一步予以闡明。
本發明的應用性的進一步範疇將由下文所提供的敘述而為明暸。然而,應理解敘述及具體的實施例,雖然指稱為本發明的較佳具體例,僅作為闡明之意而提供,而本發明的精神與範疇內的各種變化及修改可為所屬技術領域中具有通常知識者由此敘述及實施例所理解。
使用用於附接TC-標籤DNA寡核苷酸於各種基材的簡單UV交聯製程流程。該製程流程係對應於Sun Y, Perch-Nielsen I, Dufva M, 等人之 “Direct immobilization of DNA probes on non-modified plastics by UV irradiation and integration in microfluidic devices for rapid bioassay”. Anal Bioanal Chem. 2012;402(2):741-748. doi:10.1007/s00216-011-5459-4所揭示者。
相較於其它者,已顯示技術不僅具有高變通性也具有高的熱安定性。此研究中,此方法使用於固定經標記多尾及經標記核酸探針至PS固體支撐。使用於下述實施例的標記為螢光染料。使用「Quasar 570」及「Cy3」作為螢光染料。
實驗中使用的數種不同的經標記多尾及核酸探針係列於下表1。
數5、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22及29的核酸探針或包含多尾的核酸探針為本發明的實施例。其餘的核酸探針或包含多尾的核酸探針為比較例。
此實施例中,核酸探針或包含多尾的核酸探針的數為6、9、 10、 1、 2、 3、 4、 5、 7、 8 (如示於圖1的順序)。
多尾/核酸探針以具有0.04% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA)的5 × 生理鹽水檸檬酸鈉(SSC)緩衝液(Promega, WI, USA)稀釋。多尾/核酸探針溶液使用非接觸sciFLEXARRAYER S11點位機 (Scienion, Germany)點位於乾淨的PS玻片。個多尾/核酸探針溶液係點位於四個連續點。乾燥後,玻片於Ultraviolet Crosslinkers (UVP, Fisher Scientific, Denmark)於254 nm以1.8 Joule/cm2
暴露於UV照射以將多尾/核酸探針固定至該基材表面。
之後該固體支撐(PS玻片)使用由Millipore Corporation獲得的milliQ水清洗5分鐘。MilliQ水為如同各種專責機關(例如,ISO 3696)所定義的「第1型」的「超純水」。
UV暴露後如下述測量及決定固定有效性(固定百分比) 固定有效性係計算如下述方程式:= 清洗的固定有效性。
結果顯示於圖2。可觀察到多尾40TC20
(如上所列的數5多尾)相較於比較多尾具有最高的固定有效性。 實施例 2
此實施例係以圖3所示製程圖進行如下。
使用具有不同多尾的不同長度及構型的TC多尾/核酸探針。所使用的經標記多尾/核酸探針係如下述(如圖4所是由左至右的順序)的數12、 5、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 22、 19、 20、 21、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30。
使用實施例1所述相同步驟固定多尾/核酸探針。之後清洗固體支撐。
點位及UV交聯後藉由顯微鏡獲得不同多尾/核酸探針的信號。其次玻片以 0.1 x 生理鹽水檸檬酸鈉(SSC)緩衝液清洗5分鐘及於 MilliQ水中清洗另外5分鐘以移除未附接的探針及螢光信號。
成像固體支撐及如下述方程式計算固定有效性:= 清洗的固定有效性。
對於各多尾/核酸探針之清洗後的固定有效性係示於圖4第一欄。 實施例 3
然後經固定及經清洗的多尾/核酸探針接受對應於嚴苛的SP-PCR熱循環機處理條件的處理條件。
經固定的多尾/探針藉由PCR程式接受不同溫度,94˚C 2分鐘後為30個循環的94˚C 10秒、 60˚C 20秒、 72˚C 20秒,然後另一個15PCR循環的94˚C 10秒、 65˚C 20秒、72˚C 20秒。多尾於平板床PCR熱循環機 (Proflex, Thermo fisher)中測試且獲得螢光信號。
PCR熱循環機處理後得固定有效性係如下述計算:= 熱循環機(2)的固定有效性。
對於各多尾/核酸探針的PCR熱循環機處理後的固定有效性係示於圖4第二欄。
可觀察到清洗後及特別是PCR熱循環機處理後的固定有效性對於本發明的核酸探針為大幅較高。特別地,上述較佳核酸探針顯示意外高的固定有效性。
實施例2及3的PS玻片固體支撐所獲得的成像示於圖5。清楚地,具有含更多T型鹼基的多尾的核酸探針,具有優異高的固定有效性。 實施例 4
合成3個不同核酸探針,包含a) 根據本發明具體例之第1核酸探針,具有核苷酸序列 40TTTTC8
的多尾及靶定hilA基因的捕捉部分, b)根據本發明具體例的第2核酸探針具有核苷酸序列 42TTCCTT7
的多尾及靶定hilA基因的捕捉部分及c) 比較核酸探針具有核苷酸序列20T10
C10
的多尾及用於偵測沙門氏菌屬的hilA基因的捕捉部分。該等核酸探針示於圖6。
該等核酸探針以不同濃度範圍由1 µM至 60 µM點位於固體支撐(PS基材)。
製備25 µL 的SP-PCR反應混合物。SP-PCR混合物由1 × Phusion® Human Specimen PCR緩衝液(Thermo Fisher Scientific)、400 nM 的hil
A前置引子及1600 nM的hil
A反置引子、
及 0.05 U/µL Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA 聚合酶 (Thermo Fisher Scientific)所組成。使用基因框(Gene Frame)(Thermo Fisher Scientific)製造圍繞固體支撐引子陣列的25 µL反應室。藉由滴管將PCR主混合物裝載至基因框且以蓋玻片密封。PS玻片係經以核酸探針點位。於平板床PCR熱循環機進行SP-PCR,其中使用1cm後的聚苯乙烯絕緣發泡體片隔開玻片與PCR熱循環機上蓋。SP-PCR條件為: 94˚C 2分鐘後30個循環的94˚C 10秒、 60˚C 20秒、 72˚C 20秒,然後另外15個PCR循環為94˚C 10秒、65˚C 20秒、72˚C 20秒。較高的黏合溫度使用於後段的15個PCR循環以增強SP-PCR。SP-PCR後,該室以 0.1 × SSC及0.1% 時按完基硫酸鈉(SDS)(Promega, WI, USA)清洗5分鐘後以去離子水潤洗且於室溫乾燥。玻片可進行掃描。
SP-PCR後,玻片使用顯微鏡(ZEISS Axiovert 200, Germany)掃描。微陣列影像係使用ImageJ 軟體(Molecular devices)分析。拉出圓圈且調整點的尺寸,測定平均光強度值作為信號。拉出附近的另一圓圈使用作為背景。此研究的信號係定義為陣列上4點的信號,去除平均背景。
圖7顯示SP-PCR後於不同核酸探針濃度所得的固定有效性。可容易地觀察到本發明的核酸探針相較於比較核酸探針具有大幅較高的固定有效性。
圖8為對照探針及二個不同捕捉部分的影像-靶定沙門氏菌的Flic基因及靶定博德特氏細菌的Brtz基因。對照探針使用多尾42TTCCTT7
。
如圖7所示,靶定沙門氏菌屬的多尾42TTCCTT7
於SP-PCR之後相較於之前顯示相同的圓形,此意味42TTCCTT7
多尾有助於整體探針以非常高的鍵結有效性固定於表面。
示於圖9a之用於進行SP-PCR的第一製程流程為標準製程流程。
示於圖9b之用於進行SP-PCR的第二製程流程為新穎的SP-PCR製程,其已因本發明而成為可利用。由於本發明的核酸探針及方法所提供的高固定有效性,SP-PCR可進行UV交聯(固定)後無清洗及/或SP-PCR步驟後無清洗。
圖10a為具有經點位的核酸探針的固體支撐接受有及吳清洗的SP-PCR的影像。 實施例5
實施例5中使用代表本發明具體例的實施例5的二個核酸探針,亦即核酸探針 a) 根據本發明具體例的第1核酸探針具有核苷酸序列 40TTTTC8
的多尾及靶定hilA基因的捕捉部分及b) 根據本發明具體例的核酸探針具有核苷酸序列42TTCCTT7
的多尾及靶定hilA基因的捕捉部分。
點位及SP-PCR過程係使用核酸探針濃度 60 µM依照實施例4的過程進行。
示於圖10a的結果為清洗前及清洗後。圖10b顯示有清洗及無清洗之進去背景的信號平均且可觀察到於無清洗樣品中有相對低量的偽陽性。 實施例 6
數種不同的經標記多尾/核酸探針接受不同的UV暴露時間及不同的UV劑量用以固定。所使用的多尾/核酸探針示於圖1。
多尾/核酸探針係如實施例1所述點位於固體支撐但利用不同的UV暴露。
各多尾/核酸探針的四個點由8W UV發射器接受UV暴露3分鐘。各多尾/核酸探針的四個點由16W UV發射器接受UV暴露8分鐘。
結果示於圖11,其中左圖對於各多尾/核酸探針為8W UV發射器3分鐘處理及右圖對於各多尾/核酸探針為16W UV發射器接8分鐘處理。其顯示8W UV發射器3分鐘處理較佳於16W UV發射器8分鐘處理。
具有序列40 T/C(亦稱為40TC20)的經標多尾使用於此測試。多尾的樣品係如實施例1所述點位於固體支撐但利用不同UV暴露。
對於某些樣品使用8W UV發射器及對於其他樣品使用16W UV發射器。暴露時間係示於圖12,其中清洗後的固定有效性係以對於各樣品的二個發射器的暴露時間為函數作圖。
可觀察到較低瓦數(8Watt UV發射器)較佳於較高瓦數發射器。再者,8W發射器具有固定最適操作3分鐘,其意味核酸探針可以低UV劑量固定,而由於捕捉部分的損傷風險解此可降低甚至避免為高度有利的。
於本發明之一具體例中使用具有核苷酸序列40TTTTC8的多尾及靶定hilA基因的捕捉部分的核酸探針。
合成3個不同的核酸探針及c)比較核酸探針具有核苷酸序列20T10
C10
的多尾及具有用於偵測沙門氏菌屬的基因的捕捉部分。該等核酸探針示於圖6。
圖13a至13e顯示使用8W UV發射器於清洗前及清洗後以不同UV暴露所獲得之經固定多尾的影像。
圖14a至14c顯示使用16W UV發射器於清洗前及清洗後以不同UV暴露所獲得之經固定多尾的影像。 實施例8
測試具有不同長度多尾的核酸探針。該等核酸探針包含靶定博德特氏細菌的Brtz基因。
核酸探針如實施例1所述製程點位、固定及清洗。圖15a顯示對於各種核酸探針減去背景的信號。可觀察到具有非常短多尾的核酸探針難以固定及具有18或更多核苷酸的多尾的本發明具體例的核酸探針顯示有效的固定。圖15b為經固定核酸探針的影像。 實施例 10
測試具有多尾42TTCCTT7
及靶定博德特氏肺炎細菌的捕捉部分之本發明具體例之核酸探針樣品。
核酸探針樣品係如實施例1所述製程點位、固定及清洗但使用不同UV暴露時間。固定後,樣品接受如實施例2所述之SP-PCR處理。
SP-PCR處理後,測定對於各樣品之減去背景信號的信號。圖16a顯示結果且可觀察到若本發明具體例可使用非常低的UV劑量獲得核酸探針的有效固定。
圖16b為經固定的核酸探針的影像。
SAF結構1對應於WO17133741所揭示的SAF結構且進一步的詳細內容可鑑於該文獻。SAF結構係安裝於微流體匣之通道的反應段的底2。經以螢光團標記之本發明具體例的核酸探針3係安裝於SAF結構1的頂表面。
SAF結構1具有錐截頭錐形,其具有頂表面。SAF結構1具有突出高度、頂表面直徑、及底直徑。激發的螢光團發射光各項異性地至SAF結構-相較於反應段中的樣品、空氣或液體其具有較高折射率-具有角於其上的超臨界角(Өc)。所發射的光係準平行且可藉由判讀儀以光圓圈讀出。
圖18為具有邊緣12的匣的反應通道的段的透視圖,其中反應段包含具有經固定的核酸探針的SAP結構11,其已接受SP-PCR。
圖19顯示SAF結構載明有點部分以顯示截頭錐角α。 SAF結構 21具有底周緣24其係安裝至或整合於固體支撐的其餘部分。關於其底周緣,SAF結構具有底直徑 db
。SAF結構具有頂表面23,其具有直徑D。由底至頂表面,SAF結構具有高度h。說明的頂部分為示意的頂,顯示截頭錐角。
圖19a至19d說明標準SAF結構31,包含頂表面3。該SAF結構洗與固體支撐32的其餘部分整合。僅顯示某些該固體支撐的其餘部分。如上文所解釋,該固體支撐可與通道形成匣或其可為匣的一部分。
圖19a為SAF結構31的透視圖。
圖 19b為SAF結構31的頂視圖 。
圖 19c 為SAF結構31的側視圖。
圖 19d為可見於圖19c的段A-A的SAF結構31的截面圖。
SAF結構具有高度h及頂直徑D。D及h可彼此獨立地如本文他處所揭示者。SAF結構31係說明具有截頭錐角60度。應理解SAF結構可具有如本文他處所揭示的其他截頭錐角。
可觀察到頂表面為平的。
一具體例中,SAF結構1具有下述維度: D=0.2 mm;h =0.25 mm 及 SAF 截頭錐角 α為 60度。
圖20a至20d說明較佳的SAF結構41,包含具有凹部44的頂表面43。SAF結構係與固體支撐42的其餘部分整合。
圖 20a為SAF結構41的透視圖。
圖 20b為SAF結構41的頂視圖 。
圖 20c為SAF結構41的側視圖。
圖 20d為可見於圖20c的段A-A的SAF結構41的截面圖。
圖 20e 顯示圖20a的一部分,其中,凹部邊緣寬度W經標記。凹部邊緣寬度W有利地至少約0.008,如至少約0.01,如至少約0.015。
SAF結構具有高度h及頂直徑D。D及h可彼此獨立地如本文他處所揭示者。SAF結構高度係由無凹部44的頂表面43測定。
凹部具有高度h1,其可如本文他處所揭示者。
凹部實質上為圓形且係位於使其中心軸重合於SADF的中心軸。凹部具有高度h1,其可如本文他處所揭示者。
可觀察到,凹部底板實質上為平的。凹部直徑d係於凹部底板測定且可如本文他處所揭示者。
凹部具有藉由底板所形成之具有頂表面的錐、截頭錐形。
所示具體例中,截頭錐角 θ及截頭錐角 α接為60度。應理解凹部截頭錐角 θ及SAF 截頭錐角 α可具有本文他處所揭示的其他值。
凹部增加點位穩健性及增加讀出信號強度。
一具體例中,SAF結構41具有下述維度: D=0.2 mm,h =0.25 mm,d =0.05 mm,h1 = 0.01 mm,SAF 截頭錐角 α為60度及凹部截頭錐角 θ為60度。
另一具體例中,SAF結構41具有下述維度: D=0.2 mm,h =0.3 mm,d =0.05 mm,h1 = 0.01 mm,SAF 截頭錐角 α為60度及凹部截頭錐角 θ為60度。
圖21a至21d說明另一較佳SAF結構51,包含具有凹部54的頂表面53。SAF結構影與固體支撐52的其餘部分整合。
圖 21a為SAF結構51的透視圖。
圖 21b為SAF結構51的頂視圖。
圖 21c 為SAF結構51的側視圖。
圖 21d 為可見於圖21c的段A-A的SAF結構51的截面圖。
SAF結構具有高度h及頂直徑D。D及h可彼此獨立地如本文他處所揭示者。SAF結構高度係由無凹部54的頂表面53測定。
凹部54具有高度h1,其可如本文他處所揭示者。
凹度時值上為圓形且位於使其中心軸重合於SAF的中心軸。凹部具有高度h1,其可如本文他處所揭示者。
可觀察到,凹部底板實質上為平的。凹部直徑d係於凹部底板測定且可如本文他處所揭示者。
凹部具有圓形半徑R的圓形凹部邊緣,其可如本文他處所揭示者。
一具體例中,SAF結構51具有下述維度: D=0.2 mm;h =0.25 mm,d =0.08 mm,h1 = 0.01 mm, 凹部邊緣為圓形具有半徑R=0.05 mm 及SAF 截頭錐角 α為60度。
另一具體例中,SAF結構51具有下述維度: D=0.2 mm;h =0.3 mm,d =0.08 mm,h1 = 0.01 mm,凹部邊緣為圓形具有半徑 R=0.05 mm及 SAF 截頭錐角 α為60度。 實施例 11
由聚苯乙烯製造7個匣。各匣具有微流體通道,該為流體通道具有反應段及由反應段的壁突出的8個相同的SAF結構。
第1匣的SAF結構係塑形如圖22的SAF結構no.1; 第二匣的結構係塑形如圖22的SAF結構no. 等等。
SAF結構no.3係如圖19a至19d所示類型。
SAF 結構 no. 5係如圖21a至21d及SAF 結構 no. 6係如圖20a至20e所示類型。
等量的經Cy-3標記的寡聚物係點位至個別SAF結構各者的頂表面後其乾燥。
第一回測試中,反應室維持充滿空氣。Cy3-標記物接受光於激發波長(~550 nm)及偵測SAF結構發射信號的信號強度。
對於各匣,測定平均SAF結構的空氣/PS介面強度信號。
第二回測試中,各別匣的反應段將充滿水。Cy3-標記物接受光於激發波長(~550 nm)及偵測SAF結構發射信號的信號強度。
對於各匣,測定平均SAF結構空氣/PS介面強度信號。
結果示於圖23。
對於各別匣的SAF結構測定變異相關係數(CoV)。
可觀察到SAF結構no. 1 及2對於空氣/PS介面信號具有相對高的光強度。然而,對於空氣/PS介面信號強度及水/PS介面信號二者,CoV為相對高。
SAF結構no. 6對於水/PS介面信號及CoV具有最高的光強度。然而,對於空氣/PS介面信號強度及水/PS介面信號二者,CoV為相對高。
然而對於樣品6的CoV為相對高。咸信對於此相對高CoV的理由為某些SAF結構於其底周緣處與殘留的固體支撐整合,具有小的表面波紋及/或突起,其可造成信號損失。因此,期望藉由減低頂直徑對高度的縱寬比D/h,此可能的光信號損失可緩和。咸信藉由增加高度,例如至約0.3 mm,該信號可增強及CoV可減低。
SAF結構 no. 5對於水/PS介面信號具有最高光強度及低CoV。
咸信凹部的圓形邊緣確保非常有效及強力的點位,其增加至低CoV。
SAF 結構no. 6對於水/PS介面信號具有最高光強度及CoV。然而,對於空氣/PS介面信號強度汲水/PS介面信號,CoV為相對高。
1、11、21、31、41、51‧‧‧SAF結構
2‧‧‧底
3‧‧‧核酸探針
12‧‧‧邊緣
23、33、43、53‧‧‧頂表面
24‧‧‧底周緣
32、42、52‧‧‧固體支撐
44、54‧‧‧凹部
A‧‧‧段
α‧‧‧截頭錐角
D、d、db‧‧‧直徑
h、h1‧‧‧高度
R‧‧‧半徑
W‧‧‧寬度
圖1顯示根據本發明具體例之微流體匣的示意頂視圖在第一實施例中測試的經標記多尾數。 圖2顯示第一實施例中各別的經標記多尾的固定百分比。 圖3顯示進一步實施例中應用的製程。 圖4顯示進一步實施例中各別的經標記多尾數的固定百分比。 圖5為進一步實施例中多尾的點位影像。 圖6顯示本發明具體例的二個核酸探針及具有可比較多尾(終端錨鏈部分)的核酸探針。 圖7顯示圖6a及圖6b中核酸探針經標記的核酸探針的不同濃度影像。 圖8為對照探針及二個不同捕捉部分的影像-靶定沙門氏桿菌的Flic基因及靶定博德氏細菌的Brfz基因。 圖9a顯示進行SP-PCR的第一製程流程。 圖9b顯示進行SP-PCR的第二製程流程。 圖10a為具有經點位的核酸探針進行SP-PCR經及不經清洗的固體支撐的影像。 圖10b為平均信號減去圖10a的影像的背景的作圖。 圖11顯示使用不同UV暴露時間固定多尾/核酸探針的經標記多尾數及核酸探針數的固定百分比。 圖12顯示對於經標記多尾作為UV曝光時間函數的固定百分比。 圖13a至13e為清洗之前及之後以不同UV暴露時間所獲得的經固定多尾數及核酸探針數的影像,其中使用的UV發射為8W UV發射器。 圖14a至14c為清洗之前及之後以不同UV暴露時間所獲得的經固定多尾數及核酸探針數的影像,其中使用的UV發射為16W UV發射器。 圖15a顯示對於具有不同多尾的經標記的核酸探針數的信號減去背景的圖。 圖15b為圖15a之經固定的核酸探針的影像。 圖16a顯示對於使用不同時間的UV暴露經固定至固體支撐的經標記核酸探針的信號減去背景的圖,其中該經固定的核酸探針已接受SP-PCR。 圖16b為圖16a之經固定的核酸探針的影像。 圖17為包含經固定的核酸探針的SAF結構的截面圖。 圖18為匣的反應通道段的透視圖,其中該反應段包含具有經固定核酸探針的SAP結構,其已接受SP-PCR。 圖19為說明具有點狀頂部分以顯示截頭錐角α的SAF結構的透視圖。 圖19a至19d說明具有截頭錐角60度的標準SAF結構。 圖20a至20e顯示具有頂表面凹部的SAF結構。 圖21a至21d顯示具有頂表面凹部的另一SAF結構。 圖22顯示實施例11使用的7個不同的SAF結構。 圖23顯示實施例11的信號強度結果。 圖24顯示實施例11的變異結果的係數。 為了簡明,圖式係示意及簡化。全文中,相同的參照編號係使用於相等或對應部分。
Claims (25)
- 一種將核酸探針固定於一固體支撐的方法,該方法包括提供該核酸探針使包含終端錨鏈部分及捕捉部分,施用該核酸探針至該固體支撐的表面,以及藉由使其接受UV光將該核酸探針的錨鏈部分錨定至該固體支撐,其中,該核酸探針的終端錨鏈部分包含N核苷酸序列,該N核苷酸由具有胞嘧啶(C)型鹼基的中間核苷酸的X型鹼基核苷酸序列的延伸部所組成,其中,該N核苷酸的序列包含下式型鹼基的核苷酸的重複亞序列(-(X)Y-(C)Z-)M,其中,Y為1至5的整數,Z為1至5的整數,YZ及M為4至20的整數,或該N核苷酸的序列包含下式型鹼基的核苷酸的重複亞序列(-(X)Y2-(C)Z-(X)Y2-)M,其中,Y2為1至4的整數,Z為1至4的整數,Y2Z及M為4至20的整數,且其中各X型鹼基彼此獨立地指定為胸嘧啶(T)型鹼基或尿嘧啶(U)型鹼基。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中,該N核苷酸由具有胞嘧啶(C)型鹼基的中間核苷酸的X型鹼基核苷酸序列及鳥嘌呤型鹼基的一個核苷酸的延伸部所組成。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中,該核酸探針的終端錨鏈部分包含由具有C型鹼基的中間核苷酸的X型鹼基的2至5個核苷酸的延伸部所組成的N核苷酸的序列。
- 如申請專利範圍第4項的方法,其中Y為2至5的整數,Z為1至4的整數,Y>Z及M為4至20的整數。
- 如申請專利範圍第6項的方法,其中Y2為2至3的整數,Z為1至3的整數。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中,該捕捉部分包含引子及/或包含核苷酸序列的雜交鏈部分。
- 如申請專利範圍第8項的方法,其中,該捕捉部分包含引子及/或包含核苷酸序列的雜交鏈部分,且該核苷酸序列適用於雜交至目標核酸探針的互補區及/或適用於進行聚合酶鏈反應(PCR)檢測。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中,該核酸探針係藉由點位設置於該固體支撐的表面。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中,該固體支撐的表面為聚苯乙烯PS表面。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中,該固體支撐的表面無胺基、亞甲基、硫醇基、環氧基、重氮基或醯胺基之一者或多者。
- 如申請專利範圍第12項的方法,其中,該固體支撐的表面無胺基、亞甲基、硫醇基、環氧基、重氮基或醯胺基之全部。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中,該固體支撐為匣的一部分,該匣包含一通道其具有定義該通道的通道表面,其中,該固體基材的表面形成該通道表面的一部分以及其中該通道包含反應段,該方法包含將核酸探針固定於該通道的該反應段內的一表面。
- 如申請專利範圍第14項的方法,其中,該反應段包含一種或多種光學元件,其中,該光學元件包含透鏡結構及/或超臨界角螢光結構(SAF結構),該SAF結構具有一頂表面及該方法包含將該核酸探針固定至該頂表面。
- 如申請專利範圍第15項的方法,其中,該光學元件具有SAF結構,該SAF結構具錐、截頭錐型具有截頭錐角α、頂表面、頂直徑D及高度h,其中,該截頭錐角α由30°至70°,該頂直徑對高度之縱寬比D/h為1.1或更小及該SAF結構包含頂表面凹部。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中,該核酸的錨鏈部分係使其接受包含波長範圍由250nm至500的UV光錨定至該固體支撐。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中,該核酸的錨鏈部分係使其接受使用能量由0.2Joule/cm2至15Joule/cm2的UV光錨定至該固體支撐。
- 一種適合用於固定至固體支撐的核酸探針,該核酸探針 包含終端錨鏈部分及捕捉部分,其中,該核酸探針的終端錨鏈部分包含N核苷酸序列或,該N核苷酸由具有胞嘧啶(C)型鹼基的中間核苷酸的X型鹼基的核苷酸序列的延伸部所組成,其中,該N核苷酸的序列包含下式型鹼基的核苷酸的重複亞序列(-(X)Y-(C)Z-)M,其中,Y為1至5的整數,Z為1至5的整數,YZ及M為4至20的整數,或該N核苷酸的序列包含下式型鹼基的核苷酸的重複亞序列(-(X)Y2-(C)Z-(X)Y2-)M,其中,Y2為1至4的整數,Z為1至4的整數,Y2Z及M為4至20的整數,及其中各X型鹼基彼此獨立地為指定為胸腺嘧啶(T)型鹼基或尿嘧啶(U)型鹼基。
- 如申請專利範圍第19項的核酸探針,其中,該核酸探針的終端錨鏈部分包含具有C型鹼基的中間核苷酸的X型鹼基的2至5個核苷酸的延伸部所組成的N核苷酸的序列。
- 如申請專利範圍第19項的核酸探針,其中,該捕捉部分包含具有由4至100個核苷酸的核苷酸鏈。
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