TWI507528B - 測試樣品的多重分析方法 - Google Patents

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Description

測試樣品的多重分析方法
本發明概括地關於偵測一樣品中的標的分子所用之方法、裝置、試劑、和套組且、更特定言之，關於可能包含在一測試樣品中的一或多種標的分子之偵測及/或定量分析。
下面的說明提供有關本發明的資訊之摘要且不是作為本文所提及的資料或公開中任何一者係此處所主張的本發明的先前技術之讓步。
針對在生物樣品和其他樣品中的生理重要性分子的偵測和定量分析之檢定都是科學研究和健康照護領域中的重要工具。有一類此等檢定係涉及微陣列的使用，該微陣列包括一或多種經固定化在固體承載體上的適合體。該等適合體分別能夠以高特異性方式，且以很高的親和力結合到標的分子。參閱，例如，美國專利第5,475,096號，名稱"Nucleic Acid Ligands；"也參閱，例如，美國專利第6,242,246號；美國專利第6,458,543號，及美國專利第6,503,715號，彼等的名稱皆為"Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"。在微陣列與樣品接觸之際，適合體即結合到樣品中所含彼等個別的標的分子且藉此測定樣品中該等標的分子不存在、存在、量、及/或濃度。
此檢定的變異採用的適合體係包括光反應性功能基， 其可使該適合體共價鍵結合，或"光交聯"彼等的標的分子。參閱，例如，美國專利第6,544,776號，名稱"Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"。此等光反應性適合體也稱為光適合體(photoaptamer)。參閱，例如，美國專利第5,763,177號，美國專利第6,001,577號，及美國專利第6,291,184號，彼等的名稱皆為"Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"，也參閱，例如美國專利第6,458,539號，名稱"Photoselection of Nucleic Acid Ligands"。在微陣列與樣品接觸且有機會結合到彼等標的分子之後，該光適合體即經光活化，且洗滌該固體承載體以移除任何非特異結合的分子。可以使用嚴苛的洗滌條件，係因為由光適合體上經光活化的官能基所完成的共價鍵導致結合到光適合體的標的分子通常不被移除掉之故。於此方式中，該檢定可促成測試樣品中標的分子的不存在，存在、量、及/或濃度之測定。
於兩種此等檢定方式中，都在接觸樣品之前，將適合體固定化在固體承載體之上。不過，於某些情況下，接觸樣品之前的適合體固定化可能不會提供最優檢定。例如，適合體的預固定化可能造成適合體與標的分子在固體承載體面上的無效率混合，導致久長的反應時間，且因而延長促成適合體對彼等的標的分子之有效結合之育成時間。另外，在檢定中採用光適合體之時，且依用為固體承載體的 材質而定，該固體承載體可能會將促成該光適合體與彼等的標的分子之間的共價鍵之形成所用的光予以分散或吸收。再者，依所採用的方法而定，經結合到彼等的適合體之標的分子可能會發生不精確，係因為固體承載體的表面也可能暴露於所用的任何標記劑且受其影響之故。最後，適合體在固體承載體上的固定化通常包括在適合體暴露於樣品之前的適合體，製備步驟(即，固定化)，且此步驟可能影響到適合體的活性或功能性。
綜上所述，對於可經由影響(1)適合體活性，(2)達到適合體-標的分子複合物的結合平衡之效率，(3)在適合體與其標的分子之間的共價鍵之形成，及(4)適合體-標的分子複合物的偵測，等的條件予以最優化而提供對一測試樣品中的標的分子之偵測及/或定量分析所用的高敏感性檢定之方法、裝置、試劑和套組存在著其需要。
本揭示包括在一測試樣品中可能存在的一或多種標的分子之偵測及/或定量分析所用的方法、裝置、試劑和套組。於一具體實例中，係會測試樣品接觸一適合體，該適合體包括一標籤且對該標的分子具有特異親和性。使其形成一包括一經結合到其標的分子的適合體之適合體親和複合物。若測試樣品包含標的分子，則通常會在測試樣品內形成一適合體親和複合物。將該適合體親和複合物隨意地轉化成包括經共價鍵合到其標的分子的適合體之適合體共 價複合物。之後，可以使用諳於此技者所知的多種方法之一來偵測及/或定量分析該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)，包括但不限於使用固體承載體，使用質譜分析法，及使用定量式聚合酶鏈型反應(Q-PCR)。
於一具體實例中，係透過固體承載體的使用來偵測及/或定量分析該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)。於此具體實例中，係將適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)附加到固體承載體。該附加係經由令該固體承載體接觸該適合體親和複合物(或隨意的適合體親和複合物)且使該適合體上的包括的標籤，直接或間接地，結合經附加在該固體承載體上的探針(probe)。之後，偵測且隨意地定量分析已與固體承載體上的探針締合之適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)。在偵測和隨意的定量分析之前的任何點，亦即，在該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)附加到該固體承載體之前或之後的任何時刻，令該複合物接觸一標記劑以促成經結合的標的分子之偵測。
於另一具體實例中，係使用質譜分析法來偵測/定量分析該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)。於此具體實例中，係經由令該固體承載體接觸該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)且使該適合體上所包括的標籤，直接或間接地，締合該固體承載體所附加的探針而使該適合體親和複合物(或適合體共價複合物)附加到固體承載體。此有助於該適合體親和複合物(或隨意的 適合體共價複合物)從測試樣品的其餘部份分隔開，藉此在質譜分析之前將標的分子濃縮且改良使用此分析工具從複合物混合物對分析物(analytes)的偵測與定量分析。之後，將已經與固體承載體上的探針締合之適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)溶析及使用質譜分析法予以分析，此可產生可用來鑑定，及因而偵測，該標的分子的譜峯之質譜。在標的分子經偵測之後，隨意地也可用諳於此技者所知的標準技術予以定量分析。於標的分子為蛋白質的一具體實例中，在使用質譜分析法分析該適合體親和複合物)(或隨意的適合體共價複合物)之前可用蛋白酶酵素消化該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)，諸如使用蛋白酶K(proteinase K)或胰蛋白酶消化，而產生經結合的標的分子之片段，其隨後可用來鑑定標的分子，且藉此促成該等標的分子的偵測及隨意的定量分析。
於另一具體實例中，係使用Q-PCR來偵測及/或定量分析適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)。於此具體實例中，在偵測及/或定量分析之前，將測試樣品中的游離適合體從適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)分離開。之後，經由實施PCR且直接或間接地，測定經結合到測試樣品中的其標的分子之適合體的量或濃度，而定量分析該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)。測試樣品中的標的分子之量或濃度通常正比於使用PCR定量分析出的適合體之量或濃度。可以 用來以此方式定量分析適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)之一種示範方法為TaqMar® 檢定法(PE Biosystems,Foster City,Calif.)，也可參閱美國專利第5,210,015號)。
詳細說明
除非有不同的指明，否則本文所揭示的本發明之實施係採用在技藝中的技巧層次內之習用的化學、微生物學、分子生物學、與重組DNA技術之方法。此等技術在文獻中有完整地解說。參閱，例如Sambrook,et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual (Current Edition)；DNA Cloning：A Practical Approach,vol.I&II (D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis (N.Gait,ed.,Current Edition)；Nucleic Acid Hybridization (B.Hamer & S.Higgins,eds.,Current Edition)；Transcription and Translation (B.Hames & S.Higgins,eds.,Current Edition)。
在本說明書中引述的所有公開發行之專利文件，和專利申請都指出本發明所屬技藝中之技巧層次。本文引述的有有公開、發明之專利文件、和專利申請都以如同每一個別公開發行之專利文件、或專利申請都以特定且個別地以引用方式納入本文之相同程度以引用方式納入本文。
於用在本說明書之包括後附申請專利範圍之中時，單數形式"一"("a"、"an"和"the")，除非文中有清楚的不同指 明，否則都包括複數指稱，且可與"至少一和""一或更多"交換使用。例如，對"一適合體"的指稱係包括適合體混合物，對"一探針"的指稱包括探針混合物，及類似者。
於用於本文中時，術語"包含"("comprises"、"comprising")，"包括"("includes"、"including")；含有("contains"、"cantaining")，及彼等的任何變異形式，都意欲涵蓋非-排除性的內含，使得包含、包括、或含有一要素和要素表單的程序、方法、程序產物、或主體的組成不是只包括彼等要素，而且也包括沒有明確表列出或為此等程序、方法、程序產物、或主體的組成中所固有之其他要素。
本揭示包括在一測試樣品中可能存在的一或多種標的分子的偵測及/或定量分析所用之方法、裝置、試劑，和套組。所揭示的方法、裝置、試劑、和套組係經由將會影響(1)適合體活性，(2)達到適合體-標的分子複合物的結合平衡之效率，(3)在適合體與其標的分子之間的共價鍵結之形成，及(4)適合體-標的分子複合物的偵測等的條件予以最優化而提供對一測試樣品中的標的分子之偵測及/或定量分析所用之高敏感度檢定。
參照圖1A和1B，測試樣品中標的分子的存在係經由先令測試樣品與對標的分子具有特異親和性的適合體接觸而進行偵測及/或定量分析。使其形成包括結合到其標的分子的適合體之適合體親和複合物。若測試樣品包含標的 分子，則通常會在測試樣品中形成適合體親和複合物。該適合體親和複合物可隨意地，使用對所用適合體為恰適之方法，予以轉化成包括經共價鍵結到其標的分子之適合體共價複合物。然後偵測及/或定量分析該適合體親和複合物(或隨意適合體共價複合物)。
於一具體實例中，該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)係經由將該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)附加到固體承載體而偵測及/或定量分析。參照圖2A、2B、和2C，於偵測及/或定量分析可能存在於測試樣品中的標的分子所用示範方法中，係令該測試樣品接觸一包括一標籤且對標的分子具有特異親和性之適合體。使其形成一包括經結合到其標的分子的適合體之適合體親和複合物。若該測試樣品含有該標的分子，則通常會在測試樣品中形成適合體親和複合物。該適合體親和複合物可隨意地經由使用對該所用適合體為恰當的方法予以轉化成包括經共價鍵結到其標的分子的適合體之適合體共價複合物。將該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)附加劑一固體承載體。該附加係經由令該固體承載體接觸該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)且使該適合體上所包括的標籤與附加到該固體承載體上的探針，直接或間接地締合。然後偵測及隨意地定量分析已與固體承載體上的探針締合之適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)。在偵測和隨意的定量分析之前，亦即，在將該適合體親和複合物(或隨意的適合體 共價複合物)附加到該固體承載之前或之後的任何時，令該複合物接觸一標記劑以促成該經結合的標的分子之偵測。
於用在本文中之時，"核酸"、"低聚核苷酸"和"聚核苷酸"係可交換地用來指稱任何長度的核苷酸聚合物，且此等核苷酸可包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，及/或經化學改質的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之類似物。術語"聚核苷酸"、"低聚核苷酸"和"核酸"包括雙股型或單股型分子以及三股-螺旋分子。
若有時，核苷酸的化學改質可包括，單一地或任何組合地，2’-位置糖改質，5-位置嘧啶改質(例如，5-(N-苯甲基羧醯胺)-2’-脫氧尿苷，5-(N-異丁基羧醯胺)-2’-脫氧尿苷，5-(N-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]羧醯胺)-2’-脫氧尿苷，5-(N-(1-(3-三甲銨)丙基)羧醯胺)-2’-脫氧尿苷氯化物，5-(N-萘基羧醯胺)-2’-脫氧尿核，和5-(N-[1-(2,3-二羥基丙基)]羧醯胺)-2’-脫氧尿苷)，8-位置嘌呤改質，在環外胺上的改質，4-硫代尿苷之取代，5-溴-或5-碘尿嘧啶之取代，骨幹(backbone)改質，甲基化，非尋常的鹼對組合諸如異鹼異胞苷和異胍，及類似者。改質也可包括3’和5’改質，諸如加帽(capping)。其他的改質可包括用類似物取代一或多種天然發生的核苷酸，核苷酸之間的改質諸如，有未荷電鍵聯者(如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等)及有荷電鍵聯者(如，硫代磷酸根，二硫代磷 酸根，等)，有***質(intercalators)者(如，吖啶(acridine)、補骨脂內酯(psoralen)、等)，含鉗合劑者(如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬、等)，含烷基化劑者，及有改質鍵聯者(如，α-芳族核酸、等)。另外，在糖中通常存在的任何羥基可用膦酸基或磷酸基置換；以標準保護基予以保護；或予以活化以製備額外的對額外核苷酸之鍵聯或對固體承載體之額外鍵聯。5’和3’端OH基可予以磷醯化或用胺、有從約1至約20個碳原子的有機加帽基部份體，或有從約1至約20個聚乙二醇(PEG)聚合物或其他親水性或疏水性生物合成聚合物的有機加帽基部份體予以取代。若含有時，可在聚合物組合成之前或之後，加以對核苷酸結構之改質。一核苷酸序列可用非核苷酸成分予以***。聚核苷酸可在聚合後進一步改質，諸如與標記成分共軛接合。
聚核苷酸可含有技藝中通常知悉的核糖或脫氧核糖之類似式，包括2’-O-甲基，2’-O-烯丙基-，2’-氟-，或2’-疊氮基-核糖；碳環糖類似物，α-異頭物糖；表異構物糖類***糖、木糖或來蘇糖(lyxose)；吡喃糖類；呋喃糖類；景天庚酮糖；非環狀類似物及非鹼性核苷酸似物諸如甲基核糖核苷。如上面提及者，一或多個磷酸二酯鍵聯可用替代的鍵聯基予以置換。此等替化性鍵聯基包括下述具體實例，其中磷酸根被P(O)S("硫代酸根")、P(S)S("二硫代酸根")，(O)NR2 ("醯胺酸根")，P(O)R，P(O)OR’，CO或CH2 ("甲縮醛")所置換，其中各R 或R’獨立地為H或經取代或未經取代的烷基(1-20C)，其隨意地含有醚(-O-)鍵聯；芳基；烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。聚核苷酸內的所有鍵聯不需相同。糖，嘌呤和嘧啶的類似形式之取代在設計最後產物之中可能為有利者，如同，例如聚醯胺骨幹的替代性骨幹結構一般者。
於用在本文中時，"適合體"與"核酸配體"係可互換地用來指稱對一標的分子具有特異結合親和性的核酸。經公認者，親和***互作用為程度問題；不過，於本文中，適合體對其標的物"特異結合親和性"意指該適合體對其標的物通常係以比其結合到測試樣品中的其他成分遠較為高的親和度結合。"適合體"為一組具有特別核苷酸序列的核酸分子類型或物種之複本。適合體可包括任何適當數目的核苷酸。"適合體"係指稱一組以上的此等分子組。不同的適合體可能具有相同或不同數目的核苷酸。本文所揭示的任何方法都可包括一或多種適合體之使用。本文所揭示的任何方法也可包括二或更多種可特異地結合相同標的分子之適合體的使用。如在下文要進一步討論者，適合體可包括一標籤(tag)。若適合體包括一標籤，則該適合體的所有複本不需具有相同的標籤。再者，若不同的適合體各包括一標籤，則此等不同適合體可具有相同的標籤或不同的標籤。
適合體可以使用任何已知方法予以鑑定，包括SELEX法。參閱，例如，美國專利第5,475,096號，名稱"Nucleic Acid Ligands"。於鑑定後，可根據任何已知方 法，包括化學合成法和酵素合成法，製備或合成一適合體。
術語"SELEX"和"SELEX法"於本文中可交換地用來概括地指稱下列之組合：(1)與標的分子以合宜方式交互作用(例如以高親和力結合到蛋白質)之核酸的選擇，與(2)所選核酸之擴增。參閱，例如美國專利第5,475,096號，名稱"Nucleic Acid Ligands"。SELEX法可用來產生可共價鍵結合到其標的物的適合體或以非共價鍵結合到其標的物之適合體。參閱，例如，美國專利第5,705,337號，名稱"Systematic Evolutiion of Nuclaic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Chemi-SELEX"。
如本文中所揭示者，適合體可進一步包含一"標籤"，其係指一成分，其可提供一種手段用以附加或固定化一適合體(及其所結合的任何標的分子)到一固體承載體上。"標籤"為一組一類型或物種的能夠與探針締合之成分。"多標籤"(tags)係指一組以上的此等成分組。標籤可用技藝中已知的任何方法附加或包括在適合體內。通常，標籤可讓適合體，直接或間接地締合到經附加在固體承載體上的探針。標籤可促成一適合體共價複合物定位化在固體承載體上的空間上明確的定址。如此一來，不同的標籤可能促成不同的適合體共價複合物定位化到固體承載體上的不同空間明確定址。標籤可為聚核苷酸、多肽、肽核酸、閉鎖(locked)核酸、寡醣、多醣、抗體、親和體(affybody)、抗體模擬物(antibody mimic)、細胞受體、配體、脂質、此 等結構的任何片段或衍生物)，前述之任何組合，或任何其他結構可用來設計或構組探針(或連接子分子(linker molecule)，如上所述者)以特異性地結合或其他方式的締合。通常，一標籤係經構組成使得其不會與其本身或其所附加的適合體或其為其部分的適合體發生分子內交互作用。若使用SELEX來鑑定適合體，可在SELEX之前或之後，將標籤加到適合體。於一具體實例中，標籤係經在後一SELEX包括在適合體的5’-端。於一具體實例中，標籤係經在後一SELEX包括在適合體的3’-端。
於一具體實例中，標籤係包括聚核苷酸，其經設計成經由與探針序列直接雜合而直接締合包括互補聚核苷酸序列的探針。於此具體實例中，通常構組成標籤且雜合反應係在使得該標籤不會與該標籤所包括的完美互補物所對應的探針以外之探針相雜合之條件下進行。
於某些具體實例中，標籤係包括核苷酸，其為適合體本身的一部份。例如，若使用SELEX來鑑定一適合體，該適合體通常包括以按照適合體而變異的核苷酸序列，亦即，可變區，從3’-固定端分隔的5’-固定端。於一具體實例中，標籤可包含任何適當數目的包括在適合體固定端內的核苷酸，諸如，一整個固定端或該固定端的任何部份，包括在固定端內部的核苷酸。於另一具體實例中，標籤可包含任何適當數目的包括在適合體可變區內的核苷酸，諸如，整個可變區或該可變區的任何部份。於又另一具體實例中，標籤可包含任何適當數目的重疊該可變區和 諸固定區之一的核苷酸，亦即，該標籤可包含一核苷酸序列，該序列包括該可變區的任何部份(包括全部)和固定端的任何部份(包括全部)。
於另一具體實例中，標籤可與探針直接締合及價鍵結到探針，藉此將適合體以共價鍵聯結到固體承載體的表面。於此具體實例中，標籤和探針都可包括適當的反應性基，在該標籤與探針締合時，彼此足夠靠近而經歷會產生共價鍵之化學反應。該反應可自然發生或可能需要活化，諸如，光活化或化學活化。於一示範具體實例中，標籤包括二烯部份體且該探針包括親二烯物，且從二烯與親二烯物的自然Diels-Alder共軛反應導致共價鍵形成。任何恰當的互補化學都可以使用，諸如，N-Mannich反應，二硫化物形成，Curtius反應，Aldol縮合，Schift鹼形成，和Michael加成。
於另一具體實例中，標籤係與探針間接締合，諸如，透連接子分子，如下面要進一步討論者。於此具體實例中，標籤可包括對一連接子分子的一特別區或成分呈互補之聚核苷酸序列。標籤通常經構組成且雜合反應係經進行得使標籤不會與包括在聯結分子內的聚核苷酸序列以外之聚核苷酸序列雜合。
若標籤包括聚核苷酸，該聚核苷酸可包括任何適當數目的核苷酸。於一具體實例中，一標籤包括至少約10個核苷酸。於另一具體實例中，標籤包括從約10至約45個核苷酸。於又另一具體實例中，標籤包括至少約30個核 苷酸。包括聚核苷酸的不同標籤可包括相同數目的核苷酸或不同數目的核苷酸。
於用在本文中時，術語"約"係表數值的不明顯修改或變異使得該數值所關聯的品項之基本功能沒有改變。
於用在本文中時，"締合"("associate","associates")其任何變異形式係指在一標籤與一探針之間的交互作用或複合導致足夠穩定的複合物以促成"未締合"或未結合物質，例如，測試樣品的未結合成分，在所給複合或反應條件下從標籤-探針複合物分離開。標籤與探針可經由彼此以特異***互作用和結合而彼此直接締合。標籤與探針也可彼此間接締合諸如以連接子分子媒介彼等的複合之時。
於用在本文中之時，"探針"係指稱一分子，其經構組成，直接或間接地，締合一標籤。"探針"為一組能夠將適合體經由與標籤，直接或間接地，締合而固定化在一固體承載體上的一類型分子或一類型多分子結構之複本。"多探針"(Probes)係指一組以上的此等分子，一探針可為聚核苷酸、多肽、肽核酸、閉鎖核酸、寡醣、多醣、抗體、親和體(affybody)、抗體模擬物、細胞受體、配體、脂質、此等結構的任何片段或衍生物，前述的任何組合，或可用來設計或構組出可與其以特異性結合或其他方式的締合之標籤(或連接子分子)的任何其他結構。探針可經由技藝中已知的任何方法共價鍵或非共價鍵地附加到固體承載體。
於一具體實例中，探針包括聚核苷酸，其具有對一聚核苷酸標籤序列呈互補之序列。於此具體實例中，通常構 組出探針序列且在使探針不與探針所包括的互補序列所針對的標籤以外的核苷酸序列相雜合之條件下進行雜合反應(即，通常構組成探針且在使該探針不與不同的標籤或適合體親合之條件下進行雜合)。
於一具體實例中，探針係，例如，透過連接子分子，間接地與一標籤締合。於此具體實例中，探針可包括對一連接子分子的特別區或成分呈互補之聚核苷酸序列。該探針通常經構組且該雜合反應係經進行得使該探針不與該連接子分子中所包括的聚核苷酸序列以外的聚核苷酸序列雜合。
若一探針包括一聚核苷酸，則該聚核苷酸可包含任何適當數目的核苷酸。於一具體實例中，一探針包括至少約10個核苷酸。於另一具體實例中，一探針包括從約10至約45個核苷酸。於又另一具體實例中，一探針包括至少約30個核苷酸。包括聚核苷酸的不同探針可包括相同數目的核苷酸或不同數目的核苷酸。
於用在本文中時，"連接子分子"係指一或多種經構組成媒介一標籤與一探針的締合之分子。通常，連接子分子係雙官能者，亦即其包含一用於聯結到標籤的官能性及一用於聯結到探針的官能性。"連接子分子"為一組能夠將一標籤締合一探針的分子或多分子結構的類型或物種之複本。"多連接子分子"指的是一組以上的此等分子或多分子結構。一連接子分子可具有任何適當的構形且可包括任何適當的成分，包括聚核苷酸、多肽、肽核酸、閉鎖核酸、 寡醣、多醣、抗體、親和體(affybody)、抗體模擬物、聚乙二醇(PEG)分子、細胞受體、配體、脂質、此等結構的任何片段或衍生物，前述的任何組合，或可經設計或構組以媒介在一標籤與一探針之間具有特異性的締合之任何其他結構或化學成分。連接子分子可為脂族或芳族。
連接子分子的組成對本文所揭示的任何方法都不具關鍵性。時常較佳者為該連接子分子係親水性者。一般而言，一特別連接子分子的長度可經選擇以提供合成方便性及在媒介一標籤與一探針的締合中之容易性。連接子分子必須不包含會干擾根據所揭示方法所需的反應之官能性，或長度。
參照圖2A、2B和2C，在本文所揭示的任何方法中採用連接子分子之時，可在檢定實施中的任何適當時間導入連接子分子，且可先與標籤或先探針接觸。例如，可令包括在適合體上的標籤在適合體共價複合物接觸固體承載體上的探針之前的任何時間接觸連接子分子。於另一具體實例中，可令附加在固體承載體上的探針在該探針暴露於在適合體共價複合物上的標籤之前接觸連接子分子。於另一具體實例中，依所實施的特別檢定之複雜度及反應條件而定，一探針可，例如，同時接觸連接子分子及在一適合體共價複合物上的標籤。
連接子分子通常包含一標籤締合成分及一探針締合成分。該標籤締合成分和探針締合成分係根據一特別檢定中用的特別標籤和探針而獨立地選擇。於一具體實例中，該 標籤締合成分為一對標籤中所含聚核苷酸序列呈互補的聚核苷酸。於另一具體實例中，該探針締合成分為對該探針中所包含的聚核苷酸序列呈互補之聚核苷酸。於另一具體實例中，該標籤締合成分為一聚核苷酸且該探針締合成分也為一聚核苷酸。
於另一具體實例中，連接子分子包括以第三成分與探針締合成分相隔開之標籤締合成分。於此具體實例中，該第三成分可包括一或多種分子或子成分，包括聚核苷酸、多肽、肽核酸、鎖合核酸、寡醣、多醣、抗體、親和體(affybody)、抗體模擬物、脂族碳分子、聚乙二醇(PEG)分子、細胞受體、配體、脂質、此等結構的任何片段或衍生物，前述之任何組合、或有助於標籤與探針的締合之任何其他化學結構或成分，諸如有助於增加在標籤締合成分與探針締合成分之間的伸縮性者。
連接子分子的聚核苷酸成分可包括任何適當數目的核苷酸。於一具體實例中，連接子分子的聚核苷酸成分包括至少約10個核苷酸。於另一具體實例中，連接子分子的聚核苷酸成分包括從約10至約45個核苷酸。於又另一具體實例中，連接子分子的聚核苷酸成分包括至少約30個核苷酸。於本文中所述任何方法中所用的連接子分子可包括具有相同數目的核苷酸或不同數目的核苷酸之聚核苷酸成分。
於用在本文中之時，"光適合體"，"光反應性核酸配體"、和"光反應性適合體"係可交換地用來指稱含有一或 多個可共價鍵結合或"交聯"標的分子的光反應性官能基之適合體。例如，可將天然發生的核酸殘基改質以包括賦予該核酸殘基光反應性的化學官能基，其在暴露於具有恰當波長的輻射源時具光反應性。光適合體可經使用任何已知方法予以鑑定及/或製備。於某些具體實例中，係使用photoSELEX法來鑑定光反應性適合體。參閱，例如，美國專利第5,763,177號，美國專利第6,001,577號，及美國專利第6,291,184號，彼等的名稱皆為"Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"；也參閱，例如，美國專利第6,458,539號，名稱"Photoselection of Nucleic Acid Ligands"。於其他具體實例中，製備適合體且隨後序以改質以摻入一或多個光反應性官能基，由是產生光適合體。於此等具體實例中，可經由用一光反應性核酸殘基取代一或多個其他核苷酸，例如，適合體中的一或多個胸苷及1或胞苷，或經由將一或多個核酸殘基改質以包括光反應性官能基，而將一或多個光反應性核酸殘基摻加到適合體內。
可以摻組到光適合體內的範例光反應性官能基包括5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-碘乙烯基尿嘧啶、5-疊氮基尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-硫尿嘧啶、4-硫胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-溴乙烯基胞嘧啶、5-碘乙烯基胞嘧啶、5-疊氮基胞嘧啶、8-疊氮基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-碘腺嘌呤、8- 疊氮基鳥嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-碘鳥嘌呤、8-疊氮基次黃嘌呤、8-溴次黃嘌呤、8-碘次黃嘌呤、8-疊氮基黃嘌呤、8-溴黃嘌呤、8-碘黃嘌呤、5-[(4-疊氮基苯甲醯甲基)硫]胞嘧啶、5-[(4-疊氮基苯甲醯甲基)硫]尿嘧啶、7-去氮-7-碘腺嘌呤、7-去氮-7-碘鳥嘌呤、7-去氮-7-溴腺嘌呤、和7-去氮-7-溴鳥嘌呤。
除了此等範例以核苷酸為基的光反應性官能基之外，也可以使用經由使用恰當連接子分子加到適合體的末端之其他光反應性官能基。此等光反應性官能基包括二苯甲酮、蒽醌、4-疊氮基-2-硝基-苯胺、補骨髓內酯、任何此等的衍生物、和類似者。
經摻組到光適合體內的光反應性官能基可經由任何適當方法予以活化。於一具體實例中，含光反應性官能基的光適合體係經由將該光適合體親合複合物暴露於一電磁射線源而交聯到其目標。適當的電磁射線類型包括紫外光、可視光、X-射線、和γ射線、適當的射線源包括利用單色光或過濾多色光的射線源。
於一具體實例中，可將光反應性核苷酸，諸如4-疊氮基-2-硝基-苯胺，摻加到光適合體內，且可以使用具有從約325奈米至約470奈米的波長之光照射包含此光適合體的光適合體親和複合物。於此等波長下的激發可以用，例如不貴的發光二極體(LEDs)以單一LED或以LEDs陣列來完成，因其功率需求係輕微之故。由一或多個高功率LEDs可供給具有從465至475奈米的波長之近乎單色 光，100度視角且提供38流明的光。於所欲光反應性官能基不能以LED所產生的波長激發之事件中，電子抽取基或電子供給基的恰當取代常可用來將光反應性官能基的激發波長適度地偏移可促成在LED所產生的波長下之光反應性官能基的激發。
於一具體實例中，係將光應性核苷酸摻加到光適合體內，且可用具有從約300奈米至約350奈米的波長之光來照射包括此光適合體的光適合體親和複合物使該光適合體親和複合物轉化為光適合體共價複合物。
於一具體實例中，可將光反應性分子，諸如5-碘尿嘧啶或5-碘胞嘧啶，摻組到光適合體內，且可以使用具有從約320奈米至約325奈米的波長之光來照射包括此光適合體的光適合體親和複合物。此種組合有助於將含發色團的光適合體選擇性地光交聯劑到標的分子而不誘發其他的，非特異性光反應。例如，在目標蛋白質的情況中，可能包括在目標蛋白質中的任何色胺酸殘基及可能包括在光適合體中的尿嘧啶鹼也可為光反應性者。由於5-碘尿嘧啶或5-碘胞嘧啶會吸收約325奈米波長的光但色胺酸和天然發生的核酸鹼則不會，因此使用此波長的光可促成在光適合體親和複合物內的5-碘尿嘧啶或5-碘胞嘧啶處之選擇性光反應。具有從約320奈米至約325奈米波長的單色光可由，例如，發出約320奈米波長的光之頻率雙調式染料雷射，或發出約325奈米波長的光之氦鎘雷射，予以供應。
於另一具體實例中，可將光適合體親和複合物暴光於經調定發出約308奈米波長的光之氯化氙(XeCl)激生分子雷射。於此具體實例中，光適合體可包括光反應性官能基(如，5-溴尿嘧啶或5-溴胞嘧啶)，且可以採用以光源處理光適合體親和複合物之法來光活化該光反應性官能基使得該光適合體與其標的分子交聯且形成光適合體共價複合物。
於又另一具體實例中，可由將光適合體親和複合物暴露於經調定發出約313奈米波長的光之高壓汞燈而使光適合體交聯到其目標。於其他具體實例中，可以採用波長過濾器將發出的光限制到大於約300奈米以減少包括在光適合體親和複合物內者以外的發色團之活化。
於另一具體實例中，可經由將光適合體親和複合物暴光於經調定以發射約254奈米波長的光之低壓汞燈而將光適合體交聯劑到其標的物，該光係被燐光體所吸收且再發出於從約300奈米至約325奈米的波長之光。於此具體實例中，再發出的光係經過濾以移除約254奈米的任何光(此不會被燐光體所吸收)以及從約290奈米至約305奈米的波長光(此可損及目標蛋白質)。
於又另一具體實例中，可在光適合體中組入鹵素光反應性官能基，諸如碘尿嘧啶或溴胞嘧啶，且可用具有從約350奈米至約400奈米的波長之光處理包括此光適合體的光適合體親和複合物。例如，可以使用來自銨YAG雷射經調定在約355奈米的第三諧波之單色光或來自氟化氙 (XeF)激生分子雷射在約351奈米的第一諧波之單色光。
如在本文中所用者，"標的分子"，或"標的物"可互換地指稱可讓適合體以高親和力且特定地結合且可能存在於測試樣品內之任何標的分子。"標的分子"包括一特別分子的任何小幅變異，諸如，於蛋白質情況中，在胺基酸序列中的小幅變異、二硫代鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷醯化、或任何其他操縱或改質，諸如與不會實質變更該分子的本體之標記成分共軛結合。"標的分子"或"標的物"，為一組能夠結合到適合體的分子或多分子結構之類型或物種之複本。"(多)標的分子"，或"(多)標的物"係指多於一組的此等分子。範例標的分子包括蛋白質、多肽、核酸、碳水化合物、脂質、多醣、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、親和體(affybody)、抗體模擬物、病毒、病原、毒性物質、受質、代謝物、過渡態類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、養分、生長因子、細胞、組織、及任何前述之片段或部份。適合體可經鑑定為幾乎為具有任何尺寸的任何化學或生物分子，且因而幾乎為任何尺寸的任何化學或生物分子都可為適當的標的物。標的物也可經改質以提高在標的物與適合體之間的交互作用之機率或強度。於範例具體實例中，標的分子為蛋白質。參閱美國專利第6,376,190號，名稱"Modified SELEX Processes Without Purified Protein"，有關SELEX標的物為肽之方法。
"多肽"、"肽"和"蛋白質"於本文中可互換地用來指稱 具有任何長度的胺基酸聚合物。該聚合物可為線型或分枝者，其可包含經改質的胺基酸，且其可經非一胺基酸所***。該等術語也涵蓋經天然改質或經介入，諸如二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷醯化、或任何其他操縱或改質，諸如與標記成分共軛拼合等予以改質之胺基酸聚合物。在該定義中也包括，例如，包含一或多種胺基酸類似物(包括，例如，非天然胺基酸、等)，以及技藝中已知的其他改質之多肽。多肽可為單鏈者或締合鏈者。
於在本文中使用時，"非標的分子"和"非標的物"，可互換地用來指稱在測試樣品中所含可與適合體形成非特異性複合物之分子。"非標的分子"或"非標的物"為一組一類型或物種的能結合到適合體的分子或多分子結構之複本。"多非標的分子"或"多非標的物"係指一組以上的此等分子組。要理解者，對第一種適合體為非標的物之分子可能為第二種適合體之標的物。同樣地，對第一種適合體為標的物之分子可能為第二種適合體的非標的物。
於用在本文中時，術語"適合體親和複合物"指的是經由適合體與其標的分子的交互作用所形成的非-共價鍵複合物。"適合體親和複合物"為一組一類型或物種由結合到其對應標的分子的適合體所形成的複合物之複本。"多適合體親和複合物"係指一組以上的此等複合物組。適合體親和複合物通常可因環境條件改變，如溫度增高，鹽濃度增加，或添加變性劑而逆反或解離。
於用在本文中時，術語"適合體共價複合物"係指其中 的適合體業經誘導與其標的分子形成或經其他方式形成共價鍵之適合體親和複合物。"適合體共價複合物"為一組一類型或物種的經由一適合體共價鍵結到其對應的標的分子所形成的複合物之複本。"多適合體共價複合物"指的是一組以上的此等複合物組。在適合體與其標的分子之間的共價鍵或鍵聯可經由對適合體上的化學部份體，包括上面針對光適合體所述彼等部份體，施以光活化，予以誘導。在適合體與其標的分子之間的共價鍵或鍵聯也可經由化學方式予以誘導。包括在適合體內且用來誘導與標的分子的化學鍵聯之化學基包括但不限於醛、順丁烯二醯亞胺、丙烯醯基衍生物、重氮鎓衍生物、硫醇、等。於某些具體實例中，化學交聯基，諸如順丁烯二醯亞胺或重氮鎓鹽，可經由單純提供發生特異性且充足增強的化學反應性所需反應性基之恰當環境與併置，即可將適合體親和複合物轉化為適合體供價複合物。於其他具體實例中，化學交聯劑，諸如醛基，可能需要添加另一成分，例如，氰硼氫化鈉、將適合體親和複合物轉化為穩定，不可逆的適合體共價複合物。又於其他具體實例中，在適合體中不包括此等化學交聯劑；反而，使用第三種藥劑經由幫助在適合體與其標的物之間的共價接著而將適合體親和複合物轉化為適合體共價複合物。例如，同時含有胺反應性部份體(如，N-羥基丁二醯亞胺基酯、醛、或醯亞胺酸根)與核苷反應性基(如，碘乙醯胺或活化醛)之同一異-雙官能劑可誘導適合體親和複合物，諸如適合體與其標的蛋白質所形成的親和 複合物，之共價鍵複合。
術語"測試樣品"於本文中係指稱包含複數種分子且可包括至少一種標的分子之任何材料、溶液或混合物。術語"測試樣品"包括如下所述之生物樣品，及可用於環境或毒物學測試之樣品，諸如經污染或可能被污染的水和工業放流物。測試樣品也可為一製備程序如製程之終端產物、中間產物、或副產物。測試樣品可包括任何適當的檢定介質、緩衝液、或稀釋劑等業經加到從生物或從某些其他來源(如，環境或工業來源)所得之材料、溶液、或混合物之中者。
術語"生物樣品"係指從生物所得任何材料、溶液或混合物。此包括血液(包括全血液、白血球、周圍血液單核細胞、血漿和血清)、痰、呼吸氣、尿液、***、唾液、腦膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭吸出液、細胞、細胞萃取物、和腦脊髓液。此也包括所有前述之實驗分離部份。術語"生物樣品"也包括含有經勻化的固體物質之材料、溶液或混合物，諸如得自糞樣、組織樣、或組織活體檢樣者。術語"生物樣品"也包括衍生自組織培養物、細胞培養物、細菌培養物、或病毒培養物之材料、溶液、或混合物。
"固體承載體"係指具有一表面可讓分子，透過共價鍵或非共價鍵，直接或間接地，附加之任何基質。固體承載體可包括能夠對附加於該表面的探針提供物理支撐之任何基質材料。該材料通常能夠耐住與該探針對該表面的附加 及在檢定操作中所遇到的任何後續處理、處置或加工相關聯之條件。該材料可為天然發生者、合成者或天然發生材料的改質者。適當的固體承載體材料可包括矽、石墨、鏡面、積層體、陶瓷、塑膠(包括聚合物諸如，聚(氯乙烯)、環-烯烴共聚物、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(對苯二甲酸乙二酯)、聚四氟乙烯(PTFE或Teflon® )、尼龍(nylon)、聚(丁酸乙烯酯)、鍺、砷化鎵、金、銀等，以彼等的本身使用或與其他材料搭配使用。也可考慮其他的剛硬材料，諸如玻璃，其包括氧化矽且進一步包括，例如，可用為生物玻璃(Bioglass)的玻璃。可以採用的其他材料包括多孔型材料，諸如有控制細孔的玻璃珠粒。此外，也涵蓋技藝中已知的能夠將一或多種官能基，諸任何下列者：胺基、羧基、硫醇基、或羥基，摻加到其表面上之任何其他材料。
用為固體承載體的材料可採從簡單至複雜之多種組態中的任何一者。固體承載體可具有多種形狀中的任何一者，包括條、板、碟、棒、粒子(包括珠粒)、管、井、和類似者。通常，材料係相當平面者諸如，載片(slide)，不過其也可為球形，諸如珠粒，或圓柱形(如，管柱)。於許多具體實例中，該材料通常成形為長方實體。多種預定的配置諸如探針陣列，可經合成在片上，然後予以裁切，亦即沿著劃線斷裂切割，成為單一陣列基板。可以使用的範例固體承載體包括微滴板孔洞、載玻片、膜、順磁性珠 粒、荷電紙、Langmuir-Blodgett膜、矽晶圓晶片、流通片、及微珠粒。
固體承載體的表面常為形成該固體承載體的基板材料之外面部份。探針所結合的固體承載體表面可為平滑或實質平面者，或具有不規則處者，諸如凹陷、溝槽、豎起、或其他構造。該表面可用一或多層不同化合物層予以改質，用來將表面的性質修改成所欲方式。於多種具體實例中，此等表面改質層於含有時通常具有從單分子厚度到約1毫米之厚度，或從單分子厚度到約0.1毫米的厚度，或從單分子厚度至約0.001毫米的厚度。
有用的適當改質層包括無機和有機層，諸如金屬、金屬氧化物、聚合物、小的有機分子、和類似者。有用的聚合物層包括甲基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯醯胺、多醣類、磷脂質、聚胺基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚醯胺、聚乙烯胺、聚芳基硫醚、聚矽氧烷、聚醯亞胺、聚乙酸酯、和類似者，其中該等聚合物可為異聚物或均聚物，且可具有或可不具有附加於其上之分隔官能基團(例如，共軛基團)。有用的其他表面改質包括三維網絡，諸如水凝膠。技藝中已知的任何適當水凝膠都可以使用。參閱，例如美國專利申請公開第2003/0218130號，名稱"Biochips with Surfaces Coated with Polysaccharide-Based Hydrogels"；美國專利申請公開第20050147994號，名稱"Method for Immobilizing a Biologic in a Polyurethane-Hydrogel Composition,a Composition Prepared from the Method，and Biomedical Applications"；美國專利申請公開第2005005908號，名稱"Photocrosslinked Hydrogel Blend Surface Coatings"；及此等公開中引述的任何參考資料。
於一具體實例中，固體承載體的表面包括水凝膠。水凝膠可包含，例如：聚合物基質。水凝膠可經化學附加到固體承載體的表面且可包括能夠將探針，直接或間接地附加到水凝膠之結合官能基。範例結合官能基包括疏水性基、親水性基、反應性基諸如醛、環氧基、碳酸根和類似者，羧基、硫醇，磺酸根，硫酸根，胺基，經取代胺基，磷酸根，金屬鉗合基，硫醚，生物素，硼酸根，等。
也可以使用適宜基因表現或SNP分析的任何表面，包括由Affymetrix,General Electric(如，CodeLink)，Agilent,and Schott Nexterion所提供的基板和表面，可為基板和表面形式或為進一步包含其他成分的產品所含成分之形式。
探針可用任何適當方式結合到固體承載體的表面只要在後續的根據所揭示方法的溫浸和處理步驟中，諸如洗滌表面以移除非特異性複合物之中，探針不能脫結合即可。探針可經由非共價鍵結合，如黏附、吸收、吸附，或經由共價鍵聯結到固體承載體的表面。於探針經共價鍵聯到固體承載體的情況中，該固體承載體的表面可包含鍵聯到探針之官能基。所用官能基的本質決定於探針的本質。有多種材料業經報導用於將分子共價鍵附加到表面。典型地， 此等反應係經由在一分子上的活性官能基與在表面上的活化官能基之反應而實施。例如，含胺的化合物可經由令含羧酸的表面形成該羧酸的活化酯，諸如N-羥基丁二醯亞胺衍生物，而附加到該表面上。胺可與此活化酯順利反應形成穩定的醯胺鍵。此反應可用於與所欲胺的反應明顯快於與系統的其他親核物的反應之狀況下。
在先前技藝中述及的方法例子包括用溴化氰、N-羥基丁烯二醯亞胺酯、羰基二咪唑、碳化二醯亞胺、氮雜內酯、氰尿酸氯、有機磺醯基氯化物，二乙烯基碸、硝基苯基酯、碘乙醯基、順丁烯二醯亞胺、環氧基、醯肼、還原胺化、重氮鎓離子、及Mannich縮合。可與活化表面反應的分子包括胺、醇、羧酸、硫醇、羰基化合物、及含活性氫的化合物。
於一具體實例中，探針係以預定的空間排列或圖案結合到固體承載體的表面，此意指在表面上的任何排列，其中在特別位置上的探針本體係已知者。於一具體實例中，該預定的排列為一陣列。一陣列通常包括可定址區的任何一維、二維或三維排列，其中該區載有與該區締合的特別探針。陣列可定址係在於其具有多個各具不同探針之區使得在該陣列上一特別預定位置的區或特徵或點可藉由與此適合體共價複合物上的標籤特異地締合而偵測一特別的適合體共價複合物，及因而一特別的標的分子。
在一固體承載體表面上的一陣列組合體指的是沿著一個別固體承載體的表面配置且以陣列間部位分隔之一或更 多陣列。通常，與陣列表面相異(相反表面)的固體承載體表面不攜載任何陣列。該等陣列可經設計用以測試任何類型的測試樣品。固體承載體的表面可攜載至少一、二、四、二十、一百、或至少五有個陣列。依預期用途而定，任何或所有該等陣列可彼此相同或相異且每一陣列可包含配置於其上的多重探針點或特徵。一典型陣列可在小於約20平方公分或甚至小於10平方公分的面積內包含超過十個，超過一百個，超過一千個，或一萬個特徵，或其至超過十萬個特徵。例如，該等特徵可具有在從約10微米至約1.0公分範圍內之寬度(亦即，對於圓點而言，為一直徑)。於其他具體實例中，每一特徵可具有在約1.0微米至約1.0毫米，或從約5.0微米至約500微米，或從約10微米至約200微米範圍內之寬度。非圓形特徵可具有相當於具有前述寬度(直徑)範圍的圓形特徵所具者之面積範圍。
陣列在固體承載體上的任何種幾何都可以使用。如上面所提及者，個別固體載體可包含單一陣列或多重陣列。可將陣列的特徵安排成直列與行。此對於在固體承載體上的單一陣列特別具吸引性。在含有多重陣列時，可將此等陣列安排成，例如，有於固體承載體表面上的曲線列序列(例如，點的同心圓或半圓形序列)，及類似者。相似地，特徵的圖案可從點的直線列和變異到包括，例如，有於固體承載體表面上的曲線列序列(例如，點的同心圓或半圓之序列)，和類似者。陣列和彼等的特徵之組態可根據製 造、處置、和使用等的考慮予以選擇。
在陣列內的每一特徵，或元件係經定義為固體承載體表面的一小規則成形區。該等特徵用預定方式排列。一陣列的每一特徵通常攜載一預定的探針或探針混合物。分子陣列內的每一特徵可包一不同的探針，且在一所給特徵內的探針可與在該陣列其餘特徵內的探針不相同。某些或全部的特徵可各具不同的組成。每一陣列可包含多點或特徵，且每一陣列可用空間或部位與另一陣列分隔。也可理解，陣列彼此不需任何空間予以分隔。陣列間部位及特徵間部位常為存在者，但不是必要者。如同任何邊界部位一般，陣列間和特徵間部位都不攜載任何探針。要了解者，陣列間部位和特徵間部位於存在時，可各具不同尺寸和組態。
於某些具體實例中，可經由將一探針附加在一第一固體承載體，諸如珠粒，然後將該第一固體承載體安排在一第二固體承載體，諸如微滴板，上的陣列格式內，而形成一陣列。於其中具體例中，可經由將探針附加於可定址的珠粒上而形成一陣列。"可定址珠粒"包括染料、條碼、和異頻雷達收發器(transponders)。
於某些具體實例中，依所選固體承載體的表面而定，該表面可經"封阻"或"鈍化"以減少或抑制分子對固體承載體表面之非特異性結合。封阻或鈍化用藥劑包括乾奶、酪蛋白、混合血清、混合血漿、BSA、PEG-PLL、PEG-矽烷、SuperBlock或StarterBlock(Pierce Biotechnology, Rockford,Ill.)，及任何前述之任何組合。
於用在本文中時，術語"標記劑"係指一或多種可用來偵測在適合體共價複合物中結合到適合體的標的分子之藥劑。
於偵測標的分子的一具體實例中，係令一適合體共價複合物接觸一標記劑，該標記劑包括一對經結合到該適合體的標的分子具特異性之結合伴體。該特異性結合伴體可為任何適當的部份體(moiety)，包括抗體、抗體片段、合成抗體摸擬物、生物模擬物、適合體、分子刻印配體、及類似者。特異性結合伴體係經共軛撥合或鍵聯到另一標記劑成分，通常為可偵測的部份體或標記。該特異性結合伴體對標記的鍵聯可用任何上述用於將探針聯結到固體承載體的方法來進行。要理解者，於偵測多個標的分子的情況中，可令多個適合體共價複合物接觸多個特異性結合伴體的方法，每一者都對懷疑有存在的標的分子具特異性。所用標記可為技藝中已知的用於多數標的分子之複式偵測的標記。
可偵測部份體或標記都能夠被直接或間接地偵測。通常，可偵測的任何報導子分子都可為標記。標記包括，例如，(i)可藉由產生一信號而直接偵測之報導子分子，(ii)特異性結合配對成員，可經由隨後結合到包報導子分子的關聯物(cognate)而間接地被偵測，(iii)可用質譜分析法偵測的質量標籤，(iv)低聚核苷酸引子，其可提供模板供擴增或連接(ligation)所用，及(v)特異性聚核苷酸序列或辨 識序列，其可作為配體，諸如抑制子蛋白質，其中，於後兩種情況中，低聚核苷酸引子或表現子蛋白質係具有，或能夠具有，報導子分子者，等等。報導子分子可為催化劑，諸如酵素，編碼一催化劑的聚核苷酸、啟動子、染料、螢光性分子、量子點(quantum dot)、化學致發光性分子、輔酶、酵素受質、放射性基、小有機分子、可擴增的聚核苷酸序列、粒子諸如膠乳粒子或碳粒子、金屬溶膠、微晶粒、脂質體、細胞，等，其可經或可不經進一步用染料、催化劑或其他可偵測基，可變更其所拼合的分子之重量供質譜分析目的所用之質量標籤，與類似者予以標記。該標記可選自電磁性或電化學性物質。於一具體實例中，該可偵測標記為螢光染料。其他標記及標記程序可由諳於此技者根據本文中的揭示而明白。
於用於偵測標的分子的另一具體實例中，標的分子為一蛋白質，且該適合體共價複合物係與包含一通用蛋白質染色劑的標記劑接觸。於用在本文中時，"通用蛋白質染色劑"和"UPS"係可互換地用來指稱可將測試樣品中所含，若非全部，也為大部份的蛋白質，用可偵測的部份體予以標記，但對於核酸或檢定的其他成分，諸如固體承載體，不給予標記或只最小標記之任何標記劑，出現於蛋白質上，但不出現於核酸或基板表面上的任何反應性化學基都可用為共價鍵附加部位。範例反應性化學基包括一級胺(如，在離胺酸上者)，硫醇(如在半胱胺酸上者，其可經由將二硫鍵聯還原而產生)，醇(如，絲胺酸、蘇胺酸、酪 胺酸、與糖蛋白上的糖部份體(包括此等糖上的順-二醇之氧化產物))，和羧酸(如，在穀胺酸和天冬胺酸上者)。
可偵測部份體可包括任何上列報導子分子及可用任何方式產生可偵測信號之任何其他化學物或成分。可偵測部份體可通過螢光信號、化學發光信號、或取決於部份體的本質之任何其他可偵測信號予以偵測。於該可偵測部份體為酵素(例如，鹼性磷酸酶)的情況中，可在酵素質和酵素活性所需的任何添加因子的存在中產生信號。於可偵測部份體為酵素受質的情況中，可在酵素及酵素活性所需的添加因子之存在中產生信號。將可偵測部份體附加到標的蛋白質所用的適當用劑組態包括將可偵測部份體附加到標的蛋白質之共價附加，可偵測部份體與共價附加到標的蛋白質的另一標記劑成分之非共價締合，及可偵測部份體對可與標的蛋白質非共價締合的標記劑成分之共價附加。通用蛋白質染色經詳載於在2004年8月12日提出申請的美國專利申請序號10/504,696，名稱"Methods and Reagents for Detecting Target Binding by Nucleic Acid Ligands"之中。
於某些具體實例中，UPS為包含一可偵測部份體的單一化學劑，且可與蛋白質特具，但非適合體特具的官能基共價反應，且於如此反應中，將可偵測部份體共價附加於標的蛋白質。根據此具體實例的UPS包括染料，其具有能夠與蛋白質獨具的官能基共價地反應之基。此等基可經由將未改質染料衍化而加到染料上或可能存在於未改質染 料上。於一具體實例中，UPS包含經N-羥基丁二醯亞胺活化的染料，其可與胺基反應，諸如經N-羥基丁二醯亞胺活化的螢光體，包括NHS-Alexa螢光體(諸如，NHS-Alexa 647)。另一種可用的UPS為CBQCA(3-(4-羧基苯甲醯基)喹啉-2-甲醛)，其可在氰化物或硫醇存在中與胺反應而形成高度螢光性異吲哚。適用於USP劑中的其他胺反應性基包括異氰酸酯、異硫氰酸酯、醯基疊氮化物、磺醯基氯化物、醛、4-磺酸基-2,3,5,6-四氟苯酚(STP)酯，TFP-Alexa 647，與芳基化劑諸如NBD(7-硝基苯并-2--1,3-二唑)氯化物，NBD氟化物，及二氯三。
於其他具體實例中，UPS包含複數種藥劑。例如，UPS可包含能與標的蛋白質共價地反應之第一種藥劑，及一或多種其他藥劑，其可通過第一種藥劑所引入的化學基或其他官能性，將可偵測部份體，直接或間接地，且共價或非共價地附加到標的蛋白質。在UPS包含多種藥劑的情況中，可理解者，於某些情況中，該等藥劑係依序添加者，且於其他情況中，彼等可同時加入。
於一具體實例中，適當的UPS包含(a)可與標的蛋白質反應之生物素衍生物；和(b)鏈黴抗生物蛋白質-可偵測部份體共軛拼合物，諸如，螢光性鏈黴抗生物素蛋白衍生物或鏈黴抗生物素蛋白-酵素共軛拼合物。生物素衍生物會與胺基反應，由是將生物素共價地附加到標的蛋白質；鏈黴抗生物素蛋白-可偵測部份體共軛拼合物可結合 到經固定化的生物素基，藉此將該可偵測部份體定位化到固體承載體上有結合標的蛋白質之部位。於此具體實例中，適當的藥劑包括PFP-生物素、NHS-PEO4 -生物素(間隔臂(spacer arm)29Å)、磺酸基-NHS-LC-生物素(間隔臂22.4Å)、和TFP-PEO3 -生物素(間隔臂32.6Å)。
於另一具體實例中，適當的UPS包含：(a)生物素，或生物素衍生物，經共軛拼合到能夠將生物素或生物素衍生物共價附加到結合標的蛋白質的反應基；(b)抗生物素蛋白質及/或鏈黴抗生物素蛋白；及(c)生物素-可偵測的部份體共軛拼合物，諸如，螢光性生物素衍生物。上面(a)中的生物素衍生物可為胺-反應性生物素衍生物，諸如，NHS-生物素，其中該生物素係隨意地以間隔原子從NHS分開(Calbiochem,Inc.)。NHS基與結合標的蛋白質上的一級胺之反應導致生物素共價附加到已結合到其對應的適合體之標的蛋白質。與其相應適合體複合物的蛋白質可隨後用鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白予以處理。由於鏈黴抗生物素蛋白和抗生物素蛋白各可結合四個生物素，因此，此等蛋白質的添加可對每一原來就經NHS-生物素偶合到經結合的標的蛋白質之生物素提供三個生物素結合部位。上面(c)的生物素-可偵測部份體衍生物即可隨後加入，其隨即緊密地結合到鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白上未被占有的生物素結合部位。於此具體實例中，適當的藥劑包括DFP-生物素、NHS-PEO4 -生物素(間隔臂29Å)、磺酸基-NHS-LC-生物素(間隔臂22.4Å)，及 TFP-PEO3 -生物素(間隔臂32.6Å)。
諸如標記劑的本質、標的分子的本質及對其預定的截止含量，特定標的物含量的生物學意義等之考慮通常決定標記劑的濃度，包括可用的特別用劑之個別濃度。每一該等藥劑的最後濃度通常係以實驗決定以使該方法的敏感度最優化。於一具體實例中，標記劑的濃度通常足以偵測至少約1%的標的分子。於另一具體實例中，標記劑的濃度常足以偵測至少約10%的標的分子。於又一具體實例中，標記劑的濃度常足以偵測至少約90%的標的分子。
標記劑的活化決定於所用藥劑的本質。例如，對於用光活化的彼等藥劑，係用恰當波長的光照射藥劑。其他活化方法可由本文的揭示令諳於此技者聯想到。對於某些標記劑，例如涉及放射性標記、酵素等的標記劑，都不需活化劑。對於酵素系統，可能需要添加受質及/或輔因子。
對於標記劑產生的信號之存在及/或量之固體承載體的檢驗包括該信號的偵測，其通常僅為一道讀取信號之步驟。信號通常係使用儀器讀取，儀器本質決定於信號的本質。該儀器可為光譜光度計、螢光計、吸收光譜計、發光計、化學發光計、露光計、照片儀器、和類似者。所偵測的信號之存在及/或量係關聯於測試樣品中所含任何標的分子高於預定截止含量的存在和量。測量中的溫度適當可從約10℃至約70℃，或從約20℃至約45℃，或從約20℃至約25℃。於一種作法中，係使用已知濃度的測試標的分子形成標準曲線。也可以使用校準和其他對照物。
於一具體實例中，係將固體承載體，包括例如陣列，移動到一檢驗裝置，於該處探究固體承載體的表面是否含有任何經結合的標的分子。該檢驗裝置可為包括光學系的掃描裝置。例如，可經由照射該陣列且讀取該陣列所含每一特徵處所得信號(例如，螢光)之位置和強度，而檢驗或讀取該陣列。掃描器可類似於，例如得自Tecan Systems,San Jose,California的TECAN LS 300掃描器。不過，也可經由使用前述以外的方法或裝置，使用他種檢驗陣列的方法，包括其他光學技術(例如，偵測化學致發光性或電致發光性標籤)與電技術，來檢驗或讀取陣列。
從陣列檢驗所產生的結果可為原始結果(諸如在一或更多色頻中的一特徵之螢光強度讀值)或可為處理過的結果，諸如將針對一特徵為低於預定的底限值之讀取值排斥掉所得結果及/或根據從陣列所得圖案讀取形成結論(諸如測試樣品中是否含有一特別的標的分子)。於需要時，可將檢驗結果(有處理過者與否)傳送到(諸如經由通信)遠方位所，且於該處接收供進一步用(諸如進一步處理)。
於另一具體實例中，係在電腦控制之下，亦即藉助電腦，來進行該方法。例如，可以利用IBM® 相容性個人電腦。電腦係以對本文所述方法具特異性之軟體予以驅動。能夠幫助本文所揭示的方法之實施的電腦硬體可包括具有下列規格之系統，Pentium® 處理器或更佳者，帶有至少(100MHz的時鐘速度，至少32百萬位元的隨機存取記憶體(RAM)，及至少80百萬位元的虛擬記憶體，在例如 Microsoft window® 95或Microsoft Window NT® 4.0操作系統(或彼等的後代)之下運轉。
可用來實施該方法的軟體可為，例如，Mircosoft Excel或Microsoft Access® ，通過使用者撰寫出的功能和模板適當地擴充，且在需要時聯結到可能需要的獨立程式。用來幫助進行本發明方法的軟體或電腦程式之例子可為在Visual BASIC® 、FORTRAN、C、C++ 、Java、Python，或目前或未來可取得的任何其他適當編程語言中撰寫出者。必須了解者，上述用於本發明中的電腦資料和軟體都僅為範例且無意具有限制性。本文所揭示的任何方法都可經適當到其他電腦、電腦系統，和軟體。可以用到的其他語言包括，例如，PASCAL、PERL或組合語言。
於另一具體實例中，係使用質譜分析法偵測及/或定量分析適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)。參照圖1B，於偵測及/或定量分析可能存在於測試樣品中的標的分子所用範例方法中，係令測試樣品接觸包括標籤且對標的分子具有特異性親和性之適合體。使其形成包括經結合到標的分子的適合體之適合體親和複合物。若測試樣品包含標的分子，則通常會在測試樣品中形成適合體親和複合物。該適合體親和複合物可隨意地經由使用對所用適合體為恰當之方法予以轉化成為包括經共價鍵結合到其標的分子之適合體的適合體共價複合物，適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)係經附加到一固體承載體上。該附加係經由令固體承載體接觸適合體親和複合物 (或隨意的適合體共價複合物)且使適合體上所包括的標籤，直接或間接地締合經附加到固體承載體的探針，而完成的。適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)在與固體承載體上的探針締合後即可準備供使用質譜分析法予以偵測(及隨意的定量分析)。
適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)可使用多種方法的任何一者予以準備用於以質譜分析法進行偵測及隨意的定量分析。例如於一具體實例中，當標的分子的一蛋白質之時，適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)係在從固體承載體取出複合物之前或之後，用蛋白酶消化而準備。於另一具體實例中，係將適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)從固體承載體釋放出之後，使用技藝中已知的許多方法之任何者準備供質譜分析所用，包括使用矩陣輔助雷射脫吸離子化(MALDI)、表面增強雷射脫吸離子化(SELDI)、電噴離子化、或電子撞擊離子化於一具體實例中，可將適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)直接溶析到電噴離子化質譜儀中，於其他具體實例中，可對溶析過的測試樣品進一步處理，諸如，酵素消化或化學改質，然後才進行質譜分析。質譜可經由，例如，電噴離子化、矩陣輔助雷射脫吸離子化，或電子撞擊離子化，而得到。
典型地，以質譜分析法定量分析標的分子時需要一內標準，亦即，摻加到要分析的測試樣品中的已知濃度化合物。理想內標準具有類似於標的分子之溶析和離子化特 性，但產生不同的質量對電荷比。常用的內標準為標的分子的穩定同位素標記型式。於一具體實例中，係將經穩定同位素標記型式的標的分子加到測試樣品中作為內標準。對應於測試樣品中的各種成分之光譜峯即可與內標準的峯高或面積相比對，藉此促成標的分子的定量分析。
於另一具體實例中，標的分子之定量分析係經由將對應於標的分子的譜峯之峯高或面積與從具有已知濃度的標的分子之一組樣品所產生的彼等譜相比較。得自具有已知濃度的標的分子的樣品之譜峯所具峯高或面積構成一標準曲線，自此曲線可計算出測試樣品中的標的分子之未知濃度。
於另一具體實例中，係使用Q-PCR來偵測及/或定量分析該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)。於用在本文中時，"Q-PCR"係指以下述方式及控制條件下實施的PCR使得檢定結果係量形式者，亦即，該檢定能夠定量分析出測試樣品中所含適合體之量或濃度。參照圖1B，於一偵測及/或定量分析可能存在於測試樣品中的標的分子所用範例方法中，係令測試樣品接觸可能包括標籤且對標的分子具有特異性親和性之適合體。使其形成包括經結合到其標的分子的適合體之適合體親和複合物。若測試樣品包含標的分子，則通常會在測試樣品中形成適合體親和複合物。該適合體親和複合物可以使用對所用適合體恰當的方法隨意地轉化為包括經共價鍵結到標的分子的適合體之適合體共價複合物。如本文中進一步說明 者，在形成適合體親和複合物及任何隨意地轉化適合體共價複合物之後，即將可能存在於測試樣品中的任何游離適合體從適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)分離開。然後使用已知用於聚核苷酸的量化複製之技術定量分析該適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)。
於一具體實例中，測試樣品中適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)的量或濃度係使用TeqMan® PCR予以測定。此技術通常依賴低聚核苷酸複製酵素的5’-3’核酸外切酶活性以產生來自標的序列之信號。ToqMan探針係根要定量分析的適合體所具序列來選擇且通常包括5’-端螢光體，諸如6-羧基螢光素，及3’-端淬滅體(quencher)，諸如6-羧基四甲基螢光素，以在使用聚合酶鏈型反應(PCR)擴增適合體序列時產生信號。隨著聚合酶複製出適合體序列，核酸外切酶活性可從探針釋出螢光體、其從PCR引子的下游黏合(anneal)，由是產生信號，信號會隨著複製產物的產生而增加。PCR產物的量決定於所實施的複製循環之數目及適合體的起始濃度。
於另一具體實例中，適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)的量或濃度係在複製程序中使用嵌入性螢光染料予以測定。嵌入性螢光染料，諸如，SYBR® 綠，會在雙股DNA存在中產生相較於在單股DNA存在中產生的螢光信號為較大之螢光信號。隨著在PCR中雙股DNA產物之形成，染料產生的信號也增加。所產生的信號之大 小係決定於PCR循環的數目及適合體的起始濃度。
於另一具體實例中，適合體親和複合物(或隨意的適合體共價複合物)的量或濃度係在複製序中使用"分子信標"(molecular beacon)(參閱，例如Tyagi et al.,Nat.Biotech.16：49 53,1998；美國專利第5,925,517號)。分子信標為一種特殊的核酸探針，其摺疊或髮夾迴圈且在髮夾結構的一端含有螢光體而在另一端含有淬滅體使得在髮夾形成時不會從螢光體產生信號。該迴圈序列對標的聚核苷酸序列具特異性，且在雜合到適合體序列之後，髮夾打開且因而產生螢光信號。
可以利用電腦程式來實施本文所揭示的諸方法中任一者的一或更多個步驟。本發明的另一方面為一種電腦程式產品，其包括一其上面具有儲存的電腦程式之電腦可讀取之儲存媒體，其在裝載到電腦內時，可實施或幫助實施本文所揭示的任一方法。
本發明的一方面為本文所揭示的任一方法之產物，亦即，檢定結果，其可在測試場所評估或其可經運送到另一場所評估且於需要時通信到遠處的相關團體。如用在本文中者，"遠處"指的是在物理上不同於得到結果之處的位置。據此，可將該等結果送到不同的房間，不同大樓、城市的不同部份、不同的城市等。數據可用標準手段傳送諸如傳真、郵遞、隔夜傳送、電子信箱、ftp、音信、和頻似者。
"通信"資訊指的是將表出該資訊的資料以電信號形式 經由適當的通信頻道(例如，私人或大眾網路)進行之傳送。"轉遞"一物項意指將一物項從一位置送到下一位置之任何手段，不論係經物理方式運送該物項或者(可能時)其他方式運送，且包括，至少於資料的情況中，物理方式傳送一載有資料的媒體或通信該資料。
參照圖3，於偵測及/或定量分析可能存在於一測試樣品的一或多種標的分子所用另一範例方法中，可以令可能包含一標的分子和至少一種非標的分子之測試樣品接觸競爭分子(於圖3中示為Option A)。於此可形成一或多種非特異性複合物。然後令該測試樣品接觸包含標籤且對一標的分子具有特異親和性之適合體。使其形成包含經鍵結到其標的分子的適合體之適合體親和複合物。若該測試樣品含有該標的分子，則通常會在測試樣品內形成適合體親和複合物。依測試樣品的本質而定，也可形成一或多種在適合體與一或多種非標的分子之間的非特異性複合物。若令測試樣品接觸競爭分子，也可能形成且存在於測試樣品內之多種非特異性複合物。
然後可隨意地將測試樣品暴露於該測試樣品的動力學上挑激成分之條件下(圖3中示為Option B)。如下面要進一步說明者，動力學上挑激可包括稀釋該測試樣品，將競爭分子導到測試樣品內，或將適合體親和複合物捕捉到固體承載體上接著洗滌，洗液中可含或不含競爭分子。若有導入競爭分子，則在解離後不可能再形成介於適合體與任何非標的分子之間的非特異性複合物。由於非特異性複合 物通常解離得比適合體親和複合物更為快速，因此動力學挑激含減低適合體涉入與非標的物的非特異性複合物之內有效的動力學挑激可提供額外的特異性給該檢定，除了起始適合體結合事件和後面的共價交互作用所給者以外。
不論是否有採用動力學挑激。已形成的適合體親和複合物即可經由使用對所用適合體為恰當的方法轉化成包含經共價結合到其標的分子的適合體之適合體親和複合物。於形成適合體共價複合物之後，可以隨意地從測試樣品分離掉測試樣品中可能包含的任何游離或未複合適合體(圖3中Option C所示者)。隨意地，可從測試樣品分離掉測試樣品中可能包含的任何游離或未複合之非標的分子和標的分子(圖3中Option D所示者)。隨意地，在形成適合體共價複合物之後，可移除掉游離適合體和游離非標的分子與標的分子，任一順序皆可。
若使用稀釋來導入動力學挑激，較佳者要將後面含有適合體共價複合物的測試樣品予以濃縮。若可用時，此濃縮可以使用下面針對從測試樣品隨意分離出任何游離適合體及/或將可與標示劑反應的測試樣品之其他成分移除掉之步驟所述方法予以完成。
然後使用本文所述任何方法或諳於此技者已知的任何其他適當方法來偵測及/或定量分析該測試樣品中所含適合體共價複合物。例如，可經由令固體承載體接觸測試樣品且使適合體上的標籤與經固定化在該固體承載體表面上的探針，直接或間接地締合，而將適合體共價複合物附加 在固體承載體的表面。然後偵測及隨意地定量分析已與固體承載體上的探針締合之適合體共價複合物。在偵測及隨意的定量分析之前的任何點，亦即在該適合體共價複合物附加在固體承載體之前或之後的任何時間，令適合體共價複合物接觸標示劑以促成所結合的標的分子之偵測。如諳於此技者所了解者，也可以使用質譜分析法、Q-PCR、或技藝中已知的任何其他適當方法來偵測及/或定量分析該適合體共價複合物。
於用在本文中之時，"競爭分子"和"競爭物"係可互換地用來指稱可與非標的分子形成非特異性複合物之任何分子。"多競爭分子"或"多競爭物"指的是一組以上的此等分子組。競爭分子包括低聚核苷酸、聚陰離子(例如，肝素、單股鮭魚***DNA、和葡聚醣(如，葡聚醣硫酸鹽))、無鹼性磷酸二酯聚合物、dNTPs、和焦磷酸鹽。於使用競爭物的動力學挑激情況中，該競爭物也可為能與適合體形成非特異性複合物任何分子。此等競爭物分子包括聚陽離子(如，精胺、亞精胺、聚離胺酸、和聚精胺酸)及胺基酸(如，精胺酸和離胺酸)。
於用在本文中之時"非特異性複合物"指的是除適合體與其標的分子以外的一或多種分子之間的非共價鍵締合。因非特異性複合物不是以其組成分子之間的親和***互作用為基礎而選擇，而是呈現分子類別之間的交互作用，所以締合在非特異性複合物內的分子平均而言會展現出對彼此都遠較為低的親和性，且比適合體和其標的分子都相應 較高的解離速率。非特異性複合物包括在適合體與非標的分子之間，競爭物與非標的分子之間，競爭物與標的分子之間，及標的分子與非標的分子之間形成的複合物。
於用在本文中之時，術語"動力學上挑激"和"動力學挑激"指的是從一組包括適合體親和複合物與非特異性複合物的複合物，經由施加動力學壓力及利用此類複合物的組成物所具不同親和特性，包括解離速率，以增濃適合體親和複合物之程序。動力學挑激通常會導致特異性的增加，係因為適合體-非標的物複合物異型地會比適合體-標的物複合物較為減少之故。於用在本文中之時，術語"動力學壓力"指的是一種手段，用以提供機會給複合物的天然解離及/或抑制經從複合物自然解離出的分子之再結合。動力學壓力可經由添加競爭分子；或單純地經由稀釋；或經由在複合物結合到固體承載體之時，徹底洗滌；或經由諳於此技者所知的任何其他手段而施加。如諳於此技者所了解者，因為動力學挑激通常有賴於適合體親和複合物與適合體非標的物複合物之間的不同解離速率，所以動力學挑激的持續期係經選擇成得以保留高比例的適合體親和複合物，同時實質地減低適合體非標的物複合物之數目。要使動力學挑激有效用，適合體親和複合物的解離速率較佳地要明顯低於適合體非標的複合物。由於適合體可經選擇為包括特別性質，因此適合體親和複合物的組成分可經設計成具有相較為低的解離速率。
於用在本文中之時，術語"分離"指的是從測試樣品分 出或移除一或多種分子物種。分離可用來增加敏感性及/或或減低背景。在適合體共價複合物形成後，適合體親和複合物因共價鍵變成不可逆之時，分離最有效。
例如，從測試樣品移除游離適合體可增加檢定的敏感度，係因為在將適合體共價複合物附加到固體承載體表面上的探針之中，游離適合體可能與適合體共價複合物競爭之故。在使用QPCR來偵測及隨意的定量分析之時，游離適合體的移除有助於標的分子的偵測和定量分析。於一具體實例中，標的分子為蛋白質且經由可沈澱蛋白質，和包括蛋白質的複合物，諸如適合體共價複合物，而不沈澱測試樣品中所的游離核酸之用劑將游離適合體從適合體共價複合物分離出。此等用劑可包括K+ /SDS、丙酮、(NH4)2 SO4 、Pro Cipitate，和技藝中已知的其他荷電聚合物。
於一具體實例中，係將適合體，諸如對標的分子，於此例中為標的蛋白質，具有特異親和性的帶標籤光適合體，導到測試樣品中。如本文中進一步說明者，在形成適合體親和複合物及轉化成適合體共價複合物之後，使用恰當用劑，諸如任何上列用劑或任何其他適當用劑從測試樣品沈澱出適合體-蛋白質共價複合物的與未複合的蛋白質。將測試樣品經沈澱出的成分以離心沈著，並丟棄含游離適合體的上澄液。然後將含有游離蛋白質及適合體-蛋白質共價複合物的沈丸懸浮在恰當的溶液內，諸如檢定結合稀釋劑，且之後可在將適合體共價複合物附加到固體承 載體之前或之後，令適合體共價複合物接觸標記劑。然後，經由偵測適合體共價複合物上的標記劑而偵測及/或定量分析標的分子(若共有存在於測試樣品中時)。
為了減低檢定背景，可從測試樣品移除能與標記劑反應且不會共價鍵結到適合體之分子。於一具體實例中，此係經由從測試樣品沈澱出適合體，包括游離和複合兩者，而要丟棄的上澄液中留下能與標記劑反應的其他分子。此等核酸沈澱可用包括下列的用劑來完成：溴化鯨蠟基三甲基銨(CTAB)、溴化十二烷基三甲基銨(DTAB)，及有機溶劑諸如乙醇，於另一具體實例中，係經由將適合體雜合到固體承載體而從樣品分離出適合體，包括游離及經複合兩者。於此例中，該固體承載體可包括微珠粒(例如，順磁性珠粒)，本文中述及的任何其他適當固體承載體，和類似者。於使適合體雜合到適當固體承載體的表面之後，即可容易地移除含有能與標記劑反應的分子之溶液，導致適合體共價複合物之濃縮。如諳於此技者所理解者，以此方式進行的適合體分離可以使用包括在適合體上的標籤或在適合體上的某種其他核酸序列將該適合體雜合到經附加到固體承載體的適當互補核苷酸序列。
於一具體實例中，係將帶標籤的適合體，諸如對標的蛋白質具有特異親和性的帶標籤光適合體，導到測試樣品中。如本文中進一步說明者，在形成適合體親和複合物及轉化為適合體共價複合物之後，使用恰當的用劑，諸如任何上列用劑或任何其他適當用劑從測試樣品沈澱出適合體 -蛋白質共價複合物和游離適合體。經由離心將測試樣品經沈澱的成分沈著成丸，且丟棄含有未複合標的物和測試樣品的其餘物之上澄液。然後將含有游離適合物和適合體共價複合物的沈丸懸浮在恰當的溶劑內，諸如檢定結合用稀釋劑，然後可令該適合體共價複合物和游離適合體，在將該適合體共價複合物附加到固體承載體之前或之後，接觸標記劑。之後，經由偵測在該適合體共價複合物上的標記劑來偵測及/或定量分析標的分子(若其有存在於測試樣品內之時)。
於另一具體實例中，係將帶標籤的適合體，諸如對標的蛋白質具有特異親和性之帶標籤光適合體，導到測試樣品內。如本文中進一步說明者，在形成適合體親和複合物及轉化成適合體共價複合物之後，使用，例如含有對適合體標籤呈互補的探針之珠粒，將適合體-蛋白質共價複合物和游離適合體捕捉到固體承載體上。將珠粒沈著成丸，其在順磁性珠粒情況中，可用磁力，或對於非順磁性珠粒可用離心來完成，且丟棄含未複合標的物和測試樣品上澄液。然後，將沈丸懸浮在恰當溶液，諸如檢定結合稀釋劑之內，且使用破解雜合交互作用的任何適當手段，包括例如，熱、高pH、蒸餾水、此等的某些組合，或任何其他已知方法溶析出適合體共價複合物和游離適合體。再將珠粒沈著成丸，且令含有游離適合體和適合體共價複合物的上澄液在將適合體共價複合物附加在固體承載體之前或之後，接觸標記劑。然後，經由偵測在適合體共價複合物上 的標記劑而偵測及/或定量分析該標的分子(若其有存在於測試樣品中之時)。
於另一具體實例中，檢定係按上面概述者實施，直到且包括在丟棄含有未複合標的物和測試樣品的上澄液之後，將珠粒懸浮之步驟。然後，在從珠粒溶析出游離適合體與適合體共價複合物之前，可令適合體共價複合物接觸標記劑，接著重複沈著及洗滌以移除未反應的標記劑，才令固體承載體接觸適合體共價複合物以偵測及/或定量分析標的分子。
於本文所揭示的任何方法中，可將測試樣品製備成該測試樣品的二或更多稀釋液。此可增加標的分子可存在於測試樣品中且可用本文揭示的方法予以偵測之動態濃度範圍。個別稀釋測試樣品可分開檢定直到且包括適合體共價複合物形成，其後可將稀釋測試樣品合併供檢定的其餘步驟所用且在單一固體承載體上同時偵測。於一具體實例中，每一稀釋測試樣品包括一獨特適合體，藉此促成對應標的物之單一測量。於另一具體實例中，可將適合體加到二或多份稀釋樣品中，每一稀釋液分別接觸各針對一特別標的物之帶標籤適合體，促成在單一固體承載體上對每一不同稀釋樣之特異性適合體信號之偵測。以此方式將諸稀釋樣連鎖起來可將單一標的分子的動態範圍擴大許多數位級數目在重疊的定量分析區導致單一標的物濃度的多重測定時添加準確性。
於一具體實例中，係將一組測試樣品製備成系列稀釋 樣，於其中導入帶標籤的適合體，諸如對一標的分子具有特異親和性的帶標籤光適合體。於每測試樣品稀釋液中可加入帶不同標籤的相同適合體。如本文中進一步說明者，在形成適合體親和複合物及轉化適合體共價複合物之後，可將諸個別測試樣品合併且在將適合體共價複合物附加到固體承載體之前或之後接觸標記劑。然後經由偵測在適合體共價複合物上的標記劑而偵測及/或定量分析標的分子(若其有存在於測試樣品中之時)。對每一各具不同標籤的適合體偵測所得信號可合併以準確地定量測定出在原測試樣品中的標的分子之量或濃度。例如，第一稀釋樣可導致標的物最大信號，產生僅為半定量資訊，而第二稀釋樣可導致低於飽和的信號，促成在測試樣品中的標的物之正確定量分析。
於另一具體實例中，係將一組測試樣品製備成一系列稀釋樣，於其中導入帶標籤適合體，諸如對標的分子具有特異親和性的帶標籤光適合體。於每一稀釋樣中可加入各具獨一標籤的不同適合體。如本文中進一步說明者，在形成適合體親和複合物及轉化成適合體共價複合物之後，將個別測試樣品合併且在將適合體共價複合物附加到固體承載體之前或之後，接觸標記劑。然後經由偵測在適合體共價複合物上的標記劑偵測及/或定量分析測試樣品中所含標的分子。所得信號可對在許多數量級內的標的物範圍進行定量分析，取決於原始樣品的不同系列稀釋。
於文所揭示的任何方法中，可將測試樣品對參考樣品 相比較。"參考樣品"於本文中係指稱含有複數種分子且已知包括至少一種標的分子之任何材料、溶液、或混合物。也可以知道參考樣品中所含任何標的分子的正確量或濃度。術語"參考樣品"包括生物樣品，如本文中所定義者，及可能用於環境或毒物學測試之樣品，諸如經污染或可能被污染的水和工業放流物。參考樣品也可為製備程序，例如製造程序的終端產物、中間產物、或副產物。參考樣品可包括經添加到得自生物或得自某種其他來源(如環境或工業來源)的材料、溶液或混合物中之檢定介質、緩衝液、或稀釋劑。
於一具體實例中，參考樣品係與測試樣品以相同方式分開處理直到，但不包括，暴露於標記劑，其僅在此具體實例，必須在將適合體共價複合物附加於固體承載體之前發生。使用兩種不同的標記劑來區別參考樣品中的標的物含量與測試樣品中的標的物含量。在令樣品接觸標記劑之後，將彼等均等混合且可同時接觸固體承載體。然後經由分別測量來自每一標記劑的信號可直接比較在參考樣品與測試樣品之間的任何差別表現(亦即，樣品中標的物的差別量或濃度)。兩種標記劑可包括Cy3與Cy5配對、及Alexa 555與Alexa 647配對。於一具體實例中，參考樣品可為代表對照組的合併生物樣品。於另一具體實例中，參考樣品可為來自個體，第一時間收集的生物樣品，且測試樣品可得自相同個體但在第二時間收集者，由是可經由測量和評定由個體在不同時間提供的多份生物樣品中的一 或更多種標的分子在量或濃度上的任何變化而幫助對一個體的縱向研究。
於一具體實例中，係將帶標籤適合體，諸如對標的分子具有特異親和性的帶標籤光適合體導到參考樣品與測試樣品兩者之內。如本文中進一步說明者，在形成適合體親和複合物及轉化成適合體共價複合物之後，令兩種樣品接觸兩種不同的標記劑，包含兩種不同的偵測分子。然後可將兩種分開標記的含適合體共價複合物之樣品附加到固體承載體。之後可經由偵測在適合體共價複合物上的兩種標記劑而偵測及/或定量分析標的分子(若在任一或兩樣品中含有時)，典型地，例如，當偵測標記為螢光分子時，係在不同的激發波長和發射波長實施多重掃描。此種定量分析可導致對參考樣品與測試樣品中的差別標的物量或濃度之更正確評定且在所用參考樣品為相同者之時，幫助不同測試樣品之間的比較。
於本文中所揭示的任何方法中，可以使用多種標記劑來分析單一測試樣品。於一具體實例中，可對單一測試樣品使用二或多種標記劑，各具不同的化學以標記不同的標的分子部份體及隨意地不同偵測基。不同的化學可標記標的分子上的不同官能基，由此可導出額外的資訊。例如，於標的蛋白質的情況中，一標記可以經由使用與第一胺(如，離胺酸)反應的化學而附加到標的物，而第二標記可透過與例如，典型地伴隨糖基化蛋白質的醣基反應之化學附加到標的物。由一共同適合體所辨識的在相同標的分子 上之此兩種部份體之相對定量分析可提供有關在測試樣品中該標的物的糖基化程序之有用資訊。
於一具體實例中，可在測試樣品中導入帶標籤的適合體，諸如對標的分子具有特異親和性之帶籤光適合體。如本文中進一步說明者，在形成適合體親和複合物與轉化成適合體共價複合物之後，可令測試樣品接觸兩種不同的標記劑，各會不同的偵測分子，此可在令該適合體複合物接觸固體承載體之前之後進行。於一具體實例中，偵測標記與化學都是獨一者，用以對包含一適合體共價複合物的相同測試樣品給予依序標記。於另一具體實例中，可於一反應中同時進行該等化學。之後，可經由偵測在該適合體共價複合物上的兩種標記劑而偵測及/或定量分析該經多重標記的適合體共價複合物，典型地，例如當偵測標記為螢光分子時，經由在不同的激發波長和發射波長實施多重掃描。
於另一具體實例中，二或多種不同的標記劑採用相同的偵測標記。該檢定係按上述進行，直到且包括轉化成適合體共價複合物，其後將測試樣品分成與不同標記劑一樣多的液份，且令每一測試樣品份分別接觸一種標記劑，此可在將適合體共價複合物附加到固體承載體之前或之後進行。隨後可分開地偵測及/或定量分析包含適合體共價複合物的經分開標記的測試樣品液份。
本文中所述任何方法都可用來執行測試樣品的多重分析。任何此種多分析都可包括使用至少兩種、至少數十 種、至少數百種、或至少數千種適合體以同時檢定一測試樣品諸如，生物樣品中同等數目的標的分子。於此等具體實例中，可在測試樣品中導入複數種帶標籤適合體，諸如帶標籤光適合體，各對一種標的分子具有特異親和性。如本文進一步說明者，在形成適合體親和複合物和轉化成適合體共價複合物之後，透過經固定化在固體承載體的複數種相應探針，將適合體共價複合物附加到固體承載體上。在將該適合體共價複合物附加到固體承載體之前或之後，可令該適合體共價複合物接觸標記劑。然後，經由偵測在適合體共價複合物上的標記劑而偵測及/或定量分析測試樣品中所含的標的分子。
本發明另一方面係有關套組(kits)，可用來方便地實施本文所揭示的方法以分析測試樣品。為了提高本發明的多用途性，可將試劑提供於包裝組合中，於相同或分開的容器內，使得試劑比例可提供該方法和檢定的實質最優化。諸試劑可各在分開的容器或可將各試劑組合在一或多個容器內，取決於試劑的交互反應性和穩定性。
一套組包含，於包裝組合中，至少一種帶標籤適合體，包括至少一種探針的固體承載體、與適當的標記劑。套組也可包括洗滌溶液諸如用於樣品稀釋以及陣列洗滌的緩衝水性介質，樣品製備試劑；等。套組中各試劑的相對量可有廣幅變異以提供使檢定中需要發生的反應實質最優化及進一步便檢定敏感度最優化之試劑濃度。在恰當情況下，可將套組中的一或多種試劑提供成乾粉末形式，常為 經冷凍乾燥者，包括賦形劑，其在溶解後提供具有用於實施根據本發明的方法或檢定之恰當濃度的試劑溶液。該套組可進一步包括本文所述本發明方法之書面說明。
於一範例具體實例中，偵測及/或定量分析可能存在於測試樣品中的一或多種標的分子所用的套組包括至少一種對一標的分子具有特異親和性且包含一標籤之適合體；標記劑；及固體承載體，其中該固體承載體包括經配置於其上之至少一探針，且其中該探針能夠與該適合體上面的標籤締合。
實施例
下面的實施例係經提供僅供闡明目的所用且無意用以限制在後附申請專利範圍中所界定的本發明範圍。
實施例1 使用以固定化在表面上的探針雜合捕捉測量經系列地稀釋在緩衝液與血漿內的VEGF以偵測和定量分析之光適合體檢定
此實施例闡述如圖2A、2B、和2C中所示用於單一光適合體及其標的蛋白質之檢定所含步驟。該檢定使用兩種不同的測試樣品，緩衝液和血漿，來實施。
A.低聚核苷酸之製備。於此係使用包括在光適合體的3’端之DNA低聚核苷酸標籤。於此例中，該標籤為在SELEX實驗程序中所用的3’固定區。VEGF光適合體509 -80係使用習用合成器在固相上以磷醯胺酸酯DNA合成所用的標準實驗程序予以合成。含5-BrdU的光適合體係在比DNA合成中的標準條件較溫和的條件中切開及脫保護，使用1：1：2比例的第三丁胺：甲醇：水，在70℃進行5小時，過濾且蒸發乾。使用乙醇沈澱接著逆相HPLC純化適合體。對光適合體上的標籤呈互補且包含胺反應性基的DNA探針係依上述而合成且使用對DNA的標準實驗程序予以切開及脫保護。探針係經由只使用乙醇沈澱予以純化。
B.將捕捉探針固定化在胺反應性表面之上。該捕捉標籤的反向互補物(reverse complement)係按上述合成，具有5’胺且偶合到由環烯烴共聚物(COC)基板上塗覆甲基丙烯酸酯共聚物所構成的胺反應性載片表面，如在2006年3月14日提出申請的國際專利申請第PCT/US2006/008877(WO 2006/101798)，名稱"Polymer Compound for Biomedical Use and Biochip Substrate Usting Such a Polymer Compound"中進一步說明者，且於本文中稱為"甲基丙烯酸酯共聚物表面"。捕捉探針微陣列係印刷在該表面上。概述之，令含胺的捕捉探針與埋置在表面內的活性酯基反應。捕捉探針係經稀釋在緩衝液中到20μm(緩衝液係由300mM磷酸鈉、25mM硼酸鈉(pH9.5，21℃),0.01% Tween® 20和1mM 4-二甲胺基吡啶(DMAP)所組成)。使用GeneMachines OmniGrid Accent微陣列器在載片表面上以250pL點三重複沈積捕捉探針。將陣列載 片溫浸於室溫65%濕度中一小時，接著在65℃中一小時且最後在室溫中整夜。剩餘的胺反應性基係在20mM NaOH中水解5分鐘，接著10次H2 O清洗，然後在N2 流下乾燥。使用前，將載片儲存在乾燥室內室溫黑暗中。
將VEGF適合體509-80以1nM濃度與經系列稀釋的標的蛋白質VEGF，從5nM至1.6pM，在100微升檢定稀釋劑(1×SB17(40mM HEPES、102mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2 、1mM EDTA)，0.1% Tween® 20，0.05%，BSA，100微克/毫升鯡魚***DNA)或在10血漿中(10%血漿於1×SB18(40mM HEPES、102mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2 )，200微克/毫升鯡魚***DNA，0.1% Tween® 20)。將各樣品溫和地混合且在37℃下溫浸30分鐘。用從激生分子雷射(Tui Laser ExciStar S200，10ns脈衝長度、200Hz，0.8mJ每脈衝)傳送的1焦耳308奈米光照射樣品。經由在每一樣品中添加1微升丁二醯亞胺基-Alexa 647(10毫克/毫升，DMSO中)以起始染著。將溶液混合且在4℃反應整夜。染著反應係經由添加5微升的10%BSA且溫浸2小時而驟止。最後，於90微升的10%血漿樣品中加入18微升的5M NaCl和4.5微升的10% Triton，且於90微升緩衝液樣品中加入18微升的5M NaCl和0.9微升的10% Triton。將一Grace Proplate墊片附加到含有經固定化探針的載片，造出16洞。每一洞中裝入80微升由600微升5M NaCl與30微升10% Triton和3毫升檢定稀釋劑所構成的溶液且在42℃下溫浸15分 鐘。然後移除此溶液且用80微升樣品置換。用Microseal‘F’膜密封該等洞且在37℃於Eppendorf Thermomixer R上以600rpm混合該載片3小時。移除雜合溶液且用由SB17、0.5% Triton、100微克/毫升鯡魚***DNA和1M NaCl所構成的溶液清洗諸洞3次。然後移除墊片且將整個載片放置在pap瓶中的30毫升由SB17、0.5% Triton和1M NaCl構成的溶液內30分鐘，接著在1×SB17，0.05% Tween® 20內清洗2分鐘，接著在0.5×SB17中清洗30秒。將該載片置於N2 流下乾燥且用TECAN LS300螢光掃描器(激發633奈米/發射670奈米)予以掃描。所得TIF影像係使用得自Imaging Research,Inc.的Array Vision Software予以分析以離析諸特徵且使用處理微陣列影像所用的標準技術計算彼等的平均強度。
結果示於圖4中，其中係按上面對VEGF適合體捕捉探針所述定量分析緩衝液(圖4A)和血漿(圖4B)之結果。從每一回應值減掉無蛋白質的緩衝液對照樣所得兩介質中的系列稀釋所得線性回應係涵蓋從2pM至5nM範圍的VEGF濃度。
實施例2：使用經固定化在表面上的探針之雜合捕捉之光適合體檢定用以偵測和定量分析緩衝液中的多重標的蛋白質
此實施例闡述在圖2A、2B和2C中所述多重格式，使用10種光適合體及彼等的標的蛋白質在緩衝液內之檢 定步驟。
A.帶標籤光適合體之製備。從得自Affymetrix GeneChip® Test3 Array的一組基因表現探針之反向互補物對每一光適合體分配獨特的低聚核苷酸。按實施例1中所述製備帶標籤的光適合體，其中不同處在於在光適合體的5’端添加胺基。在使用之前，將光適合體溶液加熱到95℃ 3分鐘接著以0.1℃/秒的速率控制冷卻到37℃。
B.捕捉探針在胺反應性表面上之固定化。按實施例1所述將捕捉標籤的反向互補物固定化，不同處在於在此例中對探針使用3’端胺且在從印刷緩衝液消去DMAP時使用0.0025% Tween® 20。將印好的載片溫浸在65℃中2小時，接著貯存在乾燥器內整夜。然後用甲氧基乙基胺溶液(pH9.5，於37℃)處理載片以移除未結合的探針及消耗掉表面上的過剩活性酯基。
該檢定係採用圖2A、2B和2C中概述的流程。使用實施例1所述基本實驗程序。不過，有41秒光適合體經多重處理且將對此等適合體的子組之10種標的蛋白質在樣品中系列稀釋。在此實施例中定量分析的蛋白質：光適合體配對包括bFGF：6-7；ERBB4：1797-38；IL-1 R4：1472-3；MCP-3：851-90；PAI-1921-52；TIMP-1：90536；tPA：987-51；uPA：1162-70；VEGF：509-80；VEGF sR2：1546-23。
將各具2nM濃度的41種光適合體與10種標的蛋白質的6系列稀釋液及一無蛋白質的對照樣在100微升檢定 緩衝液(SB17，0.1% Tween® 20)中於37℃下溫浸30分鐘。按實施例1中所述照射和染著諸樣品，不同處在於使用2.1微升的丁二醯亞胺基-Alexa 647且在室溫黑暗中溫浸反應2小時。染著反應係經由添加25微升5M NaCl、5微升Triton X-100、13.5微升100mM甘胺酸和1.5微升10毫克/毫升鯡魚***DNA且在室溫黑暗中溫浸40分鐘，接著在70℃ 2分鐘予以驟止。於雜合之前，按實施例1中所述製備以雜合探針排陣列的加墊片載片。移除預雜合溶液且將雜合樣品加到諸洞內並在45℃潮濕室內溫浸2小時。移除雜合溶液並用45℃由1×SB17、0.33% Triton X-100和1M胍鹽酸鹽所構成的洗滌溶液清洗諸洞3次。然後移除墊片且將整個載片分別置於廣口瓶中所裝的45℃洗滌緩衝液中20分鐘，接著在1×SB17、0.1% Tween® 20、中清洗2分鐘，並於0.25×SB17中進行最後清洗。按實施例1中所述將載片乾燥、掃描及定量分析。結果經陣列於圖5中，其中示出對10種標的蛋白質在從10pM至1nM在緩衝液內的蛋白質濃度進行多重檢定所產生的信號。
實施例3：使用經固定化在表面上的探針進行雜合捕捉以偵測和定量分析血清中的多種標的蛋白質之光適合體檢定
此實施例證實圖2A、2B和2C中所述檢定在使用57種光適合體以多重格式在血清中測量之用途。
A.帶標籤光適合體之製備。按實施例2中所述製備帶標籤光適合體。
B.捕捉探針在胺反應性表面上之固定化。按實施例2中所述固定化捕足標籤的反向互補物。
將57種光適合體分成二組用於多重分析，27種適合體一組者用於人類血清或血漿中的低豐盛度標的物而另一30種適合體一組者係用於高豐盛度標的物者。將14份血清樣品製備成兩稀釋樣且與兩組適合體混合以繪出每一適合體為1nM的最後濃度且對於27種適合體組者為10%血清、0.9×SB1、0.1% Tween® 20、50毫克/毫升lghsDNA、10毫克/毫升(BrdU)30 ，及對於30適合體組者為1%血清、0.99×SB1、0.1% Tween® 20、5毫克/毫升lghsDNA、1毫克/毫升(BrdU)30 。SB1包含40mM HEPES、102mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2 、和1mM CaCl2 。按實施例2中所述將諸樣品平衡、交聯和染著。染著反應係經由添加10微升10%低脂肪酸(FA)BSA、25微升5nM NaCl、5微升10% Triton X100和7微升100mM甘胺酸且在室溫下溫浸40分鐘予以驟止。於驟止後，加入1.5微升10%SDS且將樣品加熱到42℃二分鐘。
按實施例1中所述製備加墊片的載片且與1×SB1、0.1%Tween® 20、0.66%低FA BSA、830mM NaCl、0.33% Triton X100、0.1%SDS、50毫克/毫升大鯡魚***DNA和10毫克/毫升(BrdU)30 一起溫浸15分鐘。移除預雜合緩衝液，加入染著樣品且在60℃潮濕室內溫浸2小時。於雜 合後，按實施例2中所述，將載片洗滌、掃描和定量分析。
圖6顯示出對得自兩個體的血清樣品重複測量57種光適合體所得掃描影像進行定量分析之信號。該等測量經證實具有高度可再現性，對於重複樣品之間的適合體測量得到優於0.99之Pearson相關值。
實施例4：在使用經固定化在表面上的探針進行雜合捕捉的光適合體檢定中經由稀釋進行動力學挑激
此實施例述說在圖3中所示檢定中兩種隨意步驟之使用，動力學挑激接著移除游離蛋白質。該動力學挑激係經由稀釋而完成，示出適合體-蛋白質非特異性複合物之減損，而將適合體-標的物親和複合物保留在血漿中。此實施例也闡述出在稀釋後使用珠粒捕捉來濃縮樣品及在染著前促成游離蛋白質的移除。
A.帶標籤光適合體987-51之製備。按實施例2中所述製備帶標籤光適合體。
B.捕捉探針在胺反應性表面上之固定化。按實施例2中所述固定化捕捉標籤的反向互補物。
將20nM濃度的光適合體987-51混合兩份無蛋白質對照樣及10份經系列稀釋濃度的標的蛋白質tPA，該混合係在檢定緩衝液(SB17，0.1% Tween® 20)中或在血漿中(10%血漿，於SB18，0.1% Tween® 20中)。為了評估在沒 有動力學挑激中的回應，在緩衝液與血漿兩者中分別製備兩份額外的對照樣品，一為無蛋白質者且一為有最高蛋白質濃度者。將體積為10微升的此等28份樣品，在緩衝液中與在血漿中各14份，置於37℃下溫浸30分鐘。於緩衝液和血漿兩者中的前12份樣品中經由添加SB17、0.1%Tween® 20予以稀釋50倍且溫浸5分鐘，接著用1J UV光(OAI Hg燈濾光光源)照射全部28份樣品。於照射之後，按上述將剩餘兩份分別在緩衝液與血漿中的樣品稀釋50倍。
將每一樣品調整到1M NaCl，且於25微克經偶合到對適合體987-51的3’端互補的低聚核苷酸之Dynal順磁性珠粒一起在45℃下溫浸90分鐘。以1000g離心諸樣品2分鐘且移除上澄液。用100微升SB17、0.1%Tween® 20洗滌珠粒3次。將珠粒懸浮在100mM碳酸氫鈉中，1mM EDTA、0.02% Tween® -20、0.2毫克/毫升Alexa 647-NHS染料中，且在室溫搖動1小時。移除染色溶液且改換以100微升SB17、0.1%Tween-20、10mM甘胺酸以驟止染色反應。接著用100微升體積的胍洗滌緩衝液(SB17、0.1%Tween-20、0.33% Triton X-100、1M胍鹽酸鹽)洗滌珠粒3次後，懸浮在70微升0.33%Triton X-100，1毫克/毫升葡聚糖硫酸酯之中且在95℃加熱5分鐘以後磁珠粒溶析出適合體。按實施例2中所述製備加墊片載片且預-雜合。將各65微升含溶析出的適合體之每一上澄液轉移到裝有25微升3.6M NaCl、144mM HEPES、0.33% Triton X-100之洞中。將該等載片溫浸於45℃潮濕室內整夜後，按實施例2中所述洗滌、乾燥、掃描和定量分析。
圖7顯示出在50-倍稀釋後於緩衝液(●)與血漿(▲)中的結果之圖形呈現。從沒有稀釋的高蛋白質對照樣所得信號(○緩衝液、△血漿)都與稀釋後所得值有良好吻合，表面在動力學挑激中標的物信號很少流失。沒有稀釋與有稀釋的無蛋白質血漿RFU分別為838RFU(□，於0.1pM時)及131RFU(△)，導到84%的信號下降，也許是因為在動力學挑激中適合體非特異性複合物經移除掉所致。
實施例5：在使用經固定化在表面上的探針進行雜合捕捉的光適合體檢定中以競爭物施以動力學挑激
本實施例闡述將動力學挑激導到圖3中所示檢定中的隨意步驟。於此實施例中經由添加競爭分子完成的動力學挑激示出適合體-蛋白質非特異性複合物的流失同時將適合體-標的物親和複合物保留在血漿內。
A.帶標籤光適合體987-51之製備。按實施例2中所述製備帶標籤光適合體。
B.捕捉探針在胺反應性表面上之固定化。按實施例2中所述固定化捕捉標籤的反向互補物。
將20nM濃度的光適合體987-51混合-無-蛋白質對照樣及6種經系列稀釋濃度的標的蛋白質tPA在10%血 漿中，經稀釋在SB18、0.1%Tween® 20中的樣品。製備兩組樣品以幫助在有與無競爭物添加的樣品之間的比較。每一溶液都在37℃溫浸30分鐘。於30分鐘的平衡之後，從一組中的每一樣品取出一半添加到相同體積的550μM dN15 競爭物在SB17、0.1% Tween® 20中的溶液且在37℃溫浸9分鐘，接著按實施例4中所述照射。於照射後，於無競爭物的樣品組中添加SB17、0.1% Tween® -20到相等於競爭物添加的體積。按實施例4中所述染著樣品，不同處在於溫浸時間為2小時。經由添加45微升0.83M NaCl、0.33% Triton X-100、0.1毫克/毫升大鯡***DNA和9mM甘胺酸。將樣品混合且溫浸於室溫黑暗中40分鐘，接著加熱到70℃ 2分鐘。
按實施例2中所述製備加墊片載片且溫浸在含SB18、0.1% Tween® 20、0.33% Triton X-100和100微克/毫升大鯡***DNA的溶液中。將樣品加到載片洞內且溫浸在45℃潮濕室內整夜，然後按實施例2中所述予以洗滌、乾燥、掃描及定量分析。
結果顯示在圖8中，其中呈現出有與無添加競爭物的tPA/血漿樣品之劑量回應曲線。沒有添加蛋白質的血漿值因競爭物添加而減低70%，而在競爭物存在中，對最高標的物濃度的回應則不變。
實施例6：在使用經固定化在表面上的探針進行雜合捕捉的光適合體檢中使用適合體親和複合 物的捕捉及洗滌施加動力學挑激
此實施例闡述在圖3中所示檢定中導入動力學挑激之隨意步驟。於此實施例中的動力學挑激係經由將適合體親和複合物捕捉到珠粒上且洗滌經固定化的複合物使得在交聯之前移除經解離的標的蛋白質。
A.帶標籤光適合體987-51、1152-46、和1920-1的製備。按實施例2中所述製備帶標籤的光適合體。
B.捕捉探針在胺反應性表面上之固定化。按實施例2中所述固定化該捕捉標籤的反向互補物。
將4nM濃度的光適合體987-51、1152-46、和1920-1混合8nM濃度的對每一光適合體獨具的標籤序列呈互補之經生物素化探針且在95℃溫浸15秒，然後以0.1℃/秒慢慢冷卻到37℃。將0.2nM光適合體：0.4nM探針的光適合體：生物素化探針複合物混合一無-蛋白質對照樣及6系列稀釋濃度的標的蛋白質tPA、PAI-1和IL-6在檢定緩衝液(SB17、0.1% Tween® 20)或血漿(10%血漿於SB18、0.1%Tween® 20內)中的樣品。此14份樣品在100微升體積中，緩衝液的血漿各7份，在37℃溫浸30分鐘，然後於每一樣品中加入50微克Dynal MyOne鏈黴抗生物素蛋白珠粒且在37℃混合溫浸2分鐘以捕捉非-共價鍵結的光適合體：生物素化探針：蛋白質複合物。使用100微升SB17、0.1%Tween® 20、0.1毫克/毫升鯡魚***DNA洗珠粒30秒三次，再懸浮於100微升彼溶液中，且在混合下用4J UV光(OAI Hg濾光光源)予以照射。
用100mM碳酸氫鈉、1mM EDTA、0.02% Tween® -20洗該珠粒一次，再懸浮於100mM碳酸氫鈉，1mM EDTA、0.02%Tween® 20、0.2毫克/毫升Alexa 647-NHS染料中，且在室溫下搖動1小時。接著用100微升SB17、0.1%Tween-20、0.33% Triton X-100、1M胍鹽酸鹽、25mM甘胺酸洗滌珠粒三次，用100微升SB17、0.1%Tween-20、0.33%Triton X-100洗一次，且懸浮在95微升40mM HEPES pH7.5、0.33% Triton X-100中，並在70℃下加熱5分鐘以從磁珠溶析出適合體。按實施例2中所述製備加墊片的載片且預雜合。取90微升每一含溶析出的適合體之澄液與30微升40mM HEPES-pH7.5、3M NaCl-0.33% Triton X-100混配，在70℃溫浸2分鐘，且分別取110微升轉移到載片洞中。將該等載片溫浸在45℃潮濕室內整夜。取出樣品且各用150微升SB17、0.1 Tween-20、0.33% Triton X-100、1M胍鹽酸鹽在45℃清洗三次。將加墊片的載片拆開，放置在pap瓶內所裝30毫升SB17、0.1% Tween-20、0.33% Triton X-100、1M胍鹽酸鹽之內，且在45℃旋轉20分鐘予以混合。然後將載片轉移到pap瓶內所裝30毫升SB17、0.1% Tween-20中且在20℃轉動混合2分鐘，轉移到pap瓶中所裝30毫升0.2X SB17、0.01% Tween-20內15秒不混合，且按實施例2中所述予以乾燥、掃描和定量分析。
圖9顯示出對tPA適合體987-51(圖9A)、PAI-1 適合體1152-46(圖9B)、和IL-6適合體1920-1(圖9C)在緩衝液(●)和血漿(▲)中的結果之圖形呈現。RFU值都經由對每一適合體減去無-蛋白質緩衝液RFU值予以矯正過。此三種適合體的經矯正無蛋白質血漿RFU值(△，於1pM)分別為66、26和49RFU。
實施例7：在使用固定化在表面上的探針進行雜合捕捉的光適合體檢定中移除游離光適合體
此實施例闡述在如圖3中所示，雜合捕捉之前，移除游離適合體之隨意步驟。以K+ /SDS沈澱蛋白質和適合體-蛋白質共價複合物而游離適合體保留在溶液內以移除游離適合體。將包含游離適合體的上澄液丟棄且將沈丸懸浮而完成該步驟。
A.帶標籤光適合體之製備。按實施例2中所述製備帶標籤的光適合體。
B.捕捉探針在胺反應性表面上的固定化。按實施例2中所述固定化該捕捉標籤的反向互補物。
按實施例1中所述準備在SB18中的結合反應以包含2nM最後濃度的光適合體及除了無蛋白質對照樣之外，從2nM-0.64pM的系列稀釋標的蛋白質。將反應在37℃溫浸30分鐘且按實施例1中所述予以照射。將樣品轉移到1.5-毫升Eppendorf管且加入10微升的合併血漿。於每一樣品中加入300微升下述SDS溶液：1.33% SDS、1.33微克/毫升tRNA和10mM HEPES(pH7.5)(400微升最後體 積)。將各樣品激烈渦旋10秒鐘後，在37℃溫浸10分鐘。於每一反應中加入6微升2.5M KCl且將樣品激烈渦旋10秒鐘，然後保持在冰上10分鐘。經在一微離心機內以8,000g在4℃離心5分鐘將沈澱物沈著成丸。丟棄所得上澄液。經由添加冷的200mM KCl、10mM HEPES(pH7.5)，接著溫和渦旋混合5秒鐘而洗滌沈丸。經由在4℃以8,000g離心5-分鐘將沈澱物再度沈著成丸。丟棄洗滌上澄液。將每一沈丸懸浮在200微升溫(>37℃)1mM EDTA、10mM HEPES(pH7.5)中。在每一樣品中按實施例4中所述加入順磁性珠粒且在50℃激烈混合珠粒懸浮液30分鐘。使用微洞板磁鐵之下，以100微升SB17、0.1%Tween® 20緩衝液洗珠粒3次。將珠粒懸浮在含有0.2毫克/毫升胺反應性NHS-Alexa 647的碳酸鹽緩衝液(pH8.5)中且於固定混合下在25℃溫浸60分鐘。按實施例4中所述驟止反應、洗滌珠粒、溶析出適合體及雜合。按實施例1中所述掃描及定量分析載片。
圖10顯示出有與無移除游離適合體處理樣品所得結果。在將樣品導到探針之前，有從樣品移除未複合的雜合體時，信號較為高。
實施例8：在可影響來自適合體親和複合物的信號但不影響來自適合體共價複合物的信號之條件下產生UPS檢定信號
本實施例展示在將光適合體複合物雜合到在固體承載 體上的其探針之中，使用清潔劑和高鹽濃度時，標的分子對其光適合體的共價鍵附加之效用。針對血漿樣品與在緩衝液中的含bFGF之樣品，比較在本實施例中有光活化媒介共價鍵交聯與沒有者之下實施檢定所得結果。
A.帶標籤光適合體6-7之製備。於此使用的低聚核苷酸為在SELEX實驗程序中所用的3’固定區。bFGF光適合體6-7係按實施例1中所述合成。
B.捕捉探針在胺反應性表面上之固定化。按實施例1中所述固定化該捕捉標籤的反向互補物。
按實施例1中所述在緩衝液和血漿結合溶液中製備1nM6-7。只緩衝液樣品中加入10nM bFGF蛋白質。將樣品溫和地混合且在37℃溫浸30分鐘。一組樣品按實施例1中所述照射而重複組樣品則不照射。然後，按實施例1中所述染著樣品，不同處在於反應時間為在室溫下3小時，接著添加10微升BSA、25微升5M NaCl、和5微升10%Triton X-100且溫浸2小時。按實施例1中所述製備載片且於每一洞中加入80微升預雜合溶液(500微升5M NaCl和100微升10%Triton於2毫升樣品緩衝液中)且在42℃溫浸15分鐘。之後，移除預雜合溶液且改換以80微升樣品。用Microseal’F’膜密封諸洞，然後將載片在Eppendorf Thermomixer R上於40℃下以600rpm予以混合2小時，接著在35℃下20分鐘。用1×SB17、0.5% Triton、1M NaCl清洗諸洞2次後，溫浸在第二份洗液中15分鐘。於雜合後，按實施例1中所述處理載片，不 同處在於三次洗滌時間分別為15分鐘、2分鐘和30秒鐘。按實施例1中所述將載片乾燥掃描與定量分析。
圖11呈現出bFGF光適合體6-7的結果。對於10nMbGFG在緩衝液中與在10%血漿中所得信號看來係與光有關聯。在無光樣品(不能發光標的物對光適合體的共價鍵附加)上的信號可相比於在特徵之外所觀察到的信號，於此稱為"一般背景"。bFGF在10%血漿中的內源濃度頗為低，如反映於相對於無光回應和一般背景回應的血漿中小信號中者。
實施例9：在緩衝液中經交聯到包含5-苯甲基-dT和5-溴-dC核苷酸的DNA光適合體之C4b的偵測
本實施例示出包含改質核苷酸的光適合體在圖2A-2B和2C中所示檢定格式中的活性。針對蛋白質C4b的DNA光適合體(1987-74)包含5-苯甲基-dT和5-溴-dC核苷酸取代標準dT和dC。
A.帶標籤光適合體1987-74之製備。將含適合體序列的載體***物從大腸桿菌(E.coli)細胞用對該適合體的固定區具特異性的引子以PCR擴增。3’引子係經生物素化，用於將PCR產物捕捉在MyOne-鏈黴抗生物素蛋白珠粒上。於洗滌之後，將所捕捉的雙股體之未經生物素化股以20mM NaOH洗滌予以移除且用帶有偶合到5’引子序列的獨一捕捉標籤之低聚核苷酸經引子伸展造出適合體。 引子伸展係使用仍偶合到鏈黴抗生物素蛋白珠粒的模板DNA在含dATP、5-Br-dCTP、dGTP和5-苯甲基-dUTP的混合物內使用KOD DNA聚合酶摻入改質核苷酸而實施者。用20nM NaOH洗滌接者用HCl中和而從珠粒收集適合體。
B.捕捉探針在胺反應性表面上的固定化。按實施例1中所述固定化該捕捉標籤的反向互補物。
將最後濃度為2nM的1987-74與C4b蛋白質在SB17、0.1% Tween® 20中在下列濃度的系列稀釋液：25nM、5nM、1nM、0.2nM、0.04nM；及一無蛋白質對照樣分別溫浸。按實施例1中所述將樣品平衡化及照射，其後加入2微升的鯡魚***DNA(10毫克/毫升)。經由於每一樣品添加7.5微升NHS-Alexa-647(1.33毫克/毫升，DMSO中)及在室溫下溫浸2小時將C4b蛋白質螢光標記。加入25微升5M NaCl、5微升10% Triton-100及1微升100mM甘胺酸以驟止未反應的標的物，破斷非共價鍵交互作用及幫助後面的雜合。
按實施例1中所述製備加墊片的載片且與含SB17、0.1%Tween® 20、0.8M NaCl、20微克/毫升鯡魚***DNA和0.33%Tween X-100的溶液在42℃下溫浸15分鐘。於移除溶液後，於載片上加入80微升經標記的樣品，每一子陣列一份，且在轉台上於42℃浸浸30分鐘。取出樣品且用預雜合溶液洗基板2次，一次用沒有鯡魚***DNA或Tween® 20的預雜合溶液，一次用1×SB17、 0.1%Tween® 20；及用0.25×SB17洗一次。然後按實施例1中所述將載片乾燥、掃描與定量分析。
圖12顯示出1987-74相對於標的物濃度所得劑量回應曲線，闡明經改質核苷酸適合體在該檢定中的活性。
實施例10：在兩種不同的表面上使用兩種獨立的染色方法之UPS雜合捕捉檢定
此實施例展示出對兩種不同組成的表面，前面諸實施例的甲基丙烯酸酯共聚物表面及在玻璃基板上的Schott Nexterion胺反應性表面，之上的檢定功能性。此外，經由直接將Alexa-647附加到標的蛋白質或先用生物素在標的蛋白質上加標籤接著用鏈黴抗生物素蛋白-Alexa-647予以標記，以進行前面諸實施例之標的蛋白質染著反應。該檢定可促成採用表面法或染著法在緩衝液中進行的VEGF蛋白質定量偵測。
A.帶標籤光適合體509-80之製備。按實施例中所述製備帶標籤光適合體
B.捕捉探針在胺反應性表面上之固定化。按實施例1中所述合成帶有5’胺之捕捉探針且固定化在兩種表面上。在Schott Nexterion載片上的固定化係經由將探針以40或20μM溶解在由300mM磷酸鈉(pH 8.5)、0.005%Tween® 20和0.001%sarkosyl所構成的緩衝液中而完成。按實施例1中所述沈積捕捉探針。於探針沈積之後，將載片溫浸在乾燥盒中，然後與100mM碳酸氫鈉 (pH8.5)和0.1%Tween® 20在室溫下溫浸8小時。之後，用水清洗載片10次在N2 流下乾燥。按實施例1中所述實驗程序將捕捉探針固定化在甲基丙烯酸酯共聚物表面上。
將VEGF適合骿509-80以1nM濃度溫分別浸於100微升體積的各含6系列稀釋VEGF濃度(從50nM至16pM)，及一無蛋白質對照樣之檢定稀釋劑(SB17、0.1%Tween® 20、0.05%BSA、100微克/毫升鯡魚***DNA)之中。將諸樣品溫和地混合且在37℃下溫浸15分鐘，接著按實施例1中所述予以照射。將樣品分開且用NHS-Alexa 647直接染色或經由與NHS-PEO4 -生物素反應且隨後用鏈黴抗生物素蛋白Alexa-647予以染色。使用實施例1的程序進行用NHS-Alexa-647的染色，不同處在於該反應係在室溫下進行4小時。對於用NHS-PEO4 -生物素的反應，將1微升20mM溶解於DMSO中的NHS-PEO4 -生物素加到100微升樣品中。混合該溶液且在室溫下溫浸4小時。兩種染著反應都經由添加23微升5M NaCl、11.4微升10% BSA和1.1微升10% Triton X-100，且溫浸2小時予以驟止。
按實施例1中所述將兩種不同的表面加墊片且與1×SB17、0.1%Triton X-100、0.5%BSA和100微克/毫升hsDNA在42℃下預雜合15分鐘。然後移除溶液且改換以80微升樣品。用Microseal‘F’膜密討諸洞且在Eppendorf Thermomixer R上於42℃下以600rpm混合該等載片3小時，接著在34℃下1小時。對於用NHS-Alexa-647直 接標記的樣品，使用1×SB17、0.5% Triton和1M NaCl清洗諸洞3次。移除墊片且將整個載片放置在pap瓶中的30毫升SB17、0.5%Triton、1M NaCl內30分鐘，接著在1×SB17、0.1%Tween® 20中清洗2分鐘，且接著在0.25×SB17中清洗20秒。對於先與NHS-PEO4 -生素反應的樣品，係用1×SB17、0.1 Tween® 20、0.5M NaCl、100微克/毫升鯡魚***DNA、0.5BSA(鏈黴抗生物素蛋白染著緩衝液)清洗諸洞3次。於該鏈黴抗生物素蛋白染著緩衝液中製備4微克/毫升鏈黴抗生物素蛋白Alexa-647溶液且取80微升此溶液加到每一洞中，在37℃下15分鐘。然後用1×SB17、0.1%Tween® 20清洗諸洞3次。移除墊片且將整個載片置於pap瓶內所裝30毫升1×SB17、0.1%Tween® 20內30分鐘、接著在0.25×SB17中施以20秒清洗。按實施例1中所述將載片乾燥、掃描及定量分析。
圖13顯示出使用Schott Noxterion表面(圖13A)和甲基丙烯酸酯共聚物表面(圖13B)相對於蛋白質濃度的劑量回應之結果。兩種表面都給出相似的定量分析結果，展示出檢定的表面獨立性。兩種染著策略看來也都有可相比較之效用。
實施例11：在經塗覆的石英表面上的Affymetrix GeneChip® Test3 Array進行光交聯蛋白質的雜合捕捉在緩衝液和血清內偵測標的 蛋白質VEGF和bFGF
本實施例展示又另一種表面，Affymetrix GeneChip® Test3 Array(石英玻璃表面)，對於檢定中的雜合捕捉步驟之用處。檢定係在緩衝液與血清兩者之中運行。
A.帶標籤適合體509-80和6-7之合成。將Affymetrix GeneChip® Test3 Array上稱為201和1121的兩探針之反向互補物指定給適合體509-80和6-7，且按實施例1中所述予以製備。
B.捕捉探針在胺反應性表面上之固定化。從Affymetrix購得GeneChip® Test3 Array，其帶有原位(in situ)合成的探針。
在檢定稀釋劑(1×SB17、0.1%Tween® 20，0.02% BSA、100微克/毫升鯡魚***DNA)中，用20nM VEGF和bFGF製備100微升體積各為2nM濃度的VEFG適合體509-80和bFGF適合體6-7。將諸樣品溫和地混合且在37℃溫浸60分鐘，然後按實施例9中所述照射且用NHS-PEO4 -生物素染色，不同處在於反應時間為1小時。經由添加10微升的10%BSA、1微升的10毫克/毫升鯡魚***DNA、5微升的10%Triton X-100，及25微升的5M NaCl，將反應驟止。於一樣品中加入10微升血清以近似10%血清樣品。
將得自Affymetrix GeneChip® Test3 Array與100微升由100微升檢定稀釋劑、10微升10%BSA、1微升的10毫克/毫升鯡魚***DNA、25微升5M NaCl、5微升的 10% Triton X-100和7微升的DMSO所構成的溶液在45℃下溫浸1小時，其後，在Test3 Array室中加入100微升樣品且在45℃溫浸60分鐘，然後，用1×SB1、0.5% Triton X-100和1M NaCl構成的緩衝液清洗。然後將陣列放置在Affymetrix GeneChip® 流體站上，其可實施標準的Affymetrix洗滌和染色程序。之後在Affymetix掃描器上讀取及定量分析該等陣列。結果經陳述於圖14中。於緩衝液(圖14A)中，VEGF適合體以3500RFU的強度雜合到探針201(圖中標示為1者)而bFGF適合體以23000RFU的強度雜合到探針1121(圖中表為2者)。於血清中(圖14B)，對於VEGF適合體與bFGF適合體的相對強度分別為5000(1)和18000(2)。
實施例12：經由用脫脂奶、Superblock或未染著血漿將在經塗覆的石英表面上之Affymetrix GeneChip® Test3 Array予以表面鈍化
此實施例闡述經由用脫脂奶、Superblock，或未染著血漿封阻使Affymetrix GeneChip® Test3 Array針對血清和血漿吸附發生表面鈍化。
A.生物素化低聚核苷酸之製備。按實施例1中所述合成經冷卻配對(anneal)到經固定化在GeneChip® Test3 Array上，標示為201，1121和108的三種不同探針之經生物素化低聚核苷酸。
B.血漿生物素化。將160微升21mM NHS-PEO4 -生物素添加到100毫升10%血漿於1×SB18、0.1%Tween® 20中的溶液，且使所得溶液反應2小時，然後經由添加1毫升100mM甘胺酸(pH7.5)予以驟止。將經生物素化的血漿儲存在-20℃。
對照緩衝液包含0.75×SB17、0.1BSA、100微克/毫升鯡魚***DNA、0.1%Tween® 20和0.8M NaCl。使用對照緩衝液和經生物素化的血漿製備10%生物素化血漿。經由添加50微升10% Triton X-100、10微升SDS和10微升鯡魚***DNA到1毫升的10%生物素化血漿，加熱到95℃ 10分鐘，然後添加200微升5M NaCl以預處理該血漿。於1毫升對照緩衝液或10%血漿中加入1微升1000×生物素化探針混合物。
將4個Affymetrix GeneChip® Test3 Array與1×BS17、1%BSA、0.4%Triton X-100、0.1%SDS、1M NaCl和100微克/毫升鯡魚***DNA一起溫浸。用2%脫脂奶(Nestle Carnation,INSTANT NONFAT DRY MILK)在PBS、0.1%SDS和0.4%中的懸浮液封阻Array B。Array C係使用含StarrerBlock(PIERCE)、0.1% SDS和0.4%的溶液予以封阻。Array D係用含10%合併血漿、0.1% SDS和0.4% Triton X-100的溶液予以封阻。每一封阻溶液都加熱到95℃ 10分鐘且使其冷卻到室溫後才加到陣列。每一Test3 Array都用100微升個別封阻溶液在45℃封阻1.5小時。然後於每一陣列加入100微升的樣品。Array A接 受含探針的對照緩衝液而Array B、C和D接受10%帶探針的血漿。將諸陣列在45℃溫浸45分鐘。
之後，用1×SB17、0.4% Triton X-100、0.1%SDS、1M NaCl、1% BSA清洗諸陣列接著用1毫升洗滌過該室，使陣列溫浸5分鐘、然後用另一1毫升流過該室且最後用100微升新鮮洗液置換最後的100微升洗液。此程序經實施3次。將諸陣列溫浸約1小時後，放置在Affymetrix GeneChip® 流體站且在Affymetrix掃描器上讀取。
結果陳示於圖15A-D中。在四個陣列上的一般背為40、300、400和500RFU，而三生物素化探針在陣列上測得~17,000、~34,000和18,000。
實施例13：在用脫脂奶預封阻的GeneChip® Test3 Array上以光交聯蛋白質的雜合捕捉偵測標的蛋白質
此實施例闡述在用脫脂奶封阻的經塗覆玻璃表面上之Affymetrix GeneChip® Test3 Array上進行的對標的蛋白質IL-1 R4和bFGF之雜合捕捉。
A.帶標籤光適合體1472-3和6-7的合成。將Affymetrix GeneChip® Test3 Array上表明為1364和1121的兩探針之反向互補物指定給適合體1472-3和6-7且按實施例1中所述合成
分別含2nM濃度的各適合體1472-3和6-7之四種 溶液係在10%血漿中製備以給出下列對蛋白質配對(IL-1 R4、bFGF)的最後濃度：(0,0)、(1nM、30pM)、(100pM、1nM)、和(10pM、100pM)。該血漿稀釋劑包含0.9×SB18、100微克/毫升鯡魚***DNA、5微克/毫升(BrdU)30 、0.1%Tween® 20和10%血漿。將樣品溫浸在37℃ 30分鐘且按實施例1中所述予以照射。於每一樣品中加入1微升的5毫克/毫升NHS-PEO4 -生物素/DMSO且在室溫下溫浸2小時，其後加入2微升的100mM甘胺酸(pH7.5)、1微升10%SDS和5微升10% Triton X-100。接著將樣品加熱到95℃ 10分鐘，使其冷卻到室溫且經由添加10微升10%BSA和25微升5M NaCl予以驟止。接著加入1微升100×探針-108作為對照序列。
按實施例11對Array B所述，用脫脂奶溶液在45℃下封阻四個Test 3 Array 3小時。然後用PBS、0.1%SDS和0.4%Triton X-100清洗陣列，再與1×SB17、1%BSA、0.5% Triton X-100、0.1%SDS、1M NaCl和0.1毫克/毫升鯡魚***DNA一起在45℃溫浸20分鐘。接著於各陣列分別加入各100微升之樣品。將陣列在45℃溫浸45分鐘。之後，按實施例12中所述完成檢定。結果呈現在圖16中，其中可觀察到對兩種標的物在血漿中的線型劑量回應。
實施例14：經由在Luminex SeroMapTM 微球體上的光交聯蛋白質之雜合捕捉偵測標的蛋白 質C5b,6複合物、親神經素-3(Neurotropin-3)、和肌鈣蛋白I(Troponin I)
本實施例展示使用Luminex SeroMapTM 微球體作為固體承載體用以偵測及隨意地定量分析可能存在測試樣品中的標的分子。此等檢定係使用定加到緩衝液中的標的蛋白質來實施的。偵測儀器為Luminex 100 IS儀器系統。
將指定給光適合體2184-64(C5b,6複合物適合體)、2273-34(親神經素-3適合體)、和2338-12(肌鈣蛋白I適合體)的胺終端探針使用EDC化學(1-乙基-3-[3-(二甲胺基丙基)碳化二醯亞胺鹽酸鹽]共軛拼合到-COOH官能化SeroMapTM 微球體上。
將光適合體2184-64、2273-34和2338-12，以各為2nM的最後檢定濃度預冷卻配對到對適合體3’端互補的生物素化低聚核苷酸，然後與蛋白質C5b,6複合物，親神經素-3和肌鈣蛋白I(濃度範圍169fM至3.33nM)在緩衝液SB17、0.05% Tween® 20中組合。此外也製備二重複的無蛋白質對照檢定樣品。將100微升體積的此等檢定樣品在37℃溫浸15分鐘後，予以光交聯。於每一檢定樣品中加入Dynal MyOne鏈黴抗生物素蛋白珠粒(400微克)且在25℃混合溫浸10分鐘以捕捉光適合體：生物素化低聚物及蛋白質-光適合體：生物素化低聚物等雜合物。分別用100微升100mM碳酸氫鈉、1mM EDTA、0.02% Tween® 20、和10μM D-生物素(pH 8.5)洗珠粒30秒鐘2 次。此緩衝液中的D-生物素成分之目的在於用以飽和游離的鏈黴抗生物素蛋白結合部位。將洗過的珠粒懸浮在100微升100mM碳酸氫鈉(pH 8.5)、1mM EDTA、0.02% Tween® 20、和150μM磺酸基-NHS-LC-生物素(pierce Biotechnology)之中以用生物素標記該光適合體共軛結合的標的蛋白質。此生物素化反應係在25℃於固定混合下溫浸1小時。然後用100微升SB17、3.14M胍鹽酸鹽、0.05% Tween® 20洗珠粒3次，接著用100微升SB17、0.33%Triton X-100洗2次。將洗過的珠粒懸浮在100微升10μM D-生物素、0.05% Tween® 20、10mM HEPES pH 7.5中，然後在70℃下加熱5分鐘以後彼等的珠粒結合互補生物素化低聚核苷酸釋放出光適合體。對於每一檢定樣品，取75微升體積的珠粒溶析液與25微升下述高鹽緩衝液混配：4M NaCl、0.4%Tween® 20、160mM Tris-HCl、pH 8.0。加入SDS(11.25微升20%)且將一檢定樣品轉到30微升恰當探針-共軛拼合StroMapTM 微球體中(1500色碼微球體每探針、0.1% Tween® 20、1M NaCl、1.25%BSA、40mM Tris-HCl、pH 8.0)。為了促進光適合體對微球體、拼合探針的雜合，將檢定樣品在65℃固定混合下溫浸2小時。在65℃下，將檢定樣品轉移到96-洞微滴真空過濾板上且用200mM NaCl、0.1% Tween® 20、40mM Tris-HCl(pH 8.0)在65℃洗微球體4次。然後將微球體懸浮在80微升200mM NaCl、0.1%Tween® 20、40mM Tris-HCl(pH 8.0)中且轉移到96 -洞微滴板。加入20微升的10微克/毫升鏈黴抗生物素蛋白-R-薄紅蛋白(Molecular Probes #866)以促成光適合體-交聯生物素化標的蛋白質之偵測。在37℃溫浸15分鐘之後，對檢定樣品施以標準的Luminex儀器信號(R-薄紅蛋白)定量分析程序。
圖17以圖形呈現出C5b,6複合物光適合體2184-64(圖17A)、親神經素-3光適合體2273-34(圖17B)、和肌鈣蛋白I光適合體2338-12(圖17C)之結果。MFI(中間螢光強度)值係經由減除每一適合體的無蛋白質對照樣MFI值而矯正過。
前文係參照各具體實例和實施例說明本發明。各特別具體實例、實施例、或特別具體實例或實施例的要素都不可視為申請專利範圍任何項之關鍵、需要的、或必要的要素或特徵。再者，除非經明確述及為"必要"或關鍵者，否則本文所述要素沒有一者係實施本發明所需者。
要理解者，對所揭示的具體實例可作出各種修改和取代而不違離下面申請專利範圍所陳述的本發明範圍。說明書，包括圖式和實施例，要視為係闡述方式，而非限制性者，且所有此等修改和取代理應包括在本發明範圍之內。因此之故，本發明範圍應該由後附申請專利範圍及彼等的合法等效物所決定，而非由上面所給實施例所決定。例如，所主張的任何方法或程序中引述的步驟可用任何可行順序來執行且不受在任具體實例、實施例、或申請專利範圍中呈現的順序所限制。
圖1A和1B示出偵測及/或定量分析在一測試樣品中可能含有的一或多種標的分子所用之示範方法。
圖2A、2B、和2C示出偵測及/或定量分析在一測試樣品中可能含有的一或多種標的分子所用之示範方法。
圖3示出偵測及/或定量分析可能存在於測試樣品中的一或多種標的分子所用的示範方法。
圖4顯示1出使用圖2A、2B和2C中給示的檢定法對VEGF在緩衝液(圖4A)和在血漿(圖4B)中的系列稀釋液所得劑量一回應由線。於兩組中每一數據點都經減除無-蛋白質緩衝液回應液。所示出者為配合到對數轉換數據之最小平方曲線。
圖5A-5J顯示出使用圖2A、2B和2C中所給示的檢定對10種目標蛋白質與41種光適合體多重複合的系列稀釋液之劑量回應曲線。從該組內每一數據點都已減除對每一種適合體之無-蛋白質緩衝液回應。也標繪出配合到對數轉換數據的最小平方曲線。
圖6A和6B顯示出從圖2A、2B示2C中概述的檢定法所得對兩個體針對血清中的57種光適合體在REM中之重複測量結果。兩重複測量展示出對該57種所測目標之非常良好再現，產生大於0.99的Pearson相關性。
圖7顯示出使用UPS雜合捕捉檢定法以隨意的動力學挑激對tPA在緩衝液(●)和血漿(▲)內的劑量回應曲 線。將無-蛋白質緩衝液回應值平均化且從兩曲線減除。對於沒有添加目標蛋白質的血漿樣品，沒有動力學挑激的稀釋血漿回應值係以(□)表之且有加上動力學挑激者係在0.1pM tPA以(△)表之。由於在血漿中的動力學挑激，所測得得之回應值減少幾乎一個對數值，而標的物-適合體回應值則沒有變化，如於10nM添加tPA的(○)(緩衝液)和(△)(血漿)所證明者。
圖8顯示出顥示出使用有用競爭物(■)和沒有用(●)的隨意動力學挑激之檢定法在血漿中對tPA之劑量回應曲線。以1pM[tPA]標給繪出無-蛋白質血漿值且因添加競爭物導致減低70%，而標的物-適合體回應則沒有變化，如由在30nM tPA的回應所證明者，其在有含或不含競爭物下基本上係相同者。
圖9顯示出三種目標蛋白質(tPA(圖9A)、PAI-1(圖9b)和IL-6(圖9C)在線衝液(●)和血漿(▲)中之劑量回應曲線。RFU值業經針對每一適合體減值無-蛋白質緩衝液RFU而矯正過。也針對組液數據標繪出配合到對數轉換數據之最小平方曲線。對於此等適合體(△，於1pM)的經矯正無-蛋白質血漿RFU值分別為66，26和49RFU。
圖10A、10D顯示出在使用K+ /SDS沈澱隨意地移除游離適合體之前在緩衝液中交聯四種目標蛋白質且添加到血漿中所得劑量回應曲線(●)及沒有移除游離適合體(■)所產生的曲線之比較，在移除游離適合體後，信號增加且測量的動態範圍通常都增加。
圖11顯示出在雜合中使用清潔劑和高鹽濃度時，目標蛋白質(bFGF)經光誘導化學交聯到其光適合體所產生的影響。於沒有光，且因而沒有標的物對其光適合體的共價附加之下，在緩衝液中的檢定信號會減低超過兩個數位級。bFGF的內源濃度頗低，反映出超過無光對照組回應和一般背景回應之小信號。
圖12顯示出使用以改質5-苯甲基-dT庫取代dT開發出的適合體所得目標蛋白質(C4b)在緩衝液中的劑量回應。跨越3個對數值的標的物濃度之線性回應展現出改質核苷酸適合體在該檢定中之活性。
圖13顯示出在Schott Nexterion表面(圖13A)或在甲基丙烯酸酯共聚物表面(圖13B)上直接標記目標蛋白質(▲)或先生物素化接著以螢光標記鏈黴抗生物素蛋白處理(■)所產生的劑量回應曲線。兩種表面都表現得很好且兩種標記策略都可相比較。
圖14示出來自緩衝液(圖14A)或10%血清(圖14B)且用NHS-PEO4 -生物素在Affymetrix GeneChip® Test 3 Array上標記所得適合體-標的物複合之雜合。用薄紅素-R的染色係在Affymetrix GeneChip® 流體站中完成。於緩衝液中(圖14A)，VEGF適合體以3500RFU之強度雜合到探針201(1)，且bFGF適合體以23000RFU的強度雜合到探針1121(2)。於血清中(圖14B)，對於VEGF和bFGE適合體的相對強度分別為5000(1)和18000(2)。
圖15示出在得自血漿樣品的適合體-標的物複合物之 雜合之前，阻斷Affymetrix GeneChip® Test 3 Array之影響。經生物素化的探針係在緩衝液(圖15A)中及在血清樣品中雜合到經用脫脂奶(圖15B)，"起始物阻斷(starter block)"(圖15C)、和未標記血漿(圖15D)所阻斷的表面。此四種表面的背景值為49、300、400和500RFU，而三種探針的合信號為在(圖15A)和(圖15B)中的16,000、33000和18000，在(圖15C)中的17000、35000、和18000、及在(圖15D)中的20000、36000和18000。
圖16示出經加到血漿，交聯到光適合體，及雜合在Affymetrix GeneChip® Test 3 Array上的目標蛋白質之定量偵測。在血漿中形成的目標蛋白質IL1-R4(▲)和bFGF(■)的適合體複合物之雜合回應都已減除掉無蛋白質回應RFU值。在阻斷陣列表面以減低分子在樣品基質中的吸附之後，可以看到血漿樣品有兩個對數之量範圍。
圖17顯示出三種與光適合體多重複合的目標蛋白質在緩衝液中的系列稀釋液之目標蛋白質劑量回應值。經光適合體交聯的目標蛋白質係透過對經特異性低聚核苷酸探針-共軛接合的Luminex SeroMapTM 微球體予以捕捉。使用Luminex 100 IS儀器進行信號量化。MFI(中間螢光強度)值係經由減除每一適合體的無-蛋白質對照MFI值而矯正過。

Claims (39)

  1. 一種偵測可能存在於測試樣品中的標的分子之方法，該方法包含：(a)令測試樣品接觸對標的分子具有特異親和性的適合體(aptamer)，其中若該標的分子存在於該測試樣品中，適合體親和複合物係藉由適合體與其標的分子交互作用而形成，其中適合體親和複合物係藉由適合體與其標的分子交互作用所形成之非共價複合物；(b)在步驟(a)中適合體親和複合物形成後，將競爭分子引入該測試樣品及/或捕捉該適合體親和複合物於固體承載體上，接著以帶有競爭分子之溶液來洗滌，該競爭分子係選自低聚核苷酸、聚陰離子、葡聚醣(polydextran)、或dNTP；及(c)偵測及/或定量該適合體親和複合物之適合體或自該測試樣品之剩餘部分分離(partition)之適合體親和複合物。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一種競爭分子係聚陰離子。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該聚陰離子係葡聚糖硫酸酯。
  4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該聚陰離子係肝素或聚葡聚糖。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該適合體為單股核酸或雙股核酸。
  6. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該適合體為單股核酸或雙股核酸。
  7. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該適合體為單股核酸或雙股核酸。
  8. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該適合體為單股核酸或雙股核酸。
  9. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該適合體為DNA或RNA。
  10. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該適合體為DNA或RNA。
  11. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該適合體為DNA或RNA。
  12. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該適合體為DNA或RNA。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中該標的分子係選自由蛋白質、碳水化合物、多醣、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、受質、代謝物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營養分、生長因子、和組織所組成的群組。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該標的分子為蛋白質。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該蛋白質為糖蛋白。
  16. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該蛋白質為受體或抗體。
  17. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該標的分子為碳水化合物。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該碳水化合物為多醣。
  19. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中該測試樣品為選自全血液、白血球、周圍血液單核細胞、血漿、血清、痰、呼氣、尿液、***、唾液、腦液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽取液、氣管抽取液、滑液、關節抽取液、細胞、細胞萃取物、糞、組織、活體組織檢查樣和腦脊髓液所組成的群組之生物樣品。
  20. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該測試樣品為選自全血液、白血球、周圍血液單核細胞、血漿、血清、痰、呼氣、尿液、***、唾液、腦液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽取液、氣管抽取液、滑液、關節抽取液、細胞、細胞萃取物、糞、組織、活體組織檢查樣和腦脊髓液所組成的群組之生物樣品。
  21. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該測試樣品為選自全血液、白血球、周圍血液單核細胞、血漿、血清、痰、呼氣、尿液、***、唾液、腦液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽取液、氣管抽取液、滑液、關節抽取液、細胞、細胞萃取物、糞、組織、活體組織檢查樣和腦脊髓液所組成的群組之生物樣品。
  22. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該測試樣品為選自全血液、白血球、周圍血液單核細胞、血漿、血 清、痰、呼氣、尿液、***、唾液、腦液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽取液、氣管抽取液、滑液、關節抽取液、細胞、細胞萃取物、糞、組織、活體組織檢查樣和腦脊髓液所組成的群組之生物樣品。
  23. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該測試樣品為選自全血液、白血球、周圍血液單核細胞、血漿、血清、痰、呼氣、尿液、***、唾液、腦液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽取液、氣管抽取液、滑液、關節抽取液、細胞、細胞萃取物、糞、組織、活體組織檢查樣和腦脊髓液所組成的群組之生物樣品。
  24. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該測試樣品為選自全血液、白血球、周圍血液單核細胞、血漿、血清、痰、呼氣、尿液、***、唾液、腦液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽取液、氣管抽取液、滑液、關節抽取液、細胞、細胞萃取物、糞、組織、活體組織檢查樣和腦脊髓液所組成的群組之生物樣品。
  25. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該測試樣品為選自全血液、白血球、周圍血液單核細胞、血漿、血清、痰、呼氣、尿液、***、唾液、腦液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽取液、氣管抽取液、滑液、關節抽取液、細胞、細胞萃取物、糞、組織、活體組織檢查樣和腦脊髓液所組成的群組之生物樣品。
  26. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該生物樣品為細胞生物樣品。
  27. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該生物樣品為細胞生物樣品。
  28. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該生物樣品為細胞生物樣品。
  29. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該生物樣品為細胞生物樣品。
  30. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該生物樣品為細胞生物樣品。
  31. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該生物樣品為細胞生物樣品。
  32. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該生物樣品為細胞生物樣品。
  33. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該細胞為白血球或周圍血液單核細胞。
  34. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該細胞為白血球或周圍血液單核細胞。
  35. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該細胞為白血球或周圍血液單核細胞。
  36. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該細胞為白血球或周圍血液單核細胞。
  37. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該細胞為白血球或周圍血液單核細胞。
  38. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該細胞為白血球或周圍血液單核細胞。
  39. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該細胞為白血球或周圍血液單核細胞。
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