ES2538121T3 - Métodos de detección usando aptámeros - Google Patents

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Abstract

Un método de detección de una molécula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, método que comprende: (a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptámero que comprende una modificación de pirimidina en la posición 5 y que tiene una afinidad específica por la molécula diana, formándose un complejo de afinidad de aptámero mediante la interacción de un aptámero con su molécula diana, si la molécula diana está presente en dicha muestra de ensayo, en donde un complejo de afinidad de aptámero es un complejo no covalente formado por la interacción de un aptámero con su molécula diana; (b) tras la formación del complejo de afinidad de aptámero de la etapa (a), exponer dicha muestra de ensayo a una condición que desafíe cinéticamente los componentes de dicha muestra de ensayo, en donde el desafío cinético comprende: (i) introducir una molécula competidora en la muestra de ensayo o (ii) capturar el complejo de afinidad de aptámero sobre un soporte sólido, seguido del lavado con moléculas competidoras presentes en la solución de lavado, estando la molécula competidora seleccionada entre un oligonucleótido, un polianión, un polidextrano o varios dNTP; y (iii) diluir la muestra de ensayo para enriquecerla en un complejo de afinidad de aptámero de un conjunto de complejos que incluye un complejo de afinidad de aptámero y complejos no específicos, reduciendo de este modo la dilución los complejos de aptámero-no diana en comparación con los complejos de aptámero-diana; (c) detectar y/o cuantificar el aptámero del complejo de afinidad de aptámero o el complejo de afinidad de aptámero separado del resto de la muestra de ensayo.

Description

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Nº 6.291.184, toda ellas tituladas "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; véase también, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.458.539, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands”. En otras realizaciones, se prepara un aptámero y se modifica posteriormente para incorporar uno o más grupos funcionales fotorreactivos, generando de
5 este modo un fotoaptámero. En dichas realizaciones, se pueden incorporar uno o más restos de ácidos nucleicos fotorreactivos en un aptámero bien mediante la sustitución de un resto de ácido nucleico fotorreactivo en el lugar de uno o más de otros nucleótidos, tales como uno o más de los nucleótidos timidina y/o citidina en el aptámero, por ejemplo, o mediante la modificación de uno o más restos de ácidos nucleicos para incluir un grupo funcional fotorreactivo.
Los grupos funcionales fotorreactivos ilustrativos que se pueden incorporar a un fotoaptámero incluyen 5bromouracilo, 5-yodouracilo, 5-bromoviniluracilo, 5-yodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-tiouracilo, 4tiocitosina, 5-bromocitosina, 5-yodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5-yodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-yodoadenina, 8-azidodoguanina, 8-bromoguanina, 8-yodoguanina, 8
15 azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-yodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-yodoxantina, 5-[(4azidofenacil)tio]citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-deaza-7-yodoadenina, 7-deaza-7-yodoguanina, 7-deaza-7bromoadenina y 7-deaza-7-bromoguanina.
Además de estos grupos funcionales fotorreactivos basados en nucleósidos de ejemplo, también se pueden usar otros grupos funcionales fotorreactivos que se pueden añadir a un extremo terminal de un aptámero usando una molécula enlazadora adecuada. Dichos grupos funcionales fotorreactivos incluyen benzofenona, antraquinona, 4azido-2-nitroanilina, psoraleno, derivados de cualquiera de estos, y similares.
Un grupo funcional fotorreactivo incorporado a un fotoaptámero se puede activar mediante cualquier método
25 adecuado. En una realización, un fotoaptámero que contiene un grupo funcional fotorreactivo se puede reticular con su diana mediante la exposición del complejo de afinidad de fotoaptámero a una fuente de radiación electromagnética. Los tipos adecuados de radiación electromagnética incluyen luz ultravioleta, luz visible, rayos X y rayos γ. Las fuentes de radiación adecuadas incluyen fuentes que utilizan luz monocromática o luz policromática filtrada.
En una realización, un nucleótido fotorreactivo, tal como 4-azido-2-nitro-anilina, por ejemplo, se puede incorporar a un fotoaptámero, y se pueden usar luz que tiene una longitud de onda que varía de aproximadamente 325 nm a aproximadamente 470 nm para irradiar una complejo de afinidad de fotoaptámero que incluye este fotoaptámero. La excitación a estas longitudes de onda se puede lograr, por ejemplo, con diodos emisores de luz (LED) de bajo coste,
35 usando ya sea un solo LED o una matriz de LED, ya que los requisitos de potencia son moderados. Luz casi monocromática que tiene una longitud de onda que varía de 465 a 475 nm, un ángulo de visión de 100 grados y que proporciona 38 lúmenes de luz es suministrada por uno o más LED de alta potencia. En el caso de que un grupo funcional fotorreactivo deseado no se pueda excitar a una longitud de onda producida por un LED, normalmente, se puede usar la sustitución adecuada de grupos aceptores de electrones o donantes de electrones para cambiar moderadamente la longitud de onda de excitación del grupo funcional fotorreactivo con el fin de permitir la excitación del grupo funcional fotorreactivo a una longitud de onda producida por un LED.
En una realización, se incorpora un nucleótido fotorreactivo a un fotoaptámero, y se puede usar luz que tiene una longitud de onda que varía de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm para irradiar un complejo de
45 afinidad de fotoaptámero que incluya esta fotoaptámero para convertir el complejo de afinidad de fotoaptámero en un complejo covalente de fotoaptámero.
En una realización, un nucleótido fotorreactivo, tal como un 5-yodouracilo o una 5-yodocitosina, por ejemplo, se puede incorporar a un fotoaptámero, y se puede usar luz que tiene una longitud de onda que varía de aproximadamente 320 nm a aproximadamente 325 nm para irradiar un complejo de afinidad de fotoaptámero que incluye dicho fotoaptámero. Esta combinación facilita la fotorreticulación selectiva del fotoaptámero que contiene cromóforo a la molécula diana sin inducir otras fotorreacciones no específicas. Por ejemplo, en el caso de la proteína diana, ningún resto de triptófano que se pudiera incluir en la proteína diana ni ninguna base de timina y uracilo que se pudiera incluir en el fotoaptámero puede ser también fotorreactivo. Dado que el 5-yodouracilo o la 5-yodocitosina
55 absorbe la luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 325 nm, pero el triptófano y las bases de ácidos nucleicos de origen natural no lo hacen, el uso de luz de esta longitud de onda permite una fotorreacción selectiva en el/los 5-yodouracilo/s o la/s 5-yodocitosina/s dentro del complejo de afinidad de fotoaptámero. Se puede suministrar luz monocromática que tiene una longitud de onda que varía de aproximadamente 320 nm a aproximadamente 325 nm, por ejemplo, mediante láser de colorante sintonizable de doble frecuencia emisor de luz a una longitud de onda de aproximadamente 320 nm o mediante un láser de helio y cadmio emisor de luz a una longitud de onda de aproximadamente 325 nm. En una realización adicional, un complejo de afinidad de fotoaptámero se puede exponer a un láser excimer de cloruro de xenón (XeCl) configurado para emitir luz a una longitud de onda de aproximadamente 308 nm. En dicha realización, el fotoaptámero puede incluir un grupo funcional fotorreactivo (por ejemplo, un 5-bromouracilo o una 5
65 bromocitosina), y el tratamiento del complejo de afinidad de fotoaptámero con la fuente de luz sirve para fotoactivar el grupo funcional fotorreactivo de manera que el fotoaptámero se reticula con su molécula diana y se forma un
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En otras realizaciones, la UPS comprende una pluralidad de reactivos. Por ejemplo, la UPS puede comprender un primer reactivo que reacciona covalentemente con una proteína diana, y uno o más reactivos adicionales que unen el resto detectable, ya sea directa o indirectamente y, bien covalente o no covalentemente, con la proteína diana a
5 través de un grupo químico u otra funcionalidad introducida por el primer reactivo. Cuando la UPS comprende múltiples reactivos, se apreciará que, en algunos casos, los reactivos se añaden secuencialmente y, en otros casos, se pueden añadir simultáneamente.
En una realización, una UPS adecuada comprende (a) un derivado de biotina que reacciona con una proteína diana; y (b) un conjugado de estreptavidina-resto detectable tal como, por ejemplo, un derivado de estreptavidina fluorescente o un conjugado de estreptavidina-enzima. El derivado de biotina reacciona con grupos amina, uniendo así covalentemente la biotina con la proteína diana; el conjugado de estreptavidina-resto detectable se une a los grupos de biotina inmovilizados, localizando así el resto detectable en el/los sitio/s del soporte sólido al/ a los que se une la proteína diana. En dicha realización, los reactivos adecuados incluyen PFP-biotina, NHS-PEO4-biotina (brazo
15 espaciador de 29 Å), sulfo-NHS-LC-biotina (brazo espaciador de 22,4 Å) y TFP-PEO3-biotina (brazo espaciador de 32,6 Å).
En otra realización, una UPS adecuada comprende: (a) biotina, o un derivado de biotina, conjugada con un grupo reactivo que es capaz de unir covalentemente la biotina o el derivado de biotina con una proteína diana unida; (b) avidina y/o estreptavidina; y (c) un conjugado de biotina-resto detectable tal como, por ejemplo, un derivado de biotina fluorescente. El derivado de biotina de (a) anterior puede ser un derivado de biotina reactivo con amina, tal como, por ejemplo, NHS-Biotina, en el que la biotina está opcionalmente separada de NHS por átomos espaciadores (Calbiocheni, Inc.). La reacción del grupo NHS con aminas primarias en la proteína diana unida conduce a la unión covalente de la biotina con la proteína diana que está unida a su correspondiente aptámero. A continuación, se
25 puede tratar la proteína diana complejada con su correspondiente aptámero con la estreptavidina o la avidina. Dado que la estreptavidina y la avidina se pueden unir cada cuatro biotinas, la adición de estas proteínas proporciona tres sitios de unión de biotina para cada biotina originalmente acoplada a la proteína diana unida por el NHS-biotina. Entonces se puede añadir el derivado de biotina-resto detectable de (c) anterior, tras lo que se une estrechamente a los sitios de unión desocupados de biotina de la estreptavidina o la avidina. En dicha realización, los reactivos adecuados incluyen PFP-biotina, NHS-PEO4-biotina (brazo espaciador de 29 Å), sulfo-NHS-LC-biotina (brazo espaciador de 22,4 Å) y TEP-PEO3-biotina (brazo espaciador de 32,6 Å).
Las consideraciones tales como la naturaleza del agente de marcaje, la naturaleza de, y los niveles de corte predeterminados para, las moléculas diana, la importancia biológica de los niveles de diana específicos, etcétera,
35 normalmente, determinan la concentración del agente de marcaje, incluyendo las concentraciones individuales de los reactivos particulares que se pueden usar. La concentración final de cada uno de los reactivos normalmente se determinará empíricamente para optimizar la sensibilidad del método. En una realización, la concentración del agente de marcaje normalmente es suficiente para detectar al menos aproximadamente el 1 % de las moléculas diana. En otra realización, la concentración del agente de marcaje normalmente es suficiente para detectar al menos aproximadamente el 10 % de las moléculas diana. En una realización adicional, la concentración del agente de marcaje normalmente es suficiente para detectar al menos aproximadamente el 90 % de las moléculas diana.
La activación del agente de marcaje depende de la naturaleza de los reactivos usados. Por ejemplo, para aquellos reactivos que se activan con luz, el reactivo se irradia con luz de una longitud de onda apropiada. Los expertos en la
45 materia sugerirán otros métodos de activación en vista de las divulgaciones del presente documento. Para algunos agentes de marcaje, tales como agentes de marcaje que implican un marcador radiactivo, una enzima, etcétera, no se necesita ningún agente de activación. Para los sistemas de enzimas, se puede requerir la adición de un sustrato y/o un cofactor.
El examen del soporte sólido para la presencia y/o cantidad de la señal generada por el agente de marcaje incluye la detección de la señal que, en general, es meramente una etapa en la que se lee la señal. La señal se lee normalmente usando un instrumento, cuya naturaleza depende de la naturaleza de la señal. El instrumento puede ser un espectrofotómetro, un fluorímetro, un espectrómetro de absorción, un luminómetro, un quimioluminómetro, un actinómetro, un instrumento fotográfico, y similares. La presencia y/o la cantidad de señal detectada se relacionan
55 con la presencia y la cantidad de cualquier molécula diana presente en una muestra de ensayo por encima de un nivel de corte predeterminado. En general, las temperaturas durante las mediciones pueden variar de aproximadamente 10 ºC a aproximadamente 70 ºC, o de aproximadamente 20 ºC aproximadamente 45 ºC, o de aproximadamente 20 ºC a aproximadamente 25 ºC. En una metodología, se forman curvas de calibración usando concentraciones conocidas de las moléculas diana que se están ensayando. También se pueden usar calibradores y otros controles.
En una realización, un soporte sólido, incluyendo, por ejemplo, una matriz, se desplaza a un dispositivo de examen donde la superficie del soporte sólido es inspeccionada por la presencia de cualquier molécula diana unida. El dispositivo de examen puede ser un dispositivo de exploración que incluya un sistema óptico. La matriz se puede 65 examinar o leer, por ejemplo, mediante la iluminación de la matriz, y la lectura de la ubicación y la intensidad de una señal resultante (por ejemplo, fluorescencia) en cada característica de la matriz. El escáner puede ser similar a, por
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detecta y/o cuantifica mediante la detección del agente de marcaje en el complejo covalente de aptámero.
Para reducir el fondo del ensayo, se pueden eliminar de la muestra de ensayo las moléculas que pueden reaccionar con el agente de marcaje y que no están unidas covalentemente con el aptámero. En una realización, esto se realiza 5 por precipitación del aptámero, tanto libre como complejado, en la muestra de ensayo, dejando otras moléculas que pueden reaccionar con el agente de marcaje en el sobrenadante para su retirada. Dicha precipitación de ácido nucleico se puede realizar con reactivos que incluyen bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB) y disolventes orgánicos tales como etanol, por ejemplo. En otra realización, el aptámero, tanto libre como complejado, se separa de la muestra por hibridación del aptámero en un soporte sólido. En este caso, el soporte sólido puede incluir microperlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas), cualquier otro soporte sólido adecuado descrito en el presente documento, y similares. Tras dejar que el aptámero se hibride con la superficie de un soporte sólido adecuado, la solución que contiene moléculas que pueden reaccionar con el agente de marcaje se elimina fácilmente, produciendo una concentración del complejo covalente de aptámero. Como cualquier experto habitual en la materia apreciará, la separación del aptámero de esta manera puede usar bien un
15 marcador incluido en el aptámero o alguna otra secuencia de ácido nucleico del aptámero para hibridar el aptámero a una secuencia de nucleótidos complementaria adecuadamente unida al soporte sólido.
En una realización, un aptámero de marcaje, tal como una fotoaptámero marcado con una afinidad específica por una proteína diana, se introduce en la muestra de ensayo. Como se describe además en el presente documento, tras la formación de un complejo de afinidad de aptámero y la conversión en un complejo covalente de aptámero, el complejo covalente de aptámero-proteína y el aptámero libre se precipitan en la muestra de ensayo usando un reactivo apropiado tal como cualquiera de los reactivos mencionados anteriormente o cualquier otro reactivo adecuado. Los componentes precipitados de la muestra de ensayo se sedimentan por centrifugación, y se desecha el sobrenadante que contiene diana no complejada y el resto de la muestra de ensayo. Luego, se suspende el
25 sedimento, que contiene el aptámero libre y el complejo covalente de aptámero, en una solución apropiada tal como, por ejemplo, el diluyente de unión del ensayo, y entonces se pueden poner en contacto el complejo covalente de aptámero y el aptámero libre con un agente de marcaje, ya sea antes o después de la unión del complejo covalente de aptámero con el soporte sólido. Entonces, se detecta y/o cuantifica la molécula diana, si está presente en la muestra de ensayo, mediante la detección del agente de marcaje en el complejo covalente de aptámero.
En otra realización, un aptámero marcado, tal como un fotoaptámero marcado con una afinidad específica por una proteína diana, se introduce en la muestra de ensayo. Como se describe además en el presente documento, tras la formación de un complejo de afinidad de aptámero y la conversión en un complejo covalente de aptámero, el complejo covalente de aptámero-proteína y el aptámero libre son capturados sobre un soporte sólido usando, por 35 ejemplo, perlas que contienen una sonda que es complementaria al marcador de aptámero. Las perlas se sedimentan por la fuerza magnética, en el caso de la perlas paramagnéticas, o por centrifugación para las perlas no paramagnéticas, y se desecha el sobrenadante que contiene diana no complejada y muestra de ensayo. Entonces, se suspende el sedimento en una solución apropiada tal como, por ejemplo, el diluyente de unión del ensayo, y el complejo covalente de aptámero y el aptámero libre se eluyen usando cualquier medio adecuado para interrumpir la interacción de hibridación, incluyendo, por ejemplo, calor, pH alto, agua destilada, alguna combinación de estos o cualquier otro método conocido. Se vuelven a sedimentar las perlas, y el sobrenadante, que contiene el aptámero libre y el complejo covalente de aptámero, se puede poner en contacto con un agente de marcaje, ya sea antes o después de la unión del complejo covalente de aptámero con el soporte sólido. Entonces se detecta y/o cuantifica la molécula diana, si está presente en la muestra de ensayo, mediante la detección del agente de marcaje en el
45 complejo covalente de aptámero.
En otra realización, el ensayo se realiza como se ha descrito anteriormente, hasta e incluyendo la etapa en la que se suspenden las perlas tras desechar el sobrenadante que contiene diana no complejada y muestra de ensayo. Entonces, antes de eluir el aptámero libre y el complejo covalente de aptámero de las perlas, el complejo covalente de aptámero se puede poner en contacto con un agente de marcaje, seguido de la aglomeración repetida y el lavado para eliminar el agente de marcaje no reactivo antes de poner en contacto el soporte sólido con el complejo covalente de aptámero para la detección y/o cuantificación de la molécula diana.
En cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la muestra de ensayo se puede preparar como
55 dos o más diluciones de la muestra de ensayo, lo que pueden aumentar el intervalo dinámico de concentraciones a las que una molécula diana puede estar presente en una muestra de ensayo, y someterse a detección mediante los métodos desvelados en el presente documento. Las muestras de ensayo de dilución individuales se analizan por separado hasta e incluyendo la formación del complejo covalente de aptámero, tras lo que las muestras de ensayo de dilución se pueden combinar para el resto del ensayo y detectarse simultáneamente en un solo soporte sólido. En una realización, cada muestra de ensayo de dilución incluye un solo aptámero, permitiendo así una sola medición de la diana correspondiente. En otra realización, se puede añadir un aptámero a dos o más diluciones, cada dilución en contacto con un aptámero marcado distinto para una determinada diana, lo que permite la detección de una señal del aptámero específica para cada una de las diferentes muestras de dilución en un solo soporte sólido. El encadenamiento de muestras diluidas entre sí de esta manera puede extender un intervalo dinámico para una sola
65 molécula diana en muchos órdenes de magnitud y añadir exactitud cuando las regiones de cuantificación en solapamiento conducen a múltiples determinaciones de la concentración de una sola diana.
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Se dividieron los 57 fotoaptámeros en dos grupos para la multiplexación, uno de 27 aptámeros hacia dianas poco abundantes y otro de 30 aptámeros hacia dianas muy abundantes en suero o plasma humano. Se prepararon 14 muestras de suero en dos diluciones y se mezclaron con los dos conjuntos de aptámeros, dando una concentración final de 1 nM para cada aptámero y suero al 10 %, 0,9 x SB1, Tween® 20 al 0,1 %, 50 mg/ml de ADN largo de 5 esperma de arenque, 10 mg/ml (BrdU)30 para el conjunto de los 27 aptámeros y suero al 1 %, 0,99 x SB1, Tween® 20 al 0,1 %, 5 mg/ml de ADN largo de esperma de arenque, 1 mg/ml de (BrdU)30 para el conjunto de los 30 aptámeros. SB1 se compone de HEPES 40 mM, NaCl 102 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM y CaCl2 1 mM. Se equilibraron las muestras, se reticularon y se tiñeron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se detuvo la reacción de tinción mediante la adición de 10 µl de BSA baja en ácidos grasos (FA) al 10 %, 25 µl de NaCl 5 nM, 5 µl de Triton
10 X100al10%y7 µl de glicina 100 mM, y se incubaron durante 40 minutos a temperatura ambiente. Tras la inactivación, se añadieron 1,5 µl de SDS al 10 % y se calentaron las muestras hasta 42 ºC durante dos minutos.
Se prepararon portaobjetos con juntas como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se incubaron con 1 x SB1, Tween® 20 al 0,1 %, BSA baja en ácidos grasos (FA) al 0,66 %, NaCl 830 mM, Triton X100 al 0,33 %, SDS al 0,1 %, 50 mg/ml
15 de ADN largo de esperma de arenque y 10 mg/ml de (BrdU)30 durante 15 minutos. Se retiró el tampón de prehibridación, se añadieron las muestras teñidas y se incubaron en una cámara húmeda a 60 ºC durante 2 horas. Tras la hibridación, se lavaron, se secaron, se exploraron y se cuantificaron los portaobjetos como se ha descrito en el Ejemplo 2.
20 La Fig. 6 muestra las señales cuantificadas de las imágenes exploradas para las mediciones replicadas de los 57 fotoaptámeros para las muestras de suero de dos individuos. Las mediciones demostraron ser altamente reproducibles, con correlaciones de Pearson mejores que 0,99 para las mediciones de aptámero entre las muestras replicadas.
25 Ejemplo 4. Desafío cinético con dilución en ensayo de fotoaptámero usando la captura por hibridación mediante sondas inmovilizadas en una superficie
El presente ejemplo ilustra el uso de dos etapas opcionales en el ensayo representado en la Fig. 3, un desafío cinético seguido de la eliminación de proteína libre. El desafío cinético, realizado por dilución, ilustra la pérdida de
30 complejos no específicos de proteína-aptámero con la retención de los complejos de afinidad de aptámero-diana en plasma. El presente ejemplo también ilustra el uso de la captura de perlas para concentrar la muestra tras la dilución y permitir la extracción de proteína libre antes de la tinción.
A. Preparación del fotoaptámero marcado 987-51. El fotoaptámero marcado se preparó como se ha descrito en el 35 Ejemplo 2.
B. Inmovilización de sondas de captura sobre una superficie de reactiva con amina. Los complementos inversos de los marcadores de captura se inmovilizaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.
40 Se mezcló el fotoaptámero 987-51 a una concentración 20 nM con dos controles sin proteína y 10 concentraciones diluidas en serie de proteína diana tPA, bien en tampón de ensayo (SB17, Tween® 20 al 0,1 %) o plasma (plasma al 10 % en SB18, Tween® 20 al 0,1 %). Para evaluar la respuesta en ausencia de un desafío cinético, se prepararon dos muestras de control adicionales tanto en tampón como en plasma, uno sin proteína y otro con la concentración de proteína más alta. Estas 28 muestras en volúmenes de 10 µl, 14 para cada tampón y plasma, se incubaron
45 durante 30 minutos a 37 ºC. Las primeras 12 muestras, tanto en tampón como en plasma, se diluyeron 50 veces mediante la adición de SB17, Tween® 20 al 0,1 % y se incubaron durante 5 minutos, seguido de la irradiación de las veintiocho muestras con 1 J de luz UV (fuente de luz filtrada de lámpara de Hg OAI). Tras la irradiación, se diluyeron las dos muestras restantes cada una en tampón y plasma 50 veces como se ha descrito anteriormente.
50 Se ajustó cada muestra a NaCl 1 M y se incubó a 45 ºC durante 90 minutos con 25 µg de perlas paramagnéticas Dynal acopladas a un oligonucleótido complementario al extremo 3' del aptámero 987-51. Se centrifugaron las muestras a 1.000 g durante 2 minutos y se eliminó el sobrenadante. Se lavaron las perlas 3 veces con 100 µl de SB17, Tween® 20 al 0,1 %. Se suspendieron las perlas en bicarbonato de sodio 100 mM, EDTA 1 mM, Tween® 20 al 0,02 %, 0,2 mg/ml de colorante Alexa647-NHS, y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminó la
55 solución de tinción y se reemplazó por 100 µl de SB17, Tween-20 al 0,1 %, glicina 10 mM para inactivar la reacción de tinción. A continuación, se lavaron las perlas 3 veces con volúmenes de 100 µl de tampón de lavado de guanidina (SB17, Tween-20 al 0,1 %, Triton X-100 al 0,33 %, clorhidrato de guanidina 1 M), se suspendieron en 70 µl de Triton X-100 al 0,33 %, 1 mg/ml de sulfato de dextrano y se calentaron hasta 95 ºC durante 5 minutos para eluir los aptámeros de las perlas magnéticas. Se prepararon portaobjetos con juntas y se prehibridaron como se ha descrito
60 en el Ejemplo 2. Se transfirieron 65 µl de cada sobrenadante que contenía aptámeros eluidos a un pocillo que contenía 25 µl de NaCl 3,6 M, HEPES 144 mM, Triton X-100 al 0,33 %. Se incubaron los portaobjetos en una cámara húmeda a 45 ºC durante la noche, luego se lavaron, se secaron, se exploraron y se cuantificaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.
65 La Fig. 7 muestra una representación gráfica de los resultados en tampón (●) y plasma (▲) después de la dilución
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