JP6925051B2 - デジタル計数のための方法の改良 - Google Patents
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Description
a)捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
b)捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
a)捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
b)捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
a)捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
b)捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
ここで、追加の検出サイクルが行われる前にステップc)が行われ、続いて再標識化ステップが行われ、少なくとも1つの捕獲された検体は、標識剤を添加することによって標識化される。
本文脈において、用語「デジタル計数(counting)」、「デジタル計数分析」、「単一分子デジタル計数」、または「単一分子デジタル計数分析」は、サンプルの特異成分が区画の中に限界濃度で分配される任意の検体を参照し、区画の数は特異サンプル成分の数より大きい。こうして2値/デジタル値が、それが空(値0)または装填(値1)であるかに応じて各区画に割当てできる。本文脈において、装填とは、特異サンプル成分の少なくとも1つを含む区画を参照し、一方、空とは、特異サンプル成分を含まない区画を参照する。デジタル計数は、装填および空の区画の数が、特異サンプル成分から、または特異サンプル成分の存在に結合した付属検出試薬から由来する特異信号に基づいて評価される場合に行う。
a)捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
b)捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
a)捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
b)捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
a)捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
b)捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
追加の検出サイクルが行われる前に、ステップc)後に再標識化ステップが行われ、少なくとも1つの検体は、標識剤を添加することによって標識化される。
a)捕獲された検体から標識剤を分離するステップ。
b)標識剤が信号を促進する能力を非活性化させるステップ。または、
c)a)およびb)の組合せ。
ここで、信号の非活性化ステップの後、必要に応じてリンスステップが行われる。
a)固体基板、
b)コロイドビーズ、または、
c)コロイドビーズの集合体。
フロー区画を使用したデジタルカウント用フローシステム
・疎水性基板によって包囲された親水性機構のパターンを提示する液滴領域であり、蒸発耐性気相封止のナノリットルからアトリットルの液滴の形成を可能にする。
・液滴領域を覆う1つ以上のフロー区画であり、親水性/疎水性パターンとの液体接触を可能にする。
・フロー区画に液体および試薬を供給するための液体装填パッド。
・フロー区画を液体装填パッドに接続する液体入口。
・吸引を提供し、そしてフロー区画を介して液体駆動に介在する圧力源にフロー区画を接続する液体出口。
1.コンピュータ数値制御(CNC)フライス加工、射出成形、熱エンボス加工、または3次元印刷を用いて、固体基板にフロー区画を製造する。
2.CNCフライス加工、射出成形、熱エンボス加工、または3次元印刷に適合した任意の固体基板を適用する。
3.1つ以上のコンポーネントからフローシステムを作成し、続いてコンポーネントを共に接合して、所望の幾何形状または機能性を達成する。接合する手法は、感圧接着フィルム、液体接着剤のスプレーコーティング、熱接合、超音波溶接またはレーザ溶接を含む。接合する代わりに、個々のコンポーネントは、例えば、最終アセンブリを生産するために、機械的、電気機械的または磁気的にクランプしてもよい。マイクロ流体用途のために利用される接合および製造プロセスの概要は、文献(Temiz, Y., Lovchik, R., Kaigala, G. V. and Delamarche, E. in "Lab-on-a-chip devices: How to close and plug the lab" published in Microelectronics Engineering, vol. 132, pp. 156-175 (2015) (DOI: 10.1016/j.mee.2014.10.013))を参照。
・親水性機構を構成する材料の親水性
・疎水性基板を構成する材料の疎水性
・機構のエリア
・機構の厚さ
1.最初に、目前の応用のために適切な液滴体積を選択する。液滴体積についての前述した議論を参照。
2.次に、この応用で適用される液体について固体/液体接触角γを取得する。
3.親水性機構の所望の幾何形状、即ち、円形、四角、六角形などについて決定する。形状は、パターンを生成するために適用される製造手順に依拠することになる。
4.ステップ3からの特定形状の外周長と対応する最大液滴体積との間の関係を計算する。円形形状の場合、関係は式(1)で提供される。他の幾何形状については、関係は、式(1)の誘導について記述したのと同様な方法で誘導する必要があるであろう。
5.ステップ4での関係から、選択した液滴体積に対応する外周長を取得する。円形形状の場合、それはRDについて式(1)を解くのに充分である。
1)用途に必要とされる液滴の合計数を決定する。上述したように、液滴の合計数は、測定のダイナミックレンジを決定し、検体の予想される濃度範囲に整合させる必要がある。
2)パターンについてのVDA値は、ここでは式(2)から計算でき、フロー区画体積、即ち、VC値について下限を提供する。
3)適用される液体の公称モル重量(MW)および体積密度(ρL)、そして測定が行われる温度(T)およびRHI値を決定する。基準温度、圧力、蒸気のエンタルピーについて適切な値セットを適用して、式(9)を用いてフロー区画体積についてVMAXを計算する。例えば、水についてはP0=1.0atm、T0=373Kであり、40.7kJ/molのΔHVAP値を示す。
4)親水性機構のパターンの特定配置、例えば、正方形格子アレイ、六角形格子アレイ、矩形格子アレイ、菱形格子アレイなどを決定する。好ましいアレイ幾何形状は、通常、製造方法によって決定されることになる。液滴の合計数を収容するために、アレイの長さおよび幅を決定する。
5)フロー区画幾何形状、例えば、矩形チャネル、円形チャネル、半円形チャネルなどを決定する。好ましいアレイ幾何形状は、通常、製造方法によって決定されることになる。
6)合計体積がVMAXより小さくなるように、フロー区画幾何形状を拡大縮小する。この例が例2において提供される。簡潔には、矩形チャネルの場合、合計体積は、チャネルの幅×長さ×高さとして与えられる。チャネルの幅および長さは、例えば、アレイと整合でき、高さを可変にする。こうして高さは、VMAXより小さい合計体積を提供するように選択できる。
ここで説明する本発明は、多くの可能性ある用途を有し、これは当業者に知られており、例えば、文献(Witters et al. in Digital Biology and Chemistry (DOI: 10.1039/C4LC00248B, (Frontier) Lab on a Chip, 2014, 14, pp. 3225-3232))を参照。これらは、アッセイのクラスを含み、我々は単一酵素結合分子分析(SELMA)と称している。SELMA式アッセイは、単一のペプチド、タンパク質及び/又はオリゴヌクレオチド分子の操作および検出に依拠している。
少なくとも1つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法であって、サンプルは、複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも1つの検体を捕獲可能であり、この方法は、少なくとも2つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、下記ステップを含む。
a)捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
b)捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
サンプル、および複数の個別の捕獲部位を有する固相は、少なくとも1つの検体の捕獲前または捕獲中に区分化される、番号付き項目1に記載の方法。
捕獲された検体および標識剤は、少なくとも1つの検体の標識化の前または標識化中に区画化される、番号付き項目1に記載の方法。
検体は、ステップa)の前に各検出サイクルにおける標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、標識化される、番号付き項目1〜3のいずれかに記載の方法。
固相上の検体の捕獲前または捕獲中に標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、捕獲された検体が標識化され、ステップc)は、追加の検出サイクルが行われる前に行われ、続いて再標識化ステップが行われ、捕獲された検体は標識剤を添加することによって標識化される、番号付き項目1〜4のいずれかに記載の方法。
捕獲され標識化された検体は、区画化され、少なくとも1つの検体を含む液体区画を生成する、番号付き項目1〜5のいずれかに記載の方法。
少なくとも1つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法であって、サンプルは複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも1つの検体を捕獲可能であり、この方法は、少なくとも2つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、標識剤を添加することによって少なくとも1つの検体を標識化し、そして、少なくとも1つの捕獲され標識化された検体を区画化して、少なくとも1つの検体を含む液体区画を生成するステップを含み、そして、ステップa)〜c)を含む。
a)捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
b)捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
少なくとも1つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法であって、サンプルは複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも1つの検体を捕獲可能であり、少なくとも1つの検体は、固相上の少なくとも1つの検体の捕獲前または捕獲中に、標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって標識化され、この方法は、少なくとも2つの検出サイクルを含み、少なくとも1つの捕獲され標識化された検体は、区画化され、少なくとも1つの検体を含む液体区画を生成し、そして、ステップa)〜c)を含む。
a)捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
b)捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
追加の検出サイクルが行われる前にステップc)が行われ、続いて再標識化ステップが行われ、少なくとも1つの検体は、標識剤を添加することによって標識化される。
分析は、単一分子デジタル計数分析である、番号付き項目1〜8のいずれかに記載の方法。
サンプルの単一分子デジタル計数分析において偽ポジティブ検出及び/又はバックグラウンドノイズの低減のための、番号付き項目1〜9のいずれかに記載の方法。
サンプルは、ターゲット検体および非ターゲット化合物を含み、または潜在的に含み、ターゲット検体は、捕獲部位によって捕獲効率C1で捕獲され、非ターゲット化合物は、捕獲部位によって捕獲効率C2(C1≧C2)で捕獲され、ターゲット検体は、第1標識剤によって標識効率L1で標識化され、非ターゲット化合物は、第1標識剤によって標識効率L2(L1≧L2)で標識化され、検出サイクル数NCは、下記の式で示す比αが、
該方法は、偽ポジティブ検出サイクルを含み、標識化ステップにおいて第1標識剤の代わりに第2標識剤が適用され、非ターゲット化合物は、標識効率L1で第2標識剤によって標識化され、ターゲット検体は、第2標識剤によって標識効率L2(L1≧L2)で標識化される、番号付き項目11に記載の方法。
サンプル中に存在する非ターゲット化合物の数は、偽ポジティブ検出サイクルにおいて信号を示す捕獲部位の数から推定される、番号付き項目12に記載の方法。
サンプル中に存在するターゲット検体の数は、偽ポジティブ検出サイクルの前の全ての検出サイクルにおいて、信号を繰り返し示す捕獲部位の数およびサンプル中に存在する非ターゲット化合物の推定された数から推定される、番号付き項目13に記載の方法。
液体区画のせいぜい99%、例えば、せいぜい95%、せいぜい90%、せいぜい85%、せいぜい80%、せいぜい最大75%、せいぜい70%、せいぜい65%が、捕獲され標識化された検体を含む、番号付き項目1〜14のいずれかに記載の方法。
該方法は、偽ポジティブ検出サイクルを含み、該方法は、いずれの標識化ステップを含まない、番号付き項目1〜15のいずれかに記載の方法。
標識剤は検出様式(modality)を含み、信号を起動するステップは、検出剤を検出様式に配給することによる、番号付き項目1〜16のいずれかに記載の方法。
検出サイクルは、少なくとも1つの捕獲され標識化された検体からの信号を起動する前に、検体を標識化しなかった標識剤を続いて除去するステップを含む、番号付き項目1〜17のいずれかに記載の方法。
結合していないサンプル成分は、捕獲された検体または捕獲され標識化された検体から除去される、番号付き項目1〜18のいずれかに記載の方法。
信号の非活性化ステップは、下記から選択される。
a)捕獲された検体から標識剤を分離するステップ。
b)標識剤が信号を促進する能力を非活性化させるステップ。
c)a)およびb)の組合せ。
ここで、信号の非活性化ステップの後、必要に応じてリンスステップが行われる、番号付き項目1〜19のいずれかに記載の方法。
サンプルからの少なくとも1つの検体の捕獲は、固相への固定化によるものである、番号付き項目1〜20のいずれかに記載の方法。
サンプルから少なくとも1つの検体の捕獲は、検体に特異的な1つ以上の捕獲プローブを使用することによるものであり、捕獲プローブは固相に付着されている、番号付き項目1〜21のいずれかに記載の方法。
第1の数の検出サイクルおよび第2の数の検出サイクルが使用され、第1の数の検出サイクルは、第2の数の検出サイクルとは異なる標識剤を使用する、番号付き項目1〜22のいずれかに記載の方法。
1つ以上の異なる検体タイプ用の1つ以上の異なる捕獲プローブが固相に付着している、番号付き項目1〜23のいずれかに記載の方法。
1つ以上の異なる標識剤を使用して、1つ以上の異なる検体タイプを標識化する、番号付き項目1〜24のいずれかに記載の方法。
検出サイクルの数は、少なくとも3サイクル、少なくとも4サイクル、少なくとも5サイクル、少なくとも6サイクル、少なくとも7サイクル、少なくとも8サイクル、少なくとも9サイクル、または少なくとも10サイクルである、番号付き項目1〜25のいずれかに記載の方法。
検出サイクル数は、3〜20サイクル、3〜15サイクル、3〜10サイクル、3〜9サイクル、3〜8サイクル、3〜7サイクル、3〜6サイクル、または3〜5サイクルである、番号付き項目1〜26のいずれかに記載の方法。
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、洗浄によって除去される、番号付き項目1〜27のいずれかに記載の方法。
信号を非活性化するステップは、複数の液体区画において実施される、番号付き項目1〜28のいずれかに記載の方法。
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、分離は、酵素的開裂によるものである、番号付き項目1〜29のいずれかに記載の方法。
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、分離は、pHを調整したり、イオン強度を調整したり、変性塩を添加し、または界面活性剤を添加することによって、化学的開裂または脱着によるものである、番号付き項目1〜30のいずれかに記載の方法。
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、分離は加熱によるものである、番号付き項目1〜31のいずれかに記載の方法。
標識剤は、その化学的状態または物理的状態を変化させることによって非活性化される、番号付き項目1〜32のいずれかに記載の方法。
標識剤は、酵素を含み、酵素の状態は、活性部位の化学的修飾または生化学的修飾によって変化する、番号付き項目1〜33のいずれかに記載の方法。
標識剤は、酵素を含み、酵素の状態は、酵素の三次構造の化学的***または物理的***によって変化する、番号付き項目1〜34のいずれかに記載の方法。
捕獲され標識化された検体は、親水性液体を複数の個別の捕獲部位に導入して引き出すことによって区画化されて、捕獲され標識化された検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位は親水性にされており、複数の個別の捕獲部位が1つの疎水性基板上に配置され、そのため親水性液体を引き出す際、複数の液滴が形成され、各液滴が1つの個別の捕獲部位を占有する、番号付き項目1〜35のいずれかに記載の方法。
捕獲され標識化された検体は、複数の個別の捕獲部位に第1親水性液体を導入し、続いて第1親水性液体を第2液体と置換することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、2つの液体は非混和性であり、第2液体は第1液体よりも軽く、各個別の捕獲部位が親水性にされており、複数の個別の捕獲部位が疎水性基板上に配置され、そのため第1親水性液体を第2液体と置換する際、第1親水性液体を含む複数の液滴が形成され、各液滴は1つの個別の捕獲部位を占有する、番号付き項目1〜36のいずれかに記載の方法。
捕獲され標識化された検体は、第1液体を複数の個別の捕獲部位に導入することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位はウェル形状または毛細管形状であり、第1液体は第2液体と置換され、2つの液体は非混和性であり、第2液体は第1液体よりも軽く、そのため第1液体の置換の際、第1液体を含む複数の液滴が形成され、各液滴は1つの個別の捕獲部位を占有する、番号付き項目1〜37のいずれかに記載の方法。
捕獲され標識化された検体は、液体を複数の個別の捕獲部位に導入することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位はウェル形状または毛細管形状であり、液体は個別の捕獲部位に分配され、そのため各液体区画は1つの個別の捕獲部位を占有する、番号付き項目1〜38のいずれかに記載の方法。
捕獲され標識化された検体は、液体を複数の個別の捕獲部位に導入することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位はウェル形状であり、液体は、蓋を複数の捕獲部位の上に付与することによって置換され、そのため複数の捕獲部位が形成され、各液滴は、蓋によって境界設定された1つのウェル形状の捕獲部位を占有する、番号付き項目1〜39のいずれかに記載の方法。
捕獲され標識化された検体は、複数の個別の捕獲部位および捕獲され標識化された検体を含む第1液体を第2液体に導入することによって区画化されて、捕獲され標識化された検体を収容する液体区画を生成し、第2液体は第1液体と非混和性であり、そのため第1液体で構成され、第2液体によって包囲された複数のエマルジョン液滴が形成され、各エマルジョン液滴は、少なくとも1つの個別の捕獲部位および少なくとも1つの捕獲され標識化された検体を含む、番号付き項目1〜40のいずれかに記載の方法。
各検出サイクルにおいて信号を示す液体区画の位置は、他の検出サイクルにおいて信号を示す液体区画の位置と比較され、その結果、液体区画が信号を示す連続的な検出サイクルの数が計数され、液体区画は、少なくとも2つのカテゴリーに分類され、液体区画の第1カテゴリーは第2カテゴリーよりも多い計数を示す、番号付き項目1〜41のいずれかに記載の方法。
連続検出サイクルにおいて信号を繰り返し示す液体区画の数は、サンプル中のターゲット検体の濃度を計算するために適用される、番号付き項目42に記載の方法。
個別の捕獲部位の数は、少なくとも1000個、好ましくは少なくとも10000個、好ましくは少なくとも100000個、好ましくは少なくとも1000000個、好ましくは少なくとも10000000個である、番号付き項目1〜43のいずれかに記載の方法。
個別の捕獲部位は、円形または球状であり、個々の個別の部位の直径は、1mm未満、好ましくは100μm未満、好ましくは10μm未満、好ましくは1μm未満である、番号付き項目1〜44のいずれかに記載の方法。
個別の捕獲部位は、円形または球状であり、個別の部位の直径は、0.5〜5μm、0.5〜10μm、0.5〜50μm、0.5〜100μm、10〜1000μm、50〜1000μm、100〜1000μmの間である、番号付き項目1〜45のいずれかに記載の方法。
個別の捕獲部位は、正方形(quadratic)であり、個別の部位の長さは、1mm未満、好ましくは100μm未満、好ましくは10μm未満、好ましくは1μm未満である、番号付き項目1〜46のいずれかに記載の方法。
個別の捕獲部位は、正方形(quadratic)であり、個別の部位の長さは、0.5〜5μm、0.5〜10μm、0.5〜50μm、0.5〜100μm、10〜1000μm、50〜1000μm、100〜1000μmの間である、番号付き項目1〜47のいずれかに記載の方法。
固相は、下記のものである、番号付き項目1〜48のいずれかに記載の方法。
a)固体基板、
b)コロイドビーズ、または、
c)コロイドビーズの集合体。
液体区画は、気相シール下の複数の液体ナノリットルからアトリットル液滴の形態である、番号付き項目1〜49のいずれかに記載の方法。
液体区画は、ウェル形状の捕獲部位、空洞形状の捕獲部位、または毛細管形状の捕獲部位を占有する、番号付き項目1〜50のいずれかに記載の方法。
液体区画は、複数の油中水型エマルジョン液滴の形態である、番号付き項目1〜51のいずれかに記載の方法。
液体区画は、水非混和性の液相の下で複数の水性ナノリットルからアトリットル液滴の形態である、番号付き項目1〜52のいずれかに記載の方法。
デジタル計数は、サンプル中の1つ以上の検体タイプのデジタル計数のためのフローシステム(10)において行われ、フローシステムは、疎水性基板(16)の内または上に親水性機構(14)のパターンを有する支持体(12)を備え、疎水性基板(16)は、少なくとも1つの開口を含むフロー区画(18)内に埋め込まれ、親水性機構(14)は、最大液滴体積をそれぞれ有する複数の液体ナノリットルからアトリットル液滴を支持するように構成され、そしてフロー区画(18)は、各ナノリットルからアトリットル液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される、番号付き項目1〜53のいずれかに記載の方法。
気相シールは、マイクロ液滴の蒸発を低減できるフローシステム内の蒸気圧を確立する、番号付き項目54に記載の方法。
気相シールは、各ナノリットルからアトリットル液滴の蒸発を最大液滴体積の50パーセント未満まで減少させる、番号付き項目54〜55のいずれかに記載の方法。
(i)疎水性基板(16)の内または上にある親水性機構(14)のパターンを、1つ以上の検体タイプを含むサンプルと接触させるステップを含む、番号付き項目54〜56のいずれかに記載の方法。
(ii)親水性機構(14)の上に1つ以上の検体タイプを捕獲するステップを含む、番号付き項目54〜57のいずれかに記載の方法。
(iii)少なくとも1つの捕獲された検体タイプを、検出対象の検体タイプに特異的な標識剤で標識化するステップを含む、番号付き項目54〜58のいずれかに記載の方法。
捕獲され標識化された検体は、検出剤を、パターンを横断するように流し、パターンから引き出して、個々の液滴をナノリットルからアトリットル液滴の形態に生成するステップ(iv)によって、区画化されて、少なくとも1つの検体を収容する液体区画を生成する、番号付き項目54〜59のいずれかに記載の方法。
標識剤と検出剤の両方を収容する液滴の数を計数するステップ(v)を含む、番号付き項目54〜60のいずれかに記載の方法。
ステップ(iii)、(iv)および(v)を1回以上繰り返すことを含む、番号付き項目54〜61のいずれかに記載の方法。
第1標識剤の代わりに、検出対象の第2検体タイプに特異的な第2標識剤を使用することによって、ステップ(iii)、(iv)および(v)を繰り返すことを含む、番号付き項目54〜62のいずれかに記載の方法。
ステップ(iii)、(iv)および(v)を繰り返す前に、前回のステップに存在する標識剤を非活性化させるステップを含む、番号付き項目54〜63のいずれかに記載の方法。
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、そしてフローシステムの洗浄によって除去される、番号付き項目54〜64のいずれかに記載の方法。
標識剤は、酵素および特定の検体認識部位(moiety)を含み、検体認識部位は、下記の分子グループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、それらの複合体またはそれらの合成変異体から選択される、番号付き項目1〜65のいずれかに記載の方法。
個別の捕獲部位は、親水性機構である、番号付き項目1〜66のいずれかに記載の方法。
1つ以上の異なる検体タイプのための1つ以上の捕獲プローブ(22)が、親水性機構(14)に付着している、番号付き項目1〜67のいずれかに記載の方法。
親水性機構に付着した2つ以上のタイプの捕獲プローブ(22)を含み、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域(24)内に配置される、番号付き項目1〜68のいずれかに記載の方法。
捕獲プローブ(22)は、下記のプローブグループ、即ち、オリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、抗体、ペプチドまたはそれらの合成変異体から選択される、番号付き項目1〜69のいずれかに記載の方法。
液体中に1つ以上のタイプの検体を含有するサンプルは、完全浸漬によって親水性機構(14)を含む基板と接触する、番号付き項目1〜70のいずれかに記載の方法。
標識化は、検体のための標識剤を含有する溶液を、捕獲された検体と完全浸漬によって接触させることによって行われる、番号付き項目1〜71のいずれかに記載の方法。
検体は、下記の検体グループ、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、タンパク質/オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質/脂質複合体、ペプチド、エキソソーム、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、細胞断片または細胞から選択される、番号付き項目1〜72のいずれかに記載の方法。
サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織から選択される、番号付き項目1〜73のいずれかに記載の方法。
サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織、の研究室処理サンプルから選択される、番号付き項目1〜74のいずれかに記載の方法。
デジタル計数分析は、単一分子の検出と定量化の両方を含む、番号付き項目1〜75のいずれかに記載の方法。
捕獲された検体は、捕獲の後に捕獲プローブ(22)と共有結合するようになる、番号付き項目1〜76のいずれかに記載の方法。
捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む分子複合体であり、検体は、捕獲プローブ配列に対して相補的な配列を介して捕獲プローブと結合され、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンC、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される、番号付き項目1〜77のいずれかに記載の方法。
捕獲プローブは、タンパク質、アプタマー、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、メチルグリオキサールまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される、番号付き項目1〜78のいずれかに記載の方法。
捕獲プローブは、合成オリゴヌクレオチドであり、合成修飾は、捕獲の後に検体と捕獲プローブとの間に共有結合が確立できるように検体に対して反応性の化学基を組み込む、番号付き項目1〜79のいずれかに記載の方法。
検体と捕獲プローブとの間の共有結合は、検体/捕獲プローブ複合体を化学物質と接触させることによって起動される、番号付き項目80に記載の方法。
検体と捕獲プローブとの間の共有結合は、検体/捕獲プローブ複合体を電磁放射線と接触させることによって起動される、番号付き項目80に記載の方法。
デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析(SELMA)、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)、単一酵素結合免疫吸着法(sELISA)またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法(dELISA)を含む、番号付き項目1〜82のいずれかに記載の方法。
少なくとも1つの検体は、オリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、単一ヌクレオチドの多型、挿入または欠失など、1つ以上の塩基対変化を有するゲノム配列または転写ゲノム配列であり、サンプルは、潜在的に、2つ以上の非ターゲットオリゴヌクレオチドを含み、非ターゲットオリゴヌクレオチドは、ターゲットと同じゲノム配列または転写されたゲノム配列を有するが、1つ以上の塩基対変化を伴わない、番号付き項目1〜83のいずれかに記載の方法。
サンプルは、第1および第2検体タイプを含み、第1検体タイプはサンプル中に第1配列および第1濃度を有し、第2検体タイプはサンプル中に第2配列および第2濃度を有し、第1配列および第2配列は異なり、第1および第2配列はゲノム配列または転写されたゲノム配列であり、ここに開示するように、第1および第2濃度は測定され、互いに比較してコピー数の変動を識別する、番号付き項目1〜84のいずれかに記載の方法。
気相は、大気によって提供され、捕獲プローブは一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖DNAであり、標識剤は、検出様式(modality)および認識部位を備え、検出様式は酵素であり、認識部位は、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される、番号付き項目1〜85のいずれかに記載の方法。
複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、番号付き項目1〜86のいずれかに記載の方法で少なくとも1つの検体を捕獲可能である。
複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、例えば、偽ポジティブ検出及び/又はバックグラウンドノイズの低減のために、番号付き項目1〜87のいずれかに記載の方法で少なくとも1つの検体を捕獲可能である。
複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、例えば、偽ポジティブ検出及び/又はバックグラウンドノイズの低減のために、番号付き項目1〜86のいずれかに定義される少なくとも2つの検出サイクルを行うことによって、少なくとも1つの検体を捕獲可能である。
体積がピコリットル以下のマイクロ液滴を基板上の所定場所に液相で保持するプロセスが、マイクロ液滴を、少なくとも1つの開口を有するチャネル内に配置することと、チャネルの空間を、マイクロ液滴の蒸発を低減できるチャネル内蒸気圧を確立する値に設定することとを含む。
サンプル中の1つ以上の検体タイプのデジタル計数のためのフローシステムが、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも1つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、それぞれ最大液滴体積を有する複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、フロー区画は、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される。
実施形態1に係るフローシステムにおいて、フロー区画は、体積(VC)を有し、体積(VC)は、全てのナノリットルからアトリットルの液滴の凝集最大液滴体積(VDA)より大きく、下記式によって計算されるVMAXより小さい。
実施形態1〜2のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構が(RD)の半径を有する円形であり、単一の親水性円が支持できる最大液滴体積(VD)は、下記式である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発は、最大液滴体積の50%未満、各ナノリットルからアトリットルの液滴の最大液滴体積の、40%未満、好ましくは30%未満、好ましくは20%未満、好ましくは10%未満、好ましくは5%未満、好ましくは1%未満である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気、窒素、アルゴン及び/又はヘリウムによって構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気によって構成される。
サンプル中の1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のためのフローシステムが、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも1つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、親水性/疎水性パターンとの液体接触を可能にするために、液滴領域を覆う1つ以上のフロー区画を備える。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、フローシステムに液体および試薬を供給するための1つ以上の液体装填パッドを備える。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、フロー区画を液体装填パッドに接続する液体入口を備える。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、液体は、入口から出口への圧力降下を用いてフロー区画を横断して駆動される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、フローチャネルを圧力源に接続する液体出口を備え、吸引を提供し、よってフローチャネルを介して液体駆動に介在する。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気、窒素、アルゴン及び/又はヘリウムによって構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気によって構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、1つ以上の区別できる検体タイプのための1つ以上の捕獲プローブを備え、捕獲プローブは、親水性機構に付着される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、支持体は平面的である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は平面的である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構のパターンは、親水性機構がアレイ状に配置された少なくとも1つの領域を含む。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は、正方形平面アレイ状に編成され、機構は、半径(RD)を有する円として形状をなし、アレイは、隣接する機構の間のピッチ(δ)を有し、δは少なくとも3RDであり、アレイは、フロー方向に沿って長さ(LAX)に延びており、アレイは、フロー方向に対して垂直な長さ(LAY)に延びており、チャネルは、フロー方向に沿って長さ(LCX)を有し、LCXはLAXより大きいか、またはこれに等しく、チャネルは、フロー方向に対して垂直な長さ(LCY)を有し、LCYはLAYより大きいか、またはこれに等しく、チャネルは、高さ(h)を有し、これは少なくとも2RDで、多くてもhMAXであり、hMAXは下記の式から計算される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構のパターンは、少なくとも2つの領域を備え、一方の領域のアレイは、他方の領域のアレイと相違する。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構を支持する領域は、フロー区画内に中央に設置される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構の数は、少なくとも1000個、好ましくは少なくとも10000個、好ましくは少なくとも100000個、好ましくは少なくとも1000000個、好ましくは少なくとも10000000個である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、フロー区画は、チャネル形状であり、区画の対向端部での2つの開口の間でフロー方向を形成する。
実施形態13に係るフローシステムにおいて、フロー区画および開口は、フロー方向に対して垂直な断面で矩形形状を有する。
実施形態13に係るフローシステムにおいて、フロー区画は、矩形形状を有し、開口は、フロー方向に対して垂直な断面で円形形状を有する。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は、ナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、液滴は、少なくとも90度、多くても150度の、疎水性基板での接触角を示す。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は、少なくとも0.1μm、多くても100μmの半径を有するナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性基板は、ガラス、親水性ポリマーまたは金属酸化物化合物である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、疎水性層は、基板に共有結合的に接合した分子単層である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、疎水性層は、金属基板上に化学吸着した分子単層である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、1つ以上の捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブと共有結合的に架橋または結合できる。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む分子複合体であり、検体は、捕獲プローブ配列に対して相補的な配列を介して捕獲プローブと結合され、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンC、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、捕獲プローブは、タンパク質、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、デジタル計数は、デジタル計数測定である。
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析(SELMA)、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)、単一酵素結合免疫吸着法(sELISA)またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法(dELISA)である。
前述した実施形態のいずれかで定義されるフローシステムを調製する方法。
少なくとも1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための、前述した実施形態のいずれかで定義されるフローシステムを使用する方法。
少なくとも1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための方法であり、該方法は、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴に含まれる検体タイプを計数することを含む。
実施形態39に係る方法において、気相シールは、マイクロ液滴の蒸発を低減できる、フローシステム内の蒸気圧を確立する。
実施形態39〜40のいずれかに係る方法において、デジタル計数は、フローシステムにおいて実施され、該フローシステムは、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも1つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
実施形態39〜41のいずれかに係る方法において、親水性機構は、半径(RD)を有する円形であり、単一の親水性円が支持できる最大液滴体積(VD)は、下記の式である。
実施形態39〜42のいずれかに係る方法において、気相シールは、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を最大液滴体積の50%未満に低減する。
実施形態39〜43のいずれかに係る方法において、フローシステムは、実施形態1〜36のいずれかにおいて定義される。
実施形態39〜44のいずれかに係る方法はさらに、(i)疎水性基板の中または上にある親水性機構のパターンを、1つ以上の検体タイプを含むサンプルに接触させるステップを含む。
実施形態39〜45のいずれかに係る方法は、(ii)親水性機構の上で少なくとも1つの検体タイプを捕獲するステップを含む。
実施形態39〜46のいずれかに係る方法は、(iii)少なくとも1つの捕獲された検体タイプを、検出される検体タイプに特異的な標識剤を用いて標識化するステップを含む。
実施形態39〜47のいずれかに係る方法は、(iv)検出剤を、パターンを横断して流し、パターンから引き出して、個々の液滴をナノリットルからアトリットルの液滴の形態に生成するステップを含む。
実施形態39〜48のいずれかに係る方法は、(v)標識剤および検出剤の両方を収容する液滴の数を計数するステップを含む。
実施形態39〜49のいずれかに係る方法は、ステップ(iii)、(iv)および(v)を1回以上繰り返すことを含む。
実施形態39〜50のいずれかに係る方法は、第1標識剤の代わりに、検出される第2検体タイプに特異的な第2標識剤を使用することによって、ステップ(iii)、(iv)および(v)を繰り返すことを含む。
実施形態39〜51のいずれかに係る方法は、ステップ(iii)、(iv)および(v)を繰り返す前に、前回ステップに存在する標識剤を不活性化するステップを含む。
実施形態39〜52のいずれかに係る方法において、標識剤は、表面結合した検体からの脱離によって不活性化され、フローシステムの洗浄(flushing)によって除去される。
実施形態39〜53のいずれかに係る方法において、標識剤は、酵素的切断によって脱離される。
実施形態39〜54のいずれかに係る方法において、標識剤は、pHを調整し、イオン強度を調整し、変性塩を追加し、または洗浄剤を追加することによって、化学的切断または脱着によって脱離される。
実施形態39〜55のいずれかに係る方法において、標識剤は、フローシステムの温度を上昇させることによって脱離される。
実施形態39〜56のいずれかに係る方法において、標識剤は、その化学的または物理的な状態を変化させることによって不活性化される。
実施形態39〜57のいずれかに係る方法において、標識剤は酵素を含み、酵素の状態は、活性部位の化学的または生化学的修飾によって変化する。
実施形態39〜58のいずれかに係る方法において、標識剤は酵素を含み、酵素の状態は、酵素の三次構造の化学的または物理的分断によって変化する。
実施形態39〜59のいずれかに係る方法において、標識剤は、酵素および特異検体認識部位を含み、検体認識部位は、下記の分子グループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、その複合体またはその合成変異体から選択される。
実施形態39〜60のいずれかに係る方法において、1つ以上の区別できる検体タイプのための1つ以上の捕獲プローブは、親水性機構に付着される。
実施形態39〜61のいずれかに係る方法において、1つ以上の区別できる検体タイプのための1つ以上の捕獲プローブは、リンカー(linker)部位によって親水性機構に付着され、リンカー部位は、下記の分子グループ、即ち、ポリ(エチレングリコール)、直鎖または分岐アルカン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはその合成変異体から選択される。
実施形態39〜62のいずれかに係る方法は、親水性機構に付着された2つ以上のタイプの捕獲プローブを備え、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置される。
実施形態39〜63のいずれかに係る方法において、捕獲プローブは、下記のプローブグループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはその合成変異体から選択される。
実施形態39〜64のいずれかに係る方法において、液体中に1つ以上の検体タイプを含むサンプルは、完全浸漬によって親水性機構を含む基板と接触する。
実施形態39〜65のいずれかに係る方法は、液体を除去し、基板を洗浄することを含む。
実施形態39〜66のいずれかに係る方法において、標識化は、完全浸漬によって、検体用の標識剤を含む溶液を、捕獲した検体と接触させることによって実施される。
実施形態39〜67のいずれかに係る方法は、残りのプローブを含む溶液を除去し、基板を洗浄することを含む。
実施形態39〜68のいずれかに係る方法において、液体は、入口から出口への圧力降下を用いてフロー区画を横断して駆動される。
実施形態39〜69のいずれかに係る方法において、検体は、下記の検体グループ、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、タンパク質/オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質/脂質複合体、ペプチド、エキソソーム(exosome)、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、細胞断片または細胞から選択される。
実施形態39〜70のいずれかに係る方法において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織から選択される。
実施形態39〜71のいずれかに係る方法において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または、処理した血液サンプルなどの組織、の研究室処理サンプルから選択される。
実施形態39〜72のいずれかに係る方法において、1つ以上の捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブと共有結合的に架橋または結合できる。
実施形態39〜73のいずれかに係る方法において、捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、捕獲プローブ配列に対して相補的な配列を介して捕獲プローブと結合されたオリゴヌクレオチドであり、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンC、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される。
実施形態39〜74のいずれかに係る方法において、捕獲プローブは、タンパク質、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される。
実施形態39〜75のいずれかに係る方法において、デジタル計数は、デジタル計数測定である。
実施形態39〜76のいずれかに係る方法において、デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析(SELMA)、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)、単一酵素結合免疫吸着法(sELISA)またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法(dELISA)である。
実施形態1〜38のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相は、大気によって提供され、及び/又は、捕獲プローブは、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、及び/又は、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、及び/又は、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖または二本鎖のDNAであり、及び/又は、標識剤は、検出様式(modality)および認識部位を備え、及び/又は、検出様式は酵素であり、及び/又は、認識部位は、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される。
実施形態39〜77のいずれかに係る方法において、気相は、大気によって提供され、及び/又は、捕獲プローブは、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、及び/又は、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、及び/又は、異なるタイプの捕獲プローブは複数領域に配置され、及び/又は、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖または二本鎖のDNAであり、及び/又は、標識剤は、検出様式および認識部位を備え、及び/又は、検出様式は酵素であり、及び/又は、認識部位は、一本鎖DNAオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される。
少なくとも1つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴の使用。
実施形態80に係る使用は、実施形態39〜77、79のいずれかに係る方法によって実行される。
実施形態80〜81のいずれかに係る使用は、実施形態1〜38、78のいずれかに係るフローシステムにおいて実行される。
安定したマイクロ液滴を形成するために、平面的な疎水性領域の上に組み込まれた親水性円形機構の正方形アレイをリン酸緩衝水溶液と接触させた。溶液の10μlプラグをアレイの表面を横断するように駆動して、図4の顕微鏡写真に示すように、親水性機構の上にマイクロ液滴を残した。
化学的にパターン化された固体基板が組み込まれたフローチャネルについて検討する。化学パターンは、アレイに編成された円形の親水性領域からなる。親水性アレイは、連続的な疎水性領域によって包囲される。こうして、例1に示すように、いったん水溶液が注入され、続いてフローチャネルから引き出されると、マイクロ液滴のアレイが親水性機構の上部に形成される。
フローシステムの製造は、2つの主要ステップで行った。1つのステップは、UVフォトリソグラフィおよびマイクロ加工(microfabrication)処理を利用して、パターン化した親水性機構を製造するものであり、一方、第2ステップは、親水性パターンを、直角(right)の幾何形状を示すフロー区画に集積化することに取り組むものである。以下、両方のステップについてより詳細に説明する。
本発明の実施形態において、親水性機構は、石英(quartz)(SiO2)で構成し、疎水性領域は、ペルフルオロデシルトリクロロシラン(FDTS)で構成した。製造プロセスの第1ステップにおいて、FDTSの分子単層を、MVD100分子気相成膜システム(アプライド・マイクロストラクチャ社)を用いて分子気相成膜によって石英ウエハの上に堆積した。FDTSは、石英の表面でのシラノール基との共有結合を受け、ウエハ表面での疎水性単分子層を生成した。
集積化の前に、フロー区画に嵌め込むために、マイクロ加工ウエハを矩形ピース(25mm×12mm)に切断した。アレイが更なる表面機能化を必要とする場合、下記の例4〜5で説明するように、区画集積化の前に機能化プロトコルを行った。
本例では、集積化液滴アレイチップを備えたフローシステムを用いて単一の生体分子(本ケースでは、一本鎖DNA)がどのように検出され、デジタル計数できるかを示す。フローシステムアセンブリは、例1〜3で説明した手順に従って製造し動作させたが、液滴アレイチップのPMMAフロー構造への集積化の前に、チップは、一本鎖ターゲットDNAの特異的捕獲を可能にするために、更なる表面機能化を施した。マイクロ加工チップは、4μmの直径を有し、8μmの機構間間隔で正方アレイ状に配置された93750個の円形親水性機構で構成した。
液滴アレイチップは、アセトン中で10分間の超音波処理によって全面的に洗浄し、続いてイソプロパノール中で10分間の超音波処理を行い、続いてエタノール中で10分間の超音波処理を行った。チップは、窒素フロー下で乾燥し、95%(v/v)エタノール中の1%(v/v)エポキシシラン(Dynasylan GLYEO、エボニック インダストリーズ社)液の溶液に浸漬した。チップは、30分間、エポキシシラン溶液中で培養し、続いて95%エタノールを用いて3回洗浄し、窒素フロー下で乾燥し、110℃で30分間、硬化させた。
検出のターゲットは、50−bpのDNAオリゴ(5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT GT−3’(SEQ ID NO:2))であった。DNAオリゴの最後の14個の塩基対は、PNA捕獲プローブに対して相補的であり、一方、DNAオリゴの最初の12個の塩基対は、DNA系標識剤に対して相補的であった。標識剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素に共役した1つ以上の12−bpのDNAオリゴによって構成した。標識DNAオリゴの配列は、5’−GCC TAC GAC AGA−3’−TEG−ビオチン(TEG−ビオチンに結合したSEQ ID NO:3)であって、TEGは、テトラエチレングリコールリンカーを表す。
標識緩衝液:5×SSC緩衝液、0.5%(v/v)トリトンX−100、10g/lのBSA、pH7.0。
洗浄緩衝液1:10mMのPBS、138mMのNaCl、2.7mMのKCl、0.1%(v/v)トリトンX−100、50g/lの20kDaモル重量のポリ(エチレングリコール)(PEG20000)、pH7.4。
洗浄緩衝液2:10mMのPBS、138mMのNaCl、2.7mMのKCl、50g/lのPEG20000、pH7.4。
検出緩衝液:10mMのPBS、138mMのNaCl、2.7mMのKCl、10g/lのPEG20000、1.0mMのH2O2、pH7.4。
ステップ1:25μlのDNAターゲット溶液を0.2μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ2:フローチャネルを10μlのパッシベーション緩衝液で注入する。
ステップ3:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ4:フローチャネルを、標識緩衝液中の50pMのNAv−HRP−LO3の10μlで注入する。
ステップ5:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ6:100μlの洗浄緩衝液1を10μl/分のフローレートで作動させる。
ステップ7:100μlの洗浄緩衝液2を10μl/分のフローレートで作動させる。
ステップ8:検出緩衝液中の200μMのampliflu red(シグマアルドリッチ社、90101−5MG−F)溶液の3μlを5μl/分のフローレートで作動させる。
本例において、捕獲されたDNAターゲットが、標識剤の不活性化によってどのようにして繰り返し検出できるかを示す。本例で使用したフローシステムは、例1〜3に従って製造し動作し、そして例4で提供された表面機能化プロトコルに従って機能化した。
ステップ1:25μlのDNAターゲット溶液を0.2μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ2:フローチャネルを10μlのパッシベーション緩衝液で注入する。
ステップ3:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ4:フローチャネルを、標識緩衝液中の50pMのNAv−HRP−LO3の10μlで注入する。
ステップ5:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ6:100μlの洗浄緩衝液1を10μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ7:100μlの洗浄緩衝液2を10μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ8:検出緩衝液中の200μMのampliflu red(シグマアルドリッチ社、90101−5MG−F)溶液の3μlを5μl/分のフローレートで作動させる。
ステップ9:液滴アレイの蛍光および明視野顕微鏡写真を記録する。
ステップ10:フローチャネルを10μlの消化緩衝液で注入する。
ステップ11:10分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ12:20μlの不活性化緩衝液を5μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ13:50μlの洗浄緩衝液1を10μl/分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ14:ステップ4〜13を繰り返す。
ステップ15:ステップ4〜9を繰り返す。
本例において、100μlのサンプル溶液中に存在するDNA検体のデジタル検出を実施できるフローシステムが、後述するステップを続けることによって得られる。検体(ターゲットDNA)は、サンプル中に約10aMの濃度で存在すると予想され、下記の配列セグメント:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT−3’(SEQ ID NO:4)を含む。検体に加えて、サンプルは、約10000倍以上の濃度、即ち、100fMの他の非ターゲットDNA分子(野生型DNA)を含むと予想され、下記の配列セグメント:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC CAC TAT−3’(SEQ ID NO:5)を含む。ターゲットおよび野生型DNAは、ボールド体の下線付き位置だけ配列が相違する。
SEQ ID NO:1:ACA TAG TTG ACA CG
SEQ ID NO:2:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT GT−3’
SEQ ID NO.3:5’−GCC TAC GAC AGA−3’
SEQ ID NO:4:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT−3’
SEQ ID NO:5:5’−TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC CAC TAT−3’
SEQ ID NO:6:5’−GTG CCT ACG ACA GA−3’
SEQ ID NO:7:5’−ATA GTT GAC AC−3’
Claims (17)
- 少なくとも1つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法であって、サンプルは、複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも1つの検体を捕獲可能であり、
該方法は、同じ検体が標識剤で標識化または再標識化される少なくとも2つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、
a)捕獲され標識化または再標識化された検体からの信号を起動するステップと、
b)捕獲され標識化または再標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップと、
c)追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップと、を含み、
該信号の非活性化ステップは、
i)捕獲された検体から標識剤を分離して除去するステップ、
ii)標識剤が信号を促進する能力を非活性化させるステップ、または
iii) (i)および(ii)の組合せ、から選択される、方法。 - サンプルおよび複数の個別の捕獲部位を有する固相は、少なくとも1つの検体の捕獲前または捕獲中に区画化される、請求項1に記載の方法。
- 捕獲された検体および標識剤は、少なくとも1つの検体の標識化の前または標識化の間に区画化される、請求項1に記載の方法。
- 検体は、ステップa)の前に各検出サイクルにおける標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、標識化される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 固相上の検体の捕獲前または捕獲中に標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、捕獲された検体が標識化され、ステップc)は、追加の検出サイクルが行われる前に行われ、続いて再標識化ステップが行われ、捕獲された検体は標識剤を添加することによって標識化される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 捕獲され標識化された検体は、区画化され、少なくとも1つの検体を含む液体区画を生成する、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- サンプルは、ターゲット検体および非ターゲット化合物を含み、
該方法は、あるタイプの偽ポジティブ検出サイクルを含み、該偽ポジティブ検出サイクルにおいて標識化または再標識化ステップは、非ターゲット化合物に対して特異的な標識剤を用いて行われる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 該方法は、あるタイプの偽ポジティブ検出サイクルを含み、該偽ポジティブ検出サイクルは、いずれの標識化ステップも含まない、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 該方法は、あるタイプの偽ポジティブ検出サイクルをさらに含み、該偽ポジティブ検出サイクルは、いずれの標識化ステップも含まない、請求項7に記載の方法。
- サンプルから少なくとも1つの検体の捕獲は、検体に特異的な1つ以上の捕獲プローブを使用することによるものであり、捕獲プローブは固相に付着されている、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、洗浄によって除去される、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブと共有結合する、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- サンプルの単一分子デジタル計数分析において偽ポジティブ検出及び/又はバックグラウンドノイズの低減のための、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の方法における、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、少なくとも1つの検体を捕獲可能である、使用。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の方法における、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、少なくとも1つの検体を捕獲可能である、使用。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の方法における、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、偽ポジティブ検出のために、少なくとも1つの検体を捕獲可能である、使用。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の方法における、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、バックグラウンドノイズの低減のために、少なくとも1つの検体を捕獲可能である、使用。
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