ES2319757T3 - Fermentacion de azucares de pentosa. - Google Patents
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Abstract
Célula huésped eucariótica transformada con un constructo de ácidos nucléicos que comprende una secuencia de nucleótidos, la cual a su vez codifica una xilosa isomerasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 1, como se determinó usando un algoritmo de Needleman y Wunsch, donde el constructo de ácidos nucléicos en la transformación de la célula huésped confiere a la célula huésped la capacidad de crecer en xilosa como fuente de carbono.
Description
Fermentación de azúcares de pentosa.
La presente invención se refiere a células
huéspedes transformadas mediante una secuencia de ácidos nucléicos
que codifica una xilosa isomerasa eucariótica. La xilosa isomerasa
se expresa en la célula huésped para conferir la capacidad de
isomerizar xilosa a xilulosa. La célula huésped se usa en un
proceso para la producción de etanol y otros productos de
fermentación mediante la fermentación de un medio con pentosa. La
presente invención también se refiere a secuencias de ácidos
nucleicos que codifican xilosas isomerasas eucarióticas.
El consumo a gran escala de los combustibles
fósiles tradicionales (combustibles a base de petróleo) en las
últimas recientes décadas ha contribuido a generar altos niveles de
contaminación. Además, la percepción de que las reservas mundiales
de petróleo no son ilimitadas, combinada con la creciente
conciencia medioambiental, han impulsado nuevas iniciativas para
investigar la viabilidad de combustibles alternativos tales como el
etanol, lo cual podría significar entre un 60-90%
de reducción en la producción de CO_{2}. Aunque el etanol
derivado de biomasa se puede producir mediante la fermentación de
azúcares hexosa, la cual se obtiene de muchas fuentes diferentes,
hasta ahora, no obstante, los sustratos para la producción a escala
industrial o el alcohol combustible son azúcar de caña y almidón de
maíz. El inconveniente de estos sustratos es su alto coste.
Aumentar la producción de etanol requiere la
capacidad de utilizar materias primas de coste inferior.
Actualmente, sólo la biomasa lignocelulósica proveniente de plantas
estaría disponible como materia prima en cantidades suficientes
como para sustituir los brotes utilizados en la producción de
etanol. Los azúcares fermentables de materiales lignocelulósicos
más importantes son la glucosa y la xilosa, constituyendo
respectivamente alrededor de un 40% y un 25% de lignocelulosa. Sin
embargo, la mayoría de las levaduras susceptibles de fermentación
alcohólica, como la Saccharomyces cerevisiae, no pueden usar
la xilosa como fuente de carbono. Adicionalmente, no hay ningún
organismo conocido que pueda fermentar xilosa en etanol tanto con un
alto rendimiento como con una alta productividad de etanol. Para
permitir la producción comercial de etanol a partir de hidrolizado
de lignocelulosa, sería necesario un organismo que posea estas dos
propiedades. Por lo tanto, un objetivo de la invención es proveer
una levadura que sea capaz de tanto la fermentación alcohólica como
de usar xilosa como fuente de carbono.
La D-xilosa es metabolizable por
numerosos microorganismos como bacterias entéricas, algunas
levaduras y hongos. En la mayoría de las xilosas que utilizan
bacterias, la xilosa es directamente isomerizada a
D-xilulosa por xilosa (glucosa) isomerasa (XI). Los
hongos filamentosos y las levaduras, sin embargo, no son aptos para
esta isomerización de un solo paso y reducen primero xilosa a
xilitol mediante la acción de la xilosa reductasa (XR), después de
lo cual el xilitol se convierte en xilulosa mediante xilitol
dehidrogenasa (XDH). La primera fase requiere NAD(P)H
como un cofactor, mientras que la segunda fase requiere NAD^{+}.
La xilulosa que se produce entra posteriormente en la ruta de los
fosfatos de pentosa (PPP) después de ser fosforilada mediante
xilulosa quinasa (XK). La fermentación anaeróbica de xilosa en
etanol no es posible en organismos con una xilosa reductasa (XR)
estrictamente dependiente de NADPH. Esto ocurre porque el xilitol
deshidrogenasa (XDH) es estrictamente dependiente de NAD^{+},
dando como resultado un desequilibrio de redox (es decir, depleción
NAD^{+}). Para resolver el desequilibrio de redox bajo
condiciones anaeróbicas, el organismo produce subproductos tales
como glicerol y xilitol. De forma similar, la producción aeróbica
de \beta-lactamas en xilosa también está
influenciada negativamente en comparación con la producción de
\beta-lactama en glucosa. Una probable causa de
estos bajos rendimientos es nuevamente una demanda relativamente
alta de reducir equivalentes en forma de NADPH en esta ruta, en
comparación con el uso de glucosa (W.M. van Gulik et al.
Biotechnol. Bioeng. Vol. 68, nº 6, 20 junio, 2000).
Con el paso de los años se ha intentado en
muchas ocasiones introducir el metabolismo de la xilosa en S.
cerevisiae y levaduras similares, como se ha reseñado en
Zaldivar et al. (2001, Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:
17-34). Un enfoque trata la expresión de genes que
codifican una xilosa (aldosa) reductasa y un xilitol
deshidrogenasa, p. ej. el XYL1 y el XYL2 de Pichia
stipitis, en S. cerevisiae (US 5.866.382; WO 95/13362; y
WO 97/42307). Aunque este enfoque permite el crecimiento de S.
cerevisiae en xilosa, generalmente ello conlleva a una baja
productividad y/o rendimiento del etanol, al igual que a una alta
producción de xilitol, principalmente como resultado del
desequilibrio de redox entre XR y XDH.
La expresión de una XI en S. cerevisiae o
una levadura afín o en hongos filamentosos eludiría el
desequilibrio de redox y su consiguiente producción y excreción de
xilitol. Se han insertado genes de xilosa isomerasa de diferentes
bacterias en S. cerevisiae, no obstante, la expresión de XIs
procarióticas mesofílicas en S. cerevisiae no condujo a una
XI activa (Amore and Hollenberg, 1989, Nucleic Acids Res. 17: 7515;
Amore et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:
351-357; Chan et al., 1986, Biotechnol. Left
8: 231-234; Chan et al., 1989, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 31: 524-528; Ho et
al., 1983, Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 42: 2167;
Hollenberg, 1987, EBC-Symposium on Brewer's Yeast,
Helsinki (Finlandia), 24-25 Nov 1986; Sarthy et
al., 1987, Appl. Environ. Microbiol. 53:
1996-2000; Ueng et al., 1985, Biotechnol.
Left. 7: 153-158). Sin embargo, dos XIs de bacterias
termofílicas expresadas en S. cerevisiae mostraron una
actividad específica de 1 \mumol por minuto por mg^{-1} a 85ºC
(Bao et al., 1999, Weishengwu-Xuebao 39:
49-54; Walfridson et al., 1996, Appl.
Environ. Microbiol. 61: 4184-4190). No obstante, a
una temperatura fisiológica para S. cerevisiae
(20-35ºC) sólo falta un pequeño porcentaje de esta
actividad, lo cual no es suficiente para conseguir una fermentación
alcohólica de xilosa eficaz. Por tanto, sigue habiendo una
necesidad de ácidos nucleicos que codifiquen una XI, la cual pueda
ser expresada en levaduras para proporcionar suficiente actividad
XI bajo condiciones fisiológicas para permitir el uso de xilosa
como fuente de carbono.
La enzima "xilosa isomerasa" (EC 5.3.1.5)
se define aquí como una enzima que cataliza la isomerización
directa de D-xilosa a D-xilulosa y
viceversa. La enzima también es conocida como una
D-xilosa cetoisomerasa. Algunas xilosas isomerasas
también son capaces de catalizar la conversión entre
D-glucosa y D-fructosa y en
consecuencia a veces se hace referencia a ellas como glucosa
isomerasa. Las xilosas isomerasas requieren magnesio como cofactor.
Las xilosas isomerasas de la invención pueden ser definidas además
por su secuencia de aminoácidos como se describe aquí abajo.
Asimismo las xilosas isomerasas se pueden definir por las secuencias
de nucleótidos que codifican la enzima, al igual que por secuencias
de nucleótidos que hibridan a una secuencia de nucleótidos de
referencia que codifica una xilosa isomerasa como se describe aquí
abajo.
Una unidad (U) de actividad de xilosa isomerasa
se define aquí como la cantidad de enzimas que producen 1 nmol de
xilulosa por minuto, en una mezcla reactiva que contiene un tampón
de 50 mM de fosfato (pH 7.0), 10 mM de xilosa y 10 mM de
MgCl_{2}, a 37ºC. La xilulosa formada se determinó por el método
de Dische y Borenfreund (1951, J. Biol. Chem. 192:
583-587) o por HPLC como se describe en los
ejemplos.
La identidad de secuencia se define aquí como
una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos
(polipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácidos
nucleicos (polinucleótidos), determinada al comparar las
secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el
grado de relación secuencial entre las secuencias de aminoácidos o
de ácidos nucleicos, según el caso, determinado mediante la
combinación entre las series de caracteres de estas secuencias. La
"similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina
comparando la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos sustitutos
conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo
polipéptido. "Identidad" y "similitud" se pueden calcular
fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, pero sin
limitarse a los descritos en (Computational Molecular Biology,
Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988;
Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed.,
Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data,
Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds. Humana Press, New
Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine,
G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov,
M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y
Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073
(1988).
Los métodos preferidos para determinar la
identidad son diseñados para dar la mayor correspondencia entre las
secuencias evaluadas. Los métodos para determinar identidad y
similitud están codificados en programas informáticos abiertos al
público. Los métodos de programas informáticos preferidos para
determinar identidad y similitud entre dos secuencias incluyen p.
ej. el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al.,
Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984 )), BestFit, BLASTP,
BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol.
215:403-410 (1990). El programa BLAST X está
disponible para el público en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual,
Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;
Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:
403-410 (1990). Para determinar la identidad se
puede usar también el bien conocido algoritmo de Smith
Waterman.
Los parámetros preferidos para la comparación de
la secuencia polipeptídica incluyen lo siguiente: Algoritmo:
Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453
(1970 ); Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff and
Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
89:10915-10919 (1992); Penalización de Espacio: 12;
y Penalización de Longitud de Espacio: 4. Un programa útil con
estos parámetros está disponible al público como el programa
"Ogap" del Genetics Computer Group, ubicado en Madison, WI. Los
parámetros mencionados son los parámetros predefinidos para las
comparaciones de aminoácidos (sin penalización para espacios
terminales).
Los parámetros preferidos para la comparación de
ácidos nucleicos incluyen lo siguiente: Algoritmo: Needleman y
Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de
comparación: correspondencias=+10; no correspondencias=0;
Penalización de Espacio: 50; Penalización de Longitud de Espacio:
3. Están disponibles en el programa Gap del Genetics Computer
Group, ubicado en Madison, Wis. Arriba se dan los parámetros por
defecto para las comparaciones de ácidos nucleicos. Opcionalmente,
en el proceso de determinar el grado de similitud de aminoácidos,
el experto en la materia también puede tener en cuenta las
denominadas sustituciones de aminoácidos "conservadoras", como
deducirán los expertos en la materia. Las sustituciones de
aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de
residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un
grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas es: glicina,
alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos con
cadenas laterales hidróxilo-alifáticas es: serina y
treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales las cuales
contienen amida es: asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos
con cadenas laterales aromáticas es: fenilalanina, tirosina, y
triptófano; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales básicas
es: lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos con
cadenas laterales con azufre es: cisteína y metionina. Los grupos
preferidos de sustitución conservadora de aminoácidos son:
valina-leucina-isoleucina,
fenilalanina-tirosina,
lisina-arginina, alanina-valina, y
asparagina-glutamina. Las variantes sustitutivas de
la secuencia de aminoácidos que se exponen aquí son aquellas en las
que al menos un residuo de las secuencias expuestas ha sido
eliminado y se ha insertado en su lugar un residuo diferente.
Preferiblemente, el cambio de aminoácido será conservador. Las
sustituciones conservadoras preferidas para cada uno de los
aminoácidos naturales en su origen son las siguientes: Ala por ser;
Arg por lys; Asn por gln o his; Asp por glu; Cys por ser o ala; Gln
por asn; Glu por asp; Gly por pro; His por asn o gln; Ile por leu o
val; Leu por ile o val; Lys por arg; gln o glu; Met por leu o ile;
Phe por met, leu o tyr; Ser por thr; Thr por ser; Trp por tyr; Tyr
por trp o phe; y, Val por ile o leu.
Las secuencias nucleótidas que codifican xilosas
isomerasas o xilulosa quinasas de la invención pueden definirse
también por su capacidad para hibridar con las secuencias
nucleótidas de SEQ ID nº 2 o SEQ ID nº 4, respectivamente, bajo
condiciones de hibridación moderadas, o preferiblemente rigurosas.
Las condiciones de hibridación rigurosas se definen aquí como
condiciones que permiten hibridar una secuencia de ácidos nucléicos
de al menos unos 25, mejor de aproximadamente 50 nucleótidos, 75 o
100 y más preferiblemente de alrededor de 200 o más nucleótidos, a
una temperatura de unos 65ºC en una solución que contenga
aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier
otra solución que tenga una fuerza fónica comparable, y lavar a
65ºC en una solución que contenga aproximadamente 0.1 M de sal, o
menos, preferiblemente 0.2 x SSC o cualquier otra solución que
tenga una fuerza fónica comparable. Preferiblemente, la hibridación
se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y
el lavado se realiza preferiblemente durante al menos una hora con
un mínimo de dos cambios de la solución de lavado. Estas
condiciones normalmente permiten la hibridación específica de
secuencias que tienen aproximadamente un 90% o más de identidad de
secuencia.
Las condiciones moderadas se definen aquí como
condiciones que permiten hibridar secuencias de ácidos nucleicos de
al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de unos 200 o más
nucleótidos, a una temperatura de aproximadamente 45ºC en una
solución que contenga aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente 6
x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica
comparable, y lavar a temperatura ambiente en una solución que
contenga aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente 6 x SSC o
cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable.
Preferiblemente, la hibridación se realiza durante la noche, es
decir, durante al menos 10 horas, y el lavado se realiza
preferiblemente durante al menos una hora con un mínimo de dos
cambios de la solución de lavado. Estas condiciones normalmente
permiten la hibridación específica de secuencias que tienen hasta un
50% de identidad de secuencia. El experto en la técnica será capaz
de modificar estas condiciones de hibridación para identificar de
forma específica secuencias que varíen en identidad entre un 50% y
un 90%.
Tal y como se utiliza aquí, el término
"operativamente enlazado" se refiere a una conexión de
elementos polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido
nucleico está "operablemente enlazado" cuando está colocado en
una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucléicos. Por
ejemplo, un promotor o intensificador está operativamente enlazado
a una secuencia codificante si ello afecta a la transcripción de la
secuencia codificante. Operablemente enlazadas significa que las
secuencias de ADN que se enlazan son normalmente contiguas y, donde
sea necesario unir dos regiones de codificación de proteínas,
contiguas y en el marco de lectura.
Como se utiliza en este caso, el término
"promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que
funciona para controlar la transcripción de uno o más genes,
ubicados en sentido ascendente con respecto a la dirección de
transcripción del sitio de inicio de la transcripción de los genes,
y se identifica estructuralmente por la presencia de un centro de
unión para la ANR polimerasa dependiente de ADN, sitios de
iniciación de transcripción y cualquier otra secuencia de ADN,
incluido, pero no limitado a sitios de enlace de factores de
transcripción; sitios de unión de proteínas represoras y
activadoras, y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida para
un experto en la técnica que actúe directa o indirectamente con el
fin de regular la cantidad de transcripción desde el promotor. Un
promotor "constitutivo" es un promotor activo bajo muchas
condiciones del entorno y de desarrollo. Un promotor
"inducible" es un promotor activo bajo una regulación del
entorno o de desarrollo.
En un primer aspecto la presente invención se
refiere a una célula huésped transformada que tiene la capacidad de
isomerizar xilosa a xilulosa. La capacidad de isomerizar xilosa a
xilulosa se confiere a la célula huésped mediante la transformación
de la célula huésped con un constructo de ácidos nucléicos que
comprende una secuencia de nucleótidos, que a su vez codifica una
xilosa isomerasa. La capacidad de la célula huésped transformada
para isomerizar xilosa a xilulosa es la isomerización directa de
xilosa a xilulosa. Esto significa que la xilosa isomerizada a
xilulosa en una única reacción catalizada por una xilosa isomerasa
es diferente a la conversión en dos fases de xilosa a xilulosa a
través de un xilitol intermediario así como catalizado por xilosa
reductasa y xilitol deshidrogenasa, respectivamente.
La secuencia de nucleótidos codifica una xilosa
isomerasa que está preferiblemente expresada en forma activa en la
célula huésped transformada. Así, la expresión de la secuencia de
nucleótidos en la célula huésped produce una xilosa isomerasa con
una actividad específica de al menos 10 U de actividad de xilosa
isomerasa por mg de proteína a 25ºC, preferiblemente de al menos
20, 25, 30, 50, 100, 200 o 300 U por mg a 25ºC. La actividad
específica de la xilosa isomerasa expresada en la célula huésped
transformada se define aquí como la cantidad de unidades de
actividad de xilosa isomerasa por mg de proteína de lisado libre de
células de la célula huésped, por ej. un lisado libre de células de
levadura. La determinación de la actividad de xilosa isomerasa, la
cantidad de proteína y la preparación del lisado libre de células se
describen en el Ejemplo 1. De forma alternativa, la actividad
específica se puede determinar como se indica en el Ejemplo 4. Por
consiguiente, la expresión de la secuencia de nucleótidos en la
célula huésped produce una xilosa isomerasa con una actividad
específica de al menos 50 U de actividad de xilosa isomerasa por mg
de proteína a 30ºC, preferiblemente de al menos 100, 200, 500, o 750
U por mg a 30ºC.
Preferiblemente, la expresión de la secuencia de
nucleótidos en la célula huésped produce una xilosa isomerasa con
un K_{m} por xilosa, que es menos de 50, 40, 30 o 25 mM, más
preferentemente, el K_{m} para la xilosa es aproximadamente de 20
mM o menos.
Una secuencia de nucleótidos que codifica la
xilosa isomerasa puede ser seleccionada del grupo que consiste en:
secuencias de nucleótidos que codifican una xilosa isomerasa que
comprenden una secuencia de aminoácidos con al menos un 70, 80, 90,
95, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID nº: 1, determinada usando un algoritmo
Needleman y Wunsch.
La secuencia de nucleótidos preferentemente
codifica una xilosa isomerasa eucariótica, es decir, una xilosa
isomerasa con una secuencia de aminoácidos idéntica a la de una
xilosa isomerasa que se encuentra de forma natural en un organismo
eucariótico. La expresión de una xilosa isomerasa eucariótica
aumenta la probabilidad de que la xilosa isomerasa se exprese en
forma activa en una célula huésped eucariótica como una levadura, a
diferencia de las xilosas isomerasas mesofílicas procarióticas. De
forma más deseada, la secuencia nucleótida codifica una xilosa
isomerasa de plantas o una xilosa isomerasa fúngica (p. ej. de
Basidiomycete). Con la mayor preferencia, no obstante, la
secuencia nucleótida codifica una xilosa isomerasa de un hongo
anaeróbico, para aumentar más la probabilidad de expresión en forma
enzimáticamente activa en una célula huésped eucariótica, en
particular en levadura. Se prefieren mejor las secuencias de
nucleótidos que codifican una xilosa isomerasa de un hongo
anaeróbico que pertenezca a las familias Neocallimastix,
Caecomyces, Piromyces, Orpinomyces, o Ruminomyces.
Una célula huésped para la transformación
mediante una secuencia de nucleótidos que codifica una xilosa
isomerasa es preferentemente un huésped capaz de transportar de
forma activa o pasiva xilosa dentro de la célula. La célula huésped
contiene preferentemente glucólisis activa, la ruta de fosfatos de
pentosa, y preferiblemente contiene actividad xilulosa quinasa de
modo que la xilulosa isomerizada de xilosa se puede metabolizar a
piruvato. Además, el huésped contiene preferiblemente enzimas para
la conversión de piruvato a un producto de fermentación deseado tal
como etanol, etileno o ácido láctico. Una célula huésped preferida
es una célula huésped naturalmente capaz de la fermentación
alcohólica, preferentemente, de la fermentación alcohólica
anaeróbica. Preferiblemente, la célula huésped tiene además una alta
tolerancia al etanol y a los ácidos orgánicos, como el ácido
láctico, el ácido acético o el ácido fórmico y los productos de
degradación de azúcar tales como el furfural y el
hidroximetilfurfural. Cualquiera de estas características o
actividades de la célula huésped pueden encontrarse de forma natural
en la célula huésped o se pueden introducir o modificar mediante
modificación genética. Una célula huésped adecuada es un
microorganismo como una bacteria o un hongo, no obstante, lo más
adecuado como célula huésped son las levaduras o los hongos
filamentosos.
filamentosos.
Las levaduras se definen aquí como
microorganismos eucarióticos e incluyen todas especies de la
subdivisión Eumicotina (Alexopoulos, C. J., 1962, en: Introductory
Mycology, John Wiley & Sons, Inc., New York) que
predominantemente crecen en forma unicelular. Las levaduras pueden
crecer o bien mediante injerto de un tallo unicelular o bien
mediante fisión del organismo. Las levaduras preferidas para ser
células huéspedes pertenecen a los géneros Saccharomyces,
Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosacaromyces, Hansenula,
Kloeckera, Schwanniomyces, y Yarrowia. Preferiblemente,
la levadura es capaz de una fermentación anaeróbica, y más
preferiblemente de una fermentación alcohólica anaeróbica.
Los hongos filamentosos se definen aquí como
microorganismos eucarióticos que incluyen todas las formas
filamentosas de la subdivisión Eumicotina. Estos hongos se
caracterizan por un micelio vegetativo compuesto por quitina,
celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos
de la presente invención son morfológica, fisiológica y
genéticamente diferentes de las levaduras. El crecimiento vegetativo
por hongos filamentosos se produce mediante alargamiento hifal y el
catabolismo de carbono de la mayoría de hongos filamentosos se
produce de forma estrictamente aeróbica. Los hongos filamentosos
preferidos para ser células huéspedes pertenecen a los géneros
Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremonium, Fusarium y
Penicillium.
Con el paso de los años se han hecho sugerencias
para introducir varios organismos para la producción de bioetanol
proveniente de azúcares de cosechas. En la práctica, sin embargo,
los procesos de producción de bioetanol más importantes han
continuado usando las levaduras del género Saccharomyces
como productoras de etanol. Esto se debe a las muchas
características atractivas de la especie Saccharomyces para procesos
industriales, es decir, alta tolerancia al ácido, al etanol y a la
osmolaridad; capacidad de crecimiento anaeróbico, y por supuesto
alta capacidad de fermentación alcohólica. Las especies de levadura
preferidas como células huéspedes incluyen S. cerevisiae, S.
bulderi, S. bametti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K.
lactis, K. marxianus, y K. fragilis.
La célula huésped se transforma con un
constructo de ácidos nucléicos como se define más detalladamente
abajo, y pueden comprender una única copia, aunque sería mejor
múltiples copias, del constructo de ácidos nucléicos. El constructo
de ácidos nucléicos se puede mantener de forma episomal y
comprender así una secuencia de replicación autónoma, tal como un
secuencia ARS. Los constructos adecuados de ácidos nucleicos
episómicos pueden estar basados, p. ej., en los plásmidos de
levadura 2 \mu o pKD1 (Fleer et al., 1991, Biotechnology
9:968-975). Preferiblemente, no obstante, el
constructo de ácidos nucléicos está integrado en una o más copias
del genoma de la célula huésped. La integración en el genoma de la
célula huésped puede ocurrir al azar mediante recombinación
ilegítima, pero es más preferible que el constructo de ácidos
nucléicos se integre en el genoma de la célula huésped mediante
recombinación homóloga, como bien se conoce en la técnica de
genética molecular fúngica (ver p. ej. WO 90/14423,
EP-A-0 481 008,
EP-A-0 635 574 y US 6.265.186).
En una célula huésped transformada preferida
según la invención, el constructo de ácidos nucléicos confiere a la
célula huésped la capacidad de aumentar la xilosa como fuente de
carbono, preferiblemente como fuente de carbono única, y bajo
condiciones anaeróbicas, a través de la cual preferentemente el
huésped transformado no produce esencialmente xilitol, por ej. el
xilitol producido está por debajo del límite de detección o por ej.
es menor de un 5, 2, o un 1% del carbono consumido en una base
molar. La célula huésped transformada tiene la capacidad de
aumentar la xilosa como única fuente de carbono a una velocidad de
al menos 0.01, 0.02, 0.05, 0.1 o 0.2 h^{-1}. La célula huésped
transformada de la invención expresa así una xilosa isomerasa a un
nivel de actividad específico definido arriba.
Una célula huésped puede comprender
modificaciones genéticas adicionales que resulten en una o más de
las características seleccionadas del grupo que consiste en (a)
mayor transporte de xilosa a la célula huésped; (b) mayor actividad
de xilulosa quinasa; (c) mayor flujo de la ruta de fosfatos de
pentosa; (d) menor sensibilidad para la represión catabólica; (e)
mayor tolerancia al etanol, la osmolaridad o los ácidos orgánicos;
y, (f) menor producción de subproductos. Los subproductos se
entienden como otras moléculas contenedoras de carbono diferentes
del producto de fermentación deseado e incluyen p. ej. xilitol,
glicerol y/o ácido acético. Tales modificaciones genéticas pueden
introducirse mediante mutagénesis tradicional, cribado y/o
selección de la mutación deseada. De forma alternativa, las
modificaciones genéticas pueden consistir en una sobreexpresión de
genes endógenos y/o una expresión de unos genes heterólogos y/o la
inactivación de genes endógenos. Los genes son escogidos
preferiblemente de genes que codifican una hexosa o son
transportadores de pentosa; una xilulosa quinasa tal como los genes
de xilulosa quinasa de S. cerevisae (XKS1 Deng and Ho,
1990, Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25:
193-199) o Piromyces (xylB, es decir
SEQ ID nº 4); una enzima de la ruta de fostafos de pentosa tal como
una transaldolasa (TAL1) o una transcetolasa (TKL1)
(véase p. ej. Meinander et al., 1995, Pharmacol. Toxicol.
Suppl. 2: 45) enzimas glicolíticas, enzimas etanologénicas tales
como deshidrogenasas de alcolhol. Los genes endógenos preferidos
para la inactivación incluyen un gen de hexosa quinasa, por ej. el
gen de S. cerevisae HXK2 (véase Diderich et
al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67:
1587-1593); los genes de S. cerevisae
MIG1 o MIG2; genes de aldosa red uctasa (no
específicos) tales como el gen de S. cerevisae GRE3
(Traff et al., 2001, Appl. Environm. Microbiol. 67:
5668-5674); genes para enzimas implicadas en el
metabolismo de glicerol tales como los genes de S. cerevisae
glicerolfosfato dehidrogenasa 1 y/o 2; u homólogos (hibridizantes)
de los genes en otras especies huésped. Otras modificaciones de
células huéspedes preferidas para la fermentación de xilosa son
analizadas en Zaldivar et al. (2001, supra).
En otro aspecto la invención se refiere a una
célula huésped transformada para la producción de productos de
fermentación, excepto de etanol. Este tipo de productos de
fermentación no etanólica incluyen en un principio cualquier
producto químico de mayor o menor volumen que sea producible por un
microorganismo eucariótico tal como una levadura o un hongo
filamentoso. Tales productos de fermentación incluyen p. ej. ácido
láctico, ácido acético, ácido succínico, aminoácidos,
1,3-propano-diol, etileno,
glicerol, antibióticos \beta-lactámicos y
cefalosporinas.
La transformación de células huéspedes con los
constructos de ácidos nucleicos de la invención y la modificación
genética adicional de células huéspedes, preferiblemente levaduras,
como se ha descrito anteriormente, se pueden realizar mediante
métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos son conocidos
por ej. en manuales estándares, tales como Sambrook and Russel
(2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3ª edición),
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
o F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular
biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York
(1987). Se conocen métodos para la transformación y modificación
genética de células huéspedes fúngicas por ej. en
EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO
99/60102 y WO 00/37671.
En otro aspecto la invención se refiere a un
constructo de ácidos nucléicos que comprende una secuencia
nucleótida, que a su vez codifica una xilosa isomerasa tal como se
ha definido anteriormente, y ésta se usa para la transformación de
una célula huésped, tal como se ha definido anteriormente. En el
constructo de ácidos nucléicos, preferiblemente la secuencia de
nucleótidos que codifica la xilosa isomerasa está operativamente
enlazada a un promotor para el control y la iniciación de la
transcripción de la secuencia nucleótida en una célula huésped tal
y como se define abajo. El promotor, preferiblemente, es capaz de
causar suficiente expresión de xilosa isomerasa en la célula
huésped para conferir a la célula huésped la capacidad de isomerizar
la xilosa a xilulosa. Preferiblemente, el promotor causa una
actividad de xilosa isomerasa específica en la célula huésped tal
como se ha definido anteriormente. Entre los promotores útiles en
los constructos de ácidos nucleicos de la invención se incluyen
ambos promotores constitutivos e inducibles naturales al igual que
los promotores creados genéticamente. Un promotor preferido para su
uso en la presente invención será además insensible a la represión
catabólica (glucosa) y/o preferiblemente no requerirá xilosa para
la inducción. Los promotores que tengan estas características están
mucho más disponibles y son mucho más conocidos por el experto en la
materia. Ejemplos adecuados de promotores de este tipo incluyen por
ej. a los promotores de levadura de genes glicolíticos, tal como la
fosfofructoquinasa de levadura (PPK), triosa fosfato isomerasa
(TPI),
gliceraldehído-3-fosfato-dehidrogenasa
(GPD, TDH3 o GAPDH), piruvato-quinasa (PiK),
fosfoglicerato-quinasa (PGK); se pueden encontrar
más detalles sobre este tipo de promotores en (WO 93/03159). Otros
promotores útiles son los promotores de genes que codifican
proteínas ribosómicas, el promotor de gen de lactasa (LAC4), los
promotores de alcohol-dehidrogenasa (ADH1, ADH4, y
similares), y el promotor de enolasa (ENO). Otros promotores, tanto
constitutivos como inducibles así como potenciadores o secuencias
activadoras en sentido ascendente, serán conocidos por los expertos
en la materia. Los promotores usados en los constructos de ácidos
nucleicos de la presente invención pueden ser modificados, si se
desea, para influir en sus características de control.
Preferiblemente, el promotor usado en el constructo de ácidos
nucléicos para la expresión de la xilosa isomerasa es homólogo a la
célula huésped en la que se expresa la xilosa isomerasa.
Preferiblemente, en el constructo de ácidos
nucléicos, el extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleótidos que
codifica la xilosa isomerasa se enlaza operativamente a una
secuencia de transcripción terminadora. Preferiblemente, la
secuencia terminadora es operable en una célula huésped de elección,
tales como p. ej. las especies de levadura de elección. En
cualquier caso la elección del terminador no es un punto crítico,
por ej. puede provenir de cualquier gen de levadura, aunque a veces
los terminadores pueden funcionar con genes eucaróticos que no
provienen de ninguna levadura. Además, preferiblemente, la secuencia
de transcripción terminadora comprende una señal de
poliadenilación.
Opcionalmente, puede estar presente un marcador
seleccionable en el constructo de ácidos nucléicos. Tal y como se
utiliza aquí, el término "marcador" se refiere a un gen que
codifica una característica o un fenotipo que permite la selección
de o para una célula huésped que contenga al marcador. El gen
marcador puede ser un gen de resistencia antibiótica a través del
cual se pueda utilizar el antibiótico apropiado para seleccionar
células transformadas de entre las células no transformadas.
Ejemplos de marcadores de resistencia antibiótica adecuados
incluyen, por ej., dihidrofolato-reductasa,
higromicina-b-fosfotransferasa,
3'-O-fosfotransferasa II
(resistencia a canamicina, neomicina y G418). Aunque los marcadores
de resistencia antibiótica puedan ser más convenientes para la
transformación de células huéspedes poliploides, preferiblemente,
no obstante, se usan marcadores de resistencia no antibiótica, así
como marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2) o el gen de S.
pombe TPI (descrito por Russell P R, 1985, gen 40,
125-130). En una forma de realización preferida las
células huéspedes transformadas con los constructos de ácidos
nucleicos son genes marcadores libres. Se exponen métodos para
construir genes marcadores recombinantes de células huéspedes
microbianas libres en EP-A-0 635
574, basados en el uso de marcadores bidireccionales tales como el
gen A. nidulans amdS (acetamidasa) o los genes de levadura
URA3 y LYS2. De forma alternativa, un marcador de diagnóstico tal
como la proteína verde fluorescente, lacZ, luciferasa,
cloranfenicol acetiltransferasa, o
beta-glucuronidasa, puede ser incorporado en los
constructos de ácidos nucleicos de la invención permitiendo cribar
las células
transformadas.
transformadas.
Algunos otros elementos opcionales que pueden
estar presentes en los constructos de ácidos nucleicos de la
invención incluyen, pero no se limitan a, una o más secuencias
líder, intensificadores, factores de integración, y/o genes
indicadores, secuencias de intrón, centromeros, telomeros y/o
secuencias de fijación matricial (MAR). Los constructos de ácidos
nucleicos de la invención pueden comprender además una secuencia
para la replicación autónoma, como una secuencia ARS. Los
constructos de ácidos nucleicos episómicos adecuados pueden estar
basados, por ej., en los plásmidos de levadura 2 \mu o pKD1 (Fleer
et al., 1991, Biotechnology 9:968-975). De
forma alternativa, el constructo de ácidos nucléicos puede
comprender secuencias para la integración, preferiblemente por
recombinación homóloga. De este modo tales secuencias pueden ser
secuencias homólogas al sitios objetivo para la integración en el
genoma de la célula huésped. Los constructos de ácidos nucleicos de
la invención pueden ser proporcionados de un modo conocido per
se, que generalmente implica técnicas tales como restringir y
conectar secuencias de ácidos nucleicos/ácido nucleico, para lo que
se hace referencia a los manuales estándares, tales como Sambrook
and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3ª
edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, o F. Ausubel et al, eds., "Current
protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley
Interscience, New York (1987).
En otro aspecto, la descripción se refiere a una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos, que a su vez codifica una xilosa isomerasa. La
molécula de ácido nucleico se selecciona preferiblemente del grupo
que consiste en:
- (a)
- moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido, las cuales comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50, 53, 54, 55, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, o un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 1;
- (b)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos, la cual tiene al menos un 50, 56, 57, 58, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, o un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID nº 2;
- (c)
- moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida a una secuencia de moléculas de ácido nucleico de (a) o (b);
- (d)
- moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (c) debido a la degeneración del código genético.
De forma alternativa, una molécula de ácido
nucleico de (a) puede codificar un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos, la cual tiene al menos un 67, 68, 69, 70,
80, 90, 95, 97, 98, o un 99% de similitud de secuencia con la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 1. Una molécula de ácido
nucleico de (c) preferiblemente hibrida bajo condiciones moderadas,
y más preferiblemente bajo condiciones rigurosas, como ya se ha
definido arriba. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico
proviene de una célula eucariota, más preferiblemente de un
microorganismo eucariótico tal como un hongo, y de la forma más
preferible de un hongo anaeróbico, tal como p. ej. algún hongo
anaeróbico de los descritos anteriormente.
Otro aspecto más de la descripción se refiere a
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos, la cual codifica una xilulosa quinasa, preferiblemente
una D-xilulosa quinasa. Una
D-xilulosa quinasa (EC 2.7.1.17; también referida
como una D-xiluloquinasa) se define aquí como una
enzima que cataliza la conversión de D-
xilulosa en xilulosa-5-fosfato. La molécula de ácido nucleico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en:
xilulosa en xilulosa-5-fosfato. La molécula de ácido nucleico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en:
- (a)
- moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 45, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, o un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 3;
- (b)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos, la cual tiene al menos un 30, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, o un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº 4;
- (c)
- moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida a una secuencia de molécula de ácido nucleico de (a) o (b); y,
- (d)
- moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (c) debido a la degeneración del código genético.
De forma alternativa, una molécula de ácido
nucleico de (a) puede codificar un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos, la cual tiene al menos un 64, 65, 66, 70,
80, 90, 95, 97, 98, o 99% de similitud de secuencia con la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº3. Una molécula de ácido
nucleico de (c) hibrida preferiblemente bajo condiciones moderadas,
y más preferiblemente bajo condiciones rigurosas, como se ha
definido arriba. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico
proviene de una célula eucariota, más preferiblemente de un
microorganismo eucariótico tal como un hongo, y de la forma más
preferible de un hongo anaeróbico, tal como p. ej. los hongos
anaeróbicos descritos anteriormente.
En otro aspecto la invención se refiere a
procesos de fermentación donde las células huéspedes transformadas
de la invención se usan para la fermentación de la fuente de
carbono que comprende una fuente de xilosa, tal como xilosa. Además
de una fuente de xilosa, la fuente de carbono en el medio de
fermentación puede comprender también una fuente de glucosa. La
fuente de xilosa o glucosa puede ser de xilosa o glucosa como tales
o puede consistir en cualquier oligómero o polímero de
carbohidratos que comprenda xilosa o unidades de glucosa, tal como
p. ej. lignocelulosa, xilanos, celulosa, almidón y similares. Para
la emisión de unidades de xilosa o de glucosa de carbohidratos de
este tipo se pueden añadir carbohidrasas apropiadas (tales como
xilanasas, glucanasas, amilasas y similares) al medio de
fermentación, o ésta también se puede producir por la célula
huésped transformada. En este caso, la célula huésped transformada
se puede crear genéticamente para producir y excretar carbohidrasas
de este tipo. En un proceso deseado, la célula huésped transformada
fermenta tanto la xilosa como la glucosa, preferiblemente de forma
simultánea, en cuyo caso se usa preferiblemente una célula huésped
transformada insensible a la represión de glucosa para prevenir el
crecimiento diauxico. Además de una fuente de xilosa (y glucosa)
como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá
también el ingrediente apropiado requerido para el crecimiento de
la célula huésped transformada. Las composiciones de medios de
fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como
levaduras son bien conocidas en la técnica.
El proceso de fermentación es un proceso para la
producción de un producto de fermentación tal como etanol, ácido
láctico, ácido acético, ácido succínico, aminoácidos,
1,3-propano-diol, etileno, glicerol,
antibióticos \beta-lactámicos tales como
Penicilina G o Penicilina V y derivados fermentativos de los
mismos, y cefalosporinas. El proceso de fermentación puede ser un
proceso de fermentación aeróbico o anaeróbico. Un proceso de
fermentación anaeróbico se define aquí como un proceso de
fermentación que funciona en ausencia de oxígeno o donde
sustancialmente no se consume oxígeno, por ej., menos de 5 mmol/L/h,
y donde las moléculas orgánicas sirven a la vez de donantes de
electrones y de aceptadores de electrones. En ausencia de oxígeno,
el NADH producido en la glucólisis y la formación de biomasa no
puede ser oxidado por fosforilación oxidante. Para resolver este
problema muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus
derivados, como aceptado de electrones y de hidrógeno, regenerando
de este modo NAD^{+}. Así, en un proceso de fermentación
anaeróbica deseado el piruvato se usa como un aceptador de
electrones (y de hidrógeno) y se reduce a productos de fermentación
tales como etanol, ácido láctico, 1,3-propanodiol,
etileno, ácido acético o ácido succínico.
El proceso de fermentación se empieza
preferiblemente a una temperatura óptima para la célula huésped
transformada. Así, para la mayoría de levaduras o de células
huéspedes fúngicas, el proceso de fermentación se realiza a una
temperatura inferior a 38ºC. Para levaduras o células huéspedes
filamentosas fúngicas, el proceso de fermentación se realiza
preferiblemente a una temperatura inferior a 35, 33, 30 o 28ºC y a
una temperatura superior a 20, 22, o 25ºC.
Un proceso deseado es un proceso para la
producción de etanol, para lo cual éste proceso comprende las fases
de: (a) fermentación de un medio que contiene una fuente de xilosa
con una célula huésped transformada, tal como se ha definido
anteriormente, por la cual la célula huésped fermenta xilosa a
etanol; y, opcionalmente, (b) recuperación del etanol. El medio de
fermentación también puede comprender una fuente de glucosa, la
cual también se fermenta a etanol. Preferiblemente, en el proceso
la productividad de etanol volumétrico es de al menos 0.5, 1.0,
1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 5.0 o 10.0 g de etanol por litro por hora.
Preferiblemente, el rendimiento de etanol en xilosa y/o glucosa en
el proceso es de al menos un 50, 60, 70, 90, 95 o 98%. El
rendimiento de etanol se define aquí como un porcentaje del
rendimiento teórico, el cual para glucosa y xilosa es de 0.51 g de
etanol por g de glucosa o xilosa.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
proceso para producir un producto de fermentación seleccionado del
grupo que consiste en ácido láctico, ácido acético, ácido
succínico, aminoácidos,
1,3-propano-diol, etileno, glicerol,
antibióticos \beta-lactámicos y cefalosporinas.
Preferiblemente, el proceso comprende las fases de: (a)
fermentación de un medio que contiene una fuente de xilosa con una
célula huésped transformada, tal y como se ha definido arriba, por
la cual la célula huésped fermenta xilosa al producto de
fermentación, y, opcionalmente, (b) recuperación del producto de
fermentación. En un proceso deseado, el medio también contiene una
fuente de glucosa.
Figura 1. Curvas de crecimiento del
transformante de S. cerevisiae desarrollado en un medio que
contiene 25 mM de galactosa y 100 mM de xilosa como fuente de
carbono. El transformante pYes contiene un vector de expresión de
levadura sin inserción. Los transformantes 14.3, 16.2.1 y 16.2.2
son transformados con el vector pYES, que contiene la secuencia
codificante de xilosa isomerasa de Piromyces esp. E2.
El hongo anaeróbico Piromyces esp. E2
(ATCC 76762), aislado de heces de un elefante indio, se desarrolló
de forma anaeróbica bajo N_{2}/CO_{2} (80%/20%) a 39ºC en un
medio M2 suplementado con varias fuentes de carbono (24). Las
fuentes de carbono usadas fueron Avicel (celulosa microcristalina de
tipo PH 105, Serva, Alemania), fructosa o xilosa (todos 0,5%, p/v).
Después de que el crecimiento cesara, según se juzgó por la
producción de hidrógeno, las células se cosecharon por centrifugado
(15.000 x g, 4ºC, 15 min;) o por filtración sobre gasa de nilón
(con un tamaño de poro de 30 \muM).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células micóticas se lavaron con agua
desionizada para eliminar componentes del medio. Los extractos
libres de la célula se prepararon mediante congelación de las
células en nitrógeno líquido y trituración posterior con perlas de
vidrio (de 0.10-0.11 mM de diámetro) en un mortero.
Se añadió un tampón de Tris/HCL (100 mM, pH 7.0) al polvo (1:1,
p/v) y después de descongelarse la suspensión durante 15 min, ésta
se centrifugó (18.000 x g, 4ºC, 15 min). El sobrenadante claro se
usó como una fuente de enzimas intracelulares.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de xilosa isomerasa se evaluó a
37ºC en una mezcla reactiva que contenía un tampón de 50 mM de
fosfato (pH 7.0), 10 mM de xilosa, 10 mM de MgCl_{2} y una
cantidad adecuada de extracto libre de célula. La cantidad de
xilulosa formada se determinó mediante el método de
cisteína-carbazol (9). Las actividades de xilulosa
quinasa y xilosa reductasa se evaluaron como se describe por
Witteveen et al. (28). Una unidad de actividad se define
como la cantidad de enzimas que producen 1 nmol de xilulosa por
minuto según las condiciones del ensayo. La xilulosa formada se
determinó por el método de Dische y Borenfreund (Dische and
Borenfreund, 1951, J. Biol. Chem. 192,
583-587) o por HPLC, usando una columna BioRad
HPX-87N accionada a 80ºC y eluada a 0.6 ml/min,
usando 0.01 M de Na_{2}HPO_{4}, como elueno. La xilosa y la
xilulosa se detectaron con un detector de Indice de Refracción a
una temperatura interna de 60ºC.
La actividad específica se expresa en unidades
por mg de proteína. La proteína se determinó con el reactivo de
proteínas Bio-Rad (Laboratorios
Bio-Rad, Richmond, CA, EEUU) con
\gamma-globulina bovina como estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó la genoteca de ADNc construida en el
vector lambda ZAPII como se ha descrito previamente (2). Una parte
alícuota de esta genoteca se convirtió en clones de PBluescript SK
mediante escisión de masa con el fago ExAssist auxiliar
(Stratagene, La Jolla, CA, USA). Los clones seleccionados de forma
aleatoria fueron secuenciados con el cebador inverso M13 para
obtener secuencias de 5' partes. Los ADNcs incompletos se usaron
para sintetizar sondas, las cuales se usaron para volver a cribar
la genoteca. Para obtener secuencias de longitud total se generaron
subclones en pUC18. La secuenciación se realizó con el secuenciador
automatizado ABI prism 310 y con el kit secuenciador de ADN de
reacción preparada para el ciclo de secuenciación del terminador de
dRhodamine (Perkin-Elmer Applied Biosystems).
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones seleccionados de una genoteca de ADNc
del hongo anaeróbico Piromyces esp. E2 se ordenaron de forma
aleatoria, de ahí resultaron dos clones (pH97 y pAK44) cuyas
secuencias mostraron una alta homología con la xilosa isomerasa y
los genes D-xiluloquinasa, respectivamente. Se
analizaron los clones detalladamente.
El clon pH97 no contenía un ORF (marco de
lectura abierto, del inglés Open Reading Frame) completo y en
consecuencia se volvió a cribar la genoteca de ADNc con una sonda
diseñada en base a los datos de secuencia del clon pH97. Esto
resultó en un clon pR3 con un inserto de 1669 pares de bases. Se
podría identificar un ORF que codifique una proteína de 437
aminoácidos con una alta similitud con las xilosas isomerasas.
Aunque la región no codificante 5' comprende sólo 4 pares de bases,
el presunto principio de residuo de metionina se adaptó bien en una
alineación de secuencias conocidas de xilosa isomerasa. La región
no codificante 3' tuvo 351 pares de bases de longitud y un alto
contenido de AT, lo que es típico para los hongos anaeróbicos. El
ORF contenido en los aminoácidos se mostró como un factor
importante para la interacción con el sustrato (tríada catalítica
His 102, Asp 105, Asp 340 y Lys 235) y la unión de magnesio (Glu
232) (14, 26). Además estaban presentes los dos modelos de firma
(residuos 185-194 y 230-237)
desarrollados para las xilosas isomerasas (20). La xilosa isomerasa
(Xy1A) de Piromyces esp. E2 muestra la máxima homología con
las enzimas de Haemophilus influenza (52% de identidad, 68%
de similitud) y Hordeum vulgare (49% de identidad, 67% de
similitud). El polipéptido deducido de la secuencia de ADNc se
corresponde con una masa molecular de 49,395 Da y tiene un pl
calculado de 5,2.
El segundo clon, pAK44, tuvo un inserto de 2041
pares de bases y contenía un ORF completo que codificaba una
proteína de 494 aminoácidos con un peso molecular de 53.158 Da y un
pl de 5.0. La primera metionina se procesó mediante una región no
codificante de 111 pares de bases 5', mientras que la región no
codificante 3' comprendía 445 pares de bases. Ambas regiones son
ricas en AT. Las búsquedas BLAST y FASTA revelaron una alta
similitud con xiluloquinasas. Las dos regiones de consenso de
fosfato definidas por Rodríguez-Peña et al.
(22) se encontraron en las posiciones 6-23 y
254-270, como se muestra en una alineación parcial.
Además se identificaron las firmas para esta familia de
carbohidrato quinasa como se describen en la base de datos Prosite
(131-145 y 351-372). La
xiluloquinasa (Xy1 B) de Piromyces esp. E2 presentó la máxima
homología con la proteína Xy1 B de Haemophilus influenza
(46% de identidad, 64% de similitud).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó ADNc de Piromyces esp. E2 en una
reacción PCR con polimerasa Pfu (Stratagene). Los cebadores
se diseñaron usando las secuencias de los extremos 5' y 3' del gen
de xilosa isomerasa y también contenían un Sfi I y un sitio de
restricción de XbaI. El producto de PCR se clonó en el vector
pPICZ\alpha (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Para obtener el gen
de xilosa isomerasa, se digirió el vector pPICZ\alpha con EcoRI y
XbaI. El producto de digestión se ligó en el vector pYes2
(Invitrogen). El plásmido pYes2 junto con el gen de xilosa
isomerasa se transformó en Saccharomyces cerevisiae (stam
BJ1991, donación de Beth Jones, UvA). El genotipo de esta cepa es:
mat\alpha, leu2, trp1, ura 3-251,
prb1-1122 y pep4-3.
Los transformantes fueron colocados en placas SC
(0.67% de medio YNB + 0.05% de L-Leu + 0.05% de
L-Trp + 2% de glucosa + 2% de agarosa). Las células
no transformadas no pueden desarrollarse en estas placas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de Saccharomyces cerevisiae
transformadas se desarrollaron en un medio de glucosa a 25ºC
durante 72 h (se puede utilizar rafinosa como medio alternativo a
la glucosa). Las células se cosecharon y se resuspendieron en un
medio SC con galactosa en vez de glucosa. Después de 8 h de
inducción se cosecharon y lisaron las células usando perlas de
vidrio (de 0.10-0.11 mM de diámetro) y un "tampón
de suspensión" (un tampón de 50 mM de fosfato + 5% glicerol +
inhibidor de proteasa). Después de la lisis se centrifugó la mezcla
(18,000 x g, 4ºC, 15 min). El sobrenadante claro se usó para
determinar la actividad de xilosa isomerasa usando el método
descrito anteriormente (Ejemplo 1). Se midió una actividad de 10 U
por mg de proteína a 37ºC.
Las cepas de Saccharomyces cerevisiae se
desarrollaron en un medio SC con la composición siguiente: 0.67%
(p/v) de base nitrogenada de levadura; 0.01% (p/v) de
L-triptófano; 0.01% (p/v) de Leucina L o bien de
glucosa, galactosa o xilosa, o una combinación de estos sustratos
(ver abajo). Para las placas de agar se suplementó el medio con un
2% (p/v) de agar bactereológico.
La cepa de Saccharomyces cerevisiae
BJ1991 (genotipo: mat\alpha, leu2, trp1, ura
3-251; prb1-1122,
pep4-3) transformada con pYes2 sin inserción y tres
transformantes seleccionados (16.2.1, 16.2.2 y 14.3) conteniendo
pYes2 con el gen Piromyces esp. E2 de xilosa isomerasa
crecieron en placas de agar SC con 10 mM de glucosa como fuente de
carbono. Cuando las colonias se hicieron visibles, se utilizaron
colonias individuales para inocular el medio de SVC líquido con 100
mM de xilosa y 25 mM de galactosa como fuentes de carbono. Se
controló el crecimiento midiendo el aumento en densidad óptica a
600 nm en un espectrofotómetro LKB Ultrospec K.
Los resultados de los experimentos de
crecimiento se compilan en la figura 1. El cultivo junto con la
cepa BJ1991 transformada con pYes2 sin inserción muestra un aumento
en OD600 hasta llegar a 80 h. Después de este tiempo se observa una
reducción gradual. Esto es debido a la agregación de las células de
levadura, lo cual se observa con frecuencia al final del
crecimiento. Los cultivos con los tres transformantes no dejan de
crecer después de 80 h y muestran una continuación del aumento
hasta llegar al menos a 150 H.
Se utilizó el vector pPICZ\alpha, conteniendo
el gen de Piromyces esp. E2 que codifica la xilosa isomerasa
como molde para la PCR con ADN polimerasa Vent_{R} (New England
Biolabs). Los cebadores se diseñaron usando las secuencias 5' y 3'
del gen que codifica la xilosa isomerasa e incluían un sitio EcoRI
y SpeI. Además, los cebadores se diseñaron para eliminar el sitio
XbaI encontrado en el constructo pPICZ\alpha, sustituyéndolo por
un codon de parada (TAA). El producto final se diseñó para
restaurar el marco de lectura abierto orginal, sin los aminoácidos
añadidos (marcadores his y c-Myc) encontrados en el
constructo pPICZ\alpha. El producto PCR se cortó con EcoRI y SpeI.
El producto final se clonó en un vector derivado de pYES2
(Invitrogen). En este vector el promotor GAL1 encontrado en
pYES2 se sustituyó por el promotor TPI1 para asegurar la expresión
constitutiva de la xilosa isomerasa, eliminando así la necesidad de
galactosa en el medio. El promotor TPI1 se clonó de una forma
modificada de plásmido pYX012 (sistemas R&D). El promotor se
cortó como un fragmento de NheI-EcoRI. Tanto el
promotor TPI1 como el producto de PCR del gen que codifica la
xilosa isomerasa se ligaron en un corte pYES2 con SpeI y XbaI. Este
plásmido se usó para transformar la cepa de Saccharomyces
cerevisiae CEN.PK113-5D (donación de Peter
K\tilde{o}tter, Frankfurt). El genotipo de la cepa es: MatA
ura3-52. Los transformantes se seleccionaron en
placas de medio mineral (Verduyn et al.: Effect of benzoic
acid on metabolic fluxes in yeasts: a continuous- culture study on
the regulation of respiration and alcoholic fermentation.(1992)
Yeast 8(7):501-17) con un 2% de glucosa como
fuente de carbono. Las células no transformadas no pueden crecer en
estas placas.
Los transformantes crecieron en mezclas de
glucosa/xilosa en cultivos quimiostáticos con límite de carbono.
Los transformantes que crecieron bajo estas condiciones mostraron
altas actividades de xilosa isomerasa (800 unidades por mg a 30ºC),
según un ensayo enzimático específico como el llevado a cabo por
Kersters-Hildersson et al. (Kinetic
characterization of D-xylose isomerases by enzymatic
assays using D-sorbitol dehydrogenase. Enz. Microb.
Technol. 9 (1987) 145-148). La actividad in
vitro de xilosa isomerasa en los extractos libres de célula de
la cepa de S. cerevisiae transformada resultó ser
dependiente de los cationes bivalentes (Mg2+ o Co2+) y se midió un
valor relativamente bajo de Km para la xilosa de aproximadamente 20
mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante es solamente para la conveniencia lector. No forma
parte del documento de patente europea. Aunque se hayan recopilado
las referencias con la mayor diligencia, la OEP no asume
responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones a este
respecto.
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<110> Royal Nedalco B.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fermentación de azúcares pentosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> xilosa isomerasa de Piromyces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> BO 44829
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-12-31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Piromyces esp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1669
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Piromyces esp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Piromyces esp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 2041
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Piromyces esp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
Claims (17)
1. Célula huésped eucariótica transformada con
un constructo de ácidos nucléicos que comprende una secuencia de
nucleótidos, la cual a su vez codifica una xilosa isomerasa que
comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 70% de
identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
No. 1, como se determinó usando un algoritmo de Needleman y Wunsch,
donde el constructo de ácidos nucléicos en la transformación de la
célula huésped confiere a la célula huésped la capacidad de crecer
en xilosa como fuente de carbono.
2. Célula huésped transformada según la
reivindicación 1, donde la célula huésped es una levadura,
preferiblemente una levadura perteneciente a uno de los géneros:
Saccharomyces, Kluyveromices, Candida, Pichia,
Schizosacaromyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y
Yarrowia.
3. Célula huésped transformada según la
reivindicación 2, donde la levadura pertenece a una de las
especies: S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S.
uvarum, S diastaticus, K. lactis, K. marxianus, y K.
fragilis.
4. Célula huésped transformada según la
reivindicación 1, donde la célula huésped es un hongo filamentoso,
preferiblemente un hongo filamentoso perteneciente a uno de los
géneros: Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremonium,
Fusarium, y Penicillium.
5. Célula huésped transformada según cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, donde la secuencia de
nucleótidos que codifica una xilosa isomerasa se enlaza de forma
operativa a un promotor que cause suficiente expresión de la xilosa
isomerasa en la célula huésped para conferir a la célula huésped la
capacidad para isomerizar xilosa en xilulosa.
6. Célula huésped transformada según la
reivindicación 5, donde el promotor es insensible a la represión
catabólica en la célula huésped.
7. Célula huésped transformada según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, donde la célula huésped
comprende una modificación genética que resulta en una
característica seleccionada del grupo que consiste en:(a) mayor
transporte de xilosa en la célula huésped;
(b) mayor actividad de xilulosa quinasa;
(c) mayor flujo de la ruta de fosfatos de
pentosa;
(d) menor sensibilidad a la represión
catabólica;
(e) mayor tolerancia al etanol, osmolaridad o
ácidos orgánicos; y,
(f) menor producción de subproductos.
8. Célula huésped transformada según la
reivindicación 7, donde la modificación genética consiste en una
sobreexpresión de un gen endógeno, una expresión de un gen
heterólogo, o una combinación de las mismas, y donde el gen
endógeno o heterólogo, se selecciona del grupo que consiste en un
gen que codifica: una hexosa o un transportador de pentosa, una
xilulosa quinasa; una enzima de la ruta de fosfatos de pentosa, una
enzima glicolítica, y una enzima etanologénica.
9. Célula huésped transformada según la
reivindicación 7, donde la modificación genética consiste en la
inactivación de un gen endógeno, donde el gen se selecciona del
grupo que consiste en un gen de hexosa quinasa, los genes
Saccharomices MIL1 y MIG2 y homólogos híbridos de los
mismos.
10. Célula huésped transformada según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, donde la célula huésped expresa
una o más enzimas que confieren a la célula huésped la capacidad
para producir ácido láctico, ácido acético, ácido succínico,
aminoácidos, 1,3-propano-diol,
etileno, glicerol, antibióticos \beta-lactámicos y
cefalosporinas.
11. Célula huésped transformada según la
reivindicación 10, donde la célula huésped contiene una
modificación genética que resulta en una actividad disminuida de
alcohol-deshidrogenasa.
12. Proceso para producir etanol, el cual
comprende las fases de:
- (a)
- fermentación de un medio que contiene una fuente de xilosa con una célula huésped transformada tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, donde la célula huésped fermenta xilosa a etanol, y opcionalmente,
- (b)
- recuperación del etanol.
13. Proceso según la reivindicación 12, donde el
medio también contiene una fuente de glucosa.
14. Proceso según las reivindicaciones 12 o 13,
donde la productividad de etanol volumétrico es de al menos 0.5 g
de etanol por litro y hora.
15. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones de la 12 a la 14, donde el rendimiento de etanol
es de al menos un 50% del rendimiento teórico de 0.51 g de etanol
por g de glucosa o xilosa.
16. Proceso para producir un producto de
fermentación seleccionado del grupo que consiste en ácido láctico,
ácido acético, ácido succínico, aminoácidos,
1,3-propanodiol, etileno, glicerol, antibióticos
\beta-lactámicos y cefalosporinas, donde el
proceso comprende las fases de:
- (a)
- fermentación de un medio que contiene una fuente de xilosa con una célula huésped transformada tal y como se define en las reivindicaciones 10 o 11, donde la célula huésped fermenta xilosa para el producto de fermentación, y opcionalmente,
- (b)
- recuperación del producto de fermentación.
17. Proceso según la reivindicación 16, donde el
medio también contiene una fuente de glucosa.
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