JP6027559B2 - キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用 - Google Patents
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Description
第1のモチーフ:FXXXXKXXXXXXXXHDXD(配列番号2)
(ただし、Xは天然アミノ酸を表す。)
第2のモチーフ:XXXXXXXWGGREGYXXLXNT(配列番号3)
(ただし、Xは天然アミノ酸を表す。)
第3のモチーフ:XXXXXXXXEPKPXEPXXHQYDXD(配列番号4)
(ただし、Xは天然アミノ酸を表す。)
第4のモチーフ:LXXXXXXNXEXNHXXLXXHXXXH(配列番号5)
(ただし、Xは天然アミノ酸を表す。)
第5のモチーフ:XGSXDXNXGXXXXGWDXDXXP(配列番号6)
(ただし、Xは天然アミノ酸を表す。)
第6のモチーフ:GGXNFDXKXRR(配列番号7)
(ただし、Xは天然アミノ酸を表す。)
(2)前記第1のモチーフは、FXXXXKXGXXXXXFHDXD(配列番号8)で表され、
前記第2のモチーフはXXXXXVFWGGREGYXXLLNT(配列番号9)で表され、
前記第3のモチーフは、XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(配列番号10)で表され、
前記第4のモチーフは、LXXXFKXNXEXNHXXLAGHXXXH(配列番号11)で表され、
前記第5のモチーフは、XGSXDXNXGXXXXGWDTDXFP(配列番号12)で表され、
前記第6のモチーフは、GGXNFDXKXRR(配列番号13)で表される、(1)に記載のタンパク質。
(3)前記第1のモチーフは、FEXXXKXGXXXXCFHDXD(配列番号102)(ただし、3位: F or I or L、4位:A or M、5位: E or Q or S or T、7位: L or M、9位: I or V、10位: E or K or P、11位: F or Y、12位: F or Y、17位: A or I or V である。)で表され、
前記第2のモチーフはGXXXYVFWGGREGYXXLLNT(配列番号103)(ただし、2位: A or G、3位: V or K or E、4位: G or N、15位: E or M、16位: S or T
である。)で表され、
前記第3のモチーフは、XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(配列番号10)(ただし、1位: G or N、2位: F or H、3位: K or D or L、4位: G or P、5位: D or T or I
7位: L or Y、13位: K or M、16位: M or T、17位: K or T、22位: F or V
である。)で表され、
前記第4のモチーフは、LXKXFKXNXEXNHAXLAGHTFXH(配列番号104)(ただし、2位: D or Eであり、4位: D or Yであり、7位: L or M or Vであり、9位: I or Lであり、11位: A or T or Vであり、15位: T or Wであり、22位: Q or Eである。)で表され、
前記第5のモチーフは、XGSXDANXGXXXXGWDTDXFP(配列番号105)(ただし、1位: F or L、4位: I or V、8位: Q or R or T、10位: D or N、11位: P or Y
12位: L or N or Q、13位: L or N、19位: E or Qである)で表され、
前記第6のモチーフは、GGXNFDXKXRR(配列番号13)(ただし、3位: I or L or T
7位: A or S、9位: T or Vである)で表される、(1)又は(2)に記載のタンパク質。
(4)前記第6のモチーフにおけるアスパラギン(N)に替えてシステイン、スレオニン、バリン及びアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を有している、(1)〜(3)のいずれかに記載のタンパク質。
(5)前記アスパラギンに替えてスレオニン又はシステインを有している、(1)〜(4)のいずれかに記載のタンパク質。
(6)前記第1のモチーフは、配列番号24で表されるアミノ酸配列と65%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第2のモチーフは、配列番号25で表されるアミノ酸配列と75%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第3のモチーフは、配列番号26で表されるアミノ酸配列と65%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第4のモチーフは、配列番号27で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第5のモチーフは、配列番号28で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第6のモチーフは、配列番号29で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、(1)〜(5)のいずれかに記載のタンパク質。
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNA。
(8)(7)に記載のDNAを含む真核細胞用の形質転換用ベクター。
(9)(7)に記載のDNAを保持する真核細胞。
(10)酵母である、(9)に記載の真核細胞。
(11)前記酵母は、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hancenula、Klocckera、Schwanniomyces、Yarrowia、及びIssatchenkiaからなる群から選択されるいずれかに属する、(10)に記載の真核細胞。
(12)セルラーゼを分泌生産する、(9)〜(11)のいずれかに記載の真核細胞。
(13)エタノール、乳酸、酢酸、1,3−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン、グリセロール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール及びスクアレンからなる群から選択されるいずれかを生産する外因性又は内因性の遺伝子を備えている、(9)〜(11)のいずれかに記載の真核細胞。
(14)キシロース利用性が付与ないし向上された真核細胞の作製方法であって、(7)に記載のDNAを真核細胞に導入して形質転換する工程を備える、作製方法。
(15)有用物質を生産する方法であって、キシロースの存在下、(9)〜(13)のいずれかに記載の真核細胞を培養する工程を備える、生産方法が提供される。
(16)前記有用物質は、エタノール、乳酸、酢酸、1,3−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールからなる群から選択されるいずれかである、(15)記載の生産方法。
本タンパク質は、RsXIの配列番号1で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、以下に示す第1のモチーフ〜第6のモチーフ(配列番号2〜7)のうち1又は2以上を備えることができる。第1のモチーフ〜第6のモチーフは、本タンパク質においてアミノ酸配列のN末端側から順に含まれうる。
MultiAlin:http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html; mkdom/xdom:
http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/xdom/等各種の手法を採用することができる。さらに、マルチプルアラインメントから保存性の高いアミノ酸を抽出することができる。このような手法も当業者において公知である。例えば、Weblogo3.3(http://weblog.berkeley.esu/)を用いて保存性の高いアミノ酸をロゴ化することができる。図2に示す配列ロゴ解析においては、保存性の高いアミノ酸ほど大きく表示されている。さらに、こうした配列ロゴ解析から、高度保存領域(モチーフ)を規定するモチーフ解析が可能である。
第1のモチーフは、FXXXXKXXXXXXXXHDXD(配列番号2)で表される。第1のモチーフは、18アミノ酸からなり、配列番号1で表されるアミノ酸配列の88位〜105位に相当している。このモチーフにおいては、第15位(H)及び第18位(D)のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている(Hu, H., H. Liu, and Y. Shi. 1997. The reaction pathway of the isomerization of D-xylose catalyzed by the enzyme D-xylose isomerase: a theoretical study. Proteins 27:545-55.)。
2位: D or E
3位: F or I or L or M
4位: A or C or F or I or L or M or Y
5位: D or E or H or N or Q or S or T
7位: L or M
8位: D or G or N or S
9位: A or I or L or T or V
10位: D or E or G or K or P
11位: F or H or Y
12位: F or L or W or Y
13位: A or C or S or T
14位: F or W
17位: A or I or K or R or T or V
2位: D or E
3位: F or I or L
4位:A or M
5位: E or Q or S or T
7位: L or M
9位: I or V
10位: E or G or K or P
11位: F or H or Y
12位: F or W or Y
13位: C or T
17位: A or I or K or R or V
3位: F or I or L
4位:A or M
5位: E or Q or S or T
7位: L or M
9位: I or V
10位: E or K or P
11位: F or Y
12位: F or Y
17位: A or I or V
第2のモチーフは、XXXXXXXWGGREGYXXLXNT(配列番号3)で表される。第2のモチーフは、20アミノ酸からなり、配列番号1で表されるRsXIのアミノ酸配列の182位〜201に相当している。
1位: D or G or K or N
2位: A or G or S
3位: A or E or K or Q or S or T or V
4位: G or N
5位: F or Y
6位: V or T
7位: F or L
15位: A or D or E or H or M
16位: C or N or S or T
18位: H or L or W
1位: G or N
2位: A or G
3位: V or K or E or T
4位: G or N
5位: F or Y
15位: E or M or H
16位: S or T
2位: A or G
3位: V or K or E
4位: G or N
15位: E or M
16位: S or T
第3のモチーフは、XXXXXXXXEPKPXEPXXHQYDXD(配列番号4)で表される。第3のモチーフは、23アミノ酸からなり、配列番号1で表されるRsXIのアミノ酸配列の225位〜247位に相当している。このモチーフにおいては、第9位(E)及び第11位(K)のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている。
1位: G or N
2位: F or H or Y
3位: D or E or K or L or N or Q or R or T
4位: G or P
5位: A or D or I or N or Q or T
6位: F or L or M
7位: F or L or Y
8位: I or L
13位: K or M or Q
16位: M or S or T
17位: K or S or T
22位: F or T or V or Y
1位: G or N
2位: F or H
3位: K or D or T or E or L
4位: G or P
5位: D or Q or T or I
7位: F or L or Y
13位: K or M
16位: M or S or T
17位: K or T
22位: F or V or Y
1位: G or N
2位: F or H
3位: K or D or L
4位: G or P
5位: D or T or I
7位: L or Y
13位: K or M
16位: M or T
17位: K or T
22位: F or V
第4のモチーフは、LXXXXXXNXEXNHXXLXXHXXXH(配列番号5)で表される。第3のモチーフは、23アミノ酸からなり、配列番号1で表されるRsXIのアミノ酸配列の260位〜282位に相当している。このモチーフにおいては、第10位(E)及び第13位(H)のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている。
2位: D or E or K or L or N or Q
3位: D or E or G or K or N or P or Q
4位: D or E or H or Y
5位: F or I or V
6位: K or R
7位: F or I or L or M or V
9位: I or L
11位: A or G or P or T or V
14位: A or T
15位: N or T or W
17位: A or S
18位: F or G or Q
20位: C or D or S or T
21位: F or H or M or Y
22位: D or E or H or M or Q
2位: D or E or N
3位: K or Q
4位: D or Y
7位: I or L or M or V
9位: I or L
11位: A or P or T or V
14位: A or T
15位: T or W
20位: C or T
21位: F or H
22位: Q or E
2位: D or E
4位: D or Y
7位: L or M or V
9位: I or L
11位: A or T or V
15位: T or W
22位: Q or E
第5のモチーフは、XGSXDXNXGXXXXGWDXDXXP(配列番号6)で表される。第5のモチーフは、21アミノ酸からなり、配列番号1で表されるRsXIのアミノ酸配列の293位〜303位に相当している。このモチーフにおいては、第5位(D)、第16位(D)及び第18位(D)のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている。
1位: F or L
4位: I or L or V
6位: A or S
8位: M or Q or R or T
10位: D or H or N or S
11位: A or K or L or M or P or T or V or Y
12位: L or N or Q or D
13位: I or L or N
17位: I or T
19位: E or Q
20位: F or Y
1位: F or L
4位: I or V
6位: A or S
8位: Q or R or T
10位: D or N or S
11位: L or M or P or Y
12位: D or L or N or Q
13位: L or N
19位: E or Q
1位: F or L
4位: I or V
8位: Q or R or T
10位: D or N
11位: P or Y
12位: L or N or Q
13位: L or N
19位: E or Q
第6のモチーフは、GGXNFDXKXRR(配列番号7)で表される。第6のモチーフは、11アミノ酸からなり、配列番号1で表されるRsXIのアミノ酸配列の335位〜345位に相当している。このモチーフにおいては、第6位(D)のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている。
3位: F or I or L or M or T or V
7位: A or C or S or T
9位: I or L or P or T or V
3位: F or I or L or T
7位: A or C or S
9位: T or V
3位: I or L or T
7位: A or S
9位: T or V
本DNAは、本タンパク質をコードする塩基配列を有するDNAである。本DNAは、本タンパク質をコードするDNAを、合成的に取得するほか、既に説明したように、部位特異的変異導入法や、ハイブリダイゼーション技術やPCR等により取得できる。
本明細書に開示される形質転換用ベクターは、本DNAを適切なプロモーターの下流に当該プロモーターにより作動可能に保持されている。プロモーターとしては、後述する真核細胞等において機能する各種プロモーターほか、GALプロモーター等の誘導的プロモーターが挙げられる。このほか、形質転換用の組換えベクターは、ターミネーター、エンハンサー、複製開始点(ori)、マーカー等を備えることができ、これらの要素が必要に応じ適宜選択される。また、組換えベクターが、遺伝子置換等、染色体への所望のDNA断片の組み込みを意図する場合は、染色体上の所定の領域との相同領域を有している。本ベクターは、商業的に入手可能な酵母発現ベクター等を適宜選択して利用することで構築できる。
本明細書に開示される真核細胞は、本DNAを含む真核細胞である。本真核細胞は、典型的には、本ベクターにより形質転換された形質転換真核細胞である。本DNAは、宿主細胞の染色体外において保持されていてもよいが、好ましくは染色体上に保持されている。また、高いキシロース資化能力を発揮するために、例えば、複数コピー保持されていることが好ましい。
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、キシロースの存在下、本真核細胞を培養する工程を備えることができる。本生産方法によると、本真核細胞はキシロース資化能力が向上しているため、炭素源としてキシロースを含んでいれば、それを有効利用して、有用物質に変換することができる。したがって、キシロースを含有するリグノセルロースの糖化物を培地に含む場合であっても、こうしたバイオマス炭素源を有効利用して、有用物質に変換できる。リグノセルロースの透過物には、キシロースほか、グルコースを含んでいてもよく、さらにヘミセルロースの分解物を含んでいてもよい。
本明細書によれば、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質のスクリーニング方法も提供される。本スクリーニング方法は、配列番号1で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、既に説明した第1〜第6のモチーフをN末端側に近い側からのこの順序で有し、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質の前記第6のモチーフのアミノ酸配列におけるアスパラギン(N)に変えて他のアミノ酸を有する改変体タンパク質のキシロースイソメラーゼ活性を測定する工程、を備えることができる。この方法によれば、キシロースイソメラーゼ活性に関し改善された改変体タンパク質を取得できる。特に、酵母において発現させるのに有効な改変タンパク質を得ることができる。置換すべき他のアミノ酸としては、各種の天然アミノ酸が挙げられ、なかでも、システイン、スレオニン、バリン及びアラニンを適用することができ、特には、システイン、スレオニンが挙げられる。また、第1〜第6のモチーフについても、既に説明した好ましい態様を適用することができる。
本明細書によれば、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法も提供される。本製造方法は、配列番号1で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、既に説明した第1〜第6のモチーフをN末端側に近い側からのこの順序で有し、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質の前記第6のモチーフのアミノ酸配列におけるアスパラギン(N)に変えて他のアミノ酸を有する改変体タンパク質であってキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程、を備えることができる。この方法によれば、キシロースイソメラーゼ活性を有する改変体タンパク質を容易に製造できる。他のアミノ酸、元タンパク質、モチーフの各種態様については、既述のスクリーニング方法同様、既に本明細書において説明した各種態様を適用することができる。
SD液体培地:6.7g/l Yeast Nitorogen Base without amino acid、20g/l D−Glucose
SD寒天培地:6.7g/l Yeast Nitorogen Base without amino acid、20g/l D−Glucose、20g/l Agar
SX液体培地:6.7g/l Yeast Nitorogen Base without amino acid、20g/l D−Xylose
SX寒天培地:6.7g/l Yeast Nitorogen Base without amino acid、20g/l D−Xylose、20g/l Agar
SX液体培地50:6.7g/l Yeast Nitorogen Base without amino acid、50g/l D−Xylose
酵母コドンに最適化してヤマトシロアリ(Reticulitermes speratus)腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子RsXI−C1−opt(GenBank:HV438143)が挿入されたpRS436GAP−RsXIC1−Oを鋳型にGeneMorphII(Stratagene)を用いてエラープローンPCRを行った。反応は、95℃で2分の後、95℃で1分、60℃で1分、72℃で1分30秒を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で10分とした。なお、使用したプライマーの配列は以下の通りであった。
pRSSacII−AAA−ATG−F4:5’-GAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAACCGCGGAAAATG-3’(配列番号41)
pRSXhoI−TAA−R3:5'-GTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCGAGTTA-3'(配列番号42)
低コピー型の遺伝子導入用ベクターpRS316GAPを作製した。pRS436GAP(DDBJアクセッション番号:AB304862)を鋳型に、プライマーTDH3p−CYC1t−IF−F及びRを用いて、PCRを行った。PCRは、PrimeSTAR HS DNA ポリメラーゼ(タカラバイオ)を用い、98℃で10秒、55℃で15秒、72℃で1分30秒を1サイクルとして30サイクル実施した。使用したプライマーの配列は以下の通りであった。
TDH3p−CYC1t−IF−F:5'-TCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC -3'
(配列番号43)
TDH3p−CYC1t−IF−R:5'-GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC -3'(配列番号44)
エラープローンPCRにより得られたDNA断片と、pRS436−GAP−RsXIC1−Oを鋳型に、プライマーpRSSacII−AAA−ATG−F4及びpRsXhoI−TAA−R3、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR HS DNA ポリメラーゼを用いたPCRで得られたDNA断片(コントロール)と、制限酵素SacIIとXhoIで消化したpRS316GAPとそれぞれ混合し、Frozen−EZ Yeast Transformation II(Zymo Research)を用いて、酵母Saccharomyces cerevisiaeW600W株(特開2011−147445号公報参照)に導入して、SD液体培地5mlで培養した。
2日間培養した実施例3のSD培養液をSX液体培地5mlに添加し、バイオフォトレコーダーTVS062CA(アドバンテック)を用いて30℃、70rpmで培養した。培養開始7日目の培養液から菌体を回収し、新しいSX液体培地5mlに、初期培養液濃度がOD(600nm)が0.1となるように菌体を添加した。バイオフォトレコーダーを利用して30℃で70rpmで7日間培後、培養液から菌体を回収してSX寒天培地に塗布し、30℃で培養した。RsXI−C1−optのDNA断片を導入した酵母よりも早く生育してきたコロニーを選抜し、SD寒天培地に画線培養してコロニーを純化し、選抜株とした。
実施例4の増殖試験で比増殖速度が高かった上位10株及びRsXI−C1−optを導入した株について、Yeast Plasmid Minipreparationキット、Zymoprep(Zymo research)を用いてプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドのRsXI−C1−opt遺伝子領域を解析した結果、5種類の変異配列を確認した。変異XI遺伝子をそれぞれ、RsXIC1O−T76I、RsXIC1O−E125G、RsXIC1O−I286F、RsXIC1O−N337T及びRsXIC1O−K384Eと命名し、各遺伝子の酵母導入ベクターをpRS316GAP−RsXlC1O−T76I、pRS316GAP−RsXIC1O−E125G、pRS316GAP−RsXIC1O−I286F、pRS316GAP−RsXIC1O−N337T、pRS316GAP−RsXIC10−K384Eと命名した。また、野生型であるRsXl−C1−optの酵母導入用プラスミドをpRS316GAP−RsXIC1Oと命名した。
実施例5で作製したプラスミドを、実施例3と同様にしてFrozen−EZ Yeast Transformation II(Zymo Research)を用いて、酵母Saccharomyces cerevisiaeW600W株(特開2011−147445号公報参照)に導入し、SD寒天培地に塗布し、30℃で培養した。生育したコロニーを新たなSD培地で画線培養してコロニーを純化した。純化して得られた選択株の名称と使用したプラスミドを以下に示す。
WR702Gs:pRS316GAP−RsXIC1O−E125G
WR703Fs:pRS316GAP−RsXIC1O−I286F
WR704Ts:pRS316GAP−RsXIC1O−N337T
WR705Es:pRS316GAP−RsXIC10−K384E
WR700s:pRS316GAP−RsXIC1O
実施例6で取得した酵母のキシロース資化能力を評価するため、キシロースを炭素源とした培地での増殖試験を行った。実施例6で作製した5種類の株をSD液体培地で24時間培養し、菌体を回収して滅菌水で施錠後、L字型試験管に調製したSX液体培地に菌体を加え、増殖試験を開始した。増殖試験はバイオフォトレコーダーTVSO62CAを用い、培養条件は30℃、70rpmで、20分間隔で培養液のOD(660nm)を測定した。各株の比増殖速度の比較を図5に示す。
WR700s株及びWR704Ts株を5mlのSD液体培地に接種して24時間培養した。次に50mlのSD液体培地に培養液1mlを加えて24時間培養し、菌体を回収して滅菌水で2回洗浄した。発酵試験にはブチルゴムで密栓したねじ口の耐圧試験管を用いた。発酵培地の最終OD(600nm)が10となるように酵母懸濁液を加えたSX液体培地50を5m1調製し、30℃、180rpmで発酵を行った。任意の時間に発酵液を分取し、液体クロマトグラフィーによりキシロースおよびエタノールの分析を行なった。液体クロマトグラフィーのカラムはHPX−87Hカラム(Bio−RAD)を60℃で使用し、検出器は示差屈折率検出器RID−10A(島津製作所)を用いた。移動相には0.05%硫酸溶液を用い、流速0.8ml/minで送液した。図6に各株の発酵培地中のキシロース濃度、エタノール濃度の経時変化を示す。なお、発酵試験は4回実施し、その平均値を記している。
酵母においてキシロース資化能力の向上効果が確認されたRsXIC10の337番目のアミノ酸(アスパラギン)をターゲットに、アミノ酸点変異ライブラリの作製を行った。実施例5に記載のpRS316GAP−RsXIC1Oを鋳型に、以下の表1に示すプライマー、およびQuick Change Lightning MultiSite−Directed Mutagenesisキット(アジレント・テクノロジー)を用い、キットに付属のプロトコルに従い反応を行った。得られた反応液を用いてECOS Competent E.coliDH5α(ニッポンジーン)の形質転換を行い、生育したコロニーからプラスミドを抽出した。シーケンシングにより変異導入部位を確認し、アスパラギンとトレオニンを除く18種類(アラニン;A、アルギニン;R、アスパラギン酸;D、システイン;C、グルタミン;G、グルタミン酸;E、グリシン;G、ヒスチジン;H、イソロイシン;I、ロイシン;L、リジン;K、メチオニン;M、フェニルアラニン;F、プロリン;P、セリン;S、トリプトファン;W、チロシン;Y、バリン;V)の変異を有する変異XIのそれぞれについて、酵母導入用のプラスミドを、獲得した(表1)。次に、得られたプラスミドをFrozen−EZ Yeast TransformationIIを用いてW600W株に導入し、SD寒天培地に塗布した。生育したコロニーを新たなSD寒天培地に画線培養してコロニーを純化した。得られた遺伝子組換え酵母、変異Xlの酵母への導入に用いたプラスミド及び導入された変異XI遺伝子を表1に示す。
表1で示す18種の組換え酵母、およびWR700s株とWR704Ts株を、1ウェル当たり2ml容量の96ウェルストレージブロック(コーニング)に調製した1mLのSD液体培地に接種し、恒温振とう培養機M・BR−022UP(タイテック)にて30℃、1500rpm、24時間培養した。次に96ウェルストレージブロックに調製した1mlのSD液体培地に培養液200μ1を加えて同様の条件で24時間培養し、菌体を回収して滅菌水で2回洗浄した後、滅菌水で懸濁して酵母懸濁液を調製した。発酵試験は以下の条件で行った。発酵培地の最終OD(600nm)が1となるように酵母懸濁液を加えたSX液体培地を96ウェルストレージブロックに1ml調製した。嫌気的な条件とするため、タイタースティックHC(カジックス)を用いて各ウェルを密閉し、M・BR−022UPにて30℃、1500rpmの条件で発酵を行った。任意の時間に発酵液を分取し、実施例8と同様にして液体クロマトグラフィーによりキシロースおよびエタノールの分析を行なった。図7に発酵72時間目における発酵培地中のキシロース濃度を示す。なお、発酵試験は2回以上実施し、その平均値を記している。
RsXIClOの337番目のアミノ酸に対する変異により得られたキシロース資化能力の向上効果が、他の生物種由来のXIにおいても得られるかについて評価を行った。酵母コドンに最適化されたPiromyces sp.E2由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子及びClostridium phytofermentans由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子(特開2011−147445号公報))を鋳型に、以下の表2に示すプライマーを用いてRsXlの337番目のアミノ酸残基に相当するアスパラギンをスレオニンに置換する変異を導入したDNA断片、PiXIO−N338TおよびCpXIO−N337T(配列番号75及び配列番号76)を合成した。また、コントロールとして変異を導入していないDNA断片、PiXIOおよびCpXIOも同時に合成した。得られたDNA断片を、In−Fusion HD PCRクローニングキット(タカラバイオ)を用いて制限酵素SacII及びXhoIで消化したpRS316GAPに挿入し、遺伝子導入用プラスミドを獲得した。次に、得られたプラスミドをFrozen−EZ Yeast Transformationllを用いてW600W株に導入し、SD寒天培地に塗布した。生育したコロニーを新たなSD寒天培地に画線培養してコロニーを純化した。得られた遺伝子組換え酵母、変異Xlの酵母への導入に用いたプラスミド、および導入された変異XI遺伝子を表2に示す。
表2に示す4種の組換え酵母を、5mlのSD液体培地に接種し、30℃、100rpmで24時間培養した。培養液を新しく調製した5mlのSD液体培地に200μ1を加えて同様の条件で24時間培養し、菌体を回収して滅菌水で2回洗浄した後、滅菌水で懸濁して酵母懸濁液を調製した。発酵試験は以下の条件で行った。発酵培地の最終OD(600nm)が、WP700s株及びWP704Ts株では10、WC700s株及びWC704Ts株では50となるように酵母懸濁液を加えたSX液体培地を96ウェルストレージブロックに1ml調製した。嫌気的な条件とするため、タイタースティックHCを用いて各ウェルを密閉し、30℃、1500rpmの条件で発酵を行った。任意の時間に発酵液を分取し、実施例8と同様にして液体クロマトグラフィーによりキシロースおよびエタノールの分析を行なった。図8に発酵72時間目における発酵培地中のキシロース濃度を示す。なお、発酵試験は2回以上実施し、その平均値を記している。
酵母での活性が報告されているPiromyces sp. E2由来のXI(PiXI)、Clostridium phytofermentans由来のXI(CpXI)、Bacteroides thetaiotaomicron由来のXI(BtXI)、およびLactococcus lactis由来のXI(LlXI)について、RsXIC1Oの337番目のアスパラギンと対応するアミノ酸をアラニン、システイン、スレオニンおよびバリンに置換し、キシロース資化能力の向上効果が得られるか評価を行った。表3に、変異導入に用いた株、プラスミド、遺伝子及びプライマーを示し、表4にプライマー配列を示す。
点変異を導入するための鋳型DNAの調製は以下のように行った。PiXIおよびCpXIについては、実施例11と同様に、酵母での発現用にコドンを適合させたPiromyces sp.E2由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子及びClostridium phytofermentans由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子(特開2011-147445号公報)を鋳型に、表4に示すプライマー(配列番号77、78、79、80)を用いてそれぞれのDNA断片を合成した。得られたDNA断片を、In-Fusion HD PCR Cloning kitを用いて、制限酵素SacIIおよびXhoIで消化したpRS316GAPに挿入してpRS316GAP-PiXIO、pRS316GAP-CpXIOを作製した(表3)。
表3で示す20種の組換え酵母を、96ウェルストレージブロックに調製した1 mLのSD液体培地に接種し、恒温振とう培養機M・BR-022UPにて30℃、1500 rpm、24時間培養した。次に新しい96ウェルストレージブロックに調製した1mlのSD液体培地に培養液200μlを加えて同様の条件で24時間培養し、菌体を回収して滅菌水で2回洗浄した後、滅菌水で懸濁して酵母懸濁液を調製した。
配列番号30〜40:キシロースイソメラーゼ変異体
配列番号41〜70、77〜101:プライマー
配列番号71〜76: キシロースイソメラーゼ変異体
Claims (13)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、以下の第1、第2、第3、第4、第5及び第6のモチーフをN末端側に近い側からのこの順序で有し、かつ前記第6のモチーフのアミノ酸配列におけるアスパラギン(N)に替えて、システイン、スレオニン、バリン及びアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を有する、タンパク質であって、
前記第1のモチーフは、配列番号24で表されるアミノ酸配列と75%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第2のモチーフは、配列番号25で表されるアミノ酸配列と65%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第3のモチーフは、配列番号26で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第4のモチーフは、配列番号27で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第5のモチーフは、配列番号28で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第6のモチーフは、配列番号29で表されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記タンパク質は、
配列番号1で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号14で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号15で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号16で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号17で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号18で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号19で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号20で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号21で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号22で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列及び
配列番号23で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかを有し、
かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質。
第1のモチーフ:FEXXXKXGXXXXCFHDXD(配列番号102)(ただし、3位:F or I or L、4位:A or M、5位:E or Q or S or T、7位:L or M、9位:I or V、10位:E or K or P、11位:F or Y、12位:F or Y、17位:A or I or V である。)
第2のモチーフ:GXXXYVFWGGREGYXXLLNT(配列番号103)(ただし、2位:A or G、3位:V or K or E、4位:G or N、15位:E or M、16位:S or Tである。)
第3のモチーフ:XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(配列番号10)(ただし、1位:G or N、2位:F or H、3位:K or D or L、4位:G or P、5位:D or T or I、7位:L or Y、13位:K or M、16位:M or T、17位:K or T、22位:F or Vである。)
第4のモチーフ:LXKXFKXNXEXNHAXLAGHTFXH(配列番号104)(ただし、2位:D or Eであり、4位:D or Yであり、7位:L or M or Vであり、9位:I or Lであり、11位:A orT or Vであり、15位:T or Wであり、22位:Q or Eである。)
第5のモチーフ:XGSXDANXGXXXXGWDTDXFP(配列番号105)(ただし、1位:F or L、4位:I or V、8位:Q or R or T、10位:D or N、11位:P or Y、12位:L or N or Q、13位:L or N、19位:E or Qである。)
第6のモチーフ:GGXNFDXKXRR(配列番号13)(ただし、3位:I or L or T、7位:A or S、9位:T or Vである。) - 配列番号1で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、前記アミノ酸配列の第337位に相当するアスパラギン(N)に替えて、システイン、スレオニン、バリン及びアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を有し、
配列番号1で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号14で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号15で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号16で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号17で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号18で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号19で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号20で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号21で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号22で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列及び
配列番号23で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかを有し、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記第6のモチーフのアミノ酸配列における前記アスパラギン(N)又は配列番号1で表される前記アミノ酸配列とアラインメントしたとき前記アミノ酸配列の第337位に相当する前記アスパラギン(N)に替えてスレオニン又はシステインを有している、請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質は、Saccharomyces cerevisiaeで発現させたとき、キシロース資化能が、アミノ酸置換されていない野生型タンパク質の120%以上である、請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNA。
- 請求項5に記載のDNAを含む真核細胞用の形質転換用ベクター。
- 請求項5に記載のDNAを保持する真核細胞。
- 酵母である、請求項7に記載の真核細胞。
- 前記酵母は、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hancenula、Klocckera、Schwanniomyces、Yarrowia、及びIssatchenkiaからなる群から選択されるいずれかに属する、請求項8に記載の真核細胞。
- エタノール、乳酸、酢酸、1,3−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン、グリセロール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール及びスクアレンからなる群から選択されるいずれかを生産する外因性又は内因性の遺伝子を備えている、請求項7〜9のいずれかに記載の真核細胞。
- キシロース利用性が付与ないし向上された真核細胞の作製方法であって、請求項5に記載のDNAを真核細胞に導入して形質転換する工程を備える、作製方法。
- 有用物質を生産する方法であって、キシロースの存在下、請求項7〜10のいずれかに記載の真核細胞を培養する工程を備える、生産方法。
- 前記有用物質は、エタノール、乳酸、酢酸、1,3−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールからなる群から選択されるいずれかである、請求項12に記載の生産方法。
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