CN105074001A - 糖化和发酵纤维素材料的方法 - Google Patents

糖化和发酵纤维素材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及糖化一种纤维素材料的方法，这些方法包括在浓度处于0.5％至10％的饱和度范围内的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受一种纤维素分解酶组合物和一种GH61多肽以及任选地一种过氧化氢酶。本发明还涉及使用包括本发明的糖化步骤的方法生产所希望的发酵产物如乙醇的方法。

Description

糖化和发酵纤维素材料的方法
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
背景
纤维素材料提供了用于产生化石燃料的可替代能源的一个有吸引力的平台。将纤维素材料(例如来自木质纤维素原料)转化成生物燃料具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的合意性、以及该生物燃料(例如乙醇)的清洁性。木材、农业残余物、草本作物以及城市固体废物已被认为是用于生物燃料生产的原料。一旦将纤维素材料糖化并转化成可发酵的糖，例如葡萄糖，那么这些可发酵的糖就可以被酵母发酵成生物燃料(如乙醇)。
在过去十年里已经研发了新的且改进的酶和酶组合物并且已经使得预处理的纤维素材料的糖化变得更有效。然而，仍需要改进预处理的纤维素材料的糖化以及用于生产生物燃料的方法。
发明概述
在此描述了将纤维素材料糖化成可发酵的糖的方法。还描述了通过糖化和发酵从纤维素材料(如预处理的纤维素材料)生产发酵产物(如乙醇)的方法。
在一个方面中，本发明涉及糖化一种纤维素材料的方法，这些方法包括在浓度处于0.5％至10％的饱和度范围内的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受一种纤维素分解酶组合物和一种GH61多肽。
在另一个方面中，本发明涉及生产一种发酵产物的方法，这些方法包括：
(a)在浓度处于0.5％-10％的饱和度范围内的溶解氧的存在下使一种纤维素材料经受一种纤维素分解酶组合物和一种GH61多肽；
(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料；并且
(c)从(b)中回收发酵产物。
在另一个方面中，本发明涉及生产一种发酵产物的方法，这些方法包括：
(a)在浓度处于0.5％-10％的饱和度范围内的溶解氧的存在下使一种纤维素材料经受一种纤维素分解酶组合物、一种GH61多肽和一种过氧化氢酶；
(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料；并且
(c)从(b)中回收发酵产物。
在一个实施例中，纤维素材料已经例如通过化学和/或物理预处理(如稀酸和/或蒸汽***预处理)而被预处理。在一个优选实施例中，纤维素材料是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwPCS)。
使用本发明的方法将预处理的纤维素材料糖化/水解成糖。可以将这些糖转化为许多有用的所希望的物质，例如燃料、可饮用乙醇和/或发酵产品(例如，酸、醇、酮、气体等)。
糖化的预处理的纤维素材料可以是以下糖，这些糖可以用在用于生产糖浆(例如，高果糖玉米糖浆(HFCS))和/或塑料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯)、聚乳酸(例如，用于生产PET)的工艺中。
附图简要说明
图1示出了使用具有和不具有金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(GH61多肽A)的纤维素分解酶组合物糖化5天后溶解氧(DO)对葡萄糖产率(g/L)的影响。
图2示出了使用具有埃默森青霉GH61多肽(GH61多肽B)的纤维素分解酶组合物糖化5天后溶解氧(DO)对葡萄糖产率(g/L)的影响。
定义
α-L-***呋喃糖苷酶：术语“α-L-***呋喃糖苷酶”意指一种α-L-***呋喃糖苷***呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化α-L-***糖苷中的末端非还原性α-L-***呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-***呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-***聚糖、***糖基木聚糖、以及***半乳聚糖起作用。α-L-***呋喃糖苷酶还被称为***糖苷酶、α-***糖苷酶、α-L-***糖苷酶、α-***呋喃糖苷酶、多糖α-L-***呋喃糖苷酶、α-L-***呋喃糖苷水解酶、L-***糖苷酶、或α-L-***聚糖酶。出于本发明的目的，使用每ml的100mM乙酸钠(pH5)中5mg的中等粘度小麦***糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(MegazymeInternationalIreland,Ltd.)，爱尔兰威克洛郡布瑞公司(Bray,Co.Wicklow,Ireland)以总体积200微升在40℃下持续30分钟，接着通过HPX-87H柱色谱(伯乐实验室有限公司(Bio-RadLaboratories,Inc.)，赫拉克勒斯，加州，美国)进行***糖分析来测定α-L-***呋喃糖苷酶活性。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”是指催化α-D-葡萄糖苷酸水解成为D-葡萄糖醛酸酯和醇的一种α-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶(EC3.2.1.139)。出于本发明的目的，根据德弗里斯(deVries)，1998，细菌学杂志(J.Bacteriol.)180:243-249来测定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于在pH5、40℃的条件下每分钟能够释放1微摩尔葡萄糖醛酸或4-O-甲基葡萄糖醛酸的酶量。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据文丘里(Venturi)等人，2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性(Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties)，基础微生物学杂志(J.BasicMicrobiol.)42:55-66描述的基本程序确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH4.8下，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指一种β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-木寡糖的外水解，以从非还原性末端去除连续的D-木糖残基。可以在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中，在pH5、40℃下，使用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物测定β-木糖苷酶活性。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH5下，在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
生物质材料：术语“生物质材料”是指任何含糖生物质(例如，植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树叶、树枝和树木)及其任何组分(如纤维素、半纤维素或木脂素)。应理解的是，除非另外说明，否则生物质材料包括未处理的、预处理的和水解的或部分水解的形式(例如，生物质降解产物，如寡糖)。
过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”意指一种过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(E.C.1.11.1.6或E.C.1.11.1.21)，其催化将两个过氧化氢转化为氧和两个水。可以基于以下反应通过在240nm下监测过氧化氢的降解而测定过氧化氢酶活性：
2H2O2→2H2O+O2
在25℃下，在具有10.3mM底物(H2O2)和大约100个单位的酶/ml的50mM磷酸盐(pH7)中进行该反应。用分光光度计监测16-24秒内的吸光度，这应该对应于从0.45至0.4的吸光度降低。可以将一个过氧化氢酶活性单位表示为在pH7.0和25℃下每分钟降解一微摩尔的H2O2。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997，结晶纤维素降解：对纤维二糖水解酶的功能的新认识(Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases)，生物技术趋势(TrendsinBiotechnology)15:160-167；泰里等人，1998，里氏木霉纤维二糖水解酶：对结晶纤维素为何如此有效？(Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose？)，生物化学学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)26:173-178)。根据里弗(Lever)等人，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279；范·帝伯赫(vanTilbeurgh)等人，1982，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLetters)，149:152-156；范·帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，汤美等人的方法可以用于测定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶组合物：术语“纤维素分解酶组合物”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，2006，纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略(Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies)，生物技术进展(BiotechnologyAdvances)24:452-481中所综述的。通常使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼№1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(高斯(Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量(Measurementofcellulaseactivities)，纯粹与应用化学(PureAppl.Chem.)59:257-68)确立的。
出于本发明的目的，可以通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比，由一种或多种纤维素分解酶对纤维素材料的水解/糖化的增加来测定纤维素分解酶活性：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于PCS中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(例如50℃、55℃、60℃或65℃)下持续3-7天。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠(pH5)，1mMMnSO4，50℃、55℃、60℃或65℃，72小时，通过HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加州，美国)进行糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料”是指包含纤维素(β-(1-4)-D-葡聚糖(包含β(1-4)连接的D-葡萄糖单元的聚合物)的一种化学上均质的寡糖或多糖)的任何生物质材料。尽管纤维素一般为多态的，但可发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树叶、树枝和树木中。纤维素材料可以是，但不限于：草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸、以及纸浆和造纸厂残余物(参见，例如，维色洛戈尔(Wiselogel)等人，1995，于生物乙醇手册(HandbookonBioethanol)(查尔斯·E·怀曼(CharlesE.Wyman)编辑)，第105-118页，泰勒弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(WashingtonD.C.)；怀曼(Wyman)，1994，生物资源技术(BioresourceTechnology)50:3-16；林德(Lynd)，1990，应用生物化学与生物技术(AppliedBiochemistryandBiotechnology)24/25:695-719；莫思尔(Mosier)等人，1999，木质纤维素的生物转化的最近进展(RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics)，生物化学工程/生物技术的进展(AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)，T·谢伯(T.Scheper)主编，第65卷，第23-40页，纽约斯普林格出版社(Springer-Verlag,NewYork)。纤维素材料包括任何形式的纤维素，例如降解或水解为寡糖的多糖。在此应理解的是，纤维素可以是呈以下形式：木质纤维素的一个组分、包括木质素的植物细胞壁材料、纤维素、以及混合基质中的半纤维素。
在一个方面中，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面中，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面中，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。在另一个方面中，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面中，纤维素材料是废纸。在另一个方面中，纤维素材料是纸浆和造纸厂废弃物。
在另一个方面中，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面中，纤维素材料是小麦秸秆。在另一个方面中，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面中，纤维素材料是玉米芯。在另一个方面中，纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面中，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面中，纤维素材料是稻秸。在另一个方面中，纤维素材料是芒草。在另一个方面中，纤维素材料是芦竹。在另一个方面中，纤维素材料是竹子。在另一个方面中，纤维素材料是橘皮。在另一个方面中，纤维素材料是杨树。在另一个方面中，纤维素材料是松树。在另一个方面中，纤维素材料是白杨。在另一个方面中，纤维素材料是冷杉。在另一个方面中，纤维素材料是云杉。在另一个方面中，纤维素材料是柳树。在另一个方面中，纤维素材料是桉树。
在另一个方面中，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是海藻纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是棉短绒。在另一个方面中，纤维素材料是无定形磷酸处理的纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是滤纸。
在另一个方面中，纤维素材料是一种水生生物质(aquaticbiomass)。如在此所用的，术语“水生生物质”是指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。该水生生物质可以是藻类、沉水植物、挺水植物、以及浮叶植物。
该纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法经受预处理(预处理的纤维素材料)，如在此所描述。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。
溶解氧饱和度：在标准氧分压(0.21个大气压)下测定氧的饱和度。标准氧分压下的饱和度取决于温度和溶质浓度。在一个水解过程中的温度是50℃的实施例中，取决于溶质浓度，饱和度典型地应处于5-5.5mg氧/kg浆料的范围内。因此，溶解氧在50℃左右的温度下以从0.025ppm至0.55ppm，如例如0.05ppm至0.165ppm的范围存在。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”是指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，它催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合的β-1,3葡聚糖(例如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖)中的β-1,4键，以及含有纤维素组分的其他植物材料的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(BiotechnologyAdvances)24:452-481)。出于本发明的目的，根据高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(PureandAppl.Chem.)59:257-268的程序，在pH5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物测定内切葡聚糖酶活性。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61多肽”意指根据亨利萨特(Henrissat)，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；和亨利萨特和贝洛赫(Bairoch)，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。现在GH61多肽被归类为溶解性多糖单加氧酶(lyticpolysaccharidemonooxygenase)(昆兰(Quinlan)等人，2011，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)208:15079-15084；菲利普斯(Phillips)等人，2011，ACS化学生物学(ACSChem.Biol.)6:1399-1406；林(Lin)等人，2012，结构(Structure)20:1051-1061)并放入一个认定为“辅助活性(AuxiliaryActivity)9”或“AA9”的新家族。
GH61多肽通过具有纤维素分解活性的酶增强纤维素材料的水解/糖化。出于本发明的目的，纤维素分解增强活性通过测量来自由纤维素分解酶在以下条件下水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定：1-50mg总蛋白质/g于PCS中的纤维素，其中总蛋白质由50％-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白以及0.5％-50％w/wGH61多肽的蛋白质构成，在合适的温度(例如，50℃、55℃或60℃)下持续1-7天，与用相等的总蛋白质负载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g于PCS中的纤维素)的对照水解相比较。在一个优选方面中，使用在总蛋白质重量的2％-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或总蛋白质重量的2％-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO02/095014中所描述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下1.5L(诺维信公司(NovozymesA/S)，巴格斯瓦尔德(Bagsvaerd)，丹麦)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍、更优选至少1.05倍、更优选至少1.10倍、更优选至少1.25倍、更优选至少1.5倍、更优选至少2倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、甚至更优选至少10倍、以及最优选至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解/糖化。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为***糖)的水解，以产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(feruloylesterase)也被称为阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。出于本发明的目的，在50mM乙酸钠(pH5.0)中使用0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物来确定阿魏酸酯酶活性。一个单位的阿魏酸酯酶等于，在pH5，25℃，每分钟能够释放1微摩尔的对硝基酚根阴离子的酶的量。
半纤维素：如此处使用的，术语“半纤维素”是指生物质材料除了纤维素之外的一种寡糖或多糖。半纤维素在化学上是异质的并包括通过氢键结合到该植物细胞壁中的纤维素微纤维的呈复杂的异质的枝状和线性多糖或寡糖的多种聚合的糖，主要是D-戊糖，例如木聚糖、木葡聚糖、***木聚糖、以及甘露聚糖，并且其中木糖通常呈最大量。半纤维素可共价地附接到木质素，并通常氢键合到纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质，形成高度复杂结构。半纤维素材料包括任何形式的半纤维素，例如降解或水解为寡糖的多糖。在此应理解的是，半纤维素可以是呈以下形式：木质纤维素的一个组分、包括木质素的植物细胞壁材料、纤维素、以及混合基质中的半纤维素。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(若干种)酶。参见例如沙勒姆(Shallom)和肖汉姆(Shoham)，2003，微生物半纤维素酶(Microbialhemicellulases).微生物学当前观点(CurrentOpinionInMicrobiology)6(3):219-228。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以通过数字进行标记而被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-ActiveEnzymes)(CAZy)数据库中获得。可以根据高斯和比萨拉(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752测量半纤维素分解酶活性。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝，或比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液中。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指呈其在翻译以及任何翻译后修饰之后的最终形式的多肽，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。该成熟多肽可使用SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(ProteinEngineering)10:1-6)预测。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在此处被定义为编码具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。该成熟多肽编码序列可使用SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，见上文)预测。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或者以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
多肽片段：术语“片段”意指从一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的一种多肽。在一个方面中，片段含有参比成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基。
严格条件：对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，非常低至非常高严格条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA中，以及对于非常低和低严谨度在25％甲酰胺中，对于中和中-高严谨度在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严谨度在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS在45℃下(非常低严谨度)、在50℃下(低严谨度)、在55℃下(中严谨度)、在60℃下(中-高严谨度)、在65℃下(高严谨度)以及在70℃下(非常高严谨度)洗涤三次，每次15分钟。
对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针而言，严格条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算法所计算的Tm之下大约5℃至大约10℃，在每毫升0.9MNaCl、0.09MTrisHClpH7.6、6mMEDTA、0.5％NP40、1X登哈特(Denhardt)溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mMATP和0.2mg酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后，将载体材料在所计算的Tm之下5℃至10℃，在6XSCC加0.1％SDS中洗涤1次(持续15分钟)并且使用6XSSC洗涤2次，每次15分钟。
亲本酶：术语“亲本”意指对其作出改变以产生变体的酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。
预处理的玉米秸杆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过预处理(例如，通过加热和稀硫酸预处理、碱预处理或中性预处理)源自玉米秸秆的纤维素材料。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有生物活性的一个片段。
变体：术语“变体”意指在一个或多个位置包含改变(即，一个或多个(例如，若干个)氨基酸残基的取代、***和/或缺失)的几丁质结合蛋白。取代是指用不同的氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；删除是指除去占据一个位置的氨基酸；并且***是指添加与占据一个位置的氨基酸相邻的氨基酸。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总木聚糖分解活性，和(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、***呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。在若干出版物中对木聚糖分解酶的测定的最近进展进行了总结，包括：别雷(Biely)和普查德(Puchard)，木聚糖分解酶的测定的测定的最新进展(Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes)，2006，食品与农业科学杂志(JournaloftheScienceofFoodandAgriculture)86(11):1636-1647；斯潘妮科娃(Spanikova)和别雷，2006，葡糖醛酸酯酶-由裂褶菌生成的新型碳水化合物酯酶(Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune)，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLetters)580(19):4597-4601；赫尔曼(Herrmann)等人，1997，里氏木霉的β-D-木糖苷酶是一种多功能β-D-木聚糖木糖水解酶(Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase)，生物化学杂志(BiochemicalJournal)321:375-381。
总木聚糖降解活性可以通过测定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦(oatspelt)木聚糖、山毛榉木木聚糖、以及落叶松木木聚糖)形成的还原糖，或通过光度法测定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定是基于从多聚4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖生成还原糖，如在贝利(Bailey)等人，1992，“(Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity)木聚糖酶活性的实验室比对检测方法”，生物技术杂志(JournalofBiotechnology)23(3):257-270中所述的。木聚糖酶活性还可以在37℃下在0.01％X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中用0.2％AZCL-***糖基木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶定义为在200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中，在37℃、pH6下，从作为底物的0.2％AZCL-***糖基木聚糖中每分钟生成1.0微摩尔天青精。
出于本发明的目的，木聚糖降解活性通过测量由木聚糖降解酶在以下典型条件下造成的桦木木聚糖(西格玛化学有限公司(SigmaChemicalCo.,Inc.)，圣路易斯，密苏里州，美国)水解的增加来测定：1ml反应、5mg/ml底物(总固体)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物、50mM乙酸钠(pH5)、50℃、24小时，如里弗(Lever)，1972，用于碳水化合物的比色测定的新反应(Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates)，分析生物化学(Anal.Biochem)47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。出于本发明的目的，在37℃下，在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH6)中用0.2％AZCL-***糖基木聚糖作为底物来测定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶定义为在200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中，在37℃、pH6下，从作为底物的0.2％AZCL-***糖基木聚糖中每分钟生成1.0微摩尔天青精。
在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。
如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式“一种/个”、“或”以及“该”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的本发明的这些方面包括“由方面组成”和/或“基本由方面组成”。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
详细说明
本发明尤其涉及将纤维素材料糖化成糖(如可发酵的糖)和将这些糖转化为所希望的产品的方法。
可以将可发酵的糖转化为许多有用的所希望的物质，例如燃料、可饮用乙醇和/或发酵产品(例如，酸、醇、酮、气体等)。
糖化的预处理的纤维素材料还可以是以下糖，这些糖可以用在用于生产糖浆(例如，高果糖玉米糖浆(HFCS))和/或塑料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯)、聚乳酸(例如，用于生产PET)的工艺中。
诸位发明人已经出人意料地发现当使用纤维素分解酶组合物和GH61多肽时，在酶糖化过程中存在0.5％-10％饱和度范围内的溶解氧(DO)使葡萄糖产率强劲增加。诸位发明人发现对于不具有GH61多肽的纤维素分解酶组合物，溶解氧(DO)对可发酵的糖产率有很少或没有影响(参见实例1)。然而，对于具有GH61多肽的纤维素分解酶组合物，溶解氧(DO)浓度对可发酵的糖的最终产率具有强烈影响，其中最适DO浓度在1％-2％左右饱和度范围内(参见实例1和2)。
糖化纤维素材料的方法
在一个方面中，本发明涉及糖化一种纤维素材料的方法，这些方法包括在浓度处于0.5％至10％的溶解氧饱和度范围内的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受一种纤维素分解酶组合物和一种GH61多肽。
在另一个方面中，本发明涉及糖化一种纤维素材料的方法，这些方法包括在浓度处于0.5％至10％的饱和度范围内的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受一种纤维素分解酶组合物、一种GH61多肽和一种过氧化氢酶。
在糖化步骤(亦称为水解)中，处理该纤维素材料(例如，预处理的纤维素材料)，以将纤维素和/或半纤维素分解为可发酵的糖，如***糖、纤维二糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、木酮糖和/或可溶性寡糖。通过一种纤维素分解酶组合物和一种GH61多肽酶促地进行糖化。这些组合物的酶可以同时或依次添加。例如，该GH61多肽可以被包含在该纤维素分解酶组合物中。
优选地，在可以由本领域的普通技术人员容易确定的条件下并且在如在此定义的溶解氧的存在下在适合的水性环境中进行酶糖化。在一个方面中，在适于一种或多种酶的活性，即对于该一种或多种酶而言最佳的条件下进行糖化。糖化可以作为补料分批过程或连续过程进行，其中将例如预处理的纤维素材料(底物)逐渐进料至例如含酶的糖化溶液中。
根据本发明，可以有利地在受控的pH、温度和氧以及混合条件下在搅拌釜反应器、容器、槽或发酵罐中进行糖化。在一个实施例中，反应器、容器、槽或发酵罐包括超过10m3，如超过25m3，如超过50m3纤维素材料。
糖化可以进行长达200小时，例如，约12至约96小时、约16至约72小时或约24至约48小时，如持续至少12小时，例如，至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时或至少72小时。
在一个实施例中，在约25℃至约75℃范围内的温度下进行糖化，例如，约30℃至约70℃、约35℃至约65℃、约40℃至60℃、约45℃至55℃或约50℃。
在一个实施例中，在约3.0至约7.0范围内的pH下进行糖化，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。在一个实施例中，本发明的方法进一步包括向槽中添加碱，以将pH维持在约3.0至约7.0范围内，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。可以使用任何碱，包括但不限于KOH、NaOH、Ca(OH)2以及NH4OH或其组合。在一个实施例中，以25-2,500mmol碱/kg干纤维素材料的量添加碱，如25-1000mmol/kg、25-500mmol/kg、25-250mmol/kg、50-200mmol/kg。诸位发明人已经确定，与用纤维素分解组合物和GH61多肽但不存在过氧化氢酶的相同工艺相比，在过氧化氢酶的存在下用该纤维素分解组合物和该GH61多肽糖化纤维素材料过程中需要较少的碱来维持pH。因此，本发明的涉及过氧化氢酶的方法成本更低并且产生更少的处于盐形式的废物。另外，由于源于添加的碱的盐的含量较低，本发明的方法使得用完的生物质更容易地再循环回田里。在一个实施例中，糖化过程中添加的碱的量被减少至少1％，例如，至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
糖化过程中的干固体含量(例如，纤维素材料中的总固体)典型地低于约30wt.％、25wt.％、20wt.％、15wt.％、10wt.％、7.5wt.％、5wt.％、2.5wt.％、2wt.％、1wt.％或0.5wt.％，如在5wt.％与30wt.％之间，如在10wt.％与25wt.％之间。
在本发明的一个实施例中，糖化过程中的溶解氧浓度处于约0.5％-10％饱和度范围内，如0.5％-5％、如0.5％-4％、如0.5％-3％、如0.5％-2％、如1％-5％、如1％-4％、如1％-3％、如1％-2％。在一个优选实施例中，在糖化期的至少25％，如至少50％、如至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在约0.5％-10％饱和度范围内，如0.5％-5％、如0.5％-4％、如0.5％-3％、如0.5％-2％、如1％-5％、如1％-4％、如1％-3％、如1％-2％。
向容器中添加氧，以在糖化过程中达到所希望的溶解氧浓度。可以通过经由扩散器或喷雾器添加压缩空气或通过其他已知的通气方法给容器、槽等通气而将溶解氧水平维持在所希望的范围内。可以在来自放置于容器/槽中的溶解氧传感器的反馈的基础上控制通气速率或该***可以在没有反馈控制的情况下以恒定速率运行。在水解行列由多个串联的容器/槽组成的情况下，可以在这些容器/槽中的一个或多个或所有容器/槽中实施通气。通氧***是本领域是熟知的。根据本发明，可以使用任何适合的通气***。商业通气***由例如英格兰德比的凯米尼尔公司(Chemineer)设计并且由例如美国密苏里州的保罗·穆勒公司(PaulMuellerCompany)制造。
从纤维素材料生产发酵产物的方法
在另一个方面中，本发明涉及从纤维素材料生产发酵产物的方法，这些方法包括：
(a)在浓度处于0.5％-10％的饱和度范围内的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受一种纤维素分解酶组合物和一种GH61多肽；
(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料；并且
(c)任选地从(b)中回收该发酵产物。
在另一个方面中，本发明涉及从纤维素材料生产发酵产物的方法，这些方法包括：
(a)在浓度处于0.5％-10％的饱和度范围内的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受一种纤维素分解酶组合物、一种GH61多肽和一种过氧化氢酶；
(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料；并且
(c)任选地从(b)中回收该发酵产物。
在发酵过程中，将在糖化过程中产生的糖转化为所希望的产物。可以将可发酵的糖转化为许多有用的所希望的物质，例如燃料、可饮用乙醇和/或发酵产品(例如，酸、醇、酮、气体等)。可以将其他糖用在用于生产糖浆(例如，高果糖玉米糖浆(HFCS))和/或塑料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯)、聚乳酸(例如，用于生产PET)等的工艺中。
糖化和发酵可以分开或同时进行。这包括但不限于：分开水解和发酵(SHF)；同时糖化和发酵(SSF)；同时糖化和共发酵(SSCF)；杂合的水解和发酵(HHF)；分开水解和共发酵(SHCF)；杂合的水解和共发酵(HHCF)；以及直接微生物转化(DMC)。SHF使用分开的步骤以首先将纤维素材料酶促糖化(水解)为可发酵糖，例如，葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖以及戊糖，并且然后将这些可发酵的糖发酵成乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶糖化和糖发酵成例如乙醇被组合在一个步骤中(菲利皮迪斯·G.P.(Philippidis,G.P.)，1996，纤维素生物转化技术(Cellulosebioconversiontechnology)，生物乙醇手册：生产和利用(HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization)，怀曼·C.E(Wyman,C.E.)编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(Washington,DC)，179-212))。SSCF涉及多种糖的共发酵(希恩(Sheehan)和希默尔(Himmel)，1999，酶、能量与环境：美国能源部研究和开发生物乙醇活性的战略性观点(Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol)，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)15:817-827)。HHF涉及一个分开的糖化(水解)步骤，并且另外涉及一个同时糖化和发酵步骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行，即高温酶糖化，接着在发酵菌株能够耐受的更低温度下进行SSF。DMC将全部三个过程(酶生产、水解、和发酵)组合在一个或多个(若干个)步骤中，其中使用了相同的生物体来产生用于转化纤维素材料为可发酵糖并且用于转化可发酵糖为终产物的酶(林德(Lynd)等人，2002，微生物纤维素利用：基本原理和生物技术(Microbialcelluloseutilization:Fundamentalsandbiotechnology)，微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Reviews)66:506-577)。在此应理解的是，本领域中已知的包括预处理、酶水解(糖化)、发酵或其组合的任何方法都可以用于实践本发明的方法。
常规装置可以包括补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超过滤的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流动柱反应器(费尔南达德卡斯蒂约斯柯瑞芝(FernandadeCastilhosCorazza)等人，2003，用于纤维二糖水解的补料分批反应器中的最佳控制(Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis)，技术学报(ActaScientiarum.Technology)25:33-38；古萨科夫(Gusakov)和辛涅特西(Sinitsyn)，1985，纤维素酶水解动力学：1.用于分批反应器过程的数学模型(Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess)，酶与微生物技术(Enz.Microb.Technol.)7:346-352)，研磨反应器(隆(Ryu)和李(Lee)，1983，通过使用研磨生物反应器，生物转化废物纤维素(Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor)，生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng)25:53-65)，或具有电场诱导的有力搅拌的反应器(古萨科夫(Gusakov)等人，1996，使用具有电场诱导的有力搅拌的新颖类型的生物反应器的纤维素酶糖化的增强(Enhancementofenzymaticcellulosesaccharificationusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield)，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)56:141-153)。另外的反应器类型包括：用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层(upflowblanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。
纤维素材料。纤维素材料可以是任何生物质材料。在一个优选实施例中，纤维素材料已经例如通过化学和/或物理预处理(如通过稀酸和/或蒸汽***预处理)而被预处理。适合的预处理的实例可以在下面的“预处理”部分中找到。该纤维素材料可以是预处理的玉米秸杆(PCS)，如稀酸预处理的玉米秸杆。该纤维素材料还可以是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwPCS)。
预处理。预处理的纤维素材料可以是例如通过一种化学预处理、一种物理预处理、或一种化学预处理和一种物理预处理而被预处理的，如以下所述的。在一个方面中，预处理的纤维素材料已通过一种化学预处理被预处理。在另一个方面中，预处理的纤维素材料已通过物理预处理而被预处理。在另一个方面中，预处理的纤维素材料已通过一种化学的预处理和一种物理的预处理而被预处理。在一些方面中，预处理的纤维素材料是预处理的玉米秸杆(PCS)。
可以使用本领域已知的任何适合的预处理工艺来破坏纤维素材料的植物细胞壁组分(钱德拉(Chandra)等人，2007，底物预处理：木质纤维素的有效酶水解的关键？(Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics？)，生物化学工程/生物技术的进展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93；盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2007，用于高效生物乙醇生产的木质纤维素材料的预处理(Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction)，生物化学工程/生物技术的进展108:41-65；亨德里克斯(Hendriks)和季曼(Zeeman)，2009，用以增强木质纤维素生物质的消化性的预处理(Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass)，生物资源技术(BioresourceTechnol.)100:10-18；莫热(Mosier)等人，2005，用于木质纤维素生物质的预处理的有前景技术的特征(Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass)，生物资源技术96:673-686；塔希尔扎德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi)，2008，预处理木质纤维素废弃物以改善乙醇和生物气体产生：综述(Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview)，分子科学国际杂志(Int.J.Mol.Sci.)9:1621-1651；杨(Yang)和怀曼，2008，预处理：释放低成本纤维素乙醇的关键(Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol)，生物燃料、生物产品与生物精炼(BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.)2:26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行颗粒粒度减小、预浸泡、润湿、洗涤或调理。
常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理(伴随或不伴随***)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿***、氨纤维***、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、以及γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。优选在水解前进行预处理。可替代地，可以同时用酶水解进行预处理，以释放可发酵糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身引起纤维素材料到可发酵的糖的某些转化(即使不存在酶)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素、以及纤维素，以使纤维素和其他级分，例如，半纤维素可接近酶。纤维素材料经过或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持在其中持续希望的反应时间。蒸汽预处理可以在140℃-230℃，例如160℃-200℃、或170℃-190℃下执行，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理的停留时间可以是1-15分钟，例如3-12分钟、或4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的***放料组合，这被称为蒸汽***，即，快速闪变至大气压和材料湍流，以通过破碎增加可及的表面积(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，生物资源技术(BioresourceTechnology)855:1-33；盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2002，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:618-628；美国专利申请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纤维素部分地水解成变得更增溶的半纤维素单糖和半纤维素寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。所得的液体主要包含溶解的半纤维素材料(例如半纤维素单糖和半纤维素寡糖)，而余下的固体主要由纤维素材料组成。
经常在蒸汽预处理之前添加一种催化剂(例如H2SO4或SO2)(典型地是0.3至3％w/w)，该催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改进酶水解(巴列斯特罗斯(Ballesteros)等人，2006，应用生物化学与生物技术129-132:496-508；瓦尔加(Varga)等人，2004，应用生物化学与生物技术113-116:509-523；塞斯尼尔(Sassner)等人，2006，酶与微生物技术(EnzymeMicrob.Technol.)39:756-762)。
化学预处理。术语“化学处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。适合的化学预处理方法的实例包括：(例如)稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻***(AFEX)、氨渗滤(APR)、以及有机溶剂预处理。
在稀酸预处理中，纤维素材料与稀酸(典型地是H2SO4)和水混合，以形成浆料，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可以用许多反应器设计来进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，见上文，舍尔(Schell)等人，2004，生物资源技术(BioresourceTechnol.)91:179-188；李(Lee)等人，1999，生物化学工程与生物技术的进展(Biochem.Eng.Biotechnol.)65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻***(AFEX)。
用碳酸钙、氢氧化钠、或氨，在85℃-150℃的低温下进行石灰预处理，并且停留时间为从1小时到几天(怀曼(Wyman)等人，2005，生物资源技术(BioresourceTechnol.)96:1959-1966；莫热(Mosier)等人，2005，生物资源技术96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900以及WO2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂(如过氧化氧或过压氧)的情况下在180℃-200℃下持续5-15分钟进行(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen)，1998，生物资源技术(BioresourceTechnol.)64:139-151；帕罗内(Palonen)等人，2004，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)117:1-17；瓦尔加等人，2004，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)88:567-574；马丁(Martin)等人，2006，化学技术与生物技术杂志(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81:1669-1677)。预处理优选以1％至40％干物质，更优选2％至30％干物质，并且最优选5％至20％干物质进行，并且经常通过添加碱如碳酸钠来增加初始pH。
被称为湿***(湿氧化和蒸汽***的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30％的干物质。在湿***中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化剂(oxidizingagent)。然后通过急骤蒸发至大气压结束预处理(WO2006/03228)。
氨纤维***(AFEX)涉及在如90℃-100℃的中等温度和如17至20巴的高压下，用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟，其中干物质含量可以高达60％(格拉帕里(Gollapalli)等人，2002，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)98:23-35；俊达瓦特(Chundawat)等人，2007，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)96:219-231；阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，应用生物化学与生物技术121:1133-1141；泰莫里(Teymouri)等人，2005，生物资源技术(BioresourceTechnol.)96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质素-碳水化合物复合物被裂解。
有机溶剂预处理通过使用含水乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃下萃取30-60分钟而将纤维素材料脱木质素(潘(Pan)等人，2005，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)90:473-481；潘等人，2006，生物技术与生物工程94:851-861；库拉比(Kurabi)等人，2005，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素被去除。
适合的预处理方法的其他实例由谢尔(Schell)等人，2003，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.andBiotechnol.)105-108:69-85，和马塞尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术(BioresourceTechnology)96:673-686，以及美国专利申请2002/0164730进行描述。
在一个方面中，化学预处理是作为酸处理进行，例如持续稀酸和/或弱酸处理。该酸可以是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物。弱酸处理优选在1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面中，酸浓度处于0.01至20wt.％酸范围内，优选0.05至10wt.％酸，更优选0.1至5wt.％酸，并且最优选0.2至2.0wt.％酸。使酸与生物质材料相接触，并在优选160℃-220℃，并且更优选165℃-195℃范围内的温度下保持从几秒到几分钟，例如1秒至60分钟范围内的时间。
在另一个方面中，预处理是作为氨纤维***步骤(AFEX预处理步骤)进行。
在另一个方面中，预处理在水性浆料中进行。在一个方面，在预处理过程中纤维素材料以优选在10-80wt.％之间，例如20-70wt.％之间或30-60wt.％之间，例如约50wt.％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理或物理预处理。术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒粒度减小的任何预处理。例如，这种预处理可以涉及各种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨、或振动球磨)。
纤维素材料可以物理地(机械地)且化学地预处理。机械或物理预处理可以与以下相结合：蒸汽/蒸汽***、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波福射)或其组合。在一个方面中，高压意指在优选约100至约400psi，更优选约150至约250psi范围中的压力。在另一个方面中，高温意指在约100℃至约300℃，优选约140℃至约200℃范围内的温度。在一个优选方面中，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸***水解器***，例如从顺智公司(SundsDefibratorAB)，瑞典可获得的顺智水解器(SundsHydrolyzer)来进行，该***使用如上所定义的高压和高温。这些物理预处理和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。
因此，在一个优选方面中，使纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从生物质材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如，舒·T.-A.(Hsu,T.-A.)，1996，生物质的预处理(Pretreatmentofbiomass)，生物乙醇手册：生产和利用(HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization)，怀曼·C.E.(Wyman,C.E.)编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团，华盛顿特区，179-212；高希(Ghosh)和辛格(Singh)，1993，用于纤维素生物质的酶/微生物转化的物理化学与生物处理(Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionofcellulosicbiomass)，应用微生物学进展(Adv.Appl.Microbiol.)39:295-333；麦克米兰·J.D.(McMillan,J.D.)，1994，预处理木质纤维素生物质：综述(Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview)，用于燃料生产的生物质的酶转化(EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction)，希默尔·M.E.(Himmel,M.E.)、贝克·J.O.(Baker,J.O.)、以及奥弗伦·R.P.(Overend,R.P.)编辑，美国化学学会讨论会系列566(ACSSymposiumSeries566)，美国化学学会(AmericanChemicalSociety)，华盛顿特区，第15章；贡·C.S.(Gong,C.S.)、卡奥·N.J.(Cao,N.J.)、杜·J.(Du,J.)、以及曹·G.T.(Tsao,G.T.)，1999，由可再生资源生产乙醇(Ethanolproductionfromrenewableresources)，生物化学工程/生物技术的进展(AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)，舍佩尔·T.(Scheper,T.)编辑，施普林格出版社德国海德堡柏林(BerlinHeidelberg,Germany)，65:207-241)；奥尔森(Olsson)和哈恩-哈格达尔(Hahn-Hagerdal)，1996，用于乙醇生产的木质纤维素水解物的发酵(Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction)，酶与微生物技术(Enz.Microb.Tech.)18:312-331；以及瓦蓝德(Vallander)和埃里克松(Eriksson)，1990，由木质纤维素材料生产乙醇：技术现状(Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart)，生物化学工程/生物技术的进展42:63-95)。
发酵。可以通过能够将糖(例如，葡萄糖、木糖)直接或间接发酵成所希望的发酵产物(例如，乙醇)的一种或多种(若干种)发酵微生物发酵根据本发明的从糖化纤维素材料获得的可发酵的糖。
“发酵”或“发酵过程”是指任何发酵过程或包括发酵步骤的任何过程。发酵方法还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的发酵方法。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物，并且可以由本领域的普通技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，酶糖化所导致的从纤维素材料释放的糖由发酵生物(如酵母)发酵成一种产物，例如，乙醇。如上所述，糖化和发酵可以是分开或同时的。
在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的根据本发明的糖化的纤维素材料。通常基于所希望的发酵产物(即，要从发酵获得的物质)和所采用的方法来选择材料。
术语“发酵培养基”在此可理解为指在添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，如，由糖化产生的培养基，以及例如在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”是指适用于所希望的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物可以是己糖和/或戊糖发酵生物、或其组合。己糖和戊糖发酵生物二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、***糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所希望的发酵产物。
产生乙醇的细菌和真菌发酵生物的实例由琳(Lin)等人，2006，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)69:627-642描述。
能够发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌生物和真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母菌属菌株，优选酿酒酵母。
能够发酵C5糖的发酵生物的实例包括细菌生物和真菌生物，如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属的菌株，优选树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS5773；假丝酵母属的菌株，优选博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、芸薹假丝酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假丝酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)、或产朊假丝酵母(Candidautilis)。
其他发酵生物包括发酵单胞菌属的菌株，例如运动发酵单胞菌；汉逊酵母属，例如异常汉森酵母；克鲁维酵母属，例如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、以及脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；大肠杆菌，尤其已被遗传修饰以提高乙醇产率的大肠杆菌菌株；梭菌属，例如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌(Chlostridiumthermocellum)、以及发酵植物多糖梭菌(Chlostridiumphytofermentans)；土芽孢杆菌属(Geobacillussp.)；热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)，例如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)；以及芽孢杆菌属，例如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)、甲醇山梨糖假丝酵母(C.methanosorbosa)、迪丹斯假丝酵母(C.diddensiae)、***滑假丝酵母(C.parapsilosis)、C.naedodendra、布朗克假丝酵母(C.blankii)、嗜虫假丝酵母(C.entomophilia)、芸薹假丝酵母、假热带假丝酵母、博伊丁假丝酵母、产朊假丝酵母、以及休哈塔假丝酵母；克雷伯氏菌属，例如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)。
在一个方面中，酵母是酵母属物种。在另一个方面中，酵母是酿酒酵母。在另一个方面中，酵母是糖化酵母。在另一个方面中，酵母是葡萄汁酵母。在另一个方面中，酵母是克鲁维酵母属物种。在另一个方面中，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个方面中，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个方面中，酵母是假丝酵母属物种。在另一个方面中，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个方面中，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个方面中，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个方面中，酵母是假热带假丝酵母。在另一个方面中，酵母是产朊假丝酵母。在另一个方面中，酵母是棒孢酵母属物种。在另一个方面中，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一个方面中，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一个方面中，酵母是管囊酵母属物种。在另一个方面中，酵母是嗜鞋管囊酵母。在另一个方面中，酵母是毕赤酵母属物种。在另一个方面中，酵母是树干毕赤酵母。在另一个方面中，酵母是酒香酵母属物种。在另一个方面中，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(菲利皮迪斯(Philippidis)，1996，见上文)。
能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、热纤维梭菌、发酵植物多糖梭菌、土芽孢杆菌属种、解糖热厌氧杆菌以及凝结芽孢杆菌(菲利皮迪斯(Philippidis)，1996，见上文)。
在一个方面中，细菌是发酵单胞菌属物种。在一个方面中，细菌是运动发酵单胞菌。在另一个方面中，细菌是梭菌属物种。在另一个方面中，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个方面中，细菌是发酵植物多糖梭菌。在另一个方面中，细菌是热纤维梭菌。在另一个方面中，细菌是土芽孢杆菌属物种。在另一个方面中，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个方面中，细菌是凝结芽孢杆菌。
适于乙醇生产的可商购的酵母包括，例如乙醇红酵母(ETHANOLREDTMyeast)(可从富酶泰斯/乐斯富(Fermentis/Lesaffre)，USA获得)、FALITM(可从弗莱施曼酵母(Fleischmann’sYeast)，USA获得)、SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从乙醇技术(EthanolTechnology)，WI，USA)、BIOFERMTMAFT和XR(可从NABC-北美生物产品公司(NorthAmericanBioproductsCorporation)，GA，USA获得)、GERTSTRANDTM(可从GertStrandAB，瑞典获得)、以及FERMIOLTM(可从帝斯曼食品配料部(DSMSpecialties)获得)。
在一个方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖的微生物、利用***糖的微生物、以及共同利用木糖和***糖的微生物。
将异源基因克隆到多种发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物(陈(Chen)和霍(Ho)，1993，酿酒酵母中毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆和改善表达(CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae)，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)39-40:135-147；霍等人，1998，能够有效共发酵葡萄糖和木糖的遗传工程化的酵母菌属酵母(GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose)，应用与环境微生物学64:1852-1859；科特(Kotter)和西拉塞(Ciriacy)，1993，酿酒酵母发酵木糖(XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae)，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)38:776-783；维尔福森(Walfridsson)等人，1995，过表达编码戊糖磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKL1和TAL1基因的木糖代谢酿酒酵母菌株(Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKL1andTAL1genesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase)，应用与环境微生物学61:4184-4190；凯珀(Kuyper)等人，2004，用于有效厌氧木糖发酵的酿酒酵母的最小代谢工程化：原理的证实(MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple)，欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMSYeastResearch)4:655-664；比尔(Beall)等人，1991，通过重组大肠杆菌从木糖和其他糖产生乙醇的参数研究(ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli)，生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)38:296-303；英格拉姆(Ingram)等人，1998，用于乙醇产生的细菌的代谢工程化(Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction)，生物技术与生物工程58:204-214；张(Zhang)等人，1995，产生乙醇的运动发酵单胞菌中戊糖代谢途径的代谢工程化(MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis)，科学(Science)267:240-243；狄安妲(Deanda)等人，1996，通过代谢途径工程化开发发酵***糖的运动发酵单胞菌菌株(Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering)，应用与环境微生物学62:4465-4470；WO2003/062430，木糖异构酶)。
在一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。在另一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母属物种。
本领域中熟知的是，以上所描述的生物还可以用于产生其他物质，如在此所描述。
典型地向糖化的预处理的纤维素材料中添加发酵微生物并且发酵可以进行约8至约96小时，如约24至约60小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间，具体地约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，例如pH4至5、6、或7左右。
在一个方面中，应用酵母和/或另一种微生物至糖化的预处理的纤维素材料并且然后将发酵进行约12小时至约96小时，如24-60小时。在一个方面中，温度在约20℃至约60℃之间，例如约25℃至约50℃或约32℃至约50℃，并且pH通常是从约pH3至约pH7，例如pH4-7左右，例如约pH5。
然而，一些发酵生物(例如细菌)具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以每mL发酵液约105至1012，例如从约107至1010，特别是约2×108个活细胞计数的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指南可以见于例如“醇教材”(“TheAlcoholTextbook”)(K·雅克(K.Jacques)、T.P.里昂(T.P.Lyons)以及D.R.凯尔索尔(D.R.Kelsall)编辑，诺丁汉大学出版社(NottinghamUniversityPress)，联合王国(UnitedKingdom)1999)，将其通过引用结合在此。
对于乙醇生产，在发酵之后，可蒸馏发酵的浆料以萃取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的中性烈酒，或工业乙醇。
发酵刺激剂可与在此描述的任何方法结合使用以进一步改进发酵过程，并且特别是，改进发酵微生物的性能，例如，提高速度和乙醇产率。“发酵刺激剂”是指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E。例如参见阿尔弗雷多(Alfenore)等人，通过在进料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活力(ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiabyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess)，施普林格(2002)，将其通过引用结合在此。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物盐。
发酵产物：发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。该发酵产物可以是(不限于)一种醇(例如，***糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇(glycerol)、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇、以及木糖醇)；一种有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、丁二酸、以及木糖酸)；一种酮(例如，丙酮)；一种氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；一种烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；一种环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；一种烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；以及一种气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白。
在一个方面中，发酵产物是一种醇。应理解的是，术语“醇”涵盖包含一个或多个羟基部分的物质。在一个方面中，醇是***糖醇。在另一个方面中，醇是丁醇。在另一个方面中，醇是乙醇。在另一个方面中，醇是甘油。在另一个方面中，醇是甲醇。在另一个方面中，醇是1,3-丙二醇。在另一个方面中，醇是山梨醇。在另一个方面中，醇是木糖醇。参见，例如，贡(Gong)等人，1999，由可再生资源生产乙醇，生物化学工程/生物技术的进展，舍佩尔·T.编辑，施普林格，德国海德堡柏林，65:207-241；西尔韦拉·M.(Silveira,M.)和乔纳斯(Jonas)，2002，山梨醇的生物技术生产(Thebiotechnologicalproductionofsorbitol)，应用微生物学与生物技术59:400-408；尼加姆(Nigam)和辛格(Singh)，1995，用于木糖醇-一种糖替代品的发酵产生工艺(Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute)，加工生物化学(ProcessBiochemistry)30(2):117-124；伊泽吉(Ezeji)等人，2003，通过拜季林斯基羧菌BA101生产丙酮、丁醇和乙醇并且通过气提原位回收(Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBA101andinsiturecoverybygasstripping)，微生物与生物技术世界杂志(WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology)19(6):595-603。
在另一个方面中，发酵产物是一种有机酸。在一个方面中，有机酸是乙酸。在另一个方面中，有机酸是醋酮酸。在另一个方面中，有机酸是己二酸。在另一个方面中，有机酸是抗坏血酸。在另一个方面中，有机酸是柠檬酸。在另一个方面中，有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个方面中，有机酸是甲酸。在另一个方面中，有机酸是富马酸。在另一个方面中，有机酸是葡糖二酸。在另一个方面中，有机酸是葡糖酸。在另一个方面中，有机酸是葡糖醛酸。在另一个方面中，有机酸是戊二酸。在另一个方面中，有机酸是3-二羟基丙酸。在另一个方面中，有机酸是衣康酸。在另一个方面中，有机酸是乳酸。在另一个方面中，有机酸是苹果酸。在另一个方面中，有机酸是丙二酸。在另一个方面中，有机酸是草酸。在另一个方面中，有机酸是丙酸。在另一个方面中，有机酸是琥珀酸。在另一个方面中，有机酸是木糖酸。参见例如陈(Chen)和李(Lee)，1997，用于从纤维素生物质生产乳酸的膜介导的萃取发酵(Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass)，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)，63-65:435-448。
在另一个方面中，发酵产物是一种酮。应理解的是，术语“酮”涵盖包含一个或多个酮部分的物质。在另一个方面中，酮是丙酮。参见，例如，库雷希和布拉舍克，2003，见上文。
在另一个方面中，发酵产品是一种氨基酸。在一个方面中，氨基酸是天冬氨酸。在另一个方面中，氨基酸是谷氨酸。在另一个方面中，氨基酸是甘氨酸。在另一个方面中，氨基酸是赖氨酸。在另一个方面中，氨基酸是丝氨酸。在另一个方面中，氨基酸是苏氨酸。参见例如理查德(Richard)和马加里蒂(Margaritis)用于聚(谷氨酸)生产和其他微生物生物聚合物的分批发酵动力学的实验建模(Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers)，生物技术和生物工程(BiotechnologyandBioengineering)87(4):501-515。
在另一个方面中，发酵产物是一种烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。在一个方面中，烷烃是戊烷。在另一个方面中，烷烃是己烷。在另一个方面中，烷烃是庚烷。在另一个方面中，烷烃是辛烷。在另一个方面中，烷烃是壬烷。在另一个方面中，烷烃是癸烷。在另一个方面中，烷烃是十一烷。在另一个方面中，烷烃是十二烷。
在另一个方面中，发酵产物是一种环烷烃。在一个方面中，环烷烃是环戊烷。在另一个方面中，环烷烃是环己烷。在另一个方面中，环烷烃是环庚烷。在另一个方面中，环烷烃是环辛烷。
在另一个方面中，发酵产物是一种烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。在一个方面中，烯烃是戊烯。在另一个方面中，烯烃是己烯。在另一个方面中，烯烃是庚烯。在另一个方面中，烯烃是辛烯。
在一个方面中，发酵产物是异戊二烯。在另一个方面中，发酵产物是聚酮化合物。
在另一个方面中，发酵产物是一种气体。在一个方面中，气体是甲烷。在另一个方面中，气体是H2。在另一个方面中，气体是CO2。在另一个方面中，气体是CO。参见例如片冈(Kataoka)等人，1997，关于通过产氢气厌氧细菌的连续培养***的氢气生产的研究(Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria)，水科学与技术(WaterScienceandTechnology)36(6-7):41-47；以及古那森兰(Gunaseelan)，1997，用于甲烷生产的厌氧消化：一篇综述(Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview)，生物质与生物能源(BiomassandBioenergy)13(1-2):83-114，。
回收。可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基中回收一种或多种发酵产物，该方法包括但不限于：色谱法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的甘蔗废物中分离和纯化醇。可以获得具有高达约96vol.％的纯度的乙醇，这可以用作例如燃料乙醇，饮用乙醇，即可饮用的中性烈酒，或工业乙醇。酶
下面描述的一种或多种酶和多肽有待以“有效量”用于本发明的方法中。下文应在上文的“定义”部分中的酶披露的背景下加以阅读。用于糖化的纤维素分解酶组合物
这些纤维素分解酶组合物可以包括有用于降解纤维素材料的任何蛋白。用于糖化的纤维素分解酶组合物可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。
在一个方面中，纤维素分解酶组合物包括或进一步包括选自下组的一种或多种(例如，若干种)蛋白质，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。在另一个方面中，纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。在另一个方面中，半纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。在另一个方面中，氧化还原酶是过氧化氢酶、漆酶或过氧化物酶。
在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括或进一步包括一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶和一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种内切葡聚糖酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种内切葡聚糖酶和一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种内切葡聚糖酶和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种内切葡聚糖酶和一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。
在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种***聚糖酶(例如，α-L-***聚糖酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种***呋喃糖苷酶(例如，α-L-***呋喃糖苷酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种香豆酸酯酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种阿魏酸酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种葡糖醛酸酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种甘露聚糖酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种甘露糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种木聚糖酶。在一个实施例中，木聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。在另一个实施例中，木聚糖酶是一种家族11木聚糖酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种CIP。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种棒曲霉素。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种木质素分解酶。在一个实施例中，木质素分解酶是一种锰过氧化物酶。在另一个实施例中，木质素分解酶是一种木质素过氧化物酶。在另一个实施例中，木质素分解酶是一种H2O2产生酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种果胶酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种氧化还原酶。在另一个实施例中，氧化还原酶是一种漆酶。在另一个实施例中，氧化还原酶是一种过氧化物酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种蛋白酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种膨胀蛋白。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物来源于或分离自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)的菌株。在一个优选实施例中，纤维素分解酶组合物来源于或分离自里氏木霉的菌株。
具有重组产生的GH61多肽的里氏木霉纤维素分解酶组合物的实例描述于WO2008/151079(诺维信)和WO2013/02892(诺维信)中，将两者通过引用结合在此。适合的GH61多肽的实例可以在下面的“GH61多肽”部分中找到。
该纤维素分解酶组合物可以进一步包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：酯酶、棒曲霉素、半纤维素酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。
该纤维素分解酶组合物的最佳量取决于若干因素，包括但不限于，组分酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的一种或多种预处理、温度、时间、pH以及所包含的发酵生物(例如，酵母)。
可以按约0.01至约50.0mg，例如，约1至约25mg，如约2-10mg、如约4至约8mg蛋白/g/DS的纤维素材料的量添加该纤维素分解酶组合物。
β-葡糖苷酶
在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解酶组合物可以包括一种或多种β-葡糖苷酶。该β-葡糖苷酶可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶来自曲霉属的菌株，如米曲霉，如披露于WO02/095014中的β-葡糖苷酶或披露于WO2008/057637中的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白(参见例如，实例10-15)，或烟曲霉，如披露为WO2005/047499中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5的β-葡糖苷酶或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，如披露于WO2012/044915中的变体，如具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用在此的SEQIDNO:5用于编号)。
在另一个实施例中，β-葡糖苷酶来源于青霉属的菌株，如在WO2007/019442中披露为SEQIDNO:2的巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶是一种选自下组的烟曲霉β-葡糖苷酶或其同系物，该组由以下各项组成：
(i)一种β-葡糖苷酶，包括WO2005/047499中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5的成熟多肽；
(ii)一种β-葡糖苷酶，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与WO2005/047499中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性；
(iii)一种β-葡糖苷酶，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括一个与WO2005/047499中的SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的核苷酸序列；以及
(iv)一种β-葡糖苷酶，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中、高严格条件或非常高严格条件下与WO2005/047499中的SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶是一种变体，该变体在对应于WO2005/047499中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5的成熟多肽的位置100、283、456以及512的一个或多个(若干个)位置处包括一个取代，其中该变体具有β-葡糖苷酶活性。
在一个实施例中，变体的亲本β-葡糖苷酶是(a)一种多肽，包括WO2005/047499中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5的成熟多肽；(b)一种多肽，与在此的SEQIDNO:5的成熟多肽具有至少80％序列一致性；(c)一种多肽，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低、中、高或非常高严格条件下与(i)WO2005/047499(通过引用结合在此)中的SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)包含在SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交；(d)一种多肽，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与WO2005/047499中的SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％一致性；或(e)WO2005/047499中的SEQIDNO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有β-葡糖苷酶活性。
在一个实施例中，变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但低于100％序列一致性。
在一个实施例中，变体与WO2005/047499中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5的成熟多肽具有至少80％，例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但低于100％序列一致性。
在一个实施例中，取代的数目在1与4之间，如1、2、3或4个取代。
在一个实施例中，变体在对应于位置100的位置处包括一个取代、在对应于位置283的位置处包括一个取代、在对应于位置456的位置处包括一个取代和/或在对应于位置512的位置处包括一个取代。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶变体包括WO2005/047499中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5中的以下取代：Phe100Asp、Ser283Gly、Asn456Glu、Phe512Tyr。
内切葡聚糖酶
根据本发明使用的该纤维素分解酶组合物包括一种或多种内切葡聚糖酶。该内切葡聚糖酶可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。
在一个实施例中，这种或这些内切葡聚糖酶可以来自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如卢克诺文思金孢子菌的菌株。在一个优选实施例中，内切葡聚糖酶来源于里氏木霉的菌株。
根据本发明可以使用的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因(Gene)45:253-263；里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22；里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人，1988，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563；GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:219-228；GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究(NucleicAcidsResearch)18:5884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995，当代遗传学(CurrentGenetics)27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；热白丝菌(Melanocarpusalbomyces)内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶；GENBANKTM登录号M15665。
可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039；WO93/15186；美国专利号5,275,944；WO96/02551；美国专利号5,536,655；WO00/70031；WO05/093050)；褐色高温双歧菌(Thermobifidafusca)内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；以及褐色高温双歧菌内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。
纤维二糖水解酶I
根据本发明使用的该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBHI(纤维二糖水解酶I)。该纤维二糖水解酶I可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBHI)，如来源于或分离自以下项的纤维二糖水解酶I，曲霉属的菌株如烟曲霉的菌株，如披露于WO2011/057140中的SEQIDNO:6或在此的SEQIDNO:6中的Cel7ACBHI，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶I(CBHI)或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种纤维二糖水解酶I，包括在此的SEQIDNO:6的成熟多肽；
(ii)一种纤维二糖水解酶I，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQIDNO:6的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性；
(iii)一种纤维二糖水解酶I，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括一个与WO2011/057140(通过引用结合在此)中的SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的核苷酸序列；以及
(iv)一种纤维二糖水解酶I，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低、中、高或非常高严格条件下与WO2011/057140中的SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。
纤维二糖水解酶II
根据本发明使用的该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBHII(纤维二糖水解酶II)。该纤维二糖水解酶II可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。
在一个实施例中，纤维二糖水解酶II(CBHII)是如来源于以下项的纤维二糖水解酶II，曲霉属的菌株(如烟曲霉的菌株)，如在此的SEQIDNO:7中的纤维二糖水解酶II，或木霉属的菌株，如里氏木霉，或梭孢壳霉属的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株，如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。
在一个实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种纤维二糖水解酶II，包括SEQIDNO:4的成熟多肽；
(ii)一种纤维二糖水解酶II，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQIDNO:7的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性；
(iii)一种纤维二糖水解酶II，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括一个与WO2013/028928(通过引用结合在此)中的SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的核苷酸序列；以及
(iv)一种纤维二糖水解酶II，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低、中或高严格条件(例如，非常高严格条件)下与WO2013/028928中的SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。
GH61多肽
根据本发明，在糖化过程中GH61多肽与纤维素分解酶组合物一起存在。该GH61多肽可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。
该GH61多肽可以与该纤维素分解酶组合物分开、同时添加或作为该纤维素分解酶组合物的一部分。
该GH61多肽对于该纤维素分解酶组合物来源于其中或分离自其中的菌株而言可以是天然的或外源的，如里氏木霉、特异腐质霉、埃默森篮状菌或卢克诺文思金孢子菌(嗜热毁丝霉)的菌株。在一个实施例中，GH61多肽是一种重组GH61多肽。在一个实施例中，GH61多肽不具有与纤维素分解酶组合物的宿主细胞相同的来源，例如，不具有木霉属来源，如不具有里氏木霉来源。在一个实施例中，GH61多肽作为该纤维素分解酶组合物的一部分而重组地产生，例如，由产生纤维素分解酶组合物的里氏木霉宿主细胞产生。
在一个实施例中，GH61多肽来源于或分离自嗜热子囊菌属，如金黄色嗜热子囊菌的菌株，如在WO2005/074656中描述为SEQIDNO:2和在此的SEQIDNO:1的GH61多肽；或来源于或分离自梭孢壳霉属，如土生梭孢壳霉的菌株，如在WO2005/074647中描述为SEQIDNO:8或在此的SEQIDNO:4的GH61多肽；或来源于或分离自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如在WO2010/138754中描述为SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:3的GH61多肽；或来源于或分离自青霉属的菌株，如埃默森青霉的菌株，如在WO2011/041397中披露为SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:2的GH61多肽。
在一个实施例中，青霉属GH61多肽或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种GH61多肽，包括在此的SEQIDNO:8的成熟多肽；
(ii)一种GH61多肽，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性；
(iii)一种GH61多肽，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括一个与WO2011/041397(通过引用结合在此)中的SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的核苷酸序列；以及
(iv)一种GH61多肽，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低、中、高或非常高严格条件下与WO2011/041397中的SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。
在一个实施例中，多肽或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：一种包括以下项的成熟多肽的GH61多肽，WO2005/074656中的SEQIDNO:2；WO2005/074647中的SEQIDNO:8；WO2010/138754中的SEQIDNO:2；或一种包括以下氨基酸序列的GH61多肽，该氨基酸序列与以下项的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性，WO2005/074656中的SEQIDNO:2；WO2005/074647中的SEQIDNO:8；或WO2010/138754中的SEQIDNO:2(所有参考文献和序列都通过引用结合在此)。
在一个实施例中，GH61多肽构成该纤维素分解酶组合物的从0.1％-25％，如0.5％-20％、0.5％-15％、0.5％-10％或0.5％-7％。在一个实施例中，纤维素分解酶组合物中的GH61多肽的量是约1g至约1000g，如约1g至约200g、约1g至约100g、约1g至约50g、约1g至约20g、约1g至约15g、约1g至约10g、约1g至约7g或约1g至约4g/g的纤维素分解酶组合物。
包含GH61多肽的具体纤维素酶组合物
以下是多种用于在本发明中使用的包含GH61多肽的纤维素分解酶组合物的一个列表。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括一种金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656和在此的SEQIDNO:1)和一种米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(参见WO2008/057637-实例10-15)。
在另一个实施例中，纤维素分解酶组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括一种金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:1)和一种烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5)。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括一种在WO2011/041397中披露为SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:2的埃默森青霉GH61A多肽、一种烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5)或具有以下取代的其变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用在此的SEQIDNO:5用于编号)(披露于WO2012/044915中)。
纤维素分解酶组合物的配制品
根据本发明使用的纤维素分解酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。
该纤维素分解酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体、或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶组合物进行稳定化。
商业纤维素分解酶组合物
根据本发明的方法使用的纤维素分解酶组合物可以是商业纤维素分解酶组合物。适于根据本发明使用的商业纤维素分解酶组合物的实例包括例如CELLICTMCTec(诺维信公司)、CELLICTMCTec2(诺维信公司)、CELLICTMCTec3(诺维信公司)、CELLUCLASTTM(诺维信公司)、NOVOZYMTM188(诺维信公司)、CELLUZYMETM(诺维信公司)、CEREFLOTM(诺维信公司)及ULTRAFLOTM(诺维信公司)、ACCELERASETM(杜邦公司(DuPont))、ACCELERASETM1000；ACCELERASETM1500；ACCELERASETMTRIO；ACCELERASETMDUET(杜邦公司)；LAMINEXTM(杰能科国际公司(GenencorInt.))、SPEZYMETMCP(杰能科国际公司)、ROHAMENTTM7069W(罗姆公司(GmbH))、LDI(并矢国际公司(DyadicInternational,Inc.))、LBR(并矢国际公司)或150L(并矢国际公司)。可以按约0.001至约5.0wt％的固体，更优选从约0.025至约4.0wt％的固体，并且最优选从约0.005至约2.0wt％的干固体(DS)的量添加商业纤维素分解酶组合物。
过氧化氢酶
该过氧化氢酶可以是有用于本发明的方法的任何过氧化氢酶。过氧化氢酶可以包括但不限于E.C.1.11.1.6或E.C.1.11.1.21过氧化氢酶。
有用的过氧化氢酶的实例包括但不限于来自以下各项的过氧化氢酶：海水产碱杆菌(Alcaligenesaquamarinus)(WO98/00526)、兰图鲁斯曲霉(Aspergilluslentilus)、烟曲霉、黑曲霉(美国专利号5,360,901)、米曲霉(JP2002223772A；美国专利号6,022,721)、嗜热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidasius)(JP11243961A)、特异腐质霉(WO2009/104622、WO2012/130120)、樟绒枝霉、变黑微颤菌(Microscillafurvescens)(WO98/00526)、粗糙脉孢菌、埃默森青霉(WO2012/130120)、嗜松青霉、微小根毛霉、巴斯德酵母(WO2007/105350)、嗜热柱顶孢霉、柄篮状菌(Talaromycesstipitatus)(WO2012/130120)、金黄色嗜热子囊菌(WO2012/130120)、布氏栖热菌(Thermusbrockianus)(WO2005/044994)以及土生梭孢壳霉(WO2010/074972)。
有用于本发明的过氧化氢酶的非限制性实例是来自以下各项的过氧化氢酶：专性嗜碱芽孢杆菌(Bacilluspseudofirmus)(UNIPROT：P30266)、枯草芽孢杆菌(UNIPROT：P42234)、灰腐质霉(GeneSeqP：AXQ55105)、费希新萨托菌(UNIPROT：A1DJU9)、埃默森青霉(GeneSeqP：BAC10987)、嗜松青霉(GeneSeqP：BAC10995)、嗜热柱顶孢霉(GeneSeqP：AAW06109或ADT89624)、柄篮状菌(GeneSeqP：BAC10983或BAC11039；UNIPROT：B8MT74)以及金黄色嗜热子囊菌(GeneSeqP：BAC11005)。将登录号以其全部内容结合在此。
在一个方面中，过氧化氢酶与在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性，该成熟多肽具有过氧化氢酶活性。
在另一个方面中，过氧化氢酶的氨基酸序列与在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在另一个方面中，过氧化氢酶包括在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的氨基酸序列或由其组成。
在另一个方面中，过氧化氢酶包括在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，过氧化氢酶是在此披露的过氧化氢酶的一种等位基因变体。
在另一个方面中，过氧化氢酶是一个包含在此披露的过氧化氢酶的成熟多肽的至少85％氨基酸残基，例如，至少90％氨基酸残基或至少95％氨基酸残基的片段。
在另一个方面中，氧化氢酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低、低、中、中-高、高或非常高严格条件下与在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
可以使用编码过氧化氢酶的多核苷酸或其子序列、连同过氧化氢酶的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆编码来自不同属或种的菌株的过氧化氢酶的DNA。具体而言，此类探针可以用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，如在上文所述。
出于本发明的目的，杂交是指在非常低至非常高严格条件下多核苷酸杂交到标记的核酸探针上。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
在一个方面中，核酸探针是过氧化氢酶的成熟多肽编码序列。
在另一个方面中，核酸探针是编码全长过氧化氢酶；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。
在另一个方面中，过氧化氢酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。
该过氧化氢酶可以是一种杂合多肽，其中一个多肽的一个区域融合在另一个多肽的一个区域的N-末端或C-末端，或一种融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一个多肽融合在过氧化氢酶的N-末端或C-末端，如在此所述。
在糖化反应中，过氧化氢酶的蛋白含量处于约0.5％至约10％，例如，约0.5％至约7％、约0.5％至约5％、约0.5％至约4％、约0.5％至约3％、约0.5％至约2％以及约0.5％至约1％的总酶蛋白的范围内。在一个实施例中，过氧化氢酶与纤维素分解酶组合物的蛋白比处于约1:200至约1:10，例如，约1:100至约1:15或约1:50至约1:25的范围内。
糖化过程中存在或添加的其他酶和多肽
可以在糖化过程中存在或添加其他酶和/或多肽。这些另外的酶和/或多肽可以与纤维素分解组合物和/或GH61多肽分开或一起添加。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包括或进一步包括选自下组的一种或多种(若干种)酶和/或多肽，该组由以下各项组成：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。
在一个实施例中，半纤维素酶是木聚糖酶(例如，棘孢曲霉木聚糖酶)、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、***呋喃糖苷酶、木糖苷酶以及葡糖醛酸糖苷酶。在一个优选实施例中，半纤维素酶是木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。
在一个实施例中，木聚糖酶是一种GH10木聚糖酶。在一个实施例中，木聚糖酶来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如在WO2006/078256中披露为XylIII或在此的SEQIDNO:9的木聚糖酶，或棘孢曲霉，如在WO94/21785中披露为例如XylII或在此的SEQIDNO:8的木聚糖酶。
在一个实施例中，β-木糖苷酶来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如在WO2013/028928(通过引用结合在此)的实例16-17中披露为SEQIDNO:16或在此的SEQIDNO:11的β-木糖苷酶，或来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株，如WO2011/057140中的SEQIDNO:58或在此的SEQIDNO:12的成熟多肽。
材料&方法
材料：
CELLUCLAST TM 1.5L：可获得自诺维信公司的里氏木霉纤维素分解酶组合物。
GH61多肽A：金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽在WO2005/074656中披露为SEQIDNO:2并且是在此的SEQIDNO:1。
GH61多肽B：青霉属(埃默森青霉)GH61多肽在WO2011/041397中披露为SEQIDNO:2并且是在此的SEQIDNO:2。
棘孢曲霉β-葡糖苷酶：根据川口(Kawaguchi)等人，1996，基因(Gene)173:287-288获得。
具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶(在此的SEQIDNO:5)变体披露于WO2012/044915中：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用SEQIDNO:5用于编号)。
烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I披露于WO2011/057140中并且是在此的SEQIDNO:6。
烟曲霉纤维二糖水解酶II披露于WO2011/057140中并且是在此的SEQIDNO:7。
烟曲霉GH10木聚糖酶披露于WO2006/078256中并且是在此的SEQIDNO:9。
棘孢曲霉木聚糖酶：GH10木聚糖酶在WO94/21785中披露为XylII(可获得自诺维信公司)并且在此披露为SEQIDNO:8。
烟曲霉β-木糖苷酶披露于WO2011/057140中并且是在此的SEQIDNO:11。
纤维素分解酶组合物A：里氏木霉纤维素分解酶组合物包括一种烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I(WO2011/057140)、一种烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO2011/057140)、一种具有以下突变F100D、S283G、N456E及F512Y的披露于WO2012/044915中的烟曲霉β-葡糖苷酶变体、一种青霉属(埃默森青霉)GH61多肽(WO2011/041397)、一种烟曲霉GH10木聚糖酶(WO2006/078256)以及一种烟曲霉β-木糖苷酶(WO2011/057140)。
预处理的玉米秸秆(PCS)由科罗拉多州戈尔登的国家可再生能源实验室(NREL)提供。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
实例1：在具有/不具有来自金黄色嗜热子囊菌的GH61多肽A的情况下，糖化过程中氧的影响
为了研究当用一种纤维素分解酶组合物和一种GH61(家族)多肽糖化纤维素材料时溶解氧(DO)对溶解的碳水化合物(主要是葡萄糖)产率的影响，使用以下程序。
程序：
在伴随连续搅拌的封闭的实验室规模反应器中用具有和不具有GH61多肽的纤维素分解酶组合物糖化预处理的纤维素材料批次，其中温度、pH和溶解氧(DO)饱和是受控的。这些反应器的填充体积是1500克纤维素材料浆料，并且顶部空间体积为大约1L。通过测量用不同DO浓度运行的反应器的溶解的碳水化合物的终浓度，可以分别针对具有和不具有GH61多肽的纤维素分解酶组合物确定DO对产率的影响。将糖化运行五天，针对所有反应器，将温度维持在50℃，并且pH是5.0。将DO的目标水平设置成处于0％与3％之间饱和度范围内的值。通过控制氮和空气流经反应器顶部空间和顶部空间与纤维素材料之间的良好的氧扩散而维持DO。空气和氮的适合流速处于1-100ml/分钟范围内。通过以高速(例如，175rpm)运行搅拌器而保证良好的氧扩散。将氮流手动地设置成恒定值，并且在来自DO传感器(来自英戈尔德公司(Ingold)的InPro6800)的反馈的基础上自动调节空气流。
实验：
使用的纤维素材料是在稀硫酸的存在下通过蒸汽***预处理的玉米秸秆。该预处理的纤维素材料由科罗拉多州戈尔登的国家可再生能源实验室(NREL)提供。总固体含量为20％并且硫酸浓度为大约0.8％。在被丢弃并进行蒸汽***之前，将该纤维素材料加热至180℃，持续大约5分钟。在添加酶之前，用氢氧化钠将预处理的底物的pH调节至5.0。
不具有GH61多肽的纤维素分解酶组合物由来自CELLUCLASTTM1.5L(诺维信公司)的90％酶蛋白(EP)、来自棘孢曲霉β-葡糖苷酶的5％EP和来自棘孢曲霉木聚糖酶的5％EP组成。应用10mgEP/克的纤维素的用量。
具有GH61多肽的纤维素分解酶组合物由来自CELLUCLASTTM1.5L的85％EP、棘孢曲霉β-葡糖苷酶的5％EP、棘孢曲霉木聚糖酶的5％EP以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(GH61多肽A)的5％EP组成。应用7mgEP/克的纤维素的用量。
根据2008年1月描述于NREL/TP-510-42623中的程序，使用HPX-87H柱通过HPLC测量溶解的碳水化合物终浓度。通过以下方式制备用于HPLC的样品：离心约10g的浆料，将300微升的上清液转移至一个具有10微升的40％硫酸和2.09ml去离子水(8X稀释)的管中，并且通过0.2μm针筒式滤器(沃特曼GD/XPTFE，25mm直径)过滤。
结果：
该实验的结果示于图1中。对于不具有GH61多肽的纤维素分解酶组合物，溶解氧(DO)浓度对溶解的碳水化合物终浓度具有很少或没有影响。对于具有GH61多肽的纤维素分解酶组合物，溶解氧(DO)浓度对碳水化合物产率具有强烈影响，其中最适浓度在1％-2％饱和度范围内并且急剧下降在最适浓度之下。
实例2：在糖化过程中，氧浓度对来自青霉属(埃默森青霉)的GH61多肽B的影响
用纤维素分解酶组合物A代替描述于实例1中的纤维素分解酶组合物重复描述于实例1中的实验。以5mgEP/克的纤维素的用量应用纤维素分解酶组合物A。
结果：
示于图2中的结果表明溶解氧(DO)对碳水化合物产率具有强烈影响，并且趋势类似于针对描述于实例1中的具有GH61多肽的纤维素分解酶组合物观察到的趋势。
实例3：溶解氧和过氧化氢酶对滴定剂的消耗的影响
为了研究溶解氧和过氧化氢酶添加对糖产率和碱滴定剂的消耗的影响，实施以下实验。
这些反应器容器是具有锚式搅拌器的IKALR-2.ST反应器***。这些容器各自都配备有一个MettlerToledoInPro4260pH和温度传感器以及一个MettlerToledoInPro6800溶解氧和温度传感器。这些传感器连接至MettlerToledoM300发送器上。这些传感器信号被发送至一台PC。通过由PC控制的蠕动泵给料氢氧化钠的25％(w/w)溶液而自动控制pH。以0与100ml/min之间的速率向这些反应器的顶部空间中引入空气和氮。通过来自科尔-帕默公司(Cole-Parmer)的气体质量流控制器(型号#32907-59)调节气流。手动地控制氮流，并且在溶解氧传感器信号的基础上通过PC自动控制空气流。运行以下三个反应器：
(1)反应器1.纤维素分解酶组合物A，仅用氮覆盖，以从该反应器中吹扫氧。
(2)反应器2.纤维素分解酶组合物A，仅将溶解氧(DO)调节设置为2％饱和。
(3)反应器3.纤维素分解酶组合物A和过氧化氢酶，将DO调节设置为2％饱和。
对于以上每个反应器，对底物进行蒸汽***，其中麦秸的干物质含量为20％。将温度设置为50℃-51℃，同时搅拌器速度为75rpm。
将总共830g液体和394ml水装进每个反应器中。用25％NaOH将这些液体的pH调节至5.2-5.3。在搅拌下，通过位于反应器顶部的漏斗添加这些固体。对于反应的剩余部分，将pH维持为5.0。
反应器1和反应器2的酶用量为9mg酶蛋白/g纤维素的纤维素分解酶组合物A。反应器3的酶用量为8.78mg酶蛋白/g纤维素的纤维素分解酶组合物A和0.217mg/g过氧化氢酶。
对于所有反应器而言，初始时氮流为100ml/分钟，直到溶解氧浓度低于10％的饱和度。在试验过程中将至顶部空间的氮流维持为10ml/分钟，以便防止超过DO浓度。对于反应的剩余部分，将反应器2和3的溶解氧浓度维持为2％的饱和度。
用于HPLC的样品的制备：在第3和第5天，用血清移液器将浆料样品从每个反应器容器中移出并转移至15ml塑料管中。将这些样品在台式离心机中以4000rpm离心20分钟，以将液体和固体分离。将来自每个样品的总共300微升的上清液用2.09ml的DI水和6微升的40％H2SO4(8X稀释)稀释。通过0.45μmPES针筒式滤器过滤稀释的样品。
使用配备有0.2μm在线过滤器的300x7.7mmHyperREZXP碳水化合物H+8μm柱代替保护柱，通过在65℃下以0.9ml/分钟的流速用作为流动相的5mMH2SO4洗脱，并通过在50℃下整合由糖标准品校准的来自折射率检测(1200HPLC，安捷伦科技(AgilentTechnologies)，圣克拉拉，加州，美国)的葡萄糖信号定量而测量这些样品的糖浓度。注射体积为10微升并且运行时间为18分钟。
通过添加8.0000g的纤维二糖、15.0000g的葡萄糖、15.0000g的木糖、8.0000g的***糖、8.0000g的木糖醇、8.0000g的甘油而制备糖标准品。向一个具有5mMH2SO4的200mLA类容量瓶中添加12.0000g的乙酸钠和15.0000g的乙醇，以制备储备溶液(SS)。在5mMH2SO4中从储备溶液(SS)制备以下稀释物：
·标准品5＝SS
·标准品4＝SS稀释2x
·标准品3＝SS稀释4x
·标准品2＝SS稀释20x
·标准品1＝SS稀释50x
·检查标准品＝SS稀释10x
结果提供于下表中：
下表示出了用于在反应过程中将pH维持为5.2，在糖化过程中消耗的碱的量。
反应器 NaOH(25％，ml)
4：氮 4.9
5：2％DO 9.6
6：过氧化氢酶+2％DO 5.7
结果显示，与缺氧条件相比，低水平的溶解氧(2％饱和度)对于糖化过程而言是有利的，但是它导致在水解过程中将pH值维持在5的设置点所需的碱滴定剂的较高消耗(几乎加倍)。数据还表明，添加过氧化氢酶与2％溶解氧饱和一起显著减少滴定剂消耗的增加并且在孵育5天后显著改进木糖和葡萄糖两者的产率。
实例4：通气对水解部分的影响
进行此实验，以确定对于麦秸的整个水解而言是否需要通气。
通过在两阶段过程中蒸煮而对麦秸进行预处理。在第一阶段蒸煮中，将温度在158℃下维持65分钟，并且在第一阶段蒸煮后将液体从该材料中压出。在第二阶段蒸煮中，使压出的材料(干固体)经受195℃的温度，持续4分钟。将在第一次蒸煮后压出的液体和来自第二次蒸煮的固体合并，以形成预处理的麦秸。
在伴随连续搅拌的封闭的实验室规模反应器中用纤维素分解酶组合物A水解预处理的麦秸批次，其中温度、pH和溶解氧(DO)饱和是受控的。反应器类型是配备有螺旋式叶轮的工作容积为2L的Labfors-5。这些容器各自都配备有一个MettlerToledo405-DPAS-SC-K8SpH传感器以及一个MettlerToledoInPro6820溶解氧传感器。对于对应的气体而言，通过开/关阀控制直接进入水解产物中的空气流和氦流，并且将转子流量计并入控制单元中，全部由Infors公司提高。当接通气流时，通过转子流量计将气体的流速控制为0.4L/min。pH滴定剂是1MKOH。
用于将预处理的麦秸装进反应器中的程序如下。将预处理的麦秸和水装进反应器中。通过用氦冲洗而从浆料中除去所有氧。将浆料加热至50℃，并且通过手动控制滴定剂给料泵而将pH调节至5.3。添加更多的水，以达到17％总固体的终稠度。这些反应器的填充体积是1200克浆料。向反应器中的浆料中添加酶制剂。氦流是连续的，直到预处理的麦秸被液化。然后，将DO控制切换到在下面针对给定反应器描述的程序。
将糖化实施五天。将温度维持在50℃，并且将pH维持在5.3。将搅拌器速度设置为50RPM。以10mgEP/克的用量添加纤维素分解酶组合物A。根据以下DO控制方案，以2％饱和度水平向反应器中引入氧。对于未引入氧的水解部分，向反应器中添加受控的氦流。
·反应器A：以2％饱和度引入DO持续24小时，然后针对糖化的剩余部分引入氦。
·反应器B：引入氦持续18小时，然后以2％饱和度引入DO持续24小时，然后再次针对糖化的剩余部分引入氦。
·反应器C：引入氦持续44小时，然后针对糖化的剩余部分以2％饱和度引入DO。
·反应器D：参比实验。针对整个糖化以2％饱和度引入DO。
在水解2.5、18.5、24、43.8、48、94以及114.8小时后取全浆料的样品。通过将2g浆料与8g纯化水充分混合而制备这些样品的重量/重量稀释物。从此稀释中取一个小的等分部分，转移至艾本德(Eppendorf)管中，并通过在艾本德5417C离心机中以14000RPM离心而分离。根据2008年1月描述于NREL/TP-510-42623中的程序，通过0.22μm过滤器过滤上清液并转移至HPLC小瓶中并在HPX-87H柱上分析葡萄糖和木糖。
测量的葡萄糖浓度示于下表中。
稍后开始添加氧(氦持续44小时，然后是DO)对葡萄糖终浓度未显示出不利影响。无论是在前24小时还是在18–44小时之间，短期添加氧导致葡萄糖终浓度降低。因此，重要的是在稍后阶段的水解过程中进行通气，但是在水解过程的早期通气并不总是必要的。
在此描述并且要求的本发明不应限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
在以下编号的段落中进一步描述本发明：
1.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在一个容器中经受一种纤维素分解酶组合物和一种GH61多肽，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在0.5％至10％饱和度范围内。
2.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在一个容器中经受一种纤维素分解酶组合物、一种GH61多肽和一种过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在0.5％至10％饱和度范围内。
3.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在一个容器中经受一种纤维素分解酶组合物和一种GH61多肽，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在0.025ppm至0.55ppm范围内，如例如0.05至0.165ppm。
4.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在一个容器中经受一种纤维素分解酶组合物、一种GH61多肽和一种过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在0.025ppm至0.55ppm范围内，如例如0.05至0.165ppm。
5.如段落1-4中任一项所述的方法，其中过氧化氢酶的量处于0.5％至25％，例如，0.5％至20％、0.5％至15％、0.5％至10％、0.5％至7.5％、0.5％至5％以及0.5％至4％的总蛋白范围内。
6.如段落1-5中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于0.5％-10％饱和度范围内，如0.5％-7％、如0.5％-5％、如0.5％-4％、如0.5％-3％、如0.5％-2％、如1％-5％、如1％-4％、如1％-3％、如1％-2％。
7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，如至少50％或至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在0.5％-10％饱和度范围内，如0.5％-7％、如0.5％-5％、如0.5％-4％、如0.5％-3％、如0.5％-2％、如1％-5％、如1％-4％、如1％-3％、如1％-2％。
8.如段落1-7中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：草本材料(包括能源作物)、农业残余物、木材(包括林业残余物)、城市固体废物、废纸、纸浆以及造纸厂残余物。
9.如段落1-8中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：玉米秸秆、麦秸、甘蔗渣、玉米芯、柳枝稷、玉米纤维、稻秸、芒草、芦竹、竹子、橘皮、杨树、松树、白杨、冷杉、云杉、柳树以及桉树。
10.如段落1-9中任一项所述的方法，其中该纤维素材料例如通过化学和/或物理预处理(如稀酸和/或蒸汽***预处理)而被预处理。
11.如段落1-10中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是预处理的玉米秸秆(PCS)，如稀酸预处理的玉米秸秆。
12.如段落1-11中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwPCS)。
13.如段落1-12中任一项所述的方法，其中糖化进行长达200小时，例如，约12至约96小时、约16至约72小时或约24至约48小时，如持续至少12小时，例如，至少24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。
14.如段落1-13中任一项所述的方法，其中在糖化24-48小时后开始向该容器中添加氧并继续直到糖化结束。
15.如段落1-13中任一项所述的方法，其中贯穿糖化进行氧的添加。
16.如段落1-15中任一项所述的方法，其中在约25℃至约75℃范围内的温度下进行糖化，例如，约30℃至约70℃、约35℃至约65℃、约40℃至60℃、约45℃至55℃或约50℃。
17.如段落1-16中任一项所述的方法，其中在约3.0至约7.0范围内的pH下进行糖化，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。
18.如段落17所述的方法，进一步包括在糖化过程中添加一种碱，以将pH维持在约3.0至约7.0范围内，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。
19.如段落18所述的方法，其中该碱选自下组，该组由以下各项组成：KOH、NaOH、Ca(OH)2以及NH4OH。
20.如段落18或19所述的方法，其中以25-2,500mmol碱/kg干纤维素材料的量添加碱，如25-1000mmol/kg、25-500mmol/kg、25-250mmol/kg、50-200mmol/kg。
21.如段落1-20中任一项所述的方法，其中糖化过程中的干固体含量(例如，该纤维素材料中的总固体)低于约30wt.％、25wt.％、20wt.％、15wt.％、10wt.％、7.5wt.％、5wt.％、2.5wt.％、2wt.％、1wt.％或0.5wt.％，如在5wt.％与30wt.％之间或在10wt.％与25wt.％之间。
22.如段落1-21中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物具有真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。
23.如段落1-22中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物来源于木霉属(例如，里氏木霉)。
24.如段落1-23中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括至少一种纤维二糖水解酶、一种内切葡聚糖酶和一种β-葡糖苷酶。
25.如段落1-24中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、一种内切葡聚糖酶以及一种β-葡糖苷酶。
26.如段落1-24中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶、一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶以及一种木聚糖酶。
27.如段落1-24中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶以及一种木聚糖酶。
28.如段落1-24中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、一种木聚糖酶以及一种β-木糖苷酶。
29.如段落24-28中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括选自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、CIP、香豆酸酯酶、酯酶、棒曲霉素、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、漆酶、木质素分解酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。
30.如段落1-29中任一项所述的方法，其中该GH61多肽来源于嗜热子嚢菌属，如金黄色嗜热子囊菌的菌株，如在WO2005/074656中描述为SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:1的GH61多肽；或来源于梭孢壳霉属，如土生梭孢壳霉的菌株，如在WO2005/074647中描述为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8或在此的SEQIDNO:4的GH61多肽；或来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如在WO2010/138754中描述为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:3的GH61多肽；或青霉属的菌株，如埃默森青霉的菌株，如披露于WO2011/041397或在此的SEQIDNO:2中的GH61多肽。
31.如段落1-30中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种β-葡糖苷酶，优选来源于以下项的β-葡糖苷酶，曲霉属的菌株，如米曲霉，如披露于WO02/095014中的β-葡糖苷酶或披露于WO2008/057637中的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，如在WO2005/047499中披露为SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5的β-葡糖苷酶，或披露于WO2012/044915中的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或青霉属的菌株，如在WO2007/019442中披露为SEQIDNO:2的巴西青霉的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
32.如段落1-31中任一项所述的方法，其中该纤维素酶组合物包括一种木聚糖酶，优选一种GH10木聚糖酶，如来源于曲霉属的菌株的木聚糖酶，如烟曲霉的菌株，如在WO2006/078256中披露为XylIII或在此的SEQIDNO:9的木聚糖酶，或棘孢曲霉，如在WO94/21785中披露为XylII或在此的SEQIDNO:8的木聚糖酶。
33.如段落1-32中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种β-木糖苷酶，如来源于曲霉属的菌株的β-木糖苷酶，如烟曲霉的菌株，如披露于未决国际申请号PCT/US2012/052163或在此的SEQIDNO:11中的β-木糖苷酶，或来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株，如WO2011/057140中的SEQIDNO:58或在此的SEQIDNO:12的成熟多肽。
34.如段落1-33中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBHI)，如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶I，如烟曲霉的菌株，如披露于WO2011/057140中的SEQIDNO:6或在此的SEQIDNO:6中的Cel7aCBHI，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
35.如段落1-34中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶II(CBHII)，如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶II，如披露于在此的SEQIDNO:7中的烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，如里氏木霉，或梭孢壳霉属的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株，如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。
36.如段落1-35中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种里氏木霉纤维素酶组合物和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:1)。
37.如段落1-36中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种β-葡糖苷酶，如米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)。
38.如段落1-37中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括一种披露于WO2011/041397或在此的SEQIDNO:2中的埃默森青霉GH61A多肽。
39.如段落1-38中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种β-葡糖苷酶，如烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用在此的SEQIDNO:5用于编号)。
40.如段落1-39中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括以下组分中的一种或多种：
(a)一种烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(b)一种烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(c)一种烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有以下取代中的一种或多种的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y，使用在此的SEQIDNO:5用于编号；以及
(d)一种青霉属GH61多肽；或其同系物。
41.如段落1-40中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括一种金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:1)、一种米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)和一种棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中的XylII或在此的SEQIDNO:8)。
42.如段落1-41中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括一种金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:1)、一种烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5)和一种棘孢曲霉木聚糖酶(披露于WO94/21785中的XylII或在此的SEQIDNO:8)。
43.如段落1-42中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括一种埃默森青霉GH61A多肽(WO2011/04139中的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:2)、一种烟曲霉β-葡糖苷酶(在WO2005/047499中披露为SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:5)、一种烟曲霉木聚糖酶(披露于WO2006/078256中的XylIII或在此的SEQIDNO:9)以及一种来源于烟曲霉菌株的β-木糖苷酶(在此的SEQIDNO:11)。
44.如段落1-43中任一项所述的方法，其中按约0.01至约50.0mg，例如，约1至约25mg，如约2-10mg、如约4至约8mg蛋白/g/DS的纤维素材料的量添加该纤维素分解酶组合物。
45.如段落1-44中任一项所述的方法，进一步包括回收该糖化的纤维素材料。
46.如段落45所述的方法，其中该糖化的纤维素材料是一种糖。
47.如段落46所述的方法，其中该糖选自下组，该组由以下各项组成：***糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖以及木糖。
48.如段落1-47中任一项所述的方法，其中该GH61多肽构成该纤维素分解酶组合物的从0.1％-15％，优选0.5％-10％,，并且更优选0.5％-7％。
49.如段落1-48中任一项所述的方法，其中该容器包括超过10m3，如超过25m3，如超过50m3纤维素材料。
50.一种从纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
(a)根据如段落1-49中任一项所述的方法糖化该纤维素材料；并且
(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料。
51.如段落50所述的方法，进一步包括从(b)中回收发酵产物。
52.如段落50或51所述的方法，其中糖化和发酵同时或顺序发生。
53.如段落50-52中任一项所述的方法，其中发酵进行约8至约96小时，如约24至约60小时。
54.如段落50-53中任一项所述的方法，其中在约26℃至约60℃之间的温度下进行发酵，特别是约32℃或50℃。
55.如段落50-54中任一项所述的方法，其中在约pH3至约pH8下进行发酵，如pH4-5、6或7左右。
56.如段落50-55中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、或气体。
57.如段落56所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。
58.如段落50-57中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是一种细菌或真菌生物。
59.如段落50-58中任一项所述的方法，其中该发酵生物是一种己糖和/或戊糖发酵生物、或其组合。
60.如段落50-59中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是一种酵母属菌株，优选酿酒酵母。
61.如段落50-60中任一项所述的方法，其中该发酵生物是一种毕赤酵母属菌株，优选树干毕赤酵母，如树干毕赤酵母CBS5773；假丝酵母属菌株，优选博伊丁假丝酵母、芸薹假丝酵母、休哈塔假丝酵母、迪丹斯假丝酵母、假热带假丝酵母、或产朊假丝酵母。
62.如段落50-61中任一项所述的方法，其中该发酵生物是一种发酵单胞菌属菌株，如运动发酵单胞菌；汉森酵母属，如异常汉森酵母；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母、及脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母；大肠杆菌，梭菌属菌株，例如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、及发酵植物多糖梭菌；土芽孢杆菌属菌株；热厌氧杆菌属菌株，例如解糖热厌氧杆菌；芽孢杆菌属菌株，如凝结芽孢杆菌。
63.如段落50-62中任一项所述的方法，其中该发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖的微生物、利用***糖的微生物、以及共同利用木糖和***糖的微生物。
64.如段落50-63中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是一种能够共发酵葡萄糖和木糖的酵母属菌株，如酿酒酵母。
65.如段落50-64中任一项所述的方法，其中该发酵微生物表达木糖异构酶。

Claims (15)

1.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在一个容器中经受一种纤维素分解酶组合物和一种GH61多肽，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在0.5％至10％饱和度范围内。
2.如权利要求1所述的方法，其中使该纤维素材料进一步经受一种过氧化氢酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中过氧化氢酶的量处于0.5％至25％，例如，0.5％至20％、0.5％至15％、0.5％至10％、0.5％至7.5％、0.5％至5％以及0.5％至4％的总蛋白范围内。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，如至少50％、如至少75％过程中，糖化过程中的溶解氧浓度处于0.5％-10％饱和度范围内，如0.5％-7％、如0.5％-5％、如0.5％-4％、如0.5％-3％、如0.5％-2％、如1％-5％、如1％-4％、如1％-3％、如1％-2％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，进一步包括在糖化过程中添加一种碱，以将pH维持在约3.0至7.0范围内，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。
6.如权利要求5所述的方法，其中该碱选自下组，该组由以下各项组成：KOH、NaOH、Ca(OH)2以及NH4OH。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶、一种内切葡聚糖酶、和一种β-葡糖苷酶。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、一种内切葡聚糖酶、以及一种β-葡糖苷酶。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种木聚糖酶。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、一种木聚糖酶、以及一种β-木糖苷酶。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该容器包括超过10m3，如超过25m3，如超过50m3纤维素材料。
12.一种从纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
(a)根据如权利要求1-11中任一项所述的方法糖化该纤维素材料；并且
(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料。
13.如权利要求12所述的方法，进一步包括从(b)中回收发酵产物。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、或气体。
15.如权利要求14所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。
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