KR20200135469A - 자일로스 대사 효모 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 i) 자일룰로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1) 및 트랜스케톨라제 2 (TKL2)를 코딩하는 천연 유전자의 과다발현 및 ii) 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 기능적 이종 유전자의 발현 - 여기서 자일로스 이소머라제 (XI) 유전자는 티. 네아폴리타나, 에이. 안덴시스 및 씨. 클라리플라붐으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래됨 - 을 위한 하나 이상의 발현 구축물(들)로 형질전환된 미생물, 특히 효모에 관한 것이다. 본 발명은 또한 발현 구축물, 본 발명에 따른 미생물을 사용하여 펜토스 당을 발효시키는 방법 및 이러한 미생물을 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

자일로스 대사 효모
본 발명은 i) 자일룰로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1) 및 트랜스케톨라제 2 (TKL2)를 코딩하는 천연 유전자의 과다발현 및 ii) 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 기능적 이종 유전자의 발현 - 여기서 자일로스 이소머라제 (XI) 유전자는 써모토가 네아폴리타나 (Thermotoga neapolitana), 안디탈레아 안덴시스 (Anditalea andensis) 및 클로스트리듐 클라리플라붐 (Clostridium clariflavum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래됨 - 을 위한 하나 이상의 발현 구축물(들)로 형질전환된 미생물, 특히 효모에 관한 것이다. 본 발명은 또한 자일로스 이소머라제의 트랜스제닉 발현을 위한 발현 구축물, 본 발명에 따른 미생물을 사용하여 펜토스 당을 발효시키는 방법 및 이러한 미생물을 생성하는 방법에 관한 것이다.
자일로스는 헤미셀룰로스의 가수분해 생성물이며 리그노셀룰로스 가수분해액에서 당 단량체의 상당 부분을 구성한다. 에쉐리키아 콜리 (Escherichia coli)를 포함한 많은 유기체가 자연적으로 자일로스를 탄소원으로 활용할 수 있지만, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)는 그러한 능력이 없다. 그러나, 더 높은 성장 억제제 내성 및 일반적인 견고성은 효모를 생물공학 및 바이오연료 산업을 위한 공급 원료로서의 리그노셀룰로스 바이오매스의 활용에 더 우수한 후보가 되게 한다. 지난 20년 동안 세계 최대의 에탄올 생성자인 효모가 리그노셀룰로스 가수분해물에서 당의 최대 1/3을 구성하는 5개 탄소 당을 대사할 수 있도록 상당한 노력을 기울였다. 리그노셀룰로스 물질의 5개 탄소 당 중 자일로스가 주성분이다.
자일로스의 대사 플럭스로의 통합을 가능하게 하는 2가지의 택일적 경로가 자연에 존재한다 - 자일로스 리덕타제/자일리톨 데히드로게나제 (XR/XDH) 및 자일로스 이소머라제 (XI) (도 1) (참조 8). 두 공정 모두 자일룰로스를 생성하며, 이는 자일룰로스 키나제 (XKS) 및 펜토스 포스페이트 경로 (PPP)의 산화 단계에 의해 더욱 처리된다. XI 경로는 주로 원핵생물에서 발견되고 XR/XDH 경로는 진핵생물에서 발견되며, 이 규칙에 대한 예외가 존재한다. 경험 상, 이종 유전자 발현은 유전자 발현 및 단백질 성숙 기구 뿐만 아니라 이들 유기체가 서식하는 환경의 유사성 때문에 밀접하게 관련된 유기체에서 더 효율적이다 - 즉, 초호열균으로부터의 효소는 새로운 숙주가 접근할 수 없는 온도를 필요로 할 수 있다. 이는 XR/XDH 효소의 사용이 에스. 세레비지애에서 선호될 수 있음을 제시한다. 자일로스의 자일리톨로의 환원은 XR에 의해 촉매되며 보조인자로 NADPH가 필요하다. 자일리톨의 자일룰로스로의 산화는 XDH에 의해 촉매되고 NAD+로부터 NADH를 생성한다. 탄소원으로 자일로스의 신속한 사용은 동등하게 신속한 NADP 및 NADH 불균형을 야기시켜, 성장을 억제시킨다. 따라서, XR/XDH 경로를 이용하는 작업은 종종 자일로스 대사율이 낮은 균주를 생성하고 부생성물로 상당한 양의 자일리톨을 생성하여 결과적으로 생성물 수율을 감소시킨다 (참조 9).
자일로스 이소머라제를 통해 자일로스 대사를 조작하는 다른 택일적 경로는 하나의 효소만 필요하고 XR-XDH 경로를 통한 상기에서 언급된 바와 같은 보조인자 불균형 문제가 없기 때문에 간단해 보인다. 이 경로는 박테리아에서는 흔하지만 효모와 같은 진핵생물 종에서는 드물다. 혐기성 진균인 피로마이세스 (Piromyces) 종 E2는 활성 XI 효소를 발현하는 유전자를 보유하는 공지된 극소수의 종 중 하나이다. US　7,622,284 B2는 에스. 세레비지애에서 피로마이세스 종 XI를 발현하여 낮은 비율로 자일로스를 대사할 수 있는 효모 균주를 발생시키는 방법을 기재한다.
US 8,114,974 B2에 따라, 진균 자일로스 이소머라제 및 루미노코커스 플라베파시엔스 (Ruminococcus flavefaciens) 자일로스 이소머라제의 인접한 아미노산을 포함하는 키메라 효소는 사카로마이세스 세레비지애와 같은 숙주 세포에서 발현된다. US 7,943,366 B2는 피로마이세스 종 또는 실라마이세스 아베렌시스 (Cyllamyces aberensis)와 같은 진균 또는 박테리아, 즉 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron)로부터 유래될 수 있는 외인성 자일로스 이소머라제 유전자로 형질전환된 효모 세포에 관한 것이다. US 2011/0244525 A1에서 사카로마이세스 세포는 락토코쿠스 (Lactococcus) 종으로부터 유래된 자일로스 이소머라제로 형질전환되고, US 2011/0269180 A1에서 효모 세포 또는 사상 진균 세포는 클로스트리듐 피토페르멘탄스 (Clostridium phytofermentans)로부터 유래된 원핵생물 자일로스 이소머라제를 발현한다.
그러나, 박테리아 기원으로부터의 대부분의 자일로스 이소머라제 유전자의 발현은 에스. 세레비지애에서 활성 자일로스 이소머라제의 존재를 발생시키지 않으며 이에 대한 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않는다 (참조 10). 효모에서 발현되는 박테리아 기원으로부터의 XI 효소 중 일부만이 기능적으로 활성인 단백질을 생성하였지만 활성이 너무 낮아 자일로스에서 혐기성 성장을 지원할 수 없다. 따라서, 생물기반 화학물질 생성을 위한 탄소원으로 자일로스를 사용할 수 있도록 충분한 활성을 갖는 효모에서 발현될 수 있는 기능적 XI 효소를 식별할 필요성이 여전히 강하다.
또한, 사카로마이세스 세레비지애 펜토스 포스페이트 경로 (PPP)는 자일룰로스를 포함하는 펜토스 당을 위한 주요 대사 경로이다. 이는 해당 경로의 초기 단계와 병행하여 작용하여 펜토스 당으로부터 글리세르알데히드-3-포스페이트 및 프룩토스-6-포스페이트를 생성한다 (도 2). 우선적으로 대사될 수 있는 헥소스 당이 존재하는 경우, PPP는 주로 리보스 당을 생성하는데 필요하다. 자일로스를 높은 비율로 효율적으로 대사할 수 있는 효모 균주를 생성하기에는 기능적 XI 유전자의 발현이 충분하지 않을 수 있는데, 이는 펜토스 포스페이트 경로로 이를 통한 플럭스가 제한 요인이 될 수 있기 때문이다. 특히, D-자일룰로스를 D-자일룰로스-5-포스페이트로 전환하여 펜토스 포스페이트 경로로의 진입을 제공하는 자일룰로스 키나제 (XKS1) 및 트랜스케톨라제 TLK1 및 TLK2 뿐만 아니라 펜토스 포스페이트 경로의 트랜스알돌라제 (TAL1)가 이러한 맥락에서 매우 중요하다.
본 발명의 목적은 자일로스와 같은 펜토스 당의 효율적인 대규모 대사를 위한 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 펜토스 당, 특히 자일로스를 대사할 수 있고 에탄올과 같은 대사물을 높은 수율로 생성하는 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 종의 효모와 같은 억제제에 내성이 있고 일반적으로 견고한 미생물을 제공하는 것이다. 이러한 미생물은 생체내에서 높은 활성을 나타내고 원하는 생성물의 상당한 수율을 제공하는 외인성 자일로스 이소머라제를 발현해야 한다. 추가 목적은 하기의 명세서, 제공된 실시예 및 특히 첨부된 청구범위로부터 도출될 수 있다.
상기 확인된 목적은
i) 자일룰로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1) 및 트랜스케톨라제 2 (TKL2)를 코딩하는 천연 유전자의 과다발현 및
ii) 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 기능적 이종 유전자의 발현 - 여기서 자일로스 이소머라제 (XI) 유전자는 써모토가 네아폴리타나, 안디탈레아 안덴시스 및 클로스트리듐 클라리플라붐으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래됨 -
을 위한 하나 이상의 발현 구축물(들)로 형질전환된 미생물, 특히 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 종의 효모에 의해 충족된다.
상이한 박테리아 기원으로부터의 많은 자일로스 이소머라제 (XI) 유전자가 천연 자일룰로스 키나제 및 언급된 PPP 효소를 과다발현하는 사카로마이세스 세레비지애에서 시험되었다. XI 유전자 중 단지 3개, 즉 써모토가 네아폴리타나 (티. 네아폴리타나 (T. neapolitana)), 안디탈레아 안덴시스 (에이. 안덴시스 (A. andensis)) 및 클로스트리듐 클라리플라붐 (씨. 클라리플라붐 (C. clariflavum))만이 사카로마이세스 세레비지애에서 상당한 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 에이. 안덴시스로부터의 XI이 가장 활성적이다. 이미 상기에서 언급된 바와 같이, 박테리아 기원으로부터의 대부분의 XI 유전자가 활성 효소의 발현을 발생시키지 않는 이유는 이해되지 않는다. 따라서, 사카로마이세스 세레비지애에서 발현될 때 (활성이 조금이라도 있는 경우) 어떤 XI가 상당한 활성을 나타낼지를 예측하는 합리적인 접근법이 없는 것으로 보인다.
상술된 미생물은 바람직하게는 천연 자일로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1) 및 트랜스케톨라제 2 (TKL2)를 함유하여 펜토스 포스페이트 경로를 통해 펜토스 당을 도입 및 대사할 수 있는 특히 사카로마이세스 세레비지애 종의 효모 세포이다. 자일룰로스 키나제 (XKS1)는 ATP를 사용하여 D-자일룰로스를 D-자일룰로스-5-포스페이트로 인산화할 수 있는 효소이다 (EC 2.7.1.17). 트랜스알돌라제 1 (TAL1)은 세도헵툴로스-7-포스페이트 및 D-글리세르알데히드-3-포스페이트의 D-프룩토스-6-포스페이트 및 D-에리트로스-4-포스페이트로의 반응을 촉매한다 (EC 2.2.1.2). 트랜스케톨라제 1 및 2 (TKL1 및 TKL2)는 세도헵툴로스-7-포스페이트 및 글리세르알데히드-3-포스페이트를 형성하기 위해 D-자일룰로스-5-포스페이트로부터 D-리보스-5-포스페이트로 2-탄소 단편의 전달을 촉매할 뿐만 아니라 D-자일룰로스-5-포스페이트로부터 에리트로스-4-포스페이트로 2-탄소 단편의 전달을 촉매하여 프룩토스-6-포스페이트 및 글리세르알데히드-3-포스페이트를 산출한다 (EC 2.2.1.1). 자일로스 이소머라제 (XI)는 D-자일로스 및 D-자일룰로스의 상호전환을 촉매하고 많은 박테리아에서 발견된다 (EC 5.3.1.5).
본 발명의 맥락에서 발현 구축물은, 각각 발현될 하나 이상의 유전자가 뒤따르는, 하나 이상의 프로모터를 포함하는 핵산 서열이다. 프로모터는 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 핵산 서열이며 각각의 유전자(들)의 전사 시작 부위 근처에 위치된다. 발현될 각각의 유전자는 보통 터미네이터 서열이 뒤따른다. 과다발현이 가능한 프로모터는 바람직하게는 항상 활성인 구성적 프로모터이다. 본 발명의 맥락에서, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애의 천연 유전자는 적절한 프로모터의 제어 하에 배치함으로써 과다발현되며, 이는 각각의 내인성 유전자를 발현하는 비변형된 유기체에 대한 유전자의 발현을 증가시킨다.
대조적으로, XI 유전자의 카피는 비변형된 숙주 유기체인 사카로마이세스 세레비지애에 자연적으로 존재하지 않고 공여자 유기체로부터 유래된 트랜스진으로 도입되고 발현된다. 숙주 세포에서 트랜스진의 발현을 달성하기 위해, 트랜스진의 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 최적화된 코돈이고 숙주 세포로부터 유래된 프로모터 서열의 제어 하에 배치된다. 기능적 이종 유전자는 숙주 유기체에서 지정된 역할을 수행할 수 있는 효소의 발현을 이끈다.
XI 유전자가 유래되는 공여자 유기체는 박테리아이다. 써모토가 네아폴리타나는 온천 환경에서 발견될 수 있는 호열성 박테리아이다. 안디탈레아 안덴시스는 친알칼리성의 내염성 박테리아로 매우 알칼리성인 토양으로부터 단리되었다. 클로스트리듐 클라리플라붐은 셀룰로스를 대사할 수 있는 호열성 박테리아이다. 발현된 XI의 생체내 활성이 사카로마이세스 세레비지애에서 발현에 대해 시험된 유전자 중 가장 높기 때문에 안디탈레아 안덴시스의 XI 유전자가 본 발명의 맥락에서 특히 바람직하다.
바람직한 실시양태에 따라, 자일로스 이소머라제 (XI)는 서열식별번호 (SEQ ID No): 21, 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 25와 적어도 66%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 개시내용이 서로에 대한 핵산 또는 아미노산 서열의 동일성 백분율과 관련될 때마다, 이들 값은 핵산에 대해서는 EMBOSS 워터스 쌍별 서열 정렬 (EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments) (뉴클레오티드) 프로그램 (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html) 또는 아미노산 서열에 대해서는 EMBOSS 워터스 쌍별 서열 정렬 (단백질) 프로그램 (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/)을 이용하여 수득된 값을 정의한다. 본원에 사용된 정렬 또는 서열 비교는 서로 비교되는 2개의 서열의 전체 길이에 걸친 정렬을 지칭한다. 유럽 분자 생물학 실험실 (European Molecular Biology Laboratory: EMBL) 유럽 생물정보학 연구서 (European Bioinformatics Institute: EBI)에 의해 로컬 서열 정렬을 위해 제공된 도구는 변형된 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘을 이용한다 (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ and Smith, T.F. & Waterman, M.S. "Identification of common molecular subsequences" Journal of Molecular Biology, 1981 147 (1):195-197). 정렬을 수행할 때, EMBL-EBI에 의해 정의된 디폴트 파라미터가 사용된다. 이들 파라미터는 (i) 아미노산 서열의 경우: 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 오픈 패널티 = 10 및 갭 확장 패널티 = 0.5 또는 (ii) 핵산 서열의 경우: 매트릭스 = DNAfull, 갭 오픈 패널티 = 10 및 갭 확장 패널티 = 0.5이다.
서열식별번호: 21은 티. 네아폴리타나의 천연 XI 유전자의 핵산 서열에 상응하고, 서열식별번호: 5는 에이. 안덴시스의 천연 XI 유전자에 상응하고, 서열식별번호: 25는 씨. 클라리플라붐의 천연 XI 유전자에 상응한다. 각각 적어도 66%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열은 기능적 자일로스 이소머라제의 발현을 허용하는 한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 유전자는 각각의 공여자와 상이한 숙주 유기체에서 발현되기 때문에, 서열은 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 따라서, 상기 주어진 서열 동일성에 의해 커버되는 사카로마이세스 세레비지애에 대한 코돈-최적화로 인한 차이는 통상의 기술자에게 공지되어 있고 쉽게 식별될 수 있다.
바람직하게는, 자일로스 이소머라제 (XI)는 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 26에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 나타내어진다.
서열식별번호: 22는 티. 네아폴리타나로부터의 천연 XI의 아미노산 서열에 상응하고, 서열식별번호: 6은 에이. 안덴시스의 천연 XI에 상응하고, 서열식별번호: 26은 씨. 클라리플라붐의 천연 XI에 상응한다. 각각 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열은 기능적 자일로스 이소머라제를 구성하는 한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따라, 자일룰로스 키나제 (XKS1)는 서열식별번호: 74에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되고, 트랜스알돌라제 (TAL1)는 서열식별번호: 77에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되고, 트랜스케톨라제 1 (TKL1)은 서열식별번호: 80에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되고, 트랜스케톨라제 2 (TKL2)는 서열식별번호: 83에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
서열식별번호: 74, 77, 80 및 83은 사카로마이세스 세레비지애의 천연 XKS1 유전자, 천연 TAL1 유전자 및 천연 TKL1 및 TKL2 유전자의 핵산 서열에 상응한다. 각각 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열은 각각의 기능을 수행할 수 있는 효소의 발현을 허용하는 한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
추가의 바람직한 실시 양태에서, 자일룰로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1), 트랜스케톨라제 2 (TKL2) 및 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 유전자 각각은 구성적 프로모터의 제어 하에 있으며, 여기서 구성적 프로모터는 서열식별번호: 73에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 TDH3, 서열식별번호: 76에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 PGK1, 서열식별번호: 79에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 CYC19, 서열식별번호: 82에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 PFK1, 서열식별번호: 90에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 말단절단된 HXT7 및 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 TEF로부터 선택된다.
본 발명에 따른 발현 구축물의 유전자는 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애의 구성적 프로모터의 제어 하에 배치된다. 각각 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열은 본원에 기재된 유전자의 발현 또는 각각 과다발현을 촉진할 수 있는 한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
바람직하게는, XKS1 유전자는 TDH3 프로모터의 제어 하에 배치되고/되거나 TAL1 유전자는 PGK1 프로모터의 제어 하에 배치되고/되거나 TKL1 유전자는 CYC19 프로모터의 제어 하에 배치되고 TKL2 유전자는 PFK1 프로모터의 제어 하에 배치된다. 더욱 바람직하게는, XI 유전자는 말단절단된 HXT7 또는 TEF 프로모터의 제어 하에 배치된다. 유전자 및 프로모터의 이들 조합은 다른 조합보다 높은 발현 수준을 발생시켰다.
각각의 발현 구축물(들)에서, 상술된 유전자의 서열은 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 터미네이터 서열이 뒤따른다. 이러한 터미네이터 서열은 tDIT1 (서열식별번호: 75), tYHI9 (서열식별번호: 78), tEFM (서열식별번호: 81), tRPL15A (서열식별번호: 84), tTEF (서열식별번호: 87), tCYC1 (서열식별번호: 91) 및 tADH1 (서열식별번호: 94)로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, XKS1 다음에 DIT1 터미네이터가 오고/오거나 TAL1 유전자 다음에 YHI9 터미네이터가 오고/오거나 TKL1 유전자 다음에 EFM1 터미네이터가 오고, TKL2 유전자 다음에 RPL15A 터미네이터가 온다. 더욱 바람직하게는, XI 유전자 다음에 CYC1 터미네이터 또는 ADH1 터미네이터가 온다. 상기 명시된 유전자 및 프로모터와 상기 명시된 터미네이터의 조합은 특히 높은 발현 수준을 발생시켰다.
본 발명은 또한 티. 네아폴리타나, 에이. 안덴시스 및 씨. 클라리플라붐으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래된 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 유전자의 발현을 위한 발현 구축물에 관한 것으로서, 여기서 자일로스 이소머라제 (XI) 유전자는 사카로마이세스 세레비지애의 구성적 프로모터의 제어 하에 있다. 에이. 안덴시스로부터 유래되는 XI를 코딩하는 유전자가 특히 바람직하다.
바람직하게는, 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 유전자는 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 25에 대해 적어도 66%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 나타내어진다.
서열식별번호: 21은 티. 네아폴리타나의 천연 XI 유전자의 핵산 서열에 상응하고, 서열식별번호: 5는 에이. 안덴시스의 천연 XI 유전자에 상응하고, 서열식별번호: 25는 씨. 클라리플라붐의 천연 XI 유전자에 상응한다. 각각 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열은 기능적 자일로스 이소머라제의 발현을 허용하는 한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 유전자가 사카로마이세스 세레비지애에서 발현되도록 의도되기 때문에, 서열은 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애에 대해 최적화된 코돈이다. 상기 주어진 서열 동일성에 의해 커버되는 코돈-최적화로 인한 차이는 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
더욱 바람직하게는, 구성적 프로모터는 서열식별번호: 90에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 말단절단된 HXT7 및 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 TEF로부터 선택된다.
상술된 발현 구축물의 XI 유전자는 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애의 구성적 프로모터의 제어 하에 배치된다. 각각 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열은 기능적 XI의 발현을 촉진할 수 있는 한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다
본 발명은 또한 상술된 바와 같은 미생물을 펜토스 당(들)을 포함하는 배양 배지에서 펜토스 당(들)이 대사될 수 있는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 펜토스 당(들)을 발효시키는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 방법은 자일로스를 발효시키는 방법이다. 이미 상기에서 언급된 바와 같이, 자일로스는 헤미셀룰로스의 가수분해 생성물이며 리그노셀룰로스 가수분해액에서 당 단량체의 상당 부분을 나타낸다. 따라서, 생물공학 및 바이오연료 산업을 위한 공급 원료로 리그노셀룰로스 바이오매스를 사용하기 위해 자일로스를 발효시킬 수 있는 것이 특히 바람직하다.
특히 바람직한 실시양태에 따라, 배양 배지는 리그노셀룰로스 바이오매스 및/또는 그의 가수분해물을 포함하거나 그로 이루어진다.
펜토스 당 발효, 특히 자일로스 발효의 유용한 생성물은 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,4-부탄디올, 글리세린, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 카프로산, 팔미트산, 스테아르산, 옥살산, 말론산, 숙신산 또는 숙시네이트, 글루타르산, 올레산, 리놀레산, 글리콜산, 락트산 또는 락테이트, 감마-히드록시부티르산, 3-히드록시알칸산, 알라닌, 메탄, 에탄, 프로판, 펜탄, n-헥산, 피루베이트, 아스파르테이트, 말레이트, 발린, 류신 및 그의 조합이다. 바이오연료로 사용되는 것 외에도 많은 다른 용도가 있는 에탄올의 생성이 특히 바람직하다.
따라서, 상술된 방법에서 발효는 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,4-부탄디올, 글리세린, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 카프로산, 팔미트산, 스테아르산, 옥살산, 말론산, 숙신산 또는 숙시네이트, 글루타르산, 올레산, 리놀레산, 글리콜산, 락트산 또는 락테이트, 감마-히드록시부티르산, 3-히드록시알칸산, 알라닌, 메탄, 에탄, 프로판, 펜탄, n-헥산, 피루베이트, 아스파르테이트, 말레이트, 발린 및 류신으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 에탄올을 생성한다.
본 발명은 또한 바람직하게는 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 에탄올의 생성을 위한 펜토스 당(들), 특히 자일로스의 발효를 위한 상술된 미생물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미생물은 자일로스와 같은 펜토스 당(들)을 대규모로 효율적으로 발효시킬 수 있으므로 원하는 대사 대사물의 산업적 생성을 가능하게 한다. 유리하게는, 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 에탄올을 생성하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상술된 임의의 발현 구축물(들)로 사카로마이세스 세레비지애 균주를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 상술된 미생물을 생성하는 방법에 관한 것이다. 특히, 사카로마이세스 세레비지애 균주는
i) 자일룰로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1) 및 트랜스케톨라제 2 (TKL2)를 코딩하는 천연 유전자의 과다발현 및
ii) 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 기능적 이종 유전자의 발현 - 여기서 자일로스 이소머라제 (XI) 유전자는 티. 네아폴리타나, 에이. 안덴시스 및 씨. 클라리플라붐으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래됨 -
을 위한 발현 구축물(들)로 형질전환된다.
에이. 안덴시스로부터 유래되는 XI 유전자가 특히 바람직하다.
각각의 유전자 및 서열과 관련하여, 이전 설명이 그에 따라 적용된다.
발현 구축물은 플라스미드상에서 세포로 전달될 수 있고 플라스미드로부터 발현되거나 사카로마이세스 세레비지애 균주의 게놈으로 통합될 수 있다. 통상의 기술자는 적합한 형질전환 방법 및 관련 이점을 잘 알고 있다.
바람직한 실시양태에 따라, 발현 구축물은 사카로마이세스 세레비지애 균주의 염색체, 바람직하게는 16번 염색체에 통합된다. 16번 염색체에서 통합 부위를 표적화하는 PPP 경로의 바람직한 어셈블리는 도 4에 나타나 있다. 이 통합 부위가 이종 유전자에 대해 가장 높은 발현을 발생시켰다는 것이 문헌 (Flagfeldt, D.B., Siewers, V., Huang, L. and Nielsen, J. in "Characterization of chromosomal integration sites for heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae". Yeast, 26 (10), 545-551, 2009)에 의해 입증되었다. 도 4에 나타난 어셈블리에서, 카나마이신 내성 마커는 XI 통합 모듈로 대체될 수 있다.
추가의 바람직한 실시 양태에서, 상술된 자일로스 이소머라제 (XI)를 대한 발현 구축물은 자일룰로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1) 및 트랜스케톨라제 2 (TKL2)에 대한 천연 유전자의 과다발현을 위한 재조합 발현 구축물에 통합된다.
유리하게는, 이 실시양태는 한 단계의 형질전환을 가능하게 하는 모든 필요한 유전자를 함유하는 발현 구축물을 생성한다. 이러한 발현 구축물의 특히 바람직한 실시양태는 다음 실시예에서 설명된다. 그러나, 통상의 기술자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 상기 개시내용에 따른 변형이 가능하다.
도 1은 탄소원으로 자일로스를 소비하는 2가지 경로를 나타낸다. 자일로스는 자일로스 리덕타제 및 자일리톨 데히드로게나제 (A) 또는 자일로스 이소머라제 (B)에 의해 자일룰로스로 전환된다. 두 경로 모두 ATP를 소비하지만 자일로스 리덕타제 및 자일리톨 데히드로게나제도 NADPH를 활용하고 NADH를 생성하여 보조인자 불균형을 유발한다 (참조 8).
도 2는 사카로마이세스 세레비지애에서 펜토스 포스페이트 경로의 도식적 개요를 나타낸다.
도 3은 XKS1, TAL1, TKL1 및 TKL2의 과다발현을 위해 생성된 발현 카세트 단편을 나타낸다.
도 4는 사카로마이세스 실험실 균주 SEY6210의 16번 염색체에서 통합 부위를 표적화하는 KanR 선별 마커를 갖는 펜토스 포스페이트 경로 (PPP) 어셈블리를 나타낸다.
도 5는 RT-qPCR에 의한 XKS 및 펜토스 포스페이트 경로 (PPP) 발현을 나타낸다. SEY6210은 모 사카로마이세스 실험실 균주이며; CJY21 및 CJY22는 SEY6210을 XKS-PPP 과다발현 모듈로 형질전환함으로써 단리된 2개의 동질유전자계열 클론이다.
도 6은 말단절단된 HXT7 프로모터 하에서 자일로스 이소머라제의 과다발현을 위해 생성된 유전자 발현 카세트를 나타낸다.
도 7은 KanR 내성 마커를 후보 자일로스 이소머라제 모듈의 단일 카피로 대체하기 위해 생성된 통합 카세트를 나타낸다.
도 8은 37℃ 및 42℃에서 수행된 전체 세포 추출물을 사용한 자일로스 이소머라제 활성 검정 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 2에서 사용된 pRS426 발현 벡터를 나타낸다.
도 10은 30℃에서 20g/L 자일로스를 갖는 YEP 배지를 사용하고 200rpm에서 진탕하는 자일로스 상에서의 (형질전환된) 균주의 호기성 성장을 나타낸다.
도 11은 30℃에서 20g/L 자일로스를 갖는 YEP 배지를 사용하고 200rpm에서 진탕하는 자일로스 상에서의 (형질전환된) 균주의 혐기성 성장을 나타낸다.
도 12는 30℃에서 20g/L 자일로스를 갖는 YEP 배지를 사용하고 200rpm에서 진탕하는 호기성 (왼쪽 컬럼) 및 혐기성 (오른쪽 컬럼) 발효에서의 자일로스 소비를 나타낸다.
도 13은 30℃에서 20g/L 자일로스를 갖는 YEP 배지를 사용하고 200rpm에서 진탕하는 호기성 (왼쪽 컬럼) 및 혐기성 (오른쪽 컬럼) 발효에서의 에탄올 생성을 나타낸다.
실시예 1: XKS-PPP 발현 모듈의 구축
사카로마이세스 시험 균주는 효모 펜토스 포스페이트 경로를 과다발현하도록 조작되었다. 유전자 발현 카세트 단편은 TDH3 프로모터 하에서 XKS1, PGK1 프로모터 하에서 TAL1, CYC19 프로모터 하에서 TKL1 및 PFK1 프로모터 하에서 TKL2의 과다발현을 위해 생성되었다 (도 3).
XKS 발현 모듈의 구축: TDH3 프로모터는 서열식별번호: 29 및 서열식별번호: 30에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. XKS1 유전자의 코딩 영역은 서열식별번호: 31 및 서열식별번호: 32에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. DIT1 터미네이터는 서열식별번호: 33 및 서열식별번호: 34에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. 이어서, PCR 생성물은 컬럼 정제되고 깁슨 (Gibson) 등온 어셈블리 (참조 1)에 의해 SmaI-선형화된 pRS426 (참조 2) 벡터로 어셈블리되었다.
TAL1 발현 모듈의 구축: PGK1 프로모터는 서열식별번호: 35 및 서열식별번호: 36에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. TAL1 유전자의 코딩 영역은 서열식별번호: 37 및 서열식별번호: 38에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. YHI9 터미네이터는 서열식별번호: 39 및 서열식별번호: 40에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. 이어서, PCR 생성물은 컬럼 정제되고 깁슨 등온 어셈블리 (참조 1)에 의해 SmaI-선형화된 pRS426 (참조 2) 벡터로 어셈블리되었다.
TKL1 발현 모듈의 구축: CYC19 프로모터는 서열식별번호: 41 및 서열식별번호: 42에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. TKL1 유전자의 코딩 영역은 서열식별번호: 43 및 서열식별번호: 44에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. EFM1 터미네이터는 서열식별번호: 45 및 서열식별번호: 46에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. 이어서, PCR 생성물은 컬럼 정제되고 깁슨 등온 어셈블리 (참조 1)에 의해 SmaI-선형화된 pRS426 (참조 2) 벡터로 어셈블리되었다.
TKL2 발현 모듈의 구축: PFK1 프로모터는 서열식별번호: 47 및 서열식별번호: 48에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. TKL2 유전자의 코딩 영역은 서열식별번호: 49 및 서열식별번호: 50에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. RPL15A 터미네이터는 서열식별번호: 51 및 서열식별번호: 52에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. 이어서, PCR 생성물은 컬럼 정제되고 깁슨 등온 어셈블리 (참조 1)에 의해 SmaI-선형화된 pRS426 (참조 2) 벡터로 어셈블리되었다.
TKL1-XKS1 발현 모듈의 구축: TKL1 카세트는 서열식별번호: 53 및 서열식별번호: 54에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 TKL1 발현 모듈을 함유하는 pRS426 벡터로부터 PCR 증폭되었다. XKS1 카세트는 서열식별번호: 55 및 서열식별번호: 56에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 XKS1 발현 모듈을 함유하는 pRS426 벡터로부터 PCR 증폭되었다. 이어서, PCR 생성물은 컬럼 정제되고 깁슨 등온 어셈블리 (참조 1)에 의해 SmaI-선형화된 pRS426 (참조 2) 벡터로 어셈블리되었다.
TKL2-TAL1 발현 모듈의 구축: TKL2 카세트는 서열식별번호: 59 및 서열식별번호: 60에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 TKL2 발현 모듈을 함유하는 pRS426 벡터로부터 PCR 증폭되었다. TAL1 카세트는 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 TAL1 발현 모듈을 함유하는 pRS426 벡터로부터 PCR 증폭되었다. 이어서, PCR 생성물은 컬럼 정제되고 깁슨 등온 어셈블리 (참조 1)에 의해 SmaI-선형화된 pRS426 (참조 2) 벡터로 어셈블리되었다.
XKS-PPP 발현 모듈의 구축: The TKL1-XKS1 카세트는 서열식별번호: 61 및 서열식별번호: 62에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 TKL1-XKS1 발현 모듈을 함유하는 pRS426 벡터로부터 PCR 증폭되었다. KanR 선별 마커 (서열식별번호: 86)는 서열식별번호: 63 및 서열식별번호: 64에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 pRS42K (참조 1)로부터 PCR 증폭되었다. TAL1-TKL2 카세트는 서열식별번호: 65 및 서열식별번호: 66에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 TAL1-TKL2 발현 모듈을 함유하는 pRS426 벡터로부터 PCR 증폭되었다. 이어서, PCR 생성물은 컬럼 정제되고 깁슨 등온 어셈블리 (참조 1)에 의해 SmaI-선형화된 pRS426 (참조 2) 벡터로 어셈블리되었다.
XKS-PPP 16번 염색체 통합 모듈의 구축: 사카로마이세스 실험실 균주 SEY6210의 16번 염색체를 표적화하는 5' 상동성 아암, CHR16-업 (서열식별번호: 88)은 서열식별번호: 69 및 서열식별번호: 70에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 증폭되었다. PPP-KanR 모듈은 서열식별번호: 67 및 서열식별번호: 68에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 PPP-KanR을 함유하는 pRS426 벡터로부터 증폭되었다. 사카로마이세스 실험실 균주 SEY6210의 16번 염색체를 표적화하는 3' 상동성 아암, CHR16-다운 (서열식별번호: 89)은 서열식별번호: 71 및 서열식별번호: 72에 의해 식별되는 프라이머를 사용하여 SEY6210 게놈 DNA로부터 증폭되었다. PCR 생성물을 컬럼 정제하고 깁슨 등온 어셈블리 (참조 1)에 의해 SmaI-선형화된 pRS426 (참조 2) 벡터로 어셈블리하였다. 상동성 아암, PPP 및 KanR 마커를 함유하는 통합 카세트를 BamHI 및 SalI으로 플라스미드 백본에서 분리하여 선형 재조합 카세트를 생성한 후 (도 4) SEY6210으로 형질전환하였다. 형질전환체를 스크리닝하여 동질유전자계열 클론 CJY21 및 CJY22가 생성되었다. XKS 및 PPP 유전자의 과다발현은 RT-qPCR에 의해 확인되었다 (도 5).
실시예 2: XI 후보 스크리닝
총 14개의 자일로스 이소머라제 효소 후보는 뉴클레오티드 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 및 27로부터 단백질 서열 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 및 28로 판독되며, 사카로마이세스에 코돈-최적화되고, 합성된다 (IDT). 이어서, 이들 합성된 후보 유전자는 말단절단된 구성적 HXT77-391 (참조 3) 프로모터 (서열식별번호: 90) 및 에스. 세레비지애로부터의 CYC1 터미네이터 (서열식별번호: 91)의 제어 하에 pRS4272로 클로닝된다 (도 6).
HXT7 프로모터-XI 유전자-CYC1 터미네이터 카세트는 PPP 카세트의 KANR 마커의 5' 말단에 있는 TEF 프로모터와 상동성인 TEF 프로모터 (서열식별번호: 87), NATR 내성 마커 (참조 4) (서열식별번호: 93), ADH1 터미네이터 (서열식별번호: 94) 및 PPP 카세트의 KANR 마커의 3' 말단과 상동성인 표적-다운 서열 (서열식별번호: 92)을 갖는 통합 벡터에 추가로 서브클로닝되었다 (도 7). 이어서, 통합 모듈은 CJY21로 형질전환되어 KANR 내성 마커를 후보 자일로스 이소머라제 모듈의 단일 카피로 대체하였다.
자일로스 이소머라제 후보는 시험관내에서 효소 활성에 대해 검정되었다. 균주를 5 ml의 YPD에서 밤새 성장시키고, 수거하고, 세척하고, XI 검정 용해 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.01% 트리톤 X-100, 10 mM MgCl2, 50 μM CoCl2, 50 μM MnCl2, 피어스 (Pierce) 프로테아제 억제제 [피어스 88666] 포함)에서 기계적 비드 비팅 (MP 바이오메디컬 패스트프렙(MP Biomedical Fastprep))에 의해 용해시켰다. 단백질 농도는 브래드퍼드 (Bradford) 검정 (참조 5)에 의해 결정되었다. 50 μl의 정화된 전체-세포 추출물 (WCE)을 50 μl의 100 mM D-자일로스와 함께 각각 37℃ 및 42℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 다음, 95℃로 5분 동안 가열하여 중단시키고 원심분리로 제거하였다.
자일룰로스의 정량화는 소르비톨 데히드로게나제 (SDH)-기반의 NADH-연결된 검정 (참조 6)에 의해 수행되었다. 96-웰 플레이트 (코닝 (Corning) # 3635)에서 SDH 완충제 (메가짐스 (Megazymes)) 및 150 μM NADH를 총 부피 200 μl로 10 μl의 검정된 당 용액과 조합하고, 혼합한 다음, A340에 대해 스캐닝하였다. 3.5 μl의 SDH 용액 (메가짐스)을 첨가하고, 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 A340에 대해 다시 스캐닝하였다. 검정 용액의 NADH 농도를 A340 (6220 M-1 cm-1) 및 경로 길이 0.58 cm에서 흡광 계수를 사용하여 결정한 다음, 자일룰로스 농도를 계산하는데 사용하였다. 이어서, D-자일로스의 자일룰로스로의 효소적 전환에 대한 자일로스 이소머라제 반응 속도 [μmole/min/mg WCE]를 계산하였다. 3개의 후보를 사카로마이세스에서 발현 시 시험관내 자일로스 이소머라제 활성으로 식별하였다 (도 8).
이어서, 티. 네아폴리타나 (서열식별번호: 22), 에이. 안덴시스 (서열식별번호: 6) 및 씨. 클라리플라붐 (서열식별번호: 26)으로부터의 초기 스크린에서 강력한 활성을 나타내는 XI 후보는 강력한 구성적 pTEF 프로모터 (서열식별번호: 85)의 제어 하에 pRS426 (도 9)으로 서브클로닝되었다.
이어서, 이들 플라스미드는 CJY21로 형질전환되고, 성장은 YEP + 20g/l D-자일로스에서 호기성 진탕 플라스크 (도 10) 및 혐기성 가압 병 (도 11)에서 600 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 자일로스 소비 및 에탄올 형성은 또한 48시간의 발효 시간에서 HPLC로 모니터링되었다 (에이. 안덴시스의 경우, 120시간 샘플도 에탄올 생성에 대해 측정됨) (도 12 및 13).
티. 네아폴리타나 (서열식별번호: 22), 에이. 안덴시스 (서열식별번호: 6) 및 씨. 클라리플라붐 (서열식별번호: 26)으로부터의 XI를 발현하는 pRS426 발현 벡터를 함유하는 균주 CJY21에 대한 효소 동역학을 30℃에서 30분 반응에서 50 mM, 25 mM, 5 mM 및 1 mM의 D-자일로스 농도를 사용하여 상기와 같이 반복하였다. Vmax는 미하엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 운동 방정식을 사용하여 계산되었으며, 문헌으로부터 취한 피로마이세스 종 및 클로스트리듐 피토페르멘타스 (Clostridium phytofermentas) 자일로스 이소머라제에 대한 참조 XI 활성과 함께 표 1에 나타낸다.
<표 1>
Figure pct00001
참조문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Xylose metabolizing yeast <130> PF170268 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1320 <212> DNA <213> Thermonanaerobacterium xylanolyticum <400> 1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaacaat 60 ccttattctt ttaaatttta caatcctgag gaagtaatcg atggtaagac gatggaggag 120 catcttcgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt 180 ggcaaagcta ccatgcaaag gccatggaat cactatacag atcctatgga catagctaaa 240 gcaagggtag aggcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccgta tttctgcttc 300 catgatagag atattgcccc tgaaggagac actcttagag agacgaacaa aaatttagat 360 acaatagttg ctatgataaa ggattacttg aagaccagca agacgaaagt tttgtggggt 420 actgcgaatc ttttctccaa tccaagattt gtgcatggtg catcaacgtc ttgcaatgcc 480 gatgttttcg catattctgc atcacaagtc aaaaaagcac ttgagattac taaggagctt 540 ggtggcgaaa actacgtatt ctggggtgga agagaaggat atgagacact tctcaataca 600 gatatggagt ttgagcttga taattttgca agatttttgc acatggctgt tgattatgca 660 aaggaaatcg gctttgaagg ccagctcttg 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His Leu Arg Phe Ser Ile Ala Tyr 35 40 45 Trp His Thr Phe Thr Ala Asp Gly Thr Asp Gln Phe Gly Lys Ala Thr 50 55 60 Met Gln Arg Pro Trp Asn His Tyr Thr Asp Pro Met Asp Ile Ala Lys 65 70 75 80 Ala Arg Val Glu Ala Ala Phe Glu Phe Phe Asp Lys Ile Asn Ala Pro 85 90 95 Tyr Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Asp Thr Leu 100 105 110 Arg Glu Thr Asn Lys Asn Leu Asp Thr Ile Val Ala Met Ile Lys Asp 115 120 125 Tyr Leu Lys Thr Ser Lys Thr Lys Val Leu Trp Gly Thr Ala Asn Leu 130 135 140 Phe Ser Asn Pro Arg Phe Val His Gly Ala Ser Thr Ser Cys Asn Ala 145 150 155 160 Asp Val Phe Ala Tyr Ser Ala Ser Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile 165 170 175 Thr Lys Glu Leu Gly Gly Glu Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly Arg Glu 180 185 190 Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Met Glu Phe Glu Leu Asp Asn 195 200 205 Phe Ala Arg Phe Leu His Met Ala Val Asp Tyr Ala Lys Glu Ile Gly 210 215 220 Phe Glu Gly Gln Leu Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys 225 230 235 240 His Gln Tyr Asp Phe Asp Val Ala Asn Val Leu Ala Phe Leu Arg Lys 245 250 255 Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Val Asn Ile Glu Ala Asn His Ala 260 265 270 Thr Leu Ala Phe His Asp Phe Gln His Glu Leu Arg Tyr Ala Arg Ile 275 280 285 Asn Gly Val Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Thr Gly Asp Met Leu Leu 290 295 300 Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asp Ile Arg Met Thr Thr Leu 305 310 315 320 Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Met Gly Gly Phe Asp Lys Gly Gly Leu 325 330 335 Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Phe Glu Pro Glu Asp Leu 340 345 350 Phe Leu Gly His Ile Ala Gly Met Asp Ala Phe Ala Lys Gly Phe Lys 355 360 365 Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Phe Asp Lys Phe Ile Glu 370 375 380 Glu Arg Tyr Ala Ser Tyr Lys Asp Gly Ile Gly Ala Asp Ile Val Ser 385 390 395 400 Gly Lys Ala Asp Phe Arg Ser Leu Glu Lys Tyr Ala Leu Glu His Ser 405 410 415 Gln Ile Val Asn Lys Ser Gly Arg Gln Glu Leu Leu Glu Ser Ile Leu 420 425 430 Asn Gln Tyr Leu Phe Ala Glu 435 <210> 3 <211> 1320 <212> DNA <213> Pseudobacteroides cellulosolvens <400> 3 atgtcagaat tttttagtaa tgtttcaaag attcaatatg aaggtaagaa ctctgataat 60 ccattggctt ttaagtatta taacccagat gaggttatag gcggaaagac aatgaaggat 120 catttgagat tcgcagttgc ttactggcat acattccagg gaacaggcgg agatccattc 180 ggacctggta cagcagtaag accatgggac aatataacag atccaatgga acttgctaaa 240 gcaaaagtag ctgcaaactt cgagttctgt gaaaaattag gtgtaccgtt ctactgtttc 300 catgacaggg atatagcacc tgaagcttca actcttagag aaacaaataa gagacttgat 360 gaaatagttg ctcttatgaa ggaatatatg aaaaccagca gtgttaagct cctctgggga 420 actacaaatg cattcggtaa cccaagattt gtacacggtg cttcaacatc accaaatgcc 480 gatgtttttg catttgcagc agctcaggtt aaaaaagcaa tggaaataac tttagagctt 540 ggcggacaga actatgtatt ctggggtgga agagaaggtt atgagaccct attaaacaca 600 gacatgaagc ttgagcttga caacatggga agattcttaa gaatggctgt tgattacgca 660 aaagaaatag gctttaaagg acaattcctc attgaaccaa agccgaagga acctacaaaa 720 caccagtatg atttcgatac agctacagtt gttggtttct taagagctca tggtcttgaa 780 aacgatttca agatgaacat agaagcaaac catgctaccc ttgctgctca taccttccag 840 catgaagtat atactgcaag agtaaacaat 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Phe Glu Phe Cys Glu Lys Leu Gly Val Pro 85 90 95 Phe Tyr Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Ala Ser Thr Leu 100 105 110 Arg Glu Thr Asn Lys Arg Leu Asp Glu Ile Val Ala Leu Met Lys Glu 115 120 125 Tyr Met Lys Thr Ser Ser Val Lys Leu Leu Trp Gly Thr Thr Asn Ala 130 135 140 Phe Gly Asn Pro Arg Phe Val His Gly Ala Ser Thr Ser Pro Asn Ala 145 150 155 160 Asp Val Phe Ala Phe Ala Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Met Glu Ile 165 170 175 Thr Leu Glu Leu Gly Gly Gln Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly Arg Glu 180 185 190 Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Met Lys Leu Glu Leu Asp Asn 195 200 205 Met Gly Arg Phe Leu Arg Met Ala Val Asp Tyr Ala Lys Glu Ile Gly 210 215 220 Phe Lys Gly Gln Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys 225 230 235 240 His Gln Tyr Asp Phe Asp Thr Ala Thr Val Val Gly Phe Leu Arg Ala 245 250 255 His Gly Leu Glu Asn Asp Phe Lys Met Asn Ile Glu Ala Asn His Ala 260 265 270 Thr Leu Ala Ala His Thr Phe Gln His Glu Val Tyr Thr Ala Arg Val 275 280 285 Asn Asn Val Phe Gly Ser Ile Asp Ala Asn Gln Gly Asp Leu Leu Leu 290 295 300 Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asn Ile Tyr Asp Thr Thr Leu 305 310 315 320 Cys Met Tyr Glu Val Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Thr Gly Gly Leu 325 330 335 Asn Phe Asp Ser Lys Val Arg Arg Gly Ser Phe Glu Pro Ile Asp Leu 340 345 350 Phe Tyr Ala His Ile Ala Gly Met Asp Ala Phe Ala Lys Gly Leu Lys 355 360 365 Ile Ala Tyr Lys Met Val Ser Glu Gly Lys Phe Asp Lys Val Ile Glu 370 375 380 Asp Arg Tyr Ala Ser Tyr Lys Ser Gly Ile Gly Ser Asp Ile Val Asn 385 390 395 400 Gly Lys Val Gly Phe Lys Glu Leu Glu Lys Tyr Ala Leu Glu His Asp 405 410 415 Gln Val Lys Asn Val Ser Gly Arg Gln Glu Val Leu Glu Ser Met Leu 420 425 430 Asn Lys Tyr Ile Leu Glu Asp 435 <210> 5 <211> 770 <212> DNA <213> Anditalea andensis <400> 5 atgtctaaaa cctattttcc atcaattgaa aaaattaaat tcgaaggaag ggattccaaa 60 aatccttttg ctttcaaatt ttacgatgaa aaccgtgtag tagggggtaa aagcatgaag 120 gagcacttca agtttgccat cgcatactgg cattcattca atgccaaagg ggatgatcct 180 tttggtccag gaaccaaaac ttttgaatgg 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50 55 60 Thr Lys Thr Phe Glu Trp Asp Glu Ser Ser Asp Ala Val Gln Arg Ala 65 70 75 80 Lys Asp Lys Met Asp Ala Ala Phe Glu Phe Ile Gln Lys Ile Gly Ala 85 90 95 Pro Tyr Tyr Cys Phe His Asp Val Asp Leu Val Asp Glu Gly Asp Ser 100 105 110 Ile Glu Glu Tyr Glu Arg Arg Met Lys Ala Ile Val Glu Tyr Ala Lys 115 120 125 Gln Lys Gln Gln Asp Thr Gly Ile Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala Asn 130 135 140 Val Phe Ser Asn Pro Arg Tyr Met Asn Gly Ala Ser Thr Asn Pro Asp 145 150 155 160 Phe Asn Val Val Ser Trp Ala Ala Thr Gln Val Lys Asn Ser Ile Asp 165 170 175 Ala Thr Ile Ala Leu Gly Gly Glu Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly Arg 180 185 190 Glu Gly Tyr Met Ser Leu Leu Asn Thr Asp Met Lys Arg Glu Thr Glu 195 200 205 His Leu Ala Gln Phe Leu Thr Met Ala Arg Asp Tyr Ala Arg Gln Gln 210 215 220 Gly Phe Lys Gly Asn Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Met Glu Pro Thr 225 230 235 240 Lys His Gln Tyr Asp Phe Asp Ser Ala Thr Val Ala Gly Phe Leu Arg 245 250 255 Leu Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Phe Lys Leu Asn Ile Glu Val Asn His 260 265 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780 cgtcagtacg acctgctggg tgattttaaa ctgaacctgg aagttaacca tgctacgctg 840 gccggacata ccttccagca tgagctgcag gtggctgctg atgccggaat gctgggctct 900 attgatgcca accgcggcga cgaacaaaat ggctgggata cagaccagtt tccaaacaac 960 atcaatgagg ttacagaatc catgctgatc atcctggaag cagggggcct gcaaggtggg 1020 ggtataaatt tcgatgccaa gatccgcagg aattcaacgg atccggccga ccttttccat 1080 gcacatattg gtggaatgga tattttcgcc cgggccctga ttaccgccga ccgcatcctt 1140 cagcattctg aatacaaaaa aataagggca gaaagatatg cgtcttacga cagtggaaaa 1200 ggcaaagcct ttgaagaagg gagcttaagc ctggaagacc tgcgcgatta tgcagtggca 1260 cagggcgaac cgcaaaccat cagcggcaaa caggaattcc tggaaaacct gatcaacagg 1320 tatatttaa 1329 <210> 16 <211> 442 <212> PRT <213> Pedobacter heparinus <400> 16 Met Thr Lys Leu Thr Ala Asp Asn Glu Tyr Phe Lys Gly Ile Gly Gln 1 5 10 15 Ile Ser Phe Glu Gly Gln Glu Thr Asp Asn Pro Leu Ala Phe Arg Trp 20 25 30 Tyr Asn Pro Glu Gln Val Val Ala Gly Lys Lys Met Lys Glu His Leu 35 40 45 Arg Phe Ala Gly Ala Tyr Trp His Ser Phe Cys Gly Asn Gly Thr 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cgaacgaggg tctcgacgca 120 ctcgagtatg aggcggtgcg cggcgtgcgt atcagcgaga agaaggctgt tgagataaag 180 agggctgcct tggagcacgg tatccttctc tcgatgcacg cgccctactt catcaaccta 240 gcgtcgccca acgaggacac cgttaagaag agccaacaga ggcttctcga cgcgctcaag 300 gcggctaact ggatgggcgc ctatgtggtc gtcttccacc cgggctacta caaggacaac 360 ccgagtaaag aagccgccct caagagggtg atcgagaacc tgaagcccgt tgtagagcag 420 gctaagcagc tcgggatcaa gggtgtcgag ctgggccccg agactaccgg gaagagagcc 480 caggtcggcg atatagacga ggtgatcaca atctgcaggg aggttgagat gtgccgcccg 540 gtggtagact gggcgcacat ctacgccagg taccggggcc aacacgtgac cagcatcgac 600 caggtgctca aggtgataga gaagattgag aaggagcttg ggagtcgcgc tgtcaacccg 660 ctacacactc acttctcgcg catcgagtac ggggagggag gagagaggga gcaccatacg 720 ctcgacgagg cggagtatgg accggagttt aggatagtgt gtgaggctta caaacaagcc 780 gggatacgcg cagtgataat ctcggagagc ccgatactag accaggacgc actcaagatg 840 aagaagattt gttgcgagga gctaggctac tgctag 876 <210> 18 <211> 291 <212> PRT <213> Pyrolobus fumarii <400> 18 Val Gly Gly Pro Leu Val Pro 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ctttgaaatg catccgggct tcgtcgtcta caacccggaa 540 acgctcctca aactgcgcga acacgtcggt gaagcgatcg gcgccaactt tgacccgagc 600 cacttgcttt ggcaaggcat cgacccggtt gaggcgatca aactgctcgg ccgcgaaaaa 660 gcgattttcc acgtccatgc gaaagacacg tacttagacg aagcgaacat ccgcaaaaac 720 ggcgtgctcg atacgaaaca ttacagccaa attctcgatc gctcatgggt gttccgcacc 780 gtcggctacg ggcaaagcga aaaaatgtgg cgcgacatcg tcagcgccct gcgcgccgtc 840 ggctacgact acgtgctgtc aatcgaacac gaagatatgc tcgcttcgat cgatgaaggg 900 ctgtcaaagg ccgtcgccct cttgaaaaag gtgttgttca aagaagaact gccggagatg 960 tggtgggcat aa 972 <210> 20 <211> 323 <212> PRT <213> Geobacillus species <400> 20 Met Lys Val Gly Val Phe Thr Val Leu Tyr Gln Gln Leu Pro Leu Glu 1 5 10 15 Asp Met Leu Asp Lys Val Ala Ala Met Gly Ile Glu Ala Val Glu Leu 20 25 30 Gly Thr Gly Asn Tyr Pro Gly Ser Ala His Cys Asp Pro Asp Ala Leu 35 40 45 Leu Asp Gln Pro Glu Asn Ile Lys Ala Leu Lys Lys Ala Val Ala Asp 50 55 60 Arg Gly Leu Val Ile Ser Ala Leu Ser Cys His Gly Asn Pro Leu His 65 70 75 80 Pro Asp Lys 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gtttcaccgg acagttcctc atcgaaccaa aaccgaaaga acccaccaaa 720 caccagtacg acttcgacgt tgcaaccgcc tatgccttcc tgaagagcca cggtctcgat 780 gaatacttca aattcaacat cgaggcaaac cacgccacac tcgccggtca caccttccag 840 cacgaactga gaatggcaag gatccttgga aaactcggaa gcatcgatgc aaaccaggga 900 gaccttcttc ttggatggga caccgatcag ttcccaacaa acgtctacga tacaaccctt 960 gcaatgtacg aagtgataaa agcgggaggc ttcacaaaag gtgggctcaa cttcgatgcg 1020 aaggtgagga gggcttctta caaagtggag gacctcttca tagggcacat agcgggaatg 1080 gacacctttg cactcggttt caaggtggca tacaaactcg tgaaggatgg tgttctggac 1140 aaattcatcg aagaaaagta cagaagtttc agggagggca ttggaaggga catcgtcgaa 1200 ggtaaagtgg attttgaaaa acttgaagag tatataatag acaaagaaac gatagaactt 1260 ccatctggaa agcaagaata cctggaaagc ctcatcaaca gttacatagt gaagaccatt 1320 ctggaactga ggtga 1335 <210> 22 <211> 444 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <400> 22 Met Ala Glu Phe Phe Pro Glu Ile Pro Lys Val Gln Phe Glu Gly Lys 1 5 10 15 Glu Ser Thr Asn Pro Leu Ala Phe Lys Phe Tyr Asp Pro Glu Glu Ile 20 25 30 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Thermotoga maritima <400> 23 gtgtggacca ttctgtgcga taaagatagc ggaggagttc tcttgagaaa aggtgtatcc 60 acgagcatca taagaagcaa tcccgatctg cttgaagcac tcccgaaagc agaactttac 120 gaactgggtt ttttcaaggc ggaagacttc gagaaggtcc tccgcttttt tcacgacaaa 180 aattttggaa tccacgctcc tttcatctac aggtacagat accaccatcc gaatccgacc 240 tctctgaacg aggaagaaag agaggacacc ttttctgtga acaaaaaatg cgctgagctt 300 gccaggaaga tcggcgcaga atacatgata attcacttcc caaatgccct tcagaaagaa 360 aactggcttt ctgtttacag agaggtggag agagaattct ccgagcttgc gggtgtcatc 420 agcgttcgag tggagaacgt ttatggaaac gatcatttcc actccgctga agattacagg 480 acctttcttg aaaacacagg ttgtaagatg tgcgttgaca tcggccatct tcttctagac 540 gctgaggttt acggtttttc tcccatcgaa ttcatagaaa aactctctga ttttgtagaa 600 gaatttcaca tttacacgcg gatttcgaaa cctacaaaaa tgccatcacg ctccctgggg 660 tga 663 <210> 24 <211> 220 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 24 Val Trp Thr Ile Leu Cys Asp Lys Asp Ser Gly Gly Val Leu Leu Arg 1 5 10 15 Lys Gly Val Ser Thr Ser Ile Ile Arg Ser Asn Pro Asp Leu 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aatatcaaaa atacagtatg aaggaaagga ttcagacaat 60 cctttagcct ttaagtacta taatcctgat gaggttgtcg gagacaagac aatgaaagaa 120 cacctcaggt ttgctgttgc ttattggcat acattccagg gcacaggagc agacccattc 180 ggtgtaggca cagctcaaag accgtgggaa aatattactg atccaatgga tttggcaaaa 240 gcaaaggtag aagctaactt tgaattttgt gaaaagttag gggttccttt cttctgcttc 300 catgacagag atatagctcc tgaagctgac aatctcagag agacaaataa aagacttgat 360 gagattgtag cagtaataaa ggatcgcatg aagaacagcc ctgtaaaact tctctgggga 420 acaaccaatg cgtttggcaa tccaagattt gttcatgggg cttcaacttc tccaaatgca 480 gatgtatttg catatgcagc tgcccaagta aagaaagcta tggagataac taaggaactt 540 ggcggtcaga actatgtatt ctggggcgga agagaaggtt atgagacact gctcaatacc 600 gatatgaagc ttgagttgga caatatggca agattcttaa gaatggctgt ggaatataaa 660 aaggaaatag gatttgacgg ccagctctta attgagccta agccaaagga acctacaaaa 720 catcagtatg attttgatac tgctacagtg atcggattct tgagaaccta cggacttgaa 780 aaagaattta aaatgaacat tgaggctaac catgctaccc tcgctgctca cacattccag 840 catgaactta gggtggcagc tataaacaat gcattaggaa gcattgacgc aaatcagggt 900 gacttgttgt taggatggga tactgaccaa ttcccgacaa acttatatga tacaaccctc 960 gcaatgtatg aagtattgaa ggccggcgga tttacaaaag gcggtttgaa ctttgactcg 1020 aaagtgagaa gaggttcctt tgaaccggtt gatctcttct atgctcatat tgcaggtatg 1080 gatgcttttg caagaggctt gaaagttgct tacaagatgc ttcaggacgg taaatttgaa 1140 aagttcattg aagaaagata ccagagctat aagaccggaa tcggaaaaga tattgttgaa 1200 ggaaaagttg gatttaaaga actcgaaaag tatgttttag agcttgaaac ggtaaaaaat 1260 acatccggta ggcaggaagt tcttgaagca atgttgaata aatatattat tgaaagctaa 1320 <210> 26 <211> 439 <212> PRT <213> Clostridium clariflavum <400> 26 Met Ser Glu Tyr Phe Lys Gly Ile Ser Lys Ile Gln Tyr Glu Gly Lys 1 5 10 15 Asp Ser Asp Asn Pro Leu Ala Phe Lys Tyr Tyr Asn Pro Asp Glu Val 20 25 30 Val Gly Asp Lys Thr Met Lys Glu His Leu Arg Phe Ala Val Ala Tyr 35 40 45 Trp His Thr Phe Gln Gly Thr Gly Ala Asp Pro Phe Gly Val Gly Thr 50 55 60 Ala Gln Arg Pro Trp Glu Asn Ile Thr Asp Pro Met Asp Leu Ala Lys 65 70 75 80 Ala Lys Val Glu Ala Asn Phe Glu Phe Cys 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catgggatat cggaaatgat 240 cctgtgacca gagcaatgca taagatggat gcaggctttg aattcatgtc taaaatgggc 300 ttcaattatt actgtttcca tgatatcgat ttggtagacc ccgccaataa ttggaaagac 360 tatgagaaga atatgcagac tattgtggag tatgcaaaac aaaagcagaa ggaaacagga 420 attaaacttt tatggggaac agcaaatgtt ttcacgcatg aaagatacat gaatggagct 480 tctaccaatc ccaattttga tgttgtagcc tgcgcaggaa cccaggtgaa aaattcaata 540 gatgccacca ttgcacttgg aggtgaaaac tatgttttct ggggtggaag agaaggatat 600 atgagtcttt taaataccga tatgaagcgt gaaaaagatc atctggcccg tttcctttcc 660 atgtcgagag attatgcccg tcagcaagga tttaaaggaa ctttccttat tgaacctaaa 720 ccaatggagc ctaccaaaca tcagtatgat tatgactctg aaaccgtaat cggattcctg 780 agacactatg gactagacaa agactttaaa ctgaatatcg aagtgaatca tgctacattg 840 gcaggtcata catttgaaca tgaacttcag gttgctgttg atgcagggct tttaggaagt 900 attgatgcga acagaggaga ttatcaaaac ggctgggata cggatcagtt tccgatcgat 960 tattatgata tggttcaggc atggttggta ctgcttccgg caggaggtct gggaaccgga 1020 ggcgtaaact ttgatgccaa aatcagaaga aattctattg atgctgaaga tttattcatt 1080 tctcatattt caggaatgga tgtattcgct aaaggtcttc ttgcggcagc ggatattttt 1140 gaaaattcgg attacaaaaa actgaaaaca aaccgttatg cttcttttga taacggaagt 1200 ggaaaagcat tcgaggaagg tacgcttacc ttggaagatc ttcagagaat tgctcacgaa 1260 ataggcgaac cacagccaaa aagcggaaaa caggaactgt ttgaggccat cgtgaatatg 1320 tatatataa 1329 <210> 28 <211> 442 <212> PRT <213> Chryseobacterium sp. <400> 28 Met Asn Thr Leu Thr Gly Thr Lys Glu Phe Phe Thr Gly Ile Glu Lys 1 5 10 15 Ile Lys Phe Glu Gly Lys Glu Ser Arg Asn Pro Leu Ala Phe Arg Tyr 20 25 30 Tyr Asp Ala Glu Lys Ile Val Met Gly Lys Pro Met Lys Asp Trp Thr 35 40 45 Arg Phe Ala Met Ala Trp Trp His Thr Leu Cys Ala Asn Gly Ser Asp 50 55 60 Pro Phe Gly Gly Pro Thr Ile His His Pro Trp Asp Ile Gly Asn Asp 65 70 75 80 Pro Val Thr Arg Ala Met His Lys Met Asp Ala Gly Phe Glu Phe Met 85 90 95 Ser Lys Met Gly Phe Asn Tyr Tyr Cys Phe His Asp Ile Asp Leu Val 100 105 110 Asp Pro Ala Asn Asn Trp Lys Asp Tyr Glu Lys Asn Met Gln Thr Ile 115 120 125 Val Glu Tyr Ala Lys Gln 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cggattcaaa cgcaagctca caacagagac tgaacgaaga tacaatcgtg 1440 aagtttgatt acgatgaatc tccgctgcgg gactacctaa ataaaaggcc agaaaggact 1500 ttttttgtag gtggggcttc taaaaacgat gctattgtga agaagtttgc tcaagtcatt 1560 ggtgctacaa agggtaattt taggctagaa acaccaaact catgtgccct tggtggttgt 1620 tataaggcca tgtggtcatt gttatatgac tctaataaaa ttgcagttcc ttttgataaa 1680 tttctgaatg acaattttcc atggcatgta atggaaagca tatccgatgt ggataatgaa 1740 aattgggatc gctataattc caagattgtc cccttaagcg aactggaaaa gactctcatc 1800 taa 1803 <210> 75 <211> 300 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 75 taaagtaaga gcgctacatt ggtctacctt tttgttcttt tacttaaaca ttagttagtt 60 cgttttcttt ttctcatttt tttatgtttc ccccccaaag ttctgatttt ataatatttt 120 atttcacaca attccattta acagaggggg aatagattct ttagcttaga aaattagtga 180 tcaatatata tttgcctttc ttttcatctt ttcagtgata ttaatggttt cgagacactg 240 caatggccct agttgtctaa gaggatagat gttactgtca aagatgatat tttgaatttc 300 <210> 76 <211> 500 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 76 tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct gtcttcctat 60 tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca caggttttgt 120 aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat gctatgatgc 180 ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc tctttcaaac 240 agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt tcttctaacc 300 aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat atataaactt 360 gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt agtttttcaa 420 gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa ttatctactt 480 tttacaacaa atataaaaca 500 <210> 77 <211> 1008 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 77 atgtctgaac cagctcaaaa gaaacaaaag gttgctaaca actctctaga acaattgaaa 60 gcctccggca ctgtcgttgt tgccgacact ggtgatttcg gctctattgc caagtttcaa 120 cctcaagact ccacaactaa cccatcattg atcttggctg ctgccaagca accaacttac 180 gccaagttga tcgatgttgc cgtggaatac ggtaagaagc atggtaagac caccgaagaa 240 caagtcgaaa atgctgtgga cagattgtta gtcgaattcg gtaaggagat cttaaagatt 300 gttccaggca gagtctccac cgaagttgat gctagattgt cttttgacac tcaagctacc 360 attgaaaagg ctagacatat cattaaattg tttgaacaag aaggtgtctc caaggaaaga 420 gtccttatta aaattgcttc cacttgggaa ggtattcaag ctgccaaaga attggaagaa 480 aaggacggta tccactgtaa tttgactcta ttattctcct tcgttcaagc agttgcctgt 540 gccgaggccc aagttacttt gatttcccca tttgttggta gaattctaga ctggtacaaa 600 tccagcactg gtaaagatta caagggtgaa gccgacccag gtgttatttc cgtcaagaaa 660 atctacaact actacaagaa gtacggttac aagactattg ttatgggtgc ttctttcaga 720 agcactgacg aaatcaaaaa cttggctggt gttgactatc taacaatttc tccagcttta 780 ttggacaagt tgatgaacag tactgaacct ttcccaagag ttttggaccc tgtctccgct 840 aagaaggaag ccggcgacaa gatttcttac atcagcgacg aatctaaatt cagattcgac 900 ttgaatgaag acgctatggc cactgaaaaa ttgtccgaag gtatcagaaa attctctgcc 960 gatattgtta ctctattcga cttgattgaa aagaaagtta ccgcttaa 1008 <210> 78 <211> 120 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 78 gattctaaac gcatagttgt aaggttgatg tatatatata tatatatatg tatatattaa 60 ttacaataat atgctcccgc ccaaattttt ctccttcaat accgccggag gcggtattga 120 <210> 79 <211> 500 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 79 acagattggg agattttcat agtagaattc agcatgatag ctacgtaaat gtgttccgca 60 ccgtcacaaa gtgttttcta ctgttctttc ttctttcgtt cattcagttg agttgagtga 120 gtgctttgtt caatggatct tagctaaaat gcatattttt tctcttggta aatgaatgct 180 tgtgatgtct tccaagtgat ttcctttcct tcccatatga tgctaggtac ctttagtgtc 240 ttcctaaaaa aaaaaaaagg ctcgccatca aaacgatatt cgttggcttt tttttctgaa 300 ttataaatac tctttggtaa cttttcattt ccaagaacct cttttttcca gttatatcat 360 ggtccccttt caaagttatt ctctactctt tttcatattc attctttttc atcctttggt 420 tttttattct taacttgttt attattctct cttgtttcta tttacaagac accaatcaaa 480 acaaataaaa catcatcaca 500 <210> 80 <211> 2043 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 80 atgactcaat tcactgacat tgataagcta gccgtctcca ccataagaat tttggctgtg 60 gacaccgtat ccaaggccaa ctcaggtcac ccaggtgctc cattgggtat ggcaccagct 120 gcacacgttc tatggagtca aatgcgcatg aacccaacca acccagactg gatcaacaga 180 gatagatttg tcttgtctaa cggtcacgcg gtcgctttgt tgtattctat gctacatttg 240 actggttacg atctgtctat tgaagacttg aaacagttca gacagttggg ttccagaaca 300 ccaggtcatc ctgaatttga gttgccaggt gttgaagtta ctaccggtcc attaggtcaa 360 ggtatctcca acgctgttgg tatggccatg gctcaagcta acctggctgc cacttacaac 420 aagccgggct ttaccttgtc tgacaactac acctatgttt tcttgggtga cggttgtttg 480 caagaaggta tttcttcaga agcttcctcc ttggctggtc atttgaaatt gggtaacttg 540 attgccatct acgatgacaa caagatcact atcgatggtg ctaccagtat ctcattcgat 600 gaagatgttg ctaagagata cgaagcctac ggttgggaag ttttgtacgt agaaaatggt 660 aacgaagatc tagccggtat tgccaaggct attgctcaag ctaagttatc caaggacaaa 720 ccaactttga tcaaaatgac cacaaccatt ggttacggtt ccttgcatgc cggctctcac 780 tctgtgcacg gtgccccatt gaaagcagat gatgttaaac aactaaagag caaattcggt 840 ttcaacccag acaagtcctt tgttgttcca caagaagttt acgaccacta ccaaaagaca 900 attttaaagc caggtgtcga agccaacaac aagtggaaca agttgttcag cgaataccaa 960 aagaaattcc cagaattagg tgctgaattg gctagaagat tgagcggcca actacccgca 1020 aattgggaat ctaagttgcc aacttacacc gccaaggact ctgccgtggc cactagaaaa 1080 ttatcagaaa ctgttcttga ggatgtttac aatcaattgc cagagttgat tggtggttct 1140 gccgatttaa caccttctaa cttgaccaga tggaaggaag cccttgactt ccaacctcct 1200 tcttccggtt caggtaacta ctctggtaga tacattaggt acggtattag agaacacgct 1260 atgggtgcca taatgaacgg tatttcagct ttcggtgcca actacaaacc atacggtggt 1320 actttcttga acttcgtttc ttatgctgct ggtgccgtta gattgtccgc tttgtctggc 1380 cacccagtta tttgggttgc tacacatgac tctatcggtg tcggtgaaga tggtccaaca 1440 catcaaccta ttgaaacttt agcacacttc agatccctac caaacattca agtttggaga 1500 ccagctgatg gtaacgaagt ttctgccgcc tacaagaact ctttagaatc caagcatact 1560 ccaagtatca ttgctttgtc cagacaaaac ttgccacaat tggaaggtag ctctattgaa 1620 agcgcttcta agggtggtta cgtactacaa gatgttgcta acccagatat tattttagtg 1680 gctactggtt ccgaagtgtc tttgagtgtt gaagctgcta agactttggc cgcaaagaac 1740 atcaaggctc gtgttgtttc tctaccagat ttcttcactt ttgacaaaca acccctagaa 1800 tacagactat cagtcttacc agacaacgtt ccaatcatgt ctgttgaagt tttggctacc 1860 acatgttggg gcaaatacgc tcatcaatcc ttcggtattg acagatttgg tgcctccggt 1920 aaggcaccag aagtcttcaa gttcttcggt ttcaccccag aaggtgttgc tgaaagagct 1980 caaaagacca ttgcattcta taagggtgac aagctaattt ctcctttgaa aaaagctttc 2040 taa 2043 <210> 81 <211> 120 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 81 ctttgatctg tagcctaagt ataaaattct acgtatgtat atatttacat gcaatttttt 60 ctttttccaa ttcatgttaa tgttcttcat catttgataa taggccaatg atattatcta 120 <210> 82 <211> 500 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 82 gaaaaatata aggatgagaa agtgaaatcg gttttttttt tccattgtcg tcatcaacat 60 gattttttaa ataaataaat acgatttttt attttttttc ccttctttgt ttttgttttg 120 cttattccca tcttcattat taaattcttc cgctcttaat aaaggagttt ttttattatc 180 ttcttgtgta atcatccttt ttctttaatt ttcttccttt tctttttctc tttactggtt 240 tttttacttc tttattctca accatctaaa gaatattatt gctttctacc aataaaatct 300 gttaattcta tttggattgt cgtctactca agtctcgcct agtaaataaa cgataaacaa 360 atttgaagta agaataacaa tatagggaga gaaatttttc tatttttaat ttcgaaacag 420 gtaccaaaaa atctaagttc actttagcac tatttgggaa agcttttata taaaaaatct 480 gaaacaaaat catatcaaag 500 <210> 83 <211> 2046 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 83 atggcacagt tctccgacat tgataaactt gcggtttcca ctttaagatt actttccgtt 60 gaccaggtgg aaagcgcaca atctggccac ccaggtgcac cactaggatt ggcaccagtt 120 gcccatgtaa ttttcaagca actgcgctgt aaccctaaca atgaacattg gatcaataga 180 gacaggtttg ttctgtcgaa cggtcactca tgcgctcttc tgtactcaat gctccatcta 240 ttaggatacg attactctat cgaggacttg agacaattta gacaagtaaa ctcaaggaca 300 ccgggtcatc cagaattcca ctcagcggga gtggaaatca cttccggtcc gctaggccag 360 ggtatctcaa atgctgttgg tatggcaata gcgcaggcca actttgccgc cacttataac 420 gaggatggct ttcccatttc cgactcatat acgtttgcta ttgtagggga tggttgctta 480 caagagggtg tttcttcgga gacctcttcc ttagcgggac atctgcaatt gggtaacttg 540 attacgtttt atgacagtaa tagcatttcc attgacggta aaacctcgta ctcgttcgac 600 gaagatgttt tgaagcgata cgaggcatat ggttgggaag tcatggaagt cgataaagga 660 gacgacgata tggaatccat ttctagcgct ttggaaaagg caaaactatc gaaggacaag 720 ccaaccataa tcaaggtaac tactacaatt ggatttgggt ccctacaaca gggtactgct 780 ggtgttcatg ggtccgcttt gaaggcagat gatgttaaac agttgaagaa gaggtggggg 840 tttgacccaa ataaatcatt tgtagtacct caagaggtgt acgattatta taagaagact 900 gttgtggaac ccggtcaaaa acttaatgag gaatgggata ggatgtttga agaatacaaa 960 accaaatttc ccgagaaggg taaagaattg caaagaagat tgaatggtga gttaccggaa 1020 ggttgggaaa agcatttacc gaagtttact ccggacgacg atgctctggc aacaagaaag 1080 acatcccagc aggtgctgac gaacatggtc caagttttgc ctgaattgat cggtggttct 1140 gccgatttga caccttcgaa tctgacaagg tgggaaggcg cggtagattt ccaacctccc 1200 attacccaac taggtaacta tgcaggaagg tacattagat acggtgtgag ggaacacgga 1260 atgggtgcca ttatgaacgg tatctctgcc tttggtgcaa actacaagcc ttacggtggt 1320 acctttttga acttcgtctc ttatgctgca ggagccgtta ggttagccgc cttgtctggt 1380 aatccagtca tttgggttgc aacacatgac tctatcgggc ttggtgagga tggtccaacg 1440 caccaaccta ttgaaactct ggctcacttg agggctattc caaacatgca tgtatggaga 1500 cctgctgatg gtaacgaaac ttctgctgcg tattattctg ctatcaaatc tggtcgaaca 1560 ccatctgttg tggctttatc acgacagaat cttcctcaat tggagcattc ctcttttgaa 1620 aaagccttga agggtggcta tgtgatccat gacgtggaga atcctgatat tatcctggtg 1680 tcaacaggat cagaagtctc catttctata gatgcagcca aaaaattgta cgatactaaa 1740 aaaatcaaag caagagttgt ttccctgcca gacttttata cttttgacag gcaaagtgaa 1800 gaatacagat tctctgttct accagacggt gttccgatca tgtcctttga agtattggct 1860 acttcaagct ggggtaagta tgctcatcaa tcgttcggac tcgacgaatt tggtcgttca 1920 ggcaaggggc ctgaaattta caaattgttc gatttcacag cggacggtgt tgcgtcaagg 1980 gctgaaaaga caatcaatta ctacaaagga aagcagttgc tttctcctat gggaagagct 2040 ttctaa 2046 <210> 84 <211> 168 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 84 gctggttgat ggaaaatata attttattgg gcaaactttt gtttatctga tgtgttttat 60 actattatct ttttaattaa tgattctata tacaaacctg tatatttttt ctttaaccaa 120 tttttttttt tatagaccta gagctgtact tttattctgc tatcaagc 168 <210> 85 <211> 348 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 85 cagcgacatg gaggcccaga ataccctcct tgacagtctt gacgtgcgca gctcaggggc 60 atgatgtgac tgtcgcccgt acatttagcc catacatccc catgtataat catttgcatc 120 catacatttt gatggccgca cggcgcgaag caaaaattac ggctcctcgc tgcagacctg 180 cgagcaggga aacgctcccc tcacagacgc gttgaattgt ccccacgccg cgcccctgta 240 gagaaatata aaaggttagg atttgccact gaggttcttc tttcatatac ttccttttaa 300 aatcttgcta ggatacagtt ctcacatcac atccgaacat aaacaacc 348 <210> 86 <211> 810 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 86 atgggtaagg aaaagactca cgtttcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat 60 ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga 120 ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc 180 aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg 240 accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc 300 ggcaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat 360 gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac 420 agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat 480 gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg 540 cataagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat 600 aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc 660 gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca 720 ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag 780 tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa 810 <210> 87 <211> 240 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 87 tcagtactga caataaaaag attcttgttt tcaagaactt gtcatttgta tagttttttt 60 atattgtagt tgttctattt taatcaaatg ttagcgtgat ttatattttt tttcgcctcg 120 acatcatctg cccagatgcg aagttaagtg cgcagaaagt aatatcatgc gtcaatcgta 180 tgtgaatgct ggtcgctata ctgctgtcga ttcgatacta acgccgccat ccagtgtcga 240 <210> 88 <211> 1000 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 88 gagaatagaa tacgtgtcta taggtgctac tatgtgatta agaggttgca aagtgaaagg 60 cagtatttga ttcctgcaag gatcttccgt gcaggacaat agggtttaat gccacattgt 120 actctgcgtg ctatgcgaat aaaggaagcg cacgccgaat ctgaaatagg caatttggta 180 caaaaatcac gttattccat taagcagagg cagttcatat tactttggcc tgtcttacga 240 atgttcttct gaatacccaa ttctcctgag aacatctatc atataatttt tgagtttagg 300 cagacttgag gaaaaagtgg gttttgaggt ggttgtttgg agtctatctc tgataagaat 360 ggctttattg catatattct aacaggccct ctcgtaggta aaggaatccc caaaaaagag 420 tgggcagctt tacatggtaa aattacaatt cgttctttcg tttcacacgt cggcacttac 480 tatcctatta cattattaat ccttacattt cagcttccac taaattcgat ggccgtttct 540 cgtcatttat gtgatatcat aacaccatat atggcagtac atcaggcata agcactaatc 600 cgtagaaatt agttgatccc aagtttaacg gactcgaagt cctgttaatt atgtgagccg 660 aagcgtagga atattaatgt aatagaatca ataaatgact gtatattaaa acgaagaacg 720 aaagaatttt accactttgt aaaatattag attgcgttga ggggcttgtg gtcacctgtc 780 ataggatgcc tatgttcccc ccaaaaattt aattctgaag taagtttttg ttgagtactt 840 caactttatt tccttcaatt gtgaaatgtt gataactagc atctattact atccgataac 900 gccaggcgcc tttatatcat ataattaaga cacaaaagga taaaacaaag gtgttaacta 960 ttctgcatac tcactatcgt aaactgtcct gcaaatcgtg 1000 <210> 89 <211> 1000 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 89 agtaatttat caagctttaa taagtttggg tagtttaact gtgcaaaaag gtatttacct 60 tacatactga atcttgtctg tttggtagcg gctgctttat gggtgtttca tagatgtcca 120 aaatatattg agatattgag atataacatt ctaggataat caaaattacc ataattcaaa 180 agctcgtatg gcgcagtggt agcgcagcag attgcaaatc tgttggtcct tagttcgatc 240 ctgagtgcga gctttctttt ttagactact aattttattt tgctagtcat ttttttttta 300 tactcaaaaa gtaaaaagac tacgagtata ttcaaagtaa aaaacgaacg tcaaactatc 360 tcgattaaaa cttgtcatac tgtgggtatc atattctgtg ccctcagtga aaagaaccag 420 caaaagaacg cgcatctcga gtgaagacgc gcccttgatg gtacaaaatt taacgggaag 480 gcgcgtcgtg atgttcacgc gctttgccca cattgggata gcgcccacag catatctgtg 540 ctaaactcac ttttcctagt gactgccgat agctactgcc atctaccgcg aagggaactt 600 catttgcgtt catcggttta ttagaagcta cttggaacta attcttaagc ttctcaagaa 660 aagttttttt tctgtctatc tattgaagtc tttttgtctt tgtacttcaa gagactcaat 720 cacctaaagc ttttcacggc caattagttg tctcacacaa agcaaaataa gcttaataat 780 tagcagtaac gcgcttttcc ctgtatttaa agccgctgaa cacctttact gaacaatggg 840 agagaaccac gaccatgagc agagtattaa aagaaattct atgatttata atgaaaatga 900 gaggcagttg tgcaattcaa acctaaagat tcttcaaaat aaaagggccc tttcaaaaaa 960 tgacagctct agtaagcagc aggttcagga ttctaaacca 1000 <210> 90 <211> 391 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 90 ctcgtaggaa caatttcggg cccctgcgtg ttcttctgag gttcatcttt tacatttgct 60 tctgctggat aattttcaga ggcaacaagg aaaaattaga tggcaaaaag tcgtctttca 120 aggaaaaatc cccaccatct ttcgagatcc cctgtaactt attggcaact gaaagaatga 180 aaaggaggaa aatacaaaat atactagaac tgaaaaaaaa aaagtataaa tagagacgat 240 atatgccaat acttcacaat gttcgaatct attcttcatt tgcagctatt gtaaaataat 300 aaaacatcaa gaacaaacaa gctcaacttg tcttttctaa gaacaaagaa taaacacaaa 360 aacaaaaagt ttttttaatt ttaatcaaaa a 391 <210> 91 <211> 248 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 91 tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60 aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120 tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180 acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240 taatttgc 248 <210> 92 <211> 278 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 92 tcaataccgc ctccggcggt attgaaggag aaaaatttgg gcgggagcat attattgtaa 60 ttaatatata catatatata tatatatata catcaacctt acaactatgc gtttagaatc 120 ttaagcggta actttctttt caatcaagtc gaatagagta acaatatcgg cagagaattt 180 tctgatacct tcggacaatt tttcagtggc catagcgtct tcattcaagt cgaatctgaa 240 tttagattcg tcgctgatgt aagaaatctt gtcgccgg 278 <210> 93 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATR <400> 93 atgggtacca ctcttgacga cacggcttac cggtaccgca ccagtgtccc gggggacgcc 60 gaggccatcg aggcactgga tgggtccttc accaccgaca ccgtcttccg cgtcaccgcc 120 accggggacg gcttcaccct gcgggaggtg ccggtggacc cgcccctgac caaggtgttc 180 cccgacgacg aatcggacga cgaatcggac gacggggagg acggcgaccc ggactcccgg 240 acgttcgtcg cgtacgggga cgacggcgac ctggcgggct tcgtggtcat ctcgtactcg 300 gcgtggaacc gccggctgac cgtcgaggac atcgaggtcg ccccggagca ccgggggcac 360 ggggtcgggc gcgcgttgat ggggctcgcg acggagttcg ccggcgagcg gggcgccggg 420 cacctctggc tggaggtcac caacgtcaac gcaccggcga tccacgcgta ccggcggatg 480 gggttcaccc tctgcggcct ggacaccgcc ctgtacgacg gcaccgcctc ggacggcgag 540 cggcaggcgc tctacatgag catgccctgc ccctaa 576 <210> 94 <211> 306 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 94 gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 60 tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttgttctt gagtaactct 120 ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacacc 180 tctaccggca tgccgagcaa atgcctgcaa atcgctcccc atttcaccca attgtagata 240 tgctaactcc agcaatgagt tgatgaatct cggtgtgtat tttatgtcct cagaggacaa 300 cacctg 306

Claims (15)

  1. i) 자일룰로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1) 및 트랜스케톨라제 2 (TKL2)를 코딩하는 천연 유전자의 과다발현 및
    ii) 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 기능적 이종 유전자의 발현 - 여기서 자일로스 이소머라제 (XI) 유전자는 써모토가 네아폴리타나 (Thermotoga neapolitana), 안디탈레아 안덴시스 (Anditalea andensis) 및 클로스트리듐 클라리플라붐 (Clostridium clariflavum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래됨 -
    을 위한 하나 이상의 발현 구축물(들)로 형질전환된 미생물, 특히 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 종의 효모.
  2. 제1항에 있어서, 자일로스 이소머라제 (XI)가 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 25에 대해 적어도 66%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자일로스 이소머라제 (XI)가 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 26에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 나타내어지는 것인 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 자일룰로스 키나제 (XKS1)가 서열식별번호: 74에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되고, 트랜스알돌라제 (TAL1)가 서열식별번호: 77에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되고, 트랜스케톨라제 1 (TKL1)이 서열식별번호: 80에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되고, 트랜스케톨라제 2 (TKL2)가 서열식별번호: 83에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 미생물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 자일룰로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1), 트랜스케톨라제 2 (TKL2) 및 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 유전자 각각이 구성적 프로모터의 제어 하에 있고, 여기서 구성적 프로모터는 서열식별번호: 73에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 TDH3, 서열식별번호: 76에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 PGK1, 서열식별번호: 79에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 CYC19, 서열식별번호: 82에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 PFK1, 서열식별번호: 90에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 말단절단된 HXT7 및 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 TEF로부터 선택되는 것인 미생물.
  6. 티. 네아폴리타나 (T. neapolitana), 에이. 안덴시스 (A. andensis) 및 씨. 클라리플라붐 (C. clariflavum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래된 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 유전자의 발현을 위한 발현 구축물이며, 여기서 자일로스 이소머라제 (XI) 유전자는 사카로마이세스 세레비지애의 구성적 프로모터의 제어 하에 있는 것인 발현 구축물.
  7. 제6항에 있어서, 자일로스 이소머라제 (XI)를 코딩하는 유전자가 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 25에 대해 적어도 66%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 나타내어지는 것인 발현 구축물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 구성적 프로모터가 서열식별번호: 90에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 말단절단된 HXT7 및 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 TEF로부터 선택되는 것인 발현 구축물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 펜토스 당(들)을 포함하는 배양 배지에서 펜토스 당(들)이 대사될 수 있는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 펜토스 당을 발효시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 배양 배지가 리그노셀룰로스 바이오매스 및/또는 그의 가수분해물을 포함하거나 그로 이루어지는 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 발효가 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,4-부탄디올, 글리세린, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 카프로산, 팔미트산, 스테아르산, 옥살산, 말론산, 숙신산 또는 숙시네이트, 글루타르산, 올레산, 리놀레산, 글리콜산, 락트산 또는 락테이트, 감마-히드록시부티르산, 3-히드록시알칸산, 알라닌, 메탄, 에탄, 프로판, 펜탄, n-헥산, 피루베이트, 아스파르테이트, 말레이트, 발린 및 류신으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 에탄올을 생성하는 것인 방법.
  12. 펜토스 당(들), 특히 자일로스의 발효, 바람직하게는 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 에탄올의 생성을 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물의 용도.
  13. 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제1항에서 정의된 바와 같은 또는 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 발현 구축물(들)로 형질전환시키는 단계를 포함하는, 미생물, 바람직하게는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 생성하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 발현 구축물이 사카로마이세스 세레비지애 균주의 염색체로 통합되는 것인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 발현 구축물이 자일룰로스 키나제 (XKS1), 트랜스알돌라제 (TAL1), 트랜스케톨라제 1 (TKL1) 및 트랜스케톨라제 2 (TKL2)에 대한 천연 유전자의 과다발현을 위한 재조합 발현 구축물로 통합되는 것인 방법.
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