ES2899215T3 - Producción fermentativa de etanol a partir de glucosa, galactosa y arabinosa empleando una cepa de levadura recombinante - Google Patents

Producción fermentativa de etanol a partir de glucosa, galactosa y arabinosa empleando una cepa de levadura recombinante Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la producción de etanol a partir de una composición de azúcar, que comprende las siguientes etapas: a) fermentar la composición de azúcar en presencia de una célula de azúcares mixtos, que es una levadura perteneciente al género Saccharomyces, y b) recuperar etanol, en el que la levadura comprende los genes araA, araB y araD, y la composición de azúcar comprende glucosa, galactosa y arabinosa, en el que los azúcares glucosa, galactosa y arabinosa se convierten en etanol, y en el que la fermentación se realiza en condiciones anaerobias.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción fermentativa de etanol a partir de glucosa, galactosa y arabinosa empleando una cepa de levadura recombinante
Campo de la invención
La invención se refiere a la fermentación de azúcares mixtos, en particular a la fermentación de una composición de azúcar que comprende glucosa, galactosa y arabinosa. La composición de azúcar puede provenir de material lignocelulósico.
Antecedentes de la invención
La mayor parte del etanol producido como alternativa a los combustibles fósiles proviene actualmente de la fermentación de almidón de maíz y sacarosa a base de caña de azúcar. Para alcanzar los ambiciosos objetivos de producción de combustibles renovables, se están desarrollando nuevas tecnologías para convertir la biomasa no alimentaria en productos de fermentación tal como el etanol. Saccharomyces cerevisiae es el organismo de elección en la industria del etanol, pero no puede utilizar azúcares de cinco carbonos contenidos en el componente hemicelulósico de las materias primas de biomasa. La hemicelulosa puede constituir hasta un 20-30% de la biomasa, siendo la xilosa y la arabinosa los azúcares de C5 más abundantes. La expresión heteróloga de una xilosa isomerasa (XI) es una opción para permitir que las células de levadura metabolicen y fermenten la xilosa. Asimismo, la expresión de genes bacterianos araA, araB, y araD en cepas de S. cerevisiae da como resultado la utilización y fermentación alcohólica eficiente de arabinosa. La galactosa es un azúcar de C6 que también es un azúcar que a menudo está presente en la lignocelulosa, a menudo en cantidades (~ 4% del total de azúcares) que no deben descuidarse por razones económicas.
J. van den Brink et al, Microbiology (2009) 155, 1340-1350, describen que la glucosa es la fuente de carbono favorecida para Saccharomyces cerevisiae, y que, al cambiar de condiciones de fermentación limitadas por glucosa a condiciones de exceso de galactosa en condiciones anaerobias, no se consumió galactosa.
Hasta ahora no se ha descrito ningún procedimiento para convertir la galactosa en el producto de fermentación en el mismo procedimiento con glucosa y uno o más azúcares de C5. Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para convertir galactosa en el producto de fermentación en el mismo procedimiento con glucosa y uno o más azúcares de C5.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de etanol a partir de una composición de azúcar, que comprende las siguientes etapas:
a) fermentar la composición de azúcar en presencia de una célula de azúcares mixtos, que es una levadura perteneciente al género Saccharomyces, y
b) recuperar etanol,
en el que la levadura comprende los genes araA, araB y araD, y la composición de azúcar comprende glucosa, galactosa y arabinosa, en el que los azúcares glucosa, galactosa y arabinosa se convierten en etanol, y en el que la fermentación se realiza en condiciones anaerobias.
La invención es como se define por las reivindicaciones adjuntas.
Preferiblemente, la cepa de azúcares mixtos es una Saccharomyces cerevisiae.
Se describe el uso de genes araA, araB y araD para conferir, a través de la expresión de esos genes, en una cepa fermentadora de glucosa la capacidad de fermentar galactosa anaerobiamente en presencia de arabinosa.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un mapa físico del plásmido pPWT006.
La Figura 2 muestra un mapa físico del plásmido pPWT018.
La Figura 3 muestra un autorradiograma de transferencia Southern. El ADN cromosómico de la cepa de tipo salvaje CEN.PK113-7D (carril 1) y BIE104A2 (carril 2) se digirió tanto con EcoRI como con HindIII. La transferencia se hibridó con una sonda SlT2 específica.
La Figura 4 muestra mapas físicos del locus SlT2 de tipo salvaje (panel a) y después de la introducción de los genes ara mediante la integración del plásmido pPWT018, seguido de recombinación intramolecular que conduce a la pérdida del vector y de las secuencias marcadoras seleccionables (panel b). Se indica la hibridación de la sonda.
La Figura 5 muestra un mapa físico del plásmido pPWT080, cuya secuencia se proporciona en SEQ ID no. 4.
La Figura 6 muestra un mapa físico del locus GRE3 de tipo salvaje (panel a), y una integración de una copia de PWT080 en el locus GRE3 (panel b, que muestra dónde se unen los cebadores, y panel c, que muestra dónde se une la sonda RKI1).
La Figura 7 muestra un mapa físico del locus GRE3, en el que la región codificante del gen GRE3 se reemplazó por la integración de los genes PPP TAL1, TKL1, RKI1 y RPE1. El panel a muestra dónde se unen los cebadores de SEQ ID 5 y 6, el panel b muestra dónde se une la sonda RKI1.
La Figura 8 muestra curvas de crecimiento en condiciones aerobias de BlE104P1A2 en diferentes medios. La cepa BIE104A2P1 se hizo crecer previamente en YNB con galactosa al 2%. La curva de crecimiento se inició con galactosa al 2% y arabinosa al 1%, seguido del evento indicado en el gráfico por el número (1) de la transferencia a YNB con arabinosa al 2% como única fuente de carbono. Después de alcanzar una OD 600 superior a 1, el cultivo se transfirió a medio reciente con una OD 600 inicial de 0,2. Tras tres transferencias en medio de arabinosa pura, la cepa resultante se denominó BlE104P1A2c.
La Figura 9 muestra curvas de crecimiento en condiciones anaerobias de BlE104P1A2c en YNB con arabinosa al 2% de única fuente de carbono. Después de alcanzar una OD 600 superior a 1, el cultivo se transfirió a medio reciente con una OD 600 inicial de 0,2. Después de varias transferencias, la cepa resultante se denominó BlE104P1A2d (= BIE201).
La Figura 10 muestra la conversión de azúcar y la formación de producto de BIE104 en un medio modelo de fibra de maíz sintética. La producción de CO2 se midió constantemente. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo. El precultivo se hizo crecer en glucosa al 2%.
La Figura 11 muestra la conversión de azúcar y la formación de producto de BlE104P1A2c en un medio modelo de fibra de maíz sintética. La producción de CO2 se midió constantemente. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo. El precultivo se hizo crecer en glucosa al 2%.
La Figura 12 muestra la conversión de azúcar y la formación de producto de BIE201 en un medio modelo de fibra de maíz sintética. La producción de CO2 se midió constantemente. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo. El precultivo se hizo crecer en glucosa al 2%.
La Figura 13 muestra la conversión de azúcar y la formación de producto de BIE104A2 en un medio modelo de fibra de maíz sintética. La producción de CO2 se midió constantemente. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo. El precultivo se hizo crecer en glucosa al 2%.
La Figura 14 muestra la conversión de azúcar y la formación de producto de BIE105A2 en un medio modelo de fibra de maíz sintética. La producción de CO2 se midió constantemente. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo. El precultivo se hizo crecer en glucosa al 2%.
La Figura 15 muestra un mapa físico del plásmido pPWT007.
La Figura 16 muestra un mapa físico del plásmido pPWT042.
La Figura 17 muestra un mapa físico del locus SlT4 de tipo salvaje (panel a), y una integración de una copia de PWT080 en el locus SlT4 (panel b, que muestra dónde se unen los cebadores).
La Figura 18 muestra una representación gráfica de las curvas de crecimiento de la cepa BlE104A2P1Y9 en diferentes medios. Panel a: cepa BlE104A2P1Y9 cultivada en glucosa, seguido de eventos indicados en el gráfico por el número (1) de transferencia a 1 % de arabinosa 1 % de xilosa, y (2) transferencia a 2% de xilosa 0,2% de arabinosa. Panel b: cepa BlE104A2P1Y9 cultivada en galactosa, seguido de (1) transferencia a 1% de arabinosa 1% de xilosa, y (2) transferencia a 2% de xilosa 0,2% de arabinosa.
La Figura 19 muestra el crecimiento en medio Verduyn suplementado con xilosa al 2% de la cepa BlE104A2P1Y9. Se ensayaron dos colonias independientes. Después de alcanzar una OD 600 de 2, las cepas se transfirieron a medio reciente, e inmediatamente comenzaron a crecer de nuevo en xilosa.
La Figura 20 muestra un mapa físico del plásmido pGBS416ARAABD.
Breve descripción de los listados de secuencias
SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de xilosa isomerasa de tipo salvaje de Bacteroides uniformis ATCC 8492. N° de acceso de Genbank AAYH02000036.
SEQ ID NO: 2 muestra una secuencia de codones optimizados derivada de SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la xilosa isomerasa de Bacteroides uniformis ATCC 8492. SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia del plásmido pPWT080.
SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia del cebador directo.
SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia del cebador inverso.
SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia del cebador multifuncional directo para PCR de diagnóstico.
SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia del cebador multifuncional inverso para PCR de diagnóstico.
SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de la sonda RKI1 del cebador directo.
SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de la sonda RKI1 del cebador inverso.
SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia del casete kanMX del cebador directo.
SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia del casete kanMX del cebador inverso.
SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia del cebador directo.
SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia del cebador inverso.
SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia del cebador multifuncional directo para PCR de diagnóstico.
La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia del cebador multifuncional inverso para PCR de diagnóstico.
SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia del plásmido pPWT018.
SEQ ID NO: 18 muestra la secuencia de integración del cebador directo pPWT018.
SEQ ID NO: 19 muestra la secuencia de integración del cebador inverso pPWT018.
SEQ ID NO: 20 muestra la secuencia de la sonda SlT2 del cebador directo.
SEQ ID NO: 21 muestra la secuencia de la sonda SlT2 del cebador inverso.
SEQ ID NO: 22 muestra la secuencia del cebador directo para amplificar el casete de expresión de araABD. SEQ ID NO: 23 muestra la secuencia del cebador inverso para amplificar el casete de expresión de araABD. Descripción detallada de la invención
A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras “comprender” e “incluir”, y variaciones tales como “comprende”, “que comprende”, “incluye”, y “que incluye”, deben interpretarse de manera inclusiva. Es decir, estas palabras están destinadas a transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no citados específicamente, cuando el contexto lo permita.
Los artículos “un” y “una” se utilizan aquí para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” puede significar un elemento o más de un elemento. Las diversas realizaciones de la invención descritas aquí se pueden combinar de forma cruzada.
La composición de azúcar
La composición de azúcar según la invención comprende glucosa, arabinosa y galactosa. En el procedimiento de la invención, ventajosamente los azúcares glucosa, galactosa y arabinosa se convierten en producto de fermentación. En la invención se puede utilizar cualquier composición de azúcar que satisfaga esos criterios. En una realización preferida, la composición de azúcar es un hidrolizado de uno o más materiales lignocelulósicos. La lignocelulosa incluye aquí hemicelulosa y partes de hemicelulosa de biomasa. También la lignocelulosa incluye fracciones lignocelulósicas de biomasa. Los materiales lignocelulósicos adecuados se pueden encontrar en la siguiente lista: podas de huertos, chaparral, desechos de molinos, desechos de madera urbana, desechos municipales, desechos de tala, aclareos forestales, cultivos leñosos de rotación corta, desechos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscaras de soja, cáscaras de arroz, paja de arroz, pienso de gluten de maíz, cáscaras de avena, caña de azúcar, rastrojo de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, cáscaras de maíz, pasto varilla, miscanthus, sorgo dulce, tallos de cánola, tallos de soja, hierba de la pradera, hierba gama, cola de zorro; pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, cáscaras de semillas, desechos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas marinas, árboles, madera blanda, madera dura, álamo, pino, arbustos, pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras de maíz, hojuelas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de la molienda húmeda o seca de granos, residuos sólidos urbanos, papel de desecho, residuos de jardín, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos urbanos, papel de desecho, pulpa, residuos de molino de papel, ramas, arbustos, cañas, maíz, hojas de maíz, un cultivo energético, bosque, una fruta, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una aguja, un tronco, un raíz, un árbol joven, un arbusto, pasto varilla, un árbol, una verdura, cáscara de fruta, una vid, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, cáscaras de avena, madera dura o blanda, material de desecho orgánico generado a partir de un procedimiento agrícola, desechos de madera forestal, o una combinación de dos o más de los mismos.
En la tabla 1 se da un resumen de algunas composiciones de azúcar adecuadas derivadas de lignocelulosa y la composición de azúcar de sus hidrolizados. Las lignocelulosas enumeradas incluyen: mazorcas de maíz, fibra de maíz, cáscaras de arroz, cáscaras de melón, pulpa de remolacha azucarera, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, madera, pasto, y prensados de olivo.
Tabla 1: Resumen de las composiciones de azúcar de materiales lignocelulósicos. Gal = galactosa, Xil = xilosa, Ara = arabinosa, Man = manosa, Glu = glutamato, Rham = ramnosa. Se da el porcentaje de galactosa (% Gal) y la fuente bibliográfica.
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De la tabla 1 se desprende claramente que, en estas lignocelulosas, una cantidad considerable de azúcar (en promedio 3,8%) es galactosa. La conversión de galactosa en producto de fermentación es de este modo de gran importancia económica.
La célula de azúcares mixtos
La célula de azúcares mixtos que comprende los genes araA, araB y araD se define en lo sucesivo. Es capaz de fermentar glucosa, arabinosa y galactosa. En una realización de la invención, la célula de azúcares mixtos puede fermentar uno o más azúcares adicionales, preferiblemente azúcar de C5 y/o de C6. En una realización de la invención, la célula de azúcares mixtos comprende uno o más de: un gen xylA y/o un gen XKS1, para permitir que la célula de azúcares mixtos fermente xilosa; la supresión del gen de la aldosa reductasa (GRE3); la sobreexpresión de genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1 para permitir el aumento del flujo a través de la ruta de pentosa fosfato en la célula.
En una realización de la invención, la célula de azúcares mixtos puede fermentar uno o más azúcares adicionales, preferiblemente azúcares de C5 y/o C6. En una realización de la invención, la célula de azúcares mixtos comprende uno o más de: un gen xylA, gen XYL1 y gen XYL2 y/o gen XKS1, para permitir que la célula de azúcares mixtos fermente xilosa; la supresión del gen de la aldosa reductasa (GRE3); la sobreexpresión de genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1 para permitir el aumento del flujo a través de la ruta de la pentosa fosfato en la célula.
En una realización, la célula de azúcares mixtos es una célula industrial, más preferiblemente una levadura industrial. Una célula industrial y una célula de levadura industrial se pueden definir como sigue. Los entornos de vida de las células (de levadura) en los procedimientos industriales son significativamente diferentes de los del laboratorio. Las células de levadura industriales deben poder funcionar bien en múltiples condiciones ambientales que pueden variar durante el procedimiento. Tales variaciones incluyen cambios en las fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que en conjunto tienen un impacto potencial en el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae. En condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes al medio ambiente deberían permitir un crecimiento y una producción robustos. Las cepas de levadura industriales son generalmente más resistentes a estos cambios en las condiciones ambientales que pueden ocurrir en las aplicaciones en las que se utilizan, tales como en la industria de la panificación, la industria cervecera, la elaboración del vino, y la industria del etanol. En una realización, la célula de azúcares mixtos industrial se construye sobre la base de una célula hospedante industrial, en la que la construcción se realiza como se describe a continuación. Ejemplos de levadura industrial (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis), Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand).
En una realización, la célula de azúcares mixtos es tolerante a los inhibidores. La tolerancia a los inhibidores es la resistencia a los compuestos inhibidores. La presencia y el nivel de compuestos inhibidores en la lignocelulosa pueden variar ampliamente con la variación de la materia prima, el método de pretratamiento, el procedimiento de hidrólisis. Ejemplos de categorías de inhibidores son ácidos carboxílicos, furanos y/o compuestos fenólicos. Ejemplos de ácidos carboxílicos son ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico. Ejemplos de furanos son furfural e hidroximetilfurfural. Ejemplos de compuestos fenólicos son vainillina, ácido siríngico, ácido ferúlico y ácido cumárico. Las cantidades típicas de inhibidores son, para ácidos carboxílicos: varios gramos por litro, hasta 20 gramos por litro o más, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento, y las condiciones de hidrólisis. Para furanos: varios centenares de miligramos por litro hasta varios gramos por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento, y las condiciones de hidrólisis.
Para compuestos fenólicos: varias decenas de miligramos por litro, hasta un gramo por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento, y las condiciones de hidrólisis.
Las cepas de azúcares mixtos según la invención son tolerantes a los inhibidores, es decir, pueden resistir inhibidores habituales al nivel que típicamente tienen con condiciones de pretratamiento e hidrólisis habituales, de modo que las cepas de azúcares mixtos pueden encontrar una amplia aplicación, es decir, tienen una alta aplicabilidad para diferentes materias primas, diferentes métodos de pretratamiento, y diferentes condiciones de hidrólisis.
En una realización, la célula de azúcares mixtos industrial se construye sobre la base de una célula hospedante tolerante a inhibidores, en la que la construcción se realiza como se describe a continuación. Las células hospedantes tolerantes a inhibidores pueden seleccionarse cribando cepas para el crecimiento en materiales que contienen inhibidores, como se ilustra en Kadar et al, Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, en la que se seleccionó una cepa de S. cerevisiae ATCC 26602 tolerante a inhibidores.
En una realización, la célula de azúcares mixtos está libre de marcadores. Como se usa aquí, el término “marcador” se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección o el cribado de una célula hospedante que contiene el marcador. Libre de marcadores significa que los marcadores están esencialmente ausentes en la célula de azúcares mixtos. Estar libre de marcadores es particularmente ventajoso cuando se han utilizado marcadores antibióticos en la construcción de la célula de azúcares mixtos y se eliminan posteriormente. La eliminación de marcadores se puede realizar usando cualquier técnica adecuada de la técnica anterior, por ejemplo recombinación intramolecular. En los ejemplos se ilustra un método adecuado de eliminación de marcadores.
Una célula de azúcares mixtos puede convertir biomasa vegetal, celulosas, hemicelulosas, pectinas, ramnosa, galactosa, fructosa, maltosa, maltodextrinas, ribosa, ribulosa, o almidón, derivados del almidón, sacarosa, lactosa y glicerol, por ejemplo, en azúcares fermentables. En consecuencia, una célula de azúcares mixtos puede expresar una o más enzimas, tales como una celulasa (una endocelulasa o una exocelulasa), una hemicelulasa (una endo- o exo xilanasa o arabinasa) necesarias para la conversión de celulosa en monómeros de glucosa y hemicelulosa en monómeros de xilosa y arabinosa, una pectinasa capaz de convertir pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico, o una amilasa para convertir almidón en monómeros de glucosa.
La célula de azúcares mixtos puede comprender además aquellas actividades enzimáticas necesarias para la conversión de piruvato en un producto de fermentación deseado, tal como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico, o una cefalosporina.
En una realización, la célula de azúcares mixtos es una célula que es naturalmente capaz de fermentación alcohólica, preferiblemente fermentación alcohólica anaerobia. Una célula de azúcares mixtos tiene preferiblemente una alta tolerancia al etanol, una alta tolerancia a un pH bajo (es decir, capaz de crecer a un pH menor que alrededor de 5, alrededor de 4, alrededor de 3, o alrededor de 2,5) y frente a orgánico, y/o una alta tolerancia a temperaturas elevadas.
Cualquiera de las características o actividades anteriores de una célula de azúcares mixtos puede estar presente de forma natural en la célula, o puede introducirse o modificarse mediante modificación genética.
Construcción de la cepa de azúcares mixtos
Los genes pueden introducirse en la célula de azúcares mixtos introduciendo en una célula hospedante:
a) un grupo formado por genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, bajo el control de promotores fuertes,
b) un grupo que consiste en un gen xylA y el gen XKS1, ambos bajo el control de promotores constitutivos,
c) un grupo que consiste en los genes araA, araB y araD, y/o un grupo del gen xylA y/o el gen XKS1;
y
d) una supresión de un gen de la aldosa reductasa y la evolución adaptativa para producir la célula de azúcares mixtos. La célula anterior se puede construir usando técnicas de expresión recombinante.
Expresión recombinante
La célula de la invención es una célula recombinante. Es decir, una célula de la invención comprende, o se transforma con o se modifica genéticamente con una secuencia nucleotídica que no se encuentra naturalmente en la célula en cuestión.
Las técnicas para la expresión recombinante de enzimas en una célula, así como para las modificaciones genéticas adicionales de una célula de la invención, son bien conocidas por los expertos en la técnica. Normalmente, tales técnicas implican la transformación de una célula con una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia relevante. Tales métodos se conocen, por ejemplo, de manuales estándar, tales como Sambrook y Russel (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o F. Ausubel et al., eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987). Los métodos para la transformación y modificación genética de células hospedantes fúngicas se conocen, por ejemplo, de los documentos EP-A-0635574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186.
Normalmente, la construcción de ácido nucleico puede ser un plásmido, por ejemplo un plásmido de copia baja o un plásmido de copia alta. La célula según la presente invención puede comprender una única o múltiples copias de la secuencia nucleotídica que codifica una enzima, por ejemplo mediante múltiples copias de una construcción de nucleótidos o mediante el uso de una construcción que tiene múltiples copias de la secuencia de la enzima.
La construcción de ácido nucleico puede mantenerse episómicamente, y de este modo puede comprender una secuencia para la replicación autónoma, tal como una secuencia de secuencia de replicación autosómica. Una construcción de ácido nucleico episomal adecuada se puede basar, por ejemplo, en los plásmidos 2p o pKD1 de levadura (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975), o los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489). Alternativamente, cada construcción de ácido nucleico puede integrarse en una o más copias en el genoma de la célula. La integración en el genoma de la célula puede ocurrir al azar por recombinación no homóloga, pero preferiblemente, la construcción de ácido nucleico puede integrarse en el genoma de la célula por recombinación homóloga como es bien conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186).
La mayoría de los plásmidos episomales o 2p son relativamente inestables y se pierden en alrededor de 10-2 o más células después de cada generación. Incluso en condiciones de crecimiento selectivo, solo 60% a 95% de las células retienen el plásmido episomal. El número de copias de la mayoría de los plásmidos episomales oscila de 10-40 por célula de hospedantes cir+. Sin embargo, los plásmidos no se distribuyen por igual entre las células, y existe una gran variación en el número de copias por célula en las poblaciones. Las cepas transformadas con plásmidos integradores son extremadamente estables, incluso en ausencia de presión selectiva. Sin embargo, la pérdida de plásmido puede ocurrir en aproximadamente 10-3 a 10-4 frecuencias por recombinación homologa entre ADN repetido en tándem, lo que conduce a un bucle fuera de la secuencia del vector. Preferiblemente, el diseño del vector en el caso de la integración estable es, por tanto, que tras la pérdida de los genes marcadores de selección (que también se produce por recombinación homóloga intramolecular) ya no es posible el bucle fuera de la construcción integrada. Preferiblemente, los genes se integran así de forma estable. La integración estable se define aquí como la integración en el genoma, en el que ya no es posible realizar un bucle de la construcción integrada. Preferiblemente, los marcadores de selección están ausentes. Normalmente, la secuencia que codifica la enzima estará operativamente unida a una o más secuencias de ácido nucleico, capaces de proporcionar o ayudar a la transcripción y/o traducción de la secuencia de la enzima.
La expresión “operativamente ligado” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Por ejemplo, un promotor o potenciador está ligado operativamente a una secuencia codificante si dicho promotor o potenciador afecta la transcripción de la secuencia codificante.
Como se usa aquí, el término “promotor” se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, ubicado en dirección 5’ con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de la transcripción del gen, y está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de inicio de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN conocida por un experto en la técnica. Un promotor “constitutivo” es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor “inducible” es un promotor que está activo bajo la regulación ambiental o del desarrollo.
El promotor que podría usarse para lograr la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica una enzima según la presente invención puede no ser nativo de la secuencia nucleotídica que codifica la enzima que se va a expresar, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia nucleotídica (secuencia codificante) a la que está operativamente ligado. Sin embargo, el promotor puede ser homólogo, es decir, endógeno, a la célula hospedante.
Los promotores están ampliamente disponibles y son conocidos por los expertos. Los ejemplos adecuados de tales promotores incluyen, por ejemplo, promotores de genes glicolíticos, tales como los promotores de fosfofructoquinasa (PFK), triosa fosfato isomerasa (TPI), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD, TDH3 o GAPDH), piruvato quinasa (PYK), fosfoglicerato quinasa (PGK) de levaduras u hongos filamentosos; se pueden encontrar más detalles sobre tales promotores de levadura en (documento WO 93/03159). Otros promotores útiles son los promotores del gen que codifica la proteína ribosómica, el promotor del gen de la lactasa (LAC4), los promotores de la alcohol deshidrogenasa (ADHI, ADH4, y similares) y el promotor de la enolasa (ENO). Los expertos en la técnica conocerán otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores, o secuencias de activación en dirección 5’. Los promotores usados en las células hospedantes de la invención pueden modificarse, si se desea, para afectar sus características de control. Los promotores adecuados en este contexto incluyen promotores naturales tanto constitutivos como inducibles, así como promotores modificados genéticamente, que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los promotores adecuados en células hospedantes eucariotas pueden ser GAL7, GAL10, o GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1, y AOX1. Otros promotores adecuados incluyen PDC1, GPD1 , Pg K1, TEF1, y TDH3.
En una célula de la invención, el extremo 3’ de la secuencia de ácido nucleotídico que codifica la enzima está preferiblemente ligado operativamente a una secuencia terminadora de la transcripción. Preferiblemente, la secuencia terminadora puede funcionar en una célula hospedante de elección, tal como, por ejemplo, la especie de levadura de elección. En cualquier caso, la elección del terminador no es crítica; por ejemplo, puede ser de cualquier gen de levadura, aunque los terminadores a veces pueden funcionar si provienen de un gen eucariota que no es de levadura. Normalmente, una secuencia nucleotídica que codifica la enzima comprende un terminador. Preferiblemente, dichos terminadores se combinan con mutaciones que evitan la desintegración del ARNm mediada sin sentido en la célula hospedante de la invención (véase, por ejemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482).
La secuencia de terminación de la transcripción comprende además preferiblemente una señal de poliadenilación.
Opcionalmente, puede estar presente un marcador seleccionable en una construcción de ácido nucleico adecuada para uso en la invención. Como se usa aquí, el término “marcador” se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección o el cribado de una célula hospedante que contiene el marcador. El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibióticos, mediante el cual se puede usar el antibiótico apropiado para seleccionar células transformadas de entre células que no se transforman. Los ejemplos de marcadores de resistencia a antibióticos adecuados incluyen, por ejemplo, dihidrofolato reductasa, higromicina-B-fosfotransferasa, 3’-O-fosfotransferasa II (resistencia a kanamicina, neomicina y G418). Los marcadores de resistencia a antibióticos pueden ser más convenientes para la transformación de células hospedantes poliploides. También se pueden usar marcadores no de resistencia a antibióticos, tales como marcadores auxotróficos (URA3, TRPI, LEU2) o el gen TPI de S. pombe (descrito por Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130). En una realización preferida, las células hospedantes transformadas con las construcciones de ácido nucleico están libres de genes marcadores. Los métodos para construir células hospedantes microbianas libres de genes marcadores recombinantes se describen en el documento EP-A-0 635574, y se basan en el uso de marcadores bidireccionales tales como el gen amdS (acetamidasa) de A. nidulans o los genes URA3 y LYS2 de levadura. Alternativamente, en las construcciones de ácido nucleico de la invención puede incorporarse un marcador detectable tal como proteína fluorescente verde, lacL, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, beta-glucuronidasa, lo que permite el cribado de células transformadas.
Otros elementos opcionales que pueden estar presentes en las construcciones de ácido nucleico adecuadas para uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, una o más secuencia líder, potenciadores, factores de integración, y/o genes informadores, secuencias intrónicas, centrómeros, telómeros, y/o secuencias de unión a matriz (MAR). Las construcciones de ácido nucleico de la invención pueden comprender además una secuencia para la replicación autónoma, tal como una secuencia ARS.
Por tanto, el procedimiento de recombinación puede ejecutarse con técnicas de recombinación conocidas. Los expertos en la técnica conocen diversos medios para la expresión y sobreexpresión de enzimas en una célula de la invención. En particular, una enzima puede sobreexpresarse aumentando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula hospedante, por ejemplo integrando copias adicionales del gen en el genoma de la célula hospedante, expresando el gen a partir de un vector de expresión episomal multicopia, o introduciendo un vector de expresión episomal que comprende múltiples copias del gen.
Alternativamente, la sobreexpresión de enzimas en las células hospedantes de la invención se puede lograr utilizando un promotor que no sea nativo de la secuencia que codifica la enzima que se va a sobreexpresar, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia codificante a la que está operativamente ligado. Aunque el promotor es preferiblemente heterólogo de la secuencia codificante a la que está operativamente ligado, también se prefiere que el promotor sea homólogo, es decir, endógeno a la célula hospedante. Preferiblemente, el promotor heterólogo es capaz de producir un mayor nivel de estado estacionario del transcrito que comprende la secuencia codificante (o es capaz de producir más moléculas del transcrito, es decir, moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) que el promotor que es nativo de la secuencia codificante. Los promotores adecuados en este contexto incluyen promotores naturales tanto constitutivos como inducibles, así como promotores modificados genéticamente.
En una realización, la célula de azúcares mixtos está libre de marcadores, lo que significa que no están presentes marcadores auxotróficos o dominantes, en particular marcadores de resistencia a antibióticos, en el genoma o extracromosómicamente.
La secuencia codificante utilizada para la sobreexpresión de las enzimas mencionadas anteriormente puede ser preferiblemente homóloga a la célula hospedante de la invención. Sin embargo, pueden usarse secuencias codificantes que son heterólogas a la célula hospedante de la invención.
La sobreexpresión de una enzima, cuando se refiere a la producción de la enzima en una célula genéticamente modificada, significa que la enzima se produce a un mayor nivel de actividad enzimática específica en comparación con la célula hospedante no modificada en condiciones idénticas. Por lo general, esto significa que la proteína enzimáticamente activa (o proteínas en el caso de enzimas de múltiples subunidades) se produce en mayores cantidades, o más bien a un mayor nivel de estado estacionario en comparación con la célula hospedante no modificada en condiciones idénticas. De manera similar, esto normalmente significa que el ARNm que codifica la proteína enzimáticamente activa se produce en mayores cantidades, o de nuevo más bien a un mayor nivel de estado estacionario en comparación con la célula hospedante no modificada en condiciones idénticas. Preferiblemente, en una célula hospedante de la invención, una enzima que se va a sobreexpresar se sobreexpresa por al menos un factor de alrededor de 1,1, alrededor de 1,2, alrededor de 1,5, alrededor de 2, alrededor de 5, alrededor de 10, o alrededor de 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa la sobreexpresión. Debe entenderse que estos niveles de sobreexpresión pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, así como al nivel de estado estacionario del transcrito que codifica la enzima.
Adaptación
La adaptación es el proceso evolutivo mediante el cual una población es más adecuada (se adapta) a su hábitat o hábitats. Este proceso tiene lugar durante varias o muchas generaciones, y es uno de los fenómenos básicos de la biología.
El término adaptación también puede referirse a una característica que es especialmente importante para la supervivencia de un organismo. Tales adaptaciones se producen en una población variable por las formas más adecuadas que se reproducen con más éxito, por selección natural.
Los cambios en las condiciones ambientales alteran el resultado de la selección natural, afectando los beneficios selectivos de adaptaciones posteriores que mejoran la idoneidad de un organismo en las nuevas condiciones. En el caso de un cambio ambiental extremo, la aparición y fijación de adaptaciones beneficiosas puede ser fundamental para la supervivencia. Una gran cantidad de factores diferentes, tales como, por ejemplo, la disponibilidad de nutrientes, la temperatura, la disponibilidad de oxígeno, etcétera, pueden impulsar la evolución adaptativa.
Idoneidad
Existe una relación clara entre la adaptación (el grado en que un organismo es capaz de vivir y reproducirse en un determinado conjunto de hábitats) y la idoneidad. La idoneidad es una estimación y un predictor de la tasa de selección natural. Mediante la aplicación de la selección natural, las frecuencias relativas de fenotipos alternativos variarán con el tiempo, si son hereditarios.
Cambios genéticos
Cuando la selección natural actúa sobre la variabilidad genética de la población, los cambios genéticos son el mecanismo subyacente. De esta forma, la población se adapta genéticamente a sus circunstancias. Los cambios genéticos pueden dar como resultado estructuras visibles, o pueden ajustar la actividad fisiológica del organismo de una manera que se adapte al hábitat modificado.
La evolución adaptativa
Las células de azúcares mixtos están en su preparación sometidas a evolución adaptativa. Una célula de la invención puede adaptarse a la utilización de azúcar mediante la selección de mutantes, espontáneos o inducidos (por ejemplo, por radiación o productos químicos), para el crecimiento en el azúcar deseado, preferiblemente como única fuente de carbono, y más preferiblemente en condiciones anaerobias. La selección de mutantes se puede realizar mediante técnicas que incluyen la transferencia en serie de cultivos, como se describe, por ejemplo, por Kuyper et al. (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664), o por cultivo bajo presión selectiva en un cultivo de quimiostato. Por ejemplo, en una célula hospedante preferida de la invención, al menos una de las modificaciones genéticas descritas anteriormente, incluyendo las modificaciones obtenidas por selección de mutantes, confiere a la célula hospedante la capacidad de crecer en la xilosa como fuente de carbono, preferiblemente como única fuente de carbono, y preferiblemente en condiciones anaerobias. Preferiblemente, la célula no produce esencialmente xilitol, por ejemplo el xilitol producido está por debajo del límite de detección, o es, por ejemplo, menor que alrededor de 5, alrededor de 2, alrededor de 1, alrededor de 0,5, o alrededor de 0,3% del carbono consumido sobre una base molar.
La evolución adaptativa también se describe, por ejemplo, en Wisselink H.W. et al, Applied and Environmental Microbiology, agosto de 2007, p. 4881 -4891.
En una realización de la evolución adaptativa, se aplica un régimen que consiste en un cultivo discontinuo repetido con ciclos repetidos de crecimiento consecutivo en diferentes medios, por ejemplo tres medios con diferentes composiciones (glucosa, xilosa y arabinosa; xilosa y arabinosa. Véase Wisselink et al. (2009) Applied and Environmental Microbiology, febrero de 2009, p. 907-914.
Transformación de levadura y estabilidad genética
La ingeniería genética, es decir, la transformación de células de levadura con ADN recombinante, se hizo factible por primera vez en 1978 [Beggs, 1978; Hinnen et al., 1978]. La tecnología de ADN recombinante en levaduras se ha establecido desde entonces. Se encuentran disponibles una multitud de construcciones de vectores diferentes. Generalmente, estos vectores plasmídicos, denominados vectores lanzadera, contienen material genético derivado de vectores de E. coli que consisten en un origen de replicación y un marcador seleccionable (a menudo el gen de la betalactamasa, ampR), que permiten su propagación en E. coli antes de la transformación en células de levadura. Además, los vectores lanzadera contienen un marcador seleccionable para la selección en levadura. Los marcadores pueden ser genes que codifican enzimas para la síntesis de un aminoácido o nucleótido particular, de modo que las células que portan la supresión (o mutación) genómica correspondiente se complementen para la auxotrofia o autotrofia. Alternativamente, estos vectores contienen marcadores de resistencia heterólogos dominantes, que proporcionan a las células de levadura recombinantes (es decir, las células que han absorbido el ADN y expresan el gen marcador) resistencia a ciertos antibióticos, como g418 (Geneticina), higromicina B o fleomicina. Además, estos vectores pueden contener una secuencia de sitios de restricción (combinados) (sitio de clonación múltiple o MCS) que permitirá clonar ADN extraño en estos sitios, aunque también existen métodos alternativos.
Tradicionalmente, se pueden distinguir cuatro tipos de vectores lanzadera por la ausencia o presencia de elementos genéticos adicionales:
• Plásmidos integradores (Ylp), que por recombinación homóloga se integran en el genoma del hospedante en el locus del marcador u otro gen, cuando éste se abre por restricción y el ADN linealizado se utiliza para la transformación de las células de levadura. Esto generalmente da como resultado la presencia de una copia del ADN extraño insertada en este sitio particular del genoma.
• Plásmidos episomales (YEp), que portan parte de la secuencia de ADN plasmídico 2p necesaria para la replicación autónoma en células de levadura. En la célula de levadura se propagan múltiples copias del plásmido transformado y se mantienen como episomas.
• Plásmidos de replicación autónoma (YRp), que portan un origen de replicación de levadura (ARS, secuencia de replicación autónoma) que permite que los plásmidos transformados se propaguen varios cientos de veces.
• Plásmidos CEN (YCp), que portan, además de una secuencia ARS, una secuencia centromérica (derivada de uno de los cromosomas nucleares) que normalmente garantiza una segregación mitótica estable y normalmente reduce el número de copias del plásmido autorreplicado a solo una.
Estos plásmidos se introducen en las células de levadura mediante transformación. La transformación de células de levadura se puede lograr mediante varias técnicas diferentes, tales como la permeabilización de células con acetato de litio (Ito et al, 1983) y métodos de electroporación.
En la aplicación comercial de microorganismos recombinantes, la inestabilidad del plásmido es el problema más importante. La inestabilidad es la tendencia de las células transformadas a perder sus propiedades manipuladas mediante ingeniería debido a cambios o pérdida de plásmidos. Este tema es discutido en detalle por Zhang et al (Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Advances, Vol. 14, No. 4, p. 401-435, 1996). Las cepas transformadas con plásmidos integradores son extremadamente estables, incluso en ausencia de presión selectiva (Sherman, F. http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman f/yeast/9.html, y referencias allí).
El ADN heterólogo suele introducirse en el organismo en forma de plásmidos extracromosómicos (YEp, YCp e YRp). Desafortunadamente, se ha encontrado tanto con bacterias como con levaduras que las nuevas características pueden no conservarse, especialmente si la presión de selección no se aplica continuamente. Esto se debe a la inestabilidad segregacional del plásmido híbrido cuando las células recombinantes crecen durante un largo período de tiempo. Esto conduce a la heterogeneidad de la población y la variabilidad clonal, y eventualmente a una población celular en la que la mayoría de las células ha perdido las propiedades que se introdujeron por transformación. Si se utilizan vectores con marcadores auxotróficos, el cultivo en medios ricos a menudo conduce a una pérdida rápida del vector, ya que el vector solo se retiene en medios mínimos. La alternativa, el uso de marcadores dominantes de resistencia a los antibióticos, a menudo no es compatible con los procedimientos de producción. El uso de antibióticos puede no ser deseable desde el punto de vista del registro (la posibilidad de que pequeñas cantidades del antibiótico terminen en el producto final) o por razones económicas (costes del uso de antibióticos a escala industrial).
La pérdida de vectores genera problemas en situaciones de producción a gran escala. Existen métodos alternativos para la introducción de ADN para levaduras, tal como el uso de plásmidos integradores (YIp). El ADN se integra en el genoma del hospedante mediante recombinación, lo que da como resultado una alta estabilidad. (Caunt, P. Stability of recombinant plasmids in yeast. Journal of Biotechnology 9(1988) 173 - 192). Hemos descubierto que un método de integración que utiliza los transposones del hospedante es una buena alternativa.
Transposones
En una realización de la invención, la célula puede comprender más de una copia del gen o genes deseados. Por ejemplo, dos o más genes de xilosa isomerasa o gen de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa pueden integrarse en el genoma de células de azúcares mixtos. Esto se puede ejecutar de cualquier forma conocida en la técnica que conduzca a la introducción de los genes. En una realización preferida, esto se puede lograr usando un vector con partes homólogas a secuencias repetidas (transposones) de la célula hospedante. Cuando la célula hospedante es una célula de levadura, las secuencias repetidas adecuadas son las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocidas como secuencia delta.
Los elementos Ty se dividen en dos subfamilias bastante similares denominadas Ty1 y Ty2. Estos elementos tienen alrededor de 6 kilobases (kb) de longitud, y están delimitados por repeticiones terminales largas (LTR), secuencias de alrededor de 335 pares de bases (Boeke JD et al, The Saccharomyces cerevisiae Genome Contains Functional and Nonfunctional Copies of Transposon Ty1. Molecular and Cellular Biology, abril de 1988, p. 1432-1442 Vol. 8, No. 4). En la cepa S. cerevisiae completamente secuenciada, S288c, los transposones más abundantes son Ty1 (31 copias) y Ty2 (13 copias) (Gabriel A, Dapprich J, Kunkel M, Gresham D, Pratt Sc , et al. (2006) Global mapping of transposon location. PLoS Genet 2(12): e212.doi:10.1371/journal.pgen.0020212). Estos transposones consisten en dos marcos de lectura abiertos (ORF) superpuestos, cada uno de los cuales codifica varias proteínas. Las regiones codificantes están flanqueadas por las LTR casi idénticas antes mencionadas. Otros elementos Ty, menos abundantes y más distintos, en S. cerevisiae comprenden Ty3, Ty4 y Ty5. Para cada familia de elementos Ty de longitud completa, hay un orden de magnitud más de elementos LTR individuales dispersos a través del genoma. Se cree que estos surgen por recombinación LTR-LTR de elementos de longitud completa, con un bucle fuera de las regiones codificantes de proteínas internas.
El mecanismo de retrotransposición del retrotransposón Ty se ha aprovechado para integrar múltiples copias en todo el genoma genome (Boeke et al., 1988; Jacobs et al., 1988). Las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocidas como secuencias delta, también son buenas dianas para la integración por recombinación homóloga, ya que existen en alrededor de 150-200 copias que están asociadas a Ty o sitios solos (Boeke, 1989; Kingsman y Kingsman, 1988). (Parekh R.N. (1996). An Integrating Vector for Tunable, High Copy, Stable Integration into the Dispersed Ty DELTA Sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Prog. 1996, 12, 16-21).
La célula hospedante
La célula hospedante puede ser cualquier célula hospedante adecuada para la producción de un producto útil. Una célula de la invención puede ser cualquier célula adecuada, tal como una célula procariota, tal como una bacteria, o una célula eucariota. Normalmente, la célula será una célula eucariota, por ejemplo una levadura o un hongo filamentoso.
Las levaduras se definen aquí como microorganismos eucariotas, e incluyen todas las especies de la subdivisión Eumycotina (Alexopoulos, C. J., 1962, en: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York) que crecen predominantemente en forma unicelular.
Las levaduras pueden crecer por gemación de un talo unicelular, o pueden crecer por fisión del organismo. Una levadura preferida como célula de la invención puede pertenecer a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces o Yarrowia. Preferiblemente, la levadura es aquella capaz de fermentación anaerobia o de oxígeno limitado, más preferiblemente aquella capaz de fermentación alcohólica anaerobia.
Los hongos filamentosos se definen aquí como microorganismos eucariotas que incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina. Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de quitina, celulosa, y otros polisacáridos complejos.
Los hongos filamentosos adecuados para uso como célula de la presente invención son morfológica, fisiológica y genéticamente distintos de las levaduras. Pueden usarse ventajosamente células fúngicas filamentosas ya que la mayoría de los hongos no requieren condiciones estériles para la propagación y son insensibles a las infecciones por bacteriófagos. El crecimiento vegetativo de los hongos filamentosos se produce por elongación de las hifas, y el catabolismo del carbono de la mayoría de los hongos filamentosos es estrictamente aerobio. Los hongos filamentosos preferidos como célula hospedante de la invención pueden pertenecer al género Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremoniurra, Fusarium o Penicillium. Más preferiblemente, la célula fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, a Penicillium chrysogenum, o Rhizopusoryzae. La célula hospedante es una levadura.
Preferiblemente, el hospedante es un hospedante industrial, más preferiblemente una levadura industrial. Un hospedante industrial y una célula de levadura industrial se pueden definir como sigue. Los entornos de vida de las células de levadura en los procedimientos industriales son significativamente diferentes de los del laboratorio. Las células de levadura industriales deben poder funcionar bien en múltiples condiciones ambientales, que pueden variar durante el procedimiento. Tales variaciones incluyen cambios en las fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que en conjunto tienen un impacto potencial en el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae. En condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes al medio ambiente deberían permitir un crecimiento y una producción robustos. Las cepas de levadura industrial son generalmente más resistentes a estos cambios en las condiciones ambientales que pueden ocurrir en las aplicaciones en las que se utilizan, tales como en la industria de la panificación, la industria cervecera, la elaboración del vino, y la industria del etanol. Ejemplos de levadura industrial (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis), Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand).
En una realización, el hospedante es tolerante a inhibidores. Las células hospedantes tolerantes a inhibidores pueden seleccionarse cribando cepas para el crecimiento en materiales que contienen inhibidores, tal como se ilustra en Kadar et al, Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, en el que se seleccionó una cepa ATCC 26602 de S. cerevisiae tolerante a inhibidores.
Preferiblemente, la célula hospedante es industrial y tolerante a inhibidores.
Genes AraA, AraB y AraD
Una célula de la invención es capaz de usar arabinosa. Por lo tanto, una célula de la invención es capaz de convertir L-arabinosa en L-ribulosa y/o xilulosa 5-fosfato y/o en un producto de fermentación deseado, por ejemplo uno de los mencionados aquí.
Los organismos, por ejemplo cepas de S. cerevisiae, capaces de producir etanol a partir de L-arabinosa se pueden producir modificando una célula que introduce los genes araA (L-arabinosa isomerasa), araB (L-ribuloquinasa) y araD (L-ribulosa-5-P4-epimerasa) de una fuente adecuada. Dichos genes pueden introducirse en una célula de la invención con el fin de que sea capaz de utilizar arabinosa. Este enfoque se describe en el documento WO2003/095627. Pueden utilizarse los genes araA, araB y araD de Lactobacillus plantanum, y se describen en el documento WO2008/041840. Pueden utilizarse el gen araA de Bacillus subtilis y los genes araB y araD de Escherichia coli, y se describen en el documento EP1499708. En otra realización, los genes araA, araB y araD pueden derivar de al menos uno del género Clavibacter, Arthrobacter y/o Gramella, en particular uno de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens, y/o Gramella forsetii, como se describe en el documento WO 2009011591.
Genes PPP
Una célula de la invención puede comprender una o más modificaciones genéticas que aumentan el flujo de la ruta de la pentosa fosfato. En particular, la o las modificaciones genéticas pueden conducir a un aumento del flujo a través de la ruta de la parte no oxidativa de la pentosa fosfato. Una modificación genética que provoca un aumento del flujo de la parte no oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato se entiende aquí como una modificación que aumenta el flujo en al menos un factor de alrededor de 1,1, alrededor de 1,2, alrededor de 1,5, alrededor de 2, alrededor de 5, alrededor de 10, o alrededor de 20, en comparación con el flujo en una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa el aumento del flujo. El flujo de la parte no oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato puede medirse haciendo crecer el hospedante modificado en xilosa como única fuente de carbono, determinando la tasa de consumo de xilosa específica y restando la tasa de producción de xilitol específica de la tasa de consumo de xilosa específica, si se produce xilitol. Sin embargo, el flujo de la parte no oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato es proporcional a la tasa de crecimiento en xilosa como única fuente de carbono, preferiblemente con la tasa de crecimiento anaerobio en xilosa como única fuente de carbono. Existe una relación lineal entre la tasa de crecimiento en xilosa como única fuente de carbono (mmax) y el flujo de la parte no oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato. La tasa específica de consumo de xilosa (Qs) es igual a la tasa de crecimiento (m) dividida entre el rendimiento de biomasa en azúcar (Yxs), debido a que el rendimiento de biomasa en azúcar es constante (en un conjunto dado de condiciones: anaerobia, medio de crecimiento, pH, antecedentes genéticos de la cepa, etc.; es decir, Qs = m/Yxs). Por lo tanto, el aumento del flujo de la parte no oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato puede deducirse del aumento de la tasa de crecimiento máxima en estas condiciones, a menos que el transporte (la absorción) sea limitante.
En la célula hospedante pueden introducirse, de diversas formas, una o más modificaciones genéticas que aumentan el flujo de la ruta de la pentosa fosfato. Estas incluyen, por ejemplo, lograr niveles más altos de actividad en estado estacionario de xilulosa quinasa y/o una o más de las enzimas de la ruta de la parte no oxidativa de pentosa fosfato, y/o un nivel reducido en estado estacionario de actividad de aldosa reductasa inespecífica. Estos cambios en los niveles de actividad en estado estacionario pueden efectuarse mediante la selección de mutantes (espontáneos o inducidos por sustancias químicas o radiación) y/o por tecnología de ADN recombinante, por ejemplo por sobreexpresión o inactivación, respectivamente, de genes que codifican las enzimas o factores que regulan estos genes.
En una célula hospedante preferida, la modificación genética comprende la sobreexpresión de al menos una enzima de la ruta de la pentosa fosfato (parte no oxidativa). Preferiblemente, la enzima se selecciona del grupo que consiste en las enzimas que codifican ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa, y transaldolasa. Se pueden sobreexpresar diversas combinaciones de enzimas de la ruta de la pentosa fosfato (parte no oxidativa). Por ejemplo, las enzimas que se sobreexpresan pueden ser al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, y transcetolasa. En una realización de la invención, cada una de las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa se sobreexpresan en la célula hospedante. Es más preferida una célula hospedante en la que la modificación genética comprende al menos la sobreexpresión de ambas enzimas transcetolasa y transaldolasa, ya que dicha célula hospedante ya es capaz de crecer anaerobiamente en xilosa. De hecho, en algunas condiciones, las células hospedantes que sobreexpresan solo la transcetolasa y la transaldolasa ya tienen la misma tasa de crecimiento anaerobio en xilosa que las células hospedantes que sobreexpresan las cuatro enzimas, es decir, la ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Además, las células hospedantes que sobreexpresan ambas enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa se prefieren sobre las células hospedantes que sobreexpresan solo la isomerasa o solo la epimerasa, ya que la sobreexpresión de solo una de estas enzimas puede producir desequilibrios metabólicos.
La enzima “ribulosa 5-fosfato epimerasa” (EC 5.1.3.1) se define aquí como una enzima que cataliza la epimerización de D-xilulosa 5-fosfato en D-ribulosa 5-fosfato, y viceversa. La enzima también se conoce como fosforribulosa epimerasa; eritrosa-4-fosfato isomerasa; fosfocetopentosa 3-epimerasa; xilulosa fosfato 3-epimerasa; fosfocetopentosa epimerasa; ribulosa 5-fosfato 3-epimerasa; D-ribulosa fosfato-3-epimerasa; D-ribulosa 5-fosfato epimerasa; D-ribulosa-5-P 3-epimerasa; D-xilulosa-5-fosfato 3-epimerasa; pentosa-5-fosfato 3-epimerasa; o D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa. Una ribulosa 5-fosfato epimerasa puede definirse adicionalmente por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una ribulosa 5-fosfato epimerasa puede definirse por una secuencia nucleotídica que codifica la enzima, así como por una secuencia nucleotídica que se hibrida con una secuencia nucleotídica de referencia que codifica una ribulosa 5-fosfato epimerasa. La secuencia nucleotídica que codifica la ribulosa 5-fosfato epimerasa se designa aquí RPE1.
La enzima “ribulosa 5-fosfato isomerasa” (EC 5.3.1.6) se define aquí como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-ribosa 5-fosfato en D-ribulosa 5-fosfato, y viceversa. La enzima también se conoce como fosfopentosisomerasa; fosforriboisomerasa; ribosa fosfato isomerasa; 5-fosforribosa isomerasa; D-ribosa 5-fosfato isomerasa; D-ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa; o D-ribosa-5-fosfato aldosa-cetosa-isomerasa. Una ribulosa 5-fosfato isomerasa puede definirse adicionalmente por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una ribulosa 5-fosfato isomerasa puede definirse por una secuencia nucleotídica que codifica la enzima, así como por una secuencia nucleotídica que se híbrida con una secuencia nucleotídica de referencia que codifica una ribulosa 5-fosfato isomerasa. La secuencia nucleotídica que codifica la ribulosa 5-fosfato isomerasa se designa aquí RK/1.
La enzima “transcetolasa” (EC 2.2.1.1) se define aquí como una enzima que cataliza la reacción: D-ribosa 5-fosfato D-xilulosa 5-fosfato<->sedoheptulosa 7-fosfato D-gliceraldehído 3-fosfato, y viceversa. La enzima también se conoce como glicolaldehídotransferasa o sedoheptulosa-7-fosfato:D-gliceraldehído-3-fosfato glicolaldehídotransferasa. Una transcetolasa puede definirse además por su aminoácido. Asimismo, una transcetolasa puede definirse por una secuencia nucleotídica que codifica la enzima, así como por una secuencia nucleotídica que se hibrida con una secuencia nucleotídica de referencia que codifica una transcetolasa. La secuencia nucleotídica que codifica la transcetolasa se designa aquí TKL1.
La enzima “transaldolasa” (EC 2.2.1.2) se define aquí como una enzima que cataliza la reacción: sedoheptulosa 7-fosfato D-gliceraldehído 3-fosfato<->D-eritrosa 4-fosfato D-fructosa 6-fosfato, y viceversa. La enzima también se conoce como dihidroxiacetonatransferasa; dihidroxiacetona sintasa; formaldehído transcetolasa; o sedoheptulosa-7-fosfato:D-gliceraldehído-3-fosfato gliceronatransferasa. Una transaldolasa puede definirse además por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una transaldolasa puede definirse por una secuencia nucleotídica que codifica la enzima, así como por una secuencia nucleotídica que se hibrida con una secuencia nucleotídica de referencia que codifica una transaldolasa. La secuencia nucleotídica que codifica la transcetolasa se designa aquí TAL1.
Genes de xilosa isomerasa o xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa
Según la invención, en el genoma de la célula hospedante se introducen una, dos o más copias de uno o más genes de xilosa isomerasa y/o una o más xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa. La presencia de estos dos o más elementos genéticos confiere a la célula la capacidad de convertir la xilosa por isomerización o reducción.
En una realización, en el genoma de la célula hospedante se introducen una, dos o más copias de uno o más genes de xilosa isomerasa.
Una “xilosa isomerasa” (EC 5.3.1.5) se define aquí como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-xilosa en D-xilulosa, y/o viceversa. La enzima también se conoce como D-xilosa cetoisomerasa. Una xilosa isomerasa aquí también puede ser capaz de catalizar la conversión entre D-glucosa y D-fructosa (y en consecuencia, puede denominarse por lo tanto como una glucosa isomerasa). Una xilosa isomerasa aquí puede requerir un catión bivalente, tal como magnesio, manganeso o cobalto, como cofactor.
Por consiguiente, dicha célula de azúcares mixtos es capaz de isomerizar xilosa a xilulosa. La capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa se confiere a la célula hospedante mediante la transformación de la célula hospedante con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una xilosa isomerasa definida. Una célula de azúcares mixtos isomeriza la xilosa en xilulosa mediante la isomerización directa de xilosa en xilulosa.
Una unidad (U) de actividad de xilosa isomerasa puede definirse aquí como la cantidad de enzima que produce 1 nmol de xilulosa por minuto, en las condiciones descritas por Kuyper et al. (2003, FEMS Yeast Res. 4: 69-78). El gen de la xilosa isomerasa puede tener diversos orígenes, tal como, por ejemplo, Pyromyces sp. como se describe en el documento WO2006/009434. Otros orígenes adecuados son Bacteroides, en particular Bacteroides uniformis, como se describe en el documento PCT/EP2009/52623, Bacillus, en particular Bacillus stearothermophilus, como se describe en el documento PCT/EP2009/052625.
En otra realización, las dos o más copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa se introducen en el genoma de la célula hospedante. En esta realización, la conversión de xilosa se lleva a cabo en una conversión de dos etapas de xilosa en xilulosa mediante un intermedio de xilitol, catalizada por xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, respectivamente. En una realización de la misma, se pueden sobreexpresar la xilosa reductasa (XR), la xilitol deshidrogenasa (XDH), y la xiloquinasa (XK), y opcionalmente uno o más genes que codifican enzimas productoras de NADPH están aumentados y uno o más de los genes que codifican enzimas que consumen NADH están aumentados, como se describe en el documento WO 2004085627.
Gen XKS1
Una célula de la invención puede comprender una o más modificaciones genéticas que aumentan la actividad de xilulosa quinasa específica. Preferiblemente, la modificación o modificaciones genéticas provocan la sobreexpresión de una xilulosa quinasa, por ejemplo por sobreexpresión de una secuencia nucleotídica que codifica una xilulosa quinasa. El gen que codifica la xilulosa quinasa puede ser endógeno a la célula hospedante, o puede ser una xilulosa quinasa que es heteróloga a la célula hospedante. Una secuencia nucleotídica usada para la sobreexpresión de xilulosa quinasa en la célula hospedante de la invención es una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido con actividad de xilulosa quinasa.
La enzima “xilulosa quinasa” (EC 2.7.1.17) se define aquí como una enzima que cataliza la reacción ATP D-xilulosa = ADP D-xilulosa 5-fosfato. La enzima también se conoce como xiluloquinasa fosforilante, D-xiluloquinasa o ATP:D-xilulosa 5-fosfotransferasa. Una xilulosa quinasa de la invención puede definirse adicionalmente por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una xilulosa quinasa puede definirse por una secuencia nucleotídica que codifica la enzima, así como por una secuencia nucleotídica que se híbrida con una secuencia nucleotídica de referencia que codifica una xilulosa quinasa.
En una célula de la invención, una modificación o modificaciones genéticas que aumenten la actividad de xilulosa quinasa específica pueden combinarse con cualquiera de las modificaciones que aumentan el flujo de la ruta de la pentosa fosfato como se describe anteriormente. Sin embargo, esto no es esencial.
De este modo, una célula hospedante de la invención puede comprender solo una modificación o modificaciones genéticas que aumentan la actividad de xilulosa quinasa específica. Los diversos medios disponibles en la técnica para lograr y analizar la sobreexpresión de una xilulosa quinasa en las células hospedantes de la invención son los mismos que los descritos anteriormente para las enzimas de la ruta de la pentosa fosfato. Preferiblemente, en las células hospedantes de la invención, una xilulosa quinasa a sobreexpresar se sobreexpresa por al menos un factor de alrededor de 1,1, alrededor de 1,2, alrededor de 1,5, alrededor de 2, alrededor de 5, alrededor de 10, o alrededor de 20, en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la o las modificaciones genéticas que causan la sobreexpresión. Debe entenderse que estos niveles de sobreexpresión pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, así como al nivel de estado estacionario del transcrito que codifica la enzima.
Supresión del gen de la aldosa reductasa (GRE3)
En la realización, en la que se usa XI como gen para convertir xilosa, puede ser ventajoso reducir la actividad de la aldosa reductasa. Por tanto, una célula de la invención puede comprender una o más modificaciones genéticas que reducen la actividad inespecífica de la aldosa reductasa en la célula hospedante. Preferiblemente, la actividad de la aldosa reductasa inespecífica se reduce en la célula hospedante mediante una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión de o inactivan un gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica. Preferiblemente, la modificación o modificaciones genéticas reducen o inactivan la expresión de cada copia endógena de un gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica en la célula hospedante (denominada aquí supresión de GRE3). Las células hospedantes pueden comprender múltiples copias de genes que codifican aldosa reductasas inespecíficas como resultado de di-, poli- o aneu-ploidía, y/o la célula hospedante puede contener varias (iso)enzimas diferentes con actividad de aldosa reductasa que difieren en la secuencia de aminoácidos y que cada una está codificada por un gen diferente. También, en tales casos, preferiblemente se reduce o inactiva la expresión de cada gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica. Preferiblemente, el gen se inactiva mediante la supresión de al menos parte del gen o mediante la alteración del gen, por lo que en este contexto el término gen también incluye cualquier secuencia no codificante en dirección 5’ o 3’ de la secuencia codificante, cuya supresión o inactivación (parcial) da como resultado una reducción de la expresión de la actividad de la aldosa reductasa inespecífica en la célula hospedante.
Una secuencia nucleotídica que codifica una aldosa reductasa cuya actividad se va a reducir en la célula hospedante de la invención es una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido con actividad de aldosa reductasa.
De este modo, en la invención se incluye específicamente una célula hospedante de la invención que comprende solo una modificación o modificaciones genéticas que reducen la actividad de aldosa reductasa inespecífica en la célula hospedante.
La enzima “aldosa reductasa” (EC 1.1.1.21) se define aquí como cualquier enzima que sea capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. En el contexto de la presente invención, una aldosa reductasa puede ser cualquier aldosa reductasa inespecífica que sea nativa (endógena) de una célula hospedante de la invención y que sea capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. La aldosa reductasas inespecíficas catalizan la reacción:
aldosa NAD(P)H H+ « alditol NAD(P)+
La enzima tiene una amplia especificidad, y también se conoce como aldosa reductasa; poliol deshidrogenasa (NADP+); alditol:NADP oxidorreductasa; alditol:NADP+ 1-oxidorreductasa; NADPH-aldopentosa reductasa; o NADPH-aldosa reductasa.
Un ejemplo particular de tal aldosa reductasa inespecífica que es endógena a S. cerevisiae y que está codificada por el gen GRE3 (Traff et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74). De este modo, una aldosa reductasa de la invención puede definirse adicionalmente por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una aldosa reductasa puede definirse por las secuencias nucleotídicas que codifican la enzima, así como por una secuencia nucleotídica que se hibrida con una secuencia nucleotídica de referencia que codifica una aldosa reductasa.
Identidad de secuencia
La identidad de secuencia (o similitud de secuencia) se define aquí como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótido), según se determina comparando las secuencias. Por lo general, se comparan las identidades o similitudes de secuencia, típicamente en toda la longitud de las secuencias comparadas. Sin embargo, las secuencias se pueden comparar en ventanas de comparación más cortas. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, según sea el caso, según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias.
Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, por ejemplo, BestFit, BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), disponibles públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos usando BLASTP son abertura de espacio 11.0, extensión de espacio 1, matriz Blosum 62. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácido nucleico usando BLASTP son abertura de espacio 11.0, extensión de espacio 1, matriz completa de ADN (matriz de identidad de ADN).
Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, la persona experta también puede tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoácidos “conservativas”, como será evidente para el experto.
Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina.
Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descrita aquí son aquellas en las que se ha eliminado al menos un resto en las secuencias descritas, y se ha insertado un resto diferente en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácidos es conservativo. Las sustituciones conservativas preferidas para cada uno de los aminoácidos de origen natural son las siguientes: Ala a ser; Arg a lys; Asn a gln o his; Asp a glu; Cys a ser o ala; Gln a asn; Glu a asp; Gly a pro; His a asn o gln; He a leu o val; Leu a ile o val; Lys a arg; gln o glu; Met a leu o ile; Phe a met, leu o tyr; Ser a thr; Thr a ser; Trp a tyr; Tyr a trp o phe; y, Val a ile o leu.
Las condiciones de hibridación rigurosas se definen aquí como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos alrededor de 25, preferiblemente alrededor de 50 nucleótidos, 75 o 100, y lo más preferible de alrededor de 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de alrededor de 65°C en una disolución que comprende alrededor de 1 M de sal, preferiblemente 6 x SSC (cloruro de sodio, citrato de sodio) o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica comparable, y se lava a 65°C en una disolución que comprende alrededor de 0,1 M de sal, o menos, preferiblemente 0,2 x SSC o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferiblemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Estas condiciones permitirán habitualmente la hibridación específica de secuencias que tienen alrededor de 90% o más de identidad de secuencia.
Las condiciones moderadas se definen aquí como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de alrededor de 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de alrededor de 45°C en una disolución que comprende alrededor de 1 M de sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica comparable, y se lava a temperatura ambiente en una disolución que comprende alrededor de 1 M de sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferiblemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Estas condiciones permitirán habitualmente la hibridación específica de secuencias que tienen hasta 50% de identidad de secuencia. La persona experta en la técnica podrá modificar estas condiciones de hibridación para identificar específicamente secuencias que varían en identidad entre el 50% y el 90%.
Para aumentar la probabilidad de que la enzima introducida se exprese en forma activa en una célula de la invención, la secuencia nucleotídica codificante correspondiente puede adaptarse para optimizar su uso de codones al de la célula de levadura escogida. Se conocen en la técnica varios métodos para la optimización de codones. Un método preferido para optimizar el uso de codones de las secuencias nucleotídicas al de la levadura es una tecnología de optimización de pares de codones como se describe en los documentos WO2006/077258 y/o W02008/000632. El documento W02008/000632 aborda la optimización de pares de codones. La optimización de pares de codones es un método en el que las secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido se modifican con respecto a su uso de codones, en particular los pares de codones que se usan, para obtener una expresión mejorada de la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido y/o una producción mejorada del polipéptido codificado. Los pares de codones se definen como un conjunto de dos tripletes (codones) subsiguientes en una secuencia codificante.
Como medida simple para la expresión génica y la eficiencia de traducción, aquí se utiliza el Índice de Adaptación de Codones (CAI), como se describe en Xuhua Xia, Evolutionary Bioinformatics 2007, 3: 53-58. El índice utiliza un conjunto de referencia de genes altamente expresados de una especie para evaluar los méritos relativos de cada codón, y se calcula una puntuación para un gen a partir de la frecuencia de uso de todos los codones en ese gen. El índice evalúa hasta qué punto la selección ha sido eficaz para moldear el patrón de uso de codones. En ese sentido, es útil para predecir el nivel de expresión de un gen, para evaluar la adaptación de genes virales a sus hospedantes, y para hacer comparaciones del uso de codones en diferentes organismos. El índice también puede dar una indicación aproximada del probable éxito de la expresión génica heteróloga. En los genes optimizados para pares de codones según la invención, el CAI es 0,6 o más, 0,7 o más, 0,8 o más, 0,85 o más, 0,87 o más, 0,90 o más, 0,95 o más, o alrededor de 1,0.
De este modo, una célula de la invención es una célula que comprende, es decir, se ha transformado con, una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica que codifica los genes araA, araB y araD como se definieron anteriormente. La construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia codificante araA preferiblemente es capaz de expresar los genes araA en la célula hospedante.
Preferiblemente, los genes se expresan en el citosol. La expresión citosólica se puede lograr mediante la eliminación o modificación de una señal de dirección mitocondrial o peroxisómica.
Producción de bioproductos
A lo largo de los años se han hecho sugerencias para la introducción de diversos organismos para la producción de bioetanol a partir de azúcares de cultivos. En la práctica, sin embargo, todos los principales procedimientos de producción de bioetanol han seguido utilizando las levaduras del género Saccharomyces como productoras de etanol. Esto se debe a las muchas características atractivas de la especie Saccharomyces para procedimientos industriales, es decir, una alta tolerancia a ácidos, etanol y osmo-tolerancia, capacidad de crecimiento anaerobio, y por supuesto su alta capacidad fermentativa alcohólica. Las especies de levadura preferidas como células hospedantes incluyen S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus o K fragilis.
Una célula de la invención puede convertir biomasa vegetal, celulosas, hemicelulosas, pectinas, ramnosa, galactosa, frucosa, maltosa, maltodextrinas, ribosa, ribulosa, o almidón, derivados del almidón, sacarosa, lactosa y glicerol, por ejemplo, en azúcares fermentables. Por consiguiente, una célula de la invención puede expresar una o más enzimas, tales como una celulasa (una endocelulasa o una exocelulasa), una hemicelulasa (una endo- o exo-xilanasa o arabinasa) necesaria para la conversión de celulosa en monómeros de glucosa y hemicelulosa en monómeros de xilosa y arabinosa, una pectinasa capaz de convertir las pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico, o una amilasa para convertir el almidón en monómeros de glucosa.
La célula comprende además preferiblemente aquellas actividades enzimáticas requeridas para la conversión de piruvato en un producto de fermentación deseado, tal como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico, o una cefalosporina.
Una célula preferida de la invención es una célula que es naturalmente capaz de fermentación alcohólica, preferiblemente fermentación alcohólica anaerobia. Una célula de la invención tiene preferiblemente una alta tolerancia al etanol, una alta tolerancia al pH bajo (es decir, capaz de crecer a un pH menor que alrededor de 5, alrededor de 4, alrededor de 3, o alrededor de 2,5) y a ácidos orgánicos como ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico y/o productos de degradación del azúcar tales como furfural e hidroximetilfurfural, y/o una alta tolerancia a temperaturas elevadas.
Cualquiera de las características o actividades anteriores de una célula de la invención puede estar presente de forma natural en la célula o puede introducirse o modificarse mediante modificación genética.
Una célula de la invención puede ser una célula adecuada para la producción de etanol. Sin embargo, una célula de la invención puede ser adecuada para la producción de productos de fermentación distintos del etanol. Dichos productos de fermentación no etanólica incluyen, en principio, cualquier producto químico a granel o fino que se pueda producir por un microorganismo eucariota tal como una levadura o un hongo filamentoso.
Dichos productos de fermentación pueden ser, por ejemplo, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico, o una cefalosporina. Una célula preferida de la invención para la producción de productos de fermentación no etanólicos es una célula hospedante que contiene una modificación genética que da como resultado una actividad de alcohol deshidrogenasa disminuida.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a procedimientos de fermentación en los que las células de la invención se utilizan para la fermentación de una fuente de carbono que comprende una fuente de xilosa, tal como xilosa. Además de una fuente de xilosa, la fuente de carbono en el medio de fermentación también puede comprender una fuente de glucosa. La fuente de xilosa o glucosa puede ser xilosa o glucosa como tal o puede ser cualquier oligo o polímero de hidrato de carbono que comprenda unidades de xilosa o glucosa, tales como, por ejemplo, lignocelulosa, xilanos, celulosa, almidón, y similares. Para la liberación de unidades de xilosa o glucosa a partir de dichos hidratos de carbono, pueden añadirse al medio de fermentación carbohidrasas apropiadas (tales como xilanasas, glucanasas, amilasas, y similares), o se pueden producir por la célula. En el último caso, la célula puede modificarse mediante ingeniería genética para producir y excretar tales carbohidrasas. Una ventaja adicional de usar fuentes oligo o poliméricas de glucosa es que permite mantener una concentración (más) baja de glucosa libre durante la fermentación, por ejemplo utilizando cantidades limitantes de la velocidad de las carbohidrasas. Esto, a su vez, evitará la represión de los sistemas necesarios para el metabolismo y transporte de azúcares distintos de la glucosa tal como la xilosa.
En un procedimiento preferido, la célula fermenta tanto la xilosa como la glucosa, preferiblemente de forma simultánea, en cuyo caso preferiblemente se usa una célula que es insensible a la represión de la glucosa para prevenir el crecimiento de diáuxico. Además de una fuente de xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá además el ingrediente apropiado requerido para el crecimiento de la célula. Las composiciones de medios de fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como levaduras son bien conocidas en la técnica. El procedimiento de fermentación es un procedimiento para la producción de un producto de fermentación tal como, por ejemplo, etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico, tal como Penicilina G o Penicilina V y derivados fermentativos de las mismas, y una cefalosporina.
Lignocelulosa
La lignocelulosa, que puede considerarse como una materia prima renovable potencial, generalmente comprende los polisacáridos celulosa (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Además, algo de hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo en materias primas derivadas de la madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, incluyendo tanto monómeros como multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas se produce bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.
Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como los arabinanos pueden constituir una proporción considerable de la masa seca de las paredes celulares típicas de los tejidos vegetales no leñosos (alrededor de un cuarto hasta la mitad de la masa seca puede ser pectinas).
Pretratamiento
El pretratamiento puede ser deseable para liberar azúcares que pueden fermentarse según la invención del material lignocelulósico (incluyendo el hemicelulósico). Estas etapas se pueden ejecutar con métodos convencionales, por ejemplo
Hidrólisis enzimática
La hidrólisis enzimática se puede ejecutar con métodos convencionales.
Fermentación
Un procedimiento de fermentación anaerobio se define aquí como un procedimiento de fermentación que se realiza en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferiblemente menos de alrededor de 5, alrededor de 2,5, o alrededor de 1 mmol/l/h, más preferiblemente se consume 0 mmol/l/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable), y en el que las moléculas orgánicas sirven tanto como dadores de electrones como aceptores de electrones. En ausencia de oxígeno, el NADH producido en la glicólisis y la formación de biomasa no puede oxidarse por fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos utilizan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones e hidrógeno, regenerando así NAD+.
De este modo, en un procedimiento de fermentación anaerobio preferido, el piruvato se usa como un electrón (y aceptor de hidrógeno) y se reduce a productos de fermentación tales como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico, y una cefalosporina.
El procedimiento de fermentación se realiza preferiblemente a una temperatura óptima para la célula. De este modo, para la mayoría de las levaduras o células hospedantes fúngicas, el procedimiento de fermentación se realiza a una temperatura que es menor que alrededor de 42°C, preferiblemente menor que alrededor de 382C. Para levaduras o células hospedantes de hongos filamentosos, el procedimiento de fermentación se realiza preferiblemente a una temperatura que es menor que alrededor de 35, alrededor de 33, alrededor de 30, o alrededor de 28°C, y a una temperatura que es mayor que alrededor de 20, alrededor de 22, o alrededor de 25°C.
El rendimiento de etanol en xilosa y/o glucosa en el procedimiento es preferiblemente de al menos alrededor de 50, alrededor de 60, alrededor de 70, alrededor de 80, alrededor de 90, alrededor de 95, o alrededor de 98%. El rendimiento de etanol se define aquí como un porcentaje del rendimiento máximo teórico.
La invención también se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación.
Los procedimientos de fermentación pueden llevarse a cabo en modo discontinuo, alimentado por lotes, o continuo. También se puede aplicar un procedimiento de hidrólisis y fermentación separadas (SHF), o un procedimiento de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). Para una productividad óptima, también puede ser posible una combinación de estos modos de procedimiento de fermentación.
El procedimiento de fermentación según la presente invención se realiza en condiciones anaerobias.
Un procedimiento de fermentación anaerobia se define aquí como un procedimiento de fermentación realizado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferiblemente menor que alrededor de 5, alrededor de 2,5, o alrededor de 1 mmol/l/h, y en el que las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptores de electrones.
Un procedimiento de fermentación con limitación de oxígeno es un procedimiento en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación de oxígeno está determinado por la cantidad y composición del flujo de gas entrante, así como por las propiedades reales de mezclamiento/transferencia de masa del equipo de fermentación utilizado. Preferiblemente, en un procedimiento en condiciones limitadas de oxígeno, la tasa de consumo de oxígeno es al menos alrededor de 5,5, más preferiblemente al menos alrededor de 6, tal como al menos 7 mmol/l/h. Un procedimiento de la invención comprende la recuperación del producto de fermentación.
En un procedimiento preferido, la célula fermenta tanto la xilosa como la glucosa, preferiblemente de forma simultánea, en cuyo caso preferiblemente se usa una célula que es insensible a la represión de la glucosa para prevenir el crecimiento diáuxico. Además de una fuente de xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá además el ingrediente apropiado requerido para el crecimiento de la célula. Las composiciones de medios de fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como levaduras son bien conocidas en la técnica.
Los procedimientos de fermentación pueden llevarse a cabo en modo discontinuo, alimentado por lotes, o continuo. También se puede aplicar un procedimiento de hidrólisis y fermentación separadas (SHF), o un procedimiento de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). Para una productividad óptima, también puede ser posible una combinación de estos modos de procedimiento de fermentación. Estos procedimientos se describen a continuación con más detalle.
Modo SSF
Para el modo de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), el tiempo de reacción para la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación depende del tiempo para obtener un rendimiento deseado, es decir, rendimiento de conversión de celulosa a glucosa. Tal rendimiento es preferiblemente tan alto como sea posible, preferiblemente 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más, 99% o más, incluso 99,5% o más, o 99,9% o más.
Según la invención, se obtienen concentraciones de azúcar muy altas en el modo SHF y concentraciones de producto muy altas (por ejemplo, etanol) en el modo SSF. En la operación SHF, la concentración de glucosa es 25 g/l o más, 30 g/l o más, 35 g/l o más, 40 g/l o más, 45 g/l o más, 50 g/l o más, 55 g/l o más, 60 g/l o más, 65 g/l o más, 70 g/l o más, 75 g/l o más, 80 g/l o más, 85 g/l o más, 90 g/l o más, 95 g/l o más, 100 g/l o más, 110 g/l o más, 120 g/l o más, o puede ser, por ejemplo, 25 g/l-250 g/l, 30 g/l-200 g/l, 40 g/l-200 g/l, 50 g/l-200 g/l, 60 g/l-200 g/l, 70 g/l-200 g/l, 80 g/l-200 g/l, 90 g/l, 80 g/l-200 g/l.
Concentración de producto en modo SSF
En la operación de SSF, la concentración de producto (g/l) depende de la cantidad de glucosa producida, pero esto no es visible ya que los azúcares se convierten en producto en el SSF, y las concentraciones de producto pueden relacionarse con la concentración de glucosa subyacente mediante la multiplicación con el rendimiento máximo teórico (Yps máx en g de producto por gramo de glucosa).
El rendimiento máximo teórico (Yps máx en g de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación puede derivarse de la bioquímica de los libros de texto. Para el etanol, 1 mol de glucosa (180 g) produce según la ruta de fermentación de la glicólisis normal en levadura 2 moles de etanol (= 2x46 = 92 g de etanol. Por tanto, el rendimiento máximo teórico de etanol sobre glucosa es 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glucosa.
Para butanol (PM 74 g/mol) o isobutanol, el rendimiento máximo teórico es 1 mol de butanol por mol de glucosa. Entonces Yps máx para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 g de (iso-)butanol/g de glucosa.
Para el ácido láctico, el rendimiento de fermentación para la fermentación homoláctica es 2 moles de ácido láctico (PM = 90 g/mol) por mol de glucosa. Según esta estequiometría, el Yps máx = 1 g de ácido láctico/g de glucosa.
Para otros productos de fermentación, se puede realizar un cálculo similar.
Modo SSF
En la operación de SSF, la concentración de producto es 25 g * Yps g/l o más, 30 * Yps g/l o más, 35 g * Yps/l o más, 40 * Yps g/l o más, 45 * Yps g/l o más, 50 * Yps g/l o más, 55 * Yps g/l o más, 60 * Yps g/l o más, 65 * Yps g/l o más, 70 * Yps g/l o más, 75 * Yps g/l o más, 80 * Yps g/l o más, 85 * Yps g/l o más, 90 * Yps g/l o más, 95 * Yps g/l o más, 100 * Yps g/l o más, 110 * Yps g/l o más, 120 g/l * Yps o más, o puede ser, por ejemplo, 25 * Yps g/l-250 * Yps g/l, 30 * Yps gl/l-200 * Yps g/l, 40 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 50 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 60 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 70 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 80 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 90 * Yps g/l, 80 * Yps g/l-200 * Yps g/l.
En consecuencia, la invención proporciona un método para la preparación de un producto de fermentación, método el cual comprende:
a. degradar la lignocelulosa usando un método como se describe aquí; y
b. fermentar el material resultante,
para preparar así un producto de fermentación.
Recuperación del producto de fermentación
Para la recuperación del producto de fermentación se utilizan las tecnologías existentes. Para diferentes productos de fermentación, son apropiados diferentes procedimientos de recuperación. Los métodos existentes para recuperar etanol a partir de mezclas acuosas suelen utilizar técnicas de fraccionamiento y adsorción. Por ejemplo, puede usarse un destilador de cerveza para procesar un producto fermentado, que contiene etanol en una mezcla acuosa, para producir una mezcla que contiene etanol enriquecido, que entonces se somete a fraccionamiento (por ejemplo, destilación fraccionada u otras técnicas similares). A continuación, las fracciones que contienen las concentraciones más altas de etanol se pueden hacer pasar a través de un adsorbedor para eliminar del etanol la mayor parte, si no toda, del agua restante.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención:
EJEMPLOS
A menos que se indique lo contrario, los métodos utilizados son técnicas bioquímicas estándar. Ejemplos de libros de texto de metodología general adecuados incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Transformación de S. cerevisiae
La transformación de S. cerevisiae se realizó según lo descrito por Gietz y Woods (2002; Transformation of the yeast by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96).
PCR de colonias
Se recogió un aislado de una sola colonia con un palillo de plástico, y se resuspendió en 50 pl de agua milliQ. La muestra se incubó durante 10 minutos a 99°C. Se utilizaron 5 pl de la muestra incubada como molde para la reacción de PCR, utilizando ADN polimerasa Phusion® (Finnzymes) según las instrucciones proporcionadas por el proveedor. Condiciones de reacción de PCR:
Figure imgf000020_0001
Composición del medio
Experimentos de crecimiento: las cepas de Saccharomyces cerevisiae se cultivan en un medio que tiene la siguiente composición: 0,67% (p/v) base de nitrógeno de levadura o medio sintético (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) y glucosa, arabinosa, galactosa o xilosa, o una combinación de estos sustratos (véase más abajo). Para placas de agar, el medio se suplementa con agar bacteriológico al 2% (p/v).
Producción de etanol: los cultivos se realizaron a 30°C en 100 ml de medio modelo sintético (medio Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) con 5% de glucosa, 5% de xilosa, 3,5% de arabinosa y 1-1,5% de galactosa) en el BAM (Biological Activity Monitor, Halotec, Países Bajos). El pH del medio se ajustó a 4,2 con NaOH 2 M/H2SO4 antes de la esterilización. El medio sintético para cultivo anaerobio se suplementó con 0,01 gl-1 de ergosterol y 0,42 gl-1 de Tween 80 disuelto en etanol (Andreasen y Stier. J. Cell Physiol. 41:23-36, 1953; y Andreasen y Stier. J. Cell Physiol.
43:271-281, 1954). Los cultivos se agitaron mediante un agitador magnético. Las condiciones anaerobias se desarrollaron rápidamente durante la fermentación ya que el cultivo no se aireó. La producción de CO2 se monitorizó constantemente. La conversión de azúcar y la formación de producto se analizaron por RMN. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm en un espectrofotómetro LKB Ultrospec K.
Los precultivos se prepararon inoculando 25 ml de medio Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) suplementado con glucosa al 2% en un matraz de agitación de 100 ml con un cultivo madre congelado o una sola colonia de una placa de agar. Después de la incubación a 30°C en un agitador orbital (200 rpm) durante alrededor de 24 horas, este cultivo se recogió y se usó para la inoculación del BAM a una OD600 de aproximadamente 2.
Ejemplo 1
Introducción de los genes araA, araBy araDen el genoma de S. cerevisiae
1.1 Construcción de un vector de expresión que contiene los genes para la ruta de la arabinosa
El plásmido pPWT018, como se muestra en la figura 2, se construyó de la siguiente manera: el vector pPWT006 (figura I, que consiste en un locus SlT2 (Gottlin-Ninfa y Kaback (1986) Molecular and Cell Biology vol. 6, no. 6, 2185-2197) y los marcadores que permiten la selección de transformantes en el antibiótico G418 y la capacidad de crecer en acetamida (véase más arriba), se digirió con las enzimas de restricción. BsiWl y Mlul. El marcador kanMX, que confiere resistencia a G418, se aisló de p427TEF (Dualsystems Biotech), y se ha descrito en la bibliografía un fragmento que contiene el marcador amdS (Swinkels, B.W., Noordermeer, A.C.M. y Renniers, A.C.H.M (1995) The use of the amdS cDNA of Aspergillus nidulans as a dominant, bidirectional selectable marker for yeast transformation. Yeast Volumen I I , Publicación 1995A, página S579; y documento US 6051431). Los genes que codifican la arabinosa isomerasa (araA), L-ribuloquinasa (araB) y L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (araD) de Lactobacillus plantarum, como se describe en la solicitud de patente WO2008/041840, se sintetizaron por BaseClear (Leiden, Países Bajos). Se sintetizó un fragmento grande, que alberga los tres genes de arabinosa mencionados anteriormente, bajo el control de (o ligado operativamente a) promotores fuertes de S. cerevisiae, es decir, el promotor TDH3 que controla la expresión del gen araA, el promotor ENO1 que controla el gene araB, y el promotor PGI1 que controla el gen araD. Este fragmento estaba rodeado por las enzimas de restricción únicas Acc65l y Mlul. La clonación de este fragmento en pPWT006 digerido con Mlul y BsiWl, dio como resultado el plásmido pPWT018 (figura 2). La secuencia del plásmido pPWT018 se muestra en SEQ ID 17.
1.2 Transformación de levadura
CEN.PK113-7D (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) se transformó con el plásmido pPWT018, que previamente se linealizó con Sfi'l (New England Biolabs), según las instrucciones del proveedor. Se diseñó un sitio de Sfil sintético en el flanco 5’ del gen SlT2 (véase la figura 2). Las mezclas de transformación se sembraron sobre agar YPD (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos de agar) que contenía 100 mg de G418 (Sigma Aldrich) por ml. Después de dos a cuatro días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, sin adición de ADN en el experimento de transformación) dio como resultado placas de YPD/G418 en blanco. La integración del plásmido pPWT018 se dirige al locus SlT2. Los transformantes se caracterizaron usando técnicas de PCR y transferencia Southern.
Las reacciones de PCR, que son indicativas de la integración correcta de una copia del plásmido pPWT018, se realizaron con los cebadores indicados por SEQ ID 18 y 15, y 15 y 14 (véase la figura 4). Con los pares de cebadores de SEQ ID 18 y 15, se comprobó la integración correcta en el locus SlT2. Si el plásmido pPWT018 se integró en múltiples copias (integración de cabeza a cola), el par de cebadores de SEQ ID 15 y 14 dará un producto de PCR. Si el último producto de PCR está ausente, esto es indicativo de la integración de una copia de pPWT018. Una cepa en la que se integró una copia del plásmido pPWT018 en el locus SlT2 se denominó BIE104R2.
1.3 Rescate del marcador
Para poder transformar la cepa de levadura con otras construcciones, utilizando los mismos marcadores de selección, es necesario eliminar los marcadores seleccionables. El diseño del plásmido pPWT018 fue tal que, tras la integración de pPWT018 en el cromosoma, las secuencias homólogas están muy próximas entre sí. Este diseño permite que los marcadores seleccionables se pierdan por recombinación intramolecular espontánea de estas regiones homólogas.
Tras el crecimiento vegetativo, tendrá lugar la recombinación intramolecular, aunque con baja frecuencia. La frecuencia de esta recombinación depende de la longitud de la homología y del locus en el genoma (resultados no publicados). Tras la transferencia secuencial de una subfracción del cultivo a medio reciente, los recombinantes intramoleculares se acumularán con el tiempo.
Para ello, se cultivó la cepa BIE104R2 en medio YPD (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa), partiendo de un aislado de una sola colonia. Se usaron 25 pl de un cultivo de una noche para inocular medio YPD reciente. Después de al menos cinco de tales transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo, y las células se diluyeron hasta una concentración de aproximadamente 5000 por ml. Se sembraron 100 pl de la suspensión celular en medio de Base de Carbono de Levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6,8), (NH4)2SO4 al 0,1%, fluoroacetamida 40 mM (Amersham) y agar (Difco) al 1,8%. Las células idénticas a las células de la cepa BIE104R2, es decir, sin recombinación intracelular, todavía contienen el gen amdS. Para esas células, la fluoroacetamida es tóxica. Estas células no podrán crecer y no formarán colonias en un medio que contenga fluoroacetamida. Sin embargo, si se ha producido una recombinación intramolecular, las variantes de BIE104R2 que han perdido los marcadores seleccionables podrán crecer en el medio de fluoroacetamida, ya que no pueden convertir la fluoroacetamida en compuestos inhibidores del crecimiento. Esas células formarán colonias en este medio de agar.
Las colonias resistentes a fluoroacetamida así obtenidas se sometieron a análisis de PCR usando cebadores de SEQ ID 18 y 15, y 14 y 19. Los cebadores de SEQ ID 18 y 15 darán una banda si la recombinación de los marcadores seleccionables ha tenido lugar como se pretendía. Como resultado, el casete con los genes araA, araB y araD bajo el control de los promotores de levadura fuertes se ha integrado en el locus SlT2 del genoma de la cepa hospedante. En ese caso, una reacción de PCR utilizando cebadores de SEQ ID 14 y 19 no debería dar como resultado un producto de PCR, ya que el cebador 14 ceba en una región que debería perderse debido a la recombinación. Si se obtiene una banda con los últimos cebadores, esto es indicativo de la presencia del plásmido completo pPWT018 en el genoma, por lo que no ha tenido lugar la recombinación.
Si los cebadores de SEQ ID 18 y 15 no dan como resultado un producto de PCR, se ha producido la recombinación, pero de tal manera que el plásmido completo pPWT018 se ha recombinado fuera del genoma. No solo se perdieron los marcadores seleccionables, sino también los genes de arabinosa. De hecho, se ha recuperado levadura de tipo salvaje.
Los aislados que mostraron resultados de PCR según la integración de una copia de pPWT018 se sometieron a análisis de transferencia Southern. El ADN cromosómico de las cepas CEN.PK113-7D y los recombinantes correctos se digirieron con EcoRI y HindIII (doble digestión). Se preparó una sonda SlT2 con cebadores de SEQ ID 20 y 21, usando como molde ADN cromosómico de CEN.PK113-7D. El resultado del experimento de hibridación se muestra en la figura 3. El patrón de hibridación esperado puede deducirse de los mapas físicos como se muestra en la figura 4 (paneles a y b).
En la cepa de tipo salvaje, se observa una banda de 2,35 kb, que está de acuerdo con el tamaño esperado del gen de tipo salvaje (figura 4, panel a). Tras la integración y la pérdida parcial por recombinación del plásmido pPWT018, se esperaba una banda de 1,06 kb (figura 4, panel b). De hecho, se observa esta banda, como se muestra en la figura 3 (carril 2).
Una de las cepas que mostró el patrón correcto de bandas en la transferencia Southern (como se puede deducir de la figura 3) es la cepa designada como BIE104A2.
1.4 Introducción de cuatro genes expresados constitutivamente de la ruta de la pentosa fosfato no oxidativa
Saccharomyces cerevisiae BIE104A2, que expresa constitutivamente los genes araA, araB y araD, se transformó con el plásmido pPWT080 (figura 5). La secuencia del plásmido pPWT080 se muestra en SEQ ID NO: 4. El procedimiento para la transformación y selección, después de seleccionar un transformante de una copia, es el mismo que se describe anteriormente en las secciones 1.1, 1.2 y 1.3). En resumen, BIE104A2 se transformó con pPWT080 digerido con Sfil. Las mezclas de transformación se sembraron sobre agar YPD (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos de agar) que contenía 100 pg de G418 (Sigma Aldrich) por ml.
Después de dos a cuatro días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, sin adición de ADN en el experimento de transformación) dio como resultado placas de YPD/G418 en blanco.
La integración del plásmido pPWT080 está dirigida al locus GRE3. Los transformantes se caracterizaron usando técnicas de PCR y transferencia Southern.
Un transformante que muestra la integración correcta de una copia del plásmido pPWT080, según el patrón de hibridación esperado, se denominó BIE104A2F1.
Para poder introducir los genes que codifican xilosa isomerasa y xiluloquinasa (ejemplo 5), es necesario eliminar los marcadores de selección introducidos por la integración del plásmido pPWT080. Para ello, la cepa BIE104A2F1 se cultivó en medio YPD, partiendo de un aislado de colonia. Se usaron 25 pl de un cultivo de una noche para inocular medio YPD reciente. Después de cinco transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo, y las células se diluyeron hasta una concentración de aproximadamente 5000 por ml. Se sembraron 100 pl de la suspensión celular en medio de Base de Carbono de Levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6,8), (NH4)2SO4 al 0,1%, fluoroacetamida 40 mM (Amersham) y agar (Difco) al 1,8%. Las colonias resistentes a fluoroacetamida se sometieron a análisis de PCR y, en caso de perfiles de PCR correctos, a análisis de transferencia Southern (sección 1.3 del ejemplo 1). Una de las cepas que mostró el patrón correcto de bandas en la transferencia Southern es la cepa designada como BIE104A2P1.
Ejemplo 2
Evolución adaptativa
2.1 Evolución adaptativa (aerobiamente)
Se utilizó un aislado de una sola colonia de la cepa BIE104A2P1 para inocular medio YNB (Difco) suplementado con galactosa al 2%. El precultivo se incubó durante aproximadamente 24 horas a 30°C y 280 rpm. Las células se recolectaron e inocularon en medio YNB que contenía galactosa al 1% y arabinosa al 1%, a una OD600 de partida de 0,2 (figura 8). Las células se cultivaron a 30°C y 280 rpm. La densidad óptica a 600 nm se monitorizó regularmente.
Cuando la densidad óptica alcanzó un valor de 5, se transfirió una alícuota del cultivo a medio YNB reciente que contenía el mismo medio. La cantidad de células añadidas fue tal que la OD600 de partida del cultivo fue 0,2. Después de alcanzar una OD600 de 5 nuevamente, se transfirió una alícuota del cultivo a medio YNB que contenía 2% de arabinosa como única fuente de carbono (evento indicado por (1) en la figura 8).
Tras la transferencia a YNB con arabinosa al 2% como única fuente de carbono, se pudo observar el crecimiento después de aproximadamente dos semanas. Cuando la densidad óptica a 600 nm alcanzó un valor de al menos 1, las células se transfirieron a un matraz de agitación con medio YNB reciente suplementado con arabinosa al 2% a una OD600 de partida de 0,2 (figura 8).
La transferencia secuencial se repitió tres veces, como se muestra en la figura 8. La cepa resultante, que fue capaz de crecer rápidamente en arabinosa, se denominó BIE104A2P1c.
2.2 Evolución adaptativa (anaerobiamente)
Después de la adaptación al crecimiento en arabinosa en condiciones aerobias, se inoculó una sola colonia de la cepa BIE104A2P1c en medio YNB suplementado con glucosa al 2%. El precultivo se incubó durante aproximadamente 24 horas a 30°C y 280 rpm. Las células se recolectaron e inocularon en medio YNB que contenía 2% de arabinosa, con densidad óptica OD600 de 0,2. Los matraces se cerraron con cierres waterlocks, asegurando las condiciones de crecimiento anaerobio después de que se agotara el oxígeno del medio y del espacio de cabeza. Después de alcanzar un mínimo de OD 600 de 3, se transfirió una alícuota del cultivo a medio YNB reciente que contenía 2% de arabinosa (figura 9), cada uno con densidad óptica OD600 de 0,2.
Después de varias transferencias, la cepa resultante se denominó BIE104A2P1d (= BIE201).
Ejemplo 3
Determinación de la capacidad fermentativa
Se utilizaron aislados de una sola colonia de las cepas BIE104, BIE104A2P1c y BIE201 para inocular medio YNB (Difco) suplementado con glucosa al 2%. Los precultivos se incubaron durante aproximadamente 24 horas a 30°C y 280 rpm. Las células se recolectaron e inocularon en un medio modelo sintético (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992; glucosa al 5%, xilosa al 5%, arabinosa al 3,5%, galactosa al 1%) a una OD600 inicial de aproximadamente 2 en el BAM. La producción de CO2 se monitorizó constantemente. La conversión de azúcar y la formación de producto se analizaron por RMN. Los datos representan la cantidad residual de azúcares al indicado (glucosa, arabinosa, galactosa y xilosa en gramos por litro) y la formación de (sub)productos (etanol, glicerol). El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm (figuras 10, 11, 12). El experimento se desarrolló durante aproximadamente 140 horas.
Los experimentos muestran claramente que la cepa de referencia BIE104 convirtió la glucosa rápidamente, pero no fue capaz de convertir ni arabinosa ni galactosa en 140 horas (figura 10). Sin embargo, las cepas BIE104A2P1c y BIE201 fueron capaces de convertir arabinosa y galactosa (figura 11 y 12, respectivamente). La utilización de galactosa y arabinosa comenzó inmediatamente después del agotamiento de la glucosa después de menos de 20 horas. Ambos azúcares se convirtieron simultáneamente. Sin embargo, la cepa BIE201, que se mejoró para el crecimiento de arabinosa en condiciones anaerobias, consumió ambos azúcares más rápidamente (figura 12). En todas las fermentaciones, solo se generó glicerol como subproducto. Los datos de la fermentación de BIE201 se dan aquí en la tabla 2.
Tabla 2: Concentraciones de azúcar y concentraciones de etanol (g/l) de fermentación de BIE201 como se muestra en la figura 12. La concentración máxima de etanol se calcula multiplicando las concentraciones por 0,51 para cada azúcar y sumando. La concentración de etanol a 136 h (39,2 g/l) significa un rendimiento de etanol de 0,45 etanol/g de azúcar. Este rendimiento muestra que todos los azúcares se convirtieron en etanol.
Concentraciones
Figure imgf000024_0001
Concentraciones máximas de etanol (en g/l) a partir de
Glucosa 21,8
Arabinosa 16,1
Galactosa 6,6
Total 44,5
Rendimiento de etanol experimental 0,45 g de etanol/g de azúcar
A partir de este cálculo, queda claro que los azúcares glucosa, galactosa y arabinosa se convierten cada uno en etanol.
Ejemplo 4
Efecto de los genes PPP sobre la conversión de azúcar
Para evaluar el efecto de los genes PPP sobre la conversión de azúcar, se inocularon colonias individuales de la cepa BIE104A2 y BIE105A2 en medio YNB (Difco) suplementado con glucosa al 2%. Ambas cepas contienen los genes de arabinosa, y se desarrollaron para el crecimiento en arabinosa (como se describe en el ejemplo 2, sección 2.1). La cepa BIE105A2 tiene los antecedentes de una cepa industrial. Sin embargo, se transformó con los mismos métodos y construcciones que se describieron anteriormente (ejemplo 1, sección 1.2).
Los precultivos se cosecharon e inocularon en medio modelo de fibra de maíz sintético (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992; glucosa al 5%, xilosa al 5%, arabinosa al 3,5%, galactosa al 1,5%) con una OD600 de partida de aproximadamente 2 en el BAM. La producción de CO2 se monitorizó constantemente. La conversión de azúcar y la formación de producto se analizaron por RMN. Los datos representan la cantidad residual de azúcares al indicado (glucosa, arabinosa, galactosa y xilosa en gramos por litro) y la formación de (sub)productos (etanol, glicerol). El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm. El experimento se desarrolló durante aproximadamente 160 horas.
Los experimentos muestran que ambas cepas son capaces de convertir arabinosa y galactosa inmediatamente después del agotamiento de la glucosa sin la sobreexpresión de los genes PPP (figuras 13 y 14).
Ejemplo 5
Introducción de genes expresados constitutivamente que codifican xilosa isomerasa y xiluloquinasa
5.1 Transformación de levadura
La cepa BIE104A2P1 (MATa URA3 HlS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2 SlT2::[TDH3-araA! ENO1-araB, PGl1-araD] AGRE3::[TP!1p-TAL1, ADH1p-TKL1, PGI1p-RPE1, ENO1p-RKl1]) se transformó con el plásmido pPWT042 (figura 16). El plásmido pPWT042 deriva del vector pPWT007 (figura 15). Contiene la xiluloquinasa con pares de codones optimizados de S. cerevisiae y la xilosa isomerasa con pares de codones optimizados de Bacteroides uniformis (SEC 2) como se describe en la solicitud de patente PCT/EP2009/52623. Antes de la transformación de BIE104A2P1, pPWT042 se linealizó utilizando la enzima de restricción Sf/1, según las instrucciones proporcionadas por el proveedor. Las mezclas de transformación se sembraron sobre agar YPD (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos de agar) que contenía 100 mg de G418 (Sigma Aldrich) por ml.
Después de dos a cuatro días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, sin adición de ADN en el experimento de transformación) dio como resultado placas de YPD/G418 en blanco.
Tras la digestión del plásmido pPWT042 con Sfil, su integración está dirigida al locus SIT4 ((Gottlin-Ninfa y Kaback (1986) Molecular and Cellular Biology Vol. 6, No. 6, 2185-2197) en el genoma (figura 17). Los transformantes se caracterizaron usando técnicas de PCR y transferencia Southern, como se describe en el ejemplo 1 (sección 1.2).
Una cepa con una copia del plásmido pPWT042 integrado en el genoma, se denominó BIE104A2P1Y9.
5.2 Experimentos de crecimiento
Se utilizaron aislados de una sola colonia de las cepas BIE104A2P1Y9 para inocular medio YNB (Difco) suplementado con glucosa al 2% o galactosa al 2%. Los matraces inoculados se incubaron a 30°C y 280 rpm hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó un valor de al menos 2,0.
El medio YNB suplementado con arabinosa al 1% y xilosa al 1% se inoculó con los cultivos durante la noche a una OD600 de partida de 0,2. Las células se cultivaron a 30°C y 280 rpm. La densidad óptica a 600 nm se monitorizó regularmente. Cuando la densidad óptica alcanzó un valor mayor que 2,0, se transfirió una alícuota del cultivo a medio YNB reciente que contenía 2% de xilosa y 0,2% de arabinosa. La cantidad de células añadidas fue tal que la OD600 de partida del cultivo fue 0,2.
La densidad óptica se monitorizó regularmente. Los resultados se muestran en la figura 18, panel a (precultivos en galactosa) y panel b (precultivos en glucosa).
Los resultados muestran claramente que las cepas son capaces de utilizar glucosa, galactosa, arabinosa y xilosa.
5.3 Rescate del marcador
Para eliminar el marcador de selección introducido por la integración del plásmido pPWT042, la cepa BIE104A2P1Y9 se cultivó en medio YPD, partiendo de un aislado de colonia. Se usaron 25 ml de un cultivo de una noche para inocular medio YPD reciente. Después de transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo, y las células se diluyeron hasta una concentración de aproximadamente 5000 por ml. Se sembraron 100 ml de la suspensión celular en medio de Base de Carbono de Levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6,8), (NH4)2SO4 al 0,1%, fluoroacetamida 40 mM (Amersham) y agar (Difco) al 1,8%. Las colonias resistentes a fluoroacetamida se sometieron a análisis de PCR y, en caso de perfiles de PCR correctos, a análisis de transferencia Southern (sección 1.3, ejemplo 1). Una de las cepas que mostró el patrón correcto de bandas en la transferencia Southern es la cepa designada como BIE104A2P1X9.
5.4 Experimentos de crecimiento
Se utilizaron aislados de una sola colonia de la cepa BIE104A2P1X9 (BIE104A2P1X9a1 y BIE104A2P1X9a2) para inocular medio Verduyn (Difco) suplementado con glucosa al 2%. Los matraces inoculados se incubaron a 30°C y 280 rpm durante aproximadamente 24 horas.
El medio Verduyn suplementado con xilosa al 2% se inoculó con los cultivos durante la noche a una OD600 de partida de 0,2. Las células se cultivaron a 30°C y 280 rpm. La densidad óptica a 600 nm se monitorizó regularmente. Los resultados se muestran en la figura 19.
Los resultados muestran claramente que ambas colonias independientes de la cepa BIE104A2P1X9 todavía son capaces de utilizar xilosa después del rescate del marcador. Como ya se mostró en el ejemplo 3, la cepa es capaz de utilizar glucosa, arabinosa y galactosa (Fig. 11 y Fig. 12).
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la producción de etanol a partir de una composición de azúcar, que comprende las siguientes etapas:
a) fermentar la composición de azúcar en presencia de una célula de azúcares mixtos, que es una levadura perteneciente al género Saccharomyces, y
b) recuperar etanol,
en el que la levadura comprende los genes araA, araB y araD, y la composición de azúcar comprende glucosa, galactosa y arabinosa, en el que los azúcares glucosa, galactosa y arabinosa se convierten en etanol, y en el que la fermentación se realiza en condiciones anaerobias.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la composición de azúcar se produce a partir de material lignocelulósico mediante:
a) pretratamiento de uno o más materiales lignocelulósicos para producir material lignocelulósico pretratado; b) tratamiento enzimático del material lignocelulósico pretratado para producir la composición de azúcar.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la célula de azúcares mixtos es una Saccharomyces cerevisiae.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en el que la célula de azúcares mixtos comprende una supresión de un gen de la aldosa reductasa.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la galactosa y la arabinosa se convierten simultáneamente.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la célula de azúcares mixtos comprende genes PPP sobreexpresados TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la célula de azúcares mixtos comprende un gen xylA y/o gen XKS1.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en el que los genes se han introducido en la célula de azúcares mixtos introduciendo en una célula hospedante:
a) un grupo que consiste en genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, bajo el control de promotores fuertes, b) un grupo que consiste en un gen xylA y el gen XKS1, ambos bajo el control de promotores constitutivos, c) un grupo que consiste en los genes araA, araB y araD, y/o un grupo de gen xylA y el gen XKS1;
y
d) supresión de un gen de la aldosa reductasa;
y la evolución adaptativa de la construcción de azúcares mixtos para producir la célula de azúcares mixtos.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la célula hospedante es una célula resistente a inhibidores.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la célula hospedante es una cepa industrial.
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