KR20150065213A

KR20150065213A - 감소된 에탄올 생산능을 갖는 효모 세포 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150065213A
Application number: KR1020130149993A
Authority: KR
Inventors: 김성수; 강창덕; 조광명; 이승현
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2015-06-15
Also published as: US9453246B2; US20150167031A1

Abstract

알코올 데히드로게나제 6의 활성이 증가되어 있고, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 활성이 감소있는 효모 세포, 및 이를 이용하여 에탄올 생산을 감소시키는 방법 및 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

감소된 에탄올 생산능을 갖는 효모 세포 및 이의 용도{Yeast cell having reduced ethanol productivity and use thereof}

감소된 에탄올 생산능을 갖는 효모 세포 및 이의 용도에 관한 것이다.

락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.

PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.

또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.

현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스(포도당), 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다.

따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있는 균주 및 그를 이용한 락테이트 생산 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 감소된 에탄올 생산능을 갖는 효모 세포를 제공한다.

다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 에탄올 생산을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

일 양상은 알코올 데히드로게나제 6의 활성이 증가되어 있고, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 활성이 감소되어 있는 효모 세포를 제공한다.

다른 양상은 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 유전자를 포함하고, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 활성이 감소되어 있는 효모 세포를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "락테이트 (lactate)"는 "젖산 (lactic acid)" 또는 그의 염을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가", "효소 활성 증가", "증가된 활성", 또는 "증가된 효소 활성"은 세포 또는 단리된 효소가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정된 활성 수준보다 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 효소에 대해 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 본래 조작되지 않은 효소에 의한 동일한 생화학적 전환 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 효소의 증가된 효소 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

본 명세서에서 유전적으로 조작되지 않은 세포는 알코올 데히드로게나제 6의 활성이 증가되어 있는 효모 세포가 유래된 모세포 또는 야생형의 세포가 포함된다.

반면, 본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 "불활성화" 또는 "감소", 활성이 "불활성화"되었거나 "감소" 효소는 세포 또는 단리된 효소 또는 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정된 활성 수준보다 낮은 활성 수준을 나타내거나 활성이 없는 것을 의미한다. 즉 해당 효소에 대해 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 본래 조작되지 않은 효소에 의한 동일한 생화학적 전환 활성보다 약 20%이상, 약 30%이상, 약 40%이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소의 감소된 효소 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.

상기 효소의 활성이 불활성화되거나 또는 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 치환, 부가 또는 결실에 의한 것일 수 있다. 일례로 상기 효소의 불활성화 또는 감소는 상동 재조합에 의해 야기될 수 있으며, 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5' 비코딩 서열(5'-non coding sequence)과 3' 비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 명세서에 있어서, 용어 "불활성화 (inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감소 (depression)"는 유전자의 발현이 조작되지 않은 효모에 비하여 낮은 수준으로 발현되거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 감소되어 있는 것을 의미할 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 유전자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것에 의한 것일 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 상동 재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자 (paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 불활성화 또는 감소 될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.

효소 활성의 증가는 조작되지 않은 세포에 비하여 상기 활성을 나타내는 효소를 코딩하는 유전자의 과발현 등으로 발현 수준이 증가하거나, 효소 자체의 비활성이 증가하는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서, 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬 (align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 정렬하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 개수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 개수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 개수를 비교 범위 내의 위치의 총 개수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign^TM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성일 수 있다.

상기 효모 세포는 감소된 에탄올 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 적절한 대조군에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 또는 약 65% 이상 감소된 것일 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 자낭균류(ascomycota)일 수 있다. 상기 자낭균류는 사카로미세타시에(saccharomycetaceae) 일 수 있다. 상기 사카로미세타시에는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 속, 캔디다 (Candida) 속, 피치아 (Pichia) 속, 이사첸키아 (Issatchenkia) 속, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 속, 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces) 속, 쉬조사카로마이세스 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속 일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다. 클루이베로마이세스 속은 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 서모톨러란스 (Kluyveromyces thermotolerans)일 수 있다. 캔디다 속은 캔디다 글라브라타 (Candida glabrata), 캔디다 보이디니 (Candida boidinii), 캔디다 마그놀리아 (Candida magnolia), 캔디다 메타노소르보사 (Candida methanosorbosa), 캔디다 소노렌시스 (Candida sonorensis), 또는 캔디다 유틸러스 (Candida utilis)일 수 있다. 피치아 (Pichia) 속은 피치아 스티피티스 (Pichia stipitis) 일 수 있다. 이사첸키아 (Issatchenkia) 속은 이사첸키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis)일 수 있다. 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 속은 데바리오마이세스 한세니 (Debaryomyces hansenii)일 수 있다. 자이고사카로마이세스 속은 자이고사카로마이세스 바일리 (Zygosaccharomyces bailli) 또는 자이고사카로마이세스 룩시이 (Zygosaccharomyces rouxii)일 수 있다. 쉬조사카로마이세스 속은 쉬조사카로마이세스 크리오필러스 (S. cryophilus), 쉬조사카로마이세스 자포니쿠스 (S. japonicus), 쉬조사카로마이세스 옥토스포루스 (S. octosporus) 또는 쉬조사카로마이세스 폼베 (S. pombe)일 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 천연 효모 세포뿐만 아니라, 락테이트와 같은 원하는 산물을 생산하기 위한 변이 효모 세포도 포함할 수 있다. 이러한 변이 효모 세포는 예를 들면, 우라실, 설파구아니딘, 설파티아졸, 아자세린, 트리메토프림, 또는 모노플루오로아세테이트에 대하여 내성을 가질 수 있다.

상기 알코올 데히드로게나제 6은 중쇄 데히드로게나제/리덕타제 (medium-chain dehydrogense/reductase, MDR)에 속하는 효소로 CAD (cinnamyl alcohol dehyrogenase) family에 속해 있다. 상기 알코올 데히드로게나제 6은 효모의 기타 알코올 데히드로게나제와 달리 NADPH에 강한 specificity, 예를 들면 약 0.029 mM의 Km값을 가질 수 있다. 또한 상기 알코올 데히드로게나제 6은 광범위한 지방족 또는 방향족 알데히드, 예를 들면 펜탄알(pentanal), 베라트알데히드(verataldehyde), 푸르프랄(furfural)에 대하여 활성을 나타낼 수 있다. 알코올 데히드로게나제 6이 효모 세포 중에서 활성이 증가되어 있는 경우, 보조인자인 과다의 NADPH가 NADP+로 산화되어 세포 중 redox balance에 영향을 줄 수 있다.

아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 활성 감소는 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 알코올 데히드로게나제 1의 발현의 감소에 의한 것일 수 있다. 알코올 데히드로게나제 1은 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 아세트알데히드를 에탄올로의 가역적 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제는 EC 1.1.1.1에 속하는 것일 수 있다.

알코올 데히드로게나제의 NADH에 대한 Km값에 비하여 작은 Km값을 갖는 효소를 코딩하는 유전자의 도입을 통해, 상기 도입된 효소로 carbon flux의 shift를 초래하여 상기 효소의 활성이 증가될 수 있다. 이로 인해 상기 효소의 활성 증가에 의해 상기 효소의 발현에 의해 생산되는 산물의 생산을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 알코올 데히드로게나제의 NADH에 대한 Km값에 비하여 작은 Km값을 갖는 효소는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제일 수 있다.

상기 효모 세포에 있어서, 상기 알코올 데히드로게나제 6의 활성은 알코올 데히드로게나제 6 (alcohol dehydrogenase 6; adh 6)의 발현의 증가, 예를 들면 과발현에 의하여 증가될 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제 6은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제 6의 활성은 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 유전자가 도입된 것에 의해 제공될 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 추가로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 용어 "감소"는 조작되지 않은 효모 세포에 비하여 조작된 상기 효모 세포에서의 활성을 상대적으로 나타낸 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다.

용어 "불활성화" (inactivation)는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감소 (depression)"는 유전자의 발현이 조작되지 않은 효모 세포에 비하여 낮은 수준으로 발현되거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 낮은 것을 의미할 수 있다. 상기 활성은 적절한 대조군 종에 비하여, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다.

상기 불활성화 또는 감소는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다. 상기 선별 마커는 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성, 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커일 수 있다.　

피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트 데카르복실라제일 수 있고, EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)를 코딩하는 pdc1 또는 pdc2일 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 추가로 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성, 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 EC 1.1.1.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GDP1)일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 gdp1일 수 있다.

상기 효모 세포에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성은 락테이트를 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다. 상기 활성은 대조군 대비 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 이러한 활성 증가는 알코올 데히드로게나제의 NADH에 대한 Km값에 비하여 작은 Km값을 갖는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 도입을 통해, 상기 락테이트 데히드로게나제로 carbon flux의 shift를 초래하여 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가된 것일 수 있다. 이로 인해 상기 락테이트 데히드로게나제의 활성 증가에 의해 생산되는 락테이트의 생산을 증가시킬 수 있다.

"락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: LDH)"는 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 L-락테이트 또는 D-락테이트에 각각 작용할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 14의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다.

상기 발현의 증가는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자는 외인성 유전자일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 동종성(homologous) 또는 이종성(heterogenous)일 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 외인성 유전자는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 발현을 가능하게 하는 프로모터의 다운스트림 위치(downstream position)에 도입될 수 있다. 또한, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 게놈에 포함될 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다. 상기 L-락테이트 데히드로게나제 또는 D-락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 효모 세포는 L-락테이트 거울상 이성질체 또는 D-락테이트 거울상 이성질체, 또는 그의 염을 생산할 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 도입된 유전자에 의하여 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가될 수 있다.

상기 효모 세포는 단일 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 또는 1 내지 10 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자와 같은 복수의 유전자를 포함할 수 있다. 상기 복수의 유전자는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 경우, 각각의 유전자는 동일한 유전자의 카피이거나 둘 이상의 상이한 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다. 상기 외인성 락테이트 데히드로게나제는 효모 세포의 내인성 락테이트 데히드로게나제보다 활성이 좋은 것일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 진균은 소르다리아 속을 포함할 수 있다. 상기 소르다리아 속은 소르다리아 마크로스포라 (Sordaria macrospora), 소르다리아 피미콜라 (Sordaria fimicola), 소르다리아 알치나 (Sordaria alcina), 소르다리아 아라네오사 (Sordaria araneosa), 소르다리아 브레비콜리스 (Sordaria brevicollis), 소르다리아 에퀴나 (Sordaria equina), 소르다리아 헤테로탈리스 (Sordaria heterothallis), 소르다리아 후마나 (Sordaria humana), 소르다리아 라페 (Sordaria lappae), 소르다리아 스클레로게니아 (Sordaria sclerogenia), 소르다리아 수페르바 (Sordaria superba), 또는 소르다리아 토멘토-알바 (Sordaria tomento - alba)일 수 있다.

또한 상기 발현의 증가는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 또한, 상기 락테이트 데히드로게나제의 활성 증가는 락테이트 데히드로게나제의 돌연변이에 의한 변형에 의한 것일 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있고, 이는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 LDH를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터는 각각 서열번호 9, 10, 11, 및 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.

상기 효모 세포는 알코올 데히드로게나제 6의 활성이 증가되어 있고, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 활성이 감소되어 있는 효모 세포로서, 알코올 데히드로게나제 6의 활성은 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 유전자가 도입되고, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불황성화되거나 감소되어 있고, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 알코올 데히드로게나제 6의 활성이 증가되어 있지 않은 모균주(mother cell) 에 비하여 약 20 내지 50%, 약 약 25 내지 약 45%, 약 26 내지 40%, 약 27 내지 35%, 또는 약 28 내지 30% 이상의 증가된 수율로 락테이트를 생산할 수 있다. 또한, 상기 세포는 소비된 글루코스 대비 생산된 락테이트의 비율인 약 40 내지 약 55% 이상, 예를 들면 약 45% 내지 약 50%, 약 46% 내지 약 50%, 약 47% 내지 약 50%, 약 48% 내지 약 50%, 또는 약 49% 내지 약 50%의 수율로 락테이트를 생산할 수 있다.

알코올 데히드로게나제 6의 활성이 증가되어 있거나 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 유전자를 포함하고, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 활성이 감소되어 있는 효모 세포를 제작하기 위한, 상기 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 적합한 숙주 내에서 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있기에 적합한 조절 서열과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 터미네이터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 결합될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미할 수 있다. 이로 인해, 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절할 수 있다.

상기 효모 발현 벡터는 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위한 벡터일 수 있고, 그의 예로 pYepSec1, 2i, pAG-1, Yep6, Yep13, PEMBLYe23, pMFa, pJRY88, 및 pYES2를 포함할 수 있다.

발현 벡터로서 작동하려면, 복제원점, 프로모터, 다중 클로닝 사이트 (multiple cloning site: MCS) 및 선택 마커를 포함할 수 있다. 복제원점은 플라스미드가 숙주 세포의 염색체와 별도로 복제할 수 있는 기능을 부여해주고, 프로모터는 삽입되는 외래유전자의 전사 과정에 작용을 하며, MCS는 외래 유전자가 다양한 제한효소 사이트를 통해 삽입될 수 있게 하며, 선별 마커는 벡터가 숙주 세포에 제대로 들어갔는지를 확인시켜 주는 역할을 한다. 선별 마커는 항생제 내성유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 선별 마커는 영양요구성 유전자 (auxotrophic gene)를 포함하며, 예를 들어 우라실, 트립토판, 루신, 및 히스티딘으로부터 선택되는 것에 대해 영양요구성을 제공하는 유전자를 포함할 수 있다.

다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산을 감소시키는 방법을 제공한다.

상기 효모 세포는 알코올 데히드로게나제 6의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다. 상기한 효모 세포는 전술한 바와 같다.

상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.

상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다. 발효액의 pH는 2 에서 7 범위로 유지되도록 조절할 수 있다.

상기 효모 세포는 연속, 반연속식, 배치식, 또는 이들의 조합의 방식으로 배양될 수 있다.

상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 호기성 또는 혐기성 조건에서 배양될 수 있다. 일례로, 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양한 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 상기 혐기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%와 같은 미세 호기성(microaerobic) 조건을 포함할 수 있다.

용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈가 이용될 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 또는 무기질소화합물일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 배양은 전술한 바와 같다.

배양물로부터의 락테이트의 분리는 당해 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화 등의 방법일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 감소된 에탄올 생산능을 가질 수 있다.

일 양상에 따른 벡터에 의하면 감소된 에탄올 생산능을 가진 효모 세포의 제조 방법에 이용될 수 있다.

일 양상에 따른 에탄올 생산을 감소시키는 방법에 의하면, 에탄올 생산을 효율적으로 감소시킬 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 p416-PDCp-ADH6 벡터의 모식도이다.
도 2는 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다.
도 3은 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터의 모식도이다. 상기 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터는 PDC1을 결실하기 위한 카세트 제작의 주형이 되는 NPT 과발현 결실 벡터이다.
도 4는 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 PDC1이 결실된 변이균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
도 6a 및 6b는 발효 조건에서 KCTC12415BP 및 변이균주 KCTC12415BP+ADH6 의 배양 특성을 나타낸 것이다.
도 7은 KCTC 12415BP 균주의 에탄올 및 락테이트 생산 경로의 모식도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. ADH6 과발현 벡터의 제작

알코올 데히드로게나제 (ADH) 중 하나를 코딩하고 있는 ADH6 유전자(서열번호 2)를 과발현하기 위한 카세트를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 사카로마이세스 세레비지애의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호 16과 17의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 p416-GPD (ATCC^® 87360^TM)에 도입하여 p416-PDCp을 제작하였다.

그런 다음 사카로마이세스 세레비지애의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호 18과 19의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 수득된 ADH6의 PCR 절편과 제작된 p416-PDCp를 XbaI과 XhoI으로 절단하고 이를 수득된 ADH6의 PCR 절편과 라이게이션(ligation)하여 p416-PDCp-ADH6을 제작하였다. 도 1은 p416-PDCp-ADH6 벡터의 모식도이다. 상기 p416-PDCp-ADH6 벡터는 ADH6을 과발현 하기 위한 카세트 제작의 주형이 된다.

실시예 2. 야생형 사카로마이세스 세레비지애에 ADH6 과발현 벡터 도입

실시예 1에서 제작한 p416-PDCp-ADH6 플라스미드를 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (유전자형: MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3ㅿ1; MAL2-8^C; SUC2, EUROSCARF accession number: 30000B)에 삽입하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 실시예 1에서 제작된 플라스미드를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합 한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 YSD (-ura) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-ura) 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Yeast plasmid isolation kit, Clontech)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 ADH6 포함 플라스미드을 확인하기 위해 하기 서열번호 20과 21의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 삽입된 플라스미드가 p416-PDCp-ADH6임을 확인하였다. 이 균주를 CEN.PK2-1D(ADH6)로 명명하였다.

실시예 3. PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제작 및 PDC1 이 결실되고 ADH6 과발현된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제작

(3.1) PDC1 유전자 결실 카세트 제작

피루베이트로부터 에탄올을 생산하는데 관여하는 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase 1, PDC1)을 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 유전자 결실 벡터를 다음과 같이 제작하였다.

항생제 마커를 사용하기 위하여 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae , CEN.PK2-1D)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 22와 23의 프라이머를 사용하여 Gal10 터미네이터 (Gal10t) PCR절편을 제작한 후 NotI으로 절단하고 이를 pGEM-5Zf (Promega USA)에 도입하여 pGEM-Gal10t를 제작하였다.

또한 서열번호 24와 25의 프라이머를 사용하여 PDC 프로모터 (PDCp)를 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae, CEN.PK2-1D)의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 얻은 후 제작된 절편을 EcoRI으로 절단하고 이를 동일한 EcoRI으로 절단된 pGEM-Gal10t에 라이게이션하여 pGEM-PDCp-Gal10t을 제작하였다. 도 2는 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다. 제네티신 항생제 저항성 유전자인 NPT를 삽입하여 과발현하기 위하여 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터를 제작하였다.

그 후, 서열번호 26과 27의 프라이머를 사용하여 제네티신 (G418) 항생제에 내성을 갖게 할 수 있는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neomycin phosphotransferase, NPT) 유전자를 pcDNA3.3-TOPO (Invitrogen 社)를 주형으로 PCR을 수행하여 얻은 후, 수득된 절편을 XhoI과 BamHI으로 절단하고 이를 동일한 제한효소로 절단된 pGEM-PDCp-Gal10t에 라이게이션하여 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t을 제작하였다. 도 3은 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다. 상기 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터는 PDC1을 결실하기 위한 카세트 제작의 주형이 되는 NPT 과발현 결실 벡터이다.

PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t를 주형으로 하고, 하기 서열번호 28과 29의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PDC1 유전자 결실카세트를 제작하였다.

(3.2) PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제작

사카로마이세스 세레비지애에서 PDC1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 도 4는 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 PDC1이 결실된 변이균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D를 YPD (10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 글루코스) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여, 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 사카로마이세스 세레비지애 세포를 수득한 다음, 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 수득된 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 재현탁한 세포를 수득한 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 수득된 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

PDC1 제거를 위해 실시예 2에서 제작된 PDC1 유전자 결실카세트 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 약 100 ug/ml 제네시틴이 함유되어 있는 YPD에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 약 100 ug/ml 제네시틴이 함유되어 있는 YPD 고체 배지에 옮겼다. 이와 동시에, 동일한 성분의 액체 배지에 선별된 콜로니를 배양한 후 배양한 콜로니로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 변이 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PDC1 결실을 확인하기 위해 하기 서열번호 30과 31의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 PDC1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1)를 수득하였다.

(3.3) PDC1 이 결실되고 ADH6 가 과발현된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제작

실시예 1에서 제작한 p416-PDCp-ADH6 플라스미드를 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1)에 삽입하기 위하여 실시예 2와 같은 방법으로 도입하고 도입여부를 확인하였다. 얻어진 균주를 CEN.PK2-1D(ㅿPDC1+ADH6)로 명명하였다.

실시예 4. 락테이트의 고효율 생산을 위한 균주 제작 및 제작된 균주에 ADH6 과발현 벡터 도입

실시예 1에서 제작한 p416-PDCp-ADH6 플라스미드를 제작된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::Psldhㅿcyb2::PsldhΔgpd1::Psldh) (기탁번호 KCTC12415BP)에 삽입하기 위하여 다음과 같은 방법을 실시하였다. KCTC12415BP는 CEN.PK2-1D 내 PDC1, CYB2, GPD1 유전자의 위치에 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래의 L-ldh (PsLDH) 유전자가 상동성 재조합 방법으로 도입되어 PDC1, CYB2, GPD1 유전자가 결실된 균주이다.

실시예 1에서 제작된 p416-PDCp-ADH6 플라스미드를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합 한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 YSD (-ura) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-ura) 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Yeast plasmid isolation kit, Clontech)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 ADH6 포함 플라스미드을 확인하기 위해 하기 서열번호 20과 21의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 삽입된 플라스미드가 p416-PDCp-ADH6임을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldh Δcyb2::Psldh ㅿgpd1::Psldh +ADH6)을 수득하였다. 이를 KCTC12415BP(ADH6)로 명명하였다.

실시예 5. 야생형 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D 균주 및 PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주에 각각 도입된 ADH6 과발현의 효과 분석

실시예 2 및 3에서 제작된 균주 CEN.PK2-1D, CEN.PK2-1D(ADH6), CEN.PK2-1D (ㅿPDC1), 및 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+ADH6)를 각각 YSD (-ura) 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후 40 g/L 글루코스를 포함한 50 ml YSD (-ura)에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.

발효는 상기의 50 ml의 CEN.PK2-1D, CEN.PK2-1D(ADH6), CEN.PK2-1D (ㅿPDC1), 및 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+ADH6) 각각의 배양액 내의 세포농도를 분광광도계를 이용하여 광학 밀도 (optical density, OD)가 600 nm에서 4.0이 되는 양을 정량한 후 원심분리 하여 상층액을 버린 후 세포를 재현탁하여 글루코스가 포함된 새로운 50 ml의 YSD (-ura)에 다시 접종하여 실시하였다. 발효 조건은 90 rpm을 유지하는 교반 배양기에서 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 발효 중 플라스크로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물인 글루코스, 글리세롤, 및 에탄올의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다. 초기 당의 양은 72 g/L이었다.

표 1에 나타낸 바와 같이 ADH6 과발현된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ADH6) 균주는 야생형 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D보다 에탄올 생산량이 적었고, 당의 소비량도 적음을 알 수 있다.

또한, ADH6 과발현된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+ADH6) 균주는 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1)보다 에탄올 생산량이 적었 었고, 당의 소비도 적음을 알 수 있다.

ADH6 과발현된 사카로마이세스 세레비지애는 ADH6이 과발현되지 않은 균주에 비하여 당 소비량은 작지만 글리세롤 생산량은 비슷함을 알 수 있다. 따라서, ADH6 과발현에 의해 ADH6 과발현 균주 내 carbon flux가 변화되었음을 확인하였다.

Strain	O.D.	남은 당 (g/L)	글리세롤 (g/L)	에탄올 (g/L))
CEN.PK2-1D	12.19±0.60	9.21±0.71	1.61±0.02	30.13±0.33
CEN.PK2-1D (ADH6)	11.34±0.18	13.1±0.75	1.77±0.06	28.11±0.38
CEN.PK2-1D (ㅿPDC1)	12.19±0.60	7.08±1.50	1.68±0.01	31.20±0.75
CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+ADH6)	10.41±0.02	24.26±0.94	1.56±0.02	22.25±0.45

실시예 6. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: Psldh ㅿcyb2::PsldhΔ gpd1 :: Psldh ) 균주에 도입된 ADH6 과발현의 효과 분석

대조군 KCTC12415BP 및 실시예 4에서 제작된 사카로마이세스 세레비지애 KCTC12415BP (ADH6) 균주를 각각 YSD (-ura) 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후 40 g/L 글루코스를 포함한 50 ml YSD (-ura)에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.

발효는 상기의 50 ml의 KCTC12415BP 및 KCTC12415BP(ADH6) 각각의 배양액 내의 세포농도를 분광광도계를 이용하여 광학 밀도 (optical density, OD)가 600 nm에서 4.0이 되는 양을 정량한 후 원심분리 하여 상층액을 버린 후 세포를 재현탁하여 40 g/L 글루코스가 포함된 새로운 50 ml의 YSD (-ura)에 다시 접종하여 실시하였다. 발효조건은 90 rpm을 유지하는 교반 배양기에서 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 발효 중 플라스크로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물 및 글루코스, 락테이트, 글리세롤 및 에탄올 각각의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.

표 2에 나타낸 바와 같이 ADH6 과발현 균주인 사카로마이세스 세레비지애 KCTC12415BP(ADH6)는 사카로마이세스 세레비지애 KCTC12415BP보다 에탄올 생산량은 약 9.45 g/L 로 적었으며, 당의 소비도 적었다. 상기 KCTC12415BP(ADH6)의 대당 락테이트 수율은 약 49.47%로, 약 38.19%의 수율을 갖는 대조군인 KCTC12415BP에 비해 수율이 약 10% 향상되었다. 이는 ADH6 과발현에 의해 ADH6 과발현 균주 내 변화된 carbon flux가 락테이트의 수율을 향상시켰음을 알 수 있다.

Strain	O.D.	대당 락테이트 수율 (%, g/g)	남은 당 (g/L)	락테이트 (g/L)	글리세롤 (g/L)	에탄올 (g/L))
KCTC12415BP	8.56±0.46	38.19±0.62	2.48±1.24	25.02±0.07	0	20.92±0.50
KCTC12415BP(ADH6)	7.48±0.06	49.47±0.04	29.33±0.14	19.13±0.09	0	9.45±0.01

실시예 7. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: Psldh ㅿcyb2::PsldhΔ gpd1 :: Psldh ) 균주에 도입된 ADH6 과발현의 효과 분석

대조군인 KCTC12415BP 및 실시예 4에서 제작된 사카로마이세스 세레비지애 KCTC12415BP(ADH6) 균주를 YPD 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후 80 g/L 글루코스를 포함한 100 ml YPD에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.

발효는 상기의 100 ml의 KCTC12415BP 및 KCTC12415BP(ADH6) 배양액을 각각 1 L의 합성배지를 함유한 미생물 반응기에 별도로 접종하여 수행하였으며 발효 조건은 초기 60 g/L 글루코스, 20 g/L 효모 추출물로 30℃로 하였다. 발효 중 pH는 5N Ca(OH)₂를 이용하여 16시간까지 pH 5, 24시간까지 pH 4.5 그리고 60시간까지 pH 3.0을 유지하였고 글루코스 농도가 20 g/L가 유지되도록 하였다. 추가 합성배지 성분은 글루코스를 포함한 50 g/L K₂HPO₄, 10 g/L MgSO₄, 0.1 g/L 트립토판, 및 0.1 g/L 히스티딘이었다.

배양액 내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 추정하였으며, 발효 중 생물 반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물 및 락테이트와 글루코스의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다. 도 6a 및 6b는 발효 조건에서 KCTC12415BP 및 변이균주 KCTC12415BP(ADH6) 의 배양 특성을 나타낸 것이다. 도 6a 및 6b 에 나타낸 바와 같이 변이균주 KCTC12415BP(ADH6)는 감소된 에탄올 생산성을 나타내고, 또한 약 배양 개시 후 10시간 내지 50시간에서 글루코스를 덜 소비하고 락테이트를 생산하므로 높은 락테이트의 수율을 나타낸다.

한국생명공학연구원

KCTC12415BP

20130530

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Yeast cell having reduced ethanol productivity and use thereof <130> PN101884 <160> 31 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 360 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Tyr Pro Glu Lys Phe Glu Gly Ile Ala Ile Gln Ser His Glu 1 5 10 15 Asp Trp Lys Asn Pro Lys Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Pro Phe Tyr 20 25 30 Asp His Asp Ile Asp Ile Lys Ile Glu Ala Cys Gly Val Cys Gly Ser 35 40 45 Asp Ile His Cys Ala Ala Gly His Trp Gly Asn Met Lys Met Pro Leu 50 55 60 Val Val Gly His Glu Ile Val Gly Lys Val Val Lys Leu Gly Pro Lys 65 70 75 80 Ser Asn Ser Gly Leu Lys Val Gly Gln Arg Val Gly Val Gly Ala Gln 85 90 95 Val Phe Ser Cys Leu Glu Cys Asp Arg Cys Lys Asn Asp Asn Glu Pro 100 105 110 Tyr Cys Thr Lys Phe Val Thr Thr Tyr Ser Gln Pro Tyr Glu Asp Gly 115 120 125 Tyr Val Ser Gln Gly Gly Tyr Ala Asn Tyr Val Arg Val His Glu His 130 135 140 Phe Val Val Pro Ile Pro Glu Asn Ile Pro Ser His Leu Ala Ala Pro 145 150 155 160 Leu Leu Cys Gly Gly Leu Thr Val Tyr Ser Pro Leu Val Arg Asn Gly 165 170 175 Cys Gly Pro Gly Lys Lys Val Gly Ile Val Gly Leu Gly Gly Ile Gly 180 185 190 Ser Met Gly Thr Leu Ile Ser Lys Ala Met Gly Ala Glu Thr Tyr Val 195 200 205 Ile Ser Arg Ser Ser Arg Lys Arg Glu Asp Ala Met Lys Met Gly Ala 210 215 220 Asp His Tyr Ile Ala Thr Leu Glu Glu Gly Asp Trp Gly Glu Lys Tyr 225 230 235 240 Phe Asp Thr Phe Asp Leu Ile Val Val Cys Ala Ser Ser Leu Thr Asp 245 250 255 Ile Asp Phe Asn Ile Met Pro Lys Ala Met Lys Val Gly Gly Arg Ile 260 265 270 Val Ser Ile Ser Ile Pro Glu Gln His Glu Met Leu Ser Leu Lys Pro 275 280 285 Tyr Gly Leu Lys Ala Val Ser Ile Ser Tyr Ser Ala Leu Gly Ser Ile 290 295 300 Lys Glu Leu Asn Gln Leu Leu Lys Leu Val Ser Glu Lys Asp Ile Lys 305 310 315 320 Ile Trp Val Glu Thr Leu Pro Val Gly Glu Ala Gly Val His Glu Ala 325 330 335 Phe Glu Arg Met Glu Lys Gly Asp Val Arg Tyr Arg Phe Thr Leu Val 340 345 350 Gly Tyr Asp Lys Glu Phe Ser Asp 355 360 <210> 2 <211> 1083 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atgtcttatc ctgagaaatt tgaaggtatc gctattcaat cacacgaaga ttggaaaaac 60 ccaaagaaga caaagtatga cccaaaacca ttttacgatc atgacattga cattaagatc 120 gaagcatgtg gtgtctgcgg tagtgatatt cattgtgcag ctggtcattg gggcaatatg 180 aagatgccgc tagtcgttgg tcatgaaatc gttggtaaag ttgtcaagct agggcccaag 240 tcaaacagtg ggttgaaagt cggtcaacgt gttggtgtag gtgctcaagt cttttcatgc 300 ttggaatgtg accgttgtaa gaatgataat gaaccatact gcaccaagtt tgttaccaca 360 tacagtcagc cttatgaaga cggctatgtg tcgcagggtg gctatgcaaa ctacgtcaga 420 gttcatgaac attttgtggt gcctatccca gagaatattc catcacattt ggctgctcca 480 ctattatgtg gtggtttgac tgtgtactct ccattggttc gtaacggttg cggtccaggt 540 aaaaaagttg gtatagttgg tcttggtggt atcggcagta tgggtacatt gatttccaaa 600 gccatggggg cagagacgta tgttatttct cgttcttcga gaaaaagaga agatgcaatg 660 aagatgggcg ccgatcacta cattgctaca ttagaagaag gtgattgggg tgaaaagtac 720 tttgacacct tcgacctgat tgtagtctgt gcttcctccc ttaccgacat tgacttcaac 780 attatgccaa aggctatgaa ggttggtggt agaattgtct caatctctat accagaacaa 840 cacgaaatgt tatcgctaaa gccatatggc ttaaaggctg tctccatttc ttacagtgct 900 ttaggttcca tcaaagaatt gaaccaactc ttgaaattag tctctgaaaa agatatcaaa 960 atttgggtgg aaacattacc tgttggtgaa gccggcgtcc atgaagcctt cgaaaggatg 1020 gaaaagggtg acgttagata tagatttacc ttagtcggct acgacaaaga attttcagac 1080 tag 1083 <210> 3 <211> 563 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr 130 135 140 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Val 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg 210 215 220 His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 300 Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr 305 310 315 320 Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg 340 345 350 Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu 355 360 365 Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val 370 375 380 Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe 385 390 395 400 Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly 405 410 415 Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile 420 425 430 Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln 435 440 445 Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro 450 455 460 Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile 465 470 475 480 His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu 485 490 495 Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val 500 505 510 Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn 515 520 525 Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Val Met Leu Pro Val Phe Asp 530 535 540 Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn 545 550 555 560 Ala Lys Gln <210> 4 <211> 1692 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60 accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120 gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180 tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240 gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300 gtcccatcca tctcttctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360 gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420 gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480 agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540 ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600 attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720 ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840 ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccaatat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080 gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140 ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta cgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga ggttatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 5 <211> 591 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 Met Leu Lys Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Ile Ser Lys Asn Cys Glu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Leu Arg Ala Ser Lys Thr Arg Leu Asn Thr Ile Arg Ala Tyr 20 25 30 Gly Ser Thr Val Pro Lys Ser Lys Ser Phe Glu Gln Asp Ser Arg Lys 35 40 45 Arg Thr Gln Ser Trp Thr Ala Leu Arg Val Gly Ala Ile Leu Ala Ala 50 55 60 Thr Ser Ser Val Ala Tyr Leu Asn Trp His Asn Gly Gln Ile Asp Asn 65 70 75 80 Glu Pro Lys Leu Asp Met Asn Lys Gln Lys Ile Ser Pro Ala Glu Val 85 90 95 Ala Lys His Asn Lys Pro Asp Asp Cys Trp Val Val Ile Asn Gly Tyr 100 105 110 Val Tyr Asp Leu Thr Arg Phe Leu Pro Asn His Pro Gly Gly Gln Asp 115 120 125 Val Ile Lys Phe Asn Ala Gly Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Glu Pro 130 135 140 Leu His Ala Pro Asn Val Ile Asp Lys Tyr Ile Ala Pro Glu Lys Lys 145 150 155 160 Leu Gly Pro Leu Gln Gly Ser Met Pro Pro Glu Leu Val Cys Pro Pro 165 170 175 Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Lys Glu Asp Ile Ala Arg Lys Glu Gln Leu 180 185 190 Lys Ser Leu Leu Pro Pro Leu Asp Asn Ile Ile Asn Leu Tyr Asp Phe 195 200 205 Glu Tyr Leu Ala Ser Gln Thr Leu Thr Lys Gln Ala Trp Ala Tyr Tyr 210 215 220 Ser Ser Gly Ala Asn Asp Glu Val Thr His Arg Glu Asn His Asn Ala 225 230 235 240 Tyr His Arg Ile Phe Phe Lys Pro Lys Ile Leu Val Asp Val Arg Lys 245 250 255 Val Asp Ile Ser Thr Asp Met Leu Gly Ser His Val Asp Val Pro Phe 260 265 270 Tyr Val Ser Ala Thr Ala Leu Cys Lys Leu Gly Asn Pro Leu Glu Gly 275 280 285 Glu Lys Asp Val Ala Arg Gly Cys Gly Gln Gly Val Thr Lys Val Pro 290 295 300 Gln Met Ile Ser Thr Leu Ala Ser Cys Ser Pro Glu Glu Ile Ile Glu 305 310 315 320 Ala Ala Pro Ser Asp Lys Gln Ile Gln Trp Tyr Gln Leu Tyr Val Asn 325 330 335 Ser Asp Arg Lys Ile Thr Asp Asp Leu Val Lys Asn Val Glu Lys Leu 340 345 350 Gly Val Lys Ala Leu Phe Val Thr Val Asp Ala Pro Ser Leu Gly Gln 355 360 365 Arg Glu Lys Asp Met Lys Leu Lys Phe Ser Asn Thr Lys Ala Gly Pro 370 375 380 Lys Ala Met Lys Lys Thr Asn Val Glu Glu Ser Gln Gly Ala Ser Arg 385 390 395 400 Ala Leu Ser Lys Phe Ile Asp Pro Ser Leu Thr Trp Lys Asp Ile Glu 405 410 415 Glu Leu Lys Lys Lys Thr Lys Leu Pro Ile Val Ile Lys Gly Val Gln 420 425 430 Arg Thr Glu Asp Val Ile Lys Ala Ala Glu Ile Gly Val Ser Gly Val 435 440 445 Val Leu Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Phe Ser Arg Ala Pro 450 455 460 Ile Glu Val Leu Ala Glu Thr Met Pro Ile Leu Glu Gln Arg Asn Leu 465 470 475 480 Lys Asp Lys Leu Glu Val Phe Val Asp Gly Gly Val Arg Arg Gly Thr 485 490 495 Asp Val Leu Lys Ala Leu Cys Leu Gly Ala Lys Gly Val Gly Leu Gly 500 505 510 Arg Pro Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Cys Tyr Gly Arg Asn Gly Val Glu 515 520 525 Lys Ala Ile Glu Ile Leu Arg Asp Glu Ile Glu Met Ser Met Arg Leu 530 535 540 Leu Gly Val Thr Ser Ile Ala Glu Leu Lys Pro Asp Leu Leu Asp Leu 545 550 555 560 Ser Thr Leu Lys Ala Arg Thr Val Gly Val Pro Asn Asp Val Leu Tyr 565 570 575 Asn Glu Val Tyr Glu Gly Pro Thr Leu Thr Glu Phe Glu Asp Ala 580 585 590 <210> 6 <211> 1776 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 atgctaaaat acaaaccttt actaaaaatc tcgaagaact gtgaggctgc tatcctcaga 60 gcgtctaaga ctagattgaa cacaatccgc gcgtacggtt ctaccgttcc aaaatccaag 120 tcgttcgaac aagactcaag aaaacgcaca cagtcatgga ctgccttgag agtcggtgca 180 attctagccg ctactagttc cgtggcgtat ctaaactggc ataatggcca aatagacaac 240 gagccgaaac tggatatgaa taaacaaaag atttcgcccg ctgaagttgc caagcataac 300 aagcccgatg attgttgggt tgtgatcaat ggttacgtat acgacttaac gcgattccta 360 ccaaatcatc caggtgggca ggatgttatc aagtttaacg ccgggaaaga tgtcactgct 420 atttttgaac cactacatgc tcctaatgtc atcgataagt atatagctcc cgagaaaaaa 480 ttgggtcccc ttcaaggatc catgcctcct gaacttgtct gtcctcctta tgctcctggt 540 gaaactaagg aagatatcgc tagaaaagaa caactaaaat cgctgctacc tcctctagat 600 aatattatta acctttacga ctttgaatac ttggcctctc aaactttgac taaacaagcg 660 tgggcctact attcctccgg tgctaacgac gaagttactc acagagaaaa ccataatgct 720 tatcatagga tttttttcaa accaaagatc cttgtagatg tacgcaaagt agacatttca 780 actgacatgt tgggttctca tgtggatgtt cccttctacg tgtctgctac agctttgtgt 840 aaactgggaa accccttaga aggtgaaaaa gatgtcgcca gaggttgtgg ccaaggtgtg 900 acaaaagtcc cacaaatgat atctactttg gcttcatgtt cccctgagga aattattgaa 960 gcagcaccct ctgataaaca aattcaatgg taccaactat atgttaactc tgatagaaag 1020 atcactgatg atttggttaa aaatgtagaa aagctgggtg taaaggcatt atttgtcact 1080 gtggatgctc caagtttagg tcaaagagaa aaagatatga agctgaaatt ttccaataca 1140 aaggctggtc caaaagcgat gaagaaaact aatgtagaag aatctcaagg tgcttcgaga 1200 gcgttatcaa agtttattga cccctctttg acttggaaag atatagaaga gttgaagaaa 1260 aagacaaaac tacctattgt tatcaaaggt gttcaacgta ccgaagatgt tatcaaagca 1320 gcagaaatcg gtgtaagtgg ggtggttcta tccaatcatg gtggtagaca attagatttt 1380 tcaagggctc ccattgaagt cctggctgaa accatgccaa tcctggaaca acgtaacttg 1440 aaggataagt tggaagtttt cgtggacggt ggtgttcgtc gtggtacaga tgtcttgaaa 1500 gcgttatgtc taggtgctaa aggtgttggt ttgggtagac cattcttgta tgcgaactca 1560 tgctatggtc gtaatggtgt tgaaaaagcc attgaaattt taagagatga aattgaaatg 1620 tctatgagac tattaggtgt tactagcatt gcggaattga agcctgatct tttagatcta 1680 tcaacactaa aggcaagaac agttggagta ccaaacgacg tgctgtataa tgaagtttat 1740 gagggaccta ctttaacaga atttgaggat gcatga 1776 <210> 7 <211> 391 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu 20 25 30 Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr 35 40 45 Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe 50 55 60 Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu 85 90 95 Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile 100 105 110 Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln 115 120 125 Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His 130 135 140 Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly 145 150 155 160 Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys 165 170 175 Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His 180 185 190 Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly 195 200 205 Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg 210 215 220 Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile 225 230 235 240 Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu 245 250 255 Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly 260 265 270 Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg 275 280 285 Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr 290 295 300 Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr 305 310 315 320 Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln 325 330 335 Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu 340 345 350 Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln 355 360 365 Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu 370 375 380 Glu Leu Asp Leu His Glu Asp 385 390 <210> 8 <211> 1176 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 8 atgtctgctg ctgctgatag attaaactta acttccggcc acttgaatgc tggtagaaag 60 agaagttcct cttctgtttc tttgaaggct gccgaaaagc ctttcaaggt tactgtgatt 120 ggatctggta actggggtac tactattgcc aaggtggttg ccgaaaattg taagggatac 180 ccagaagttt tcgctccaat agtacaaatg tgggtgttcg aagaagagat caatggtgaa 240 aaattgactg aaatcataaa tactagacat caaaacgtga aatacttgcc tggcatcact 300 ctacccgaca atttggttgc taatccagac ttgattgatt cagtcaagga tgtcgacatc 360 atcgttttca acattccaca tcaatttttg ccccgtatct gtagccaatt gaaaggtcat 420 gttgattcac acgtcagagc tatctcctgt ctaaagggtt ttgaagttgg tgctaaaggt 480 gtccaattgc tatcctctta catcactgag gaactaggta ttcaatgtgg tgctctatct 540 ggtgctaaca ttgccaccga agtcgctcaa gaacactggt ctgaaacaac agttgcttac 600 cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660 ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720 tgtggtgctt tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg tctaggctgg 780 ggtaacaacg cttctgctgc catccaaaga gtcggtttgg gtgagatcat cagattcggt 840 caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acatactacc aagagtctgc tggtgttgct 900 gatttgatca ccacctgcgc tggtggtaga aacgtcaagg ttgctaggct aatggctact 960 tctggtaagg acgcctggga atgtgaaaag gagttgttga atggccaatc cgctcaaggt 1020 ttaattacct gcaaagaagt tcacgaatgg ttggaaacat gtggctctgt cgaagacttc 1080 ccattatttg aagccgtata ccaaatcgtt tacaacaact acccaatgaa gaacctgccg 1140 gacatgattg aagaattaga tctacatgaa gattag 1176 <210> 9 <211> 289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC promoter <400> 9 atttggcgag cgttggttgg tggatcaagc ccacgcgtag gcaatcctcg agcagatccg 60 ccaggcgtgt atatatagcg tggatggcca ggcaacttta gtgctgacac atacaggcat 120 atatatatgt gtgcgacgac acatgatcat atggcatgca tgtgctctgt atgtatataa 180 aactcttgtt ttcttctttt ctctaaatat tctttcctta tacattagga cctttgcagc 240 ataaattact atacttctat agacacgcaa acacaaatac acacactaa 289 <210> 10 <211> 401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF promoter <400> 10 atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60 tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120 tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180 tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240 tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg 300 tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc 360 ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt t 401 <210> 11 <211> 655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD promoter <400> 11 agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60 tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120 ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180 tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240 aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300 tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 360 ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 420 ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 480 aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 540 agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 600 tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga cggat 655 <210> 12 <211> 1468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH promoter <400> 12 gccgggatcg aagaaatgat ggtaaatgaa ataggaaatc aaggagcatg aaggcaaaag 60 acaaatataa gggtcgaacg aaaaataaag tgaaaagtgt tgatatgatg tatttggctt 120 tgcggcgccg aaaaaacgag tttacgcaat tgcacaatca tgctgactct gtggcggacc 180 cgcgctcttg ccggcccggc gataacgctg ggcgtgaggc tgtgcccggc ggagtttttt 240 gcgcctgcat tttccaaggt ttaccctgcg ctaaggggcg agattggaga agcaataaga 300 atgccggttg gggttgcgat gatgacgacc acgacaactg gtgtcattat ttaagttgcc 360 gaaagaacct gagtgcattt gcaacatgag tatactagaa gaatgagcca agacttgcga 420 gacgcgagtt tgccggtggt gcgaacaata gagcgaccat gaccttgaag gtgagacgcg 480 cataaccgct agagtacttt gaagaggaaa cagcaatagg gttgctacca gtataaatag 540 acaggtacat acaacactgg aaatggttgt ctgtttgagt acgctttcaa ttcatttggg 600 tgtgcacttt attatgttac aatatggaag ggaactttac acttctccta tgcacatata 660 ttaattaaag tccaatgcta gtagagaagg ggggtaacac ccctccgcgc tcttttccga 720 tttttttcta aaccgtggaa tatttcggat atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat 780 ggacttcctc ttttctggca accaaaccca tacatcggga ttcctataat accttcgttg 840 gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga gatatacaat agaacagata ccagacaaga 900 cataatgggc taaacaagac tacaccaatt acactgcctc attgatggtg gtacataacg 960 aactaatact gtagccctag acttgatagc catcatcata tcgaagtttc actacccttt 1020 ttccatttgc catctattga agtaataata ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc 1080 ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga 1140 cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg 1200 atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc acactactct 1260 ctaatgagca acggtatacg gccttccttc cagttacttg aatttgaaat aaaaaaaagt 1320 ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac ctgcaattat taatcttttg tttcctcgtc 1380 attgttctcg ttccctttct tccttgtttc tttttctgca caatatttca agctatacca 1440 agcatacaat caactccaag ctggccgc 1468 <210> 13 <211> 332 <212> PRT <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 13 Met Ser Val Lys Glu Leu Leu Ile Gln Asn Val His Lys Glu Glu His 1 5 10 15 Ser His Ala His Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Arg Gly Glu Met Leu Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala His Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asp Cys Met Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys His Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Lys Leu Gly Ile His Ser Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Pro Asp Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Thr Val Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Val Lys Gly Met Tyr Gly Val Ser Ser Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Val Leu Gly Tyr Ala Gly Ile Thr Asp Val Val 290 295 300 Lys Met Thr Leu Lys Ser Glu Glu Glu Glu Lys Leu Arg Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 14 <211> 999 <212> DNA <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 14 atgtccgtaa aggaactact tatacaaaac gtccataagg aggagcattc tcacgctcac 60 aataagataa cagttgtagg agtaggtgca gtaggtatgg catgtgctat ttcgatatta 120 atgaaagact tggctgatga actagccttg gttgatgtga ttgaggataa gttacgtgga 180 gaaatgttag atttgcaaca tggttcattg ttcttgagaa cccccaaaat tgtctcgggt 240 aaggattatt cagtcactgc tcattctaaa ctggttatca ttacagcagg tgcaagacag 300 caagaagggg agagcagact aaatctggtt caacgtaatg tcaacatctt caagtttatc 360 atcccgaacg tagtaaaata cagtccagac tgcatgttgc ttgttgtgag taatccagtt 420 gacatcttaa cctatgttgc gtggaaaatc agtgggtttc caaaacatag ggtgattggc 480 tcaggatgca accttgatag cgccaggttt aggtatctaa tgggagaaaa attaggtatt 540 cactccttat cttgtcatgg ctggataata ggcgaacatg gtgattcttc ggtacctgtt 600 tggtccgggg ttaatgtggc tggtgttagt ttaaaagcat tatatcctga cctgggtact 660 gatgccgata aagaacattg gaaagaagtg cacaaacaag tggttgattc tgcttacgaa 720 gttattaaac ttaagggcta cacttcttgg gctataggtc tatcagtagc tgatttggca 780 gaaaccgtta tgaaaaattt aagaagagtc cacccaattt ccacgatggt caagggtatg 840 tacggtgtta gctctgacgt cttcttatct gttccttgtg ttttgggata tgcgggaatt 900 acagacgtcg tgaagatgac attgaaatca gaggaagagg aaaaactaag aaagtcagcc 960 gatactctgt ggggcattca aaaggaattg cagttttaa 999 <210> 15 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC1 terminator <400> 15 tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60 aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120 tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180 acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240 taatttgcgg cc 252 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 16 gagctcaaca agctcatgca aag 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 17 tctagagatt tgactgtgtt a 21 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 18 tctagaatgt cttatcctga gaaatttgaa gg 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 19 ctcgagctag tctgaaaatt ctttgtcgta gc 32 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 20 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 21 caaattaaag ccttcgagcg 20 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 22 gcggccgcga attcggatcc gtagatacat tgatgctatc 40 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 23 gcggccgctc cgcggctcgt gctatattc 29 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 24 gaattcaaca agctcatgca aag 23 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 25 gaattcctcg aggatttgac tgtgtta 27 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 26 ccgctcgaga tgattgaaca agatgg 26 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 27 cgcggatcct cagaagaact cgtcaag 27 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 28 aagatctacg aagttgaagg tatgagatgg gctggtaacg taatacgact cactataggg 60 60 <210> 29 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 29 gcttccttaa cttctggctt ggacaaggta ccgacgtaaa aacaagctca tgcaaagagg 60 t 61 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 30 gctcttctct accctgtcat tc 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 31 tagtgtacag ggtgtcgtat ct 22

Claims

알코올 데히드로게나제 6의 활성이 증가되어 있고, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 활성이 감소되어 있는 효모 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 알코올 데히드로게나제 6의 활성은 알코올 데히드로게나제 6 (alcohol dehydrogenase6; adh6)의 발현의 증가에 의하여 증가된 것인 효모 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 알코올 데히드로게나제 6의 활성은 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 유전자가 도입된 것인 효모 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 알코올 데히드로게나제 6은 서열번호 1의 아미노산 서열과 60%이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
청구항 3에 있어서, 상기 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
청구항 1에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 감소된 것인 효모 세포.
청구항 6에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감소되어 있는 것인 효모 세포.
청구항 6에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
청구항 7에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
청구항 6에 있어서, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소된 것인 효모 세포.
청구항 6에 있어서, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불황성화되거나 감소된 것인 효모 세포.
청구항 10에 있어서, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를, 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 각각 서열번호 5및 7의 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
청구항 10에 있어서, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 6 및 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
청구항 1에 있어서, 피루페이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가된 것인 효모 세포.
청구항 14에 있어서, 피루페이트를 락테이트로 전환하는 활성은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 발현의 증가에 의하여 증가된 것인 효모 세포.
청구항 1에 있어서, 알코올 데히드로게나제 6의 활성은 알코올 데히드로게나제 6을 코딩하는 유전자가 도입되고, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불황성화되거나 감소되어 있고, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것인 효모 세포.
청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 효모 세포.
청구항 1 내지 18 중 어느 하나의 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산을 감소시키는 방법.
청구항 14 내지 16 중 어느 하나의 효모 세포를 배양하는 단계; 및
배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.