ES2273043T3 - Composiciones de pirazol utiles como inhibidores de gsk-3. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula I: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: W es nitrógeno; R1 se selecciona de hidrógeno o flúor; y Ry es un grupo alifático C1-4, en donde dicho grupo alifático es una cadena hidrocarbonada C1-C4 de cadena lineal o ramificada que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarbu- ro C3-C4 monocíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático, que tiene un solo punto de ligazón al resto de la molécula.
Description
Composiciones de pirazol útiles como inhibidores
de GSK-3.
La presente invención se refiere a inhibidores
de proteína quinasas, especialmente glucógeno sintasa
quinasa-3 (GSK-3), una
serina/treonina proteína quinasa. La invención también proporciona
composiciones que comprenden los inhibidores de la invención y
métodos que utilizan estas composiciones en el tratamiento de
diversos trastornos, tales como diabetes, enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis
múltiple (MS), apoplejía, trastornos neurológicos y
neurodegenerativos y trastornos psiquiátricos.
La búsqueda de nuevos agentes terapéuticos ha
sido muy apoyada en los últimos años por una mejor comprensión de la
estructura de las enzimas y otras biomoléculas asociadas con
enfermedades elegidas como objetivo. Una clase importante de enzimas
que ha sido el objeto de estudio intensivo es la de las proteína
quinasas.
Las proteína quinasas median en la transducción
de señales intracelulares. Hacen esto efectuando una transferencia
de fosforilo desde un trifosfato de nucleósido hasta un aceptor
proteínico que está implicado en una ruta de señalización. Existe un
número de quinasas y rutas a través de las cuales los estímulos
extracelulares y otros hacen que se produzca dentro de la célula una
variedad de respuestas celulares. Ejemplos de tales estímulos
incluyen señales de estrés medioambiental y químico (por ejemplo,
choque osmótico, choque térmico, radiación ultravioleta, endotoxina
bacteriana y H_{2}O_{2}), citoquinas (por ejemplo,
interleuquina-1 (IL-1) y factor de
necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha)) y factores
de crecimiento (por ejemplo, factor estimulante de colonias de
granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF)). Un estímulo extracelular puede
afectar a una o más respuestas celulares relacionadas con el
crecimiento, la migración, la diferenciación celulares, la secreción
de hormonas, la activación de factores de transcripción, la
contracción muscular, el metabolismo de la glucosa, el control de la
síntesis de proteínas y la regulación del ciclo celular.
Muchas enfermedades se asocian con respuestas
celulares anormales activadas por episodios mediados por proteína
quinasas. Estas enfermedades incluyen enfermedades autoinmunes,
enfermedades inflamatorias, enfermedades óseas, enfermedades
metabólicas, enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, cáncer,
enfermedades cardiovasculares, alergias y asma, enfermedad de
Alzheimer y enfermedades relacionadas con hormonas. De acuerdo con
esto, se ha hecho un esfuerzo substancial en la química médica para
encontrar inhibidores de proteína quinasas que sean eficaces como
agentes terapéuticos.
La glucógeno sintasa quinasa-3
(GSK-3) es una serina/treonina proteína quinasa
comprendida por isoformas \alpha y \beta que son codificadas
cada una por genes distintos [Coghlan y otros, Chemistry &
Biology, 7, 793-803 (2000); Kim y Kimmel,
Curr. Opinion Genetics Dev., 10,
508-514 (2000)]. La GSK-3 se ha
relacionado con diversas enfermedades, incluyendo la diabetes,
enfermedad de Alzheimer, trastornos del CNS tales como trastorno
maníaco-depresivo y enfermedades neurodegenerativas,
e hipertrofia de cardiomiocitos [véanse, por ejemplo, WO 99/65897;
WO 00/38675; Kaytor y Orr, Curr. Opin. Neurobiol., 12,
275-8 (2000); Haq y otros, J. Cell Biol.,
151, 117-30 (2000);
Eldar-Finkelman, Trends Mol. Med., 8,
126-32 (2002)]. Estas enfermedades se asocian con el
funcionamiento anormal de ciertas rutas de señalización celulares en
las que representa un papel la GSK-3.
Se ha encontrado que la GSK-3
fosforila y modula la actividad de un número de proteínas
reguladoras. Estas incluyen glucógeno sintasa, que es la enzima
limitativa de la velocidad requerida para la síntesis de glucógeno,
la proteína asociada con microtúbulos Tau, el factor de
transcripción génica \beta-catenina, el factor de
iniciación de la traducción e1F-2B, así como ATP
citrato liasa, axina, factor del choque térmico 1,
c-Jun, c-myc,
c-myb, CREB y CEPB\alpha. Estas diversas
dianas implican a la GSK-3 en muchos aspectos del
metabolismo, la proliferación, la diferenciación y el desarrollo
celulares.
En una ruta mediada por GSK-3
que es pertinente para el tratamiento de la diabetes tipo II, la
señalización inducida por insulina conduce a captación de glucosa y
síntesis de glucógeno celular. La GSK-3 es un
regulador negativo de la señal inducida por insulina en esta ruta.
Normalmente, la presencia de insulina provoca la inhibición de la
fosforilación y la desactivación de glucógeno sintasa mediadas por
GSK-3. La inhibición de GSK-3
conduce a síntesis de glucógeno y captación de glucosa incrementadas
[Klein y otros, PNAS, 93, 8455-9
(1996); Cross y otros, Biochem. J., 303,21-26
(1994); Cohen, Biochem. Soc. Trans., 21,
555-567 (1993) y Massillon y otros, Biochem
J. 299, 123-128 (1994); Cohen y Frame,
Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2, 769-76
(2001)]. Sin embargo, cuando la respuesta a la insulina está
deteriorada en un paciente diabético, la síntesis de glucógeno y la
captación de glucosa no se incrementan a pesar de la presencia de
niveles de insulina en sangre relativamente altos. Esto conduce a
niveles de glucosa en sangre anormalmente altos con efectos agudos y
crónicos que finalmente pueden dar como resultado enfermedad
cardiovascular, fallo renal y ceguera. En tales pacientes, no se
produce la inhibición normal inducida por insulina de
GSK-3. También se ha presentado que la
GSK-3 se sobreexpresa en pacientes con diabetes tipo
II [WO 00/38675]. Por lo tanto, los inhibidores terapéuticos de
GSK-3 son útiles para tratar a pacientes diabéticos
que sufren una respuesta deteriorada a
insulina.
insulina.
La apoptosis se ha relacionado con la patología
del daño cerebral isquémico (Li y otros, 1997; Choi y otros, 1996;
Charriaut-Marlangue y otros, 1998; Grahm y Chen,
2001; Murphy y otros, 1999; Nicotera y otros, 1999). Publicaciones
recientes indican que la activación de GSK-3\beta
puede estar implicada en los mecanismos apoptóticos (Kaytor y Orr,
2002; Culbert y otros, 2001). Estudios en modelos de rata de
apoplejía isquémica inducida por oclusión de la arteria cerebral
media (MCAO) mostraban que la expresión incrementada de
GSK-3\beta es posterior a la isquemia (Wang y
otros, Brain Res, 859, 381-5, 2000; Sasaki y otros,
Neurol Res, 23, 588-92, 2001). El factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF) reducía la lesión cerebral
isquémica después de oclusión de la arteria cerebral media (MCO)
permanente en ratas (Fisher y otros, 1995; Song y otros, 2002). En
efecto, los efectos neuroprotectores de FGF demostrados en modelos
de isquemia en ratas pueden ser mediados por una inactivación de
GSK-3\beta dependiente de PI-3
quinasa/AKT (Hashimoto y otros, 2002). Así, la inhibición de
GSK-3\beta después de un episodio isquémico
cerebral puede mejorar el daño cerebral isquémico.
La GSK-3 también está implicada
en el infarto de miocardio. Véanse, Jonassen y otros, Circ Res,
89:1191, 2001 (La reducción en el infarto de miocardio mediante la
administración de insulina en la reperfusión está mediada a través
de una ruta de señalización dependiente de Akt); Matsui y otros,
Circulation, 104:330, 2001 (La activación de Akt conserva la función
cardíaca y evita la lesión de los cardiomiocitos después de isquemia
cardíaca transitoria in vivo); Miao y otros, J Mol Cell
Cardiol, 32:2397, 2000 (El aporte de gen Akt intracoronario mediado
por adenovirus en el corazón reducía el tamaño de infartos
voluminosos después de lesión por
isquemia-reperfusión in vivo); y Fujio y
otros, Circulation y otros, 101:660, 2000 (La señalización de Akt
inhibe la apoptosis de miocitos cardíacos in vitro y protege
contra la lesión por isquemia-reperfusión en el
corazón del ratón).
La actividad de GSK-3 representa
un papel en el trauma de cabeza. Véanse Noshita y otros, Neurobiol
Dis, 9:294, 2002 (La regulación al alza de la ruta de
Akt/PI3-quinasa puede ser crucial para la
supervivencia celular después de una lesión cerebral traumática) y
Dietrich y otros, J Neurotrauma, 13:309, 1996 (La administración
postraumática de bFGF reducía significativamente neuronas corticales
dañadas y el volumen de contusión total en un modelo de rata de
lesión cerebral traumática).
También se sabe que la GSK-3
representa un papel en trastornos psiquiátricos. Véanse
Eldar-Finkelman, Trends Mol Med, 8:126, 2002; Li y
otros, Bipolar Disord, 4:137, 2002 (Los fármacos antipsicóticos
estabilizantes del estado de ánimo LiCl y ácido valproico disminuyen
las actividades de GSK-3 e incrementan la
beta-catenina) y Lijam y otros, Cell, 90:895, 1997
(Ratones KO "dishevelled" mostraban comportamiento social
anormal y conmutación sensoriomotriz defectuosa. Dishevelled, una
proteína citoplásmica implicada en la ruta WNT, inhibe actividades
de GSK3beta).
Se ha observado que la inhibición de GSK3 por
litio y ácido valproico induce una remodelación axonal y un cambio
en la conectividad sináptica. Véanse Kaytor y Orr, Curr Opin
Neurobiol, 12:275, 2002 (La regulación a la baja de GSK3 provoca
cambios en proteínas asociadas con microtúbulos: tau, MAP1 y 2) y
Hall y otros, Mol Cell Neurosci, 20:257, 2002 (El litio y el ácido
valproico inducen la formación de estructuras similares a conos
crecientes a lo largo de los axones).
La actividad de GSK-3 también se
ha asociado con la enfermedad de Alzheimer. Esta enfermedad se
caracteriza por la presencia del bien conocido péptido
\beta-amiloide y la formación de nudos
neurofibrilares intracelulares. Los nudos neurofibrilares contienen
proteína Tau hiperfosforilada, en la que Tau está fosforilada en
sitios anormales. Se ha observado que GSK-3
fosforila estos sitios anormales en modelos celulares y animales.
Por otra parte, se ha observado que la inhibición de
GSK-3 previene la hiperfosforilación de Tau en
células [Lovestone y otros, Curr. Biol. 4,
1077-86 (1994) y Brownlees y otros,
Neuroreport 8, 3251-55 (1997); Kaytor
y Orr, Curr. Opin. Neurobiol., 12,
275-8 (2000)]. En ratones transgénicos que
sobreexpresan GSK3, se observaron hiperfosforilación de Tau
incrementada significativa y morfología normal de neuronas [Lucas y
otros, EMBO J, 20:27-39 (2001)]. La GSK3 activa se
acumula en el citoplasma de neuronas preanudadas, lo que puede
conducir a nudos neurofibrilares en cerebros de pacientes con AD
[Pei y otros, J Neuropathol Exp Neurol, 58,
1010-19 (1999)]. Por lo tanto, la inhibición de
GSK-3 frena o detiene la generación de nudos
neurofibrilares y así trata o reduce la gravedad de la enfermedad de
Alzheimer.
La evidencia del papel que la
GSK-3 representa en la enfermedad de Alzheimer se ha
mostrado in vitro. Véanse Aplin y otros (1996), J Neurochem
67:699; Sun y otros (2002), Neurosci Lett 321:61 (La GSK3b fosforila
el dominio citoplásmico de proteína precursora de amiloide (APP) y
la inhibición de GSK3b reduce la secreción de Ab40 y Ab42 en células
transfectadas con APP); Takashima y otros (1998), PNAS 95:9637;
Kirschenbaum y otros (2001), J Biol Chem 276:7366 (La GSK3b se
compleja con y fosforila presenilina-1, que está
asociada con actividad de gamma-secretasa en la
síntesis de A\beta a partir de APP), Takashima y otros (1998),
Neurosci Res 31:317 (La activación de GSK3b por
AbB(25-35) potencia la fosforilación de tau
en neuronas hipocampales. Esta observación proporciona una conexión
entre A\beta y nudos neurofibrilares compuestos por tau
hiperfosforilada, otro sello patológico de la AD); Takashima y otros
(1993), PNAS 90:7789 (El bloqueo de la expresión o la actividad de
GSK3b evita la neurodegeneración inducida por Ab de cultivos
primarios corticales e hipocampales); Suhara y otros (2003),
Neurobiol Aging. 24:437 (Ab42 intracelular es tóxica para células
endoteliales interfiriendo con la activación del mecanismo
dependiente de la señalización de Akt/GSK-3b); De
Ferrari y otros (2003) Mol Psychiatry 8:195 (El litio protege
células N2A y neuronas hipocampales primarias de citotoxicidad
inducida por fibrillas de A\beta y reducía la translocación
nuclear/desestabilización de b-catenina); y Pigino y
otros, J Neurosci, 23:4499, 2003 (Las mutaciones en presenilina 1
del Alzheimer pueden desregular e incrementar la actividad de
GSK-3, lo que a su vez deteriora el transporte
axonal en las neuronas. Las reduccio-
nes consiguientes en el transporte axonal en neuronas afectadas pueden conducir finalmente a neurodegeneración).
nes consiguientes en el transporte axonal en neuronas afectadas pueden conducir finalmente a neurodegeneración).
La evidencia del papel que la
GSK-3 representa en la enfermedad de Alzheimer se ha
mostrado in vivo. Véanse Yamaguchi y otros (1996), Acta
Neuropathol 92:232; Pei y otros (1999), J Neuropath Exp Neurol
58:1010 (La inmunorreactividad de GSK3b se eleva en regiones
susceptibles de cerebros con AD); Hernández y otros (2002), J
Neurochem 83:1529 (Ratones transgénicos con sobreexpresión de GSK3b
condicional exhiben déficits cognitivos similares a los de modelos
de AD de ratón APP transgénico); De Ferrari y otros (2003) Mol
Psychiatry 8:195 (El tratamiento crónico con litio libraba de la
neurodegeneración y deterioros de comportamiento (laberinto de agua
de Morris) provocados por inyección intrahipocampal de fibrillas de
A\beta); McLaurin y otros, Nature Med, 8:1263, 2002 (La
inmunización con A\beta en un modelo transgénico de AD reduce
tanto la neuropatología similar a AD como los deterioros de la
memoria espacial); y Phiel y otros (2003) Nature 423:435 (La GSK3
regula la producción de péptido amieloide-beta a
través de inhibición directa de gamma-secretasa en
ratones tg con AD).
La presenilina-1 y la
quinesina-1 también son substratos para
GSK-3 y se relacionan con otro mecanismo para el
papel que la GSK-3 representa en la enfermedad de
Alzheimer, según fue descrito recientemente por Pigino, G. y otros,
Journal of Neuroscience (23:4499, 2003). Se encontró que la
GSK3beta fosforila la cadena ligera de quinesina-I,
lo que da como resultado una liberación de
quinesina-I de orgánulos unidos a la membrana,
conduciendo a una reducción en el transporte axonal anterógrado
rápido (Morfini y otros, 2002). Los autores sugieren que las
mutaciones en PS1 pueden desregular e incrementar la actividad de
GSK-3 que, a su vez, deteriora el transporte axonal
en neuronas. Las reducciones consiguientes en el transporte axonal
en neuronas afectadas conducen finalmente a neurodegeneración.
La GSK-3 también está asociada
con la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). Véanse Williamson y
Cleveland, 1999 (El transporte axonal se retarda en una fase muy
temprana de ALS en ratones mSOD1); Morfini y otros, 2002 (La GSK3
fosforila cadenas ligeras de quinesina e inhibe el transporte axonal
anterógrado); Warita y otros, Apoptosis, 6:345, 2001 (La mayoría de
las neuronas motrices espinales perdía las inmunorreactividades
tanto para PI3-K como para Akt en la fase temprana y
presintomática que precedía a la pérdida significativa de las
neuronas en este modelo animal SOD1 tg de ALS); y Sánchez y otros,
2001 (La inhibición de PI-3K induce la retracción de
neuritas mediada por activación de GSK3).
La actividad de GSK-3 también
está conectada con lesiones en la médula espinal y los nervios
periféricos. Se ha observado que la inhibición de GSK3 por litio y
ácido valproico puede inducir la remodelación axonal y cambiar la
conectividad sináptica. Véanse Kaytor y Orr, Curr Opin Neurobiol,
12:275, 2002 (La regulación a la baja de GSK3 provoca cambios en
proteínas asociadas con microtúbulos: tau, MAP1 y 2) y Hall y otros,
Mol Cell Neurosci, 20:257, 2002 (El litio y el ácido valproico
inducen la formación de estructuras similares a conos crecientes a
lo largo de los axones). Véanse además Grothe y otros, Brain Res,
885:172, 2000 (FGF-2 estimula la proliferación de
células de Schwann e inhibe la mielinización durante el crecimiento
axonal); Grothe y Nikkhah, 2001 (FGF-2 es regulado
al alza en los muñones nerviosos proximales y distales en 5 horas
después del aplastamiento del nervio); y Sánchez y otros, 2001 (La
inhibición de PI-3K induce la retracción de neuritas
mediada por activación de GSK3).
Otro substrato de GSK-3 es la
\beta-catenina, que se degrada después de la
fosforilación por GSK-3. Se han presentado niveles
reducidos de \beta-catenina en pacientes
esquizofrénicos y también se han asociado con otras enfermedades
relacionadas con el incremento en la muerte celular neuronal [Zhong
y otros, Nature, 395, 698-702 (1998);
Takashima y otros, PNAS, 90, 7789-93
(1993); Pei y otros, J. Neuropathol. Exp, 56,
70-78 (1997) y Smith y otros,
Bio-org. Med. Chem. 11,
635-639 (2001)]. Por otra parte, la
\beta-catenina y Tcf-4 representan
un doble papel en la remodelación vascular inhibiendo la apoptosis
de células del músculo liso vascular y promoviendo la proliferación
(Wang y otros, Circ Res, 90:340, 2002). De acuerdo con esto, la
GSK-3 está asociada con trastornos angiogénicos.
Véanse además Liu y otros, FASEB J, 16:950, 2002 (La activación de
GSK3 reduce el factor de crecimiento de hepatocitos, conduciendo a
una función de la barrera celular endotelial alterada y una
integridad vascular disminuida) y Kim y otros, J Biol Chem,
277:41888, 2002 (La activación de GSK3beta inhibe la angiogénesis
in vivo usando el ensayo del bloque de Matrigel: la
inhibición de la señalización de GSK3beta potencia la formación de
capilares).
Se ha mostrado la asociación entre
GSK-3 y la enfermedad de Huntington (véase
Carmichael y otros, J Biol Chem., 277:33791, 2002 (La inhibición de
GSK3beta protege a las células de muerte celular neuronal y no
neuronal inducida por poliglutamina a través de incrementos en
b-catenina y su ruta transcripcional asociada). La
sobreexpresión de GSK3 reducía la activación de factor de
transcripción de choque térmico 1 y proteína de choque térmico HSP70
(Bijur y otros, J Biol Chem, 275:7583, 2000) que se muestra que
disminuyen tanto agregados de poli-(Q) como la muerte celular en un
modelo de HD in vitro (Wyttenbach y otros, Hum Mol Genet,
11:1137,2002).
La GSK-3 afecta a los niveles
FGF-2 y sus receptores se incrementan durante la
remielinización de cultivos de agregado cerebral que remielinizan
cerebros de rata. Véase Copelman y otros, 2000, Messersmith y otros,
2000 y Hinks y Franklin, 2000. También se encontró que
FGF-2 induce la extensión del proceso mediante
oligodendrocitos que implican una relación de FGF en la
remielinización (Oh y Yong, 1996; Gogate y otros, 1994) y que se ha
mostrado que la terapia con el de gen FGF-2 mejora
la recuperación de ratones con encefalomielitis alérgica
experimental (EAE) (Ruffini y otros, 2001).
La GSK-3 también se ha asociado
con el crecimiento del cabello debido a que se muestra que la
señalización de Wnt/beta-catenina representa un
papel principal en la morfogénesis y la diferenciación de los
folículos pilosos (Kishimotot y otros, Genes Dev, 14:1181, 2000;
Millar, J Invest Dermatol, 118:216, 2002). Se ha encontrado que los
ratones con sobreexpresión constitutiva de los inhibidores de la
señalización de Wnt en la piel no desarrollaban folículos pilosos.
Se requerían señales de Wnt para el desarrollo inicial de folículos
pilosos y la GSK3 regula constitutivamente rutas de Wnt inhibiendo
beta-catenina (Andl y otros, Dev Cell 2:643, 2002).
Una señal de Wnt transitoria proporciona el estímulo inicial crucial
para el inicio de un nuevo ciclo de crecimiento capilar, activando
la transcripción génica regulada por beta-catenina y
TCF en precursores de folículos pilosos epiteliales (Van Mater y
otros, Genes Dev, 17:1219, 2003).
Debido a que la actividad de
GSK-3 está asociada con la movilidad del esperma, la
inhibición de GSK-3 es útil como un anticonceptivo
masculino. Se observó que una disminución en la actividad de GSK3
del esperma está asociada con desarrollo de la movilidad del esperma
en la epididimis bovina y de mono (Vijayaraghavan y otros, Biol
Reprod, 54: 709, 1996; Smith y otros, J Androl, 20:47, 1999). Por
otra parte, la fosforilación en tirosina y serina/treonina de GSK3
es alta en esperma móvil comparado con inmóvil en toros
(Vijayaraghavan y otros, Biol Reprod, 62:1647, 2000). Este efecto
también se demostró con esperma humano (Luconi y otros, Human
Reprod, 16:1931, 2001).
WO 02/22601 se refiere a compuestos de pirazol
que son útiles como inhibidores de proteína quinasas, especialmente
inhibidores de proteína quinasas GSK-3 y
Aurora-2.
Considerando la falta de opciones de tratamiento
actualmente disponibles para la mayoría de las condiciones asociadas
con la proteína quinasa GSK-3, todavía existe mucha
necesidad de nuevos agentes terapéuticos que inhiban esta diana
proteínica.
La presente invención se dirige a esta necesidad
proporcionando compuestos de fórmula I:
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\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable de los mismos, en donde W, R^{1} y R^{y} son como se
describen
posteriormente.
Los compuestos de esta invención son capaces de
inhibir la actividad de GSK-3. De acuerdo con la
invención, estos compuestos también se utilizan en composiciones y
métodos para inhibir la actividad de GSK-3 y métodos
para tratar o disminuir la gravedad de enfermedades o condiciones
asociadas con GSK-3 en pacientes.
Las enfermedades o condiciones susceptibles de
los métodos de esta invención incluyen, por ejemplo, trastornos
neurológicos y neurodegenerativas, diabetes, trastornos
psiquiátricos, esclerosis múltiple (MS), infarto de miocardio,
reperfusión/isquemia, calvicie y apoplejía.
La Figura 1 representa efectos de tratamiento
con un compuesto de fórmula I en comparación con vehículo de
control, administrado 6 horas después del modelo de oclusión de la
arteria cerebral media (MCAO), como una disminución en el volumen de
infarto total, el volumen de infarto cortical, el daño isquémico en
el cuerpo estriado y la formación de edema.
La Figura 2 representa la función neurológica de
ratas, a lo largo del transcurso del tiempo del experimento,
tratadas con un compuesto de fórmula I en comparación con el grupo
del vehículo de control.
\newpage
La presente invención proporciona un compuesto
de fórmula I:
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, en
donde:
W es nitrógeno;
R^{1} se selecciona de hidrógeno o flúor;
y
R^{y} es un grupo alifático
C_{1-4}, en donde dicho grupo alifático es una
cadena hidrocarbonada C_{1}-C_{4} de cadena
lineal o ramificada que está completamente saturada o que contiene
una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo
C_{3}-C_{4} monocíclico que está completamente
saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que
no es aromático, que tiene un solo punto de ligazón al resto de la
molécula.
El término "alifático" o "grupo
alifático", según se usa aquí, significa una cadena
hidrocarbonada C_{1}-C_{4} de cadena lineal o
ramificada que está completamente saturada o que contiene una o más
unidades de insaturación, o un hidrocarburo
C_{3}-C_{4} monocíclico que está completamente
saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que
no es aromático (también denominado aquí "carbociclo" o
"cicloalquilo"), que tiene un solo punto de ligazón al resto
de la molécula. Por ejemplo, grupos alifáticos adecuados incluyen,
pero no se limitan a, grupos alquilo, alquenilo o alquinilo lineales
o ramificados e híbridos de los mismos tales como
(cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo o
(cicloalquil)alquenilo.
Los términos "alquilo", "alquenilo" y
"alquinilo", usados solos o como parte de un resto mayor,
incluirán cadenas tanto lineales como ramificadas que contienen de
uno a cuatro átomos de carbono y al menos dos átomos de carbono y un
doble enlace en el caso del alquenilo y al menos dos átomos de
carbono y un triple enlace en el caso del alquinilo.
Los compuestos utilizados en esta invención se
limitan a los que son químicamente factibles y estables. Por lo
tanto, una combinación de substituyentes o variables en los
compuestos descritos anteriormente solo es permisible si tal
combinación da como resultado un compuesto estable o químicamente
factible. Un compuesto estable o un compuesto químicamente factible
es uno en el que la estructura química no se altera substancialmente
cuando se mantiene a una temperatura de 40ºC o menos, en ausencia de
humedad u otras condiciones químicamente reactivas, durante al menos
una semana.
Será evidente para un experto en la técnica que
ciertos compuestos de esta invención pueden existir en formas
tautómeras, estando todas estas formas tautómeras dentro del alcance
de la invención.
A no ser que se indique otra cosa, se entiende
también que las estructuras representadas aquí incluyen todas las
formas estereoquímicas de la estructura; es decir, las
configuraciones R y S para cada centro asimétrico. Por lo tanto,
isómeros estereoquímicos simples así como mezclas enantiómeras y
diastereoisómeras de los presentes compuestos están dentro del
alcance de la invención. A no ser que se indique otra cosa, se
entiende también que las estructuras representadas aquí incluyen
compuestos que difieren solo en la presencia de uno o más átomos
isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen
las presentes estructuras excepto por la substitución de un
hidrógeno por un deuterio o un tritio, o la substitución de un
carbono por un carbono enriquecido en ^{13}C o ^{14}C, están
dentro del alcance de esta invención.
Los compuestos de la presente invención están
dentro del género de compuestos descritos en la publicación PCT WO
02/22607. Sin embargo, los solicitantes han descubierto que los
presentes compuestos tienen una potencia sorprendente e
inesperadamente incrementada en la protección de células neuronales
contra una lesión isquémica y en el tratamiento de la apoplejía.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un compuesto de fórmula I en la que R^{y} es un grupo alifático
C_{1-4} no substituido. Grupos alifáticos
preferidos de compuestos de fórmula I son grupos alquilo. Tales
grupos alquilo son preferiblemente metilo, etilo, ciclopropilo,
terc-butilo o isopropilo. Grupos alquilo más
preferidos de fórmula I son metilo, ciclopropilo y
terc-butilo.
De acuerdo con una modalidad, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula I en la que W es
nitrógeno.
De acuerdo con otra modalidad más, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula I en la que R^{1}
es hidrógeno.
De acuerdo con otra modalidad, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula I en la que R^{1}
es flúor.
Se entiende que todas las combinaciones y
subcombinaciones de modalidades, según se describen aquí, están
dentro del alcance de la presente invención.
Ejemplos representativos de compuestos de
fórmula I se indican en la Tabla 1 posteriormente.
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Los compuestos de esta invención pueden
prepararse según se ilustra mediante los Esquemas
I-II siguientes y mediante métodos generales
conocidos por los expertos en la técnica.
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Esquema
I
- Reactivos y condiciones: (a) cloruro de oxalilo, dicloroetano, 70ºC; (b) dimetilamina, pentano, TiCl_{4}; (c) NH_{4}OAc, HOAc, THF, reflujo; (d) POCl_{3}, n-Pr_{3}N, reflujo; (e) 160ºC, puro.
El Esquema I anterior muestra un método general
para preparar compuestos de la presente invención. En la etapa (a),
la arilamida 1 se trata con cloruro de oxalilo para formar el
isocianato de acilo 2. Según se muestra en la etapa (c), un
isocianato de acilo 2 puede condensarse con una enamina 3 para
proporcionar una pirimidinona 4 (J. Org. Chem (1993), 58,
414-418; J. Med. Chem., (1992), 35,
1515-1520; J. Org. Chem., 91967, 32,
313-214). El producto intermedio 4 se trata con
POCl_{3} para formar el compuesto clorado 5 que a continuación se
combina con el derivado de aminoindazol 6 para proporcionar un
compuesto de fórmula I. Métodos para preparar los derivados de
aminoindazol 6 se conocen en la técnica. Específicamente, la
síntesis de estos derivados se indica en WO 02/22607.
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Esquema
II
- Reactivos y condiciones: (a) i LiN(TMS)_{2}, éter, THF, ii HCl; (b) NaOEt, EtOH, reflujo.
El Esquema II anterior muestra un método
alternativo para preparar el producto intermedio de pirimidinona 5,
que puede utilizarse en la preparación de compuestos de fórmula I
según se representa en el Esquema I en la etapa (e) anteriormente.
En la etapa (a), el arilnitrilo 7 se convierte en el producto
intermedio de benzamidina 8 que se trata a continuación con el
beta-cetoéster 9 para formar el compuesto de
pirimidinona 5 que puede utilizarse como se describe
anteriormente.
Un experto normal en la técnica puede sintetizar
otros compuestos de esta invención siguiendo las enseñanzas de la
memoria descriptiva usando reactivos que se sintetizan fácilmente o
están disponibles comercialmente.
La actividad de un compuesto utilizado en esta
invención como un inhibidor de GSK-3 puede ensayarse
in vitro, in vivo o en una línea celular. Ensayos
in vitro incluyen ensayos que determinan la inhibición de la
actividad de fosforilación o la actividad de ATPasa de GSK3
activada. Ensayos in vitro alternativos cuantifican la
capacidad del inhibidor para unirse a GSK-3. La
unión del inhibidor puede medirse radioetiquetando el inhibidor
antes de la unión, aislando el complejo
inhibidor/GSK-3 y determinando la cantidad de
radioetiqueta unida. Alternativamente, la unión del inhibidor puede
determinarse efectuando un experimento de competición en el que
nuevos inhibidores se incuban con GSK-3 unida a
radioligandos conocidos.
De acuerdo con otra modalidad, la invención
proporciona una composición que comprende un compuesto de esta
invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un
portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. La
cantidad de compuesto en las composiciones de esta invención es tal
que es eficaz para inhibir detectablemente una proteína quinasa,
particularmente GSK-3, en una muestra biológica o en
un paciente. Preferiblemente, la composición de esta invención se
formula para la administración a un paciente que necesite tal
composición. Lo más preferiblemente, la composición de esta
invención se formula para administración oral a un paciente.
El término "paciente", según se usa aquí,
significa un animal, preferiblemente un mamífero, y lo más
preferiblemente un ser humano.
El término "portador, adyuvante o vehículo
farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador, adyuvante
o vehículo atóxico que no destruye la actividad farmacólogica del
compuesto con el que se formula. Portadores, adyuvantes o vehículos
farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones
de esta invención incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores
iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas
séricas, tales como albúmina de suero humano, substancias
tamponadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato
potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales
saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de
protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico,
cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato
magnésico, polivinilpirrolidona, substancias basadas en celulosa,
polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras,
copolímeros de bloques de
polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y
grasa de lana.
El término "inhibir detectablemente", según
se usa aquí, significa un cambio medible en la actividad de
GSK-3 entre una muestra que comprende dicha
composición y la quinasa GSK-3 y una muestra
equivalente que comprende la quinasa GSK-3 en
ausencia de dicha composición.
Una "sal farmacéuticamente aceptable"
significa cualquier sal, éster, sal de un éster u otro derivado
atóxico de un compuesto de esta invención que, al administrarlo a un
receptor, sea capaz de proporcionar, directamente o indirectamente,
un compuesto de esta invención o un metabolito o residuo del mismo
inhibidoramente activo.
Según se usa aquí, el término "metabolito o
residuo del mismo inhibidoramente activo" significa que un
metabolito o un compuesto de la presente invención, o un residuo del
mismo, también es un inhibidor de la quinasa
GSK-3.
Sales farmacéuticamente aceptables de los
compuestos de esta invención incluyen las derivadas de ácidos y
bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Ejemplos
de sales ácidas adecuadas incluyen acetato, adipato, alginato,
aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato,
canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato,
dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptanoato,
glicerofosfato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato,
hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro,
2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, malonato,
metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato,
nitrato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato,
3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato,
propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato,
tosilato y undecanoato. Otros ácidos, tales como el oxálico, aunque
no son por sí mismos farmacéuticamente aceptables, pueden emplearse
en la preparación de sales útiles como productos intermedios para
obtener los compuestos de la invención y sus sales de adición de
ácidos farmacéuticamente aceptables.
Sales derivadas de bases adecuadas incluyen
sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio y potasio), metales
alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), amonio y
N^{+}(alquilo C_{1-4})_{4}. Esta
invención también prevé la cuaternización de cualesquiera grupos que
contienen nitrógenos básicos de los compuestos descritos aquí.
Pueden obtenerse mediante tal cuaternización productos solubles o
dispersables en agua o aceite.
Las composiciones de la presente invención
pueden administrarse oralmente, parenteralmente, mediante un aerosol
de inhalación, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente,
vaginalmente o a través de un depósito implantando. El término
"parenteral", según se usa aquí, incluye técnicas de inyección
o infusión subcutáneas, intravenosas, intramusculares,
intraarticulares, intrasinoviales, intraesternales, intratecales,
intrahepáticas, intralesionales e intracraneales. Preferiblemente,
las composiciones se administran oralmente, intraperitonealmente o
intravenosamente. Formas inyectables estériles de las composiciones
de esta invención pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa.
Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas
conocidas en la especialidad usando agentes dispersantes o
humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación
inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión
inyectable estéril en un diluyente o disolvente atóxico
parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en
1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes
aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer
y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean
convencionalmente aceites fijos estériles como un medio disolvente o
de suspensión.
Para este propósito, puede emplearse cualquier
aceite fijo blando, incluyendo mono- o di-glicéridos
sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus
derivados de glicérido, son útiles en la preparación de productos
inyectables, como lo son los aceites farmacéuticamente aceptables
naturales, tales como aceite de oliva o aceite de ricino,
especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o
suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o
dispersante alcohólico de cadena larga, tal como
carboximetilcelulosa, o agentes dispersantes similares que se usan
comúnmente en la formulación de formas de dosificación
farmacéuticamente aceptable incluyendo emulsiones y suspensiones.
Otros tensioactivos comúnmente usados, tales como Tween, Spans y
otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad
que se usan comúnmente en la fabricación de formas de dosificación
sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables, también
pueden usarse con propósitos de formulación.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables
de esta invención pueden administrarse oralmente en cualquier forma
de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero no limitada a,
cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de
tabletas para uso oral, portadores comúnmente usados incluyen
lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente agentes
lubricantes, tales como estearato magnésico. Para la administración
oral en forma de cápsula, diluyentes útiles incluyen lactosa y
almidón de maíz deshidratado. Cuando se requieren suspensiones
acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes
emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también pueden añadirse
ciertos agentes edulcorantes, saboreantes o colorantes.
Alternativamente, las composiciones
farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse
en forma de supositorios para administración rectal. Estos pueden
prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante
adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a
temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para
liberar el fármaco. Tales materiales incluyen mantequilla de cacao,
cera de abejas y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables
de esta invención también pueden administrarse tópicamente,
especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u
órganos fácilmente accesibles mediante aplicación tópica, incluyendo
enfermedades del ojo, la piel o el tracto intestinal inferior.
Formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una
de estas áreas u órganos.
La aplicación tópica para el tracto intestinal
inferior puede efectuarse en una formulación de supositorio rectal
(véase anteriormente) o en una formulación de enema adecuada.
También pueden usarse parches tópicamente transdérmicos.
Para aplicaciones tópicas, las composiciones
farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada
adecuada que contiene el componente activo suspendido o disuelto en
uno o más portadores. Portadores para la administración tópica de
los compuestos de esta invención incluyen, pero no se limitan a,
aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol,
polioxietileno, un compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante
y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticamente
aceptables pueden formularse en una loción o crema adecuada que
contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o
más portadores farmacéuticamente aceptables. Portadores adecuados
incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, monoestearato de
sorbitán, polisorbato 60, ésteres cetílicos, cera, alcohol
cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y
agua.
Para uso oftálmico, las composiciones
farmacéuticamente aceptables pueden formularse como suspensiones
micronizadas en solución salina estéril isotónica de pH ajustado o,
preferiblemente, como soluciones en solución salina estéril
isotónica de pH ajustado, con o sin un conservante tal como cloruro
de benzalconio. Alternativamente, para usos oftálmicos, las
composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una
pomada tal como vaselina.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables
de esta invención también pueden administrarse mediante aerosol
nasal o inhalación. Tales composiciones se preparan de acuerdo con
técnicas bien conocidas en la especialidad de la formulación
farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina,
empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados,
promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad,
fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes
convencionales.
Lo más preferiblemente, las composiciones
farmacéuticamente aceptables de esta invención se formulan para
administración oral.
La cantidad de los compuestos de la presente
invención que puede combinarse con los materiales portadores para
producir una composición en una forma de dosificación simple variará
dependiendo del huésped tratado y del modo particular de
administración. Preferiblemente, las composiciones deben formularse
a fin de que una dosificación de entre 0,01-100
mg/kg de peso corporal/día del inhibidor pueda administrarse a un
paciente que reciba estas composiciones.
También debe entenderse que una dosificación y
un régimen de tratamiento específicos para cualquier paciente
particular dependerán de una variedad de factores, incluyendo la
actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso
corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de
administración, la velocidad de excreción, la combinación de
fármacos y el juicio del médico tratante y la gravedad de la
enfermedad particular que se trata. La cantidad de un compuesto de
la presente invención en la composición también dependerá del
compuesto particular de la composición.
Dependiendo de la condición o la enfermedad
particular que ha de tratarse o prevenirse, agentes terapéuticos
adicionales, que normalmente se administran para tratar o prevenir
esa condición, también pueden estar presentes en las composiciones
de esta invención.
Por ejemplo, factores neurotróficos u otros
agentes para tratar trastornos neurológicos o neurodegenerativos
pueden combinarse con los compuestos de esta invención para tratar
trastornos neurológicos y neurodegenerativos. Ejemplos de factores
neurotróficos conocidos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores
de acetilcolinesterasa, inhibidores de MAO, interferones,
anticonvulsivos, bloqueadores de canales iónicos, riluzol y agentes
antiparkinsonianos.
Ejemplos de tratamientos conocidos para la
apoplejía incluyen Activase®, un activador del plasminógeno tisular
recombinante o genéticamente manipulado (rt-PA),
heparina, antagonistas de glutamato, antagonistas del calcio,
antagonistas de opiáceos, antagonistas de GABA y antioxidantes.
Otros ejemplos de agentes con los que también
pueden combinarse los compuestos de esta invención incluyen, sin
limitación, agentes antidepresivos, tales como Zoloft®, Prozac®,
Paxil® y Buspar®; agentes antiinflamatorios tales como
corticosteriodes, bloqueadores de TNF, IL-1 RA,
azatioprina, ciclofosfamida y sulfasalazina; agentes
inmunomoduladores e inmosupresores tales como ciclosporina,
tacrolimus, rapamicina, micofenolato de mofetilo, interferones,
cortiscosteroides, ciclofosfamida, azatioprina y sulfasalazina;
factores neurotróficos tales como inhibidores de
acetilcolinesterasa, inhibidores de MAO, interferones,
anticonvulsivos, bloqueadores de canales iónicos, riluzol y agentes
antiparkinsonianos; agentes para tratar una enfermedad
cardiovascular tales como beta-bloqueadores,
inhibidores de ACE, diuréticos, nitratos, bloqueadores de los
canales del calcio y estatinas; agentes para tratar la diabetes
tales como insulina, análogos de insulina, inhibidores de
alfa-glucosidasa, biguanidas y sensibilizadores
frente a la insulina; y agentes para tratar trastornos de
inmunodeficiencia tales como gammaglobulina.
La cantidad de agente terapéutico adicional
presente en las composiciones de esta invención no será mayor que la
cantidad que normalmente se administraría en una composición que
comprendiera el agente terapéutico como el único agente activo.
Preferiblemente, la cantidad de agente terapéutico adicional en las
composiciones actualmente descritas variará de aproximadamente 50% a
100% de la cantidad normalmente presente en una composición que
comprende ese agente como el único agente terapéuticamente
activo.
De acuerdo con otra modalidad, la presente
invención se refiere a administrar a un paciente un agente
terapéutico adicional seleccionado de un tratamiento para la
enfermedad de Alzheimer (AD), un tratamiento para la enfermedad de
Parkinson, un agente para tratar la esclerosis múltiple (MS), un
tratamiento para el asma, un agente antiinflamatorio, un agente
inmunomodulador o inmunosupresor, un factor neurotrófico, un agente
para tratar la apoplejía, un agente para tratar una enfermedad
cardiovascular, un antidepresivo, un agente antipsicótico, un agente
para tratar la diabetes, en donde:
- dicho agente terapéutico adicional es apropiado para la enfermedad que se trata; y
- dicho agente terapéutico adicional se administra junto con dicha composición como una forma de dosificación simple o separadamente de dicha composición como parte de una forma de dosificación múltiple.
De acuerdo con otra modalidad, la invención se
refiere a un método para inhibir la actividad de quinasa
GSK-3 en una muestra biológica, que comprende la
etapa de poner en contacto dicha muestra biológica con un compuesto
de esta invención o una composición que comprende dicho
compuesto.
El término "muestra biológica", según se
usa aquí, incluye, sin limitación, cultivos celulares o extractos de
los mismos; material de biopsia obtenido de un mamífero o extractos
del mismo; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas u otros
fluidos corporales o extractos de los mismos.
La inhibición de la actividad de quinasa
GSK-3 en una muestra biológica es útil para una
variedad de propósitos que son conocidos por el experto en la
especialidad. Ejemplos de tales propósitos incluyen, pero no se
limitan a, trasfusión de sangre, trasplante de órganos,
almacenamiento de especímenes biológicos y ensayos biológicos.
De acuerdo con otra modalidad, la invención se
refiere a un método para inhibir la actividad de quinasa
GSK-3 en un paciente, que comprende la etapa de
administrar a dicho paciente un compuesto de esta invención o una
composición que comprende dicho compuesto.
De acuerdo con otra modalidad, la invención
proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de una
enfermedad o condición mediada por GSK-3 en un
paciente, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente una
composición de acuerdo con la presente invención.
El término "enfermedad mediada por
GSK-3", según se usa aquí, significa cualquier
enfermedad u otra condición o enfermedad perjudicial en la que se
sabe que la GSK-3 representa un papel. Tales
enfermedades o condiciones incluyen, sin limitación, una enfermedad
autoinmune, una enfermedad inflamatoria, un trastorno metabólico, un
trastorno psiquiátrico, diabetes, un trastorno angiogénico,
tauopotía, un trastorno neurológico o neurodegenerativo, una lesión
de la médula espinal, glaucoma, calvicie o una enfermedad
cardiovascular.
De acuerdo con otra modalidad, la presente
invención se refiere a un método para tratar o disminuir la gravedad
de una enfermedad, un trastorno o una condición seleccionados de una
enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, un trastorno
metabólico, un trastorno psiquiátrico, diabetes, un trastorno
angiogénico, tauopotía, un trastorno neurológico o
neurodegenerativo, una lesión de la médula espinal, glaucoma,
calvicie o una enfermedad cardiovascular, en un paciente que lo
necesite, que comprende administrar a dicho paciente un compuesto de
la presente invención o una composición del mismo.
De acuerdo con otra modalidad, la presente
invención se refiere a un método para tratar o disminuir la gravedad
de una enfermedad o condición seleccionada de alergia, asma,
diabetes, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington,
enfermedad de Parkinson, demencia asociada con el SIDA, esclerosis
lateral amiotrófica (ALS, enfermedad de Lou Gehrig), esclerosis
múltiple (MS), una lesión debida a un trauma de cabeza,
esquizofrenia, ansiedad, trastorno bipolar, tauopotía, una lesión en
la médula espinal o los nervios periféricos, infarto de miocardio,
hipertrofia de cardiomiocitos, glaucoma, trastorno de déficit de
atención (ADD), depresión, un trastorno del sueño,
reperfusión/isquemia, apoplejía, un trastorno angiogénico o
calvicie, en donde dicho método comprende administrar a un paciente
que lo necesite un compuesto de la presente invención o una
composición del mismo.
De acuerdo con una modalidad preferida, el
método de la presente invención se refiere a tratar o disminuir la
gravedad de la apoplejía.
De acuerdo con otra modalidad preferida, el
método de la presente invención se refiere a tratar o disminuir la
gravedad de un trastorno neurodegenerativo o neurológico.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para disminuir la movilidad del esperma en un paciente
varón, que comprende administrar a dicho paciente un compuesto de la
presente invención o una composición del mismo.
En una modalidad alternativa, los métodos de
esta invención que utilizan composiciones que no contienen un agente
terapéutico adicional comprenden la etapa adicional de administrar
separadamente a dicho paciente un agente terapéutico adicional.
Cuando estos agentes terapéuticos adicionales se administran
separadamente, pueden administrarse al paciente antes de,
secuencialmente con o después de la administración de las
composiciones de esta invención.
Para que la invención descrita aquí pueda
entenderse más a fondo, se indican los siguientes ejemplos. Debe
entenderse que estos ejemplos tienen solamente propósitos
ilustrativos y no debe considerarse que limiten esta invención de
ningún modo.
Según se usa aquí, el método de HPLC denominado
"Método A" es como sigue:
- Columna: C18, 3 \mum, 2,1 x 50 mm, "Lighting" de Jones Chromatography.
- Gradiente: agua al 100% (que contiene acetonitrilo al 1%, TFA al 0,1%) hasta acetonitrilo al 100% (que contiene TFA al 0,1%) durante 4,0 minutos, manténgase a 100% de acetonitrilo durante 1-4 minutos y vuélvase a las condiciones iniciales.
- Tiempo total del experimento 7,0 minutos.
- Caudal: 0,8 ml/minuto.
Según se usa aquí, el término "R_{f}" se
refiere al tiempo de retención, en minutos, obtenido para el
compuesto usando el método de HPLC indicado. Los números de
compuestos citados en los Ejemplos posteriormente corresponden a los
números de compuestos citados en la Tabla 1, anteriormente. Los tres
compuestos nombrados posteriormente bajo los Ejemplos 3, 9 y 15 no
son ejemplos de esta invención.
Una mezcla de
2-trifluorometilbenzamidina (2,13 g, 4 mmol) y
etóxido sódico (0,38 g, 12 mmol) en etanol (20 ml) se trató con
acetoacetato de metilo (0,44 ml, 4 mmol) y se calentó durante 24
horas. La reacción se enfrió, se concentró, se diluyó con agua y se
acidificó con ácido clorhídrico 2N. La solución resultante se
extrajo con acetato de etilo, se secó sobre sulfato sódico y se
concentró. La purificación mediante cromatografía de desarrollo
rápido [SiO_{2}, metanol:diclorometano (3:97)] proporcionaba el
compuesto del título (0,51 g, 50% de rendimiento) como un sólido
amarillo. ^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,7 (s ancho, 1H), 7,9 (m,
1H), 7,8 (m, 2H), 7,7 (m, 1H), 6,3 (s, 1H), 2,21 (s, 3H) ppm; MS
(FIA) 255,0 (M+H); R_{t} (Método A) 2,578 minutos.
Una solución de
6-metil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona
(10,7 g, 41,9 mmol) en oxicloruro de fósforo (39 ml, 419 mmol) se
trató con tri-n-propilamina (16 ml,
83,9 mmol) y se sometió a reflujo a 110-120ºC
durante 1 hora. El disolvente se evaporó, se azeotropizó tres veces
con tolueno y a continuación se secó a vacío. El residuo se recogió
en acetato de etilo, se lavó secuencialmente con hidróxido sódico
1N, agua y salmuera, a continuación se secó sobre sulfato sódico y
se concentró. La purificación mediante cromatografía de desarrollo
rápido [SiO_{2}, acetato de etilo:hexanos (1:9)] proporcionaba el
compuesto del título (9,61 g, 84% de rendimiento) como un aceite
naranja. ^{1}H NMR (CDCl_{3}, DMSO-d_{6})
\delta 2,63 (3H, s), 7,26 (s, 1H), 7,61 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,67 (t,
J=7,5Hz, 1H), 7,76 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,82 (d, J=7,8Hz, 1H) ppm; MS
(FIA) 273,0 (M+H); R_{t} (Método A) 3,499 min.
Una mezcla de
4-cloro-6-metil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina
(0,10 g, 0,37 mmol) y
5-fluoro-1H-indazol-3-ilamina
(0,072 g, 0,48 mmol) se calentó a 160-170ºC durante
8 horas. El residuo resultante se enfrió hasta temperatura ambiente
y a continuación se disolvió en N-metilpirrolidinona
(2 ml). Esta mezcla se vertió en agua (20 ml) y se añadió
dicarbonato sódico (5 ml) y la mezcla resultante se filtró, lavando
con agua. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionaba el
compuesto del título (0,081 g, 43% de rendimiento) como un sólido de
color canela. ^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,8 (s ancho, 1H), 10,6 (s
ancho, 1H), 7,86 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,77 (m, 4H), 7,62 (s ancho, 1H),
7,50 (m, 1H), 7,29 (m, 1H), 2,44 (s, 3H) ppm; LC-MS
388,05 (M+H); R_{t} (Método A) 2,900 minutos.
Una mezcla de
2-trifluoremetilbenzamidina (1,12 g, 5 mmol),
etóxido sódico (1,02 g, 15 mmol) y éster metílico de ácido
4,4-dimetil-3-oxopentanoico
(0,80 ml, 5 mmol) en etanol (50 mL) se calentó a reflujo durante 16
horas. La reacción se enfrió, se concentró, se diluyó con agua y se
acidificó con ácido clorhídrico 2N. Esta solución se extrajo con
acetato de etilo, se secó sobre sulfato sódico y se concentró. La
purificación mediante cromatografía de desarrollo rápido [SiO_{2},
metanol:diclorometano (2:98)] proporcionaba el compuesto del título
(0,48 g, 32% de rendimiento) como un sólido amarillo;
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 12,8 (s ancho, 1H), 7,89 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,78 (m, 2H),
7,71 (d, J=7,4Hz, 1H), 6,24 (s, 1H), 1,20 (s, 9H) ppm;
LC-MS 297,03 (M+H); R_{t} (Método A) 3,30
minutos.
Una solución de
6-terc-butil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona
(0,47 g, 1,59 mmol) en oxicloruro de fósforo (1,65 ml, 15,9 mmol) se
trató con tri-n-propilamina (0,61
ml, 3,17 mmol) y se calentó a 110-120ºC durante 1
hora. El disolvente se retiró mediante evaporación y a continuación
se azeotropizó tres veces con tolueno. El residuo se recogió en
acetato de etilo, se lavó secuencialmente con hidróxido sódico 1N,
agua y salmuera, a continuación se secó sobre sulfato sódico y se
concentró. La purificación mediante cromatografía de desarrollo
rápido [SiO_{2}, acetato de etilo:hexanos (1:9)] proporcionaba el
compuesto del título (0,33 g, 66% de rendimiento) como un aceite
amarillo. ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 1,31 (9H, s),
7,25 (s, 1H), 7,51 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,58 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,74 (t,
J=8,5Hz, 2H) ppm; MS (FIA) 314,9 (M+H); R_{t} (Método A) 4,156
minutos.
Una mezcla de
4-cloro-6-terc-butil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina
(0,10 g, 0,32 mmol) y
1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamina
(0,064 g, 0,48 mmol) se calentó a 160-170ºC durante
16 horas. La mezcla resultante se enfrió, se disolvió en
N-metilpirrolidinona (2 ml), a continuación se
vertió en agua (20 ml) y bicarbonato sódico (5 ml) y se extrajo dos
veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se
lavaron cuatro veces con agua, una vez con salmuera, a continuación
se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron. El producto en
bruto se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar el
compuesto del título (0,007 g, 4% de rendimiento) como un sólido
amarillo. ^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s ancho, 1H), 10,6 (s
ancho, 1H), 8,49 (m, 2H), 7,84 (d, J=7,8Hz, 2H), 7,76 (m, 2H), 7,68
(m, 1H), 7,12 (m, 1H), 1,32 (s, 9H) ppm; LC-MS
413,08 (M+H); R_{t} (Método A) 3,112 minutos.
- A una solución de ciclopropilmetilcetona (19,8 ml, 200 mmol) en pentano (600 ml) a 0ºC bajo nitrógeno se añadió dimetilamina/tetrahidrofurano (2M, 500 ml, 1000 mmol) y a continuación se añadió gota a gota una solución de cloruro de titanio(IV) (12,1 ml, 110 mmol) en pentano (60 ml). La reacción se agitó 0,5 horas a 0ºC y a continuación durante 5 horas a temperatura ambiente. La reacción se filtró a través de Celite, lavando con pentano y éter, se concentró a vacío con una temperatura del baño de 15-20ºC y a continuación se almacenó durante la noche como un aceite naranja a -4ºC.
- Una solución de 2-trifluorometilbenzamida (34,9 g, 185 mmol) en 1,2-dicloroetano (600 ml), a temperatura ambiente bajo nitrógeno, se trató con cloruro de oxalilo (20,2 ml, 230 mmol) en gotas rápidas y la reacción se agitó a 70-80ºC durante la noche. El disolvente se retiró mediante evaporación y el residuo se azeotropizó dos veces con tolueno.
- A una solución de (1-ciclopropilvinil)dimetilamina en tetrahidrofurano (400 ml) a 0ºC bajo nitrógeno se añadió una solución de isocianato de 2-trifluorometilbenzoílo en tetrahidrofurano (50 ml), gota a gota. La reacción se agitó durante 0,5 horas y a continuación se añadieron acetato amónico (78 g, 1000 mmol) y ácido acético (400 ml). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3 horas con retirada continua de tetrahidrofurano, a continuación se enfrió y se vertió en agua (1,2 l). El precipitado resultante se recogió mediante filtración, lavando con agua y éter para proporcionar 6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona (28,79 g, 56% de rendimiento) como un sólido blanco que es una mezcla del compuesto del título y (2-trifluorometilbenzoil)-urea (91:9 mediante HPLC), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 12,7 (s ancho, 1H), 7,87 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,79 (m, 2H), 7,73 (d, J=7,5Hz, 1H), 6,32 (s, 1H), 1,93 (m, 1H), 0,90 (m, 4H), [urea: 10,8 (s ancho, 1H), 7,45 (s ancho, 1H)] ppm; LC-MS 280,96 (M+H); R_{t} (Método A) 2,961 minutos (compuesto del título), 2,313 minutos (impureza de urea).
6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona
(12,0 g, 42,8 mmol) en oxicloruro de fósforo (40 ml, 428 mmol) se
calentó a 75-80ºC durante 1 hora. El disolvente se
retiró mediante evaporación y azeotropizando tres veces con tolueno.
El residuo se enfrió hasta 0ºC. Se recogió en acetato de etilo, se
trató con trozos de hielo y agua. La mezcla se lavó a continuación
secuencialmente con bicarbonato sódico, agua y salmuera, se secó
sobre sulfato sódico y se concentró. La purificación mediante
cromatografía de desarrollo rápido (SiO_{2}, acetato de
etilo:hexanos 5:95) proporcionaba el compuesto del título (9,71 g,
76% de rendimiento) como un aceite incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}, 500
MHz) \delta 1,12 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 2,02 (m, 1H), 7,24 (s,
1H), 7,56 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,64 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,79 (m, 2H) ppm;
MS (FIA) 299,1/300,9 (M+H); R_{t} (Método A) 3,882 minutos.
Una mezcla de
4-cloro-6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina
(0,08 g, 0,27 mmol) y
1H-indazol-3-ilamina (0,036
g, 0,41 mmol) se calentó a 160-170ºC durante 6
horas. El residuo se enfrió y se disolvió en
N-metilpirrolidinona (2 ml), se vertió en agua (30
ml) y bicarbonato sódico (5 ml) y a continuación se filtró, lavando
con agua y éter. El precipitado recogido y el lavado etéreo se
combinaron y se concentraron. La purificación mediante cromatografía
de desarrollo rápido [SiO_{2}, metanol:diclorometano (2:98)]
proporcionaba el compuesto del título (0,017 g, 15% de rendimiento)
como un sólido amarillo claro. ^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,6 (s ancho, 1H), 10,2 (s
ancho, 1H), 8,00 (d, J=8,1Hz, 2H), 7,81 (d, J=7,9Hz, 1H), 7,71 (m,
3H), 7,65 (t, J=7,3Hz, 1H), 7,45 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,36 (t, J=7,5Hz,
1H), 7,06 (t, J=7,5Hz, 1H), 2,04 (m, 1H), 1,01 (m, 2H), 0,96 (m, 2H)
ppm; LC-MS 396,10 (M+H); R_{t} (Método A) 3,122
minutos.
Una mezcla de
4-cloro-6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina
(7,00 g, 23,4 mmol, preparada como se describe anteriormente en el
Ejemplo 8) y
1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamina
(9,43 g, 70,3 mmol) en N-metilpirrolidinona (50 ml)
se calentó a 130ºC durante 1 horas. El residuo se recogió, se
disolvió en N-metilpirrolidinona (2 ml), se vertió
en agua (500 ml) y bicarbonato sódico (15 ml) y a continuación se
filtró, lavando con agua. La purificación mediante cromatografía de
desarrollo rápido [SiO_{2}, acetato de etilo:hexanos (35:65)]
proporcionaba el compuesto del título (5,25 g, 57% de rendimiento)
como un sólido blanco. ^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,1 (s ancho, 1H), 10,5 (s
ancho, 1H), 8,50 (m, 2H), 7,82 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,73 (m, 3H), 7,66
(t, J=7,7Hz, 1H), 7,12 (m, 1H), 2,07 (m, 1H), 1,02 (m, 2H), 0,97 (m,
2H) ppm; LC-MS 397,22 (M+H); R_{t} (Método A)
3,412 minutos.
La sal de HCl se preparó disolviendo el
compuesto I-1 (8,42 g, 21,4 mmol) en ácido
clorhídrico 6N y liofilizando para proporcionar el compuesto del
título (9,242 g, 99%) como un sólido amarillo.
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 13,3 (s ancho, 1H), 10,9 (s ancho, 1H), 8,53 (dd, J=4,4,
1,4Hz, 1H), 8,48 (d ancho, J=7,4Hz, 1H), 7,87 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,79
(m, 2H), 7,72 (t, J=6,8Hz, 2H), 7,15 (m, 1H), 2,14 (m, 1H), 1,07 (m,
4H) ppm; MS (FIA) 397,3 (M+H), 395,2 (M-H), 431,2
(M-H+HCl); R_{t} (Método A) 2,798 minutos.
Se preparó
6-but-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona
como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, excepto que usando
éster etílico de ácido
3-oxohept-6-enoico.
La reacción proporcionaba el compuesto del título ((2,545 g, 49% de
rendimiento) como un sólido de color crema.
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 12,8 (s, 1H), 7,88 (d, 1H), 7,79 (t, 1H), 7,75 (t, 1H),
7,68 (d, 1H), 6,22 (s, 1H), 5,80 (m, 1H), 5,03 (dd, 1H), 4,98 (dd,
1H), 2,56 (t, 2H), 2,36 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 295,1(M+H);
R_{t} (Método A) 3,160 minutos.
El compuesto del título se preparó como se
describe en el Ejemplo 2, excepto que usando
6-but-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona
para proporcionar un aceite amarillo (0,49 g, 99% de rendimiento).
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 7,72 (d, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,57 (t, 1H), 7,51 (t, 1H),
7,13 (s, 1H), 5,77 (m, 1H), 4,98 (m, 2H), 2,84 (t, 2H), 2,49 (m, 2H)
ppm; MS (FIA) 313,0(M+H); R_{t} (Método A) 4,220
minutos.
El compuesto del título se preparó como se
describe en el Ejemplo 6, excepto que usando
4-but-3-enil-6-cloro-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidina
para proporcionar un sólido de color crema (2,712 g, 62% de
rendimiento). ^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,1 (s, 1H), 10,56 (s, 1H),
8,50 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,84 (d, 1H), 7,76 (t, 1H), 7,69 (m,
3H), 7,13 (m, 1H), 5,86 (m, 1H), 5,06 (dd, 1H), 4,98 (dd, 1H), 2,76
(t, 2H), 2,46 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 411,2(M+H); R_{t}
(Método A) 3,019 minutos.
Una solución de
[6-but-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
(0,10 g, 0,25 mmol) en metanol (5 ml) y tetrahidrofurano (5 ml) a
-78ºC se burbujeó con ozono durante 5 minutos. Se añadió a esta
mezcla morfolina (0,05 ml, 0,56 mmol) y triacetoxiborohidruro sódico
(0,39 g, 1,85 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 24 horas, cuando se añadían morfolina (0,10 ml, 1,28 mmol) y
triacetoxiborohidruro sódico (0,39 g, 1,85 mmol) adicionales y a
continuación la agitación continuaba otras dos horas. La reacción se
extinguió con bicarbonato sódico y se evaporó. La purificación
mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO_{2}, eluida con
metanol:diclorometano 1:9) seguida por HPLC preparativa
proporcionaba el compuesto del título como un liofilizado amarillo
brillante (0,068 g, 38% de rendimiento). ^{1}H-NMR
(500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7
(s, 1H), 9,60 (s ancho, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,86 (d,
1H), 7,77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,97 (m ancho, 2H),
3,61 (m ancho, 2H), 3,44 (m ancho, 2H), 3,18 (m ancho, 2H), 3,05 (m
ancho, 2H), 2,78 (t, 2H), 2,08 (m, 2H) ppm.
Los siguientes compuestos se prepararon mediante
métodos substancialmente similares a los descritos aquí en los
Ejemplos 1-15, los Esquemas Generales y mediante
métodos conocidos por un experto normal en la técnica.
[6-(3-Piperidin-1-il-propil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
(I-9):
482,2(M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (S, 1H), 9,04 (s ancho, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,78 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,42 (m, 2H), 3,10 (m, 2H), 2,85 (m, 2H), 2,77 (t, 2H), 2,09 (m, 2H), 1,79 (m, 2H), 1,61 (m, 3H), 1,35 (m, 1H) ppm.
482,2(M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (S, 1H), 9,04 (s ancho, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,78 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,42 (m, 2H), 3,10 (m, 2H), 2,85 (m, 2H), 2,77 (t, 2H), 2,09 (m, 2H), 1,79 (m, 2H), 1,61 (m, 3H), 1,35 (m, 1H) ppm.
[6-(3-Dietilaminopropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
(I-10):
470 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 9,07 (s, 1H), 8,50 (m, 1H), 7,85 (m, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,76 (m, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,11 (m, 6H), 2,80 (t, 2H), 2,05 (m, 2H), 1,15 (t, 6H) ppm.
470 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 9,07 (s, 1H), 8,50 (m, 1H), 7,85 (m, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,76 (m, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,11 (m, 6H), 2,80 (t, 2H), 2,05 (m, 2H), 1,15 (t, 6H) ppm.
[6-(3-(4-Metilpiperazin-1-il)-propil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
(I-11): 497,2 (M+H), ^{1}H-NMR
(500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7
(s, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (m, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H),
7,72 (m, 3H), 7,14 (m, 1H), 3,0-3,7 (ancho, 10H),
2,83 (s, 3H), 2,77 (t, 2H), 2,05 (m, 2H) ppm.
[6-(3-Piperazin-1-il-propil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
(I-12): 483,3 (M+H), ^{1}H-NMR
(500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7
(s, 1H), 9,06 (s ancho, 2H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d,
1H), 7,77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,34 (m ancho, 8H),
3,15 (m ancho, 2H), 2,77 (t, 2H), 2,06 (m, 2H) ppm.
[6-(3-Dimetilaminopropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
(I-13): 442,1 (M+H), ^{1}H-NMR
(500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7
(s, 1H), 9,40 (s ancho, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d,
1H), 7,78 (m, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,12 (m, 2H), 2,77
(m, 8H), 2,06 (m, 2H) ppm.
N,N-Dimetil-N'-{3-[6-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamino)-2-(2-trifluorometliilfenil)-pirimidin-4-il]-propil}-etano-1,2-diamina
(I-14): 485,3 (M+H), ^{1}H-NMR
(500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7
(s, 1H), 9,7 (ancho, 1H), 8,8 (s ancho, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,48 (d,
1H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,71 (m, 2H) 7,14 (m, 1H), 3,32 (s,
4H), 3,07 (m ancho, 2H), 2,84 (s, 6H), 2,80 (m, 2H), 2,04 (m, 2H)
ppm.
[6-(3-Metilaminopropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
(I-15):
428,1 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 8,51 (m, 1H), 8,48 (d, 1H), 8,37 (s ancho, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 2,97 (m, 2H), 2,78 (t, 2H), 2,55 (m, 3H), 2,01 (m, 2H) ppm.
428,1 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 8,51 (m, 1H), 8,48 (d, 1H), 8,37 (s ancho, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 2,97 (m, 2H), 2,78 (t, 2H), 2,55 (m, 3H), 2,01 (m, 2H) ppm.
2-{3-[6-(1H-Pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamino)-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-il]propilamino}-etanol
(I-16):
458,2 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (m, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,69 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,62 (t, 2H), 2,99 (m, 4H), 2,78 (t, 2H), 2,04 (m, 2H) ppm.
458,2 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (m, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,69 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,62 (t, 2H), 2,99 (m, 4H), 2,78 (t, 2H), 2,04 (m, 2H) ppm.
[6-(3-(2-Morfolin-4-il-etilamino)-propil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
(I-17): 527,2 (M+H), ^{1}H-NMR
(500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7
(s, 1H), 8,76 (s ancho, 2H), 8,52 (m, 1H), 8,48 (d, 1H), 7,85 (d,
1H), 7,78 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,81 (s ancho, 4H),
3,1-3,3 (m ancho, 8H), 3,06 (t, 2H), 2,80 (t, 2H),
2,05 (t, 2H) ppm.
[6-{3-[Metil-(2-morfolin-4-il-etil)-amino]-propil}-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
(I-18): 541,2 (M+H), ^{1}H-NMR
(500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7
(s, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,78 (m, 1H),
7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,73 (s ancho, 4H), 3,39 (m, 2H), 3,21
(m, 2H), 2,8-3,3 (m ancho, 6H) 2,81 (s, 3H), 2,78
(t, 2H), 2,09 (m, 2H) ppm.
Los compuestos se rastrearon con respecto a su
capacidad para inhibir la actividad de GSK-3\beta
(AA 1-420) usando un sistema de enzimas acopladas
estándar (Fox y otros (1998) Protein Sci. 7, 2249). Las
reacciones se llevaron a cabo en una solución que contenía HEPES 100
mM (pH 7,5), MgCl_{2} 10 mM, NaCl 25 mM, NADH 300 \muM, DTT 1 mM
y DMSO al 1,5%. Las concentraciones de substrato finales en el
ensayo eran ATP 20 \mum (Sigma Chemicals, St Louis, MO) y péptido
(HSSPHQS(PO_{3}H_{2})EDEEE American Peptide,
Sunnyvale, CA) 300 \muM. Las reacciones se llevaron a cabo a 30ºC
y GSK-3b 20 nM. Las concentraciones finales de los
componentes del sistema de enzimas acopladas eran fosfoenolpiruvato
2,5 mM, NADH 300 \muM, 30 \mug/ml de piruvato quinasa y 10
\mug/ml de lactato deshidrogenasa.
Se preparó una solución tamponadora de reserva
de ensayo que contenía todos los reactivos listados anteriormente
con la excepción de ATP y el compuesto de prueba de interés. La
solución tamponadora de reserva de ensayo (175 \mul) se incubó en
una placa de 96 pocillos con 5 \mul del compuesto de prueba de
interés a concentraciones finales que variaban de 0,002 \muM a 30
\muM a 30ºC durante 10 minutos. Típicamente, se efectuó una
valoración de 12 puntos preparando diluciones en serie (a partir de
reservas de compuesto 10 mM) con DMSO del compuesto de prueba en
placas descendientes. La reacción se inició mediante la adición de
20 \mul de ATP (concentración final 20 \muM). Las velocidades de
reacción se obtuvieron usando un lector de placas Spectramax de
Molecular Devices (Sunnyvale, CA) durante 10 minutos a 30ºC. Los
valores de K_{i} se determinaron a partir de los datos de
velocidad como una función de la concentración de inhibidor.
Se encontró que los compuestos de la presente
invención tenían un valor de K_{i} de menos de 100 nM usando el
ensayo descrito anteriormente.
Según se usa aquí, el término "porcentaje de
protección" representa el porcentaje de células neuronales
protegidas contra lesión isquémica (OGD) y se calcula como:
% de protección
= (prueba-OGD)/(normal-OGD)*
100
Este protocolo describe el procedimiento usado
para inducir isquemia experimental mediante
anoxia-reoxigenación en células neuronales
hipocampales cultivadas. El efecto neuroprotector de los compuestos
de prueba se evalúa contra lesión celular y muerte celular
neuronales inducidas por isquemia.
Las siguientes etapas se realizaron antes del
día de ensayo.
El LoG-Neurobasal
[LoG-Neurobasal contiene medio
NoG-Neurobasal (Invitrogen Corp, encargado por el
cliente) más glucosa 0,5 mM, L-glutamina 0,5 mM y
0,25 x penicilina/estreptomicina] se preequilibró en la cámara
hipóxica durante la noche.
El LoG-Neurobasal se
preequilibró en la incubadora normal (CO_{2} al 5%) durante la
noche.
En la incubadora normal (CO_{2} al 5%),
Neurobasal/B27AO [Neurobasal/B27AO contiene medio Neurobasal
(Invitrogen Corp Nº Cat 21103-049) con 2 x B27 menos
complemento AO (Invitrogen Corp Nº Cat 10889-038),
L-glutamina 0,5 mM y 0,25 x
penicilina/estreptomicina] se preequilibró durante la noche.
Las siguientes etapas se realizaron el día del
ensayo: medio LoG-Neurobasal se retiró de la cámara
hipóxica y el medio se burbujeó ligeramente con N_{2} al 100%
durante 30 minutos para desoxigenarlo completamente.
El medio de cultivo (Neurobasal/B27m
[Neurobasal/B27m contiene medio Neurobasal con 2 x complemento B27
(Invitrogen Corp Nº Cat 17504-044) y
L-glutamina 0,5 mM] se aspiró de las células en cada
placa de 12 pocillos usando la bomba de vacío con una pipeta Pasteur
de vidrio estéril.
La placa se lavó una vez con 2 ml de BSS_{0}
libre de glucosa (pH 7,4), preparado a partir de lo siguiente: NaCl
143,6 mM, KCl 5,4 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, MgSO_{4} 0,8 mM,
NaH_{2}PO_{4} 1 mM, NaHCO_{3} 26,2 mM, 10 mg/l de rojo fenol y
0,25 x P/S.
Las neuronas (10-11 días desde
el cultivo inicial) se repusieron con LoG-Neurobasal
desoxigenado (1 ml por pocillo para cada pocillo de una placa de 12
pocillos). Estas células neuronales se prepararon de acuerdo con
Park LC, Calingasan NY, Uchida K, Zhang H, Gibson GE. (2000)
"Metabolic impairment elicits brain cell
type-selective changes in oxidative stress and cell
death in culture". J Neurochem
74(1):114-124.
Los compuestos de prueba se añadieron
directamente a cada pocillo (3 concentraciones del compuesto más
control positivo, cada una por triplicado). Los compuestos se
disolvieron en DMSO al 100%, cuando la concentración de DMSO nunca
superaba 0,5%, entonces las placas se ponían en la cámara hipóxica
durante 5 horas con las tapas de la placa entreabiertas.
Para controles de normoxia, se añadió medio
LoG-Neurobasal normóxico preequilibrado a cada
pocillo y la placa se volvió a colocar en la incubadora de cultivo
normal durante 4 horas.
Después de 4 horas de hipoxia, el medio
existente se eliminó por aspiración cuidadosamente y 2 ml de nuevo
Neurobasal-B27AO oxigenado (preequilibrado) se
añadieron a cada pocillo. Se alcanzó medio reoxigenado colocando el
medio durante la noche en la incubadora de cultivo (CO_{2} al
5%/O_{2} al 95%) antes del uso.
Los mismos compuestos de prueba con las mismas
concentraciones se añadieron de nuevo a los pocillos
correspondientes y las placas se pusieron en la incubadora de
cultivo celular (CO_{2} al 5%/O_{2} al 95%) y se reoxigenaron
durante 20-24 horas). Después de la reoxigenación
durante 20-24 horas, el número de neuronas vivas se
contó usando el método de fluorescencia Cell Tracker Green descrito
posteriormente.
El medio de cultivo existente se aspiró de cada
pocillo de las placas de 12 pocillos y las neuronas se lavaron una
vez con 2 ml de HBSS (pH 7,4, Invitrogen Corp. Nº Cat
14170-112) precalentado hasta
30-37ºC.
A cada pocillo de la placa se añadió 1 ml de
Cell Tracker Green ((Molecular Probes Nº Cat 2925) 2,5 \muM y
colorantes fluorescentes Hoechst 33342 5 \muM disueltos en HBSS.
Las placas se pusieron a continuación a la oscuridad a temperatura
ambiente durante 15 minutos y a continuación las neuronas se lavaron
una vez con 2 ml de HBSS. Se añadió 1 ml de HBSS a cada pocillo y
los números de células fluorescentes vivas y muertas se contaron
usando un sistema de formación de imágenes automatizado
Cellomics®.
Se encontró que los compuestos de la presente
invención tenían un % de valor de protección de \geq30%.
Los animales usados en este estudio eran ratas
Sprague-Dawley macho que pesaban entre 270 y 333 g
(Charles River, NC). Se dejó que las ratas se aclimataran a las
instalaciones de los animales durante al menos una semana con un
ciclo diurno de luz/oscuridad de 12 horas. Se les dejó acceso libre
a alimento y agua.
Los oclusores arteriales intraluminales usados
para bloquear el origen de la arteria cerebral media (MCA) estaban
hechos de sutura monofilamentosa de nailon 4-0
cortada en segmentos de 25 mm de largo. La punta de la sutura se
redondeó mediante exposición a calor. Para incrementar la eficacia
del oclusor para bloquear la luz de la arteria, se revistieron con
una suspensión de poli-L-lisina al
1% y se secaron durante 1 hora en un horno fijado a 60ºC. Las
suturas se adquirieron de Ethelon, Somerville, NJ. Chemical y los
reactivos se utilizaron como sigue:
- 1.
- Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio o TTC, Nº Cat T8877, Nº Lot 50K1435, y PEG400, Nº Cat P-3265, se adquirieron de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.
- 2.
- La formalina tamponada con fosfato, Nº Cat 245-685, se adquirió de Fisher Scientific Co., Middletown, VA.
- 3.
- El agua destilada se produjo en las propias instalaciones.
- 4.
- El etanol, Nº Cat E702-3, se adquirió de Aldridge, Milwaukee, WI.
El modelo de sutura intraluminal de isquemia
cerebral focal se usó substancialmente como se describe por Longa, y
otros, Stroke, 20:84-91 (1989). La vena yugular
externa izquierda se canuló para la administración de vehículo o
compuesto.
Para ayudar a que las ratas mantuvieran la
hidratación durante el estudio, se inyectaron subcutáneamente
dextrosa al 5% en agua y solución de Ringer lactatada (5 ml cada
una) en cada flanco a las 10, 24 y 48 horas después de la MCAO.
Las ratas que cumplían los criterios de
inclusión iniciales (puntuación neurológica de 2 y temperatura
corporal >38,5ºC) se aleatorizaron mediante asignación secuencial
a los grupos de tratamiento con vehículo o compuesto. La asignación
diaria inicial de las ratas a un grupo particular se alternaba cada
día.
El tratamiento con compuesto o vehículo se
inició mediante inyección en bolo i.v. 6 horas después de la MCAO y
continuaba durante las 18 horas siguientes mediante infusión
constante usando la bomba Infu Disk. Las ratas se anestesiaron
brevemente y el catéter yugular se expuso a través de la incisión
dorsal en el cuello. La dosis en bolo de compuesto o vehículo se
administró y la bomba de infusión se activó 5 minutos más tarde. Las
bombas de infusión se unieron al lomo de las ratas mediante un
vendaje.
Se prepararon soluciones de compuestos
recientemente cada día usando un vehículo de agua:PEG400:etanol en
el volumen 5:4:1. Los grupos y las dosis utilizados en este modelo
se indican en la Tabla 2 posteriormente.
El volumen de infarto se determinó mediante
análisis de imágenes de 7 secciones consecutivas teñidas con cloruro
de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) usando una
modificación del procedimiento descrito por Bederson y otros (1986).
Tres días después de la MCAO, las ratas fueron sacrificadas mediante
asfixia con CO_{2} y decapitación. Los cerebros se extirparon
rápidamente de la calavera y se pusieron en vasos de precipitados
individuales que contenían PBS en un baño de hielo durante 30
minutos. Las secciones cerebrales coronales, 2 mm de grosor, se
obtuvieron usando un rebanador matricial cerebral. Las secciones de
cerebro se pusieron en cápsulas de Petri marcadas que contenían TTC
al 2% en PBS durante 20 minutos a 37ºC. El TTC tiñe de rojo el
tejido cerebral viable, dejando el área isquémica blanca. Las
secciones de cerebro se sumergieron a continuación en formalina
tamponada neutra al 10% durante al menos 24 horas a 4ºC. Todas las
secciones se sometieron a obtención de imágenes antes de tres días
después del sacrificio.
Las secciones cerebrales teñidas con TTC fijadas
con formalina (7 secciones consecutivas) se capturaron digitalmente
usando el software Adobe Photoshop y una cámara digital. Las
imágenes se importaron al programa de análisis de imágenes IPLab. El
área de infarto cortical (área blanca) se bosquejó y se midió. El
volumen de infarto se calculó usando la siguiente fórmula:
Volumen de
infarto = \Sigma área de infarto x 2 (la distancia entre cada
sección)
Los volúmenes hemisféricos ipsilateral y
contralateral totales se determinaron de forma similar.
El volumen de edema e calculó substrayendo el
volumen hemisférico contralateral del volumen hemisférico
ipsilateral. Un científico que ignoraba el tratamiento de las ratas
realizaba el análisis.
La función neurológica de las ratas se evaluó a
las 2, 24, 48 y 72 horas después de la MCAO usando un sistema de
puntuación descrito por Bederson y otros (1986b). La puntuación
variaba de 0 a 3 con 0 como normal y 3 indica déficit grave.
La puntuación neurológica a las 2 horas de la
isquemia se usó como criterio de inclusión en el estudio. Si la rata
no tenía una puntuación neurológica de al menos 2 o si tenía una
puntuación de 3, se eliminaba del estudio. Un investigador, que
ignoraba el grupo de tratamiento de la rata, realizaba las
evaluaciones neurológicas.
Se obtuvieron muestras de sangre (\sim0,5 ml)
de las ratas para análisis farmacocinéticos a los 5 minutos y a las
4, 22, 46 y 70 horas después de la inyección en bolo. Las ratas
fueron anestesiadas ligeramente con isoflurano. La sangre se recogió
en tubos de recogida de sangre heparinizados (0,6 ml de capacidad)
de una vena lateral de la cola usando un instrumento de infusión de
mariposa de calibre 23. Las muestras de sangre se centrifugaron
durante 4 minutos (graduación 10) en una microcentrífuga. El plasma
se retiró, se puso en viales etiquetados y se almacenó a -20ºC en un
congelador.
Setenta y dos horas después de la MCAO, las
ratas fueron anestesiadas profundamente mediante inhalación de
CO_{2} y se obtuvo tanta sangre como fuera posible mediante
punción cardíaca. La sangre se puso en tubos de recogida de sangre
heparinizados (6 ml de capacidad). El plasma se separó de la sangre
mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos (Allegra
R_{6}). El plasma se recogió, se puso en tubos de plástico
etiquetados y se almacenó a -20ºC en un congelador.
El análisis estadístico para el tamaño del
infarto, la glucosa en plasma, la temperatura corporal y el peso
corporal entre los grupos de vehículo y tratamiento se realizó
mediante prueba t de Student de dos colas. El análisis estadístico
de la puntuación neurológica se realizó mediante análisis no
paramétrico. Los datos se presentan como media \pm MEE.
El tratamiento con un compuesto de fórmula I,
administrado 6 horas después de la MCAO, era muy eficaz para reducir
el volumen de infarto en este modelo de apoplejía local transitoria
(Figura 1). Las ratas del grupo tratado con compuesto (88 \pm 21
mm^{3}) tenían una reducción de 79% altamente significativa en el
volumen de infarto total en comparación con el control de vehículo
(418 \pm 31 mm^{3}, p<0,0001). El daño isquémico cortical en
el grupo tratado con compuesto (32 \pm 20 mm^{3}) también estaba
significativamente reducido en 88% en comparación con el control de
vehículo (272 \pm 22 mm^{3}, p<0,0001). El tratamiento con un
compuesto de fórmula I (55 \pm 12 mm^{3}) podía reducir
significativamente el daño isquémico al cuerpo estriado en 62% en
comparación con el control de vehículo (146 \pm 13 mm^{3},
p<0,0001). Finalmente, el tratamiento con un compuesto de fórmula
I (21 \pm 10 mm^{3}) reducía la cantidad de formación de edema
en 79% en comparación con el grupo de control de vehículo (97 \pm
10 mm^{3}, p<0,0001).
Las ratas tratadas con un compuesto de fórmula I
demostraban una mejora notable en la función neurológica a lo largo
del transcurso de tiempo del experimento (Figura 2). Tan pronto como
18 horas después de la iniciación de la dosificación, se observaba
una mejora significativa en la función neurológica en el grupo
tratado con compuesto en comparación con el grupo de control de
vehículo (1,3 \pm 0,3 frente a 2 \pm 0 unidades,
respectivamente, p<0,0001). La puntuación neurológica de las
ratas tratadas con compuesto continuaba mejorando, de modo que a las
72 horas después de la MCAO, estas ratas eran capaces de actuar con
poco déficit o sin déficit notable. En contraste, las ratas tratadas
con vehículo no mostraban mejora en la función neurológica a lo
largo del transcurso del tiempo del experimento.
Los compuestos de la presente invención se
ensayaron con respecto a la actividad antidepresiva en ratas
mediante métodos substancialmente similares a los descritos por
Porsolt, R.D., y otros, 1977; 229: 327-336:
Bourin M. Fundam Clin Pharmacol 1990; 4:
49-64.
Las ratas se pusieron dentro de un cilindro
transparente lleno de agua. La duración de la inmovilidad (= tiempo
de inmovilidad), definida como el tiempo durante el cual la rata
solo hace los movimientos corporales mínimos para mantener su cabeza
sobre el agua, se registra manualmente. En una segunda experiencia,
el día 4 las ratas se ponen de nuevo en el cilindro, esta vez
durante 5 minutos. El tiempo de inmovilidad se registra manualmente
a lo largo de toda la experiencia.
Experiencia I (experiencia inicial):
El día 1, ratas Wistar (raza RA239;
160-180 g) macho se pusieron durante 15 minutos
dentro de un cilindro. La duración de la inmovilidad (= tiempo de
inmovilidad), definida como el tiempo durante el cual la rata hacía
solo los movimientos corporales mínimos para mantener su cabeza
sobre el agua, se registra manualmente. Para probar un número
razonable de animales en un día, los registros se restringen a los
siguientes tres subperíodos dentro de los 15 minutos. Experiencia:
0-2,5 min (es decir, al comienzo de la experiencia),
6,25-8,75 minutos (exactamente en medio de la
experiencia) y 12,5-15 minutos (totalmente al final
de la experiencia). Se ha encontrado previamente que este
procedimiento representa la "conducta" del animal que se
presenta a lo largo de toda la experiencia.
Experiencia II (segunda experiencia):
El día 4 la ratas se ponen de nuevo dentro del
cilindro, esta vez durante 5 minutos. El tiempo de inmovilidad se
registra manualmente a lo largo de toda la experiencia.
Los tratamientos con compuestos se suspendieron
en metilcelulosa (Methocel) al 0,5% y se administraron oralmente (5
ml/kg). Las administraciones de fármaco son por la tarde (alrededor
de las 16:00) del día 1 (el día de la experiencia I), por la mañana
(alrededor de las 08:00) y por la tarde de los días 2 y 3
exactamente 1 hora antes de la experiencia II (el día 4). Los
tratamientos para las dos ratas dentro de una díada eran similares o
diferentes, dependiendo de la aleatorización para la conducta en la
experiencia I. Los grupos de ratas tratadas con Methocel o 15 mg/kg
por vía oral de Despiramine (DMI) sirven como grupo de control y
patrón positivo, respectivamente.
Se encontró que los compuestos de la presente
invención mostraban actividad antidepresiva en el modelo
anterior.
El resultado de la conmutación sensoriomotriz
relacionada con interrupciones en la atención y la cognición es
común entre pacientes esquizofrénicos. La inhibición prepulsatoria
de la alarma (PPI) está deteriorada en pacientes esquizofrénicos. La
inhibición prepulsatoria se produce cuando un sonido débil
precedente a un estímulo acústico fuerte inhibe el reflejo de
alarma. La PPI se considera una prueba con buena validez predictiva,
nominal y constructiva para la esquizofrenia.
Un control positivo, la clozapina, es un fármaco
antipiscótico atípico disponible comercialmente (Clozaril®). La
clozapina tiene una alta afinidad para receptores de dopamina D5 y
5-HT2 y potencia eficazmente la respuesta de PPI en
modelos animales.
El ensayo de PPI se realizó, de la siguiente
manera, mediante métodos substancialmente similares al descrito por
Spooren y otros. Anxiolytic-like effects of the
prototypical metabotropic glutamate receptor 5 antagonist
2-methyl-6-(phenylethynyl) pyridine
in rodents. J Pharmacol Exp Ther. 295:
1267-1275 (2000).
C57BL/6 (20-30 g) macho se
alojaron en grupos de cuatro en jaulas de Macrolon (42 x 26 x 15 cm)
durante al menos 3 días antes de la experiencia. La instalación de
alojamiento estaba controlada en temperatura y humedad y equipada
con iluminación artificial (luces encendidas de 6:00 AM a 6:00 PM).
Los animales tenían acceso a agua y alimento a voluntad. Todos los
animales eran experimentalmente ingenuos.
Los animales del procedimiento se pretrataron
con compuesto de prueba (30, 60, 100 mg/kg), clozapina (30 mg/kg),
un control positivo o vehículo (metilcelulosa al 0,5%). Después de
45 minutos, los ratones se pusieron individualmente en la cámara de
alerta con un ruido blanco uniforme de 70 dB, y se dejaron sin
alterar durante 10 minutos. A continuación, había una sesión de 15
minutos que consistía en 56 experiencias. El estímulo de alerta es
un sonido de ruido blanco de 120 dB de 40 ms, los preimpulsos son
sonido de ruido blanco de 20 ms de 72, 74 y 78 dB precedente a la
alerta en 100 ms.
Se dieron ocho tipos de experiencias: preimpulso
más alerta (7 experiencias por intensidad de preimpulso), preimpulso
solo (7 experiencias por intensidad de preimpulso), alerta sola (7
experiencia estímulo (7 experiencias). El intervalo variable entre
experiencias tiene de promedio 15 ms (entre 10 y 20 ms). En las
experiencias sin estimulación, se tomaron medidas de la línea de
base. En las pruebas con alerta sola, se midió la amplitud de alerta
auditiva básica (g) y en las pruebas de preimpulso más alerta, se
midió la cantidad de inhibición de la alerta normal y se expresó
como porcentaje de la alerta básica. En las experiencias de
preimpulso solo, la respuesta normal a un ruido débil se midió como
un control. La inhibición prepulsatoria se computó de acuerdo con la
fórmula %PPI = 100-100 x [(PA2 PPP)/PA2]. Se
encontró que los compuestos de la presente invención potenciaban la
PPI de reflejo de alerta acústica en ratones.
El ensayo ansiolítico se realizó, de la
siguiente manera, mediante métodos substancialmente similares al
descrito por Spooren y otros. Anxiolytic-like
effects of the prototypical metabotropic glutamate receptor 5
antagonist
2-metil-6-(feniletinil)piridina
in rodents. J Pharmacol Exp Ther. 295:
1267-1275 (2000) y Lecci A, Borsini F, Volterra G y
Meli A, Pharmacological validation of a novel animal model of
anticipatory anxiety in mice. Psychopharmacology 101:
255-261 (1990).
El procedimiento de prueba para la hipertermia
inducida por estrés (SHI) se adoptó con una modificación pequeña de
la descripción original de Lecci y otros (1990). La temperatura
rectal se midió hasta los 0,1ºC más cercanos mediante un termómetro
(ELLAB instruments, Copenhague, Dinamarca) a través de una sonda
termistora lubricada (2 mm de diámetro) insertada 20 mm en el recto
mientras el ratón se mantenía a mano cerca de la base de la cola. La
sonda se dejó en el lugar hasta que es obtenían lecturas estables
(en menos de 15 s).
Quince animales se alojaron por jaula de
Macrolon (42 x 26 x 15 cm). Al menos 24 horas antes del experimento
los animales de una jaula se marcaron sobre su pelo con color para
una identificación posterior. Sesenta minutos antes de tomar la
temperatura rectal todos los individuos dentro de una jaula dada se
trataron consecutivamente a intervalos de 1 minuto con compuesto de
prueba (dosis:1,3, 10 ó 30 mg/kg, por vía oral; volumen de
inyección: 10 ml/kg), clordiazepóxido-HCl (10
mg/kg, por vía oral; Research Biochemicals Interational), es decir,
los controles positivos, o vehículo (metilcelulosa al 0,5%; Animed).
Exactamente 30 minutos después de que los ratones se retiraran
consecutivamente de la jaula (de nuevo a intervalos de 1 minuto) la
temperatura rectal se determinó y se anotó. Una vez que la
temperatura se hubo registrado, los animales se pusieron en una
jaula diferente (adyacente). La variable dependiente, es decir la
hipertermia inducida por estrés, se definió como la delta de la
temperatura rectal mediana dentro de los seis ratones retirados
inicialmente y la temperatura rectal mediana dentro de los seis
ratones retirados finalmente dentro de una jaula. Esta delta se
calculó para de seis a ocho jaulas dependiendo del grupo de
tratamiento específico, mientras que en la representación final se
usó la media de estos seis a ocho valores. La temperatura rectal del
primer animal se usó, además, para evaluar el efecto potencial del
compuesto sobre la temperatura corporal basal, de por sí.
Se usaron ratas Sprague-Dawley
macho adultas (= ratas "residentes"; 350-400 g)
y ratas de Lister Hooded jóvenes (= ratas "intrusas";
100-120 g). Las ratas intrusas se alojaron por pares
y las ratas residentes se alojaron individualmente en jaulas de
Macrolon (42 x 26 x 15 cm) durante 2 semanas antes de la prueba.
Todos los animales se alojaron en la misma habitación. La
instalación de alojamiento estaba controlada en temperatura y
humedad y equipada con iluminación artificial (luces encendidas de
6:00 AM a 6:00 PM). Los animales tenían acceso a agua y alimento a
voluntad. Todas las ratas eran experimentalmente ingenuas.
Los animales recibían compuesto de prueba
(dosis: 0,3, 3, 10 ó 30 mg/kg), clordiazepóxido-HCl
(5 mg/kg, por vía oral; CDZ, Research Biochemicals International,
Natick, MA), LiCl (10, 30 mg/kg) como los compuestos de
referencia/positivos, o vehículo (metilcelulosa al 0,5%). El volumen
de inyección era 2 ml/kg. El tratamiento oral se administró a la
rata intrusa solamente y la prueba se realizó 1 hora después de la
administración del compuesto. Todas las observaciones se realizaron
durante la fase de luz (de 8:00 AM a 1:00 PM) en la jaula de
alojamiento de la rata residente (véase anteriormente). El suelo de
jaula se cubrió con serrín. Pares que consistían en una rata intrusa
y una rata residente se asignaron aleatoriamente a uno de los grupos
experimentales o de control. La duración de comportamientos de
aproximación activa (= tiempo empleado en la actividad social) de la
rata intrusa (inhalación, exploración anogenital, olfateo,
acicalamiento, lamedura, juego) hacia la residente se puntuó
manualmente y se registró acumulativamente a lo largo de un período
de 5 minutos.
Ratas Sprague-Dawley adultas
macho (180-220 g) se alojaron en grupos de cuatro en
jaulas de Macrolon (42 x 26 x 15 cm) durante al menos 3 días antes
del experimento. La instalación de alojamiento estaba controlada en
temperatura y humedad y equipada con iluminación artificial (luces
encendidas de 6:00 AM a 6:00 PM). Los animales tenían acceso a agua
y alimento a voluntad. Todos los animales eran experimentalmente
ingenuos.
El laberinto en forma de signo más elevado
consiste en dos brazos abiertos (40 x 12 cm) y dos brazos cerrados
(40 x 12 x 20 cm) que se extienden todos desde una plataforma
central común (12 x 12 cm). La configuración forma la figura de un
signo más, con brazos similares dispuestos opuestos entre sí, y el
aparato se eleva 60 cm por encima del suelo sobre un pedestal
central. El laberinto está hecho de Plexiglas gris. El agarre en los
brazos abiertos está facilitado por la inclusión de un pequeño borde
elevado (0,25 cm) alrededor de su perímetro.
El método se realizó de la siguiente manera,
mediante métodos substancialmente similares a los descritos por
Handley, S.L. y Mithani, S, Effects of
alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a
maze exploration model of "fear"-motivated behaviour.
Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 327:
1-5 (1984). Las ratas fueron asignadas
aleatoriamente a uno de los diversos tratamientos. Los animales se
transportaron desde la sala de alojamiento al laboratorio al menos 1
hora antes de la prueba. Después de la administración oral de
compuesto, las ratas se alojaron individualmente en jaulas de
Macrolon (22 x 16 x 14 cm) y después de 60 minutos se pusieron sobre
la plataforma central de cara a un brazo cerrado. Se realizó una
experiencia de 8 minutos y el laberinto se limpió a fondo entre
sujetos. Los registros directos se realizaron mediante un observador
sentado cerca del laberinto y se usaron los siguientes parámetros
convencionales: número de entradas en los brazos abiertos y cerrados
(una entrada en un brazo se define como las cuatro patas que entran
en un brazo) y tiempo transcurrido en los brazos abiertos
(excluyendo la plataforma central). Los animales de los diferentes
grupos de tratamiento se probaron alternativamente y las
experiencias se realizaron entre las 8:30 AM y las 12:30 PM, es
decir, dentro de la primera mitad de la fase de luz. Se registraron
los siguientes parámetros que reflejan ansiedad: relación de tiempo
(abierto/total) empleado sobre brazos abiertos, latencia para dejar
el primer brazo y número total de entradas en los brazos.
Los compuestos de la presente invención muestran
un efecto similar a un ansiolítico en los modelos animales
anteriores.
El siguiente ensayo se realiza mediante métodos
substancialmente similares al descrito por
Kienlen-Campard y otros, J Biol Chem 277:15666
(2002). Se prepararon cultivos primarios de neuronas hipocampales a
partir de embriones de rata E18 (Park y otros, J Neurochem, 74:114,
2000). Las células se cultivan en placa en cápsulas de cultivo de 6
a 96 pocillos (4 x 10^{5} células/cm^{2}) o cubreobjetos de
vidrio (1,25 x 10^{5} células/cm^{2}) pretratados con
poli(D-lisina) y cultivados durante 6 días
in vitro en medio NEUROBASAL™ complementado con
B-27 al 2% y L-glutamina 0,5 mM
antes de la infección con adenovirus recombinantes. Bajo estas
condiciones, los cultivos neuronales (hasta 98% de neuronas)
presentan altos grados de diferenciación y supervivencia.
Adenovirus Recombinante e Infección Neuronal -
Se realizan la producción, propagación y purificación de adenovirus
que codifican forma mutante de APP695. Después de 6 días in
vitro, los cultivos neuronales se infectan con una multiplicidad
de infección de 100 durante 4 horas en un volumen mínimo de medio de
cultivo. El medio de infección se repone a continuación mediante
medio de cultivo reciente durante 3-5 días. Bajo
estas condiciones, al menos 75% de las neuronas expresan las
proteínas codificadas por retrovirus recombinante.
Supervivencia Celular - La supervivencia
neuronal se mide mediante el ensayo de MTT colorimétrico o ensayo de
viabilidad de células fluorescentes CellTracker usando un sistema de
formación de imagen automatizado Cellomics. Para la tinción nuclear,
las células se fijan (formaldehído al 0,37%/glutaraldehído al 0,2%
en solución salina tamponada con fosfato) y se incuban durante 30
minutos en el colorante Hoechst 33342 (1 \mug/ml).
Cuantificación de la producción de Abeta - El
medio de cultivo se recoge, se trata con inhibidores de proteasa (1
\mug/ml de pepstatina, 10 \mug/ml de leupeptina, fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1 mM) y se clarifica mediante centrifugación
(16.000 x g, 5 min, 4ºC). Se usan 100 \mul del sobrenadante para
la cuantificación de amiloide beta usando el método de ELISA
descrito posteriormente.
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la
presencia de placas extracelulares y nudos neurofibrilares
intercelulares en el cerebro. El componente proteínico principal de
estas placas es el péptido amiloide beta ("A\beta") que se
segmenta de la proteína precursora de amiloide ("APP").
Una línea celular estable capaz de secreción de
A\beta se construyó en células de neuroglioma H4 humanas mediante
transducción con un vector retroviral que expresa tanto APP695 que
contiene las mutaciones Swedish (K595N, M596L) como YFP como un
marcador de selección. Tansductantes estables que expresan APP695 se
seleccionaron clasificando células que expresan altos niveles de
YFP.
Las células se cultivaron en placas a 80.000
células por ml en un placa de 96 pocillos en medio de Eagle
modificado de Dulbecco (Invitrogen, Nº de catálogo
11965-092) complementado con suero bovino fetal
(FBS) al 10% y penicilina/estreptomicina. Después de 24 horas, los
medios se reemplazaron por medio reciente que contenía el compuesto
de interés, donde las concentraciones de compuesto que variaban de
20 \muM a 10 nM se probaron en valoraciones de 7 puntos por
duplicado. Después de la incubación con compuesto de prueba durante
18-24 horas a 37ºC, la concentración de hA\beta
(1-40) en el sobrenadante se determinó usando el
ELISA para hA\beta40.
Se usó Biosource International, Inc. Signal
Select™ Human \beta Amyloid (hA\beta40) ELISA (Nº de catálogo
KHB3482) par la determinación cuantitativa in vitro de
hA\beta40 en el sobrenadante de cultivo de muestras. Un anticuerpo
monoclonal específico para el extremo NH_{2} de hA\beta se
revistió sobre los pocillos de las placas de microvaloración. Las
muestras, incluyendo patrones de contenido de hA\beta conocido, se
pipetearon en estos pocillos, seguido por la adición de un
anticuerpo de conejo específico para la secuencia
1-40 de hA\beta. Se detectó a continuación
anticuerpo de conejo unido mediante el uso de un
anti-anticuerpo de conejo etiquetado con peroxidasa
de rábano picante. Despés de la retirada de
anti-anticuerpo de conejo en exceso, se añadió una
solución de substrato, que se segmentó mediante la enzima unida para
producir color. La intensidad de este producto coloreado es
directamente proporcional a la concentración de hA\beta
(1-40) presente en la muestra.
Muestras y patrones que contienen una
concentración conocida de péptido hA\beta (1-40)
se diluyeron en diluyente de patrón/muestra (reactivo de Biosource).
Los inhibidores de proteasa AEBSF, aprotinina, bestatina,
E-64, leupeptina y pepstatina A (Calbiochem,
Protease Inhibitor Cocktail Set III, Nº de catálogo 539134) se
añadieron a todas las muestras para evitar la proteolisis de los
péptidos A\beta. 100 \mul de muestras y patrones se añadieron a
pocillos de las placas de ELISA de 96 pocillos y se incubaron
durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC. Los
pocillos se lavaron cuatro veces con 100 \mul de tampón de lavado
(Biosource Reagent) y a continuación se añadieron 100 \mul de
anticuerpo de detección y las placas se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente. El anticuerpo de detección reconoce la
secuencia de hA\beta (1-40).
Los pocillos se lavaron 4 veces con 100 \mul
de tampón de lavado y a continuación se añadieron 100 \mul de
anti-anticuerpo secundario de conejo etiquetado con
peroxidasa de rábano picante (HRP). Las placas se incubaron durante
2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron a
continuación 5 veces con 100 \mul de tampón de lavado y a
continuación se añadieron 100 \mul de cromógeno estabilizado. Las
placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad. El cromógeno estabilizado es una solución de substrato
que cuando se segmentaba mediante HRP unida se volvía azul y por lo
tanto puede verificarse en un lector de placas de microvaloración
estándar. Se añadieron a continuación 100 \mul de solución de
parada y la intensidad del color en los pocillos se midió a 450 nm
usando un lector de placas SpectraMAX 340 de Molecular Devices.
Típicamente, los compuestos se analizaron en una respuesta a la
dosis de 7 puntos realizada por duplicado con una concentración de
compuesto que varía de 20 \muM a 10 nM. Las concentraciones de
A\beta (1-40) en las muestras se calcularon a
partir de curvas estándar generadas de patrones que contenían una
concentración conocida de péptido A\beta.
Los compuestos de la presente invención se
probaron a lo largo de un período de 3 días. Cada día, la
gamma-secretasa de Calbiochem "Inhibidor X" se
incluía como un control. Este es un isóstero dipeptídico de
hidroxietileno permeable para las células con una IC50 presentada de
50 nM (Nº de catálogo 565771).
Ratones transgénicos que sobreexpresan la
isoforma de 659 aminoácidos de proteína precursora de
beta-amiloide (Abeta) de Alzheimer humano que
contiene una mutación Lys670 --> Asn, Met671 --> Leu (los
ratones Tg2576 están disponibles comercialmente de Taconic, N.Y.)
tenían aprendizaje y memoria normales en la referencia espacial y
tareas de alternación a los tres meses de edad pero mostraban un
deterioro en de 9 a 10 meses de edad. Un incremento de 5 veces en
Abeta (1-40) y un incremento de 14 veces en Abeta
(1-42/43) acompañaba a la aparición de estos
déficits de comportamiento. Numerosas placas de Abeta que se teñían
con colorante rojo Congo están presentes en estructuras corticales y
límbicas de ratones con cantidades elevadas de Abeta. La aparición
correlativa de anormalidades de comportamiento, bioquímicas y
patológicas reminiscentes de la enfermedad de Alzheimer en estos
ratones transgénicos sugiere nuevas oportunidades para explorar la
patofisiología y la neurobiología de esta enfermedad. Véase
Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in
transgenic mice. Science 4 de octubre de 1996;
274(5284):99-102.
Aunque los ratones Tg2576 se especifican en los
modelos descritos aquí, debe entenderse que otros ratones
transgénicos, disponibles tanto comercialmente como privadamente,
son propensos a ser usados en dichos modelos.
The Relationship between Ab and Memory in the
Tg2576 Mouse Model of Alzheimer's Disease. The Journal of
Neuroscience, 1 de marzo de 2002, 22(5):
1858-1867.
Hemicerebros congelados se extraen
secuencialmente en una extracción en dos etapas [sonicación en (1)
SDS al 2% y (2) ácido fórmico (FA) al 70%]. La última fracción se
denomina Abnsol. Después de la sonicación las muestras se
centrifugan a 100.000 x g durante 1 hora a 4ºC. El sobrenadante se
retira y el nódulo se somete a sonicación con la siguiente solución.
Extractos de cerebro se miden mediante ELISA tipo sándwich según se
especifica previamente (Suzuki y otros, 1994; Gravina y otros,
1995). Se usan los siguientes sistemas: (1) captura con
BAN-50 y detección con BA-27 o
BC-05 o (2) captura con 3160 y detección con
BA-27 o BC-05, ambos de los cuales
detectan A\beta 1-40 y A\beta
1-42, respectivamente. La comparación directa de
muchos cerebros de Tg2576 de ratones de todas las edades mostraba
que las cantidades de A\beta40 y A\beta42 detectadas con ELISAs
de captura con 3160 son esencialmente las mismas que cuando se usa
BAN-50 para la captura. Los extractos de SDS al 10%
se diluyen al menos 1:40 de modo que el ensayo podía realizarse en
SDS al 0,05%. Diluciones mayores se corrigen para SDS de modo que
también se ensayan en SDS al 0,5%. El extracto de FA se neutraliza
mediante una dilución 1:20 en tampón de Tris-fosfato
1M, pH 8,0. El programa Softmax se usa para calcular fentomoles por
mililitro comparando la absorbancia de la muestra con la absorbancia
de concentraciones conocidas de A\beta1-40 y
A\beta1-42 sintéticos en solución idéntica como
las muestras, y estos valores se corrigen con el peso en húmedo del
homogenado original que ha de expresarse finalmente como picomoles
por gramo de peso en húmedo. En todos los casos, los tejidos no
transgénicos se procesan de forma idéntica en paralelo con los
tejidos transgénicos.
El laberinto de agua se adapta a ratones Tg2576
en los antecedentes de la raza B6/SJL de una manera que permitía
detectar y distinguir todas las fases de la pérdida de memoria. Este
protocolo proporcionaba la sensibilidad, la especificidad y el
intervalo dinámico necesarios para medir cambios que son sutiles en
las primeras fases de la vida y notables en las últimas fases de la
vida. La interpolación de sondas durante el entrenamiento
proporcionaba sensibilidad. La adopción de criterios de inclusión
para déficits de conducta daba especificidad. El entrenamiento daba
extensivamente el intervalo dinámico. La asignación de puntuaciones
de sondeo medias (MPSs), que es el porcentaje de tiempo medio
empleado por un ratón en el cuadrante de la diana durante las
experiencias de tres sondas, mejoraba la cuantificación del
comportamiento cognitivo de ratones individuales para correlaciones
con marcadores moleculares y proporcionaba una sola medida con un
amplio intervalo dinámico. Los procedimientos para ratones Tg2576 en
otros antecedentes de raza pueden necesitar ajustarse para
diferencias específicas para la raza en los grados de déficits de
aprendizaje y conducta. Véase The Relationship between Ab and Memory
in the Tg2576 Mouse Model of Alzheimer's Disease. The Journal of
Neuroscience, 1 de marzo de 2002,
22(5):1858-1867.
El laberinto de agua es un estanque circular de
1 ó 1,2 m lleno de agua a 25-27ºC y hecho opaco
mediante la adición de pintura blanca atóxica. El estanque se pone
en medio de entradas espaciales fijas que consisten en cortinas
vistosamente decoradas y estanterías que contienen distintos
objetos. Los ratones se ponen en un vaso de precipitados y
suavemente se introducen en el agua de cara a la pared del estanque.
Los ratones experimentan en primer lugar el entrenamiento de la
plataforma visible durante 3 días consecutivos (ocho experiencias al
día), nadando hasta una plataforma elevada (una superficie cuadrada
de 12 x 12 cm^{2}) marcada con una meta de rallas blancas y
negras. Los días de la plataforma visible se dividen en dos bloques
de entrenamiento de cuatro experiencias para análisis estadísticos.
Durante el entrenamiento de la plataforma visible, tanto la
localización de la plataforma (NE, SE, SW o NW) como la posición de
inicio (N, NE, E, SE, S, SW, W o NW, excluyendo las posiciones
inmediatamente adyacentes a la plataforma) se varían
pseudoaleatoriamente en cada experiencia. La pseudoaleatorización
aseguraba que todas las posiciones se muestrearan antes de que se
repitiera una posición dada. El entrenamiento de plataforma oculta
se efectúa a lo largo de 9 días consecutivos (cuatro experiencias al
día), en donde se deja que los ratones alcancen una plataforma
sumergida 1,5 cm por debajo de la superficie del agua. Los ratones
que no alcanzan la plataforma en 60 segundos se llevan a la
plataforma con una paleta de salvamento metálica. Durante las
experiencias en plataforma oculta, la localización de la plataforma
permanecía constante (NE, SE, SW o NW) y los ratones entraban en el
estanque en una de las siete posiciones seleccionadas
pseudoaleatoriamente (N, NE, E, SE, S, SW, W o NW, excluyendo la
posición inmediatamente adyacente a la plataforma). Después de cada
experiencia con plataforma oculta, los ratones permanecían sobre la
plataforma durante 30 segundos y se retiran de la plataforma y se
devuelven a su jaula de alojamiento con la paleta de salvamento. Los
ratones aprendían rápidamente a asociar la paleta con escaparse del
estanque y por consiguiente se orientaban hacia o seguían la
aparición de la paleta. La capacidad de los ratones para orientarse
hacia o seguir la paleta de salvamento representaba medidas
independientes de visión y atención. Al principio del día 4º, 7º y
10º del entrenamiento con plataforma oculta, se efectuó una
experiencia de sondeo en la que la plataforma se retira del estanque
y se deja que los ratones busquen la plataforma durante 60
segundos. Todas las experiencias se verificaron mediante una cámara
montada directamente por encima del estanque y se registran y
analizan usando un sistema de seguimiento computarizado.
La MPS se calcula para cada ratón y se usa para
determinar la retención de la información espacial en el laberinto
de agua de Morris. Integrando la información a partir de los sondeos
intercalados, la MPS representa una medida de aprendizaje similar en
concepto al índice de aprendizaje descrito previamente (Gallagher y
otros, 1993), que muestrea la memoria en diferentes estadios de
aprendizaje. Resultados estadísticos similares se encuentran con
MPS, el índice de aprendizaje y la puntuación de aprendizaje (la
suma ponderada del porcentaje de tiempo empleado en el cuadrante
diana durante experiencias de sondeo) y se eligió representar los
presentes datos usando MPS debido a la facilidad de
representación.
Después de la prueba, un subconjunto de cada
grupo de ratones es sometido a eutanasia y el hemicerebro derecho se
congela en nitrógeno líquido para medidas de A\beta. Todos los
cerebros se analizaron de una manera codificada.
Véase Transgenic mice expressing the
betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety,
and motor coordination. Brain Res, 4 de julio de 2003;
977(1):38-45.
La alternación espontánea se prueba en un
laberinto en forma de T hecho de compuesto acrílico blanco. El
laberinto consistía en un tronco central (longitud: 30 cm)
flanqueado en cada lado por dos brazos (longitud: 30 cm). La anchura
del laberinto es 9 cm y cada pared tiene 20 cm de altura. En la
experiencia inicial, los ratones se pusieron en el tronco del
laberinto en forma de T con el brazo derecho bloqueado por una
barrera de plástico (elección forzada). Después de entrar en el
brazo disponible, los ratones se mantienen en él durante 60 segundos
cerrando la barrera detrás de ellos. Los ratones se retienen a
continuación y después de retirar la barrera se ponen inmediatamente
de nuevo en el tronco para una experiencia de elección libre, en la
que los ratones podían explorar el brazo opuesto o el mismo
(criterio de las cuatro patas). En los 9 días siguientes, se repite
el mismo procedimiento de dos experiencias, excepto que el brazo
bloqueado en la primera experiencia se cambia de la derecha los días
impares a la izquierda los días pares. El número de alternaciones y
las latencias antes de responder durante la experiencia de elección
se mide, con un período de corte de 1 minuto por experiencia. Si los
ratones no habían respondido en 1 minuto y están lejos del punto de
elección, se empujan brevemente desde detrás, habitualmente no más
de una vez, de modo que pudiera registrarse una respuesta en cada
experiencia.
La actividad motriz se mide en la zona abierta,
hecha de material acrílico blanco con una superficie de 50 x 50 cm y
paredes de 38 cm de alto. La actividad en las zonas central y
periférica se registra mediante una cámara de video elevada y se
analiza. La zona central tiene conformación cuadrada y empieza a una
distancia de 25 cm desde cada pared. Los ratones se ponen en una
esquina de la zona abierta durante tres sesiones de 5 minutos al
día. Se miden la distancia recorrida y el tiempo transcurrido en
reposo (<2 cm/s), moviéndose lentamente (2-5
cm/s) o moviéndose rápidamente (>5 cm/s), en cada zona, así como
el tiempo transcurrido en la periferia y el centro del aparato.
El laberinto en forma de signo más elevado
consistía en cuatro brazos (longitud: 70 cm, anchura: 10 cm; altura
desde el suelo: 40 cm) en una forma de cruz y una región central (10
cm^{2}). Dos de los brazos están encerrados en tres lados por
paredes (altura: 10 cm) mientras que los otros dos están abiertos,
excepto por un reborde mínimo (altura: 0,5 cm) usado para minimizar
las caídas. Los dos brazos encerrados o abiertos están frente a
frente entre sí. Los ratones se ponen en la región central y el
número de entradas y duraciones en brazos cerrados y abiertos se
miden durante dos sesiones diarias de 5 minutos con el mismo equipo
de seguimiento de video usado en la prueba anterior. Las entradas en
los brazos abiertos/totales y las relaciones de duración se calculan
a continuación. En las raras ocasiones en las que los ratones caían
de un brazo abierto, el tiempo registrado se detiene y los ratones
se ponían de nuevo en la posición exacta de la que caían. Después de
cada sesión de alternación espontánea, zona abierta y prueba en
laberinto en forma de signo más, el aparato se limpia frotando con
un paño húmedo y se seca antes del inicio de la siguiente
experiencia para reducir los posibles efectos de entradas debidas al
olor.
La viga estacionaria se construye de plástico,
con un diámetro de 2,5 cm y una longitud de 110 cm. La viga se cubre
mediante una capa de cinta de protección blanca para asegurar un
agarre firme y se divide en 11 segmentos mediante trazos lineales.
La viga se pone a una altura de 45 cm de un suelo cubierto de
estera, que servía para amortiguar las caídas y de ese modo prevenir
lesiones en los ratones. Una pared de cartulina se inserta en el
extremo de la viga para evitar que los ratones escapen. Una
experiencia comenzaba poniendo los ratones en el segmento medio. El
número de segmentos cruzados (criterio de las cuatro patas), las
latencias antes de la caída y el número de caídas se miden en una
sola sesión de cuatro experiencias. El período de corte es 1 minuto
por experiencia y el intervalo entre experiencias 15 minutos.
Se construye el Rotorod (Modelo 7650, Stoelting,
Wood Dale, IL, EE.UU. de A.) acelerador de plástico estriado
(diámetro: 3 cm). La viga se pone a una altura de 13,5 cm del nivel
del suelo y se separa en cinco secciones (anchura: 5,5 cm) mediante
una barrera de plástico. Dando la espalda al experimentador, los
ratones se ponen sobre la parte superior del rodillo que ya da
vueltas (4 rpm) en la orientación opuesta a su movimiento, de modo
que las caídas podían evitarse mediante locomoción hacia delante. El
Rotorod se aceleraba gradualmente y uniformemente desde 4 a 40 rpm
durante cada experiencia de 5 minutos. Las latencias antes de la
caída se miden para tres sesiones diarias de cuatro experiencias,
con un intervalo entre experiencias de 15 minutos. Siempre que los
ratones se aferren al rodillo sin moverse (rotación pasiva) durante
dos revoluciones completas sucesivas, se considera que han caído.
Puesto que ningún ratón parecía saltar deliberadamente, podía
obtenerse una estimación válida de la habilidad motriz. Después del
entrenamiento, se evalúa la presencia de diversos reflejos normales
y patológicos.
Véase Accelerated plaque accumulation,
associative learning deficits, and upregulation of alpha 7 nicotinic
receptor protein in transgenic mice co-expressing
mutant human presenilin 1 and amyloid precursor proteins. J Biol
Chem. 21 de junio de 2002;
277(25):22768-80.
Los ratones se someten a perfusión cardíaca con
solución salina taponada con fosfato (NaHPO_{4} 10 mM, NaCl 150
mM, pH 7,2) y se fijan con paraformaldehído al 4%. Secciones
cerebrales congeladas se seccionan coronalmente con un grosor de 12
\mum usando un criostato, montado sobre portaobjetos de
microscopio ProbeOn Plus (Fisher Scientific) y se seca al aire.
Inmediatamente antes de teñir, las secciones cerebrales se fijan con
acetona. Las secciones de tejido se incuban durante 30 minutos en
H_{2}O_{2} al 0,3% y suero caprino normal al 0,3%, se lavan en
solución salina tamponada con fosfato y se incuban con suero caprino
normal al 1,5% en solución salina tamponada con fosfato durante 30
minutos. Las secciones de cerebro se incuban a continuación con
anti-anticuerpo A\beta 6E10 (1:1000, Senetik)
teñido con anti-IgG de ratón biotinilada (1:200,
Vector Laboratories) y se inmunodetectan con Vectastain ABC Reagent
(1:100, Vector Laboratories). Las secciones se contratiñen con
hematoxilina.
Aunque un número de modalidades de esta
invención se describe anteriormente aquí, es evidente que los
ejemplos básicos pueden alterarse para proporcionar otras
modalidades que utilizan los compuestos y los métodos de esta
invención. Por lo tanto, será apreciado que el alcance de esta
invención ha de estar definido por las reivindicaciones adjuntas en
lugar de por las modalidades específicas que se han representado a
modo de ejemplo.
Claims (15)
1. Un compuesto de fórmula I:
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, en
donde:
W es nitrógeno;
R^{1} se selecciona de hidrógeno o flúor;
y
R^{y} es un grupo alifático
C_{1-4}, en donde dicho grupo alifático es una
cadena hidrocarbonada C_{1}-C_{4} de cadena
lineal o ramificada que está completamente saturada o que contiene
una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo
C_{3}-C_{4} monocíclico que está completamente
saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que
no es aromático, que tiene un solo punto de ligazón al resto de la
molécula.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que R^{y} se selecciona de metilo, etilo, ciclopropilo,
terc-butilo o isopropilo, preferiblemente se
selecciona de metilo, ciclopropilo y
terc-butilo.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que R^{1} es hidrógeno o flúor.
4. Un compuesto seleccionado del grupo que
consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
5. Una composición farmacéuticamente aceptable
que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 y un
portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. La composición de acuerdo con la
reivindicación 5, que comprende adicionalmente un agente terapéutico
adicional seleccionado de un tratamiento para la enfermedad de
Alzheimer (AD), un tratamiento para la enfermedad de Parkinson, un
agente para tratar la esclerosis múltiple (MS), un tratamiento para
el asma, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador o
inmunosupresor, un factor neurotrófico, un agente para tratar la
apoplejía, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un
antidepresivo, un agente antipsicótico o un agente para tratar la
diabetes.
7. Un método para inhibir actividad de quinasa
GSK3 en una muestra biológica, que comprende las etapas de poner en
contacto dicha muestra biológica con:
a) una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 5 ó 6; o
b) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
8. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 5 ó 6 o un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, para uso terapéutico, especialmente para el
uso en la inhibición de la actividad de quinasa GSK3 en un
paciente.
9. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 5, para el uso en el tratamiento de una enfermedad
autoinmune, una enfermedad inflamatoria, un trastorno metabólico, un
trastorno psiquiátrico, diabetes, un trastorno angiogénico,
tauopotía, un trastorno neurológico o neurodegenerativo, una lesión
de la médula espinal, glaucoma, calvicie o una enfermedad
cardiovascular.
10. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 9, en la que dicha enfermedad, trastorno o condición
se selecciona de alergia, asma, diabetes, enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, demencia asociada
con el SIDA, esclerosis lateral amiotrófica (ALS, enfermedad de Lou
Gehrig), esclerosis múltiple (MS), una lesión debida a un trauma de
cabeza, esquizofrenia, ansiedad, trastorno bipolar, tauopotía, una
lesión en la médula espinal o los nervios periféricos, infarto de
miocardio, hipertrofia de cardiomiocitos, glaucoma, trastorno de
déficit de atención (ADD), depresión, un trastorno del sueño,
reperfusión/isquemia, apoplejía, un trastorno angiogénico o
calvicie.
11. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que dicha enfermedad, trastorno o condición
es apoplejía.
12. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que dicha enfermedad, trastorno o condición
es enfermedad de Alzheimer.
13. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 9, en la que dicho trastorno es un trastorno
neurológico o neurodegenerativo.
14. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 5 ó 6, para usar en la disminución de la movilidad
del esperma.
15. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 9, para usar con un agente terapéutico adicional
seleccionado de un agente para tratar la enfermedad de Alzheimer
(AD), un agente para tratar la enfermedad de Parkinson, un agente
para tratar la esclerosis múltiple (MS), un agente para tratar el
asma, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador o
inmunosupresor, un factor neurotrófico, un agente para tratar la
apoplejía, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un
antidepresivo, un agente antipsicótico o un agente para tratar la
diabetes.
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