DE60308387T2

DE60308387T2 - Pyrazolenthaltende zusammensetzungen und ihre verwendung als gsk-3 inhibitoren

Info

Publication number: DE60308387T2
Application number: DE60308387T
Authority: DE
Inventors: J. Cornelia Pelham FORSTER; C. Larry Waltham PARK; W. Marion Stow WANNAMAKER; Yung-Mae Newton YAO
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2023-08-01
Also published as: AR040773A1; WO2004013140A1; AU2003257078A1; HK1081186A1; ECSP055640A; JP2010280729A; ATE339419T1; ZA200501124B; JP2006273872A; MXPA05001367A; TW200409774A; PT1532145E; US7872129B2; CN101037438A; JP4733388B2; EP1532145B1; EP1532145A1; AU2003257078B2; BR0313176A; NZ538426A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Inhibitoren von Proteinkinasen, insbesondere Glycogen Synthase Kinase-3 (GSK-3), eine Serin/Threonin Proteinkinase. Die Erfindung sieht auch Zusammensetzungen vor, die die erfindungsgemäßen Inhibitoren enthalten und Verfahren, die solche Verbindungen bei der Behandlung von verschiedenen Störungen wie Diabetes, Alzheimerkrankheit, Huntington's Krankheit, Parkinson's Krankheit, Multiple Sklerose (MS), Schlaganfall, neurologische und neurodegenerative Krankheiten und psychiatrische Erkrankungen verwendet.
Hintergrund der Erfindung
Die Suche nach neuen therapeutischen Wirkstoffen wurde in den letzten Jahren durch ein besseres Verständnis von der Struktur von Enzymen und anderen Biomolekülen, die mit Zielkrankheiten in Verbindung stehen unterstützt. Eine wichtige Klasse von Enzymen, welche Gegenstand ausführlicher Studien waren, sind Proteinkinasen.
Proteinkinasen vermitteln interzellulare Signalweiterleitung. Sie erfüllen dies durch Bewirken einen Phosphoryltransfers von einem Nukleotid-Triphosphat zu einem Proteinakzeptor, der in dem Signalleitungsweg involviert ist. Es gibt eine Anzahl von Kinasen und Wege, durch welche extrazellulare und andere Stimuli eine Vielzahl von zellularen Reaktionen bewirken, die innerhalb der Zelle auftreten. Beispiele solcher Stimuli enthalten Umwelt- und chemische Stresssignale (z.B. osmotischer Schock, Hitzeschock, ultraviolette Strahlung, bakterielles Endotoxin, und H₂O₂), Cytokine (z.B. Interleukin 1 (IL-1) und Tumornecrosefaktor α (TNF-α)), und Wachstumsfaktoren (z.B. Granulozyten Macrophagen-Kolonie-Stimmulierungsfaktor (GM-CSF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)). Ein extrazellulares Stimmulus kann eine oder mehrere Reaktionen hervorrufen, die mit dem Zellwachstum, der Migration, der Differentiation, der Sekretion von Hormonen, der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, der Muskelkontraktion des Glukosemetabolismus, der Kontrolle von Proteinsystemen und der Steuerung des Zellzyklus in Verbindung stehen.
Viele Krankheiten sind mit abnormalen Zellreaktionen verbunden, die durch Proteinkinase vermittelte Vorgänge ausgelöst sind. Diese Krankheiten schließen Autoimmunkrankheiten, Entzündungskrankheiten, Knochenkrankheiten, Stoffwechselkrankheiten, neurologische und neurodegenerative Krankheiten, Krebs, kardiovaskuläre Krankheiten, Allergien und Asthma, Alzheimerkrankheit und hormonbezogenen Krankheiten ein. Dementsprechend war ein wesentlicher Aufwand der medizinischen Chemie Proteinkinaseinhibitoren zu finden, die als therapeutische Wirkstoffe wirksam sind.
Glykogensynthase Kinase-3 (GSK-3) ist eine Serin/Threonin Proteinkinase, die α und β Isoformen beinhalten, die jede durch bestimmte Gene kodiert sind [Coghlan et al., Chemistry & Biology, 7, 793-803 (2000); Kim and Kimmel, Curr. Opinion Genetics Dev., 10, 508-514 (2000)]. GSK-3 wurden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht einschließlich Diabetes, Alzheimerkrankheit, CNS-Krankheiten wie manisch-depressive Krankheiten und neurodegenerative Krankheiten, und Kardiomyocyt-Hypertrophy [siehe, z.B. WO 99/65897; WO 00/38675; Kaytor and Orr, Curr. Opin. Neurobiol., 12, 275-8 (2000); Haq et al., J. Cell Biol., 151, 177-30 (2000); Eldar-Finkelman, Trends Mol. Med., 8, 126-32 (2002)]. Diese Krankheiten sind mit abnormaler Tätigkeit von bestimmten Zellsignalwegen verbunden, in welchen GSK-3 eine Rolle spielt.
Von GSK-3 wurde gefunden, dass es eine Anzahl von regulatorischen Proteinen phosphoryliert und deren Aktivität moduliert. Dies schließt Glycogensynthase ein, welche das Raten-limitierende Enzym ist, das für Glycogensynthese notwendig ist, das Mikrotubulusassoziierte Protein Tau, der Gentranskriptionsfaktor β-Catenin, der Translations-Auslösefaktor e1F-2B, sowie ATP-Citrat-Lyase, Axin, Hitzeschock Faktor-1, c-Jun, c-myc, c-myb, CREB, und CEPBα. Diese verschiedenen Zielstellen deuten darauf hin, dass GSK-3 in vielen Aspekten des zellulären Stoffwechsels, der Proliferation, der Differentiation und der Entwicklung in Verbindung steht.
In einem GSK-3 vermittelten Weg, welcher für die Behandlung von Typ II Diabetes relevant ist, führt Insulin-induziertes Signalgeben zur zellularen Glukoseaufnahme und Glycogensynthese. GSK-3 ist ein negativer Regulator des Insulin-induzierten Signals in diesem Weg. Normalerweise verursacht das Vorhandensein von Insulin die Inhibierung von GSK-3 vermittelter Phosphorilierung und Deaktivierung der Glykogensynthase. Die Inhibierung von GSK-3 führt zum Ansteigen von Glycogensynthese und Glucoseaufnahmen. [Klein et al., PNAS, 93, 8455-9 (1996); Cross et al., Biochem. J., 303, 21-26 (1994); Cohen, Biochem. Soc. Trans., 21, 555-567 (1993); und Massillon et al., Biochem. J. 299, 123-128 (1994); Cohen and Frame, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2, 769-76 (2001)] Wenn jedoch die Insulinreaktion in einem diabetischen Patienten beeinträchtigt ist, scheitert es, Glycogensynthese und Glucoseaufnahme zu steigern, und zwar trotzt der Gegenwart von relativ hohen Insulinspiegeln im Blut. Dies führt zu abnorm hohen Blutspiegeln von Glucose mit akuten und chronischen Wirkungen, die letztlich in kardiovaskulären Krankheiten, wie Nierenversagen und Blindheit enden können. Bei solchen Patienten tritt die normale Insulin-induzierte Inhibierung von GSK-3 nicht auf. Es wurde auch berichtet, dass GSK-3 in Patienten mit Typ II Diabetes überexpremiert wird [WO 00/38675]. Therapeutische Inhibitoren von GSK-3 sind daher zur Behandlung von Diabetes Patienten, die unter beeinträchtigter Insulinreaktion leiden nützlich.
Apoptose wurde mit der Pathophysiologie von ischämischer Gehirnzerstörung in Zusammenhang gebracht (Li et al., 1997; Choi, et al., 1996; Charriaut-Marlangue et al., 1998; Grahm and Chen, 2001; Murphy et al., 1999; Nicotera et al., 1999). Kürzliche Veröffentlichungen geben an, dass die Aktivierung von GSK-3β in apoptotischen Mechanismus involviert sein kann (Kaytor and Orr, 2002; Culbert et al., 2001). Studien in Rattenmodellen von ischämischem Schlag, welches durch eine mittlere zerebralische Aterien-okklusion induziert ist (MCAO) zeigte erhöhte GSK-3β Expression in der folgenden Ischämie (Wang et al., Brain Res, 859, 381-5, 2000; Sasaki et al., Neurol Res, 23, 588-92, 2001). Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) reduziert die ischämische Gehirnverletzung nach einer dauernden mittleren Zerebral-Aterien-Okklusion (MCO) in Ratten (Fischer et al. 1995; Song et al. 2002). Tatsächlich können die in ischämischen Modellen von Ratten demonstrierten neuroprotektiven Wirkungen von FGF durch einen PI-3 Kinase/AKT-Normalwerte abhängig sind, Aktivierung von GSK-3β (Hashimoto et al., 2002) Vermittelt werden. Dadurch kann die Inhibierung von GSK-3β nach einem zerebralen ischämischen Vorfall ischämische Gehirnzerstörung verbessern.
GSK-3 wird auch mit Myocardinfarkt in Verbindung gebracht. Siehe Jonassen et al., Circ Res, 89: 1191, 2001 (The reduction in myocardial infarction by insulin administration at reperfusion is mediated via Akt dependent signaling pathway); Matsui et al., Circulation, 104:330, 2001 (Akt activation preserves cardiac function and prevents cardiomyocyte injury after transient cardiac ischemia in vivo); Miao et al., J Mol Cell Cardiol, 32:2397, 2000 (Intracoronary, adenovirus-mediated Akt gene delivery in heart reduced gross infarct size following ischemia-reperfusion injury in vivo); und Fujio et al., Circulation et al., 101:660, 2000 (Akt signaling inhibits cardiac myocyte apoptosis in vitro and protects against ischemiareperfusion injury in mouse heart).
GSK-3 Aktivität spielt auch im Kopftrauma eine Rolle. Siehe Noshita et al., Neurobiol Dis, 9:294, 2002 (Upregulation of Akt/PI3-kinase pathway may be crucial for cell survival after traumatic brain injury) und Dietrich et al., J Neurotrauma, 13:309 1996 (Posttraumatic administration of bFGF significantly reduced damaged cortical neurons & total contusion volume in a rat model of traumatic brain injury).
Von GSK-3 ist auch bekannt, dass es eine Rolle in psychiatrischen Krankheiten spielt. Siehe Eldar-Finkelman, Trends Mol Med, 8:126, 2002; Li et al., Bipolar Disord, 4:137, 2002 (LiCl and Valproic acid, anti-psychotic, mood stabilizing drugs, decrease GSK3 activities and increase beta-catenin) und Lijam et al., Cell, 90:895, 1997 (Dishevelled KO mice showed abnormal social behaviour and defective sensorimotor gating. Dishevelled, a cytoplamic protein involved in WNT pathway, inhibits GSK3beta activities).
Es wurde gezeigt, dass GSK3 Inhibierung durch Lithium und Valproinsäure axonales Remodellieren und Ändern der synaptischen Gleitfähigkeit auslösen. Siehe Kaytor & Orr, Curr Opin Neurobiol, 12:275, 2002 (Downregulation of GSK3 causes changes in mirotuble-associated proteins: tau, MAP1&2) und Hall et al., Mol Cell Neurosci, 20:257, 2002 (Lithium and valproic acid induces the formation of growth cone-like structures along the axons).
GSK-3 Aktiviät ist auch mit Alzheimerkrankheit verbunden. Diese Krankheit ist durch die Gegenwart von gut bekannten β-Amyloid Peptid und der Bildung von interzellularen neurofibrillären Knäuel gekennzeichnet. Die neurofibrillären Knäuel enthalten hyperphosphoriliertes Tau-Protein, bei welchem Tau an abnormalen Stellen phosphoriliert ist. Von GSK-3 wurde gezeigt, dass sie dies abnormalen Stellen in Zellen und Tiermodellen phosphorilieren. Weiters wurde gezeigt, dass die Inhibierung von GSK-3 Zellen einer Hyperphosphorilierung von Tau in Zellen vorbeugt [Lovestone et al., Curr. Biol., 4, 1077-86 (1994); und Brownlees et al., Neuroreport 8, 3251-55 (1997); Kaytor und Orr, Curr. Opin. Neurobiol., 12, 275-8 (2000)]. In transgenen, GSK-3 überexprimierenden Mäuse wurde signifikant überhöhte Tau-Hyperphosphorilierung und abnormale Morphologie von Neuronen beobachtet [Lucas et al., EMBO J, 20:27-39 (2001)]. Aktive GSK3 akkumuliert in Zytoplasma von vorgeknäulten Neuronen, was zu neurofibrillären Knäuel im Gehirn von Patienten mit AD führen kann [Pei et al., J Neuropathol Exp Neurol, 58, 1010-19 (1999)]. Daher verlangsamt oder stoppt die Inhibierung von GSK-3 die Bildung von neurofibrillären Knäuel und behandelt oder reduziert somit die Schwere der Alzheimerkrankheit.
Der Nachweis für die Rolle die GSK-3 in Alzheimerkrankheit spielt wurde in vitro gezeigt. Siehe Aplin et al(1996), J Neurochem 67:699; Sun et al(2002), Neurosci Lett 321:61 (GSK3b phosphoriliert Zytoplasmadomäne von Amyloid Precursor Protein (APP) und GSK3b Inhibierung reduziert Ab40 & Ab42 Sekretierung in APP-transfektierten Zellen); Takashima et al(1998), PNAS 95:9637; Kirschenbaum et al(2001), J Biol Chem 276:7366 (GSK3b) bildet Komplexe mit und phosphoriliert Presenilin-1, welches mit Gamma-Sekretaseaktivität in der Synthese von Aβ von APP in Verbindung steht); Takashima et al (1998), Neurosci Res 31:317 (Aktivierung von GSK3b durch Ab (25-35) verstärkt die Phosphorilierung von Tau in hippocampalen Neuronen. Diese Beobachtung sieht eine Verbindung zwischen Aβ und neurofibrillären Knäuel, die aus hyperphosphoryliertem Tau gebildet sind, vor ein weiteres pathologisches Kennzeichen von AD); Takashima et al (1993), PNAS 90:7789 (Blockade von GSK3b Expression oder Aktivität bindet Ab-induzierte Neurodegeneration von kortikalen und hippokampalen primären Kulturen); Suhara et al (2003), Neurobiol Aging. 24:437 (Intrazellularer Ab42 ist für endotheliale Zellen toxisch durch Störung der Aktivierung von Akt/GSK-3b signalabhängigen Mechanismus); De Ferrari et al (2003) Mol Psychiatry 8:195 (Lithium schützt N2A Zellen & primäre hippocampale Neuronen vor Aβ Fibrilin-induzierte Cytotoxizität, & reduziert nukleare Translokation/Destabilisation von b-Catenin); und Pigino et al., J Neurosci, 23:4499, 2003 (Die Mutationen in Alzheimer Presenilin 1 kann GSK-3 Aktivität deregulieren und erhöhen das wiederum axonalen Transport in Neuronen behindert. Die konsequente Reduktion in axonalen Transport in beeinträchtigten Neuronen kann letztlich zu Neurodegeneration führen).
Nachweis für die Rolle, die GSK-3 bei Alzheimerkrankheit spielt, wurde in vivo gezeigt. Siehe Yamaguchi et al (1996) Acta Neuropathol 92:232; Pei et al (1999), J Neuropath Exp Neurol 58:1010 (GSK3b Immunreaktivität wird in anfälligen Regionen von AD-Gehirnen erhöht); Hernandez et al (2002), J Neurochem 83:1529 (transgene Mäuse mit bedingter GSK3b Überexpression zeigt kognitive Effekte ähnlich jener, zum transgenen APP Mausmodell von AD); De Ferrari et al (2003) Mol Psychiatry 8:195 (chronische Lithiumbehandlung heilte Neurodegeneration und Verhaltensschädigungen (Morris-Wasserlabyrinth), welche durch Intrahippokampale Injektion von Aβ-Fibrilen verursacht war.); McLaurin et al., Nature Med, 8:1263, 2002 (Immunisierung mit Aβ in transgenen Modellen von AD reduzierte sowohl AD-ähnliche Neuropathologie und die spatialen Gedächtnisbeeinträchtigungen); und Phiel et al (2003) Nature 423:435 (GSK3 reguliert die Amyloid-beta Peptidproduktion über direkte Hinderung von Gammasekretase in AD tg Mäuse).
Presenilin-1 und Kinesin-1 sind ebenso Substrate für GSK-3 und betreffen einen anderen Mechanismus für die Rolle, die GSK-3 in Alzheimerkrankheit spielt und wurden kürzlich von Pigino, G., et al., Journal of Neuroscience (23:4499, 2003) beschrieben. Es wurde gefunden, dass GSK3beta Kinesin-1 leichte Ketten phosphoriliert, was zu einer Freisetzung von Kinesin-1 aus membrangebundenen Organellen führt, was zu einer Reduktion in schnellen anterograden axonalen Transport führt (Morfini et al., 2002). Die Autoren schlagen vor, dass die Mutationen in PS1 GSK-3 Aktivität deregulieren und erhöhen können, was wiederum axonalen Transport in Neuronen behindert. Die konsequente Reduktion von axonalem Transport in beeinträchtigten Neuronen führt letztlich zur Neurodegeneration.
GSK-3 hängt auch mit amyotropher Lateralsklerose (ALS) zusammen. Siehe Williamson und Cleveland, 1999 (Axonaler Transport wird in einer sehr frühen Phase von ALS in mSOD1-Mäusen verlangsamt); Morfini et al., 2002 (GSK3 phosphoryliert Kinesin-Leichtigkeiten und inhibiert anterograde axonale Transporte); Warita et al., Apoptosis, 6:345, 2001 (Die Mehrzahl von spinalen motorischen Neuronen verlor die Immunoreaktivitäten für sowohl PI3-K und Akt in den frühen und präsymptomatischen Stadien, die dem signifikanten Verlust von Neuronen in diesem SOD-1 tg Tiermodell von ALS vorangehen); und Sanchez et al., 2001 (Die Inhibierung von PI-3K induziert Neurit-Retraktion, welche durch GSK3 Aktivierung vermittelt ist).
GSK-3 Aktivität ist auch mit Verletzungen des Rückenmarks und der peripheren Nerven verbunden. Es wurde gezeigt, dass GSK3 Inhibierung durch Lithium und Valproinsäure axonales Remodellieren und Abändern der synaptischen Konnektivität induzieren kann. Siehe Kaytor & Orr, Curr Opin Neurobiol, 12:275, 2003 (Abwärtsregulieren von GSK3 verursacht Änderungen in mikrotubuli-assiziierten Proteinen: tau, MAP1 & 2) und Hall et al., Mol Cell Neurosci, 20:257, 2002 (Lithium und Valproinsäure induziert die Bildung von konusartigen Wachstumsstrukturen entlang der Axonen). Siehe auch Grothe et al. Brain Res, 885:172,2000 (FGF-2 stimuliert Schwann-Zellen Proliferation und inhibiert Myelinierung während Axonwachstums); Grothe and Nikkah, 2001 (FGF-2 wird in den proximalen und distalen Nervenstumpfen innerhalb von 5 Stunden nach der Nervenquetschung aufwärtsreguliert); und Sanchez et al., 2001 (Die Inhibierung von PI-3K induziert Neurit-Reaktionen welche durch GSK3 Aktivierung vermittelt ist).
Ein anderes Substrat von GSK-3 ist β-Catenin, welches nach der Phosphorylierung durch GSK-3 abgebaut wird. Verminderte Pegel von β-Catenin wurde bei schizophrenen Patienten berichtet und waren mit anderen Krankheiten verbunden, welche mit dem Anstieg von neutralem Zelltod in Verbindung standen [Zhong et al., Nature, 395, 698-702 (1998); Takashima et al., PNAS, 90, 77S9-93 (1993); Pei et al., J. Neurophathol. Exp, 56, 70-78 (1997); und Smith et al., Bio-org. Med. Chem. 11, 635-639 (2001)]. Weiters spielen β-Catenin und Tcf-4 eine Doppelrolle in dem vaskulären Remodellieren durch Inhibierung von vaskulärer Apoptose, glatter Muskelzellen und Unterstützung von Proliferation (Wang et al., Circ Res, 90:340, 2002). Demgemäß ist GSK-3 mit angiogenen Krankheiten verbunden. Siehe auch Liu et al., FASEB J, 16:950, 2002 (die Aktivierung von GSK3 reduziert den Hepatozyten-Wachstumsfaktor, was zu veränderte endothelialer Zellen-Barrierfunktion und verringerter vaskulärer Integrität führt) und Kim et al., k J Biol Chem, 277:41888, 2002 (GSK3beta Aktivierung inhibiert Angiogenese in vivo unter Verwendung von Matrigel Stopfenprobe [Matrigel plug assay]; die Inhibierung von GSK3beta Signalgebung verstärkt die Kapillarformation).
Die Verbindung zwischen GSK-3 und Huntington's Krankheit wurde gezeigt. Siehe Carmichael et al., J Biol Chem., 277:33791, 2002 (GSK3beta Inhibierung schützt Zellen von Poly-Glutamin-induziertem neuronalem und nicht-neuronalem Zelltod über den Anstieg von b-Catenin und seinen assoziierten transkriptionalen Weg). Die Überexpression von GSK3 reduzierte die Aktivierung von Hitzeschock-Transkriptionsfaktor-1 und Hitzeschockprotein HSP70 (Bijur et al., J Biol Chem, 275:7583, 2000) von denen gezeigt wurde, dass sie sowohl Poly-(Q) Aggregate als auch Zelltod in vitro HD Modellen verringern (Wyttenbach et al., Hum Mol Genet, 11:1137, 2002).
GSK-3 beeinflusst die Niveaus von FGF-2 und deren Rezeptoren sind während der Remyelierung von Gehirnaggregatkulturen, welche Rattenhirn remyelieren, erhöht. Siehe Copelman et al., 2000, Messersmith, et al., 2000; und Hinks und Franklin, 2000. Es wurde auch gefunden, dass FGF-2 Prozessauswüchse durch Oligodendrozyten induziert, was die Involvierung von FGF in Remyelierung impliziert (Oh and Yong, 1996; Gogate et al., 1994) und dass FGF-2 Gentherapie gezeigt hat, die Gewinnung von experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE) Mäusen zu verbessern (Ruffini, et al., 2001).
GSK-3 wurde auch mit Haarwachstum in Verbindung gebracht, da von Wnt/beta-Cartenin Signalierung gezeigt wurde, dass sie eine größere Rolle in der Haarfollikel-Morphogenese und Differenzierung spielt (Kishimotot et al., Genes Dev, 14:1181, 2000; Millar, J Invest Dermatol, 118:216, 2002). Es wurde gefunden, dass Mäuse mit konstitutiver Überexpression des Inhibitors des von Wnt Signalisierung in der Haut versagt haben, Haarfollikel zu bilden. Wnt-Signale werden für die anfängliche Entwicklung von Haarfollikel benötigt und GSK3 reguliert konstitutiv den Wnt-Weg durch Inhibierung von beta-Catenin. (Andl et al., Dev Cell 2:643, 2002), ein transientes Wnt-Signal ergibt den ausschlaggebenden Anfangsstimulus für den Start eines neues Haarwachszyklus durch Aktivierung von beta-Catenin und TCF-regulierten Gentranskription in epithelialen Haarfollikel-Vorläufer (Van Mater et al., Genes Dev. 17:1219, 2003).
Da GSK-3 mit Spermamotilität in Verbindung steht, ist GSK-3 Inhibierung als männliches Kontrazeptivum nützlich. Es wurde gezeigt, dass die Abnahme von Sperma GSK-3 Aktivität mit der Spermamotilitätentwicklung und Affen-Epididymis verbunden ist (Vijayaraghavan et al., Biol Reprod, 54:709, 1996; Smith et al., J Androl, 20:47, 1999). Weiters ist die Tyrosin & Serin/Threonin Phosphorylierung von GSK3 hoch motil ist im Vergleich zu immotilen Spermien in Bullen (Vijayaraghavan et al., Biol Reprod, 62:647, 2000). Diese Wirkung wurde auch mit menschlichen Spermien demonstriert (Luconi et al., Human Reprod, 16:1931, 2001).
WO 02/22601 betrifft Pyrazolverbindungen, welche als Proteinkinaseinhibitoren, insbesondere Inhibitoren von GSK-3 und Aurora-2 Proteinkinasen nützlich sind.
Unter Bedachtnahme, dass es derzeit an verfügbaren Behandlungsoptionen für die Mehrzahl von Zuständen, die mit GSK-3 Proteinkinase verbunden sind, fehlt, ist nach wie vor ein großer Bedarf für neue therapeutische Wirkstoffe, die dieses Proteinziel inhibieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung spricht diesen Bedarf an durch zur Verfügung stellen von Verbindungen der Formel I:
oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, wobei W, R¹, und R^y wie untenstehend beschrieben sind.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind in der Lage GSK-3 Aktivität zu inhibieren. Entsprechend der Erfindung werden diese Verbindungen in Zusammensetzung und Verfahren zur Inhibierung der GSK-3 Aktivität und Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Schwere der Krankheiten oder Zustände die mit GSK-3 den Patienten assoziiert sind, verwendet.
Die Krankheiten oder Zustände die den erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich sind, enthalten z.B neurologische und neurodegenerative Krankheiten, Diabetes, psychiatrische Krankheiten, Multiple Sklerose (MS), Myocardiainfarkte, Reperfusion/Ischämie, Kahlköpfigkeit und Schlaganfall.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirkung der Behandlung mit einer Verbindung der Formel 1 im Vergleich mit einem Kontrollvehikel, das sechs Stunden nach der mittleren zerebralen Aterienverschlussmodell (MCAO) verabreicht wurden, als Erhöhung des totalen Infarktvolumens, des kortikalen Infarktvolumens, der striatalen ischämischen Zerstörung, und Ödembildung.
2 zeigt die neurologische Funktion von Ratten über den Zeitverlauf des Experiments, welche mit einer Verbindung der Formel 1 behandelt wurden, im Vergleich mit einer Vehikelkontrollgruppe.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel I:
oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, worin:
W Stickstoff ist;
R¹ ausgewählt ist aus Wasserstoff oder Fluor; und
R^y eine C_1-4 aliphatische Gruppe ist, wobei diese aliphatische Gruppe ein geradkettiger oder verzweigter C₁-C₄ Kohlenwasserstoff ist, der vollständig gesättigt ist oder eine oder mehrere ungesättigte Einheiten enthält oder ein monozyklischer C₃-C₄ Kohlenwasserstoff, der vollständig gesättigt ist oder der eine oder mehrere ungesättigte Einheiten enthält, aber nicht aromatisch ist, der einen einzigen Anheftungspunkt zum Rest des Moleküls aufweist.
Der Begriff „aliphatisch" oder „aliphatische Gruppe" wie hierin verwendet bedeutet eine gerade Kette oder verzweigte C₁-C₄ Kohlenwasserstoffkette, die vollständig gesättigt ist oder die eine oder mehrere ungesättigte Einheiten aufweist oder ein monozyklischer C₃-C₄ Kohlenwasserstoff, der komplett gesättigt ist oder eine oder mehrere Einheiten von Unsättigung aufweist, der jedoch nicht aromatisch ist (wie hierin als „Karbozyklus" oder „Zykloalkyl" bezeichnet), welcher einen einzigen Anheftpunkt an den Rest des Moleküls aufweist. Zum Beispiel sind passende aliphatische Gruppen jedoch nicht darauf beschränkt, lineare oder verzweigte Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Alkynylgruppen und Hybride davon, wie z.B. (Cycloalkyl)Alkyl, (Cycloalkenyl)Alkyl oder (Cycloalkyl)Alkenyl.
Die Begriffe „Alkyl", „Alkenyl" und „Alkynyl" und zwar entweder alleine oder als Teil einer größeren Einheit verwendet, sollen sowohl gerade als auch verzweigte Ketten, die eine bis vier Kohlenstoffatome aufweisen, enthalten und wenigstens zwei Kohlenstoffatome und eine Doppelbindung im Falle von Alkenyl und wenigstens zwei Kohlenstoffatome und eine Dreifachbindung im Fall von Alkynyl aufweisen.
Die in dieser Erfindung verwendeten Verbindungen sind auf solche beschränkt, die chemisch erhältlich und stabil sind. Daher ist eine Kombination von Substituenten oder Variablen der oben beschriebenen Verbindung nur zulässig, wenn eine solche Kombination in stabilen oder chemisch erhältlichen Verbindungen resultiert. Eine stabile Verbindung oder eine chemisch erhältliche Verbindung ist eine solche, welche die chemische Struktur nicht substanziell verändert wird, wenn sie bei Temperaturen von 40°C oder weniger gehalten wird, und zwar in Abwesenheit von Feuchtigkeit oder anderen chemisch-reaktiven Konditionen für wenigstens eine Woche.
Es ist für den Fachmann auf dem Gebiet erkennbar, dass bestimmte Verbindungen dieser Erfindung in tautomeren Formen existieren können, wobei alle diese tautomeren Formen der Verbindung innerhalb des Bereichs der Erfindung liegen.
Wenn nicht anders festgelegt, sind die hierin gezeigten Strukturen vorgesehen, alle stereo-chemischen Formen der Struktur zu umfassen, dass sind die R und S Konfigurationen für jedes asymmetrische Zentrum. Daher sind einzelne stereo-chemische Isomere so wie Enantiomere und Diastereomere Mischungen der vorliegenden Verbindungen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Soweit nicht anderweitig festgestellt sind die hierin gezeigten Strukturen vorgesehen um Verbindungen mit einzubeziehen, welche nur in Gegenwart von einem oder mehreren isotopisch angereicherten Atom differieren. Zum Beispiel sind Verbindungen, welche die gegenwärtigen Strukturen mit Ausnahme des Ersatzes von Wasserstoff durch Deuterium oder Tritium oder Ersatz eines Kohlenstoffs durch ein ¹³C- oder ¹⁴C-angereicherten Kohlenstoff aufweisen, innerhalb des Umfangs dieser Erfindung.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung fallen in die Gattung von Verbindungen wie sie in der PCT Veröffentlichung WO 02/22609 beschrieben sind. Jedoch haben die Anmelder entdeckt, dass die vorliegende Verbindung überraschend und unerwartet die Wirksamkeit bei dem Schützen von neuronalen Zellen gegen die ischämische Beschädigung und bei der Behandlung von Schlaganfall erhöhen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung der Formel I, in welcher R^y ein unsubstituiertes C_1-4 aliphatische Gruppe ist. Bevorzugte aliphatische Gruppen von Verbindungen von Formel I sind Alkylgruppen. Solche Alkylgruppen sind bevorzugt Methyl, Ethyl, Cyclopropyl, Tert-Butyl, oder Isopropyl. Mehr bevorzugte Alkylgruppen der Formel I sind Methyl, Cyclopropyl und Tert-Butyl.
Gemäß einer Ausführungsvariante betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel 1, in welcher W Stickstoff ist.
Gemäß einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel I, in welcher R¹ Wasserstoff ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsvariante betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel I, in welcher R¹ Fluor ist.
Es ist zu verstehen, dass alle Kombinationen und Subkombinationen von Ausführungen wie hierin beschrieben, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind.
Repräsentative Beispiele von Verbindungen der Formel I sind in Tabelle 1 unterhalb dargelegt.
Tabelle I Zusammensetzung der Formel I
Die Verbindungen dieser Erfindung können wie in den Schemen I-II unterhalb wiedergegeben hergestellt werden und auch durch allgemeine Methoden wie sie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Schema I
Reagenzien und Bedingungen: (a) Oxalylchlorid, Dichlorethan, 70°C; (b) Dimethylamin, Pentan, TiCl₄; (c) NH₄OAc, HOAc, THF, Rückfluss; POCl₃, n-Pr₃N, Rückfluss; (e) 160°C, rein.
Das oben gezeigte Schema 1 gibt ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wieder. Im Schritt (a) wird Arylamid 1 mit Oxalylchlorid behandelt um das Acylisocyanat 2 zu bilden. Wie in Schritt (c) gezeigt, kann ein Acylisocyanat 2 mit einem Enamin 3 kondensiert werden, um Pyrimidion 4 zu erzeugen (J. Org. Chem (1993), 58, 414-418; J.Med.Chem., (1992), 35, 1515-1520; J. Org. Chem., 91967, 32, 313-214). Das Zwischenprodukt 4 wird mit POCl₃ behandelt, um die Chlorverbindung 5 zu bilden, welche dann mit dem Amino-Indazol-Derivat 6 kombiniert wird, um eine Verbindung der Formel 1 zu erzielen. Die Verfahren zur Herstellung von Amino-Indazol-Derivaten 6 sind in der Wissenschaft bekannt. Insbesondere ist die Synthese dieser Derivate in WO 02/22607 dargelegt. Schema II

Reagenzien und Konditionen: (a) i LiN(TMS)₂, Ether, THF, ii HCL; (b) NaOEt, EtOH, Rückfluss.

Das oben wiedergegebene Schema II zeigt eine alternative Methode zur Herstellung von Pyrimidinonzwischenprodukt 5, welches bei der Herstellung von Verbindungen der Formel I wie sie in Schema I unter Schritt (e) wiedergegeben sind, benützt werden können. In Schritt (a) ist das Arylnitril 7 Benzamidin-Zwischenprodukt 8 welches dann mit Beta-Keto Äster 9 behandelt wird, um die Pyrimidinonverbindung 5 zu bilden, welche wie oben beschrieben verwendet werden kann.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann andere Verbindungen der Erfindung entsprechend der Lehre und der Spezifikation unter Verwendung von Reagenzien die bereits synthetisiert oder kommerziell erhältlich sind, synthetisieren.
Die Aktivität einer erfindungsgemäßen Verbindung als Inhibitor von GSK-3 kann in vitro, in vivo oder in einer Zelllinie untersucht werden. In vitro Untersuchungen umfassen Untersuchungen, die die Inhibierung von entweder Phosphorylierungsaktivität oder ATPase-Aktiviät von aktivierten GSK-3 beinhalten. Alternative in vitro Versuche, quantifizieren die Fähigkeit des Inhibitors GSK-3 zu binden. Inhibitorbindung kann durch radioaktives Markieren des Inhibitors vor der Bindung, Isolierung des Inhibitor/GSK-3 Komplexes und Bestimmung der Menge von radiomarkierten Verbindungen gemessen werden. Alternativ dazu kann die Inhibitorbindung durch Durchlaufen eines Kompetitiv-Experiments ermittelt werden, wo neue Inhibitoren mit GSK-3 inkubiert werden, welche an bekannte Radioliganden gebunden ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine Zusammensetzung vor, welche eine erfindungsgemäße Verbindung oder ein pharmazeutisch-akzeptables Salz davon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Adjuvans oder Vehikel enthält. Die Menge der Verbindung in der Zusammensetzung der Erfindung ist so, dass sie wirksam ist, um eine Proteine-Kinase, insbesondere GSK-3, in einer biologischen Probe oder in einem Patienten erkennbar zu inhibieren. Bevorzugt ist die Zusammensetzung der Erfindung für die Verabreichung an einen Patient, der eine derartige Zusammensetzung benötigt, formuliert. Insbesondere ist die Zusammensetzung der Erfindung für orale Verabreichung an den Patienten formuliert.
Der Begriff „Patient" wie er hierin verwendet wird, meint ein Tier, insbesondere ein Säugetier und am meisten bevorzugt einen Menschen.
Der Begriff „pharmazeutisch-akzeptabler Träger, Adjuvat oder Vehikel" bezieht sich auf einen nicht-toxischen Träger, Adjuvans oder Vehikel, die die pharmakologische Aktivität der Verbindung mit welcher sie formuliert sind nicht zerstören. Pharmazeutisch-akzeptable Träger, Adjuvantien oder Vehikel, die in der Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden können aber sind, ohne darauf limitiert zu sein, Ionentauscher, Aluminiumoxid, Aluminium-Stereat, Lecithin, Serumproteine, wie menschliches Serumalbumin Puffersubstanzen wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, partielle Glyceridmischungen von gesättigten pflanzlichen Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kalium-Hydrogen-Phosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Silica, Magnesium-Trisilikat, Polyvinylpyrrolidon, Zellulose-basierte Substanzen, Polyethylenglycol, Natrium-Carboxy-Methyl-Zellulose, Polyacrylate, Wachse, Polyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglycol und Wollfett.
Der Begriff „erkennbar inhibiert", wie er hierin verwendet wird meint einen messbaren Wechsel an GSK-3 Aktivität zwischen einer Probe, welche die genannte Zusammensetzung und GSK-3 Kinase und einen äquivalenten Probe die GSK-3 Kinase in Abwesenheit der Zusammensetzung aufweist.
Ein „pharmazeutisch akzeptables Salz" meint ein nicht-toxisches Salz, wie Ester, Salz eines Esters oder andere Derivate einer Verbindung der Erfindung, die bei Verabreichung an einen Empfänger in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt eine Zusammensetzung der Erfindung oder einen inhibitorisch-aktiven Metaboliten oder Rest davon zur Verfügung zu stellen.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff inhibitorisch-aktiv Metaboliten oder Rest davon, dass ein Metabolit einer Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein Rest davon ebenfalls ein Inibitor von GSK-3 Kinase ist.
Pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindungen dieser Erfindung schließen solche ein, die von pharmazeutisch akzeptablen anorganischen oder organischen Säuren oder Basen abgeleitet sind. Beispiele von passenden Säuresalzen beinhalten Acetate, Adipate, Alginate, Aspartate, Benzoate, Benzensulfonate, Bisulfate, Butyrate, Citrate, Camphorate, Camphersulfonate, Cyclopentanpropionate, Dugluconate, Dodecylsulfate, Ethansulfonate, Formiate, Fumarate, Glucoheptanoate, Glycerophosphate, Glycolate, Hemisulfate, Heptanoate, Hexanoate, Hydrochloride, Hydrobromide, Hydroiodide, 2-Hydroxyethansulfonate, Lactate, Maleate, Malonate, Methansulfonate, 2-Naphthalensulfonate, Nikotinate, Nitrate, Oxalate, Palmoate, Pectinate, Persulfate, 3-phenylpropionate, Phosphate, Pikrate, Pivalate, Propionate, Salicylate, Succinate, Sulfate, Tartrate, Thiocyanate, Tosylate und Undecanoate. Andere Säuren wie Oxalsäuren, welche als solche nicht pharmazeutisch akzeptable sind, können bei der Herstellung von Salzen nützlich sein, als Zwischenverbindungen zum Erhalten von Verbindungen der Erfindung und deren pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalzen.
Salze, die von passenden Basen abgeleitet sind, umfassen Alkali-Metalle (z.B. Natrium und Kalium), Erd-Alkali-Metalle (z.B. Magnesium), Ammonium und N+(C_1-4 Alkyl)₄ Salze. Diese Erfindung zieht auch die Quaternisierung von jeglichen basischen Stickstoff-enthaltenden Gruppen der Verbindungen, die hierin geoffenbart sind, in Betracht. Wasser oder Öl-lösliche dispergierbare Produkte können durch solche Quarternisierung erhalten werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können oral, parenteral, durch Inhalationsspray, topisch rektal, nasal, buccal, vaginal oder über ein implantiertes Reservoir verabreicht werden. Der Begriff „parenteral" wie hierin verwendet, schließt subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intra-artikuläre, intra-synoviale, intrasternale, intrathecale, intrahepatische, intralesionale und intrakraniale Injektion oder Infusionstechniken ein. Bevorzugt werden die Zusammensetzungen oral, intraperitonial oder intravenös verabreicht. Sterile injizierbare Formen der Zusammensetzung der Erfindung können wässrige oder ölige Dispersionen sein. Diese Suspensionen können entsprechend bekannte Techniken hergestellt werden und zwar unter Verwendung von geeigneten Dispergierungs- oder Netzungsmittel und Suspendierungsmittel. Die sterile injizierbare Zusammensetzung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einen nicht toxischen parenteral-akzeptablen Verdünnungs- oder Lösungsmittel sein, z.B. als eine Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den akzeptierbaren Vehikeln und Lösungsmitteln können Wasser, Ringer's Lösung und isotonische Natriumchloridlösung verwendet werden. Zusätzlich werden sterile, Fettöle üblicherweise als Lösungsmittel oder Suspendierungsmittel angewendet.
Für diese Zwecke kann jegliches Gemisch des Fettöl einschließlich synthetischer Mono- oder Di-Glyceride verwendet werden. Fettsäuren wie Ölsäure und ihre Glycerid-Derivate sind nützlich für die Herstellung von injizierbaren Ölen, das sind, natürliche, pharmazeutisch akzeptable Öle wie Olivenöl oder Rizinusöl, insbesondere in ihrer polyoxylierten Version sind. Diese Öl-Lösungen oder Suspensionen können einen langkettigen Alkohol-Diluenten oder Dispersanten aufweisen, wie Carboxymethyl-Zellulose oder ähnliche dispergierenden Mittel, die üblicherweise bei der Formulierung von pharmazeutisch akzeptablen Dosierungsformen einschließlich Emulsionen und Suspensionen verwendet werden. Andere üblicherweise verwendete oberflächenaktive Substanzen wie Tweens, Spans oder andere emulgierende Wirkstoffe oder bioverfügbare Verstärker, die üblicherweise in der Herstellung von pharmazeutisch akzeptablen Feststoffen, Flüssigkeiten oder anderen Dosierungsformen eingesetzt werden, können für die Zwecke der Formulierung verwendet werden.
Die pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung der Erfindung kann oral in jeglicher oral-akzeptablen Dosierung verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Kapseln, Tabletten, wässrige Suspensionen oder Lösungen. Im Falle von Tabletten für den oralen Gebrauch umfassen die üblicherweise verwendeten Träger Laktose und Maisstärke. Gleitmittel, wie Magnesiumstereat, werden ebenfalls typischerweise zugesetzt. Zur oralen Verabreichung in Kapselform, umfassen die nützlichen Verdünnungsmittel Laktose und getrocknete Maisstärke. Wenn wässrige Suspensionen für den oralen Gebrauch benötigt werden, wird der aktive Inhaltsstoff mit emulgierenden und suspensierenden Wirkstoffen kombiniert. Wenn gewünscht, können gewisse geschmackgebende oder färbende Wirkstoffe ebenfalls zugesetzt werden.
Alternativ dazu können pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzungen der Erfindung in Form von Suppositorien zur rektalen Verabreichung verwendet werden. Diese können durch Mischung des Wirkstoffes mit einem passenden nicht-reizenden Excipienten gemischt werden, welcher bei Raumtemperatur fest ist, jedoch bei rektaler Temperatur schmilzt und flüssig ist und daher im Rektum schmilzt um den Wirkstoff freizugeben. Solche Materialen umfassen Kakaobutter, Bienenwachs und Polyethylenglycole.
Die pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzungen dieser Erfindungen können auch topisch angewendet werden, insbesondere wenn das Ziel der Behandlung Bereiche oder Organe betrifft, welche durch topische Anwendung zugänglich sind, einschließlich Krankheiten der Augen, der Haut, oder des unteren Intestinaltraktes. Geeignete topische Formulierungen werden für jedes dieser Bereich oder Organe speziell zusammengesetzt.
Topische Anwendungen für den unteren Intestinaltraktes kann in Form von rektalen subpositorischen Formulierung (siehe oben) oder in einer passenden Klistirformulierung verabreicht werden. Topisch transdermale Pflaster können auch verwendet werden.
Für die topische Anwendung können pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung in einer passenden Salbe formuliert werden, welche den aktiven Bestandteil suspendiert oder gelöst in einen oder mehreren Trägern aufweist. Träger für die topische Anwendung der Verbindung dieser Erfindung umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Mineralöle, flüssiges Rohvaselin, weißes Rohvaselin, Propylengycol, Polyoxyethylen, Polyoxypropylenverbindungen, emulgierendes Wachs und Wasser. Alternativ kann die pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung in einer passenden Lotion oder Creme formuliert sein, welche die aktiven Komponenten suspendiert oder gelöst in einen oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern enthält. Passende Träger schließen ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Mineralöle, Sorbitan-Monostereat, Polysorbat 60, Cetyl-Ester-Wachs, Cetearylalkohol, 2-Octyldodekanol, Benzylalkohol und Wasser.
Für den ophthalmischen Gebrauch, kann die pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung in mikronisierte Suspension in isotinischen, pH adjustierte sterile Salzlösung oder bevorzugt als Lösung in isotonischer, pH adjustierter sterile Salzlösung, entweder mit oder ohne Konservierungsmittel wie Benzylalkoniumchlorid formuliert sein. Alternativ kann für ophtalmische Verwendung die pharmazeutisch akzeptable Komposition als eine Salbe wie mit Rohvaselin formuliert sein.
Die pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung dieser Erfindung kann durch Nasalaerosol oder Inhalation verabreicht werden. Solche Zusammensetzungen werden entsprechend wohlbekannter Herstellungstechniken für pharmazeutische Formulierungen hergestellt und können als Lösungen in Saline unter Verwendung von Benzylalkohol oder anderen passenden Konservierungsmitteln, Absorptionspromotoren zur Verstärkung der Bioverfügbarkeit, Fluorkohlenstoffe, und/oder andere konventionelle Lösungs- und Dispergierungswirkstoffe formuliert werden.
Am meisten bevorzugt ist die pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung der Erfindung als für die orale Verabreichung formuliert vorgeschrieben.
Die Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen, die mit dem Trägermaterial kombiniert werden können, um eine Zusammensetzung in eine Einzeldosisform zu erhalten, wird in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt und der speziellen Form der Verabreichung variieren. Bevorzugter Weise sollte die Zusammensetzung formuliert sein, dass eine Dosis von zwischen 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht/Tag des Inhibitors an den Patient, der diese Zusammensetzung erhält, abgegeben wird.
Es sollte auch verständlich sein, dass eine spezifische Dosierung an der Handlungsregel für jeglichen speziellen Patient in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren aufzustellen ist, einschließlich der Aktivität der spezielle verwendeten Verbindung, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Ernährung, der Zeit der Verabreichung, der Ausscheidungsrate, der Arzneimittelkombination, und der Beurteilung des behandelnden Arztes und der Schwere der entsprechenden zu behandelnden Krankheit. Die Menge der Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Zusammensetzung wird auch von der speziellen Verbindung in der Zusammensetzung abhängen.
In Anhängigkeit von den speziellen Zuständen oder Krankheiten, die behandelt oder denen vorzubeugen ist, können auch zusätzlich therapeutische Wirkstoffe, die normalerweise zur Behandlung oder zur Vorbeugung dieses Zustandes verabreicht werden, in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten sein.
Zum Beispiel können neurotrophe Faktoren oder andere Wirkstoffe zur Behandlung von neurologischen oder neurodegenerativen Krankheiten mit den erfindungsgemäßen Verbindungen kombiniert werden, um neurologische und neurodegenerative Krankheiten zu behandeln. Beispiele von bekannten neurotrophen Faktoren schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Acetylcholinesterase-Inhibitoren, MAO Inhibitoren, Interferone, Antikonvulsiva, Ionenkanalblocker, Riluzol, und Anti-Parkinsonwirkstoffe ein.
Beispiele für bekannte Behandlungen von Schlaganfall schließen Aktivase^®, ein rekombinanter, genetischhergestellter, Gewebeplasminogenaktivator (rt-PA), Heparin, Glutamt-Antagonisten, Kalzium-Antagonisten, Opionat-Antagonisten, GABA-Agonisten und Antioxidantien ein.
Andere Beispiele von Wirkstoffen, die mit der Verbindung dieser Erfindung kombiniert werden können, sind, ohne darauf eingeschränkt zu sein, antidepressive Wirkstoffe wie Zoloft^®, Prozac^®, Praxil^®, und Buspar^®; Anti-Entzündungswirkstoffe wie Corticosteroiden, TNF-Blocker, IL-1 RA, Azathioprin, Cyclophosphamid, und Sulfasalazin; immonmodulatorische und immunosuppressive Wirkstoffe wie Cyclosporin, Tacrolimus, Rapamycin, Mycophenolat-Mofitl, Interferone, Corticosteroide, Cyclophosphamide, Azathioprin und Sulfasalazin; neurotrophe Faktoren wie Acetylcholinesterase-Inhibitoren, MAO-Inhibitoren, Interferone, Anitkonvulsiva, Ionenkanalblocker, Riluzol, und Anti-Parkinson-Wirkstoffe; Wirkstoffe zur Behandlung von Kardiovaskulären Krankheiten wie Beta-Blocker, ACE-Inhibitoren, Diuretika, Nitrate, Kalziumkanalblocker und Statine; Wirkstoffe zur Behandlung von Diabetes wie Insulin, Insulinanaloga, Alpha-Glucosidasehinhibitoren, Biguanide, und Insulinsensitivierer; und Wirkstoffe zur Behandlung von Immuneffizienz-Krankheiten wie Gamma-Globulin.
Die Menge von zusätzlichen therapeutischen Wirkstoffen, die in der Zusammensetzung dieser Erfindung vorhanden sind, werden nicht mehr als jene Menge sein, die üblicherweise in einer Zusammensetzung verabreicht wird, welche den therapeutischen Wirkstoff als die einzig aktive Substanz enthält. Bevorzugt wird die Menge des zusätzlichen therapeutischen Wirkstoffes in der gegenwärtig offenbarten Zusammensetzung im Bereich von unter 50 % bis 100 % der gesamten üblicherweise in einer Zusammensetzung vorhandenen Menge sein, wenngleich dieser Wirkstoff als einziger therapeutischer Wirkstoff vorhanden wäre.
Entsprechend einer anderen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verabreichung eines zusätzlichen therapeutischen Wirkstoffes an einen Patienten ausgewählt aus der Behandlung von Alzheimerkrankheit (AD), einer Behandlung der Parkinsonkrankheit, einem Wirkstoff zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS), einer Behandlung für Asthma, einem Anitentzündungswirkstoff, einem immunomodulatorischen oder immunsuppressiven Wirkstoff, einen neurotrophen Faktor, einen Wirkstoff zur Behandlung von Schlaganfall, einem Wirkstoff von für die Behandlung von kardiovaskulärer Krankheit, einem Antidepressivum, einen antipsychotischen Wirkstoff, oder einem Wirkstoff zur Behandlung von Diabetes, wobei:
der genannte zusätzliche Wirkstoff für diese behandelnde Krankheit passend ist;
der genannte zusätzliche Wirkstoff zusammen mit der Verbindung als Einzeldosisform oder getrennt von der Zusammensetzung als Teil einer multiplen Dosierungsform verabreicht wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der GSK-3 Kinaseaktivität in einer biologischen Probe, welches Verfahren den Schritt des Kontaktieren der genannten biologischen Probe mit einer Verbindung der Erfindung oder einer dieser Verbindungen enthaltenden Zusammensetzung aufweist.
Der Begriff „biologische Probe" wie hierin verwendet schließt ohne Limitierung darauf, Zellkulturen oder Extrakte davon; Biopsiematerial, das von einem Säugetier oder Extrakten davon gewonnen wurde; und Blut, Speichel, Urin, Fäzes, Samen, Tränen oder andere Körperflüssigkeiten oder Extrakte davon, ein.
Inhibierung der GSK-3 Kinaseaktivität in einer biologischen Probe ist für eine Anzahl von Zwecken nützlich, welche einem Fachmann auf diesen Gebiet bekannt sind. Beispiele für solche Zwecke schließen ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Bluttransfusion, Organtransplantation, biologische Probenlagerung und biologische Versuchsanordnungen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der GSK-3 Kinaseaktivität in einem Patienten, welches den Schritt der Verabreichung einer Verbindung dieser Erfindung oder einer dieser Verbindung enthaltende Zusammensetzung an einen Patienten aufweist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln oder zum Verminderung der Schwere einer GSK-3 vermittelten Krankheit oder Zustandes in einem Patienten, welches Verfahren den Schritt der Verabreichung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthält.
Der Begriff „GSK-3-vermittelte Krankheit", wie hierin verwendet, meint jede Krankheit oder anderen schädliche Zustand oder Krankheit, in welchen GSK-3 bekannterweise eine Rolle spielt. Solche Krankheiten oder Zustände, schließen ohne darauf beschränkt zu sein, ein: Autoimmunkrankheiten, eine Entzündungskrankheit, eine metabolische Störung, eine psychatrische Störung, Diabetes, eine angiogene Krankheit, Tauopothie, eine neurologische oder neurodegenerative Krankheit, eine Rückenmarksverletzung, Glaucom, Kahlköpfigkeit, oder eine kardiovaskuläre Krankheit.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Schwere von Krankheiten, Störungen oder Zuständen, die ausgewählt sind aus einer Autoimmunkrankheit, eine Entzündungskrankheit, einen metabolischen Krankheit, einer pychiatrischen Krankheit, Diabetes, einer angiogenen Krankheit, Tauopothie, eine neurologische oder neurodegenerative Krankheit, einer Rückenmarksverletzung, Glaucom, Kahlköpfigkeit, oder einer kardiovaskuläre Krankheit in einem Patienten, der nach der Behandlung oder Verminderung der Schwere Bedarf hat, wobei das Verfahren die Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung oder eine Zusammensetzung davon an den besagten Patient enthält.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder zur Verminderung einer Schwere einer Krankheit oder eines Zustandes ausgewählt aus Allergie, Asthma, Diabetes, Alzheimerkrankheit, Huntington's Krankheit, Parkinson's Krankheit, mit AIDSverbundener Demenz, amyotrophe Lateralsklerose (ALS, Lou Gehrig's Krankheit), Multiple Sklerose (MS), einer Verletzung die auf ein Kopftrauma zurückgeht, Schizophrenie, Angstzustände, bipolare Erkrankung, Tauopothy, eine Verletzung des Rückenmarks oder von peripheren Nerven, Myocardinfarkt, Kardiomyocyten-Hypertrophy, Glaucom, Aufmerksamkeitsdeffizitsyndrom (ADD), Depression, Schlafstörungen, Reperfusion/Ischämie, Schlaganfall, eine angiogene Krankheit, oder Kahlköpfigkeit, wobei das genannte Verfahren die Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung oder einer Zusammensetzung davon an einen Patienten, der danach Bedarf hat, umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Behandlung und die Verminderung der Schwere von Schlaganfällen.
Gemäß einen anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Behandlung oder die Verminderung der Schwere von einer neurodegenerativen oder neurologischen Krankheit.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Verringern der Spermamotilität in einem männlichen Patienten, welches die Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung oder einer Zusammensetzung davon an den Patienten aufweist.
In einer alternativen Ausführungsform, weist das erfindungsgemäße Verfahren, das Zusammensetzungen benützt, die keinen weiteren zusätzlichen therapeutischen Wirkstoff enthalten, den zusätzlichen Schritt von separater Verabreichung eines zusätzlichen therapeutischen Patienten, an den Patienten auf. Wenn diese zusätzlichen therapeutischen Wirkstoffe separat verabreicht werden, können sie dem Patienten, gleichzeitig oder nachfolgend der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabreicht werden.
Damit die hierin beschriebene Erfindung verständlich wird, sind im nachfolgenden Beispiele angelegt. Es ist verständlich, dass diese Beispiele nur zum illustrativen Zweck gegeben werden und nicht als die Erfindung in irgendeiner Weise limitieren, gebildet sind.
Beispiele
Wie hierin verwendet lautet das als „Methode A" bezeichnete HPLC-Verfahren wie folgt:
Säule: C18, 3 μm, 2,1 × 50 mm, „Lighting" von Jones Chromotography.
Gradient: 100 % Wasser (enthaltend 1 % Acetonitril, 0,1 % TFA) zu 100 % Acetonitril (enthalten 0,1 TFA) über 4 Minuten, Halten bei 100 % Acetonitril für 1,4 Minuten und Rückkehr zu den Anfangskonditionen.
Totale Laufzeit 7 Minuten.
Fließrate: 0,8 mL/Minute.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „R_f" auf die Retentionszeit, in Minuten, die für die Verbindung unter Verwendung der genannten HPLC-Methode erhalten wurde. Die Verbindungsnummer die in den untenstehenden Beispielen angeführt sind, entspricht den Bindungsnummern wie in der Tabelle 1 untenstehend. Die drei Komponenten die unter den Beispielen 3, 9 und 15 angeführt sind, sind nicht Beispiele der Erfindung.
Beispiel 1
6-Methyl-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on:
Eine Mischung von 2-trifluoromethyl-benzamidin (2.13 g, 4 mmol) und Natriumethoxid (0.83 g, 12 mmol) in Ethanol (20 mL wurde mit Methyl-Acetoacetat (0.44 mL, 4 mmol) behandelt und für 24 hours erhitzt. Die Reaktion wurde gekühlt, konzentriert, mit Wasser verdünnt und mit 2N Salzsäure angesäuert. Die entstandene Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Reinigung mit Flash-Chromatographie [SiO₂, Methanol:Dichloromethan (3:97)] ergab die Titelverbindung (0-51 g, 50 % yield) als einen gelben Feststoff; ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12.7 (br s, 1H), 7.9 (m, 1H), 7.8 (m, 2H), 7.7 (m, 1H), 6.3 (s, 1H), 2.21 (s, 3H) ppm; MS (FIA) 255.0 (M+H); R_t (Methode A) 2.578 Minuten.
Beispiel 2
4-Chlor-6-methyl-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)-pyrimidin:
Eine Lösung von 6-Methyl-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on (10.7 g, 41.9 mmol) in Phosphor (V)-oxidchlorid (39 mL, 419 mmol) wurde mit tri-n-Propylamin (16 mL, 83.9 mmol) behandelt und 1 Stunde bei 110-120°C refluxiert. Die Lösung wurde verdampft, drei Mal mit Toluol azeotrop destilliert, dann im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, nacheinander mit 1 N Natriumhydroxid, Wasser und Salzlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Reinigung mit Flash-Chromatographie [SiO₂, Ethylacetat:Hexanen (1:9)] ergab die Titelverbindung (9.61 g, 84 % Ausbeute) als ein orangefarbeness Öl. ¹HNMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 2.63 (3H, s), 7.26 (s, 1H), 7-61 (t, J = 7.6Hz, 1H), 7.67 (t, J = 7.5Hz, 1H), 7.76 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.82 (d, J = 7.8Hz, 1H) ppm; MS (FIA) 273.0 (M+H); R_t (Methode A) 3.499 min.
Beispiel 3
(5-Fluor-1H-indazol-3-yl)-[6-methyl-2,(2-trifluoromethyl-Phenyl)-pyrimidin-4-yl]amin:
Eine Mischung von 4-Chlor-6-methyl-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)-pyrimidin (0.10 g, 0.37 mmol) und 5-Fluor-1H-indazole-3-ylamin (0.072 g, 0.48 mmol) wurde sanft auf 160-170°C für 8 Stunden erhitzt. Der erhaltenen Niederschlag wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt, dann in N-Methyl-pyrrolidinon (2 mL) gelöst. Diese Mischung wurde in Wasser (20 mL) gegossen und Natriumbicarbonat (5 mL) wurde zugesetzt und die entstandene Mischung filtriert, mit Wasser gewaschen. Reinigung mit präparativer HPLC ergab die Titelverbindung (0.081 g, 43 % Ertrag) als ein brauner Feststoff. ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12.8 (br s, 1H), 10.6 (br s, 1H), 7.86 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.77 (m, 4H), 7.62 (br s, 1H), 7.50 (m, 1H), 7.29 (m, 1H), 2.44 (s, 3H) ppm; LC-MS 388.05 (M+H); R_t (Methode A) 2.900 minutes.
Beispiel 4
6-tert-Butyl-1(2-trifluoromethyl-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on:
Eine Mischung von 2-Trifluoremethylbenzamidin (1.12 g, 5 mmol) Natriumethoxid (1.02 g, 15 mmol) und 4,4-dimethyl-3-oxo-Pentansäure-Methylester (0.80 mL, 5 mmol) in Ethanol (50 mL) und wurde für 16 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Reaktion wurde gekühlt, konzentriert, mit Wasser verdünnt und mit 2N Salzsäure angesäuert. Die entstandene Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Reinigung mit Flash-Chromatographie [SiO₂, Methanol:Dichloromethan (2:98)] ergab die Titelverbindung (0.48 g, 32 % Ausbeute) als gelber Feststoff;
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12.8 (br s, 1H), 7.89 (d, J = 7.5Hz, 1H), 7.78 (m, 2H), 7.71 (d, J = 7.4Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 1.20 (s, 9H) ppm; LC-MS 297.03 (M+H); R_t (Methode A) 3.30 Minuten.
Beispiel 5
6-tert-Butyl-6-chlor-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)-pyrimidin:
Eine Lösung von 6-tert-Butyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on (0.47 g, 1.59 mmol) in Phosphor (V)-oxidchlorid (1.65 mL, 15.9 mmol) wurde mit tri-n-Propylamin (0.61 mL, 3.17 mmol) behandelt und bei 110-120°C für 1 Stunde erhitzt. Die Lösung wurde durch Verdampfen entfernt, dann drei Mal mit Toluol azeotrop destilliert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, nacheinander mit 1 N Natriumhydroxid, Wasser und Salzlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Reinigung mit Flash-Chromatographie [SiO₂, Ethylacetate:Hexanen (1:9)] ergab die Titelverbindung (0.33 g, 66 % Ausbeute) als gelbes Öl. ¹HNMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 1.31 (9H, s), 7.25 (s, 1H), 7.51 (t, J = 7.6Hz, 1H), 7.58 (t, J = 7.5Hz, 1H), 7.74 (t, J = 8.5Hz, 2H) ppm; MS (FIA) 314.9 (M+H); R_t (Method A) 4.156 minutes.
Beispiel 6
[6-tert-Butyl-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)-pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazol[3,4-b]pyridin-3-yl)-Amin (I-3):
Eine Mischung von 4-Chlor-6-tert-butyl-2-(2-trifluoromethylphenyl)-pyrimidin (0.10 g, 0.32 mmol) und 1H-Pyrazolo[3,4-b] pyridin-3-ylamin (0.064 g, 0.48 mmol) wurde sanft auf 160-170°C für 16 Stunden erhitzt. Der erhaltene Rückstand wurde gekühlt, in N-methyl-pyrrolidinone (2 mL) gelöst, dann in Wasser (20 mL) und Natriumbicarbonat (5 mL) gegossen und zwei Mal mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden vier Mal mit Wasser, ein Mal mit Salzlösung gewaschen dann über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch präparative HPLC gereinigt um die Titelverbindung (0.007 g, 4 % Ausbeute) als gelben Feststoff zu erhalten. ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 13.2 (br s, 1H), 10.6 (br s, 1H), 8.49 (m, 2H), 7.84 (d, J = 7.8Hz, 2H), 7.76 (m, 2H), 7.68 (m, 1H), 7.12 (m, 1H), 1.32 (s, 9H) ppm; LC-MS 413.08 (M+H); R_t (Methode A) 3.112 Minuten.
Beispiel 7
6-Cyclopropyl-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on:

• (1-Cyclopropyl-vinyl)-dimethylamin: Zu einer Lösung von Cyclopropyl-Methylketon (19.8 mL, 200 mmol) in Pentan (600 mL) bei 0°C wurde unter Stickstoff Dimethylamine/Tetrahydrofuran (2M, 500 mL, 1000 mmol) zugesetzt, dann wurde eine Lösung von Titanium(IV)chlorid (12.1 mL, 110 mmol) in Pentan (60 mL) tropfenweise zugesetzt. Die Reaktion wurde für 0.5 Stunden bei 0°C dann für 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Celite gefiltert, mit Pentan und Ether gewaschen, in Vakuum mit einer Badtemperatur of 15-20°C konzentriert, dann über Nacht als orangefarbenes Öl bei –4°C gelagert.
• 2-Trifluoromethylbenzoyl isocyanat: Eine Lösung von 2-Trifluoromethylbenzamid (34.9 g, 185 mmol) in 1,2-Dichlorethan (600 mL), wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff mit Oxalylchlorid (20.2 mL, 230 mmol) in raschen Tropfen behandelt und die Reaktion wurde bei 70-80°C über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde zwei Mal mit Toluol azeotrop.destilliert.
• 6-Cyclopropyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-3-H-pyrimidin-4-on: Zu einer Lösung von (1-cyclopropyl-vinyl)-dimethylamin in Tetrahydrofuran (400 mL) wurde bei 0°C unter Stickstoff eine Lösung von 2-Trifluormethylbenzoylisocyanat in Tetrahydrofuran (50 mL), tropfenweise zugesetzt. Die Reaktion wurde für 0.5 Stunden gerührt, dann wurde Ammoniumacetat (78 g, 1000 mmol) und Essigsäure (400 mL) zugesetzt. Die Reaktionsmischumg wurde drei Stunden unter Rückfluss mit kontinuierlicher Entfernung von Tetrahydrofuran erhitzt, dann gekühlt und in Wasser (1.2 L) gegossen. Der entstandene Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser und Ether gewaschen, um 6-cyclopropyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on (28.79 g, 56 % Ausbeute) als weißen Feststoff zu erhalten, welcher eine Mischung aus der Titelverbindung und (2-Trifluormethyl-benzoyl)-harnstoff (91:9 durch HPLC) ist. ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12.7 (br s, 1H), 7.87 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.79 (m, 2H), 7.73 (d, J = 7.5Hz, 1H), 6.32 (s, 1H), 1.93 (m, 1H), 0.90 (m, 4H), [Harnstoff: 10.8 (br s, 1H), 7.45 (br s, 1H)] ppm; LC-MS 280.96 (M+H); R_t (Methode A) 2.961 Minuten (Titelverbindung), 2.313 Minuten (Harnstoffverunreinigungen).

Beispiel 8
4-Chloro-6-cyclopropyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-pyrimidin:
6-Cyclopropyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on (12.0 g, 42,8 mmol) in Phosphor (V)-oxidchlorid (40 mL, 428 mmol) wurde bei 75-80°C für 1 Stunde erhitzt. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt und drei Mal mit Toluol azeotrop destilliert. Der Rückstand wurde auf 0°C gekühlt, in Ethylacetat aufgenommen, mit Eissplitter und Wasser behandelt. Die Mischung wurde dann aufeinanderfolgend mit Natriumbikarbonat, Wasser und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Reinigung mit Flash-Chromatographie (SiO₂, 5:95 Ethylacetat:Hexane (5:95)] ergab die Titelverbindung (9.71 g, 76 % Ausbeute) als ein farbloses Öl. ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 1.12 (m, 2H), 1.30 (m, 2H). 2.02 (m, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.56 (t, J = 7.6Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.6Hz, 1H), 7.79 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 299.1/300.9 (M+H); R_t (Methode A) 3.882 Minuten.
Beispiel 9
[6-Cyclopropyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-pyrimidin-4-yl]-(1H-indazol-3-yl)-amin:
Eine Mischung von 4-chlor-6-cyclopropyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-pyrimidin (0.08 g, 0.27 mmol) und 1H-indazol-3-ylamin (0.036 g, 0.41 mmol) wurde sanft für 6 Stunden auf 160-170°C erhitzt. Der Rückstand wurde gekühlt und in N-methyl-pyrrolidinon (2 ml) gelöst, in Wasser (30 ml) und Natriumbicarbonate (5 ml) gegossen, danach filtriert, mit Wasser und Ether gwaschen. Die gesammelten Niederschläge und die Etherwaschung wurden kombiniert und konzentriert. Reinigung mit Flash-Chromatographie [SiO₂, Methanol:Dichloromethane (2:98)] ergab die Titelverbindung (0.017 g, 15 % Ausbeute) als ein blassgelber Feststoff.
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12.6 (br s, 1H), 10.2 (br s, 1H), 8.00 (d, J = 8.1Hz, 2H), 7.81 (d, J = 7.9Hz, 1H), 7.71 (m, 3H), 7.65 (t, J = 7.3Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.4Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.5Hz, 1H), 7.06 (t, J = 7.5Hz, 1H), 2.04 (m, 1H), 1.01 (m, 2H), 0.96 (m, 2H) ppm; LC-MS 396.10 (M+H); R_t (Methode A) 3.122 Minuten.
Beispiel 10
[6-Cyclopropyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-1):
Eine Mischung von 4-Chlor-6-cyclopropyl-2-(2-trifluormethylphenyl)-pyrimidin (7.00 g, 23.4 mmol, wir oben in Beispiel 8 beschrieben hergestellt) und 1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-ylamin (9.43 g, 70.3 mmol) in N-methylpyrrolidinon (50 ml) wurde auf 130°C für 12 Stunden erhitzt. Der Rückstand wurde gekühlt, in N-methylpyrrolidinon (2 ml) gelöst, in Wasser (500 mL) und Natriumbicarbonate (15 mL) gegossen, dann filtriert, mit Wasser gewaschen. Reinigung mit Flash-Chromatographie [SiO₂, Ethylacetat Hexane (35:65)] ergab die Titelverbindung (5.25 g, 57 % Ausbeute) als einen weißen Feststoff.
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 13.1 (br s, 1H), 10.5 (br s, 1H), 8.50 (m, 2H), 7.82 (d, J = 7.8Hz, 1H), 7.73 (m, 3H), 7.66 (t, J = 7.7Hz, 1H), 7.12 (m, 1H), 2.07 (m, 1H), 1.02 (m, 2H), 0.97 (m, 2H) ppm; LC-MS 397.22 (M+H); R_t (Methode A) 3.412 Minuten.
Beispiel 11
[6-Cyclopropyl-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)-pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazol[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin, Hydrochloridesalz:
Das HCl-Salz wurde durch Auflösung der Verbindung I-1 (8.42 g, 21.4 mmol) in 6N Salzsäure und Lyophilisierung hergestellt, um die Titelverbindung zu erhalten (9.242 g, 99 %) als ein gelber Feststoff. ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 13.3 (br s, 1H), 10.9 (br s, 1H), 8.53 (dd, J = 4.4, 1.4Hz, 1H), 8.48 (br d, J = 7.4Hz, 1H), 7.87 (d, J = 7.8Hz, 1H), 7.79 (m, 2H), 7.72 (t, J = 6.8Hz, 2H), 7.15 (m, 1H), 2.14 (m, 1H), 1.07 (m, 4H) ppm; MS (FIA) 397.3 (M+H), 395.2 (M-H), 431.2 (M-H+HCl); R_t (Methode A) 2.798 Minuten.
Beispiel 12
6-But-3-enyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on:
6-But-3-enyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on wurde wie oben in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, ausgenommen die Verwendung von 3-oxo-hept-6-ensäure-Ethylester. Die Reaktion ergab die Titelverbindung (2.545 g, 49 % Ausbeute) als ein cremefarbener Feststoff. ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.8 (s, 1H), 7.88 (d, 1H), 7.79 (t, 1H), 7.75 (t, 1H), 7.68 (d, 1H), 6.22 (s, 1H), 5.80 (m, 1H), 5.03 (dd, 1H), 4.98 (dd, 1H), 2.56 (t, 2H), 2.36 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 295.1 (M+H); R_t (Methode A) 3.160 Minuten.
Beispiel 13
4-But-3-enyl-6-chloro-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-pyrimidin:
Die Titelverbindung wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, ausgenommen die Verwendung von 6-but-3-enyl-2-(2-trifluormethylphenyl)-3H-pyrimidin-4-on um ein gelbes Öl zu erhalten (0.49 g, 99 % Ausbeute). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.72 (d, 1H), 7.67 (d, 1H), 7.57 (t, 1H), 7.51 (t, 1H), 7.13 (s, 1H), 5.77 (m, 1H), 4.98 (m, 2H), 2.84 (t, 2H), 2.49 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 313.0 (M+H); R_t (Methode A) 4.220 Minuten.
Beispiel 14
[6-But-3-enyl-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-7):
Die Titelverbindung wurde wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt, ausgenommen die Verwendung von 4-but-3-enyl-6-chlor-2-(2-trifluormethyl-phenyl)-pyrimidin um einen cremefarbenen Feststoff zu erhalten (2.712 g, 62 % Ausbeute). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.1 (s, 1H), 10.56 (s, 1H), 8.50 (m, 1H), 8.47 (d, 1H), 7.84 (d, 1H), 7.76 (t, 1H), 7.69 (m, 3H), 7.13 (m, 1H), 5.86 (m, 1H), 5.06 (dd, 1H), 4.98 (dd, 1H), 2.76 (t, 2H), 2.46 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 411.2 (M+H); R_t (Methode A) 3.019 Minuten.
Beispiel 15
[6-(3-Morpholin-4-yl-propyl)-2-(2-trifluormethyl-phenyl)pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin:
Eine Lösung von [6-but-3-enyl-2-(2-trifluormethylphenyl)-pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (0.10 g, 0.25 mmol) in Methanol (5 mL) und Tetrahydrofuran (5 mL) wurde bei –78°C mit Ozon für 5 Minuten durchperlt. Zu dieser Mischung wurde Morpholin (0.05 mL, 0.56 mmol) und Natriumtriacetoxyborhydrid (0.39 g, 1.85 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt, wenn zusätzliches Morpholin (0.10 mL, 1.28 mmol) und Natriumtriacetoxyborohydride (0.39 g. 1.85 mmol) zugesetzt wurde, dann wurde das Rühren weitere zwei Stunden fortgesetzt. Die Reaktion wurden mit Natriumbikarbonat abgelösct und abgedampft. Reinigung mit Flash-Chromatographie (SiO₂, eluiert mit 1:9 Methanol:Dichloromethan), gefolgt von präparativer HPLC ergab die Titelverbindung als ein hellgelbes Lyophilisat (0.068 g, 38 % Ausbeute). 484.3 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 9.60 (br s, 1H), 8.52 (m, 1H), 8.47 (d, 1H), 7.86 (d, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.14 (m, 1H), 3.97 (br m, 2H), 3.61 (br m, 2H), 3.44 (br m, 2H), 3.18 (br m, 2H), 3.05 (br m, 2H), 2.78 (t, 2H), 2.08 (m, 2H) ppm.
Beispiel 16
Die folgenden Verbindungen wurden durch Verfahren hergestellt, die im wesentlichen den in den Beispielen 1-15 beschriebenen, die Allgemeinen Schemata, ähnlich sind, und durch Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
[6-(3-Piperidin-1-yl-propyl)-2-(2-trifluormethyl-phenyl)pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-9):

482.2(M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (S, 1H), 9.04 (br s, 1H), 8.52 (m, 1H), 8.47 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.78 (m, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.14 (m, 1H), 3.42 (m, 2H), 3.10 (m, 2H), 2.85 (m, 2H), 2.77 (t, 2H), 2.09 (m, 2H), 1.79 (m, 2H), 1.61 (m, 3H), 1.35 (m, 1H) ppm.

[6-(3-Diethylamino-propyl)-2-(2-trifluormethyl-phenyl)pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-10):

470 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 9.07 (s, 1H), 8.50 (m, 1H), 7.85 (m, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.76 (m, 1H), 7.71 (m, 2H), 7.14 (m, 1H), 3.11 (m, 6H), 2.80 (t, 2H), 2.05 (m, 2H), 1.15 (t, 6H) ppm.

[6-(3-(4-Methyl-piperazin-1-yl)-propyl)-2-(2-trifluormethyl-phenyl)pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-11):

497.2 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 8.52 (m, 1H), 8.47 (m, 2H), 7.85 (d, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.72 (m, 3H), 7.14 (m, 1H), 3.0-3.7 (br, 10H), 2.83 (s, 3H), 2.77 (t, 2H), 2.05 (m, 2H) ppm.

[6-(3-Piperazin-1-yl-propyl)-2-(2-trifluormethyl-phenyl)pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-12):

483.3 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 9.06 (br s, 2H), 8.52 (m, 1H), 8.47 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.14 (m, 1H), 3.34 (br m, 8H), 3.15 (br m, 2H), 2.77 (t, 2H), 2.06 (m, 2H) ppm.

[6-(3-Dimethylamino-propyl)-2-(2-trifluormethyl-phenyl)pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-13):

442.1 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 9.40 (br s, 1H), 8.52 (m, 1H), 8.47 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.78 (m, 1H), 7.71 (m, 2H), 7.14 (m, 1H), 3.12 (m, 2H), 2.77 (m, 8H), 2.06 (m, 2H) ppm.

N,N-Dimethyl-N'-{3-[6-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl-amino)-2-(2-trifluorometliyl-phenyl)-pyrimidin-4-yl]-propyl}-ethan-1,2-diamin (I-14):

485.3 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 9.7 (br, 1H), 8.8 (br s, 1H), 8.52 (m, 1H), 8.48 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.71 (m, 2H) 7.14 (m, 1H), 3.32 (s, 4H), 3.07 (br m, 2H), 2.84 (s, 6H), 2.80 (m, 2H), 2.04 (m, 2H) ppm.

[6-(3-Methylamino-propyl)-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-15):

428.1 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 8.51 (m, 1H), 8.48 (d, 1H), 8.37 (br s, 2H), 7.85 (d, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.14 (m, 1H), 2.97 (m, 2H), 2.78 (t, 2H), 2.55 (m, 3H), 2.01 (m, 2H) ppm.

2-{3-[6-(1H-Pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-ylamino)-2-(2-trifluoromethyl-phenyl)pyrimidinyl]propylamino}-ethanol (I-16):

458.2 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 8.52 (m, 1H), 8.47 (m, 2H), 7.85 (d, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.69 (m, 2H), 7.14 (m, 1H), 3.62 (t, 2H), 2.99 (m, 4H), 2.78 (t, 2H), 2.04 (m, 2H) ppm.

[6-(3-(2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-propyl)-2-(2-trifluoromethylphenyl)pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-17):

527.2 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 8.76 (br s, 2H), 8.52 (m, 1H), 8.48 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.78 (m, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.14 (m, 1H), 3.81 (br s, 4H), 3.1-3.3 (br m, 8H), 3.06 (t, 2H), 2.80 (t, 2H), 2.05 (t, 2H) ppm.

[6-{3-[Methyl-(2-morpholin-4-yl-ethyl)-amino]-propyl}-2-(2-trifluormethylphenyl)pyrimidin-4-yl]-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-yl)-amin (I-18):

541.2 (M+H). ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (s, 1H), 10.7 (s, 1H), 8.52 (m, 1H), 8.47 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.78 (m, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.14 (m, 1H), 3.73 (brs, 4H), 3.39 (m, 2H), 3.21 (m, 2H), 2.8-3.3 (br m, 6H) 2.81 (s, 3H), 2.78 (t, 2H), 2.09 (m, 2H) ppm.

Beispiel 17
K_i Bestimmung für die Inhibierung von GSK-3
Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit, die GSK-3β (AA 1-420) Aktivität zu inhibieren, unter Verwendung eines Standard gekoppelten Enzymsystems durchsucht (Fox et al. (1998) Protein Sci. 7, 2249). Die Reaktionen wurden in einer Lösung durchgeführt, die 100 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 25 mM NaCl, 300 μM NADH, 1 mM DTT und 1.5 % DMSO enthält. Die Substrat-Endkonzentrationen in der Untersuchung waren 20 μM ATP (Sigma Chemicals, St Louis, MO) und 300 μM Peptid (HSSPHQS(PO₃H₂)EDEEE, American Peptide, Sunnyvale, CA). Die Reaktionen wurden bei 30°C und 20 nM GSK-3β durchgeführt. Die Endkonzentrationen der Komponenten des gekoppelten Enzymsystems waren 2,5 mM Phosphoenolpyruvat, 300 μM NADH, 30 μg/ml Pyruvatkinase und 10 μg/ml Lactatdehydrogenase.
Eine Untersuchungs-Stammpufferlösung wurde hergestellt, die alle der oben aufgelisteten Reagenzien enthielt, mit Ausnahme von ATP und der interessierenden Testverbindung. Die Untersuchungs-Stammpufferlösung (175 μl) wurde in einer 96 Kammerplatte mit 5 ul der interessierenden Testverbindung bei einer Endkonzentration im Bereich von 0,002μM bis 30 μM bei 30°C für 10 min inkubiert. Üblicherweise wird eine 12 Punkt-Titration durchgeführt, indem serielle Verdünnungen (aus 10 mM Verbindungsstammlösung) der Testverbindungen mit DMSO in Tochterplatten hergestellt werden. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 20 μl ATP (Endkonzentration von 20 μM) ausgelöst. Die Reaktionsraten wurde mittels eines Molecular Devices Spectramax Plattenlesers (Sunnyvale, CA) über 10 min bei 30°C erhalten. Die K_i Werte wurden aus den Ratendaten als eine Funktion der Inhibitorkonzentration bestimmt.
Von den Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass sie einen K_i Wert von weniger als 100 nM unter Verwendung der oben beschriebenen Versuchsanordnung ergaben.
Beispiel 18
Bestimmung der prozentuellen Neuroprotektion.
Wie hierin verwendet bestimmt der Ausdruck „Prozent-Protektion" den Prozentsatz von neuronalen Zellen, die gegen ischämische Verletzung (OGD) geschützt sind und wird wie folgt berechnet: % Protektion = (test-OGD)/(normal-OGD)·100
Dieses Protokoll beschreibt die Vorgehensweise, die eingesetzt wird, um experimentelle Ischämie durch Anoxia-Reoxygenisierung in kultivierten hippokampalen neuronalen Zellen hervorzurufen. Die neuroprotektive Wirkung der Testsubstanzen wird gegen ischämischinduzierten neuronalen Zelleverletzungen und Zelltod ermittelt.
Die folgenden Schritte wurden vor dem Tag des Versuches ausgeführt:
Aus LoG-Neurobasalen [LoG-Neurobasal enthält NoG-Neurobasal Medium (Invitrogen Corp, kundenspezifische Anordnung) plus 0,5 mM Glucose, 0,5 mM L-Glutamin und 0,25x Penicillin/Streptomycin] wurde in einer hypoxischen Kammer über Nacht vorequilibriert.
Das LoG-Neurobasal wurde in einem normalen Inkubator (5 % CO₂) über Nacht vorequilibriert.
In den normalen Inkubator (5 % CO₂), Neurobasal/B27AO [Neurobasal/B27AO enthält Neurobasal Medium (Invitrogen Corp Cat # 21103-049) mit 2x B27 minus AO Ergänzung (Invitrogen Corp Cat # 10889-038), 0,5 mM L-Glutamin und 0,25x Penicillin/Streptomycin] wurde über Nacht vorequilibriert.
Die folgenden Schritte wurden am Tag der Untersuchung ausgeführt:
LoG-Neurobasal Medium wurde aus der hypoxischen Kammer entfernt, und das Medium wurde schwach mit 100 % Stickstoff für 30 Minuten durch perlt, um komplett zu deoxygenieren.
Das Neurobasal/B27mKulturmedium [Neurobasal/B27m enthält Neurobasal Medium mit 2x B27 Ergänzung (Invitrogen Corp Cat # 17504-044) und 0,5 mM L-Glutamin] wurde von der Zellen in jeder 12-Kammer-Platte unter Verwendung einer Vakuumpumpe mit einer angebrachten sterilen Glaspastuerpipette abgesaugt.
Die Platte wurde einmal mit 2 ml von glucosefreiem BSS₀ (pH 7,4), gewaschen, welches aus dem folgenden hergestellt wird: 143,6 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgSO₄, 1 mM NaH₂Po₄, 26,2 mM NaHCO₃, 10 mg/l Phenolrot und 0,25 × P/S.
Die Neuronen (10-11 Tage von der urprünglichen Kultur) wurden mit deoxygenierten LoG-Neurobasal (1 ml pro Kammer für jede Kammer einer 12-Kammer-Platte) aufgefüllt. Diese neuronalen Zellen wurden gemäß Park LC, Calingasan NY, Uchida K, Zhang H, Gibson GE. (2000) „Metabolic impairment elicits brain cell type-selective changes in oxidative stress and cell death in culture." J Neurochem 74(1):114-124 hergestellt.
Die Testverbindungen wurden direkt in jeder Kammer zugesetzt (3 Konzentrationen in den Verbindungen plus positive Kontrolle jedes Dreifach). Die Verbindungen sind in 100 % DMSO aufgelöst, wobei die Konzentrationen von DMSO niemals 0,5 % überschritten haben und dann wurden die Platten in der hypoxischen Kammer für 5 Stunden, mit dem Plattendeckel halb offen, platziert.
Für Normoxia-Kontrollen, wurde vorher equilibriert normoxisches LoG-Neurobasal Medium jeder Kammer zugesetzt und die Platten wurden im normalen Kulturinkubator für vier Stunden eingesetzt.
Nach 4 Stunden der Hypoxie wurden die bestehenden Medien sorgfältig abgesaugt und 2 mL von neu oxygenierten (vorequilibrierten) Neurobasal/B27AO wurde jeder Kammer zugesetzt. Reoxygeniertes Medium wurde erziehlt durch platzieren des Mediums in einem Kulturinkubator (5 % CO₂/95 % O₂) bevor es verwendet wird.
Die selben Testverbindungen mit den gleichen Konzentrationen wurden in die korrespondierenden Kammern zurückgegeben und die Platten wurden in den Zellinkubator (5 % CO₂/95 % O₂) platziert und für 20 bis 24 Stunden reoxygeniert. Nach der Reoxygenisation für 20 bis 24 Stunden wurde die Anzahl von lebenden Neuronen gezählt unter Verwendung der unten beschriebenen grünen Fluoreszenz für Zellaufspürung.
Das bestehende Kulturmedium wurde von jeder Kammer der 12-Kammer-Platten abgesaugt und die Neuronen wurden einmal mit 2 ml HBSS (pH 7,4, Invitrogen Corp, Cat # 14170-112) das auf das 30 bis 37°C vorgewärmt war, gewaschen.
Zu jeder Kammer-Platte wurde 1 ml von 2,5 μM Zellauffinder Green (Cell Tracker Green) ((Molecular Probes Cat # 2925) und 5 μM Hoechst 33342 Fluoreszenz-Farbstoffe in HBSS gelöst, zugesetzt. Die Platten wurden dann bei Raumtemperatur im Dunklen 12 Minuten platziert und dann wurden die Neuronen zweimal mit 2 ml HBSS gewaschen. 1 ml HBSS wurde jeder Kammer zugesetzt und die Zahlen der lebenden und toten fluoreszierenden Zellen wurden mittels eines automatisierten Herstellungsverfahrens der Marke Cellomics^® gezählt.
Es wurde gefunden, dass die Zusammensetzung von der vorliegenden Erfindung einen % von ≥ 30 % besitzen.
Beispiel 19
Mittelzerebrales Arterienokklusionsmodell (MCAO)
Die in dieser Studie verwendeten Tiere waren Sprague-Dawley Ratten die zwischen 210 und 333 g (Charles River, NC) wegen. Die Ratten wurden an die Tierumgebung für wenigstens eine Woche über einen 12-Stunden Licht/Dunkel Tageszyklus akklimatisieren gelassen. Sie hatten freien Zutritt zu Futter und Wasser.
Die intraluminalen arteriellen Okklusionsorgane die zum Blockieren des Ausgangs der mittleren Zerebralarterie (MCA) verwendet wurden, sind aus 4-0 nylon Monofilament Nähgut welche auf 25 mm lange Segmente geschnitten war, hergestellt sind. Die Spitzen des Nähgarns waren durch Hitzeexposition gerundet. Um die Wirksamkeit der Okklusionsorgane des Lumen der Arterie zu blockieren zu erhöhen, wurden sie mit einer 1 % Poly-L-Lysinsuspension überzogen und eine Stunde in einem Ofen bei 60°C getrocknet. Die Nähorgane wurden von Ethelon, Somerville, NJ. Chemical gekauft. Die chemischen Reagenzien die verwendet wurden sind die folgenden:

1. 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, oder TTC, Cat # T8877, LOT # 50K1435, und PEG400, Cat # P-3265, wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.
2. Das Phosphate-gepufferte Formalin, Cat # 245-685, wurde von Fisher Scientific Co., Middletown, VA erworben.
3. Das destillierte Wasser wurde im Haus hergestellt.
4. Das Ethanol, Cat # E702-3, wurde von Aldridge, Milwaukee, WI erworben.

Das intraluminale Strukturmodell der fokalen Zentralischämie wurde verwendet wie es im wesentlichen by Longa et al., Stroke, 20:84-91 (1989). Die linke externe Jugolarvene wurde für die Vehikel oder Verbindungsadministration mit einer Kanüle versehen.
Um den Ratten zu helfen ihre Hydration während des Studiums aufrecht zu erhalten, wurden 5 % Dextrose im Wasser und laktatierte Ringers Lösung (5 ml jeweils) subkutan in jede Flanke bei 10, 24 und 48 Stunden nach der MCAO injiziert.
Die Ratten, die den anfänglichen Okklusionskriterien entsprochen haben (neurologische Treffer von 2 und Körpertemperatur von > 38,5°C) wurden zufallsmäßig durch sequentielle Zuordnung zur Vehikel oder zur Verbindungsbehandlungsgruppe verteilt. Die ursprüngliche tägliche Zuordnung der Ratten zu einer bestimmten Gruppe wurden jeden Tag geändert.
Die Behandlung mit der Verbindung oder dem Vehikel wurde mit einer Bolusinjektion intravenös 6 Stunden nach MCAO begonnen und für die nächsten 18 Stunden durch konstante Infusion unter Verwendung einer Infu Disk Pumpe fortgesetzt. Die Ratten wurden kurzzeitig anästhesiert und der Jugolarkatheter wurde durch einen dorsalen Nackeneinschnitt freigelegt. Die Bolusdosis des Vehikels wurde verabreicht und die Infusionspumpe wurde 5 Minuten später aktiviert. Die Infusionspumpen wurden am Rücken der Ratte durch ein Jackett befestigt.
Die Verbindungslösung wurde täglich frisch bereitet, unter Verwendung einer Vehikel von Wasser: PEG400:Ethanol im Volumen 5:4:1 hergestellt. Die Gruppen und die Dosen, die in diesem Modell verwendet wurden, sind in Tabelle 2 untenstehend angeführt.
Tabelle 2. Verbindungsdosierung für t-MCAO Modell
Das Volumen des Infarkts wurde durch Bildanalyse von 7 nacheinanderfolgenden 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) angeschlossen gefärbten Abschnitten bestimmt, unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens wie es von Bederson et al. (1968) beschrieben wurde. Drei Tage nach dem MCAO wurden die Ratten durch CO₂ Erstickung getötet und enthauptet. Die Gehirne wurden rasch aus dem Kalvarium entfernt und in individuelle PBS enthaltende Becher in einem Eisbad für 30 Minuten platziert. Die koronalen Hirnsektionen, 2 mm dick, wurden unter Verwendung einer Gehirnmatrixschneiders erhalten. Die Gehirnschnitte wurde in markierten Petri-Schalen platziert, welche 2 % TTC in PBS enthielten, für 20 Minuten bei 37°C eingelegt. TTC-Farbstoffe färben lebensfähiges Gehirngewebe rot, wogegen die ischämien Bereiche weiß gelassen wurden. Die Gehirnschnitte wurden dann in 10 % neutralen gepufferten Formalin für wenigstens 24 Stunden für 4°C gebraucht. Alle Schnitte wurden innerhalb von drei Tagen nach der Tötung abgebildet.
Formalin-fixierte TTC-gefärbte Gehirnsektionen (7 aufeinander folgende Sektionen) wurden digital erfasst unter Verwendung der Adobe Photoshop Software und einer Digitalkamera. Die Bilder wurden in das IPLab Bildanalysierprogramm importiert. Die Bereiche von kortikalen Infarkten (weiße Bereiche) wurden aufgezeichnet und gemessen. Das Infarktvolumen wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Infarktvolumen = Σ Infarktbereich × 2 (die Entfernung zwischen jedem Abschnitt)
Die gesamten Volumina der ipsilateralen und kontralateralen Hemisphären wurden ähnlich bestimmt.
Das Volumen des Ödems wurde durch Subtraktion des kontralateralen hemisphärischen Volumens von den Volumen des ipsilateralen hemisphärischen Volumens abgezogen. Die Analysen wurden von einem Wissenschaftler ausgeführt, der bezüglich der Behandlung der Ratten uninformiert war.
De neurologische Funktion der Ratten wurde nach 2, 24, 48, 72 Stunden nach MCAO evaluiert und zwar unter der Verwendung eines Bewertungssystems das von Bederson et al. (1986b) beschrieben ist. Die Treffer rangierten von 0 bis 3 wobei 0 normal und 3 schwere Defizite angab.
Ein neurologischer Treffer verteilt 2 Stunden von Ischämie wurde als Kriterium verwendet, in der Studie aufgenommen zu werden. Wenn eine Ratte nicht einen neurologischen Treffer von wenigstens 2, oder wenn sie einen Treffer von 3 hatte, wurde sie von der Studie ausgeschlossen. Ein Forscher, der in Bezug auf die Behandlung der Gruppe der Ratten uninformiert war, führte die neurologischen Evaluierungen aus.
Blutproben (~0,5 mL) wurden von den Ratten für pharmakokinetische Analysen nach 5 Minuten und nach 4, 22, 46 und 70 Stunden nach der Bolusinjektion erhalten. Die Ratten wurden leicht anästhesiert mit Isofluran. Blut wurde in heparinisierte Blutsammelröhrchen (0,6 mL Fassungsvermögen) von einer seitlichen Schwanzvene gesammelt und zwar unter Verwendung eines 23-Gauge-Flügelkanüleninfusionssets. Die Blutproben wurden 4 Minuten (Einstellung 10) in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Das Plasma wurde entfernt, in gekennzeichnete Röhrchen gegeben und bei –20°C in einem Gefrierschrank gelagert.
Zweiundsiebzig Stunden nach MCAO wurden die Ratten durch CO₂-Inhalieren tief anästhesiert und es wurde soviel Blut wie möglich durch Herzpunktur entnommen. Das Blut wurde in heparinisierte Blutsammelröhrchen (6 mL Fassungsvermögen) gegeben. Das Plasma wurde von dem Blut durch Zentrifugierung bei 4000 rpm für 5 Minten (Allegra R6,) zentrifugiert. Das Plasma wurde gesammelt, in markierte Plastikröhrchen gegeben und bei minus 20°C in einem Gefrierschrank bei –20°C gelagert.
Die statistischen Analysen bezüglich der Infarktgröße, Plasmaglucose, Körpertemperatur und Körpergewicht zwischen den Vehikelgruppen und der Behandlungsgruppen wurden durch zweiseitige Student's-Tests durchgeführt. Die statistische Analyse von neurologischen Treffern wurde durch nicht-parametrisierte Analysen ausgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM [mittlere Standardabweichung] wiedergegeben.
Die Behandlung mit einer Verbindung der Formel I, die 6 Stunden nach MCAO verabreicht wurde, war sehr wirksam bei der Reduzierung des Infarktvolumens in diesem Modell eines vorübergehenden fokalen Schlages (1). Die Ratten in der mit der Verbindung behandelten Gruppe (88 ± 31 mm³) hatten wie eine hoch-signifikante 79 % Reduktion des totalen Infarktvolumens im Vergleich zur Vehikelkontrollgruppe (418 ±31 mm³, p < 0,0001). Der kortikale ischämische Schaden in der mit der Verbindung behandelten Gruppe (32 ± 20 mm³) war ebenfalls deutlich reduziert um 88 % im Vergleich zur Vehikelkontrollgruppe (272 ± 22 mm³, p < 0,0001). Die Behandlung mit einer Verbindung der Formel I (55 ± 12 mm³) war in der Lage die striatalen ischämischen Schäden signifikant um 62 % zu reduzieren, im Vergleich mit der Vehikelkontrollgruppe (146 ± 13 mm³, p < 0,0001). Schließlich reduzierte die Behandlung mit einer Verbindung der Formel I (21 ± 10 mm³) die Menge von Ödembildung um 79 % im Vergleich zur Vehikelkontrollgruppe (97 ± 10 mm³, p < 0,0001).
Die mit einer Verbindung der Formel I behandelten Ratten zeigten eine deutliche Verbesserung ihrer neurologischen Funktion über den Zeitverlauf des Experiments (2). Schon 18 Stunden nach dem Beginn der Dorisierung wurde eine deutliche Verbesserung der neurologischen Funktion in der mit der Verbindung behandelten Gruppe beobachtet im Vergleich zur Vehikelkontrollgruppe (1,3 ± 0,3 bzw. 2 ± 0 Einheiten, p < 0,01). Der neurologische Treffer der mit der Verbindung behandelten Ratten blieben weiter erfolgreich, sodass nach 72 Stunden nach MCAO diese Ratten in der Lage waren, mit nur kleinen oder nicht wahrnehmbaren Mängeln zu funktionieren. Im Gegensatz dazu zeigten die Vehikelbehandelten Ratten keine Verbesserung der neurologischen Funktion während des Zeitablaufs des Experiments.
Beispiel 20
Tiermodell für antidepressiven Wirkstoff
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden auf ihre antidepressive Wirkung in Ratten durch Verfahren, die im Wesentlichen jenen ähnlich sind, wie in Porsolt, R.D., et al., 1997, 229:327-336: Bourin M. Fundam Clin Pharmacol 1990; 4:49-64 beschrieben, untersucht.
Schwimmtest bei Ratten (Depressionstest)
Ratten wurden in einem transparenten, mit Wasser gefüllten Zylinder gegeben. Die Dauer der Immobilität (= Immobilitätszeit), die als jene Zeit definiert ist, innerhalb welcher die Ratten nur jene minimalen Körperbewegungen ausführen, um den Kopf über Wasser zu halten, wird manuell aufgezeichnet. In einem zweiten Versuch, am vierten Tag, wurden die Ratten erneut in den Zylinder gegeben und zwar diesmal für 5 Minuten. Die Immobilitätszeit wurde manuell während des gesamten Versuches aufgezeichnet.
Versuch I (Anfangsversuch):
Am ersten Tag wurden männliche Wistar-Ratten (RA239 Stamm; 160-180g) wurden für 15 Minuten in einen Zylinder gegeben. Die Dauer der Immobilität (= Immobilitätszeit) welche als Zeit definiert ist, innerhalb welcher die Ratten nur solche minimalen Körperbewegungen ausführen, dass der Kopf über Wasser gehalten wird, wird manuell aufgezeichnet. Um eine vernünftige Zahl von Tieren innerhalb eines Tages zu testen, sind die Aufzeichnungen auf die folgenden drei Subperioden innerhalb des ersten 15-minütigen Versuches beschränkt: 0-2,5 min. (das ist am Beginn des Versuches), 6,25-8,75 Minuten (exakt in der Mitte des Versuches) und 12,5-15 Minuten (ganz am Ende des Versuches). Es wurde schon früher gefunden, dass dieses Verfahren die tierische Leistung, die über den gesamten Versuch wiedergegeben ist, repräsentiert.
Versuch II (Zweiter Versuch):
Am 4 Tag wurden die Ratten wieder in den Zylinder, diesmal für 5 Minuten gegeben. Die Immobilitätszeit ist händisch über den gesamten Versuch aufgezeichnet worden.
Die Behandlungen mit der Verbindung wurden in 0,5 % Methylzellulose (Methocel) suspendiert und oral verabreicht (5 ml/kg). Die Wirkstoffverabreichungen waren am Abend (etwa 16 Uhr) des Tages 1 (der Tag des Versuches I), am Morgen (etwa 08:00) und am Abend von Tag 2 und 3 und exakt 1 Stunde vor Versuch II (am Tag 4). Die Behandlungen von zwei Ratten innerhalb eines Paares waren gleich oder unterschiedlich abhängig von der Randomisierung für die Ausführung in Versuch I. Gruppen von Ratten, mit Methocel oder 15 mg/kg p.o. Despiramin (DMI) behandelt würden, dienten als Kontrollgruppe bzw. positiver Standard.
Es wurde gefunden, dass die Verbindungen dieser Erfindung in dem obigen Modell anitdepressive Aktivität zeigen.
Beispiel 21
Tiermodell von Schizophrenie: Pre-Puls-Inhibition von Erschrecken (PPI)
Beeinträchtigung von Sensorimotor-Gating in Verbindung mit Unterbrechung in der Aufinerksamkeit und in dem Erkennen ist unter schizophrenen Patienten üblich. Pre-Puls-Inhibierung von Erschrecken (PPI) ist bei schizophrenen Patienten beeinträchtig. Pre-Puls-Inhibierung fällt auf, wenn ein schwacher Laut, welcher dem lauten akustischen Stimulus vorangeht, den Schreck-Reflex inhibiert. PPI ist als Test bekannt, welcher eine gute voraussagende, Gesichts- und Konstruktionsvalidität für Schizophrenie ergibt.
Eine positive Kontrolle, Clozapin, ist ein im Handel erhältlicher, anti-pychotischer Wirkstoff (Clozaril^®). Clozapin hat eine hohe Affinität zu D4 Dopamin & 5-HT2 Rezeptoren und verstärkt wirksam die PPI Reaktion in Tiermodellen.
Der PPI Versuch wurde in folgender Weise, durch Verfahren, die im wesentlichen jenen ähnlich sind, die von Spooren et al., Anxiolytic-like effects of the prototypical metabotropic glutamate receptor 5 antagonist 2-methyl-6(phenylethynyl)Pyridine in rodents. J Pharmacol Exp Ther. 295:1267-1275 (2000) beschrieben ist, ausgeführt.
Männliche C57BL/6 (20-30 g) wurden in Gruppen von Vier in Makrokolonkäfigen (42 × 26 × 15 cm) für wenigstens 3 Tage vor dem Experiment aufgenommen. Die Käfigumgebung wurde temperatur- und feuchtigkeitskontrolliert und mit einer künstlichen Beleuchtung (6:00 AM bis 6: 00 PM Licht an) ausgestattet. Die Tiere hatten Zugang zu Wasser und Nahrung nach Belieben. Alle Tiere waren experimentell unerfahren.
Die in dem Verfahren eingesetzten Tiere wurden mit der Testsubstanz (30, 60, 100 mg/kg), Clozapin (30 mg/kg), eine positive Kontrolle, oder einen Vehikel (0,5 % Methylzellulose) vorbehandelt. Nach 45 Minuten wurden die Mäuse individuell in die Starterkammern mit einem weißen Hintergrundrauschen von 70 dB platziert und 10 Minuten ungestört belassen. Danach folgte eine 15-minütige Session bestehend aus 56 Versuchen. Der Schreck-Stimulus war ein 40 ms-120 dB-weißes rauschen-Geräusch, Prä-Pulse waren 20 ms-weißes-rauschen Geräusch von 72, 74, und 78 dB, die dem Erschrecken um 100 ms vorausgehen.
Acht Typen von Versuchen wurden angewandt. Präpuls plus Erschrecken (7 Versuche je Präpulsintensität), Präpuls allein (7 Versuche je Präpulsintenstität), Erschrecken allein (7 Versuche) und keine Stimmulierung (7 Versuche). Die variablen Intervalle zwischen den Untersuchungen lagen im Durchschnitt bei 15 Sekunden (zwischen 10 und 20 s). In den nicht-stimmulierenden Versuchen wurden Basislinienmessungen durchgeführt. In den nur Erschrecken-Versuchen wurde die grundlegende Audio-Schreckamplitude (g) gemessen und in den Präpuls-plus Schreckversuchen wurden die Mengen von Inhibierung von normalem Erschrecken gemessen und als Prozentsatz des Basiserschreckens wiedergegeben. In den alleinigen Präpulsversuchen, wurde die normale Reaktion auf zwei schwache Laute als Kontrolle gemessen. Präpulsinhibierung wurde entsprechend der Formel, %PPI = 100 – 100 × [(PA2 PPP)/PA2] berechnet. Es wurde gefunden, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung PPI der akustischen Schreckreflexe in Mäuse verstärken.
Beispiel 22
Tiermodell für anxiolytische Wirkstoffe.
Der anxiolytische Versuch wurde in der folgenden Weise ausgeführt, durch Verfahren, die im Wesen jenen ähnlich sind, die von Spooren et al., Anxiolytic-like effects of the prototypical metabotropic glutamate receptor 5 antagonist 2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine in rodents. J Pharmacol Exp Ther. 295: 1267-1275 (2000) und Lecci A, Borsini F, Volterra G und Meli A, Pharmacological validation of a novel animal model of anticipatory anxiety in mice.
Psychopharmacology 101:255-261 (1990).
I. Stress-induzierte Hyperthermie:
Das Testverfahren für Stress-induzierte Hyperthermie (SIH) wurde mit geringen Modifikationen von der Originalbeschreibung von Lecci, et al. (1990) übernommen. Die Rektaltemperatur wurde auf maximal 0,1°C Nährung gemessen, durch ein Thermometer (ELLAB Instruments, Copenhagen, Denmark) über eine gleitend gemachte Thermistorsonde (2-mm Durchmesser), welche 20 mm in das Rektum eingeführt wurde, während die Maus mit der Hand an der Nähe der Schwanzbasis gehalten wurde. Die Sonde wurde an Ort und Stelle gelassen, bis eine konstante Ablesung (innerhalb von 15 Sekunden) erhalten wurde.
Fünfzehn Tiere wurden in einem Makrolonkäfig (42 × 26 × 15 cm) gehalten. Spätestens 24 Stunden vor dem Experiment wurden die Tiere innerhalb des Käfigs an ihrem Pelz mit einer Farbe für spätere Identifikation markiert. Sechzig Minuten vor Entnahme der Rektaltemperatur wurden alle Lebewesen innerhalb eines gegebenen Käfigs nacheinander mit 1-Minuten-Intervallen mit der Testverbindung (Dosis: 1,3, 10 oder 30 mg/kg, p.o.; Injektionsvolumen: 10 ml/kg, Chlordiazepien-HCl (10 mg/kg, p.o.; Research Biochemicals International); als Posititvkontrollen oder mit einem Vehikel (0,5 % Methylzellulose; Animed) behandelt. Genau 30 Minuten später wurden die Mäuse nacheinander aus dem Käfig entnommen (wieder in 1- Minuten-Intervalle) und die Rektaltemperatur wurde bestimmt und aufgezeichnet. Sobald die Temperatur aufgezeichnet war, wurden die Tiere in unterschiedliche (nebeneinander liegende) Käfige gegeben. Die anhängige Variable, das ist die Stress-induzierte Hyperthermie, wurde als Differenz der mittleren Rektaltemperatur innerhalb der sechs abhängig entfernten Mäuse und der mittleren Rektaltemperatur innerhalb der sechs als letzte innerhalb des Käfigs entnommenen Mäuse definiert. Diese Differenz wurde von sechs bis acht Käfige berechnet, anfänglich von den spezifischen Behandlungsgruppen, wobei in der endgültigen Wiedergabe die Mittelwerte von diesen sechs bis acht Werten verwendet wurden. Die Rektaltemperatur von dem allerersten Tier wurde zusätzlich verwendet, um die potentielle Wirkung der Verbindung auf die Basaltemperatur als solche zu bestimmen.
II. Sozialer Erkundungstest in Ratten:
Männliche erwachsene Sprague-Dawley Ratten (= „ansässige" Ratten; 350-400 g) und junge Lister Hooded Ratten (= "eindringende" Ratten; 100-120 g) wurden verwendet. Die eindringenden Ratten wurden paarweise gehalten und die ansässigen Ratten wurden einzeln in Makrolonkäfige (42 × 26 × 15 cm) für zwei Wochen vor dem Test gehalten. Alle Tiere wurden in den gleichen Raum gehalten. Die Haltungsumgebung wurde tmperatur- und feuchtigkeitskontrolliert und war mit einer künstlichen Beleuchtung (6:00 AM bis 6:00 PM, Licht an) ausgerüstet. Die Tiere hatten zu Wasser und Nahrungsmittel Zugang ad libitum. Alle Ratten waren experimentell unerfahren.
Die Tiere erhielten Testverbindungen (Dosis 0,3, 3, 10 oder 30 mg/kg), Chlordiazepoxid-HCl (5 mg/kg, p.o.; CDZ, Research Biochemicals International, Natick, MA) LiCl (10, 30 mg/kg) als Referenz/positive Verbindungen oder Vehikel (0,5 % Methylcellulose). Das Injektionsvolumen war 2 ml/kg. Die orale Behandlung wurde nur an die eindringenden Ratten verabreicht, und der Test wurde 1 Stunde nach der Verbindungsverabreichung durchgeführt. Alle Beobachtungen wurden während der Lichtphase (8:00 AM bis 1:00 PM) in eigenen Käfig der ansässigen Ratten (siehe oben) ausgeführt. Der Boden des Käfigs war mit Sägespänen bedeckt. Paare bestehend aus einer eindringenden Ratte und einer ansässigen Ratte wurden auf Zufallsbasis zusammengegeben und auf die experimentelle oder die Kontrollgruppen verteilt. Die Dauer des aktiven Annäherungsverhaltens (ist die Zeit, die in sozialer Aktivität verbracht wurde) der eindringenden Ratten (schnüffeln, anogenitaler Untersuchung, Nasenabtastung, putzen, lecken, spielen) im Bezug auf die ansässigen Ratten war manuell bewertet und kumulativ über einen Zeitraum von 5 Minuten aufgezeigt.
III. Erhöhter-Plus-Labyrinth Test
Männliche Erwachsene Spraque-Dawley Ratten (180-220g) wurden in Vierergruppen in Makrolonkäfige (42 × 26 × 15 cm) für wenigstens 3 Tage vor dem Experiment gehalten. Die Haltungsumgebung war temperatur- und feuchtigkeitskontrolliert und mit einer künstlichen Beleuchtung (6:00 AM bis 6:00 PM, Licht an) ausgerüstet. Die Tiere hatten Zugang zu Wasser und Nahrung ad libitum. Alle Tiere waren experimentell unerfahren.
Das erhöhte Plus-Labyrinth besteht aus zwei offenen Armen (40 × 12 cm) und zwei geschlossenen Armen (40 × 12 × 20 cm), welche sich alle von einer gemeinsamen zentralen Plattform aus (12 × 12 cm) erstrecken. Die Anordnung bildet die Form eines Pluszeichens bei welchem ähnliche Arme einander gegenüberliegend angeordnet sind und der Apparat ist 60 cm über dem Boden auf einer zentralen Säule angeordnet. Das Labyrinth ist grauem Plexiglas gefertigt. Die Griffigkeit auf den offenen Armen ist durch Einschluss von kleinen erhöhten Kanten (0,25 cm) an ihrem Umfang erleichtert.
Das Verfahren wurde in der folgenden Weise durch Methoden im wesentlichen ähnlich jener, wie sie von Handley, S.L. und Mithani, S Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze exploration model of „fear"-motivated behaviour. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 327: 1-5 (1984) beschrieben ist, ausgeführt. Die Ratten wurden zufällig einer der verschiedenen Behandlungen zugeordnet. Die Tiere wurden von dem Käfigraum wenigstens eine Stunde vor dem Test in das Labor gebracht. Nach oraler Verbindungsverabreichung wurden die Ratten einzeln in Makolonkäfige (22 × 16 × 14 cm) gehalten und nach 60 Minuten auf die zentrale Plattform gegenüber einem angeschlossenen Arm gegeben. Ein 8-minütiger Versuch wurde ausgeführt und das Labyrinth wurde zwischen einzelnen Lebewesen gründlich gereinigt. Direkte Aufzeichnungen wurden durch eine Beobachtungsperson ausgeführt, die nahe dem Labyrinth saß und dabei wurden die folgenden üblichen Parameter verwendet: Anzahl von Eintritten (Armeintritt wurde dadurch definiert, dass alle vier Pfoten in den Arm eingetreten waren) von offenen und geschlossenen Armen, und die Zeit die auf offenen Armen (mit Ausnahme der zentralen Plattform) verbracht wurde. Die Tiere von unterschiedlichen Behandlungsgruppen wurden alternativ getestet und die Versuche wurden zwischen 8:30 AM und 12:30 PM, das ist innerhalb der ersten Hälfte der Lichtphase ausgeführt. Die folgenden Angst-Reflex-Parameter wurden aufgezeichnet: Verhältnis (offen/total) Zeit die auf offenen Armen verbracht wurde, Latenzzeit um den ersten Arm zu verlassen und die Gesamtzahl von Armeintritten.
Erfindungsgemäße Verbindungen zeigen einen Anxiolytik-artigen Effekt in den oben genannten Tiermodellen.
Beispiel 123
Zellversuch auf Alzheimerkrankheit-Neuronales Überleben
Der folgende Versuch wird durch Verfahren, die wesentlich ähnlich jener sind, die durch Kienlen-Campard, et al., J Biol Chem 277:15666 (2002) beschrieben sind, ausgeführt. Primärkulturen von hippocampalen Neuronen wurden aus E18 Ratten Embryos (Park et al., J Neurochem, 74:114,2000) präpariert. Die Zellen wurden in 6- oder 96-Kammer-Kulturplatten (4 × 105 Zellen/cm²) oder Glasdeckgläser (1,25 × 105 Zellen/cm²) die mit Poly(D-Lysin) vorbehandelt waren, ausplattiert und 6 Tage in vitro in NEUROBASALTM Medium, das mit 2 % B-27 und 0,5 mM L-Glutamin vor der Infektion mit rekombinanten Adenoviren ergänzt waren, kultiviert. Unter diesen Bedingungen zeigen die neuronalen Kulturen (bis zu 98 % der Neuronen) hohe Differenzierung und Überlebensraten.
Rekombinante Adenoviren und neuronalinfektionen-Produktionen, Zucht und Reinigung von Adenoviren einschließlich Mutanten von APP695 wurden hergestellt. Nach 6 Tagen in vitro wurden die neuronalen Kulturen mit einer Infektionmultiplizität von 100 für 4 Stunden in einem Minimalvolumen von Kulturmedium infiziert. Das Infektionsmedium wurde dann durch frisches Medium für 3-5 Tage ersetzt. Unter diesen Bedingungen exprimieren wenigstens 75 % der Neuronen das Protein, das durch rekombinante Andenoviren kodiert ist.
Zellüberleben-Das neuronale Überleben wird gemessen durch den kolorimetrischen MTT-Versuch oder CellTracker Fluorescenz-Zell Lebensfähigkeitstest unter Verwendung von automatischen Cellomics-Bildwiedergabesystem. Für das nukleare Färben werden die Zellen fixiert (0,37 % Formaldehyd/0,2 % Glutaraldehyd in Phosphatgepufferter Salzlösung) und 30 Minuten in Hoechst 33342 Farbstoff (1 μg/ml) inkubiert.
Quantifizierung von Abeta-Produktion – das Kulturmedium wird gesammelt, mit Proteaseinhibitor (1 μg/ml Pepstatin, 10 μg/ml Leupeptin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) behandelt und durch Zentrifugierung (16.000 × g, 5 min, bei 4°C) geklärt. Einhundert μL des Überstandes wurde zur Quantifizierung von Beta-Amyloid verwendet, und zwar unter Verwendung der ELISA Verfahren wie weiter unten beschrieben.
Beispiel 24
Inhibierung von Beta-Amyloid (1-40) Produktion
Alzheimerkrankheit wird durch die Gegenwart von extrazellulären Plaque und intrazellulären neurofibrillären Knäuel im Gehirn charakterisiert. Die Hauptproteinkomponente von diesen Plaque ist Beta-Amyloid („Aβ") Peptid welches von einem Amyloid-Vorläuferprotein („APP") abgeschnitten ist.
Zelllinie und Behandlung der Verbindung
Es wurde eine stabile Zelllinie im menschlichen H4 Neuroglioma-Zellen, die in der Lage ist, Aβ zu sekretieren, durch Transduktion mit einem retroviralen Vektor, welcher sowohl APP695, welches die schwedische Mutation (K595N, M596L), als auch YFP als Selektionsmarke enthält, konstruiert. Stabile Transduktanten, welche APP695 exprimieren, wurden durch Sortieren der Zellen, welche hohe stabile YFP exprimieren, ausgewählt.
Die Zellen wurden mit 80.000 Zellen pro Kammer in einer 96-Kammer-Platte in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Invitrogen, Katalog #11965-092) welche mit 10 % fötalen Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin ergänzt wurde, ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium durch ein frisches Medium ersetzt, welches die interessierende Verbindung enthält, wobei die Verbindungskonzentrationen im Bereich von 20 μM zu 10 nM in einer sieben-Punkt-Situation in zweifacher Ausfertigung getestet wurden. Nach der Inkubierung mit der Testverbindung für 18-24 Stunden bei 37°C, wurde die hAβ (1-40) Konzentration in dem Überstand unter Verwendung der hAβ40 ELISA bestimmt.
ELISA-Versuch für sekretierte Aβ
Es wurde der Signal Select^TM Human β Amyloid (hAβ40) ELISA (Katalog #KHB3482) von Biosource International verwendet um hAβ40 in dem Kulturüberstand der Proben quantitativ zu bestimmen. Ein monoklonaler Antikörper der spezifisch für den NH₂ Terminus von hAβ ist, wurde in die Kammern der Mikrotiterplatten als Überzug aufgebracht. Die Proben, einschließlich Standard mit bekannten hAβ-Gehalt, wurden in diese Kammern einpipettiert, wonach die Zugabe von Kaninchenantikörper-spezifische 1-40 Sequenz von hAβ sind, folgte. Gebundene Kaninchenantikörper wurden dann durch Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-markierten Anti-Kaninchenantikörper bestimmt. Nach Entfernung von überschüssigen Anti-Kaninchenantikörper wurde eine Substratlösung zugesetzt, die durch das gebundene Enzym abgeschnitten war, um Farbe zu erzeugen. Die Intensität des gefärbten Produktes ist direkt proportional der Konzentration von hAβ (1-40), das in der Probe vorhanden ist.
Der ELISA-Versuch wurde wie folgt ausführt:
Proben und Standards die eine bekannte Konzentration von hAβ (1-40) Peptid aufwiesen, wurden in einem Standard/Probe-Verdünnungsmittel (Biosource reagent) verdünnt. Die Proteaseinhibitoren AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin, und Pepstatin A (Calbiochem, Protease Inhibitor Cocktail Set III, Katalog #539134) wurden allen Proben zugesetzt, um Proteolyse von den Aβ-Peptiden zu verhindern. 100 μl der Probe und der Standards wurden den Kammern von der 96-Kammer-ELISA-Platte zugesetzt und für je zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Kammern wurden viermal mit 100 μl Waschpuffer (Biosource Reagent) gewaschen, dann 100 μl des Ermittlungsantikörpers zugesetzt und die Platten wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Ermittlungsantikörper erkennt wie hAβ (1-40) Sequenz.
Die Kammern wurden viermal mit 100 μl Waschpuffer und dann 100 μl von Meerrettich-Peroxidase (HRP)-markierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper zugesetzt. Die Platten wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kammern wurden dann fünfmal mit 100 μl Waschpuffer gewaschen und dann wurden 100 μl von stabilisiertem Chromogen zugesetzt. Die Platten wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubiert. Das stabilisierte Chromogen ist eine Substratlösung, welche, wenn sie durch gebundenes HRP geschnitten ist, sich zu blau verfärbt und daher in Standard-Mikrotiter-Platten-Lesern erkannt werden kann. 100 μl einer Stopplösung wurden dann zugesetzt und die Intensität der Farbe in den Kammern wurde unter Verwendung eines Molecular Devices SpectraMAX 340 Plattenlesers bei 450 nM gelesen. Typischerweise wurden die Verbindungen in einer 7-Punkt-Dosis Reaktion analysiert, welche zweifach mit Verbindungskonzentrationen, die von 20 μM zu 10 nM reicht, durchgeführt wird. Die Konzentrationen von Aβ (1-40) in den Proben wurden aus Standardkurven heraus berechnet, welche aus Standards generiert wurden, die bestimmten Konzentrationen von Aβ-Peptiden erhalten.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wurde über eine dreitägige Periode getestet. Jeden Tag wurde der Calbiochem Gamma-Sekretase „Inhibitor X" als Kontrolle miteinbezogen. Dies ist ein zellpermeables Hydroxyethylen Dipeptid Isosteres mit einer berichteten IC50 von 50 nM (Katalog #565771).
Beispiel 25
Transgene Tierversuche für Alzheimerkrankheit (AD)
I. AD transgene Tiere
Transgene Mäuse welche 695-Aminosäure-Isoformen des menschlichen Alzheimer-Beta-Amyloid (Abeta) Vorläufer-Proteins, welches eine Lys670 → Asn, Met671 → Leu Mutation enthält, (Tg2576 Mäuse sind im Handel von Taconic, N.Y. erhältlich) hatten ein normales Lernen und Gedächtnis in räumlicher Beziehung und Änderungsaufgaben mit einem Alter von drei Monaten, zeigten allerdings Beeinträchtigungen mit einem Alter von 9-10 Monaten. Ein fünffacher Anstieg in Abeta (1-40) und ein 14-facher Anstieg in Abeta (1-42/43) stand in Verbindung mit dem Auftreten von diesem Verhaltensdefiziten. Eine Zahl von Abeta Plaques, die mit Kongo-rot-Farbstoff gefärbt sind, sind in den kortikalen und limbischen Strukturen der Mäuse mit erhöhten Mengen von Abeta enthalten. Das korrelative Erscheinen von Verhaltens-, biochemischen und pathologischen Abnormalitäten, die an Alzheimerkrankheit in diesen transgenen Mäusen erinnern, schlagen neue Möglichkeiten zur Forschung der Pathophysiologie und Neurobiologie dieser Krankheit vor. Siehe Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 1996 Oct 4;274(2 584):99-102.
Obwohl Tg2576 Mäuse in den vorgeschriebenen Modell spezifiziert sind, ist es verständlich, dass andere transgene Mäuse, welche sowohl kommerziell als auch privat erhältlich sind, für die Verwendung in den genannten Modellen passend sind.
II. B-Amyloid ELISA Protokoll
The Relationship between Aβ and Memory in the Tg2576 Mouse Model of Alzheimer's Disease. The Journal of Neuroscience, March 1, 2002, 22(5):1858-1867.
Gefrorene Gehirnhälften werden nacheinander in einer zwei-Stufen-Extraktion extrahiert [Beschallung in (1) 2 % SDS und (2) 70 % Ameisensäure (FA)]. Die zweite Fraktion wird Abnsol genannt. Nach der Beschallung wurden die Proben mit 100.000 × g für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert, der Überstand gewonnen und die Pellets werden mit der nächsten Lösung beschallt. Die Gehirnextrakte sind durch Sandwich-ELISA wie früher beschrieben (Suzuki et al., 1994; Gravina et al., 1995) gemessen. Die folgenden Systeme sind verwendet: (1) BAN-50 Fänger und BA-27 oder BC-05 Detektion oder (2) 3160 Fänger und BA-27 oder BC-05 Detektion, wobei beide Aβ 1-40 und Aβ 1-42 ermitteln. Der direkte Vergleich von vielen Tg2576 Gehirnen von Mäusen bei allen Alterstufen zeigte, dass die Mengen von Aβ40 und Aβ42, die mit 3160 Fänger ELISAs ermittelt wurden, im wesentlichen die gleichen sind, wie wenn BAN-50 als Fänger verwendet wird. Der 2 % SDS-Extrakt wird mindestens 1:40 verdünnt, sodass der Versuch auch in 0,05 % SDS ausgeführt werden kann. Größere Verbindungen werden im Bezug auf SDS korrigiert, sodass sie ebenfalls in 0,05 % SDS untersucht werden. Der FA Extrakt wird durch ein 1:20 Verdünnung in 1 M Tris Phosphatpuffer, pH 8, neutralisiert. Das Programm Softmax wird verwendet, um Femtomol pro Milliliter durch Vergleich der Proben-Absorption mit der Absorption von bekannten Konzentrationen von synthetischen Aβ1-40 bzw. Aβ1-42 in identischen Lösungen wie die Probe zu vergleichen und diese Werte werden mit dem Nassgewicht der ursprünglichen Homogenate korrigiert, um schließlich als Picolmol per Gramm Nassgewicht ausgedrückt zu werden. In allen Instanzen, werden nicht-transgene Gewebe in identischer Weise in Parallelversuchen mit transgenen Geweben behandelt.
III. Verhaltenstest von transgenen Mäuse: Morris Wasser Labyrinth
Das Wasserlabyrinth ist auf Tg2576 Mäuse in den B6/SJL Stammhintergrund in einer Weise zugeschnitten, dass es uns ermöglicht hat, alle Stadien des Gedächtnisverlustes zu ermitteln und zu bestimmen. Dieses Protokoll sieht die Sensitivität, die Spezifität und den dynamischen Bereich vor, der benötigt wird, um die Veränderung, die zu Beginn des Lebens noch zart sind und im späten Leben krass sind, zu messen. Die Interpolation der Sonden während des Trainings ergeben die Sensitivität. Die Annahme von Ausschlusskriterien für Durchführungsmängel gaben die Spezifität. Training ergab extensiv einen dynamischen Rahmen. Die Zuordnung von mittleren Sondentreffern (MPSs), welche die mittlere Prozentsatz der Zeit ist, welche die Maus in den Zielquadranten während der drei Versuchsperioden eingenommen hat, verbesserte die Quantifizierung der kognitiven Durchführung von individuellen Mäusen zur Korrelation mit Molekularmarkern und ergab eine einzige Messung mit einem breiten dynamischen Rahmen. Protokolle für Tg2576 Mäuse in anderen Hintergründen anderer Stämme kann benötigt werden, um bezüglich stammspezifischer Differenzen in den Raten des Lernen und der Ausführungsmängel angepasst zu werden. Siehe The Relationship between Aβ and Memory in the Tg2576 Mouse Model of Alzheimer's Disease. The Journal of Neuroscience, March 1, 2002, 22(5):1858-1867.
Das Wasserlabyrinth ist ein 1 oder 1,2 Meter Teich, der mit Wasser bei 25-27°C gefüllt ist und durch Zusatz von nicht toxischer Wasserfarbe opak gemacht wurde. In dem Tool sind mittig fixierte räumliche Marken, die aus stark gemusterten Vorhängen und Brettern besteht, die bestimmte Objekte enthalten. Mäuse werden in einen Becher gesetzt und langsam in das Wasser gesenkt, und zwar gegenüber der Teichwand. Die Mäuse durchliefen ein sichtbares Plattformtraining für drei aufeinander folgende Tage (acht Versuche pro Tag), durch Schwimmen zu einer erhöhten Plattform (eine quadratische Oberfläche von 12 × 12 cm²), welche mit einer schwarz-weiß gestreiften Stange markiert ist. Die sichtbaren Plattformtage sind in zwei Trainingsblöcke für vier Versuche zur statistischen Analyse aufgesplittet. Während des sichtbaren Plattformtrainings werden sowohl die Plattformanordnung (NE, SE, SW, oder NW) und die Startposition (N, NE, E, SE, S, SW, W oder NW mit Ausnahme bei der Position unmittelbar benachbart zur Plattform) war zufällig in jedem Versuch geändert. Die Zahl der Zufälligkeit stellt sicher, dass alle Positionen geprobt sind, bevor eine bestimmte Position wiederholt wird. Ein verstecktes Plattformtraining wird über 9 aneinander folgenden Tagen (vier Versuche pro Tag) durchgeführt, wobei den Mäusen erlaubt wird, nach einer 1,5 cm unterhalb der Oberfläche des Wassers versenkten Plattform zu suchen. Mäuse, die innerhalb von 60 Sekunden die Plattform nicht erreicht hatten, wurden mit einer metallenen Rettungskelle zu der Plattform geführt. Während der versteckten-Plattform-Versuche war der Ort der Plattform konstant gehalten (NE, SE, SW oder NW) und die Mäuse wurden in einem von sieben pseudozufällig ausgewählten Orten (N, NE, E, SE, S, SW, W oder NW mit Ausnahme der unmittelbar der Plattform benachbarten Position) in den Teich eingesetzt. Nach jedem versteckten-Plattform-Versuch wurden die Mäuse 30 Sekunden auf der Plattform gelassen und dann von der Plattform mit der Rettungskelle in ihrem Heimkäfig zurückgebracht. Die Mäuse lernten schnell die Kelle mit der Rettung aus dem Pool in Verbindung zu bringen und orientierten sich dann zuverlässig oder folgten der Kelle bei ihrer Erscheinung. Die Fähigkeit der Mäuse sich zu orientieren oder der Rettungskelle zu folgen, repräsentierte unabhängige Messungen von Erkennen und Aufmerksamkeit. Am Beginn des 4., 7., und 10. Tages nach dem versteckten-Plattform-Training, wird ein Testtraining ausgeführt, in welchem die Plattform aus dem Teich entfernt ist und die Mäuse 60 Sekunden die Plattform suchen gelassen wurden. Alle Versuche sind mit einer Kamera, die direkt oberhalb des Teiches angeordnet war, beobachtet und aufgezeichnet und unter Verwendung eines computerisierten Spätfolgesystems analysiert worden.
Die MPS wird für jede Maus berechnet und zur Bestimmung des Beibehaltens der räumlichen Information in dem Morris-Wasserlabyrinth verwendet. Durch Integration der Informationen von den interkalierten Sonden repräsentierte die MPS eine Messung zum Lernen, die im Konzept ähnlich war wie jenes, das früher als Lernindex beschrieben war (Gallagher et al., 1993), welches Merkfähigkeit an unterschiedlichen Stadien des Lernen gesammelt hat. Ähnliche statistische Resultate wurden in MPS, dem Lernindex und dem Lerntreffer (die gewichtete Summe von prozentueller Zeit, die in dem Zielquadranten während des Probeversuches verbracht wurden) gefunden und wir wählten unsere Daten unter Verwendung von MPS für die Repräsentation aus, und zwar aufgrund der Leichtigkeit der Repräsentation.
Nach dem Test wurde eine Untergruppe von jeder Gruppe der Mäuse euthanasiert und die rechte Gehirnhälfte in flüssigem Stickstoff für Aβ-Messungen eingefroren. Alle Gehirne wurden in einer kodierten Weise analysiert.
IV. Verhaltenstest von transgenen Mäusen: Exploratorische Aktivität Ängstlichkeit und motorische Koordination
Siehe Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety and motor coordination. Brain Res 2003 Ju 14; 977(1):38-45.
Spontane Änderung wurde in einem T-Labyrinth aus weißem Acryl getestet. Das Labyrinth bestand aus einem zentralen Stamm (Länge: 30 cm) welche an jeder Seite von zwei Armen flankiert ist (Länge: 30 cm). Das Labyrinth ist 9 cm breit und jede Wand ist 20 cm hoch. In einem anfänglichen Versuch, werden die Mäuse in den Stamm des T-Labyrinths gesetzt, von welchem der rechte Arm durch eine Kunststoffbarriere (gezwungene Wahl) blockiert ist. Nach Eintritt in den verfügbaren Arm, wurden die Mäuse in diesen 60 Sekunden durch Schließen der Barriere hinter ihnen gehalten. Die Mäuse wurden dann aufgenommen und nach Entfernen der Barriere unmittelbar in den Stamm für eine freie Versuchswahl gesetzt, in welcher die Mäuse entweder den entgegengesetzten Arm oder den selben Arm (4-Pfoten Kriterium) auswählen. An den folgenden neun Tagen wurde die selbe zwei-Versuchs-Anordnung wiederholt, mit Ausnahme dass der blockierte Arm, von rechts an geraden Tagen, nach links an ungeraden Tagen gewechselt wurde. Die Anzahl der Veränderungen und die verbleibende Zeit zur Reaktion während des Versuchsablaufes wurde gemessen, und zwar wie mit einer Ausschlusszeit von 1 Minute pro Versuch. Wenn die Mäuse nicht innerhalb einer Minute reagiert haben und von dem Auswahlpunkt weit entfernt sind, werden sie kurz von hinten gestoßen, üblicherweise nicht mehr als einmal, sodass für jeden Versuch eine entsprechende Reaktion aufgezeichnet werden kann.
Die motorische Aktivität wird in einem offenen Feld gemessen, welches aus weißem Acryl mit einem Oberflächenbereich von 50 × 50 cm und 38 cm hohen Wänden gebildet ist. Die Aktivität in der zentralen und den peripheralen Zonen wird durch eine Überkopf-Videokamera aufgezeichnet und analysiert. Die zentrale Zone ist quadratisch und beginnt in einer Entfernung von 25 cm von jeder Wand. Die Mäuse werden in einer Ecke des offenen Feldes für drei tägliche 5-Minuten-Sitzungen eingesetzt. Die bewältigte Distanz und die Rastzeiten (< 2 cm/s), langsame Bewegung (2-5 cm/s), oder rasche Bewegung (> 5 cm/s) werden in jeder Zone gemessen, so wie auch die Zeit, die an der Peripherie und im Zentrum des Gerätes verbracht wird.
Das erhabenen Plus-Labyrinth besteht aus vier Armen (Länge: 70 cm, Breite: 10 cm, Höhe von dem Fußboden: 40 cm) in Kreuzform und einer zentralen Region (10 cm²). Zwei dieser Arme sind an drei Seiten durch Wände (Höhe: 10 cm) abgeschlossen, während die anderen offen sind, mit Ausnahme einer minimalen Begrenzung (Höhe: 0,5 cm), die verwendet werden um herausfallen zu minimieren. Die zwei geschlossenen oder offenen Arme liegen einander gegenüber. Die Mäuse werden in der zentralen Region platziert und die Anzahl von Eintreten und Verweilen in den geschlossenen und in den offenen Armen wird in zwei täglichen 5-Minuten-Sitzungen mit der selben Video-Spurfolgeausrüstung gemessen, das bei den vorhergehenden Tests verwendet wurde. Die offenen/totalen Armeintritte und die Verweilzeitverhältnisse werden dann berechnet. In seltenen Gelegenheiten, wenn die Mäuse aus einem offenen Arm herausfallen, wird die aufgezeichnete Zeit gestoppt und die Maus wird auf genau jene Position gesetzt, von welcher es herab gefallen ist. Nach jeder Sitzung der spontanen Änderung, Offen-Feld und Plus-Labyrinth-Testung wird der Apparat mit einem nassen Tuch sauber gewischt und vor Beginn des nächsten Versuches getrocknet um mögliche Wirkungen und Geruchsspuren zu reduzieren.
Der stationäre Stamm ist aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Länge von 110 cm gefertigt. Der Stab ist durch eine Schicht von weißem Abdeckband bedeckt um einen sicheren Griff zu erzielen und ist in 11 Segmente durch Linienziehung geteilt. Der Stamm wird in einer Höhe von 45 cm über einen mit einer Matte bedeckten Boden platziert, welche dazu dient, den Fall abzupolstern und durch die Verletzung von Mäusen verhindert. Eine Kartonwand ist am Ende des Stabes angebracht um die Maus am Fliehen zu hindern. Der Versuch begann durch Platzieren der Maus auf dem Mittelsegment. Der Anzahl der überschrittenen Segmente (Vier-Pfoten Kriterium), die Verweilzeit vor dem Herunterfallen und die Anzahl von Herunterfallen wurden in einer einzigen vier-Versuchs-Sitzung gemessen. Die Ausschlusszeit ist 1 Minute pro Versuch und die Versuchsintervalle betrugen 15 Minuten.
Der beschleunigende Rotorstab (Modell 7650, Stoelting, Wood Dale, IL, USA) ist aus gerippten Kunststoff (Durchmesser: 3 cm) gefertigt. Der Stab ist in einer Höhe von 13,5 cm vom Bodenniveau angeordnet und ist in 5 Sektionen (Breite 5,5 cm) durch eine Kunststoffbarriere getrennt. Von den dem Experimentierer abgewandten Seiten wird die Maus an der Spitze des bereits rotierenden Standes (4 Umdrehungen pro Minute) gesetzt und zwar in entgegen gesetzter Richt zu ihrer Bewegung, sodass ein Herunterfallen durch Vorwärtsbewegung verhindert werden kann. Der rotierende Stab beschleunigt schrittweise und sanft von 4 auf 40 Umdrehungen pro Minute während eines 5-Minütigen Versuchs. Die Verweilzeiten vor dem Herunterfallen wurden an drei täglichen Sitzungen mit vier Versuchen gemessen, und zwar mit einem Intervall von 15 Minuten zwischen den Versuchen. Wann immer die Maus an den Stab ohne zu Bewegung (passive Rotation) für zwei komplette aufeinanderfolgende Umdrehungen klammerte, wurde dies als herab Herabgefallen angesehen. Da keine Maus freiwillig abzuspringen erschien, konnte eine gültige Abschätzung von motorischem Geschick erhalten werden. Nach Training ist das Auftreten von verschiedenen und pathologischen Reflexen evaluiert.
V. Gehirn beta-Amyloid Akkumulierung, Bestimmung durch Immunohistochemie.
Siehe Accelerated plaque accumulation, associative learning deficits, and upregulation of alpha 7 nicotinic receptor protein in transgenic mice co-expressing mutant human presenilin 1 and amyloid precursor proteins. J Biol Chem. 2002 Jun 21; 277(25):22768-80
Mäuse werden mit phosphatgepufferter Salzlösung (10 mM NAHP0₄, 150 mM NaCl, pH 7,2) Herz-perfundiert und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die gefrorenen Gehirnsektionen werden koronal auf eine 12-μm Dicke unter Verwendung eines Kryostat geschnitten, auf ProbeOn-Plus Mikroskop Ojektträger (Fisher Scientific) aufgebracht und luftgetrocknet. Unmittelbar vor dem Färben werden die Gehirnschnitte mit Aceton fixiert. Die Gewebeteile werden für 30 Minuten in 0,3 % H₂O₂ und 0,3 % normalen Ziegenserum inkubiert, in Phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und mit 1,5 % normalen Ziegenserum in Phosphat-gepufferter Salzlösung für 30 Minuten inkubiert. Die Gehirnschnitte wurden dann mit Anti-Aβ-Antikörper 6E10 (1:1000, Senetik) inkubiert, mit biotinyliertem Anti-Maus-IgG (1:200, Vector Laboratories) gefärbt und mit Vectastain ABC Reagenz (1:100, Vector Laboratories) immunodetektiert. Die Schnitte wurden mit Hematoxylin gegengefärbt.
Während eine Anzahl von Ausführungsformen in dieser Erfindung von stehen beschrieben sind, ist es erkennbar, dass unsere grundlegenden Beispiele so verändert werden können, um andere Ausführungsformen vorzusehen, welche die Verbindungen und Verfahren der Erfindung verwenden. Daher ist es erkennbar, dass der Umfang der Erfindung eher durch die angeschlossenen Ansprüche als durch die spezifischen Ausführungen begrenzt sind, welche beispielhaft dargelegt sind.

Claims

Verbindung der Formel I:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei: W Stickstoff ist; R¹ ausgewählt ist aus Wasserstoff oder Fluor; und R^y eine C_1-4 aliphatische Gruppe ist, wobei diese aliphatische Gruppe ein geradkettiger oder verzweigter C₁-C₄ Kohlenwassenstoff ist, der vollständig gesättigt ist oder der eine oder mehrere ungesättigte Einheiten enthält, oder ein monozyklischer C₃-C₄ Kohlenwasserstoff, der vollständig gesättigt ist oder der eine oder mehrere ungesättigte Einheiten enthält, aber nicht aromatisch ist, der eine einzige Verknüpfungsstelle zum Rest des Moleküls aufweist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R^y ausgewählt ist aus Methyl, Ethyl, Cyclopropyl, tert-Butyl oder Isopropyl, vorzugsweise ausgewählt aus Methyl, Cyclopropyl, oder tert-Butyl.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ Wasserstoff oder Fluor ist.
Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
Pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung, welche eine Verbindung nach Anspruch 1, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein Adjuvans, oder Vehikel aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, welche zusätzlich einen weiteren therapeutischen Wirkstoff aufweist, der ausgewählt ist aus einer Behandlung von Alzheimer Krankheit (AD), einer Behandlung von Parkinson Krankheit, einem Mittel zum Behandeln von Multipler Sklerose (MS), einer Behandlung für Asthma, einem entzündungshemmenden Mittel, einem immunmodulatorischen oder immunsuppressiven Mittel, einem neurotrophen Faktor, einem Mittel zum Behandeln von Schlaganfall, einem Mittel zum Behandeln von cardiovaskulärer Krankheit, einem Antisedativum, einem antipsychotischen Mittel oder einem Mittel zum Behandeln von Diabetes.
Verfahren zum Inhibieren der GSK3-Kinase-Aktivität in einer biologischen Probe, welches den Schritt des Kontaktierens der biologischen Probe mit: a) einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 oder 6; oder b) einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6; oder einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die therapeutische Verwendung, insbesondere für die Verwendung beim Inhibieren der GSK3 Kinase-Aktivität in einem Patienten.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 für die Verwendung beim Behandeln einer Autoimmunerkrankung, einer entzündlichen Erkrankung, einer Stoffwechselstörung, einer psychiatrischen Störung, Diabetes, einer angiogenen Störung, Tauopathie, einer neurologischen oder neurodegenerativen Störung, einer Rückenmarksverletzung, Glaucoma, Calvities oder einer cardiovaskulären Krankheit.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Krankheit, Störung oder der Zustand ausgewählt ist aus Allergie, Asthma, Diabetes, Alzheimer Krankheit, Huntington Krankheit, Parkinson Krankheit, AIDS-assoziierte Demenz, amyotrophische Lateralsklerose (ALS, Lou Gehrig Krankheit), Multiple Sklerose (MS), Verletzung aufgrund eines Schädeltraumas, Schizophrenie, Angst, bipolare Störung, Tauopathie, Knochenmark- oder periphere Nervverletzung, Myokardinfarkt, Cardiomyozyt-Hypertrophie, Glaucoma, Aprosexia (ADD), Depression, eine Schlafstörung, Reperfusion/Ischämie, Schlaganfall, eine angiogene Störung oder Calvities.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die genannte Krankheit, Störung oder der Zustand Schlaganfall ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die genannte Krankheit, Störung oder der Zustand Alzheimer Krankheit ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die genannte Störung eine neurologische oder neurodegenerative Störung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6 für die Verwendung beim Verringern der Sperma-Beweglichkeit.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 für die Verwendung mit einem zusätzlichen therapeutischen Wirkstoff, der ausgewählt ist aus einem Mittel zum Behandeln von Alzheimer Krankheit (AD), einem Mittel zum Behandeln von Parkinson Krankheit, einem Mittel zum Behandeln von Multipler Sklerose (MS), einem Mittel zum Behandeln von Asthma, einem entzündungshemmenden Mittel, einem immunmodulatorischen oder immunsuppressiven Mittel, einem neurotrophen Faktor, einem Mittel zum Behandeln von Schlaganfall, einem Mittel zum Behandeln von cardiovaskulärer Krankheit, einem Antisedativum, einem antipsychotischen Mittel oder einem Mittel zum Behandeln von Diabetes.