ES2250960T3 - Metodo para la amplificacion de secuencias de acidos nucleicos, composicion y kit. - Google Patents
Metodo para la amplificacion de secuencias de acidos nucleicos, composicion y kit.Info
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Abstract
UN METODO, COMPOSICION Y EQUIPO PARA AMPLIFICAR UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO ANTICATODO BAJO CONDICIONES DE TEMPERATURA SUSTANCIALMENTE CONSTANTE, RESISTENCIA IONICA Y PH Y UTILIZANDO SOLO UN PROMOTOR-PRINCIPAL INDIVIDUAL. PARA EFECTUAR LA AMPLIFICACION, UN SUMINISTRO DE UN PROMOTOR-PRINCIPAL TIENE UN PROMOTOR Y UN PRINCIPAL COMPLEMENTARIO AL 3''-FINAL DE LA SECUENCIA ANTICATODO, UNA TRANSCRITASA INVERSA Y UNA POLIMERASA ARN SE OFRECEN A LA MEZCLA INCLUYENDO LA SECUENCIA ANTICATODO Y SE PROCEDE DE ACUERDO A LA AMPLIFICACION. LA INVENCION ES UTIL PARA GENERAR COPIAS DE LA SECUENCIA ANTICATODO DE ACIDO NUCLEICO PARA FUNCIONES QUE INCLUYEN ENSAYOS DE LA CANTIDAD ESPECIFICA DE SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO EN CASOS CLINICOS, FORENSES Y MEDIOAMBIENTALES Y MUESTREOS SIMILARES, CLONACION Y GENERACION DE MUESTRAS.
Description
Método para la amplificación de secuencias de
ácidos nucleicos, composición y kit.
El campo de la presente invención consiste en
aumentar el número de copias (o amplificar) una secuencia de ácidos
nucleicos específica o "secuencia objetivo." La secuencia
objetivo puede hallarse presente sola o bien como un componente,
grande o pequeño, de una mezcla homogénea o heterogénea de ácidos
nucleicos. La mezcla de ácidos nucleicos puede ser una mezcla
encontrada en una muestra tomada para pruebas diagnósticas, pruebas
medioambientales, para estudios de investigación, para la
preparación de reactivos o materiales para otros procesos como
clonación, o para otros propósitos.
La amplificación selectiva de secuencias de
ácidos nucleicos específicas presenta la ventaja de aumentar la
sensibilidad de los ensayos diagnósticos y medioambientales, y para
otros usos, mientras se conserva la especificidad, se aumenta la
sensibilidad, facilidad, precisión y fiabilidad de distintos
procedimientos de investigación, proporcionando además un amplio
suministro de oligonucleótidos específicos para diversos
propósitos.
La presente invención es particularmente adecuada
para su utilización en pruebas medioambientales y de diagnóstico
debido a la facilidad con la que se puede llevar a cabo.
La detección y/o cuantificación de secuencias de
ácidos nucleicos específicas es una técnica que está adquiriendo una
importancia creciente para la identificación y clasificación de
microorganismos, el diagnóstico de enfermedades infecciosas, la
detección y caracterización de anormalidades genéticas, la
identificación de cambios genéticos asociados al cáncer, el estudio
de la susceptibilidad genética a ciertas enfermedades, y la medición
de la respuesta a diversos tipos de tratamiento. Tales
procedimientos también han encontrado un uso creciente en la
detección y cuantificación de microorganismos en productos
alimentarios, muestras medioambientales, reservas de semillas, y
materiales de otro tipo en donde la presencia de microorganismos
específicos necesita ser monitorizada. Se pueden encontrar otras
aplicaciones en las ciencias forénsicas, antropología, arqueología y
biología, en donde se ha utilizado la medición del grado de relación
entre secuencias de ácidos nucleicos para identificar sospechosos de
haber cometido un crimen, resolver disputas sobre paternidad,
construir árboles genealógicos y filogenéticos, y para ayudar a
clasificar diversas formas de vida.
Un método común para la detección y
cuantificación de secuencias de ácidos nucleicos específicas es la
hibridización de ácidos nucleicos. Este método esta basado en la
capacidad de dos cadenas de ácidos nucleicos que contienen
secuencias complementarias o esencialmente complementarias de
asociarse de forma específica, bajo condiciones apropiadas, para
formar una estructura de doble cadena. Para detectar y/o cuantificar
una secuencia de ácidos nucleicos específica (que recibe el nombre
de "secuencia objetivo"), se prepara un oligonucleótido marcado
(que recibe el nombre de "sonda") que contiene las secuencias
complementarias a las de la secuencia objetivo. En un proceso que se
conoce comúnmente como "cribado," la sonda se mezcla con una
muestra que se sospecha que contiene la secuencia objetivo, y se
crean las condiciones apropiadas para la formación del híbrido. La
sonda hibridiza la secuencia objetivo si ésta se halla presente en
la muestra. Los híbridos sonda-secuencia objetivo se
separan seguidamente de la sonda de cadena única en cualquiera de
sus formas posibles. Seguidamente se mide la cantidad de marcador
asociada con los híbridos, como una indicación de la cantidad de
secuencia objetivo en la muestra.
La sensibilidad de los ensayos de hibridización
de ácidos nucleicos está limitada principalmente por la actividad
específica de la sonda, la velocidad y alcance de la reacción de
hibridación, la eficacia del método para la separación de las sondas
hibridizadas y no hibridizadas, y la sensibilidad con la cual se
puede detectar la sonda. Bajo las mejores condiciones posibles, los
métodos de hibridación directa como los que se han descrito
anteriormente pueden detectar alrededor de 1 x 10^{5} hasta 1 x
10^{6} moléculas diana. Sin embargo, los procedimientos más
sensibles pueden adolecer de varias de las prestaciones que se
requieren en pruebas clínicas y medioambientales rutinarias, como
velocidad, facilidad y precio. Además, las sensibilidades de incluso
los procedimientos más sensibles pueden no ser suficientes para
muchas de las aplicaciones deseadas.
Como resultado de la interacción entre los
diversos componentes, y los pasos que componen este tipo de ensayos,
casi siempre hay una relación inversa entre sensibilidad y
especificidad. Así pues, los pasos que se toman para incrementar la
sensibilidad del ensayo (como incrementar la actividad específica de
la sonda) pueden resultar en un porcentaje mayor de falsos positivos
en los resultados de las pruebas. La relación entre sensibilidad y
especidicidad ha representado una barrera significativa para la
mejora de la sensibilidad de los ensayos de hibridación. Una
solución a este problema consistiría en incrementar de forma
específica la cantidad de secuencia objetivo presente utilizando un
procedimiento de amplificación. La amplificación de una sola porción
de la secuencia objetivo sin amplificar una porción significativa de
la información codificada en las secuencias restantes de la muestra
podría resultar en un incremento efectivo en la sensibilidad sin que
ello comprometiera al mismo tiempo la especificidad.
Un método para la amplificación específica de
secuencias de ácidos nucleicos que recibe el nombre de "reacción
en cadena de la polimerasa" o "PCR" ha sido descrita por
Mullis, et al. (Ver U.S. patents 4,683,195, 4,683,202 y
4,800,159 y las solicitudes de patentes europeas 86302298.4,
86302299.2, y 87300203.4 y Methods in Enzymology, Volume 155, 1987,
pp. 335-350). La técnica PCR utiliza una serie de
ciclos repetidos de síntesis de ácidos nucleicos dependiente del
cebador que ocurren de forma simultánea utilizando cada una de las
cadenas de una secuencia complementaria como patrón. En la técnica
PCR se sintetizan copias de ambas cadenas de una secuencia
complementaria. Para hacer que la técnica PCR sea práctica se
necesitan termocicladores programables.
La técnica PCR ha sido acoplada a la
transcripción de ARN mediante la incorporación de una secuencia
promotora en uno de los cebadores utilizados en la reacción de PCR
y, seguidamente, después de la amplificación mediante la técnica PCR
durante varios ciclos, utilizando ADN de doble cadena como molde
para la transcripción de ARN de cadena sencilla (Ver, por ejemplo,
Murakawa et al., ADN 7:287-295 (1988)).
Otros métodos para la amplificación de una
secuencia de ácidos nucleicos específica comprende una serie de
ciclos de hibridación del cebador, pasos de extensión y pasos de
desnaturalización para proporcionar una molécula de ADN de doble
cadena intermedia que contiene una secuencia promotora mediante la
utilización de un cebador que contiene la secuencia del promotor. El
ADN de doble cadena se utiliza para producir múltiples copias de ARN
de la secuencia objetivo. Las copias de ARN resultantes se pueden
utilizar como secuencias objetivo para producir más copias, y se
pueden llevar a cabo múltiples de estos ciclos (Ver, por ejemplo,
Burg, et al., WO 89/1050; Gingeras, et al., WO
88/10315 (que a veces recibe el nombre de "sistema de
amplificación de la transcripción " o TAS); solicitud EPO No.
89313154 a Kacian y Fultz; solicitud EPO No. 88113948.9 a Davey y
Malek; Malek, et al. WO91/02818).
Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 89:392-396 (Jan. 1992), describe un método de
amplificación conducido por oligonucleótidos para su utilización con
un molde de ADN, utilizando una endocucleasa de restricción para
producir las secuencias objetivo iniciales y un enzima para cortar
el complejo ADN/ADN para permitir una reacción de extensión y, por
lo tanto, la amplificación. Becker, et al., Solicitud EPO No.
88306717.5, describe un método de amplificación en el cual se
hibridiza un cebador en la secuencia objetivo y el dúplex resultante
se corta antes de la reacción de extensión y amplificación; en el
caso en que el cebador se extienda más allá de la región de
hibridación, necesita un corte antes de la extensión, y el cebador
debe ser bloqueado en su extremo 3' para prevenir cualquier reacción
de extensión no deseada que ocurra antes de la amplificación.
Kramer, et al., U.S. Patent No. 4,786,600 describe un método
para la producción de un gran número de copias de una secuencia
sonda en una secuencia objetivo de ARN utilizando Q\beta
replicasa. Urdea, WO 91/10746, describe un método de amplificación
de la señal que incorpora una secuencia promotora T7.
Otros métodos para la amplificación de ácidos
nucleicos incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR),
descrita en la European Patent Publication 320,308, en la cual se
utilizan al menos cuatro oligosondas; dos de las oligosondas
hibridizan en lados opuestos de la misma cadena objetivo en una
orientación adecuada de tal forma que la tercera y la cuarta
oligosondas pueden hibridizar con la primera y la segunda
oligosondas para formar, después de la ligación, sondas conectadas
que pueden ser desnaturalizadas y detectadas. Otro método es el que
se describe en la publicación EPO No. 0 427 073 A2, publicada el 15
de Mayo de 1991, en la cual una sonda palindrómica capaz de formar
una horquilla y de tener una región promotora funcional en la
horquilla se hibridiza en una secuencia objetivo, y seguidamente es
ligada a un segundo oligonucleótido hibridizado a la secuencia
objetivo de tal forma que se pueden fabricar transcritos de ARN.
Otros métodos adicionales incluyen la síntesis de
oligonucleótidos y la clonación.
La presente invención está dirigida a la síntesis
de múltiples copias de una secuencia objetivo de un ácido nucleico
de cadena sencilla sin la necesidad de modificar las condiciones de
reacción, como la temperatura, pH, o la fuerza iónica, y sin la
necesidad de añadir múltiples cebadores o promotores, ni enzimas
distintos a las polimerasas, que también pueden tener actividades
ARNsa H.
La presente invención puede utilizarse como un
componente en ensayos para la detección y/o cuantificación de
secuencias objetivo de ácidos ribonucleicos específicos en muestras
clínicas, medioambientales, forenses y similares, o para producir
una gran cantidad de copias de ARN de una secuencia objetivo
específica para diversos usos. La presente invención también puede
utilizarse para producir múltiples copias de ARN de una secuencia
objetivo de un ácido nucleico para clonación o para generar sondas o
para producir copias de ARN para su secuenciación.
El presente método consiste en la incubación de
una mezcla formada esencialmente por una secuencia objetivo de un
ácido nucleico (ADN o ARN) con uno o más oligonucleótidos que
reciben el nombre de "promotores-cebadores" que
tienen una secuencia "formadora de complejo" (es decir, un
cebador) lo suficientemente complementaria al extremo 3' de la
secuencia objetivo como para hibridizar solamente en el extremo 3'
de la secuencia objetivo, o cerca de él. El
promotor-cebador también incluye, localizado en 5'
respecto a la secuencia complejante, un promotor para una ARN
polimerasa.
Con "en" o "cerca de él" simplemente se
quiere indicar el extremo 3' de la molécula objetivo, y no
necesariamente toda la molécula de ARN que quiere detectarse. Por
ejemplo, el "objetivo" puede consistir en una pequeña porción
central de una molécula de ARN dentro de una molécula de ARN
mayor.
Con "uno o más" se quiere decir que los
promotor-cebadores que se añaden a la mezcla de
reacción son lo suficientemente similares como para ser capaces de
unirse aproximadamente a la misma secuencia objetivo en
aproximadamente la misma posición (más o menos alrededor de 10
bases, en la misma cadena) de tal forma que la amplificación de la
presente invención pueda proceder. Ello no excluye el proporcionar
otros oligonucleótidos a la mezcla, por ejemplo oligonucleótidos
"de ayuda" que asistan el proceso de hibridación de los
promotores-cebadores.
Con "consiste esencialmente en" tal como se
ha utilizado anteriormente, se quiere decir que la mezcla tiene
todos los reactantes y reactivos necesarios. Sin embargo, tal mezcla
puede contener también enzimas u otros sustituyentes que no afecten
de forma cualitativa el proceso de amplificación de la invención, y
la mezcla puede contener oligonucleótidos "de ayuda". Un
oligonucleótido "de ayuda" es una secuencia de ácidos nucleicos
que asiste a la formación del complejo entre el
promotor-cebador, u otros ácidos nucleicos
complejantes como la sonda, y la secuencia objetivo, y vendrá
determinada por la secuencia real en el extremo 3' de la secuencia
objetivo. Tales oligonucleótidos de ayuda se utilizan de forma
equivalente a los oligonucleótidos de ayuda en la hibridación
descritos por Hogan et al., U.S.Patent 5,030,557, es decir,
ayudando en la unión del promotor-cebador a su ácido
nucleico objetivo incluso si el ácido nucleico objetivo posee de
forma significativa estructura secundaria. A pesar de la similitud
en la utilización de tales oligonucleótidos de ayuda, es
sorprendente que tales oligonucleótidos de ayuda pudieran ser
utilizados en protocolos de amplificación sin efectos adversos sobre
la eficacia de tales procedimientos.
El promotor-cebador y la
secuencia objetivo se someten a unas condiciones en las cuales se
forme un híbrido promotor-cebador/secuencia objetivo
y se pueda iniciar la síntesis de ADN. Se cree que en esta reacción,
el extremo 3' de la secuencia objetivo se extiende en una reacción
de extensión de ADN a partir de una localización adyacente al
complejo hibridizado entre la secuencia complejante y la secuencia
objetivo. La secuencia promotora es el patrón para esta reacción de
extensión, que produce un primer producto de la extensión del ADN y,
de este modo, una secuencia promotora de doble cadena. El extremo 3'
del promotor-cebador puede servir también como
cebador, para una segunda reacción de extensión del ADN, reacción
que utiliza la secuencia objetivo como patrón y resulta en un
complejo de ácido nucleico de doble cadena; el complejo es un
complejo de ADN/ARN.
El primer producto de extensión del ADN es
utilizado seguidamente por una ARN polimerasa que reconoce el
promotor del promotor-cebador para producir
múltiples copias de ARN de la secuencia objetivo. De forma
sorprendente, en el caso del complejo de ARN/ADN o bien sólo ARN que
contiene la secuencia objetivo, una polimerasa de ARN dependiente de
ADN, como la ARN polimerasa T7, es capaz de "leer" el complejo
ARN/ADN o el ARN y producir ARN de cadena sencilla, y es así pues
eficaz en la presente invención.
En los ejemplos de realización preferidos, el
promotor-cebador posee una modificación que puede
contener un nucleotido modificado en o cerca de su extremo 3' que
inhibe o prohíbe la extensión del ácido nucleico en esa dirección.
Es sorprendente que la invención pueda ser llevada a cabo con el
extremo 3' del promotor-cebador modificado, y es
especialmente sorprendente que la utilización de una mezcla de un
promotor-cebador modificado y no modificado (o dos
promotores-cebadores modificados de forma distinta)
resulte en una mayor eficacia en la amplificación, y de esta forma
en un mayor número de copias, que la utilización de sólo un
promotor-cebador modificado o no modificado. Los
métodos para la creación de tales modificaciones de utilidad para
prevenir o disminuir el proceso de extensión del cebador son bien
conocidas en el campo de la técnica.
Cuando la secuencia objetivo consiste en ARN, un
aspecto adicional de la presente invención incluye la generación de
un extremo 3' de la secuencia objetivo mediante procesado o
degradación química o enzimática, de tal forma que la extensión del
extremo 3' de la secuencia objetivo pueda proceder a lo largo de la
región promotora del promotor-cebador. Tal
generación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la acción de
la ARNasa H sobre un híbrido de ARN:ADN (por ejemplo, un
promotor-cebador de ADN y un híbrido objetivo de
ARN), el tratamiento con exonucleasas, y la digestión con
endonucleasas de restricción específicas o ribozimas.
En otros ejemplos de realización preferidos, la
presente invención muestra la inclusión de uno o más oligonucleótido
"de ayuda" en la composición de la reacción.
En otros ejemplos de realización preferidos, el
extremo 5' de la cadena objetivo del ácido nucleico puede definirse
de forma que que detenga la reacción de extensión o bien la reacción
de transcripción. Los métodos para llevar a cabo tal definición son
bien conocidos en el campo de la técnica y pueden incluir el
complejar una secuencia apropiada de ácido nucleico (por ejemplo, un
oligonucleótido) al extremo 5' de la secuencia objetivo, o una
modificación del extremo 5' de la secuencia objetivo.
Una composición para su uso en la presente
invención puede consistir esencialmente en una secuencia objetivo,
un promotor-cebador, una ARN polimerasa, una ADN
polimerasa y/o una transcriptasa inversa y los reactivos y
condiciones tampón suficientes para permitir la amplificación. El
promotor-cebador puede incluir extremos 3'
modificados o no modificados. Una composición puede incluir una
mezcla de promotores-cebadores modificados o no
modificados y/o una mezcla de distintos promotores cebadores
apropiados para su utilización en al presente invención.
En un ejemplo de un ensayo típico que utiliza la
presente invención, se mezcla una muestra del ácido nucleico
objetivo a amplificar con un concentrado tampón que contiene el
tampón apropiado, sales, magnesio, trifosfatos de nucleótido, uno o
más promotores-cebadores, ditiotreitol, y
espermidina. Se añaden transcriptasa inversa y ARN polimerasa y la
reacción se incuba durante un tiempo que puede ir desde minutos
hasta horas a una temperatura constante adecuada entre, por ejemplo,
desde 37ºC a 42ºC, a la cual los enzimas son activos. La reacción se
puede llevar a cabo añadiendo una solución de la sonda, incubando
durante 10-30 minutos a 60ºC, añadiendo una solución
para hidrolizar selectivamente la sonda no hibridizada, incubando la
reacción durante 5-10 minutos a 60ºC, y midiendo la
quimioluminiscencia remanente en un luminómetro, tal como ha sido
descrito por Arnold, et al., en la International Application
no. WO 89/02476, que recibe el nombre de método "HPA". Los
productos de los métodos de la presente invención pueden ser
utilizados en muchos otros sistemas de ensayo, o para otros usos,
como sabrán aquellos con experiencia en el campo de la presente
técnica.
La presente invención contiene además un kit que
incorpora los componentes de la invención y hace posible una
aplicación sencilla de la invención. Tal kit puede incluir también
otros materiales que harían la invención parte de otros
procedimientos, y puede también adaptarse a una tecnología de
múltiples pozos.
Tal como se utilizan aquí, los siguientes
términos tienen los siguientes significados a menos que se
especifique de forma expresa lo contrario.
"Ácido nucleico" significa cualquier ARN o
ADN, junto con cualquier análogo de nucleótido u otras moléculas que
puedan hallarse presente en la secuencia y que no impidan que se
lleve a cabo la presente invención.
Un "patrón" es una molécula de ácido
nucleico que es capaz de ser copiada por una polimerasa de ácido
nucleico. Un patrón puede consistir en ARN, y puede ser de cadena
sencilla, de cadena doble o de cadena doble de forma parcial,
dependiendo de la polimerasa. La copia sintetizada es complementaria
al patrón.
Un "cebador" es un oligonucleótido que es
suficientemente complementario a un patrón de tal forma que
hibridiza (mediante enlaces por puente de hidrógeno o hibridización
bajo condiciones hibridizantes, por ejemplo, condiciones severas)
con el patrón para dar un complejo cebador/patrón apropiado para la
iniciación de la síntesis mediante una ADN polimerasa, como un
transcriptasa inversa, y que se alarga mediante la adición de bases
unidas covalentemente unidas a su extremo 3' que son complementarias
al patrón. El resultado es un producto de extensión del cebador.
Virtualmente todas las ADN polimerasas
(incluyendo las transcriptasas inversas) conocidas necesitan la
formación de un complejo de un oligonucleótido con un patrón de
cadena sencilla ("cebado") para iniciar la síntesis de ADN.
Bajo circunstancias apropiadas, un cebador puede ser parte de un
promotor-cebador. Generalmente, tales cebadores
tienen una longitud de entre 0 y 100 bases, preferiblemente una
longitud de entre 20 y 50 bases.
Un "promotor" o "secuencia promotora"
es una secuencias de ácidos nucleicos específica que es reconocida
por una ARN polimerasa dependiente de ADN ("transcriptasa")
como una señal para unir a la molécula de ácido nucleico y empezar
la transcripción del ARN en un lugar específico. Para la unión,
tales transcriptasas requieren generalmente que el promotor y su
complemento sean de doble cadena; no es necesario que la parte del
patrón sea de doble cadena. Las ARN polimerasas dependientes de ADN
individuales reconocen una variedad de distintas secuencia
promotoras que pueden diferir de forma notable en su eficiencia en
la promoción de la transcripción. Cuando una ARN polimerasa se une a
la secuencia promotora para iniciar la transcripción, esa secuencia
promotora no es parte de la secuencia transcrita. Así pues, los
transcritos de ARN producidos de este modo no incluirán la secuencia
promotora.
Un promotor-cebador está formado
por un promotor y un cebador. Es un oligonucleótido que es lo
suficientemente complementario al extremo 3' de una secuencia de
ácido ribonucleico objetivo como para formar un complejo en o cerca
del extremo 3' de esa secuencia de ácido ribonucleico objetivo, lo
que quiere decir que el promotor-cebador forma un
complejo lo suficientemente cerca del final de la secuencia objetivo
como para que se cumplan los los requerimientos del ensayo, prueba,
clonación u otro uso del ácido nucleico amplificado. El
promotor-cebador se utiliza como patrón para crear
un secuencia de ácidos nucleicos complementaria que se extiende
desde el extremo 3' de una secuencia de ácido ribonucleico objetivo,
para resultar generalmente en un promotor de doble cadena, sometido
a cualquier actividad desnaturalizadora o enzimática que pueda
interrumpir la doble cadena.
Una ADN polimerasa dependiente de ADN- o ARN-
también crea una cadena complementaria a la molécula objetivo de
ácido nucleico, utilizando como patrón la porción de la secuencia
objetivo 5' a la región complementaria del
promotor-cebador.
El extremo 3' del
promotor-cebador puede modificarse, o bloquearse, de
forma que prohíba o inhiba una reacción de extensión que proceda de
allí. Una solución de promotor-cebador que contenga
promotor-cebador modificado y sin modificar consiste
en esencialmente la misma secuencia de ácidos nucleicos para el
propósito de la presente invención. El
promotor-cebador modificado no contiene un promotor
distinto ni una secuencia de reconocimiento distinta del
promotor-cebador no modificado. Ello quiere decir
que, en alrededor de 10 bases, los
promotores-cebadores modificados y no modificados
son reconocidos por la misma ARN polimerasa, y reconocen la misma
secuencia objetivo (aunque no necesariamente precisamente en la
misma posición). En uno de los ejemplos de realización preferidos,
los promotores-cebadores modificados y no
modificados o la mezcla de promotores-cebadores
modificados son idénticos excepto por la modificación. El extremo 3'
del promotor-cebador puede bloquearse de diversas
formas que son bien conocidos por aquellos con experiencia en el
campo de la técnica. Tales promotores-cebadores
tienen generalmente entre 40 y 100 bases de longitud,
preferiblemente entre 40 y 60 bases.
Una "secuencia de ácido ribonucleico
objetivo," o "secuencia objetivo," posee una secuencia de
ácidos ribonucleicos que se desea amplificar, es de cadena sencilla
y puede incluir otras secuencias junto a 5' o 3' de las secuencias a
amplificar que pueden o no ser amplificadas.
La secuencia de ácido ribonucleico objetivo
incluye las secuencias formadoras de complejos a la cual el
promotor-cebador hibridiza mientras se lleva a cabo
la presente invención. Cuando la secuencia de ácido ribonucleico
objetivo sea originalmente de cadena sencilla, el término hace
referencia a la cadena (+) o bien a la cadena (-), y también hará
referencia a la secuencia complementaria de la secuencia objetivo.
Cuando la secuencia de ácido ribonucleico objetivo sea originalmente
de doble cadena, el término hace referencia a ambas cadenas (+) y
(-).
La discusión sobre síntesis de ácidos nucleicos
se simplifica en gran manera y se hace más clara mediante la
adopción de ciertos términos para nombrar las dos cadenas
complementarias de un dúplex de ácido nucleico. Tradicionalmente, la
cadena que codifica la secuencia utilizada para producir proteínas o
ARNs estructurales recibía el nombre de la cadena "mas" y su
complemento recibía el nombre de la cadena "menos". En la
actualidad se sabe que en muchos casos ambas cadenas son
funcionales, y la asignación de la designación "mas" a una de
ellas y "menos" a la otra debe ser, por consiguiente,
arbitraria. No obstante, los términos son muy útiles para designar
la orientación de la secuencia de ácidos nucleicos, y se emplearán
aquí con tal propósito, con la cadena "mas" denominando la
cadena de la secuencia objetivo original que forma el complejo con
el promotor-cebador.
Una "ADN polimerasa dependiente de ADN" es
un enzima que sintetiza una copia complementaria de ADN a partir de
un ADN patrón. Algunos ejemplos son la ADN polimerasa I de E.
coli y la ADN polimerasa del bacteriofago T7. Todas las ADN
polimerasa dependientes de ADN conocidas necesitan un cebador
complementario para iniciar la síntesis. Se sabe que bajo las
condiciones apropiadas ciertas ADN polimerasas dependientes de ADN
pueden sintetizar una copia de ADN complementario a partir del
patrón de ARN.
Una "ARN polimerasa dependiente de ADN" o
"transcriptasa" es un enzima que sintetiza múltiples copias de
ARN a partir de una molécula de ADN de doble cadena o parcialmente
de doble cadena que tiene una secuencia promotora (generalmente de
doble cadena). Debería notarse que la presente invención incluye
promotores de cadena sencilla, así como las ARN polimerasas que los
reconocen. Las moléculas de ARN ("transcritos") se sintetizan
en la dirección 5' \rightarrow 3' de la molécula de ARN, empezando
en una posición especifica justo antes del promotor. Algunos
ejemplos de transcriptasas son las ARN polimerasas dependientes de
ADN de E. coli y de los bacteriófagos T7, T3, y SP6. Bajo
condiciones apropiadas, tal como se muestra aquí, algunas
transcriptasas pueden utilizar ARN o un copolímero ARN:ADN como
patrón.
Una "ADN polimerasa dependiente de ARN" o
"transcriptasa inversa" es un enzima que sintetiza una copia
complementaria de ADN a partir de un patrón de ARN. Todas las
transcriptasa inversas conocidas tienen también la habilidad de
fabricar una copia complementaria de ADN a partir de un patrón de
ADN; así pues, son al mismo tiempo ARN- y ADN polimerasas
dependientes de ADN. Se requiere un cebador para inicial la síntesis
tanto con los patrones de ARN como con los de ADN.
Una "ARNsa H" es un enzima que degrada la
parte del ARN de un dúplex ARN:ADN. Las ARNsas H pueden ser
endonucleasas o exonucleasas. La mayoría de los enzimas
transcriptasa inversa tienen normalmente actividad ARNsa H además de
su actividad polimerasa. Sin embargo, existen otras fuentes de ARNsa
H sin una actividad polimerasa asociada. La degradación puede
resultar en la separación del ARN de un complejo ARN:ADN. De forma
alternativa, la ARNsa H puede simplemente cortar el ARN en distintos
lugares, de tal forma que las porciones de ARN resultantes se
desnaturalicen o bien permitan a los enzimas que desenrollen partes
del ARN, o los fragmentos de ARN generados puedan servir como
cebadores para una ADN polimerasa.
Los términos "hibridización" y
"complejo" hacen referencia a la formación de un dúplex entre
las secuencias de nucleótido que son lo suficientemente
complementarias como para formar el dúplex (o "complejos") a
través de un emparejamiento de bases de tipo
Watson-Crick. Cuando un
promotor-cebador o un cebador "hibridiza" con
el objetivo (patrón), tales complejos (o híbridos) son lo
suficientemente estables como para funcionar como cebadores, tal
como requiere la ADN polimerasa para iniciar la síntesis de ADN.
El extremo 3' del cebador o del
promotor-cebador puede modificarse, o bloquearse,
para de esta forma prohibir o inhibir el inicio de una reacción de
extensión en este punto. Un cebador o un
promotor-cebador que tengan miembros modificados y
no modificados consiste esencialmente en la misma secuencia de
ácidos nucleicos para el propósito de la presente invención. En
otras palabras, el cebador o promotor-cebador
modificado no contiene una secuencia formadora de complejo (cebador)
distinta en términos de su especificidad en tanto que tanto el
oligonucleótido modificado como el no modificado hibridizan en la
misma posición (más o menos alrededor de diez bases) en la secuencia
de ácido nucleico objetivo de tal forma que la amplificación de la
secuencia objetivo no esta prohibida. Además, el
promotor-cebador modificado no contiene una
secuencia de reconocimiento (promotor) distinta del
promotor-cebador no modificado. Ello quiere decir
que, en alrededor de 10 bases, los cebadores o
promotores-cebadores modificados y no modificados
son iguales, son reconocidos por la misma ARN polimerasa, y
reconocen la misma secuencia objetivo (aunque no necesariamente
precisamente en la misma posición). En uno de los ejemplos de
realización preferidos, los cebadores o
promotores-cebadores modificados y no modificados
son idénticos excepto por la modificación.
El extremo 3' del cebador o
promotor-cebador puede modificarse de diversas
formas bien conocidas por aquellos con experiencia en el campo de la
técnica. Algunas modificaciones apropiadas a un
promotor-cebador pueden incluir la adición de
ribonucleótidos, residuos 3' deoxinucleótido, (por ejemplo,
cordicepina (CO, Glen Research)), residuos
3',2'-dideoxinucleótido, nucleótidos modificados,
como fosforotioatos, y enlaces no-nucleotídicos como
los que se describen en Arnold, et al., (PCT US 88/03173)
(RS) o modificaciones alcano-diol (Wilk et
al. Nuc. Acids Res. 18:2065, 1990) (RP), o la modificación puede
consistir simplemente en que la región 3' de la secuencia cebadora
no sea complementaria al ácido nucleico objetivo. Por supuesto,
también son posibles otras modificaciones que pueden ser
eficaces.
Se puede utilizar una mezcla de oligonucleótidos
modificados y no modificados en una reacción de amplificación, y se
han utilizado con éxito razones de oligonucleótido bloqueado a no
bloqueado desde 2:1 a 1,000:1. También se puede utilizar una mezcla
de oligonucleótidos con distintas modificaciones en 3'.
La Figura 1 muestra un
promotor-cebador y un ácido nucleico objetivo que
tiene un extremo 3' definido y, por tanto, no tiene secuencias 3'
adicionales a la secuencia objetivo, pero que sí que tiene
secuencias adicionales 5' a la secuencia objetivo.
La Figura 2 muestra una secuencia objetivo de ARN
que tiene secuencias 3' adicionales a la región complejante de la
secuencia objetivo.
La Figura 3 es una representación esquemática de
una modificación alcano diol o RP, o un oligonucleótido (línea en
zigzag).
La presente invención está dirigida a un método,
composición y a un kit para la amplificación de secuencias objetivo
de ácidos ribonucleicos específicas. Tales secuencias objetivo
amplificadas son útiles en ensayos para la detección y/o
cuantificación secuencias objetivo de un ácido nucleicos específicas
o para la producción de un gran número de copias de ADN y/o ARN de
la secuencia objetivo específica para diversos usos.
Utilizando la Fig. 1 como ilustración, la
presente invención presenta un método que comprende el tratamiento
de una secuencia objetivo 2 de un ácido nucleico, que es ARN, con un
oligonucleótido 4 que contiene un promotor-cebador
que contiene un promotor 6 y un cebador 8, donde el cebador 8 es lo
suficientemente complementario al extremo 3' parte 9 de la secuencia
objetivo para formar un complejo en o cerca del extremo 3' 9 de la
secuencia objetivo. El promotor-cebador 4 consiste
esencialmente solamente en una secuencia de ácido nucleico sencilla,
y no se necesitan introducir otros
promotores-cebadores en la mezcla de reacción para
conseguir la amplificación. Los promotores apropiados para el
promotor-cebador de la presente invención consisten
en secuencias de ácidos nucleicos (producidos de forma natural,
sintética o como un producto de una digestión de restricción) que
son reconocidos de forma específica por una ARN polimerasa que se
une a esa secuencia e inicia el proceso de transcripción en el cual
se producen los transcritos de ARN. La secuencia promotora puede
incluir de forma opcional bases nucleotídicas que se extiendan más
allá del lugar de reconocimiento exacto de la ARN polimerasa, que
puede impartir estabilidad adicional o la susceptibilidad a procesos
de degradación o una mayor eficiencia en la transcripción. Son
particularmente apropiadas las secuencia promotoras para las cuales
existe una polimerasa conocida y asequible. Tales promotores
incluyen aquellos reconocidos por las ARN polimerasas de los
bacteriófagos T3, T7 o SP6, o de E. coli.
En ciertas circunstancias puede ser deseable
introducir oligonucleótidos "de ayuda" en la mezcla, que
ayudaran al promotor-cebador a formar un complejo
con la secuencia objetivo.
El promotor-cebador 4 y la
secuencia objetivo 2 se someten a condiciones en las cuales se forma
el complejo 11 promotor-cebador/secuencia objetivo y
se puede iniciar la síntesis de ADN. Así pues, la mezcla de reacción
se incuba bajo condiciones en las cuales se forma un complejo
promotor-cebador/secuencia objetivo, incluyendo las
condiciones de cebado del ADN y síntesis del ácido nucleico
(incluyendo trifosfatos de ribonucleótido y trifosfatos de
desoxiribonucleótido) durante un periodo de tiempo suficiente
durante el cual se producen múltiples copias de la secuencia
objetivo. La reacción se lleva a cabo de forma ventajosa bajo unas
condiciones apropiadas para que se mantenga la estabilidad de los
componentes de la reacción, como los enzimas, y sin que se requiera
la modificación o manipulación de las condiciones de reacción
durante el curso de la reacción de amplificación. Así pues, la
reacción puede llevarse a cabo bajo unas condiciones que son de
hecho isotérmicas e incluyen una fuerza iónica y un pH
sustancialmente constantes. En otras palabras, las condiciones de
reacción pueden ser, de hecho, constantes, lo que quiere decir que
la temperatura, pH y concentración iónica no se alteran a propósito
de forma significativa de forma que ello afecte a las condiciones de
reacción. Los componentes de la mezcla de reacción pueden combinarse
de uno en uno o todos al mismo tiempo.
Mientras se lleva a cabo la reacción, el extremo
3' 9 de la secuencia objetivo se extiende mediante una ADN
polimerasa apropiada mediante una reacción de extensión utilizando
la secuencia promotora del promotor-cebador como
patrón para dar el producto de extensión del ADN 10 complementario a
la secuencia promotora. El extremo 3' de la región cebadora también
se extiende mediante una reacción de extensión, utilizando una
transcriptasa inversa apropiada, para formar una cadena 12
complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos objetivo. El
promotor de doble cadena resultante se utiliza seguidamente para
unir la ARN polimerasa apropiada, que, entonces, utiliza la
secuencia objetivo resultante de ácidos nucleicos de doble cadena
para producir múltiples copias de ARN de cadena sencilla (que serán
complementarias a la cadena (+) de la secuencia objetivo).
La ADN polimerasa para la extensión del
promotor-cebador debe ser una ADN polimerasa
dependiente de ARN (es decir, una transcriptasa inversa) cuando la
secuencia objetivo es ARN. Sin embargo, como todas las
transcriptasas inversas conocidas poseen también actividad ADN
polimerasa dependiente de ADN, no es necesario añadir una ADN
polimerasa dependiente de ADN distinta de la transcriptasa inversa
para llevar a cabo la reacción de extensión, incluyendo el caso en
que el promotor-cebador es ADN y la secuencia
objetivo es ARN. Las transcriptasas inversas apropiadas incluyen
transcriptasa inversa AMV y transcriptasa inversa MMLV.
La ARN polimerasa que se necesita para la
presente invención puede ser una ARN polimerasa dependiente de ADN,
como las ARN polimerasas de E. coli y de los bacteriófagos
T7, T3 y SP6; es sorprendente que tales ARN polimerasa dependientes
de ADN sean efectivas siendo la secuencia objetivo ARN.
El extremo 3' de la secuencia de ARN objetivo
debe definirse, tal como se muestra en la Fig. 1, de tal manera que
coincida aproximadamente con el extremo 5' del cebador del
cebador-promotor (es decir, la secuencia objetivo no
debe tener nucleótidos que se extiendan 3' después de la región que
forma el complejo con el cebador). La generación de este tipo de
extremo 3' del ácido nucleico objetivo mediante degradación o
procesado químico o enzimático es bien conocido en el campo de la
técnica.
Tal como se muestra en la Fig. 2, de forma
sorprendente la amplificación puede ser llevada a cabo sobre una
secuencia objetivo de ARN 14 que tiene una cadena de nucleótidos 16
que se extiende 3' más allá de la región 11 que forma el complejo
con el cebador.
Es una característica de la presente invención
que se puedan obtener múltiples copias de ARN.
En uno de los ejemplos de realización preferidos,
el promotor-cebador tiene una modificación en su
extremo 3' para evitar o disminuir la extensión a partir de este
extremo (a lo largo de la secuencia objetivo). Los métodos de
producir tales modificaciones son conocidos en el campo de la
técnica. Es sorprendente que la amplificación pueda llevarse a cabo
con el extremo 3' modificado de esta forma, y también es
sorprendente que utilizando una mezcla de
promotor-cebador modificado y no modificado resulte
en una amplificación de mayor eficiencia. Por ejemplo, se ha
encontrado que una razón de alrededor de 150
promotores-cebadores modificados a 1
promotor-cebador no modificado aumenta de forma
importante la eficiencia y la eficacia de la amplificación. Sin
embargo, esta razón cambiará de acuerdo con las condiciones de
reacción y los reactivos, como el promotor-cebador y
la secuencia objetivo.
En otro aspecto adicional, la invención muestra
un kit que contiene alguno o todos los reactivos, enzimas y
promotores-cebadores necesarios para llevar a cabo
la invención. Los artículos que comprenden el kit pueden
proporcionarse en viales separados o pueden mezclarse, cuando ello
sea apropiado.
Los siguientes ejemplos demuestran el
funcionamiento y la utilidad de la presente invención. No son
limitantes y no deberían ser considerados como tales.
Los enzimas utilizados en los siguientes ejemplos
son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar
(AMV), la ARN polimerasa T7, la transcriptasa inversa del virus
Moloney de la leucemia murina (MMLV), y Superscript (ARNsa H minus
MMLV RT, "MMLV SC RT") de Bethesda Research Laboratories. Se
pueden utilizar otros enzimas que posean actividades similares y
enzimas provinentes de otras fuentes. Otras ARN polimerasas con
diferentes especificidades por el promotor también pueden ser
apropiadas para su uso.
A menos que se especifique de otra manera, las
condiciones de reacción utilizadas en los siguientes ejemplos son
Tris-HCl 50 mM, pH 7.6, KCl 25 mM, MgCl_{2} 17.5
mM, ditiotreitol 5 mM, trihidrocloruro de espermidina 2 mM, rATP 6.5
mM, rCTP 2.5 mM, rGTP 6.5 mM, rUTP 2.5 mM, dATP 0.2 mM, dCTP 0.2 mM,
dGTP 0.2 mM, dTTP 0.2 mM, promotor-cebador 0.3
\muM, 600 unidades de transcriptasa inversa MMLV y 400 unidades de
ARN polimerasa T7, y cantidades específicas del patrón en volúmenes
de 100 \mul. Sin embargo, las mejores condiciones de reacción
variarán de acuerdo con los requerimientos del uso y las
circunstancias particulares; a partir de la presente revelación,
tales condiciones serán obvias para aquellos con experiencia en el
campo de la presente técnica. Las secuencias de oligonucleótidos
utilizadas representan solamente ejemplos y no son limitantes, ya
que se han utilizado otras secuencias para estas y otras secuencias
objetivo.
Para demostrar la invención utilizando una
secuencia objetivo con un extremo 3' definido, se incubó un
promotor-cebador (Sec. ID No. 1) que contenía una
secuencia complementaria al extremo 3' de ARNr de Ureaplasma
urealyticum 5S con ARN en presencia de ARN polimerasa T7 y
transcriptasa inversa MMLV durante cuatro horas. Se tomaron muestras
de la reacción a determinados intervalos y se analizaron por
hibridación con dos sondas del mismo sentido que el ARN objetivo
(Sec. ID Nos. 2, 3) en presencia de sondas de ayuda (Sec. ID Nos. 4,
5) tal como se describe en Hogan (U.S.Patent 5,030,557, Means for
Enhancing Nucleic Acid Hibridization).
| Tiempo de incubación | RLU | ||
| 1 fmol objetivo | 0.1 fmol objetivo | ||
| 15 min | 5,389 | 307 | |
| 30 min | 10,360 | 778 | |
| 60 min | 40,622 | 5,588 | |
| 120 min | 144,851 | 13,051 | |
| 180 min | 192,618 | 16,249 | |
| 240 min | 203,393 | 20,745 |
Para demostrar que la invención funciona con una
secuencia objetivo que contiene nucleótidos 3' respecto al lugar de
unión del promotor-cebador, se incubó un
promotor-cebador que contenía secuencias
complementarias a 21 bases de ARNr de Streptococcus
pneumoniae 16S, que corresponden a las bases
683-703 de la secuencia de referencia de E.
coli, (Sec. ID No. 6), con 1 fmol de ARNr sentido (+) de S.
pneumoniae en presencia de los enzimas que se muestran a
continuación. Diez \mul de la reacción se sometieron a un ensayo
con sondas marcadas con éster de acridinio de ambos sentidos (Sec.
ID No. 7), con sondas de ayuda (Sec. ID No. 8, 9), o sus
complementos. En un experimento separado, se hidrolizó parte de la
reacción con NaOH antes de hibridación.
| Enzimas | sonda de sentido (+) | sonda de sentido (-) | |
| MMLV RT + T7 | 434,463 | 7,333 | |
| MMLV SC RT + T7 | 2,617 | 3,579 | |
| MMLV RT, no T7 | 2,614 | 1,733 | |
| MMLV RT + T7, sin cebador | 1,753 | 3,840 | |
| MMLV RT + T7, sin NaOH | 615,299 | ||
| MMLV RT + T7, + NaOH | 2,499 |
Los resultados muestran que la amplificación de
la presente invención es dependiente de la transcriptasa inversa, de
la ARN polimerasa T7 y y de la actividad ARNsa H, y que el producto
predominante producido es ARN complementario al ARN objetivo.
Para determinar si se necesitaba la extensión del
extremo 3' del promotor-cebador para la
amplificación, se sintetizó un promotor-cebador con
modificaciones 3' utilizando química convencional, tal como se ha
descrito por Arnold et al. (RS; PCT US 88/03173) o Wilk,
et al., (RP; Figura 3 en Nucleic Acids Res. 18:2065, 1990), o
cordicepina (CO, Glen Research). Se midió el efecto de estas
modificaciones sobre la extensión de la transcriptasa inversa
mediante el siguiente experimento. Se hibridizó un
promotor-cebador con una secuencia complementaria
al ARNr de S. pneumoniae 16S (Sec. ID 6) al objetivo,
seguidamente se incubó en presencia de MMLV RT durante 30 min. Al
final de la reacción de extensión, el ARN y el ADNc se
desnaturalizaron a 95ºC durante dos minutos, y se sometieron a un
ensayo de protección de hibridación con una sonda del mismo sentido
que el ARNr (Sec. ID No. 7) con sondas de ayuda (Sec. ID Nos. 8,
9).
| RLU | |||
| Cantidad de objetivo: | 1 pmol | 0 pmol | |
| Cebador: | |||
| no modificado | 756,996 | 5,038 | |
| 3' RSL | 391,079 | 4,132 | |
| 3' RP | 68,153 | 4,365 | |
| 3' CO | 10,521 | 4,717 |
Los resultados indican que las modificaciones 3'
alteraron la extensión provocada por la transcriptasa inversa
respecto al cebador no modificado.
Para determinar si se requería la extensión del
extremo 3' para la amplificación de una secuencia objetivo con un
extremo 3' definido, el promotor-cebador
complementario al extremo 3' del ARNr de Ureaplasma
urealyticum 5S (Sec. ID 1), se modificó en el extremo 3' con RS,
y se incubó con 1 fmol del ARN objetivo, transcriptasa inversa MMLV
y ARN polimerasa T7. La hibridación con sondas tal como se describe
en el Ejemplo 1 indicó que no era necesaria una extensión eficaz del
promotor-cebador para la amplificación. La actividad
transcriptasa inversa era necesaria, tal como muestra la ausencia de
amplificación en la reacción que contiene solamente la ARN
polimerasa T7.
| Enzimas | RLU | ||
| no modificado | modificado | ||
| MMLV RT + T7 | 11,189 | 12,443 | |
| MMLV SC RT + T7 | 8,738 | 3,742 | |
| sólo T7 | 1,838 | 1,694 | |
| sin objetivo | 1,272 | 1,157 |
Para probar el efecto de las modificaciones 3'
sobre la amplificación de un objetivo que contenía secuencias 3'
respecto al lugar de unión del promotor-cebador, se
sintetizó un promotor-cebador que contenía
secuencias complementarias al ARNr de S. pneumoniae 16S,
(Sec. ID No. 6) con RS 3', RP 3', o una modificación de cordicepina
en 3'. Los promotores-cebadores modificados y no
modificados se incubaron con ARNr de S. pneumoniae,
transcriptasa inversa MMLV y ARN polimerasa T7 a 37ºC durante 4 hr.
Diez \mul de la reacción se sometieron a ensayo con una sonda del
mismo sentido que el ARN objetivo.
| RLU | ||||
| cebador | objetivo 1 fmol | objetivo 0.1 fmol | objetivo 0 | |
| no modificado | 39,652 | 7,952 | 2,785 | |
| 3' RSL | 227,639 | 15,732 | 3,117 | |
| 3' RP | 556,708 | 589,168 | 3,368 | |
| 3' CO | 509,262 | 30,004 | 3,219 |
De forma sorprendente, los datos muestran que las
modificaciones en el extremo 3' del promotor-cebador
hacen aumentar la señal observada con este mecanismo de
amplificación.
El siguiente experimento se llevó a cabo para
demostrar la cinética de la acumulación de producto con
promotores-cebadores con extremos 3' modificados o
no modificados. Se incubó un promotor-cebador que
contenía secuencias complementarias al ARNr de M. tuberculosis 23S
con 1 fmol de ARNr de M. tuberculosis en presencia de MMLV RT y ARN
polimerasa T7. En los momentos que se indican a continuación, se
recogieron muestras que se sometieron a ensayo con una sonda marcada
con éster de acridinio con el mismo sentido que el ARN objetivo. El
RLU de fondo de las reacciones libres del objetivo se sustrajeron de
los datos.
| Tiempo | No modificado | 3' RS | 3' RP | |
| 0 min | 0 | 0 | 0 | |
| 15 min | 2,266 | 430 | 43 | |
| 30 min | 7,622 | 1,532 | 214 | |
| 60 min | 9,349 | 9,584 | 1,403 | |
| 120 min | 15,281 | 32,007 | 150,781 | |
| 180 min | 24,528 | 38,086 | 590,033 | |
| 240 min | 23,866 | 46,276 | 868,145 |
Los datos muestran que los
promotores-cebadores no modificados y modificados RS
3' acumulan el producto de forma lineal, mientras que parece que el
promotor-cebador RP 3' acumula el producto de una
forma más exponencial. Este resultado también fue inesperado, e
implica un mecanismo único de amplificación que ocurre a una
temperatura, pH y fuerza iónica esencialmente constantes.
En este ejemplo, se incubaron distintos
promotores-cebadores con ARNr de S.
pneumoniae durante 4 horas en presencia de 600 unidades de
transcriptasa inversa AMV y 400 unidades de ARN polimerasa T7. Diez
\mul de la muestra se sometieron a un ensayo con una sonda marcada
con éster de acridinio del mismo sentido que el ARN objetivo.
| objetivo 1 fmol | objetivo 0 fmol | ||
| No modificado | 66,042 | 3,607 | |
| 3' RP | 359,597 | 3,411 | |
| 3' CO | 110,260 | 2,984 |
Los datos muestran que los
promotores-cebadores modificados en 3' resultan en
una mayor señal que la versión no modificada con transcriptasa
inversa AMV.
El siguiente experimento demostró que los
aditivos (DMSO y glicerol) aumentan la eficacia (sensibilidad) del
sistema de amplificación. Se añadieron
promotores-cebadores modificados o no modificados
(Sec. ID No. 6) a ARNr de S. pneumoniae en presencia de
transcriptasa inversa MMLV y ARN polimerasa T7 y se incubaron a 37ºC
durante 4 horas. Diez \mul de la reacción se sometieron a un
ensayo con una sonda marcada con éster de acridinio del mismo
sentido que el ARN objetivo, y se sustrajeron los valores
negativos.
| Cebador | DMSO/gly | 0.1 fmol | 0.01 fmol | |
| no modificado | - | 3,176 | 18 | |
| + | 1,468 | 763 | ||
| 3' CO | - | 5,168 | 668 | |
| + | 46,915 | 3,070 | ||
| 3' RP | - | 83,870 | 7,400 | |
| + | 935,945 | 117,051 |
Los datos muestran que los aditivos tienen un
efecto pequeño sobre los resultados con el
promotor-cebador no modificado, pero incrementan la
señal de forma significativa con los
promotores-cebadores modificados en 3', siendo el
efecto más marcado con la versión RP 3'.
\newpage
En este experimento, se sintetizaron
promotor-cebadores con una secuencia complementaria
a la del ARNr 23S de M. tuberculosis (Sec. ID No. 10) con uno (ribo)
o dos (diribo) desoxicitidinas 3' terminales reemplazadas con uno o
dos residuos ribocitidina 3', o con un desoxinucleótido
fosforotioato (PS) 3' terminal. Estos
promotores-cebadores modificados se utilizaron para
amplificar el ARNr de M. tuberculosis en Tris HCl 50 mM, pH 8,
MgCl_{2} 20 mM, KCl 35 mM, GTP, ATP, UTP y CTP 4 mM y dTTP, dGTP,
dCTP y dATP 1 mM, N-acetil-cisteína
15 mM, glicerol 10%, DMSO 10%, 600 unidades de MMLV transcriptasa
inversa, y 400 unidades de ARN polimerasa T7, a 42ºC durante 4
horas. Cinco \mul de cada reacción se calentaron a 95ºC durante 2
minutos y se sometieron a un ensayo con una sonda del mismo sentido
que el ARNr objetivo (Sec. ID # 11), con sondas de ayuda ID 12 y
13.
| Objetivo Tmol: | 3,000 | 300 | 30 | 3 | 0 |
| Cebador | |||||
| No modificado | 11,162 | 1,508 | 931 | 779 | 807 |
| 3' RP | 1,901,532 | 1,494,050 | 531,419 | 14,243 | 658 |
| 3' ribo | 57,401 | 3,992 | 644 | 670 | 589 |
| 3' diribo | 34,265 | 11,459 | 1,445 | 666 | 584 |
| No modificado | 1,799 | 877 | N.T. | 782 | |
| 3' PS | 266,755 | 12,567 | 1,617 | 656 |
Los resultados mostraron que los
promotor-cebadores con uno o dos ribonucleótidos en
el extremo 3', o con una unión fosforotioato 3', proporcionan una
mejor amplificación en este sistema que los
promotores-cebadores no modificados.
Otro método para alterar la extensión del
promotor-cebador mediante una transcriptasa inversa
fue la mezcla del promotor-cebador no modificado con
un promotor-cebador bloqueado modificado con
cordicepina. La utilización de una mezcla de
promotores-cebadores haría disminuir de forma
significativa la producción de ADNc observada en una reacción de
transcripción inversa, tal como se ha observado para otras
modificaciones en 3'. El siguiente experimento utilizó
promotores-cebadores con una secuencia
complementarias al ARNr de M. tuberculosis 16S (Sec. ID.# 14), bien
modificado con cordicepina o no modificado. Los
promotores-cebadores se incubaron con 3 tmol de ARNr
de M. tuberculosis, 300 unidades of transcriptasa inversa MMLV y 200
unidades de ARN polimerasa T7, utilizando las mismas condiciones que
en el ejemplo 9 excepto en que se añadió cloruro de trimetil amonio.
Después de una incubación de 2 horas a 42ºC, veinte \mul de la
reacción se sometieron a un ensayo con una sonda del mismo sentido
que el ARN objetivo (Sec. ID 15, with helpers #16, 17). Los
resultados son el promedio de 5 repeticiones.
| Objetivo | cebador 3'CO | cebador no modificado | RLU | |
| + | 15 pmol | 0 pmol | 1,879 | |
| + | 14.9 pmol | 0.1 pmol | 191,988 | |
| - | 15 pmol | 0 pmol | 1,055 |
Como se puede observar, una mezcla de promotor
cebador modificado y no modificado funciona mejor que un promotor
cebador completamente modificado. Variando la razón (por ejemplo,
entre de 1:1 a 150:1) de promotor-cebador modificado
a no modificado aumenta de forma efectiva la eficiencia de la
amplificación. La razón óptima cambiará de acuerdo a las condiciones
de reacción, incluyendo los reactivos utilizados, la secuencia
objetivo, y el promotor-cebador. La selección de las
condiciones apropiadas para una amplificación dada está dentro de
las habilidades de alguien versado en el campo de la presente
técnica sin excesiva experiencia.
En un experimento separado, las señales obtenidas
de la amplificación se compararon a referencias conocidas, y el
grado de amplificación calculado fue de 2.6 x 10^{5} veces.
En este ejemplo, se llevaron a cabo reacciones
como en el Ejemplo 10, excepto que los promotores cebadores eran no
modificados o modificados con RP o con CO. Se añadieron treinta tmol
de objetivo a cada reacción. Tal como se muestra, una mezcla de
promotores cebadores con distintas modificaciones en 3' resulta en
una amplificación significativa.
\newpage
| Cebador | RLU | |||
| 3' CO | 3'RP | No modificado | ||
| 15 pmol | -- | 0.1 pmol | 802,374 | |
| 13 pmol | 2 pmol | -- | 440,854 |
Se mostró que la cantidad de producto no
específico generado era mucho menor con los cebadores modificados,
evidenciando de esta manera otra ventaja de la invención.
El aumento del número de copias complementarias
de la secuencia objetivo con el tiempo requiere la transcriptasa
inversa y la ARN polimerasa T7. Cuando el
promotor-cebador hibridiza al extremo 3' de un
objetivo, la copia de la secuencia promotora T7 resulta en un
promotor de ADN de doble cadena que puede ser reconocido por la ARN
polimerasa T7 y utilizado para fabricar copias de ARN de la
secuencia objetivo. Los resultados con los
promotores-cebadores modificados en 3' implican que
la ARN polimerasa T7 estaba utilizando el ARN como patrón para la
síntesis del ARN. Se fabricaron oligonucleótidos sintéticos para
poner a prueba esta hipótesis. El primer oligonucleótido fue un
promotor-cebador de ADN, que contenía una secuencia
promotora T7 5' unida a la secuencia de unión objetivo 3'. También
se sintetizó otro oligonucleótido que contenía solamente la
secuencia promotora. La secuencia objetivo consistía en una molécula
quimérica de ARN:ADN que contenía la secuencia objetivo de ARN
sintético 5' con el complemento de ADN de la secuencia promotora T7
unida al extremo 3'.
En este experimento 10 o 1 fmol del
ARN-ADN quimérico objetivo se hibridizaron con el
promotor-cebador que contenía el promotor T7 y una
secuencia de unión objetivo, o sólo la secuencia promotora, dejando
la cadena de ARN objetivo en forma de cadena única. Los híbridos se
incubaron con o sin ARN polimerasa T7 y los productos se
hibridizaron con una sonda del mismo sentido que la secuencia de ARN
objetivo.
| Promotor-cebador | RLU | |||
| 10 fmol | 1fmol | |||
| +T7 | -T7 | +T7 | -T7 | |
| Pro+objetivo | 146,060 | 2,490 | 16,532 | 2,721 |
| sólo pro | 425,127 | 2,753 | 33,474 | 2,557 |
Sorprendentemente, los datos muestran que un
fragmento de ARN puede ser utilizado por la ARN polimerasa T7 como
patrón para la transcripción de ARN.
El siguiente experimento mostró que una cadena de
ARN puede ser utilizada para sintetizar ARN en presencia de
transcriptasa inversa y ARN polimerasa T7. En este experimento, el
ARN:ADN quimérico objetivo se comparó a un fragmento de ARN
sintético que contenía solamente la secuencia objetivo.
| Objetivo | T7 | RT | 10 fmol | 1 fmol |
| quimera de ARN:ADN | + | MMLV | 1,369,888 | 264,864 |
| + | AMV | 334,139 | 118,406 | |
| - | - | 5,066 | ||
| ARN objetivo | + | MMLV | 13,609 | 3,875 |
| + | AMV | 26,318 | 4,824 | |
| - | - | 5,862 |
Los presentes ejemplos de realización de esta
invención se consideran en todos los aspectos ilustrativos y no
restrictivos, y el alcance de la invención viene indicado por las
reivindicaciones que se incluyen más adelante, más que por la
descripción anterior, y, así pues, se pretende que todos los cambios
que aparezcan dentro del significado y del rango de equivalencia de
las reivindicaciones se halle incluidos en él.
(1) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGCG TAGCGATGAC CTATTTTACT TGC
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAACACAGA AGTCAAGCAC TCTAGAGCCG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGATCATAT CAGAGTGGAA ATACCTGTTC CCATCC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAGTGATCA TATCAGAGTG GAAATACCTG TTCC
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAAGTAAAA TAGGTCATCG CTACGC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACTA CGCATTTCAC CGCTACAC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTTAACCA TAGTAGGCTT TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGCGCAGGC GGTTAGATAA GTCTGAAGTT AAAGGCTGT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAACTGTTT AACTTGAGTG CAAGAGGGGA GAGTGG
\hfill36
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCA GGCCACTTCC GCTAACC
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGGATATG TCTCAGCGCT ACC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGCTGAGAG GCAGTACAGA AAGTGTCGTG GTTAGCGG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTAACCGG GTAGGGGTTG TGTGTGCGGG GTTGTG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC ACAGCCGTCA CCCCACCAAC AAGCT
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTTGTGGT GGAAAGCGCT TTAG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGATAGGA CCACGGGATG CAT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGTGTGGGA TGACCCCGCG
\hfill20
Claims (42)
1. Un método para la amplificación de una
secuencia de ácido ribonucleico objetivo de cadena sencilla que
comprende:
(a) la incubación de dicha secuencia objetivo de
ácido ribonucleico objetivo con una o más secuencias de ácido
nucleico promotoras-cebadoras que contienen una
secuencia promotora reconocible o una ARN polimerasa y una secuencia
cebadora complementaria a dicha secuencia de ácido ribonucleico
objetivo, donde dicha secuencia cebadora es lo suficientemente
complementaria como para formar un complejo con dicha secuencia de
ácido nucleico objetivo solamente en o cerca del extremo 3' de dicha
secuencia de ácido nucleico objetivo,
una ADN polimerasa y
dicha ARN polimerasa,
a una temperatura y en una solución eficaces para
permitir la amplificación de dicha secuencia de ácido nucleico
objetivo; y
(b) la producción de múltiples copias de una
secuencia de ARN complementaria a dicha secuencia de ácidos
ribonucleico objetivo.
2. Un método para la amplificación de una
secuencia de ácido ribonucleico objetivo que consiste en:
(a) la incubación de dicha secuencia objetivo de
ácido ribonucleico objetivo con una o más secuencias de ácido
nucleico promotoras-cebadoras que contienen una
secuencia promotora reconocible or una ARN polimerasa y una
secuencia cebadora complementaria a dicha secuencia de ácido
ribonucleico objetivo, donde dicha secuencia cebadora es lo
suficientemente complementaria como para formar un complejo con
dicha secuencia de ácido nucleico objetivo solamente en o cerca del
extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo,
una ADN polimerasa y
dicha ARN polimerasa,
a una temperatura y en una solución eficaces para
permitir la amplificación de dicha secuencia de ácido nucleico
objetivo; y
(b) la producción de múltiples copias de una
secuencia de ARN complementaria a dicha secuencia de ácidos
ribonucleico objetivo.
3. El método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde dichos uno o más
promotores-cebadores contienen al menos un
promotor-cebador no modificado capaz de ser
extendido por dicha ADN polimerasa para formar un complemento de
dicha secuencia de ácido ribonucleico objetivo.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el cual al menos uno de dichos uno o más
promotores-cebadores es un
promotor-cebador modificado que contiene un
nucleótido modificado en su extremo 3' para prevenir o disminuir que
la reacción de extensión de ácido nucleico proceda a partir de este
punto.
5. El método de la cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde dichos uno o más
promotores-cebadores contienen uno o más
promotores-cebadores modificados que contienen un
nucleótido modificado en su extremo 3' para prevenir o disminuir que
la reacción de extensión de ácido nucleico proceda a partir de este
punto y uno o más promotores-cebadores no
modificados, en una razón que permita producir la amplificación.
6. El método de la reivindicación 5 donde dichos
uno o más promotores-cebadores contienen un
promotor-cebador modificado y uno o más
promotores-cebadores no modificados en una razón
entre alrededor de 150:1 a 1:1, respectivamente.
7. El método de la reivindicación 4, 5 o 6 donde
dichos uno o más promotores-cebadores modificados
han sido modificados mediante la adición de uno o más
ribonucleótidos, desoxinucleótido fosforotioato 3' terminal,
3'-RS (unión no nucleotídica), un residuo
3'-alcano, o 3'-cordicepina.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende además la provisión de un
agente para crear una definición en el extremo 5' de dicha secuencia
de ácido ribonucleico objetivo de tal forma que la reacción de
extensión en la que está implicada dicha secuencia de ácido
ribonucleico objetivo se detendrá en dicha
definición.
definición.
9. El método de la reivindicación 8 en el cual
dicho agente contiene una secuencia de ácido nucleico de definición
lo suficientemente complementaria a dicho extremo 5' de dicha
secuencia de ácido ribonucleico objetivo para permitir que forme un
complejo con dicho extremo 5' de dicha secuencia de ácido
ribonucleico objetivo a dicha temperatura y en dicha solución.
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, donde se proporcionan uno o mas nucleótidos
de ayuda.
11. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde dicha secuencia de ácido nucleico
objetivo contiene nucleótidos en su extremo 3' que no están dentro
de dicho complejo formado entre dicha secuencia de ácido
ribonucleico objetivo y dichos uno o más
promotores-cebadores.
12. El método de la reivindicación 11, donde el
extremo 3' de dicha secuencia de ácido ribonucleico objetivo se
genera mediante degradación o procesado químico o enzimático.
13. El método de la reivindicación 12 donde dicha
degradación o procesado químico o enzimático comprende el
tratamiento con una exonucleasa.
14. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, donde la mezcla de amplificación posee
además actividad ARNasa H.
15. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, donde dicha ADN polimerasa es una
transcriptasa inversa.
16. El método de la reivindicación 15, donde
dicha transcriptasa inversa es transcriptasa inversa AMV.
17. El método de la reivindicación 15, donde
dicha transcriptasa inversa es transcriptasa inversa MMLV.
18. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, donde dicha incubación se lleva a cabo a
una temperatura esencialmente constante.
19. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3 a 18, donde dicha secuencia de ácido nucleico
objetivo y dichos uno o más promotores-cebadores se
incuban conjuntamente con anterioridad a la adición de dicha ADN
polimerasa y dicha ARN polimerasa.
20. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, donde dicha ARN polimerasa es una ARN
polimerasa dependiente de ADN.
21. El método de la reivindicación 20 donde dicha
ARN polimerasa dependiente de ADN se selecciona de entre el grupo
consistente en ARN polimerasa T7, T3 ARN polimerasa y ARN polimerasa
SP6.
22. Un método para la amplificación de una
secuencia de ácido ribonuleico objetivo, donde dicha secuencia se
amplifica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 y
dichas copias múltiples se detectan utilizando una sonda de
hibridación de ácido nucleico.
23. Un kit que contiene:
(a) secuencias de ácido nucleico
promotor-cebador que contienen una secuencia
promotora que puede ser reconocida por una ARN polimerasa y una
secuencia cebadora localizada 3' respecto a dicha secuencia
promotora, siendo dicha secuencia cebadora capaz de complejar
solamente en o cerca del extremo 3' de una secuencia de ácido
ribonucleico de cadena sencilla objetivo, conteniendo dichos
promotores-cebadores uno o más
promotores-cebadores que están modificados tal como
se ha definido en la reivindicación 4 y uno o más
promotores-cebadores no modificados en una razón que
permita que se produzca la amplificación,
(b) una ADN polimerasa, y
(c) dicha ARN polimerasa.
24. El kit de la reivindicación 23, donde dicha
ADN polimerasa es una transcriptasa inversa.
25. El kit de la reivindicación 23 o de la
reivindicación 24 que contiene además uno o más oligonucleótidos de
ayuda.
26. El kit de la reivindicación 23, 24 o 25 que
contiene además una sonda apropiada para un ensayo de hibridación de
ácido nucleico.
27. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
24 a 26, en el cual dicha transcriptasa inversa es transcriptasa
inversa AMV o transcriptasa inversa MMLV.
28. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
23 a 27, en el cual dicha ARN polimerasa es una ARN polimerasa
dependiente de ADN de los bacteriófagos T7, T3 o SP6.
29. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
23 a 28, donde dichos uno o mas promotores-cebadores
modificados contiene un desoxinucleótido fosforotioato 3' terminal,
3'-RS (unión no nucleotídica), un residuo
3'-alcano-diol, o
3'-cordicepina.
30. El kit de la reivindicación 29, donde dichos
promotores-cebadores modificados son
alcano-diol 3'.
31. El kit de la cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 30, donde dichos
promotores-cebadores modificados y no modificados
están presentes en una razón de alrededor de 1:1 a 150:1
respectivamente.
32. Un kit que contiene:
diversos promotores-cebadores
cada uno de los cuales contiene una secuencia promotora que puede
ser reconocida por una ARN polimerasa y una secuencia cebadora
localizada en 3' respecto a dicha secuencia promotora, siendo dicha
secuencia cebadora capaz de complejar solamente en o cerca del
extremo 3' de una secuencia de ácido ribonucleico objetivo de cadena
sencilla, y donde al menos uno de dichos
promotores-cebadores es un primer
promotor-cebador modificado, y otro es un segundo
promotor-cebador modificado, donde cada uno de
dichos primer y segundo promotores-cebadores
modificados contiene un nucleótido modificado en el extremo 3' para
prevenir o disminuir que la reacción de extensión de ácido nucleico
proceda a partir de este punto bajo condiciones que permitan la
amplificación de dicho objetivo y dicho nucleótido modificado sea
distinto de dichos primer y segundo
promotores-cebadores.
33. Un ácido nucleico formado esencialmente por
una secuencia escogida de entre el grupo formado por Sec. ID Nos 6,
10 y 14 a 17 o, en el caso de las Sec. ID Nos 15, 16 y 17, una
secuencia complementaria a ellas.
34. El ácido nucleico de la reivindicación 33
formado por la Sec. ID No. 6.
35. El ácido nucleico de la reivindicación 33
formado por la Sec. ID No. 10.
36. El ácido nucleico de la reivindicación 33
formado por la Sec. ID No. 14.
37. El ácido nucleico de la reivindicación 33
formado por la Sec. ID No. 15 o una secuencia complementaria a
ella.
38. El ácido nucleico de la reivindicación 33
formado por la Sec. ID No. 16 o una secuencia complementaria a
ella.
39. El ácido nucleico de la reivindicación 33
formado por la Sec. ID No. 17 o una secuencia complementaria a
ella.
40. Un kit que comprende los ácidos nucleicos
formado por la Sec. ID Nos. 6 a 9.
41. Un kit que comprende los ácidos nucleicos
formado por la Sec. ID Nos. 10 a 13.
42. Un kit que comprende los ácidos nucleicos
formado por la Sec. ID Nos. 14 a 17.
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