HU216105B - Amplifikációs eljárás önfenntartó szekvenciareplikációs rendszerrel - Google Patents
Amplifikációs eljárás önfenntartó szekvenciareplikációs rendszerrel Download PDFInfo
- Publication number
- HU216105B HU216105B HU1165/90A HU116590A HU216105B HU 216105 B HU216105 B HU 216105B HU 1165/90 A HU1165/90 A HU 1165/90A HU 116590 A HU116590 A HU 116590A HU 216105 B HU216105 B HU 216105B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- rna
- dna
- nucleic acid
- sequence
- target
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Exchange Systems With Centralized Control (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Error Detection And Correction (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Reverberation, Karaoke And Other Acoustics (AREA)
- Optical Communication System (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás egymást nem átfedő 5'-alfragmenst és 3'-alfragmenst tartalmazó cél RNS-részlet amplifikálására, melynek sőrána cél RNS-részletet egy alábbi kőmpőnensekből álló re kcióeleggyelhőzzák kapcsőlatba: a) egy egyszálú DNS első primer, mely a célrészlet3'-alszegmensével megfelelően kőmplementer szekvenciát, és ahhőzműködőképesen kapcsőlódó prőmőter szekvenciát tartalmaz; b) egyegyszálú másődik primer, amely a célrészlet 5'-alszegmensénekrészszekvenciáját tartalmazza; c) a prőmőtert felismerni képes RNS-pőlimeráz aktivitású enzim; d) egy DNS-függő DNS-pőlimeráz hatásúenzim; e) egy RNS-függő DNS-pőlimeráz aktivitású enzim; f)ribőnűkleőzid és dezőxi-ribőnűkleőzid trifőszfatázők és g) egy RN-áz Haktivitású enzim, ahől a képződött, működőképes prőmőtert és a célRNS-részlet szekvenciájának megfelelő DNS-t tartalmazó templátból azRNS-pőlimeráz aktivitású enzim hatására transzkripcióval keletkezett RS a tővábbi amplifikáció célőbjektűma, és ahől az eljárástfőlyamatősan, a nűkleinsav-dűplexek lényeges hődenatűrálása nélkülvégzik. ŕ
Description
A jelen találmány tárgya a molekuláris biológia és a rekombináns DNS technológia általános fejlődéséhez kapcsolódik.
Részletesebben, a jelen találmány a biológiai mintákban jelen lévő cél nukleinsav-szekvenciák, illetve a megfelelő cél DNS-szekvenciákból extrapolált RNS-szekvenciák in vitro vagy ex vivő szabályozásának detektálására, és az ilyen RNS- (DNS-)szekvenciát kódoló megfelelő polipeptidek eredetének felderítésére alkalmas eljárásokra és eszközökre vonatkozik, beleértve a mérési eljárásokat és a szükséges reagenseket, illetve eszközöket tartalmazó gyógyszerészeti kiteket (készleteket) is.
A találmány tárgya eljárás egymást nem átfedő 5’alffagmenst és 3’-alfragmenst tartalmazó cél RNS-részlet amplifikálására. Az eljárás során
i) a cél RNS-részletet egy alábbi komponensekből álló reakcióeleggyel hozzuk kapcsolatba:
a) egy egyszálú DNS első primer, mely a célrészlet 3’-alszegmensével megfelelően komplementer szekvenciát és ahhoz működőképesen kapcsolódó promoter szekvenciát tartalmaz;
b) egy egyszálú DNS második primer, mely a célrészlet 5’-alszegmensének részszekvenciáját tartalmazza;
c) a promotert felismerni képes RNS-polimeráz aktivitású enzim;
d) egy DNS-fuggő DNS-polimeráz hatású enzim;
e) egy RNS-fuggó DNS-polimeráz aktivitású enzim;
f) ribonukleozid és dezoxi-ribonukleozid-trifoszfatázok és
g) egy RN-áz H aktivitású enzim, ii) a reakcióelegyben megfelelő körülmények között, a képződött, működőképes kettős szálú promotert és a cél RNS-részlet szekvenciáját tartalmazó templátból az RNS-polimeráz aktivitású enzim hatására transzkripcióval keletkezett RNS-t további amplifikáció célobjektumaként alkalmazzuk, melynek során RNS-függő DNSpolimeráz aktivitású, DNS-fuggő DNS-polimeráz aktivitású enzime(ke)t, RNS-polimeráz aktivitású enzimet és két prímért használva, ahol az eljárást folyamatosan, a nukleinsav-duplexek lényeges hődenaturálása nélkül végezzük.
A jelen találmányt az ilyen, sajátságos nukleinsavcélszekvenciák összetartozó, egy rendszerben (egy edényben) végbemenő in vitro rendszere amplifikációjának biztosítása jellemzi, ahol a cél nukleinsav-szekvenciák amplifikációját a tetszés szerinti önreplikációs képességgel rendelkező, többszörös transzkripciós termékek létrehozása során hajtjuk végre. Ezekben az önfenntartó amplifikációs rendszerekben elkerülhető a nukleinsav-duplexek egyébként szükségszerű, hőmérsékletciklusokat igénylő ismételt denaturálása. A jelen találmány újszerű módon épül fel, egyesítve az összes reagenst, ami az amplifikációs termék egyetlen reakcióban végbemenő szabályozásának létrehozásához szükséges, vagy azt a terméket, ami az amplifikált forma detektálására alkalmas, így szemléltetve a cél nukleinsav-szekvencia jelenlétét.
A jelen találmányt az egyéni és az általános patogén betegségekre és állapotokra jellemző RNS-szekvenciák és extrapolált DNS-szekvenciák elemzése során alkalmazzák, ami a szükséges cél nukleinsav-szekvenciát tartalmazó testnedvekből és szövetekből elvégzett in vitro vagy ex vivő nukleinsav-próbák hibridizációjának mérésével történik.
A találmány háttere
A szakmában rendkívül fontos a biológiai mintákban előforduló sokféle nukleinsav-szekvencia detektálása, amikor is az adott szekvencia - az úgynevezett cél nukleinsav - rendkívül kis mennyiségben fordul elő a számos egyéb nukleinsav-fajta között (beleértve az RNSeket, DNS-eket vagy mindkettőt). Szükséges a kóros betegségekhez és állapotokhoz kapcsolódó polipeptideket - így például a humán immunhiányos betegséget okozó vírushoz (HIV-I) kapcsolódó nukleinsav-szekvenciáját - kódoló nukleinsavak detektálása. Továbbá az ilyen polipeptideket kódoló nukleinsav-szekvenciák detektálása során szükséges a kóros betegségekre és állapotokra jellemző egyéb nukleinsav-szekvenciák detektálása is, mint például a hiányos gének működése, például a hemofília esetében a defektív humán béta-globulin detektálása.
Az említett nukleinsavak a vizsgálandó egyénből származó biológiai mintákban, például a vérben, testnedvekben vagy szövetmintákban asszociált formában, az összes többi nukleinsavhoz képest rendkívül kis mennyiségben vannak jelen. Az ilyen nukleinsav-fajták detektálásához szükséges specifitás jelenlétében azok széles körben detektálhatok és mérhetők a környezetükben lévő nukleinsavak között, melyekkel asszociálódtak. Ezek a fajták, legalábbis egyes izolált részleteikben, a cél nukleinsawal közel homológok lehetnek. Továbbá, amint ezt már feljebb megjegyeztük, az említett cél nukleinsav-fajták az esetek túlnyomó többségében a vizsgálandó biológiai mintákban rendkívül kis mennyiségben fordulnak elő. Azonban a betegség megfelelő diagnózisának felállításához nélkülözhetetlen az említett cél nukleinsavak ilyen rendkívül kis mennyiségének az egyértelmű detektálása a mérési rendszer hitelességének céljából.
A probléma megoldására számos megközelítéssel próbálkoztak. Az egyik esetben a mintában lévő nukleinsavat nem alakították át, illetve nem befolyásolták. Helyette egy olyan rendszert fejlesztettek ki, amelyben a detektálható molekulák túlnyomó többsége megfelel annak a nukleinsavnak, melyet a könnyű detektálhatóság, illetve mérhetőség céljából hoztak létre. Ilyen például az úgynevezett jelképző rendszer, mely a cél nukleinsavszekvenciával összekapcsolódva a célszekvencia molekuláinak számára jellemző detektálható jelet hoz létre.
Egy másik, az előzőtől alapvetően eltérő megközelítés magának a cél nukleinsav-szekvenciának nagyszámú másolatát tartalmazza. Ezt a cél nukleinsav-szekvencia szelektív amplifikációjával lehet végrehajtani. Az eljárás szerint a minta tenyésztésének technikáját úgy finomítják, hogy a cél nukleinsav-szekvenciát előnyösen egy másik nukleinsav-szekvenciához amplifikálják. Ezek az eljárások nehezen kivitelezhetők, időigényesek, nehézségekhez és hibákhoz vezetnek.
A cél nukleinsav-szekvencia amplifikálásának másik megközelítése az úgynevezett „polimeráz láncreakció”
HU 216 105 Β („polymerase chain reaction”, PCR). Az eljárást Saiki és munkatársai ismertetik, Science, 230,1350 (1985), valamint Mullis és társai, a 200362 és 201184 számú európai szabadalmi leírásokban (lásd még a 4683195 és 4683202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat), az eljárás szerint (1) a cél nukleinsavszekvencia részét egy primerrel hibridizáljuk, (2) az említett prímért polimerázzal kiterjesztjük, és így (3) a kiterjesztési reakcióban keletkező duplex egyik szálát kapjuk. Az eljárást több ciklusban ismételhetjük meg, így amplifikálva a kiindulási cél nukleinsav-szekvenciát.
Egy újabb tökéletesített megközelítést ismertet a 07/064141 és 07/202978 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a WO 88/10315 számú nyilvánosságrahozatali irat. Az eljárás újszerű RNStranszkriptum-előállítási lépést alkalmaz, melyet a célszekvencia promoteréhez működőképesen kapcsolt szintetizált, kétszálú cDNS másolatával együtt, illetve abból származtat. Az újszerű eljárásban domináns szempont a transzkripciós lépés, melyre alkalmas módon mint egy transzkripcióra alapozott amplifikációs rendszerre (transcription-based amplification system, TAS) hivatkozunk.
A jelen találmány felöleli a nukleinsavat tartalmazó mintából legalább egy specifikus nukleinsav-szekvencia (a célszekvencia vagy annak része) in vitro vagy ex vivő detektálását, eljárást tartalmaz egy - a célszekvenciának megfelelő szekvenciát tartalmazó és a célszekvencia RNS-polimeráz promoterével működőképesen kapcsolt - kétszálú nukleinsav előállítására, ahol az említett kétszálú nukleinsavat ezek RNS-transzkriptumainak nagy mennyiségben történő előállítása során kétszálú nukleinsav templátként alkalmazza, melyek mindegyike az említett célszekvenciának megfelelő RNS-szekvenciát hordozza, valamint az említett RNS-szekvenciák jelenlététnek detektálását és az analógia alapján a célszekvencia jelenlétének detektálását.
A kétszálú nukleinsav templát létrehozása során a célszekvencia egy részének megfelelő szekvenciával működőképesen összekapcsolt promoterszekvenciát tartalmazó első nukleinsav-primer vagy próba kialakítása történik, ezt a nukleinsavat tartalmazó mintában az említett első nukleinsav-primer és a célszekvencia megfelelő körülmények között történő hibridizációja követi, az említett hibridizált első nukleinsav-primemek a célszekvenciával komplementer polimeráz kiterjesztési reakcióban történő megtoldása, az említett duplex szálainak szeparálása, a szeparált promotert tartalmazó szekvenciaszálhoz egy, az említett promoter szekvenciával szemközti végen elhelyezkedő második nukleinsav-primer hibridizálása és az említett második nukleinsav-primemek az említett promotert tartalmazó szekvenciával komplementer polimeráz kiterjesztési reakcióban történő kiterjesztése.
Ilyen módon az említett találmány eljárásának eredményeképpen egyszálú RNS-transzkriptumot vagy ennek RNS-DNS-duplex formáját kapjuk, amennyiben a mérések nem biztosítják az ilyen, a cél nukleinsavnak megfelelő szekvenciával rendelkező formák képződésének megakadályozását. Az egyszálú RNS-transzkriptum többé-kevésbé folyamatos kísérleti minta, ami a célrész közvetlen detektálását biztosítja anélkül, hogy a fárasztó és hibákat okozó ismételt PCR-ciklusokat és szálszeparálást végre kellene hajtani. A kétszálú DNS-t (az egyik szál a célrészt tartalmazza, a másik szál a célrésszel komplementer szekvenciát) eredményező PCR-eljárás nem rendelkezik ilyen előnyökkel, így a detektálás előtt a mintát szeparálni kell, és csak sok ismételt ciklus után érhető el a megfelelő amplifikációs szint.
A jelen találmány tárgya az amplifikáció alapvető eljárása alapján további előnyöket figyelembe véve lehetőséget nyújt a cél nukleinsav-szekvencia megfelelő és kényelmes detektálására, így biztosítva az exponenciálisan végbemenő másolást anélkül, hogy az amplifikációs eljárás során a reagens adagolására nézve hőmérsékletciklusokra és további ellenőrzésre lenne szükség. A jelen találmány tárgya továbbá, hogy újszerű módon egyesíti a transzkripciós és a kiterjesztéses termék előállításának eljárását, a megfelelő cél nukleinsav mérésének és detektálásának céljából.
A jelen találmány tárgya egy primemek egy nukleinsav-célszekvenciához történő hibridizálásával, majd elsődleges kiterjesztésével létrehozott RNS/DNS-duplex RNS-szál szelektív enzimes feltárásának alkalmazása, melynek eredményeképpen a kapott DNS-szál a további hibridizációs lépések templátjaként szolgál, amit a primer kiterjesztése követ. A kapott kétszálú DNS-duplex legalább egy promoter szekvenciát tartalmaz, amit a DNS-fiiggő RNS-polimeráz ismer fel, és így templátként szolgál a nagy mennyiségű transzkriptum előállítása során, ami végül a cél nukleinsav-szekvencia detektálása és mérése útján detektálható és mérhető. Ez előnyös az önfenntartó célszekvencia szempontjából, az egyszerű reakció nem igényel hőmérsékletciklust, a reakcióelegy (három) megfelelő enzimes aktivitással rendelkezik és legalább egy prímért tartalmaz, melyet a DNSfiiggő RNS-polimeráz működése során fel tud ismemi.
így a jelen találmány tárgya számos, a szakmában jelentkező célt ölel fel, és szelektív eljárást biztosít a cél nukleinsav-szekvencia amplifikációjához. Továbbá eljárást biztosít elfogadhatóan rövid periódusidejű, izoterm reakció rendszerben, ismert és megfelelő reagensek alkalmazásával történő mérések kivitelezésére, a tudományos eredmények eléréséhez szükséges pontossággal; így reprodukálható mérések szabályozására, illetve laboratóriumi/klinikai analitikai kitekben alkalmazható.
A jelen találmány az RNS/DNS-duplex „szálszeparálásának” („standard-separate”) alkalmazásán alapszik úgy, hogy annak DNS-szálát szabaddá teszi az RNS-polimeráz kötő szekvenciát (PBS) tartalmazó oligonukleotidokkal történő hibridizáció céljára, amit a primer kiterjesztése követ úgy, hogy a cél nukleinsavszekvencia jelenlétére utaló mérés alapján a detektálásra és a mérésre érzékeny, megfelelő RNS-transzkriptumok többségének előállítása során templátként alkalmazható DNS-duplexet hoz létre. Az RNS/DNSduplex a működőképes promoter szekvenciát tartalmazó DNS-primemek egy RNS-célhoz történő hibridizációja során, majd az azt követő primer kiterjesztés során keletkezik.
HU 216 105 Β
A találmány szerinti „szálszeparálás” RN-áz H aktivitással rendelkező enzimet igényel, ilyen például az NR-ázH, ami a DNS-szálat szelektíven és kedvező módon tárja fel, és ezáltal a DNS-szálat a további folyamatokhoz szabaddá teszi. Az ilyen enzimek alkalmazása kizárja az említett duplexet denaturáló hőmérsékletciklusok alkalmazását.
A nukleinsav-célszekvencia a nukleinsavat tartalmazó mintában lényegében mint olyan jelen lehet, vagy a megfelelő DNS-célszekvencia extrapolációs termékeként fordulhat elő. Az extrapolációs terméket a kétszálú DNS-célszekvencia denaturálásával, egy működőképes promoter szekvenciával rendelkező primerrel történő hibridizációval, majd a primer kiterjesztései reakciójával hozhatjuk létre, amelynek eredményeként DNS-duplex keletkezik. Ezt a RNS/DNS-duplexet a denaturált és a promoter szekvenciát tartalmazó szálon, a promoterrel ellentétes végen egy primerrel hibridizáljuk, majd a prímért úgy teijesztjük ki, hogy az DNS-duplexet hozzon létre, ami a DNS-fuggő RNS-polimerázzal találkozva a megfelelő transzkriptumot, illetve extrapolációs terméket hozza létre. Ezután az RNS a jelen találmányban mint a cél nukleinsav-szekvencia szerepel.
A cél nukleinsav-szekvenciát - bármilyen eredetű is az - létrehozása után, a jelen találmány szerint egy promoter szekvenciával működőképesen összekapcsolt primer szekvenciával hibridizáljuk, majd a DNS-szál 5’ végén promoter szekvenciát tartalmazó RNS/DNS-duplex létrehozása céljából elsődlegesen kiteijesztjük. Az elsődleges ktieijesztési reakciót alkalmas polimeráz enzimmel, például reverz transzkriptázzal hajthatjuk végre. Ezután a jelen találmány szerint az RNS/DNS-duplex olyan enzimmel történő kezelésével, ami a DNSszálat szelektíven feltárja, például az RN-ázzal, az RNS/DNS-duplex szabad DNS-szálát hozzuk létre. Az így szabaddá tett DNS-szálat 1. az előző szelektív feltárás eredményeként kapott RNS-primer alkalmazásával saját maga által létrehozott elsődleges kiteljesztésnek vetjük alá, vagy 2. külső eredetű, tetszés szerinti, működőképes promoter szekvenciát hordozó oligonukleotidprimerrel hibridizáljuk. Az elsődleges kiterjesztés során egy vagy két promoter szekvenciát tartalmazó kétszálú DNS-duplex keletkezik, ami a nagy mennyiségű transzkriptum előállítása során a DNS-fuggő RNS-polimeráz indukciótemplátjaként szerepel.
Az előbb említett reakciószekvencia izoterm úton, a három alkalmas enzimet - például a reverz transzkriptázt, az RN-áz H-t és a DNS-fuggő RNS-polimerázt egyidejűleg tartalmazó elegyben történő létrehozása céljából adott időtartamon keresztül az alábbi eljárás lépéseit kell folyamatosan és szimultán módon végrehajtani, így a fenti, végpontként megjelölt időpontban a keletkező transzkriptumokat detektálhatjuk és mérhetjük, és ebből a kiindulási cél nukleinsav-szekvencia jelenlétére következtethetünk. A fent ismertetett reakciószekvencia folyamatos, és szimultán természete a hőmérsékletciklustól független, és csak egyszeri adagolást igényel a reakció kivitelezéséhez szükséges enzimből, a transzkriptum termékek maguktól hibridizálódnak egy további tetszés szerinti, mesterséges eredetű promoterszekvenciát hordozó primerrel. Ezután a hibridizációs termék primer kitérjesztési reakciója következik, így egy második RNS/DNS-duplex keletkezik, melyet szelektív RNS feltáró enzimmel kezelünk, és így a duplex DNSszálát szabaddá tesszük. Ezt egy önmaga által létrehozott RNS-primerrel vagy egy, a rekacióelegyben jelen lévő tetszés szerinti, működőképes promoter szekvenciát hordozó, külső eredetű, oligonukleotid-primerrel hibridizáljuk úgy, hogy egy második RNS-duplex jöjjön létre, amit feltehetőleg felismer a DNS-fuggő RNS-polimeráz, és így a kezdetben létrejött transzkriptumokkal szemben nagy mennyiségű szensz transzkriptum keletkezik.
Amíg a fenti reakciószekvenciákat nem sikerült teljesen tisztázni, addig - mivel az alkalmazott reakcióelegy három alkalmas enzimaktivitást alkalmaz (például egy reverz transzkriptázt, egy RN-áz H-t és egy DNSfuggő RNS-polimerázt), és a polimeráz legalább egy promoter szekvenciát tartalmazó prímért felismer, valamint, mivel a reakció a hőmérsékletciklusoktól független - úgy hitték, hogy ahol két promotert tartalmazó oligonukleotid-primert alkalmaznak, a reakció folyamatosan, számos ciklus alatt játszódhat le, spontán módon, külső kényszer nélkül hozva létre a szensz és antiszensz transzkriptumokat, melyek különböző eljárásokkal detektálhatok és mérhetők, és így hozhatják létre a vizsgált mintában jelenlévő cél nukleinsav-szekvencia mennyiségének amplifíkációs mérését.
A jelen találmány lényege olyan reakcióelegy létrehozása, amely a megfelelő hőmérsékleten egy ideig rejtett maradhat, nem igényel a magasabb illetve az alacsonyabb hőmérsékletek közötti ciklusokat, nem igényel további periodikus enzim-, illetve reagens-adagolást, a cél nukleinsav amplifikációja folyamatosan, spontán módon, önmaga által kiváltva történik legalább egy működőképes promoter szekvenciát és enzimaktivitást hordozó primer jelenlétében, a promoter polimeráz kötőhelyét felismerő RNS-polimeráz, egy reverz transzkriptáz, egy, az RNS-t a DNS-hez duplex formában hibridizált állapotban szelektíven feltáró enzim, például RN-áz jelenlétében, és az RNS-polimeráz, illetve a reverz transzkriptáz szubsztrátjaként nukleozid-trifoszfátot igényel. A fent definiált rendszerben reprodukálható módon 107 feletti amplifíkációs szint érthető el megközelítőleg két óra alatt, 37 °C-on, például T7 RNS-polimeráz, AMV reverz transzkriptáz és E. coli RN-áz H alkalmazásával. A hőmérsékletet 4-50 °C között, előnyösebb esetben 40 °C körül tartjuk. A nukleinsav-célszekvencia mérete előnyös esetben 250 bázis felett van. A fenti rendszerben az amplifikáció optimalizálását más tényezők is befolyásolják, így például az alkalmazott RNSpolimeráz, reverz transzkriptáz, a pH-értékek, a sókoncentrációk és a nukleozid-trifoszfát koncentráció. Ezek a változók a szakmai gyakorlattal rendelkezők számára általánosan ismertek.
így a jelen találmány legalább egy specifikus nukleinsav-célszekvencia heterogén RNS-eket tartalmazó mintában történő in vitro vagy ex vivő detektálásának eljárását tartalmazza. A jelen találmány olyan eljárássá redukálódik, ami a célszekvenciának megfelelő szekvenciát kódoló működőképes RNS-promoterrel rendelkező
HU 216 105 Β kétszálú DNS-t hibridizációval, majd primer kiterjesztéssel hoz létre, a hibridizáció során alkalmazott DNSszálat annak RNS-komplementere RNS/DNS-duplexéből egy, az RNS-re szelektív feltáró enzimmel teszi szabaddá, és az említett RNS/DNS-duplexet a cél nukleinsav-szekvenciához hibridizált primerrel hozza létre, mely működőképes promoter szekvenciát hordoz, majd a prímért kiterjeszti. A nagy mennyiségű transzkriptum előállítása során templátként szolgáló kétszálú DNS előállítása során egy, az említett cél nukleinsav-szekvenciának megfelelő RNS-szekvenciát hoz létre. Az említett RNS-szekvencia jelenléte és az előre következtetett célszekvencia jelenléte detektálható és mérhető.
A jelen találmány az ilyen RNS-transzkriptumok előállításához és alkalmazásához kapcsolódó eljárásokra és eszközökre vonatkozik. A jelen találmány tetszés szerint ismételhető eljárás a fent definiált kétszálú nukleinsav-templát előállítására, melynek során cél nukleinsavszekvencia részének megfelelő szekvenciához működőképesen kapcsolt első nukleinsav-primert tartalmazó promoter szekvenciát hozzuk létre, az említett első nukleinsav-primert megfelelő körülmények között, a nukleinsavat tartalmazó mintában a cél nukleinsav-szekvenciával hibridizáljuk, az említett első nukleinsav-primert a cél nukleinsav-szekvenciával komplementer polimeráz kiterjesztési reakcióban hibridizáljuk, így hozzuk létre a megfelelő RNS/DNS nukleinsav-duplexet, az említett RNS/DNS-duplex RNS-ét enzimesen hasítjuk, a szabaddá tett promoter szekvenciát tartalmazó DNS-szálhoz megfelelő körülmények között egy másik nukleinsav prímért hibridizálunk az említett promoter szekvenciával szemközti végen 1. az RNS-primerből származó termék vagy 2. tetszés szerinti működőképes promoter szekvenciát hordozó, oligonukleotid-primer alkalmazásával, és az említett második nukleinsav-primert a polimeráz kiterjesztési reakció során az említett promotert tartalmazó szekvenciával komplementer módon kiterjesztjük.
A jelen találmány továbbá a fent említett kétszálú nukleinsavra, mint ennek nagy mennyiségű RNS-transzkriptumának templátja alkalmazására irányuló eljárásokra és eszközökre irányul, egy ennek promoterét felismerő DNS-fiiggő RNS-polimeráz által katalizált reakcióban, és további fent ismertetett, tetszés szerinti ciklusokra, melyek az RNS-transzkriptumok jelenlétének detektálását és mérését biztosítják.
A jelen találmány továbbá az így létrehozott vagy a cél DNS-szekvenciából extrapolált termékkel létrehozott cél nukleinsav-szekvencia amplifikálására irányuló tökéletesített eljárás, mely az alábbi lépésekből áll: az említett célszekvenciát működőképes promoter szekvenciát hordozó DNS-primerhez kapcsoljuk, majd a prímért kiterjesztjük, így hozva létre a megeflelő RNS/DNSduplexet, az említett duplex promoter szekvenciáját hordozó szabaddá tett DNS kiterjesztési terméket egy második primerrel a promoter szekvenciával szemközti végen hibridizáljuk, a prímért kiterjesztjük, így kétszálú DNStemplátot hozunk létre, ami ennek tetszés szerinti replikálható RNS-transzkritpumainak előállítására és detektálására alkalmazható vagy a körforgásba ismételten bevihető, amint fent definiáltuk. A tökéletesített eljárás az említett RNS/DNS-duplex primer promoter szekvenciáját hordozó DNS-szál kiterjesztési termékének szabaddá tételét tartalmazza, ami az említett RNS/DNS-duplex RNS-szálának szelektív enzimes feltárása útján történik.
A jelen találmány továbbá egy RNS/DNS-duplex RNS-ének kezelése folyamán a termékére irányul, mely a DNS-szekvencia 5’ végéhez szelektív RNS-feltáró enzimmel kapcsolt promoter szekvenciával rendelkezik.
A jelen találmány továbbá a szükséges reagenseket és az ehhez kapcsolódó eszközöket tartalmazza, melyek az RNS-t tartalmazó mintában legalább egy specifikus nukleinsav-célszekvencia in vitro vagy ex vivő detektálása során alkalmazhatók, valamint a fent definiált eljárások és eszközök alkalmazására vonatkozik.
A találmány részletes ismertetése
1. Az ábrák részletes ismertetése
Az 1. ábra a jelen találmány vázlatát mutatja be. A vázlatos bemutatás összességében 12 lépést tartalmaz azok legelőnyösebb szempontjai alapján, a folyamatos, önmagukat létrehozó lépéseket a három enzim jelenlétében, a célszekvenciát tartalmazó reakcióelegyben és a megadott, a működéshez szükséges hőmérsékleten. A három enzim, mint már felsoroltuk, például egy reverz tamszkriptáz (RT) lehet, amelyet a primer kiterjesztési reakcióban alkalmazunk, egy szelektív RNS-feltáró RNáz H, mely a találmány alapvető szempontjait tükrözi és egy T7 RNS-polimeráz, melyet a transzkriptumok DNSduplex templátból történő előállítása során alkalmazunk. A találmány lényege, mint fent már ismertettük, a vázlat
3. lépése, melynek alapján érthető, hogy a 6. lépésben kapott RNS-transzkripciós termék, mint olyan, detektálható és mérhető vagy a 7-12. lépésekben bemutatott reakciósorba vihető, melynek eredményeképpen az RNS-transzkriptum antiszensz szála jön létre. A kapott RNS-transzkriptumok a cél nukleinsav-szekvencia jelenléte következtében detektálhatok és mérhetők. A PBS a promoter szekvencia polimeráz kötőhelyeit jelöli. A TCS a cél komplementer-szekvenciát jelöli.
2. Általános eljárások és definíciók
A referencia alapvető molekuláris biológiai kézikönyvek felhasználásával készült, melyek a jelen találmány kivitelezése során alkalmazott definíciókat, alapvető eljárásokat és eszközöket ismertetik, ilyenek például az alábbiak:
DNS-próba vagy primer létrehozása, beleértve a DNS-szintézist vagy a természetes eredetű szekvenciák izolálását restrikciós enzimmel történő hasítással, és ennek olyan átalakítását, melynek eredményeképpen így vagy más DNS-hez kapcsolva itt primerként vagy próbaként történő felhasználásra alkalmassá válik;
különböző, működőképes szekvenciákkal rendelkező oligonukleotidok létrehozása, melyeket hibridizációs célokra alkalmazunk;
szigorúan meghatározott körülmények között végbemenő hibridzációs eljárások a primemek a cél DNSszekvenciával mutatott homológiafokától függő kisebb vagy nagyobb hibridizációs biztonság érdekében;
a promoterek vagy a bakteriofág DNS-fiiggő RNSpolimeráz és a bakteriofág RNS-fiiggő RNS-polimeráz, illetve eukarióta rendszerek alkalmazása esetén virális
HU 216 105 Β
DNS- és RNS-fiiggő RNS-polimeráz, például az adenovírus által kódolt RNS-polimeráz és a rozsnok mozaikvírus RNS-polimeráz által felismert, sokkal specifikusabb promoterek vagy helyek azonosítása, izolálása vagy létrehozása;
a fent említett promoterek felismerésére, illetve a primer kiteijesztési reakciókra alkalmas RNS-polimeráz azonosítása, izolálása vagy létrehozása; a fenti körülmények elősegítik az RNS-transzkriptumok, beleértve az úgynevezett transzkripciófokozó szekvenciák termelését;
a primer kiterjesztési reakciók - beleértve a DNSfiiggő polimerázokat és a dNTP-kat - iniciálását és fenntartását elősegítő körülmények;
a replikáció (indukált) mechanizmusai és eljárásai; és így tovább.
Lásd például Maniatis és társai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Col Spring Harbor Laboratory, New York (1982) és Colowick és társai, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc. (1987), valamint a számos egyéb, itt referenciaként említett hivatkozás; Hong, Bioscience Reports, 1, 243 (1981); Cooke és társai, J. Bioi. Chem., 255, 6502 (1980); valamint Zoller és társai, Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983); Crea és társai, Nucleic Acid Rés., 8, 2331 (1980); Narang és társai, Meth. Enzyme., 68, 90 (1979); Beaucage és társai, Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981); Brown és társai, Meth. Enzym., 68, 109 (1979); Caruthers és társai, Meth. Enzym., 154, 287 (1985); Hitzeman és társai, J. Bioi. Chem., 255, 2073 (1980); Lee és társai, Science, 239, 1288 (1988); Milligan és társai, Nucleic. Acids Rés., 15, 8783 (1987); Miller és társai, Virology, 125, 236 (1983); Ahlquist és társai, J. Mól. Bioi., 153, 23 (1981); Miller és társai, Natúré, 313, 68 (1985); Ahlquist és társai, J. Mól. Bioi., 3, 37 (1984); Ou és társai, PNAS, 79, 5235 (1982); Chu és társai, Nucl. Acids Rés., 14,5591 (1986); Európai szabadalmi leírások (European Patent Application) Publn. No. (EPA) 194809; Mars és társai, Positive Strand RNA Viruses, p. 327-336, Alán R. Liss (publ., New York) (1987), iratok az UCLA szimpóziumon (1986); Miller és társai, J. Mól. Bioi., 187, 537 (1986); Stoflet és társai, Science, 239,491 (1988); Kramer és társai, J. Mól. Bioi., 89, 719 (1974); Saris és társai, Nucl. Acids Rés., 10, 4831 (1982); Bresser és társai, PNAS, 80, 6523 (1983); Chu és társai, Nucl. Acids Rés., 16, 3671 (1988); Gubler és társai, Gene, 25, 263 (1983); és D’Alessio és társai, Nucl. Acids Rés., 16, 1999 (1988), valamint azok a referenciák, melyekre az alábbiakban hivatkozunk.
A fent említett publikációkat itt referenciaként említjük.
A „promoter” kifejezésen azt a nukleinsav-szekvenciát értjük (természetes eredetű vagy szintetikusan kialakított, illetve restrikciós feltárás eredményeképpen kapott), melyet egy RNS-polimeráz specifikusan felismer, a felismert szekvenciához kapcsolódik, és elindítja a transzkripciós folyamatot, melynek eredményeképpen RNS-transzkriptum keletkezik. Ez tetszés szerinti, az aktuális felismerési hely felett kiterjesztett nukleotidbázist tartalmazhat, abból a meggondolásból, hogy így a degradációs folyamat során további stabilitást ad, valamint a szomszédos transzkripciós iniciációs helyen plusz (+) nukleotidokkal lehet kiegészítve. Általában minden, az iniciációs szekvencia felismerésére képes, ismert és beszerezhető promoter szekvencia alkalmazható. Az ismert és általánosan alkalmazott promotereket egyes bakteriofág polimerázok, például a T3, a T7 vagy az SP6 bakteriofágok felismerik. Lásd Siebenlist és társai, Cell, 20, 269 (1980). Ezeket a jelen találmány esetében gyakorlatilag alkalmazható, a promoter szekvenciához kapcsolódó polimereket példaként említettük.
Az „RNS-transzkriptum” ebből a transzkripció iniciálása, majd a promoter szekvenciának az RNS-szekvencia által történő felismerése után (lásd fent) keletkező ribonukleinsav-szekvencia. Az ilyen transzkriptumok többé-kevésbé folyamatosak, és részben a jelen lévő polimerázok mennyiségétől függenek.
A „próba” vagy „primer” kifejezésen a jelen összefüggések között az egyszálú nukleinsav-szekvenciát értjük (természetes eredetű vagy szintetikusan kialakított, illetve restrikciós feltárás eredményeképpen kapott), mely a célszekvenciával szemben kielégítő mértékű komplementaritást mutat, és így megfelelő hibridizációs körülmények között hibridizációra képes, és a megfelelő (cél)szekvenciához kapcsolódik. Egy tipikus próba vagy primer legalább 10 nukleotid hosszúságú, előnyösebb esetben 20 vagy még több nukleotid hosszúságú, és előnyös esetben azonos vagy erősen komplementer a megfelelő (cél)szekvenciával. Lásd például EPA 128042 (publikálva: 1984. december 12.). Az ilyen próba vagy primer a primer kiteijesztési reakciók során a megfelelő reagensek és körülmények mellett a komplementer szekvenciával hibridizálódik.
A „működőképesen kapcsolt” vagy „asszociált” kifejezés, illetve ezek nyelvtani változatai a DNS-szekvenciát kódoló RNS promoter szekvenciájában a lánccal kapcsolatban a megfelelő RNS-transzkriptum termelése során annak működőképességére, alkalmasságára vonatkozik, amikor a megfelelő polimeráz felismeri a promotert - lásd fent.
A detektáló jeleket létrehozó eljárások, például a radioaktív jelzés, illetve a kromogén enzimet alkalmazó kromogén eljárás a szakmai körökben általánosan ismertek.
A találmány kivitelezése során felhasznált minta nyers biológiai anyag lehet, például szérum vagy más testnedv, szövettenyésztő közeg, illetve tápanyag. Ennél jellemzőbb esetekben a nyers mintából különböző kezelésekkel eltávolítjuk a cél detektálását zavaró anyagokat, melyek például a molekulák nem specifikus kötéseinek affinitását okozzák, és az így kapott anyagot tartalmazó mintán végezzük el az említett eljárásokat. A nyers minta feldolgozására alkalmas eljárások, melyek eredményeképpen a minta a találmány szerinti eljárások végrehajtására sokkal alkalmasabbá válik, a szakmai körökben általánosan ismertek.
A transzkriptum (RNS) detektálása számos eljárással történhet:
Az RNS ultraviola abszorbanciájának detektálása, például a közvetlen fotonyomtatás („photoprinting”) al6
HU 216 105 Β kalmazásával [Kutateladze és társai, Anal. Biochem., 100,129 (1979)].
A reakció során alkalmazott, radioaktívan jelzett ribonukleozid-5’-trifoszfát alkalmazásával (például 3Hval vagy alfa-32PO4-gyel jelzett), ami az RNS-t radioaktívvá alakítja, és ezáltal a radioaktivitás követésével számos ismert eljárás alkalmazásával teszi mérhetővé.
A biotin és az iminobiotin az RNS-ben felhalmozódhat, amit számos általánosan ismert eljárással, enzimavidin, vagy enzim-sztreptavidin melléktermékek alkalmazásával detektálhatunk, melyek az RNS-hez kötött biotinhoz kapcsolódnak, és egy kényelmesen detektálható kromogén keletkezését katalizálják. A biotin és az iminobiotin felhalmozódása UTP alkalmazásával történhet, ami „spaceren” keresztül az uracil egy részének 5. szénatomjával van biotinilezve, és a replikációs reakcióban a replikáz egyik szubsztrátja. Az említett UTP-k általánosan ismert vegyületek. Továbbá, mint tudjuk, az ilyen UTP-k a QB-replikáz szubsztrátjai, és az 5. szénatomon „spacer”-rel kapcsolt biotinilezett uracilt tartalmazó RNS-ek a szintézisük során alkalmazott UTP-k következtében a QB-replikáz által katalizált replikáció templátjai.
Az RNS-t T4 RNS-ligázzal katalizált reakció alkalmazásával fluoreszcenssé tehetjük, így a hozzá kapcsolt nukleotid hatására a replikatív RNS 3’-vége fluoreszcenssé módosul. Lásd Costtick és társai, Nucl. Acids Rés., 12, 1791 (1984). Az RNS számos alapvető eljárással történő detektálására a kapott RNS fluoreszcenciáját alkalmazzuk.
Az RNS detektálására alkalmas eljárások közé tartoznak még azok, melyek során egy, a megfelelő nukleinsavhoz specifikusan kapcsolt anyagot adunk a replikációs rendszerhez vagy a közeghez úgy, hogy a pozitív töltésű támasztóanyagon, például az ECTEOLA papíron, melyen a replikáit RNS-t elválasztjuk, az említett anyagból származó jelt megmérjük. Ilyen anyagok lehetnek az alábbiak: a kromogén festékek, mint például a „teljes festés” („stains all”) [Dahlberg és társai, J. Mól. Bioi., 41, 139 (1969)], a metilén kék [Dingman és társai, Biochemistry, 7,659 (1968)] és az ezüst festés [Sammons és társai, Electrophoresis, 2, 135 (1981); Igloi, Anal. Biochem., 134, 184 (1983)]; az RNS-hez kapcsolódó fluorogén vegyületek - például az etidium-bromid [Sharp és társai, Biochemistry, 12, 3055, (1973); Bailey és társai, Anal. Biochem., 70,75 (1976); és a QB replikáz által katalizált replikáció templátjaiként alkalmazott RNS-ekhez specifikusan kapcsolódó fluorogén vegyületek - például a ficobiliprotein [Oi és társai, J. Cell. Bioi., 93, 981 (1982); Stryer és társai, 4.520.110 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], melyek a QB-replikáz virális alegységéhez kapcsolódnak.
A találmány szerinti mérések kivitelezése szimultán módon történik, és amennyire csak megoldható, minden egyes vizsgálandó minta és kontrollminta esetében hasonló körülményeket alkalmazunk. Mint tudjuk, a kontrollminták a vizsgálandó mintákhoz hasonlóak, de vagy nem tartalmaznak célszekvenciát, vagy annak ismert mennyiségét tartalmazzák. A célszekvenciát nem tartalmazó kontroll a „háttér” szintet határozza meg, mely alatt a célszekvenciát tartalmazó mintát nem tudjuk megkülönböztetni az azt nem tartalmazótól. A vizsgálandó minta mérése során kapott RNS-mennyiség vagy -koncentráció, és az egyidejűleg mért kontrollminta összehasonlításával a mintában meg tudjuk határozni a háttérszínt feletti célszekvencia jelenlétét. Amennyiben a célszekvencia ismert koncentrációjú sorozatát tartalmazó kontrollmintát alkalmazunk, a célszekvencia koncentrációját megbecsülhetjük a vizsgálandó mintában.
A „replikáz” alkalmazása a tetszés szerinti, replikálható RNS-transzkriptumok replikációjának (autokatalitikus) indukálása során a szakmai körökben általánosan ismert. Ilyen, a találmány szerint alkalmazható replikáz az úgynevezett QB-vírus replikáz, ami egyes, az adott nukleinsav-szekvencia végein lévő RNS-transzkriptumokat ismeri fel, és az úgynevezett rozsnok mozaikvírus (brome mosaic vírus, BMW), valamint az alfavírus-replikáz, melyek az adott RNS-transzkriptum 3’- végén ismerik fel a nukleinsav-szekvenciát. Ezek a replikázok az RNS-transzkriptumok és kiegészítőik replikációja, vagyis újratermelődése során fejtik ki hatásukat úgy, hogy azok nagy mennyiségű másolata keletkezik. Amennyiben a transzkripció folyamata során a reakcióban ilyen enzimek vannak jelen, előre látható, hogy a transzkripció során keletkező nagy mennyiségű transzkriptumuk saját maguk által gerjesztve replikálódnak, és így a transzkripciós RNS-termék mennyisége exponenciálisan nő.
3. A találmány részletes leírása
A jelen találmány lényege, hogy a rendszer képes az in vitro amplifíkáció összetett ciklusainak végrehajtására anélkül, hogy hőmérsékletciklusokra vagy további kiegészítő enzimek adagolására lenne szükség. A részletes leíráshoz mellékelt ábra a találmány előnyös megnyilvánulásának vázlatát körvonalazza. A jelen találmány egyik leginkább figyelemreméltó és legfontosabb szempontja az RN-áz H enzim alkalmazása. Az ábra további lépéseire hivatkozva az első és a második lépés azonos az úgynevezett TAS leírásnál alkalmazottakkal - vesd össze az említett fenti szabadalmakkal és PCT nyilvánosságrahozatali iratokkal, melyeket a jelen találmányban referenciaként említünk -, de a harmadik lépésben a hődenaturálás helyett az RNS/DNS-hibrid duplexet egy RN-áz H alkalmazásával, szelektív feltárással „szálszeparálásnak” („strand-separation”) vetettük alá. Az RN-áz H alkalmazása csak akkor specifikus az RNS-re nézve, amikor az RNS/DNS-hibrid duplex formájában van jelen. Ennek a feltárásnak a termékét vagy egyetlen RNS-oligomer alkotja vagy több RNSoligomer alkotja (4. lépés), ezek az oligomerek a DNSszintézis során templátként szerepelnek, és a cDNSreakció során (5. lépés) katalizátorként reverz transzkriptázt (RT) alkalmaznak. Az 5. lépésben bemutatott kétszálú DNS a T7 RNS-polimeráz által irányított transzkripció során templátként szerepel (6. lépés). Az így amplifikált RNS-termék a célszekvencia detektálása során mint jelzőmolekula szerepel és/vagy mint kiegészítő célmolekula szerepel az „önmagától ciklusos” (self-cycling) reakció folyamatában (7-12. lépés).
A legsikeresebb reakciók, melyek a célszekvenciát megközelítőleg 106-szoros mennyiségben amplifikálják, három enzimmel és két oligonukleotid-primerrel működ7
HU 216 105 Β nek, beleértve a T7 RNS-polimerázkötő szekvenciát (PBS). A szükséges enzimek egy T7 RNS-polimeráz, egy AMV-reverz transzkriptáz és egy E. coli RN-áz H. Az E. coli RN-áz H további adagolása a reakció során kiegészíti az AMV-reverz transzkriptázban jelen lévő RN-áz aktivitást, és így szükségesnek tűnik az amplifikáció magas szintjének létrehozásához. Az optimális oligonukleotid primerek szelektálása a célszekvencia területének hosszától függ, beleértve az egy vagy az összes primer polimerázkötő szekvenciát és a transzkripciós promoterként polimerázkötő szekvenciát tartalmazó primer hatékony működését. Mindhárom hatás befolyásolja az amplifikáció szintjét. Több amplifikáció PBS-t tartalmazó oligonukleotid primer beépülése esetén több amplifikáció jön létre, mint egy PBS-t tartalmazó oligonukleotid primer vagy PBS-t nem tartalmazó primer esetén.
A mellékelt ábrára hivatkozva:
(1) a cél mRNS-molekulát célspecifikus, szintetikus oligodezoxiribonukleotiddal kezeltük, mely a T7 RNSpolimerázkötő szekvenciáját halmozott mennyiségben tartalmazta;
(2) ezt a prímért az AMV-reverz transzkriptáz DNSpolimeráz aktivitásával kiterjesztjük, és így szintetizáljuk az első cDNS-szálat;
(3) az AMV-reverz transzkriptáz RN-áz H aktivitása és az E. coli RN-áz H lebontja az RNS/DNS-hibrid duplex RNS-ét, így a DNS alkalmassá válik a kétszálú cDNS-szintézis templátjává;
(4) az RN-áz H-val végzett feltárásból „önmaga által létrehozott” (self-generated) oligoribonukleotid vagy szintetikus oligodezoxiribonukleotidból, ami előnyös esetben T7 RNS-polimeráz promoterkötő szekvenciát tartalmaz (az ábra nem jelöli), a második cDNS-szál szintézisét indítja el. Ezután az AMV-reverz transzkriptázzal a prímért kiterjesztjük, és így hozunk létre egy működőképes T7 RNS-polimeráz promoterkötő szekvenciát tartalmazó kétszálú DNS-t;
(5) a T7 RNS-polimeráz a kétszálú promoterkötő szekvenciához kapcsolódik, és a cél nukleinsav-szekvenciával komplementer RNS-ről másolatokat ír át;
(6) a PBS-sel rendelkező második oligodezoxiribonukleotid primer összeolvad az RNS-transzkriptummal;
(7) az AMV-reverz transzkriptáz a cDNS-szál szintézisét katalizálja;
(8) az RN-áz H lebontja az RNS/DNS-hibrid duplex RNS-ét, így a DNS alkalmassá válik a második szál szintézisének templátjává;
(9) a cDNS második szálához egy oligodezoxiribonukleotid primer hibridizálódik, és az AMV-reverz transzkriptáz DNS-t szintetizál. Megtörténik a transzkripció, majd a ciklusok tovább folytatódnak.
4. példák
1. Az első HlV—1 env régió amplifikációja
A HIV-I RNS-szakaszát izoterm, enzimes reakcióban amplifikáltuk, melynek során a reakció végén az adott szakaszról 106-szoros mennyiségű kópia keletkezett.
a) Az amplifikációs reakció
Kiindulási nukleinsav anyagként céziummal pelletizált RNS-t alkalmaztunk, melyet HIV-I-gyel fertőzött
CEM-sejtekből [humán limfoblaszt sejtvonal; Folks és társai, Proc. Natl. Sci., USA, 82,4531 (1985)] extraháltunk, guanidium-izotiocianát-cézium-klorid gradiens eljárással, Maniatis és társai eljárása szerint, lásd fent. (A jelen lévő teljes nukleinsav-szekvenciának megközelítőleg 1-10%-át becsültük HIV-1 specifikus szekvenciának.)
1/10 attomol cél nukleinsavat viszünk a reakcióelegybe (össztérfogat 100 μΐ), ami az alábbiakból áll (a végső koncentráció esetében):
mM Tris-HCl, pH=8,1 mM MgCl2 mM NaCl mM Spermidin - (HC1)3 5 mM ditiotreitol μβ/ιη1 BSA
1-1 mM dATPm, dCTP, dGTP, dTTP
-1 mM ATP, CTP, GTP, TTP
0,25 μg az egyes kiindulási oligonukleotidokból (88-211 és 88-347, lásd alább).
A reakcióelegy komponenseit 1,5 ml-es Eppendorfcsőben elegyítettük, és rövid ideig enyhén ráztuk. A cél nukleinsavat hőkezeléssel denaturáltuk úgy, hogy a csövet egy percre 65 °C-os vízfürdőbe helyeztük. Ezután a rakcióelegyet 37 °C-ra hűtöttük, és a következő enzimeket adtuk hozzá:
U AMV-reverz transzkriptáz (15-20 U/ml)
100 U T7 RNS-polimeráz (100 U/ml)
U E. coli RN-áz H (2 U/ml)
A reakció 37 °C-on három óra alatt ment végbe, minden további beavatkozás nélkül.
b) Az amplifikált termék detektálása
Megközelítőleg egy óra múlva a terméket 32P-vel jelzett oligonukleotiddal detektáltuk, mely az amplifikált fragment 30 bázispámyi részével komplementer (88-298). A reakcióelegy aliquot mennyiségét, az össztérfogat '/4-ed részét 9,5 μΐ 7,4%-os formaldehid és lOx SSC (Maniatis és társai, lásd fent) elegyében, vízfürdőn 20 percig 55 °C-on denaturáltuk. Közvetlenül utána az aliquotokat jégen lehűtöttük, és „slot-blof ’ készülék alkalmazásával nitrocellulóz membránra öntöttük. A nitrocellulózon UV-besugárzással immobilizáltuk a nukleinsavakat (254 nm).
A fixálás után 55 °C-on 15 percig 50-100 μΐ puffer/cm2 szűrőmennyiséggel, ami 0,5% BSA-t, 0,5% polivinil-pirrolidint, 5x SSPE-t (20x=3,6 M NaCl, 200 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7-8), és 1% SDS-t tartalmazott, előhibridizáltuk a szűrőket. A hibridizáció 55 °C-on két óra alatt történt, ugyanabban a pufferben, 2-5 χ 106 cpm/ml foszforilezett oligonukleotid minta jelenlétében. A mintát az előhibridizálás során alkalmazott pufferhez adtuk. A szűrőket szobahőmérsékleten háromszor három percig mostuk, minden esetben 1 ml puffer/cm2 szűrőmennyiséggel, majd 55 °C-on lx SSPE és 1% SDS alkalmazásával, ugyanabban a pufferben.
A szűrőket -70 °C-on, erősítőemyő alkalmazásával autoradiografáltuk.
Az amplifikációs szintet az amplifikált termék által létrehozott jel és ismert mennyiségű HIV-I RNS vagy
HU 216 105 Β pARV7A/2 [Luciw és társai, Natúré, 312, 760 (1984)] által létrehozott jel összehasonlításával becsültük meg.
A pARV7A/2 olyan plazmid, melyben a HIV-I genom cDNS-ének másolatát a pUC19 EcoRl helyébe illesztettük.
A fenti, ismertetett mintában az amplifikációs szint 1 χ 106 volt. A 88-297 és a 88-298 detektálási próbák alkalmazásával végzett Northern biot- és Southern blotanalízis eredménye szerint a minta DNS és RNS elegyéből állt, mely túlnyomó részben RNS-t tartalmazott. 10 A tennék mérete megközelítőleg 210 bp, mely szűk tartományban változott.
2. A második HIV—I env régió amplifikációja
A második HIV-I env régió amplifikációja az 1. példában ismertetett eljárással történt, azzal az eltéréssel, hogy az amplifikáció során a 87-284 és a 88-347 oligonukleotidokból indultunk ki (lásd fent), és a detektálás során a 86-272 és a 86-273 oligonukleotidokat detektáltuk (lásd lent). Az amplifikáció során 103-szoros értéket kaptunk.
3. A HIV-I sor régió amplifikációja
A HIV-I sor régió amplifikációja az 1. példában ismertetett eljárással történt, azzal az eltéréssel, hogy az amplifikáció során a 88-77 és a 87-292 oligonukleotidokból indultunk ki (lásd lent), és a detektálás során a 25
86-31 és a 86-32 oligonukleotidokat detektáltuk (lásd lent). Az amplifikáció során 103-szoros értéket kaptunk.
4. Az első HIV—I env régió amplifikációja, AIDS-es betegek véréből származó klinikai mintákból
Három HIV-I-gyel fertőzött klinikai mintából származó RNS-eket amplifikáltunk. Az RNS-eket az eljárás szerinti szerves extrakcióval extraháltuk (lásd lent).
Az amplifikáció az 1. példában ismertetett eljárással történt, a 88-211 és a 88-347 oligonukleotidokból indultunk ki (lásd lent), és a 88-297 és a 88-298 öli- 35 gonukleotidokat detektáltuk (lásd lent).
Két mintánál kaptunk pozitív eredményt. Ezekben a kísérletekben az amplifikáció során 105-szeres értéket 88-211: (kiindulási oligonukleotid; nt 6540-6479; env) kaptunk. Mivel az amplifikáció után detektált jel közvetlenül arányos a reakció kezdetekor jelen lévő kiindulási anyag mennyiségével (lásd 5. példa), elképzelhető, hogy a harmadik klinikai minta HIV-I fertőzöttségét azért 5 nem sikerült azonosítani, mert az a kiinduláskor rendkívül kis mennyiségű HIV-I-célszekvenciát tartalmazott.
5. Nem fertőzött CEM-sejtek és különböző mennyiségű HÍV-I-gyel fertőzött CEM-sejt első HIV—I env régiójának amplifikációja
Az amplifikáció a 4. példában ismertetett eljárással történt, a 88-211 és a 88-347 oligonukleotidokból indultunk ki (lásd lent), és a 88-297 és a 88-298 oligonukleotidokat detektáltuk (lásd lent).
A cél amplifikáció 103 HIV-I-gyel fertőzött CEM15 sejt 106 nem fertőzött CEM sejttel létrehozott populációjából extrahált összes nukleinsav alkalmazásával történt (lásd 7. példa), a kapott jel a mintában jelen lévő fertőzött sejtek számával volt arányos. A negatív kontroll - 106 nem fertőzött CEM-sejt - alacsony háttér20 szintet mutatott. Ez a háttérszínt jel jelentős mértékben volt alacsonyabb, mint a 103 fertőzött CEM-sejtet tartalmazó mintánál kapott jel.
6. Az alkalmazott reagensek és oligonukleotidok a) Reagensek:
- Nukleotid-trifoszfát, Sigma
- AMV-reverz transzkriptáz, Life Sciences
- T7 RNS-polimeráz, Stratagene
- E. coli ribonukleáz H és BSA, Bethesda Research Laboratories
b) Oligonukleotidok:
Az oligonukleotidokat az úgynevezett foszforamidit kémiával (phosphoramidite chemistry) szintetizáltuk, az „Applied Biosystems 380A” alkalmazásával, majd HPLC-vel tisztítottuk.
A primerként alkalmazott oligonukleotidokat és a HIV-I specifikus próbákat, valamint a megfelelő szekvenciákat Ratner és társai ismertetik [Natúré, 313, 277 (1985)] az env és a sor régiókra.
’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGATCTATTGTGCCCCGGCT GmTGCGATTCTA-3 ’
88-297: (detektálható oligonukleotid; nt 6560-6531; env) ’ -TGGCCTAATTCC AATGTGTAC ATTGTACTGT-3 ’
88-298: (detektálható oligonukleotid; nt 6531-6560; env) ’ - ACAGTAC AATGTAC ACATGGAATTAGGCC A- 3 ’
88-347: (kiindulási oligonukleotid; nt 6661-6632; env) ’ - AATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTT AGCATTGTCTGTG A-3 ’
88-77: (NT 5018-4988; sor) kiindulási ’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTA TGTGTCCTAATAAGG-3’
HU 216 105 Β
87-292: (NT 4766-4796; sor) kiindulási ’-TAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTG TCCTAATAAGG-3’
86-31: (NT 4901-4932; sor) detektálási ’ -GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3 ’
86- 32: (NT 4932-4901; sor) detektálási ’ -TGGTCTGCTAGTTC AGGGTCTACTTGTGTGC-3 ’
87- 284: (NT 6551-6579; env) kiindulási ’-TAATACGACTCACTATAGGGAAATTAAGGCCAGTAGTATCAA CICAACT-3’
86-272: (NT 6591-6620; env) detektálási ’ -TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3 ’
86-273: (NT 6620-6591; env) detektálási
5’ - AGTCTAGCAGAAGAAGAGGTAGTAATTAGA-3 ’
Minden egyes kiindulási oligonukleotid az 5 ’ végén a T7 RNS-polimerázkötő szekvenciát (aláhúzva) és az előnyben részesített transzkripciós iniciációs helyet (vastag) tartalmaz. A megmaradó szekvencia a célszekvenciával komplementer.
A HIV-I célszekvenciához viszonyítva a 88-211, a
88-298, a 87-292, a 86-31, a 87-284 és a 86-273 oligonukleotidok a negatív szállal komplementerek, és a 88-347, a 88-297, a 88-77, a 86-32 és a 86-272 oligonukleotidok a pozitív szállal komplementerek.
7. Az RNS-ek szerves extrakciója
Eljárás a fertőzött sejteket tartalmazó nukleinsavkészítményekre:
Pellet sejtek: 500 rpm, 10 perc, 1 ml Tris-pufferes 40 fiziológiás sóoldatban. A felülúszót elöntjük, a pelletekkel együtt 10 μΐ-t hagyunk meg.
600 μΐ lizálópufferben felszuszpendáljuk a pelleteket.
Az elegyet erőteljesen keverjük, és 50 °C-on 45 percig inkubáljuk, majd 10 percenként 10-15 másodper- 45 cig keverjük.
Az elegyhez 600 μΐ fenol: kloroform: izoamil-alkohol elegyet adunk (50:48:2). Rázással és keveréssel emulgeáljuk. 1400 rpm fordulatszámon történő 2 perces centrifugálással elválasztjuk a fázisokat. 50
A vizes fázisból (felső) 575 μΐ-t eltávolítunk. 600 μΐ fenol: kloroform: izoamil-alkohol elegyet adunk hozzá (50:48:2). Rázással és keveréssel emulgeáljuk.
1400 rpm fordulatszámon történő 2 perces centrifugálással elválasztjuk a fázisokat.
A vizes fázisból 525 μΐ-t eltávolítunk. 600 μΐ kloroform: izoamil-alkohol elegyet adunk hozzá (24:1). Rázással és keveréssel emulgeáljuk. 1400 rpm fordulatszámon történő 2 perces centrifugálással elválasztjuk a fázisokat.
A vizes fázisból 400 μΐ-t eltávolítunk. (A határfelületen lévő sejttörmeléket ne vigyük át.)
Adjunk hozzá ‘/|0 térfogatnyi (40 μΐ) LiCl-t. Ettől a 30 lépéstől kezdve a mintákat szétosztjuk.
A szétosztott mintákhoz adjunk háromszoros térfogatnyi jéghideg, 100%-os etanolt. A szét nem osztott mintákhoz adjunk 2,5 térfogatnyi jéghideg, 100%-os etanolt. Jól keverjük el. A csapadékképződés -20 °C35 on egy éjszaka alatt megy végbe vagy szárazjég/etanol elegyből készült fürdőben 15 perc alatt.
Reagensek:
Lizálópuffer mM Tris, pH 7,5
150 mM NaCl mM EDTA
0,2% SDS
200 μg/ml proteináz K
Tris-pufferes fiziológiás sóoldat
137 mM NaCl
5,1 mMKCl
24,8 mM Tris bázis
A pH-t 1 N HCl-dal 7,4-re állítjuk, autokláwal sterilezzük.
Az előbbi leírás a jelen találmány gyakorlati alkalmazásához nyújt részletes eljárást. Az itt bemutatott izoterm amplifíkációs rendszer leírásánál kezdetben alkalmazott részletes leírás alapján a szakmai gyakorlattal rendelkezők további, a lehetőségekhez képest 55 egyenértékű eljárásokat tervezhetnek, melyek eredménye hasonló amplifíkáció, mely izoterm módon, egy tételben játszódik le (single-pot setting), illetve a cél nukleinsav-szekvenciában tárolt információ specifikus kiterjesztése.
Claims (6)
1. Eljárás egymást nem átfedő 5’-alfragmenst és 3’-alfragmenst tartalmazó cél RNS-részlet amplifikálására, azzal jellemezve, hogy a cél RNS-részletet egy alábbi komponensekből álló reakcióeleggyel hozzuk kapcsolatba:
a) egy egyszálú DNS első primer, mely a célrészlet 3’-alszegmensével megfelelően komplementer szekvenciát, és ahhoz működőképesen kapcsolódó promoter szekvenciát tartalmaz;
b) egy egyszálú második primer, amely a célrészlet 5’-alszegmensének részszekvenciáját tartalmazza;
c) a promotert felismerni képes RNS-polimeráz aktivitású enzim;
d) egy DNS-függő DNS-polimeráz hatású enzim;
e) egy RNS-függő DNS-polimeráz aktivitású enzim;
f) ribonukleozid és dezoxi-ribonukleozid trifoszfatázok és
g) egy RN-áz H aktivitású enzim, ahol a képződött, működőképes promotert és a cél RNS-részlet szekvenciájának megfelelő DNS-t tartalmazó templátból az RNS-polimeráz aktivitású enzim hatására transzkripcióval keletkezett RNS a további amplifikáció célobjektuma, és ahol az eljárást folyamatosan, a nukleinsav-duplexek lényeges hődenaturálása nélkül végezzük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy g) RN-áz H aktivitású enzimként E. coli RN-áz H-t használunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy d) DNS-függő DNS-polimeráz és reverz transzkriptáz aktivitású enzimként AMV vagy MMLV retrovírus reverz transzkriptázt, míg c) RNSpolimeráz aktivitású enzimként T7, T3 vagy SP6 bakteriofág RNS-polimerázt használunk.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegy hőmérsékletét 33 °C és 46 °C közötti értéken tartjuk.
5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amplifikáció után a cél-RNS-t és/vagy a cél-RNS-sel komplementer szekvenciát tartalmazó RNS-t nukleinsav-próba hibridizációs esszével detektáljuk.
6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy b) második primerként az eljárás során keletkezett RNS/DNS-duplex RNS-szálának szelektív emésztésével létrejött prímért használjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28546788A | 1988-12-16 | 1988-12-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT58793A HUT58793A (en) | 1992-03-30 |
| HU216105B true HU216105B (hu) | 1999-04-28 |
Family
ID=23094358
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU1165/90A HU216105B (hu) | 1988-12-16 | 1989-12-14 | Amplifikációs eljárás önfenntartó szekvenciareplikációs rendszerrel |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0778352A1 (hu) |
| JP (1) | JP3152927B2 (hu) |
| KR (1) | KR0148265B1 (hu) |
| AT (1) | ATE156192T1 (hu) |
| AU (2) | AU4829690A (hu) |
| BR (1) | BR8907830A (hu) |
| CA (1) | CA2005589C (hu) |
| DE (1) | DE68928222T2 (hu) |
| DK (1) | DK175630B1 (hu) |
| ES (1) | ES2107412T3 (hu) |
| FI (1) | FI99143C (hu) |
| GR (1) | GR3024403T3 (hu) |
| HU (1) | HU216105B (hu) |
| IL (2) | IL92732A (hu) |
| NO (1) | NO311302B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ231815A (hu) |
| PT (1) | PT92602B (hu) |
| RU (1) | RU2107729C1 (hu) |
| WO (1) | WO1990006995A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA899593B (hu) |
Families Citing this family (174)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5753433A (en) * | 1909-12-05 | 1998-05-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the sensitive detection of nucleic acids |
| CA1340807C (en) * | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| JP2650159B2 (ja) * | 1988-02-24 | 1997-09-03 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | 核酸増幅方法 |
| US5130238A (en) * | 1988-06-24 | 1992-07-14 | Cangene Corporation | Enhanced nucleic acid amplification process |
| ATE141956T1 (de) * | 1989-07-11 | 1996-09-15 | Gen Probe Inc | Verfahren zur vervielfältigung von nukleinsäuresequenzen |
| CA2020958C (en) * | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
| US7009041B1 (en) | 1989-07-11 | 2006-03-07 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis |
| US5766849A (en) * | 1989-07-11 | 1998-06-16 | Gen-Probe Incorporated | Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence |
| US6589734B1 (en) | 1989-07-11 | 2003-07-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of HIV |
| WO1991004340A1 (en) * | 1989-09-20 | 1991-04-04 | Cambridge Biotech Corporation | In vitro, isothermal nucleic acid amplification |
| US5545522A (en) * | 1989-09-22 | 1996-08-13 | Van Gelder; Russell N. | Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex |
| US7049102B1 (en) | 1989-09-22 | 2006-05-23 | Board Of Trustees Of Leland Stanford University | Multi-gene expression profile |
| ATE176002T1 (de) * | 1990-07-24 | 1999-02-15 | Hoffmann La Roche | Verringerung von nicht spezifischer amplifikation während einer (in vitro) nukleinsäure amplifikation unter verwendung von modifizierten nukleinsäure basen |
| ZA918965B (en) * | 1990-11-13 | 1992-08-26 | Siska Diagnostics Inc | Nucleic acid amplification by two-enzyme,self-sustained sequence replication |
| CA2095611A1 (en) * | 1990-11-14 | 1992-05-15 | Jennifer Kyoko Ishii | Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor |
| DK0519053T3 (da) | 1990-12-31 | 1998-07-20 | Promega Corp | Nucleinsyreamplifikation med DNA-afhængig RNA-polymeraseaktivitet hos RNA-replicaser |
| AU8997991A (en) * | 1991-01-31 | 1992-08-06 | Becton Dickinson & Company | Exonuclease mediated strand displacement amplification |
| WO1992020820A1 (en) * | 1991-05-15 | 1992-11-26 | Vanderbilt University | Method to determine metastatic potential of tumor cells |
| ES2214472T3 (es) * | 1991-08-02 | 2004-09-16 | Biomerieux B.V. | Cuantificacion de acidos nucleicos. |
| DE4129653A1 (de) * | 1991-09-06 | 1993-03-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis aehnlicher nukleinsaeuren |
| DE4132133A1 (de) * | 1991-09-26 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen herstellung von ribonukleinsaeuren |
| DE4213029A1 (de) * | 1991-09-26 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen |
| KR100249110B1 (ko) * | 1992-05-06 | 2000-04-01 | 다니엘 엘. 캐시앙 | 핵산 서열 증폭 방법, 이에 이용되는 조성물 및 키트 |
| US5843640A (en) * | 1992-06-19 | 1998-12-01 | Northwestern University | Method of simultaneously detecting amplified nucleic acid sequences and cellular antigens in cells |
| JP4108118B2 (ja) | 1993-03-26 | 2008-06-25 | ジェン−プローブ・インコーポレイテッド | ヒト・免疫不全ウイルス１型の検出 |
| US5814442A (en) * | 1994-06-10 | 1998-09-29 | Georgetown University | Internally controlled virion nucleic acid amplification reaction for quantitation of virion and virion nucleic acid |
| FR2724934B1 (fr) * | 1994-09-26 | 1997-01-24 | Bio Merieux | Oligonucleotide chimere et son utilisation dans l'obtention de transcrits d'un acide nucleique |
| FR2726277B1 (fr) | 1994-10-28 | 1996-12-27 | Bio Merieux | Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin |
| US6436638B1 (en) | 1996-05-09 | 2002-08-20 | Metropolitan Water District Of Southern California | Cryptosporidium detection method |
| US5770368A (en) * | 1996-05-09 | 1998-06-23 | Metropolitan Water District Of Southern California | Cryptosporidium detection method |
| US6235479B1 (en) | 1999-04-13 | 2001-05-22 | Bio Merieux, Inc. | Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample |
| AT410218B (de) | 1999-08-20 | 2003-03-25 | Baxter Ag | Verfahren zur herstellung eines qualitätsgesicherten pools biologischer proben |
| US6893847B2 (en) | 2001-01-17 | 2005-05-17 | Tosoh Corporation | Oligonucleotide for detecting Salmonella and method of detecting Salmonella |
| US7338805B2 (en) | 2001-05-04 | 2008-03-04 | Bio Merieux | Labeling reagents, methods for synthesizing such reagents and methods for detecting biological molecules |
| US7504215B2 (en) | 2002-07-12 | 2009-03-17 | Affymetrix, Inc. | Nucleic acid labeling methods |
| TW200413527A (en) | 2002-10-29 | 2004-08-01 | Riken | Amplification of nucleic acid |
| FR2855832B1 (fr) | 2003-06-03 | 2007-09-14 | Biomerieux Sa | Procede de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique |
| CA2528572C (en) | 2003-06-10 | 2020-08-25 | The Trustees Of Boston University | Gene expression analysis of airway epithelial cells for diagnosing lung cancer |
| FR2857375B1 (fr) | 2003-07-10 | 2007-11-09 | Biomerieux Sa | Procede de detection et/ou d'identification de bacteries de genre staphylococcus |
| US8173785B2 (en) | 2003-11-26 | 2012-05-08 | Advandx, Inc. | Peptide nucleic acid probes for analysis of certain Staphylococcus species |
| EP2415878A1 (en) | 2003-12-25 | 2012-02-08 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
| EP1564306B1 (en) | 2004-02-17 | 2013-08-07 | Affymetrix, Inc. | Methods for fragmenting and labeling DNA |
| FR2868071B1 (fr) | 2004-03-26 | 2006-06-09 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
| FR2868433B1 (fr) | 2004-04-06 | 2008-01-18 | Biomerieux Sa | Procede pour le pronostic et/ou le diagnostic d'un cancer |
| EP1647600A3 (en) | 2004-09-17 | 2006-06-28 | Affymetrix, Inc. (A US Entity) | Methods for identifying biological samples by addition of nucleic acid bar-code tags |
| US20060073511A1 (en) | 2004-10-05 | 2006-04-06 | Affymetrix, Inc. | Methods for amplifying and analyzing nucleic acids |
| EP1652580A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-03 | Affymetrix, Inc. | High throughput microarray, package assembly and methods of manufacturing arrays |
| US7682782B2 (en) | 2004-10-29 | 2010-03-23 | Affymetrix, Inc. | System, method, and product for multiple wavelength detection using single source excitation |
| FR2881437B1 (fr) | 2005-01-31 | 2010-11-19 | Biomerieux Sa | Procede pour le diagnostic/pronostic d'un syndrome septique |
| JP2008531039A (ja) | 2005-02-28 | 2008-08-14 | バイオクエスト インク | 核酸分子が含まれる直接酵素反応方法 |
| US20100035244A1 (en) | 2005-04-14 | 2010-02-11 | The Trustees Of Boston University | Diagnostic for lung disorders using class prediction |
| AU2006246975B2 (en) | 2005-05-17 | 2011-08-11 | Ozgene Pty Ltd | Sequential cloning system |
| FR2886735B1 (fr) | 2005-06-01 | 2015-09-11 | Biomerieux Sa | Procede de marquage ou de traitement d'un echantillon biologique contenant des molecules biologiques d'interet, notamment des acides nucleiques |
| US7550264B2 (en) | 2005-06-10 | 2009-06-23 | Datascope Investment Corporation | Methods and kits for sense RNA synthesis |
| FR2902430B1 (fr) | 2005-11-25 | 2012-11-02 | Biomerieux Sa | Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diagnostiquer la presence des genes h5 et n1 du virus d'influenza a |
| US20090061454A1 (en) | 2006-03-09 | 2009-03-05 | Brody Jerome S | Diagnostic and prognostic methods for lung disorders using gene expression profiles from nose epithelial cells |
| JP2009539404A (ja) | 2006-06-12 | 2009-11-19 | オンコメチローム サイエンシズ エス．エイ． | 大腸癌の早期検出および予後のためのメチル化マーカー |
| EP2520935A3 (en) | 2006-08-09 | 2013-02-13 | Homestead Clinical Corporation | Organ-specific proteins and methods of their use |
| FR2906537A1 (fr) | 2006-09-28 | 2008-04-04 | Biomerieux Sa | Procede de diagnostic in vitro du cancer broncho-pulmonaire par detection des transcrits majoritaires alternatifs du gene klk8 codant la kallicreine 8 et son utilisation pour le pronostic de survie |
| US9845494B2 (en) | 2006-10-18 | 2017-12-19 | Affymetrix, Inc. | Enzymatic methods for genotyping on arrays |
| WO2008066655A2 (en) | 2006-11-02 | 2008-06-05 | Yale University | Assessment of oocyte competence |
| US8293684B2 (en) | 2006-11-29 | 2012-10-23 | Exiqon | Locked nucleic acid reagents for labelling nucleic acids |
| GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| EP1956097A1 (en) | 2007-02-06 | 2008-08-13 | bioMerieux B.V. | Method for discriminating single nucleotide polymorphisms (SNPs) |
| FR2917090B1 (fr) | 2007-06-11 | 2012-06-15 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage portant des fonctions diazo et nitro, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
| JP2009000063A (ja) | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Tosoh Corp | 改良されたノロウイルスｒｎａ検出方法 |
| MX2010000031A (es) | 2007-07-09 | 2010-04-21 | Microsens Medtech Ltd | Deteccion mejorada de microorganismos. |
| AU2008300397A1 (en) | 2007-09-17 | 2009-03-26 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Improved detection of MAGE-A expression |
| EP2198042B1 (en) | 2007-09-17 | 2016-11-02 | MDxHealth SA | Novel markers for bladder cancer detection |
| WO2009044773A1 (ja) | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Tosoh Corporation | レジオネラ属菌ｒＲＮＡ増幅用プライマー、検出方法および検出キット |
| EP2071034A1 (en) | 2007-12-12 | 2009-06-17 | bioMérieux | Method for treating a solution in order to destroy any ribonucleic acid after amplification |
| EP2677041A3 (en) | 2008-02-19 | 2014-04-09 | MDxHealth SA | Detection and prognosis of lung cancer |
| US20110189653A1 (en) | 2008-03-21 | 2011-08-04 | Wim Van Criekinge | Detection and prognosis of cervical cancer |
| FR2934595B1 (fr) | 2008-07-29 | 2013-04-05 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage ayant un noyau pyridine portant une fonction diazomethyle, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
| CA2679750A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-23 | Nexus Dx, Inc. | Methods for detecting nucleic acids in a sample |
| EP2172563A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-07 | bioMérieux S.A. | Method for lowering the dependency towards sequence variation of a nucleic acid target in a diagnostic hybridization assay |
| JP5428272B2 (ja) | 2008-10-06 | 2014-02-26 | 東ソー株式会社 | サバイビンｍＲＮＡの測定方法 |
| FR2940805B1 (fr) | 2009-01-05 | 2015-10-16 | Biomerieux Sa | Procede d'amplification et/ou de detection d'acides nucleiques, kits et utilisations de ce procede |
| WO2010082004A1 (fr) | 2009-01-19 | 2010-07-22 | Biomerieux | Procedes pour determiner la susceptibilite a contracter une infection nosocomiale chez un patient et pour etablir un pronostic d'evolution d'un syndrome septique |
| ES2541178T3 (es) | 2009-02-03 | 2015-07-16 | Mdxhealth Sa | Método de detección de cáncer colorrectal |
| JP2012517238A (ja) | 2009-02-11 | 2012-08-02 | カリス エムピーアイ インコーポレイテッド | 腫瘍の分子プロファイリング法 |
| EP2406393B1 (en) | 2009-03-13 | 2016-05-04 | MDxHealth SA | Novel markers for bladder cancer detection |
| EP2408933A2 (en) | 2009-03-17 | 2012-01-25 | MDxHealth SA | Improved detection of gene expression |
| US10174368B2 (en) | 2009-09-10 | 2019-01-08 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods and systems for sequencing long nucleic acids |
| CN102858995B (zh) | 2009-09-10 | 2016-10-26 | 森特瑞隆技术控股公司 | 靶向测序方法 |
| FR2950358B1 (fr) | 2009-09-18 | 2015-09-11 | Biomerieux Sa | Dispositif d'amplification d'acides nucleiques simplifie et son procede de mise en oeuvre |
| WO2011036173A1 (en) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | Oncomethylome Sciences S.A. | Detection and prognosis of cervical cancer |
| EP2494077A4 (en) | 2009-10-27 | 2013-08-21 | Caris Mpi Inc | MOLECULAR PROFILING FOR PERSONALIZED MEDICINE |
| US8835358B2 (en) | 2009-12-15 | 2014-09-16 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels |
| TWI518325B (zh) | 2010-02-04 | 2016-01-21 | 自治醫科大學 | 對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療 |
| WO2011135058A2 (en) | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Mdxhealth Sa | Methods for detecting epigenetic modifications |
| KR101176139B1 (ko) | 2010-05-20 | 2012-08-22 | 광주과학기술원 | 관절염 동물모델로서 연골 특이적 ＨＩＦ?２α 형질전환 마우스 및 이의 용도 |
| KR101223660B1 (ko) | 2010-05-20 | 2013-01-17 | 광주과학기술원 | ＨＩＦ－２α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 |
| EP2576815B1 (en) | 2010-06-04 | 2018-02-14 | Biomérieux | Method for the prognosis of colorectal cancer |
| US20130261003A1 (en) | 2010-08-06 | 2013-10-03 | Ariosa Diagnostics, In. | Ligation-based detection of genetic variants |
| US11031095B2 (en) | 2010-08-06 | 2021-06-08 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Assay systems for determination of fetal copy number variation |
| US20140342940A1 (en) | 2011-01-25 | 2014-11-20 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization |
| US8700338B2 (en) | 2011-01-25 | 2014-04-15 | Ariosa Diagnosis, Inc. | Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy |
| US10167508B2 (en) | 2010-08-06 | 2019-01-01 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of genetic abnormalities |
| US10533223B2 (en) | 2010-08-06 | 2020-01-14 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of target nucleic acids using hybridization |
| US20120034603A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Tandem Diagnostics, Inc. | Ligation-based detection of genetic variants |
| US11203786B2 (en) | 2010-08-06 | 2021-12-21 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of target nucleic acids using hybridization |
| US20130040375A1 (en) | 2011-08-08 | 2013-02-14 | Tandem Diagnotics, Inc. | Assay systems for genetic analysis |
| WO2012024642A1 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Life Technologies Corporation | Quantitative real-time pcr assay using fret dual-labeled primers |
| US9110079B2 (en) | 2010-09-29 | 2015-08-18 | Biomerieux | Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS |
| US11270781B2 (en) | 2011-01-25 | 2022-03-08 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination |
| US10131947B2 (en) | 2011-01-25 | 2018-11-20 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies |
| US20120190020A1 (en) | 2011-01-25 | 2012-07-26 | Aria Diagnostics, Inc. | Detection of genetic abnormalities |
| US9994897B2 (en) | 2013-03-08 | 2018-06-12 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Non-invasive fetal sex determination |
| FR2970975B1 (fr) | 2011-01-27 | 2016-11-04 | Biomerieux Sa | Procede et kit pour determiner in vitro le statut immunitaire d'un individu |
| AU2012214312A1 (en) | 2011-02-09 | 2013-08-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Analysis of nucleic acids |
| JP5808825B2 (ja) | 2011-02-24 | 2015-11-10 | ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド | ネコの腎障害を診断および治療する組成物および方法 |
| WO2012118745A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Arnold Oliphant | Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination |
| WO2012129758A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Biomerieux | Method and kit for determining in vitro probability for individual to suffer from colorectal cancer |
| US20120252682A1 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Maples Corporate Services Limited | Methods and systems for sequencing nucleic acids |
| KR101291668B1 (ko) | 2011-04-21 | 2013-08-01 | 서울대학교산학협력단 | 미코박테리아―대장균용 셔틀 벡터 및 이의 용도 |
| BR112013032354A2 (pt) | 2011-06-15 | 2017-01-03 | Hills Pet Nutrition Inc | Composições e métodos para diagnóstico e monitoração de hipertireoidismo em um felino |
| EP2723865B1 (en) | 2011-06-21 | 2019-03-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | METHODS FOR DETERMINING ACTIVITY OF RNAi IN A SUBJECT |
| WO2013024175A2 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | Technische Universität München | Diagnostic means and methods for type 2 diabetes |
| GB201206209D0 (en) | 2012-04-06 | 2012-05-23 | Univ Leuven Kath | Marker gene based diagnosis, staging and prognosis of prostate caner |
| FR2981088B1 (fr) | 2011-10-06 | 2013-11-29 | Biomerieux Sa | Arn polymerases mutees |
| US9566333B2 (en) | 2011-12-19 | 2017-02-14 | Hill's Pet Nutrition, Inc. | Compositions and methods for diagnosing and treating hyperthyroidism in companion animals |
| CA2865575C (en) | 2012-02-27 | 2024-01-16 | Cellular Research, Inc. | Compositions and kits for molecular counting |
| EP2820174B1 (en) | 2012-02-27 | 2019-12-25 | The University of North Carolina at Chapel Hill | Methods and uses for molecular tags |
| EP4148142A1 (en) | 2012-05-21 | 2023-03-15 | The Scripps Research Institute | Methods of sample preparation |
| US10289800B2 (en) | 2012-05-21 | 2019-05-14 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Processes for calculating phased fetal genomic sequences |
| WO2014015269A1 (en) | 2012-07-19 | 2014-01-23 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Multiplexed sequential ligation-based detection of genetic variants |
| FR3000966B1 (fr) | 2013-01-11 | 2016-10-28 | Biomerieux Sa | Procede pour etablir in vitro un pronostic de severite chez un patient en choc septique |
| KR101403507B1 (ko) | 2013-03-21 | 2014-06-09 | 주식회사 현일바이오 | 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트 |
| KR101507505B1 (ko) | 2013-04-18 | 2015-04-07 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법 |
| US10072300B2 (en) | 2013-05-21 | 2018-09-11 | Biomerieux | Kit for the prognosis of colorectal cancer |
| WO2014200579A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination |
| US10018629B2 (en) | 2013-08-08 | 2018-07-10 | Institute Pasteur | Correlation of disease activity with clonal expansions of human papillomavirus 16-specific CD8+ T-cells in patients with severe erosive oral lichen planus |
| CN110964796B (zh) | 2013-08-28 | 2024-04-05 | 贝克顿迪金森公司 | 大规模平行单细胞分析 |
| BR112016011046A2 (pt) | 2013-11-15 | 2019-01-29 | Centre Nat Rech Scient | método para genotipagem, método para a detecção de uma infecção, kit para detectar uma infecção e método para detectar em uma amostra biológica. |
| GB201322034D0 (en) | 2013-12-12 | 2014-01-29 | Almac Diagnostics Ltd | Prostate cancer classification |
| EP3191604B1 (en) | 2014-09-09 | 2021-04-14 | Igenomx International Genomics Corporation | Methods and compositions for rapid nucleic acid library preparation |
| KR101718800B1 (ko) | 2015-01-21 | 2017-03-24 | 주식회사 디알나노 | 약물 및 ｓｉＲＮＡ의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도 |
| GB201510684D0 (en) | 2015-06-17 | 2015-08-05 | Almac Diagnostics Ltd | Gene signatures predictive of metastatic disease |
| CN108138226B (zh) | 2015-10-18 | 2022-02-11 | 阿费梅特里克斯公司 | 单核苷酸多态性和***缺失的多等位基因基因分型 |
| KR101651817B1 (ko) | 2015-10-28 | 2016-08-29 | 대한민국 | Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트 |
| KR101845957B1 (ko) | 2016-02-23 | 2018-04-05 | 전남대학교기술지주회사(주) | 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법 |
| GB201605110D0 (en) | 2016-03-24 | 2016-05-11 | Mologic Ltd | Detecting sepsis |
| WO2018029532A1 (en) | 2016-08-10 | 2018-02-15 | Institut Pasteur | Methods and reagents for detecting piperaquine-resistant plasmodium falciparum malaria |
| KR101936799B1 (ko) | 2017-01-09 | 2019-01-11 | 주식회사 엠이티라이프사이언스 | 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법 |
| US20200191771A1 (en) | 2017-05-05 | 2020-06-18 | bioMérieux | Method for detecting an immune cellular response |
| WO2018223053A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Affymetrix, Inc. | Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes |
| WO2018223055A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Affymetrix, Inc. | Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes |
| KR101956315B1 (ko) | 2017-07-19 | 2019-03-08 | 국민대학교 산학협력단 | 파킨슨병 바이오마커로서의 miR494 및 이를 이용한 진단키트 |
| WO2019017680A2 (ko) | 2017-07-19 | 2019-01-24 | 국민대학교 산학협력단 | 파킨슨병 바이오마커로서의 miRNA 및 이를 이용한 진단키트 |
| US20200339987A1 (en) | 2017-11-09 | 2020-10-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Assays and methods for determining expression of the lect2 gene |
| FR3080185A1 (fr) | 2018-04-16 | 2019-10-18 | Biomerieux | Evaluation du risque de complication chez un patient suspecte d'avoir une infection ayant un score sofa inferieur a deux |
| US20210254165A1 (en) | 2018-06-29 | 2021-08-19 | bioMérieux | Method for determining in vitro or ex vivo the immune status of an individual |
| FR3085689A1 (fr) | 2018-09-12 | 2020-03-13 | Biomerieux | Procede pour determiner in vitro ou ex vivo le statut immunitaire d'un individu |
| EP3888021B1 (en) | 2018-11-30 | 2024-02-21 | Caris MPI, Inc. | Next-generation molecular profiling |
| GB201902458D0 (en) | 2019-02-22 | 2019-04-10 | Mologic Ltd | Treatment stratification for an excerbation of inflamation |
| EP3708678A1 (en) | 2019-03-15 | 2020-09-16 | Adisseo France S.A.S. | Process for identifying a stress state in a subject |
| CN114051537A (zh) | 2019-04-17 | 2022-02-15 | 艾基诺米公司 | 用于早期诊断子宫平滑肌瘤和平滑肌肉瘤的改进方法 |
| FR3101358A1 (fr) | 2019-09-27 | 2021-04-02 | Bioaster | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| FR3101423A1 (fr) | 2019-10-01 | 2021-04-02 | bioMérieux | Procédé pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus |
| CN114729402A (zh) | 2019-10-01 | 2022-07-08 | 生物梅里埃公司 | 用于确定个体对刺激物作出反应的能力的方法 |
| GB201914538D0 (en) | 2019-10-08 | 2019-11-20 | Momentum Bioscience Ltd | Microorganism capture from antimicrobial-containing solution |
| KR20220130108A (ko) | 2019-12-02 | 2022-09-26 | 캐리스 엠피아이, 아이엔씨. | 범-암 백금 반응 예측기 |
| KR20230007464A (ko) | 2020-06-05 | 2023-01-12 | 주식회사 씨젠 | 호흡기 병원체 검출을 위한 검체수송 키트 및 이를 이용한 호흡기 병원체 검출방법 |
| FR3112209A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de complication chez un patient |
| FR3112207A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| FR3112211A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| FR3112208A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| FR3112210A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| WO2022106795A1 (fr) | 2020-11-20 | 2022-05-27 | bioMérieux | Procédé de classification d'un individu |
| FR3125065A1 (fr) | 2021-07-08 | 2023-01-13 | bioMérieux | Procédé et kit de détection d’un virus respiratoire réplicatif |
| KR20240090267A (ko) | 2021-10-29 | 2024-06-21 | 주식회사 씨젠 | 검체 채취 스왑 도구 및 호흡기 병원체의 검출 방법 |
| FR3139579A1 (fr) | 2022-09-09 | 2024-03-15 | bioMérieux | Procédé de détection in vitro ou ex vivo d’un statut immunodéprimé chez un sujet |
| WO2024110392A1 (en) | 2022-11-22 | 2024-05-30 | bioMérieux | New nucleic acid binding compounds and uses |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4520110A (en) | 1981-10-06 | 1985-05-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing a phycobiliprotein labeled ligand or receptor |
| EP0128042A3 (en) | 1983-06-06 | 1985-01-16 | Genentech, Inc. | A process for indentifying or isolating a dna sequence, and a dna hybridization probe therefor |
| CA1288073C (en) | 1985-03-07 | 1991-08-27 | Paul G. Ahlquist | Rna transformation vector |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| ES8706823A1 (es) | 1985-03-28 | 1987-06-16 | Cetus Corp | Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de al menos una secuencia especifica de acidos nucleicos en una muestra |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| JP2774121B2 (ja) * | 1987-07-31 | 1998-07-09 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅 |
| AU618965B2 (en) * | 1987-07-31 | 1992-01-16 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
| CA1340807C (en) * | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| GB9807888D0 (en) | 1998-04-09 | 1998-06-10 | Chirotech Technology Ltd | Asymmetric hydrogenation |
-
1989
- 1989-12-14 AU AU48296/90A patent/AU4829690A/en not_active Abandoned
- 1989-12-14 ZA ZA899593A patent/ZA899593B/xx unknown
- 1989-12-14 WO PCT/US1989/005631 patent/WO1990006995A1/en active IP Right Grant
- 1989-12-14 HU HU1165/90A patent/HU216105B/hu unknown
- 1989-12-14 JP JP50187990A patent/JP3152927B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-14 RU SU4895764A patent/RU2107729C1/ru active
- 1989-12-14 CA CA002005589A patent/CA2005589C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-14 BR BR898907830A patent/BR8907830A/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-12-14 KR KR1019900701772A patent/KR0148265B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-12-15 ES ES89313154T patent/ES2107412T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-15 DE DE68928222T patent/DE68928222T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-15 EP EP97100006A patent/EP0778352A1/en not_active Withdrawn
- 1989-12-15 EP EP89313154A patent/EP0373960B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-15 IL IL92732A patent/IL92732A/xx not_active IP Right Cessation
- 1989-12-15 PT PT92602A patent/PT92602B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-12-15 AT AT89313154T patent/ATE156192T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-15 NZ NZ231815A patent/NZ231815A/xx unknown
-
1991
- 1991-06-11 DK DK199101106A patent/DK175630B1/da not_active IP Right Cessation
- 1991-06-14 FI FI912885A patent/FI99143C/fi active
- 1991-06-17 NO NO19912328A patent/NO311302B1/no not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-05-10 AU AU63013/94A patent/AU675520B2/en not_active Expired
-
1995
- 1995-02-23 IL IL11275095A patent/IL112750A0/xx unknown
-
1997
- 1997-08-11 GR GR970402047T patent/GR3024403T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU216105B (hu) | Amplifikációs eljárás önfenntartó szekvenciareplikációs rendszerrel | |
| JP2843586B2 (ja) | 転写に基づいた核酸増幅／検出系 | |
| JP3936798B2 (ja) | Ｒｎａ標的配列の増幅方法 | |
| JP3745774B2 (ja) | 末端反復増幅方法 | |
| US5112734A (en) | Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna | |
| DK175944B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af en dobbeltstrenget nucleinsyre som inkluderer en promotor der er operabelt forbundet til en sekvens, som skal detekteres, og en fremgangsmåde, der er anvendelig til detektion af en specifik nucleinsyresekvens ...... | |
| JP3403405B2 (ja) | 核酸伸長検定 | |
| JPH04503451A (ja) | 自己持続性、配列複製システム | |
| JPH03180184A (ja) | リボ核酸（ｒｎａ）の合成方法 | |
| US6100024A (en) | Methods and compositions for nucleic acid detection by target extension and probe amplification | |
| US5853981A (en) | Oligonucleotides, methods and kits for amplifying and detecting a nucleic acid of cytomegalovirus (CMV) using nucleic acid sequence β2.7 | |
| JP6057460B2 (ja) | デングウイルスアッセイ | |
| US20030050444A1 (en) | Nucleic acid amplification using an RNA polymerase and DNA/RNA mixed polymer intermediate products | |
| JP5692954B2 (ja) | Ｈｉｖ−１を検出しそして定量するためのアッセイ | |
| US5660989A (en) | DNA polymerase extension assay for influenza virus endonuclease | |
| JP2012503472A (ja) | 診断用ハイブリダイゼーションアッセイにおける核酸標的の配列変異に対する依存性を低下させるための方法 | |
| US8258283B2 (en) | Method for detection of HCV at the real time PCR with intercalating dye | |
| US6756198B2 (en) | Oligonucleotide for highly sensitive detection of hepatitis C virus and method for detection thereof | |
| WO1999049085A1 (en) | Use of a viral polymerase to amplify nucleic acids | |
| Morse | [5] Identification of messenger RNAs that contain inosine | |
| IE19950293A1 (en) | Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: AKZO NOBEL N.V., NL |