DE10215238C1 - Nachweis von Mykobakterien in klinischem Material - Google Patents
Nachweis von Mykobakterien in klinischem MaterialInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein molekular-biologisches Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mykobakterien und zur Differenzierung des Mycobakterium tuberculosis-Komplex und Mycobakterium avium von anderen Mykobakterien in klinischem Material mittels Amplifikations-Primer und Oligonucleotid-Sonden, die spezifisch für die Gattungs- und Art-spezifischen Regionen des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien sind.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren
zum spezifischen Nachweis von Mykobakterien und zur
Differenzierung des Mycobacterium tuberculosis-
Komplex und Mycobacterium avium von anderen Myko
bakterien in klinischem Material.
Die Tuberkulose ist eine weltweit verbreitete In
fektionskrankheit, die chronisch verläuft und jähr
lich mehr Menschen das Leben kostet als irgendeine
andere bakterielle Infektion.
Die Tuberkulose ist insbesondere in der Lunge loka
lisiert, seltener in Halslymphknoten, Darm oder
Haut. Die sehr unterschiedlichen klinischen Verläu
fe der Tuberkulose machen daher eine exakte
Beschreibung des Krankheitszustands und eine
schnelle Diagnose insbesondere zu frühen Er
krankungsstadien notwendig.
Erreger der Tuberkulose sind die Arten: Mycobacte
rium tuberculosis und sehr selten Mycobacterium bo
vis. Diese tuberkulösen Erreger werden allgemein
unter dem Begriff "Mycobacterium tuberculosis-
Komplex" zusammengefasst.
Eine Folgeerscheinung der chronischen Tuberkulose,
die insbesondere durch Streuung der tuberkulösen
Erreger im gesamten Organismus ausgelöst wird, ist
beispielsweise die Meningitis tuberculosa, die
durch Lumbalpunktion diagnostiziert werden kann,
wobei allein die eindeutige und frühzeitige Diagno
se und die anschließende gezielte intensive Thera
pie lebensrettend sind. Weitere Folgeerscheinungen
lassen sich ebenfalls nur durch eine eindeutige und
frühzeitige Diagnose erkennen oder bereits verhin
dern: Pleuritis tuberculosa, Peritonitis tuberculo
sa, Hauttuberkulose, Knochentuberkulose, Gelenktu
berkulose und Urogenitaltuberkulose. Insbesondere
die Urogenitaltuberkulose zeichnet sich durch einen
schleichenden, symptomarmen Verlauf aus und lässt
sich daher oft nicht sofort als solche erkennen,
weshalb eine eindeutige und frühzeitige Diagnose
bei Patienten notwendig ist.
In den meisten Industrienationen besteht sofortige
Meldepflicht bei einer Erkrankung, nicht zuletzt um
so schnell wie möglich eine Ausbreitung in der Be
völkerung zu verhindern. In einigen Entwicklungs
ländern wie Afrika, Asien oder Ozeanien liegt die
durchschnittliche Inzidenz bei 200 jährlichen Neu
erkrankungen auf 100 000 Einwohner. In Westeuropa
liegt die durchschnittliche Inzidenz immerhin bei
30 jährlichen Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner,
in der Bundesrepublik Deutschland bei ca. 20.
In den letzten Jahren kann ein vermehrtes Auftreten
von Tuberkulose sowohl in den Entwicklungsländern
als auch in den Industrienationen beobachtet wer
den, wobei vor allem bei immunsupprimierten HIV-
Patienten dadurch regelmäßig Todesfälle verzeichnet
werden (8).
Es wird angenommen, dass zur Zeit ein Drittel der
Weltbevölkerung mit dem Mycobacterium tuberculosis-
Komplex infiziert ist. Jedoch nicht nur wegen der
allgemeinen Gefahr für große Teile der Weltbevölke
rung, sondern auch wegen des inzwischen epidemiear
tigen Auftretens von mehrfach-resistenten Bakteri
enstämmen (MDRTB) innerhalb oder außerhalb von
Krankenhäusern wird die schnelle und eindeutige Di
agnose zum Nachweis dieser Bakterienstämme gefor
dert (9, 14).
Durch die HIV-Epidemie der letzten Jahrzehnte als
"Nährboden" zur Verbreitung von Infektionskrankhei
ten vermehrte sich außerdem auch das epidemiologi
sche Auftreten von nicht-tuberkulösen Mykobakterien
(4). Bei durch nicht-tuberkulöse Mykobakterien ver
ursachten Infektionen sind ähnlich einer "echten"
Tuberkulose Organe wie Lunge, Lymphknoten im Hals
bereich oder die Haut betroffen. Selten kommt es zu
einer Streuung der nicht-tuberkulösen Erreger in
den gesamten Organismus, wobei Folgeerscheinungen
ähnlich wie bei einer "echten" Tuberkulose beobach
tet werden können. Nicht-tuberkulöse Mykobakterien
führen bei Patienten, die beispielsweise an zysti
scher Fibrose erkrankt sind, zu einer zusätzlichen
Verschlechterung des Krankheitsbildes im Bereich
der Lunge (1, 2, 16).
Zu den nicht-tuberkulösen Mykobakterien, die in der
klinischen Praxis beobachtet werden, zählen: Myco
bacterium avium, Mycobacterium intracellulare, My
cobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Myco
bacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae und My
cobacterium abscessus (4).
Die Diagnostik von Mykobakterien in klinischem Ma
terial sollte idealer Weise einen spezifischen
Nachweis von tuberkulösen und von nicht-
tuberkulösen Mykobakterien erlauben.
In den letzten Jahren wurden zur klinischen Diagno
se von Mykobakterien im Labor verstärkt molekular
biologische Techniken basierend auf einer Nuclein
säure-Vervielfachung, insbesondere Amplifikation,
wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt.
PCR-Verfahren zur Amplifikation einer Vielzahl ver
schiedener chromosomaler DNA-Fragmente wurden zur
Detektion von sowohl Gattungs-spezifischen als auch
von M. tuberculosis-spezifischen DNA-Regionen ein
gesetzt (15).
Gattungs-spezifische Verfahren werden eingesetzt,
um eine Mykobakterien-Infektion gegenüber anderen
Infektionen abzugrenzen. Bekannte Gattungs-
spezifische Verfahren zielen dabei auf das 16S-
rRNA-Gen oder das Gen des 65 kDa-"heat shock"-
Proteins. Eine anschließende spezifische Identifi
kation einiger Mykobakterienarten wird mit konser
vierten Hybridisierungssonden durchgeführt (5, 12)
Alternativ werden die amplifizierten Gene sequen
ziert (6) oder es wird eine Analyse mittels Re
striktionsenzymen durchgeführt (15).
Zu den spezifischen DNA-Regionen, die zum Art-
spezifischen Nachweis des M. tuberculosis-Komplex
mittels PCR eingesetzt werden, zählen beispielswei
se IS 6110, die Gene des 38 kDa-Proteins, die Gene
des MBP 64-Proteins sowie die Regionen mtp40 oder
pMTb4.
Abgesehen von diesen individuellen Laborverfahren
existieren kommerziell erhältliche Diagnose-Kits,
die meist ausschließlich zur Diagnose des M. tuber
culosis-Komplex geeignet sind. Bekannte Kits werden
beispielsweise von Roche-Amplicor™, Geneprobe™
oder Abbot™ angeboten.
Die molekularbiologischen Verfahren, die zu diesem
Zweck durchgeführt werden, beinhalten einerseits
die Vervielfältigung der nachzuweisenden Nuclein
säure (Targetamplifikation), beispielsweise durch
die PCR, durch die Transkriptions-basierte isother
me DNA-Synthese (TMA), durch die Ligase-
Kettenreaktion (LCR) oder durch die isotherme
Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA), anderer
seits die Vervielfältigung der signalgebenden Kom
ponente (Signalamplifikation), wie durch die iso
therme Qβ-Replikation.
Bezeichnend für die heutige Situation ist die Tat
sache, dass es bis jetzt noch keine Methode gibt,
die als allgemein anerkannter Diagnose-Standard ak
zeptiert ist. Der Nachweis von Mykobakterien mit
Hilfe von molekularen Methoden wird in Deutschland
inzwischen zweimal pro Jahr durch eine nationale
Qualitätskontrolle überprüft. In diesen Ringversu
chen zeigten sich Schwächen bei den kommerziell er
hältlichen Diagnose-Kits und bei verschiedenen Ei
genentwicklungen, vor allen bei der Anwendung mit
stark verdünnten Proben. Es wird davon ausgegangen,
dass es sich hierbei um systematische Schwächen der
jeweils zugrunde liegenden Nachweisreaktionen han
delt. Daher werden alle bisher bestehenden Methoden
als unbefriedigend und deshalb verbesserungswürdig
angesehen.
Weitere wesentliche Nachteile der kommerziell er
hältlichen Verfahren sind insbesondere (a) eine
fehlende Möglichkeit der Unterscheidung zwischen
dem Mycobacterium tuberculosis-Komplex und nicht-
tuberkulösen Mykobakterien, (b) eine mögliche un
spezifische Inhibition der Amplifikationsreaktion
im Nachweisverfahren bei klinischen Proben, (c) ei
ne lange Untersuchungsdauer (über mehrere Stunden)
und (d) eine Beschränkung des einsetzbaren klini
schen Materials insbesondere auf Proben aus dem Re
spirationstrakt.
Das 16S-rRNA-Gen wird bereits zum Nachweis und zur
Identifizierung verschiedener humanpathogener Myko
bakterien mittels PCR eingesetzt. Zur Identifizie
rung von Mykobakterien aufgrund ihrer unterschied
lichen 16S-rRNA-Gene werden Datenbanken wie RIDOM
und Micro Seq eingesetzt. Die Datenbank RIDOM ba
siert auf 16S-rRNA-Gen 5'-Teilsequenzen bis zur Po
sition 510 (17), das Micro Seq 500 16S-rRNA-
Sequenzierkit der Firma Applied Biosystems® beruht
auf der Vervielfachung (PCR) und Sequenzierung der
ersten 500 Basenpaare des bakteriellen rRNA-Gens.
Um das Micro Seq 500-System einzusetzen, ist auch
die RIDOM-Datenbank zur Differenzierung ribosomalen
RNA erforderlich (18). Aus (19) ist bekannt, zur
Identifizierung von Mykobakterien die Untersuchung
Gattungs-spezifischer Bereiche auf dem 16S-rRNA-Gen
mit der Untersuchung des Art-spezifischen Inserti
onselements IS6110 zu verknüpfen. Die EP 0 528 306 A2
beschreibt Amplifikationsprimer für die 16S-
rRNA-Gen-Region und Gattungs-spezifische Hybridi
sierungssonden. Dabei werden auch Sonden mit Kon
sensus-Sequenzen eingesetzt. Aus der WO 02/22872 A1
wird ein Multiplex-PCR-Verfahren beschrieben. Dabei
wird der interne transkribierte Art-spezifische
"spacer" zwischen 16S-RNA-Gen und 23S-RNA-Gen un
tersucht. Aus der US 6,136,529 A ist ein Hybridi
sierungssonden-Assay bekannt, worin Einzel-Oligo-
Nucleotidsonden zur Identifizierung von M. avium
eingesetzt werden. Diese Sonden werden aus der Se
quenzinformation des gesamten 16S-rRNA-Gens abge
leitet. Basierend auf einem 16S-rRNA-Nachweissystem
wird in (7) ein Algorithmus zur spezifischen Ver
vielfältigung eines 1000 bp Fragments der mykobak
teriellen 16S-rRNA mittels eines unspezifischen
Primers und eines Gattungs-spezifischen Primers für
Mykobakterien vorgeschlagen. Zur Bestätigung, ob
das richtige Fragment vervielfältigt wird, werden
dabei Gattungs-spezifische Oligonucleotid-Sonden
eingesetzt, die mit dem amplifizierten Fragment
hybridisieren. Im weiteren Verlauf werden Art-
spezifische Hybridisierungssonden eingesetzt, wobei
anhand desselben amplifizierten Fragments die Myko
bakterienarten M. tuberculosis-Komplex und M. avium
gegenüber anderen Bakterienarten unterschieden wer
den können (5). Wesentliche Nachteile dieser meist
mehrstufigen Verfahren bestehen darin, dass diese
Nachweisverfahren auf zum
Teil aufwendigen Hybridisierungsverfahren basieren
und den Einsatz hochqualifizierter Personen erfor
dert. Darüber hinaus müssen diese Nachweisverfahren
mindestens über Nacht angesetzt werden; ein Ergeb
nis steht also frühestens am nächsten Tag nach Pro
benbereitstellung zur Verfügung (5, 6). Patienten
müssen bis zum Vorliegen der Untersuchungsergebnis
se meist stationär aufgenommen werden. Für die kli
nische Routinediagnose sind diese Verfahren daher
nur sehr bedingt einsetzbar.
Aus dem Stand der Technik ist daher bisher kein für
den klinischen Routineeinsatz geeignetes Verfahren
bekannt, das sich insbesondere durch einfache An
wendung auszeichnet und womit es gelingt, M. tuber
culosis und M. avium schneller und spezifisch in
klinischem Material wie Sputum, Bronchial-Lavage,
Magensaft, Urin, Stuhl, Knochenmark, Blut oder Bi
opsien, insbesondere Punktatbiopsien, nachzuweisen
und im gleichen Verfahren eine Mykobakterien-
Infektion eindeutig von anderen mikrobiellen Infek
tionen abzugrenzen.
DNA extrahiert aus klinischen Proben enthält Verun
reinigungen, die oft dazu führen, dass die Enzym-
basierte Amplifikation, insbesondere die PCR, ge
hemmt wird. So besteht bei den bisher bekannten
Nachweisverfahren die große Gefahr, dass ein nega
tives Ergebnis erhalten wird, obwohl tatsächlich
eine Mykobakterieninfektion beim Patienten vor
liegt. Im schlimmsten Fall wird dadurch eine beste
hende Tuberkulose übersehen. Es besteht daher seit
langem auch das Bedürfnis, ein Kontrollsystem zu
entwickeln, das sogenannte "falsch-negative" Befun
de im Nachweisverfahren ausschließt (Inhibiti
onskontrolle).
Es ist bekannt, dass der Einsatz der Echtzeit-PCR
(Rapid-Cycle-PCR), die beispielsweise mit einem
Luft-temperierten System ausgestattet ist und somit
wesentlich geringere Transitionszeiten gegenüber
einer herkömmlichen PCR aufweist, zu einer deutlich
verminderten Zeit bis zum Nachweis von beispiels
weise M. tuberculosis führt (2).
Darüber hinaus stellen fluorimetrische Messungen,
insbesondere, wenn sie Rahmen des Echtzeit-PCR-
Verfahren eingesetzt werden, eine schnelle und emp
findliche Methode zum Nachweis von amplifizierten
Genfragmenten dar. In (3) wurde eine Echtzeit-
Fluorimetrie zum Nachweis von M. tuberculosis in
Expectoraten unter Verwendung des TaqMan™-Systems
eingesetzt.
Das LightCycler™-System der Firma Roche Molecular
Biochemicals, das eine Ausgestaltung der Echtzeit-
PCR ist, wurde inzwischen ebenfalls zum Nachweis
von M. bovis in Rinderstuhl sowie zum Nachweis von
Rifampin- oder Isoniazid-Resistenz-bedingten Muta
tionen in M. tuberculosis eingesetzt (11, 13). In
diesen beiden Studien waren die vervielfachten
Fragmente typischerweise 200 Basenpaare lang. Auf
grund des hohen Durchsatzes eines LightCycler™-
Systems wird nämlich bisher davon ausgegangen, dass
eine Vervielfachung von größeren DNA-Fragmenten von
Mykobakterien aufgrund des in Mykobakterien vorkom
menden hohen CG-Nukleotidgehaltes von ca. 65% bis
zu 75% schwierig bis unmöglich ist.
Ausgehend vom Stand der Technik besteht ein wesent
licher Nachteil der bisher bekannten Nachweisreak
tionen darin, dass Mykobakterien-Infektionen in
klinischem Material bisher noch nicht eindeutig ge
genüber nicht-mykobakteriellen Infektionen abge
grenzt werden können: Aus den Stand der Technik ist
die Gattungs-spezifische Region II, "genus II", auf
dem 16S-rRNA-Gen von Mykobakterien bekannt, wobei
mittels eines spezifischen Hybridisierungssonden-
Paars und einer Schmelzkurvenanalyse eine Vielzahl
von Mykobakterienarten aufgrund eines höheren
Schmelzpunktes des Sonden-Paars von anderen Bakte
rien-Arten und anderen Mikroorganismen unterschie
den werden können (6). Jedoch weisen auch bestimmte
Mykobakterienarten wie M. triviale, M. agri, M. Xe
nopi oder M. chitae einen niedrigen Schmelzpunkt
auf, so dass nach dem Stand der Technik eine ein
deutige Abgrenzung der Mykobakterien von Nicht-
Mykobakterien, insbesondere in einem einzigen Ver
fahrensschritt, gar nicht möglich ist.
Vor diesem Hintergrund liegt das technische Problem
der vorliegenden Erfindung darin, ein verbessertes
Verfahren bereitzustellen, das insbesondere einen
besonders schnellen und gleichzeitig spezifischeren
Nachweis von Mykobakterien-Infektionen in klini
schem Material verschiedenen Ursprungs und die
Identifizierung der Arten fit tuberculosis-Komplex
und/oder M. avium in einem gemeinsamen Nachweisver
fahren ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung löst das technische Prob
lem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum
gemeinsamen, spezifischen Nachweis einer Mykobakte
rien-Infektion und des Mycobacterium tuberculosis-
Komplex und/oder von Mycobacterium avium gegenüber
anderen Mykobakterienarten in klinischem Material,
wobei
- a) mikrobielle DNA aus dem klinischen Material extrahiert wird und anschließend
- b) mindestens ein Fragment des 16S-rRNA-Gens aus
der mikrobiellen DNA mit einem Primerpaar umfassend
die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5
amplifiziert wird
oder
mit zwei Primerpaaren, wobei das eine Primerpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 umfasst und das andere Primerpaar unmittelbar davor oder danach oder gleichzeitig eingesetzt wird und die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 umfasst, amplifiziert wird und anschließend - c) das mindestens eine amplifizierte 16S-rRNA- Genfragment mittels mindestens eines Paares mar kierter Hybridisierungssonden, die mit hypervariab len Art-spezifischen Regionen des 16S-rRNA- Fragments von Mykobakterien hybridisieren, detek tiert wird, wobei das Paar markierter Hybridisie rungssonden zum Nachweis des M. tuberculosis- Komplex die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet und wobei das Paar der markierten Hybridisierungssonden zum Nachweis von M. avium die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, und anschließend, gleichzeitig oder zeitlich unmittelbar davor
- d) das mindestens eine amplifizierte 16S-rRNA- Genfragment mittels eines Paars markierter Hybridi sierungssonden, das mit der Gattungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Fragments hybridisiert, de tektiert wird, wobei das Paar die Nucleotidsequen zen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, und wo bei
- e) der spezifische Nachweis der Mykobakterien- Gattung und der Nachweis des M. tuberculosis- Komplex und/oder von M. avium in den Schritten (c) und (d) mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt.
Die Erfindung sieht vorteilhafterweise also vor,
dass in einem einheitlichen gemeinsamen Verfahrens
gang der Nachweis von Mykobakterien als Gattung zu
sammen mit dem Art-spezifischen Nachweis von M. tu
berculosis-Komplex ermöglicht wird. Die Erfindung
ermöglicht auch einen gemeinsamen einheitlichen
spezifischen Nachweis der Gattung Mycobacterium zu
sammen mit dem Art-spezifischen Nachweis von M. a
vium. Schließlich ermöglicht die Erfindung auch den
gemeinsamen spezifischen Nachweis von Bakterien der
Gattung Mycobacterium zusammen mit dem Art-
spezifischen Nachweis von M. tuberculosis-Komplex
und von M. avium.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Ver
fahrens ist, dass in dem eingesetzten kombinierten
Nachweisverfahren zur Diagnose von Mykobakterien-
Infektionen sowohl eine bestehende Mykobakterien-
Infektion gegenüber anderen mikrobiellen Infektion
als auch eine bestehende Tuberkulose gegenüber
nicht-tuberkulösen Infektionen eindeutig und sicher
erkannt werden kann. Dieser Nachweis war in so vor
teilhafter Weise nach dem Stand der Technik nicht
möglich.
Der eindeutige Nachweis einer Mykobakterien-
Infektion gegenüber anderen mikrobiellen Infektio
nen findet erfindungsgemäß durch Analyse der
Schmelztemperaturen der Hybridisierung des Gat
tungs-spezifischen Hybridisierungssonden-Paars, das
die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11
oder das Paar der komplementären Sequenzen davon
beinhaltet, mit der Gattungs-spezifischen Region
III des 16S-rRNA-Gens statt. In den erfindungsgemä
ßen Nachweisverfahren zeichnen sich Mykobakterien-
Stämme durch Schmelztemperaturen von mindestens
55°C, insbesondere von 55°C und 61,5°C aus. In ei
ner weiteren Variante dieses Nachweisverfahrens
kann bei Auftreten der Schmelztemperatur von 55°C
der Mykobakterien-Stamm M. chelonae eindeutig ge
genüber allen anderen Mykobakterien-Stämmen, die
insbesondere eine Schmelztemperatur von 61,5°C auf
weisen, identifiziert und eine Mykobakterien-
Infektion durch M. chelonae nachgewiesen werden.
Als weiterer Vorteil erlaubt das erfindungsgemäße
Verfahren neben dem eindeutigen und sicheren Nach
weis einer tuberkulösen Infektion den eindeutigen
und sicheren Nachweis einer nicht-tuberkulösen In
fektion ausgelöst durch M. avium.
Der eindeutige Nachweis einer tuberkulösen Infekti
on durch Stämme des M. tuberculosis-Komplex findet
erfindungsgemäß durch Analyse der Schmelztemperatu
ren der Hybridisierung des Art-spezifischen Hybri
disierungssonden-Paars für den M. tuberculosis-
Komplex, das die Nucleotidsequenzen SEQ ID
NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder das Paar der komplementären
Sequenzen davon beinhaltet, mit der Art-
spezifischen Region des 16S-rRNA-Gens statt. In den
erfindungsgemäßen Nachweisverfahren zeichnen sich
Stämme des M. tuberculosis-Komplex durch Schmelz
temperaturen von mindestens 55°C, insbesondere von
64°C aus.
Der eindeutige Nachweis einer tuberkulösen Infekti
on durch M. avium findet erfindungsgemäß durch Ana
lyse der Schmelztemperaturen der Hybridisierung des
Art-spezifischen Hybridisierungssonden-Paars für
M. avium, das die Nucleotidsequenzen SEQ ID
NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder das Paar der komplementären
Sequenzen davon beinhaltet, mit der Art-
spezifischen Region des 16S-rRNA-Gens statt. In den
erfindungsgemäßen Nachweisverfahren zeichnet sich
M. avium durch Schmelztemperaturen von mindestens
55°C, insbesondere von 61°C aus.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das vorgenannte Ver
fahren mit einem erfindungsgemäßen internen Stan
dard in Form von künstlichen Plasmiden, Kon
trollplasmiden, zur Identifizierung sogenannter
"falsch-negativer" Befunde durchgeführt. In einer
Variante ist dazu vorgesehen, dass ein erster Teil
der extrahierten mikrobiellen DNA dem vorgenannten
Verfahren mit den Schritten (a) bis (e) unterzogen
wird und ein zweiter Teil der extrahierten mikro
biellen DNA in einem zum vorgenannten Verfahren pa
rallelen Ansatz
- 1. (a') mit mindestens einem künstlichen Plasmid vor zugsweise subcloniert in pGEM-T, das als interner Standard dient, vermischt wird, wobei das künstli che Plasmid eine Gattungs-spezifische Region III der 16S-rRNA mit einer modifizierten Nucleotidse quenz umfasst, und anschließend
- 2. (b') Fragmente der modifizierten 16S-rRNA-Gene mit tels mindestens eines Primerpaares ausgewählt aus der Gruppe der Primerpaare bestehend aus den Nucle otidsequenz-Paaren SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 vervielfacht werden und anschließend
- 3. (c') die vervielfachten 16S-rRNA-Fragmente mittels eines Paars markierter Hybridisierungssonden detek tiert werden, die mit der modifizierten Gattungs- spezifischen Region III hybridisieren, wobei das Paar der markierten Hybridisierungssonden die Nuc leotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 umfasst und wobei
- 4. (d') während der Detektion der spezifische Nachweis der 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des internen Stan dards mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt.
In einer weiteren bevorzugten Variante des erfin
dungsgemäßen Verfahrens werden die Schritte (a),
(b), (c), (d) und (e) des vorgenannten Verfahrens
durchgeführt, wobei das mindestens eine künstliche
Plasmid in Schritt (a) mit der gesamten extrahier
ten mikrobiellen DNA vermischt wird und nach Ampli
fikation gemäß Schritt (b) die Detektion und
Schmelzkurvenanalyse zum Nachweis der vervielfach
ten 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien und der
modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des internen Stan
dards, insbesondere gleichzeitig, gemäß der Schrit
te (c') und (d') durchgeführt wird.
Durch den Einsatz eines Kontrollplasmids im erfin
dungsgemäßen Nachweisverfahren gelingt es vorteil
haft, den Erfolg der Amplifikationsreaktion bereits
während der Nachweisreaktion von Mykobakterien zu
kontrollieren, um damit besonders schnell ein si
cheres und eindeutiges Ergebnis zu erhalten. Insbe
sondere sogenannte "falsch-negative" Befunde bei
Hemmung der Amplifikation sind durch Verwendung des
erfindungsgemäßen Plasmids als interner Standard
praktisch ausgeschlossen. Damit sind Spezifität und
Selektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ge
genüber dem Stand der Technik deutlich erhöht.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird
unter den Formulierungen "Primerpaar beinhaltend
oder umfassend die Nucleotidsequenzen", "ein Paar
Hybridisierungssonden beinhaltend oder umfassend
die Nucleotidsequenzen" oder ähnlichen verstanden,
dass die jeweiligen Nucleotidsequenzen oder das
Paar von Nucleotidsequenzen jeweils die in Bezug
genommenen Nucleotidsequenzen aufweisen/aufweist,
das heißt, dass diese Nucleotidsequenzen oder das
Paar davon aus den konkret genannten Nucleotidse
quenz allein bestehen/besteht oder gegebenenfalls
weitere Sequenzen umfassen/umfasst.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer
den unter dem Begriff "Mycobacterium tuberculosis-
Komplex" die tuberkulösen Mykobakterienarten
Mycobacterium tuberculosis, insbesondere der Stamm
H37Rv, und Mycobacterium bovis, insbesondere der
Stamm R99, wobei diese Stämme Erreger der Krankheit
Tuberkulose sind, sowie der Stamm BCG Pasteur des
Mycobacterium bovis verstanden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird
unter dem Begriff "tuberkulös" eine Eigenschaft be
schrieben, die sich auf Mycobacterium tuberculosis,
insbesondere den Stamm H37Rv, und Mycobacterium bo
vis, insbesondere den Stamm R99, im engeren Sinne
sowie auf den Stamm BCG Pasteur des Mycobacterium
bovis im weiteren Sinne bezieht und das Krankheits
bild der Tuberkulose bewirkt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer
den unter der Bezeichnung "Mycobacterium avium" die
nicht-tuberkulösen Mykobakterienarten Mycobacterium
avium, insbesondere der Stamm ATCC35712, und deren
Unterart Mycobacterium paratuberculosis, insbeson
dere der Stamm Pat. 6783, verstanden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird
unter dem Begriff "nicht-tuberkulös" eine Eigen
schaft verstanden, die im Zusammenhang mit einer
anderen Erkrankung als der Tuberkulose steht und
insbesondere eine Mykobakteriose ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer
den unter klinischem Material klinische Proben wie
Sputum, Bronchiallavage, Magensaft, Urin, Stuhl,
Liquor, Knochenmark, Blut oder Biopsien, insbeson
dere Punktat-Biopsien, beispielsweise aus Hals
lymphknoten, verstanden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird
unter dem Begriff "modifizierte Nucleotidsequenz"
eine Nucleinsäuresequenz verstanden, die sich durch
Austausch, Inversion, Deletion oder Addition von
mindestens einem Nucleotid, auch einem ungewöhnli
chen oder synthetischen Nucleotid, von ihrer ur
sprünglichen Sequenz, d. h. der Wildtyp-Sequenz, in
mindestens einem Nucleotid, bevorzugt in zwei Nuc
leotiden, unterscheidet. In diesem Zusammenhang
wird unter dem Begriff "modifiziert" eine Eigen
schaft verstanden, die sich auf eine "modifizierte
Nucleotidsequenz" bezieht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorgenann
ten Verfahren wird die Amplifikation der Genfrag
mente des 16S-rRNA-Gens mittels Polymerase-
Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Bevorzugt wird
die Amplifikation mittels Echtzeit-PCR (Rapid-
Cycle-PCR) durchgeführt. Im Echtzeit-PCR Verfahren
ist es möglich, die Vervielfachung der PCR-Produkte
in Echtzeit Amplifikations-Zyklus für Amplifikati
ons-Zyklus zu beobachten. Besonders bevorzugt wird
die Amplifikation in einem LightCycler™-System der
Firma Roche Molecular Biochemicals durchgeführt,
das eine Ausgestaltung der Echtzeit-PCR ist.
Zu diesem Zweck werden insbesondere der PCR-
Ausgangsmischung neben der Polymerase, den Nucleo
tiden, den Pufferlösungen und den Primern auch
Hybridisierungssonden zugegeben, die spezifisch an
die gewünschten PCR-Amplifikationsprodukte binden.
Dabei werden insbesondere zwei Sequenz-spezifische
Oligonucleotid-Sonden verwendet, die mit verschie
denen Farbstoffen markiert sind. Die Sequenzen der
erfindungsgemäßen markierten Hybridisierungssonden-
Paare sind so ausgewählt, dass sie auf eine Weise
an die Zielsequenzen des amplifizierten DNA-
Fragments hybridisieren, dass insbesondere das 3'-
Ende der einen Sonde dicht bei dem 5'-Ende der an
deren Sonde liegt, wodurch die beiden Farbstoffe in
unmittelbare Nachbarschaft zueinander gebracht wer
den, insbesondere beträgt der Abstand zwischen den
beiden Sonden zwischen 1 und 5 Nucleotide. Insbe
sondere kommt es zu einem Fluoreszenz-Resonanz-
Energietransfer (FRET) zwischen den beiden Farb
stoffen der Hybridisierungssonden und damit zu ei
ner Verschiebung des Fluoreszenzspektrums, wobei
das Maß an Fluoreszenz in diesem Wellenlängenbe
reich eine Funktion der Menge an detektierter DNA
ist.
Durch das FRET-System sind erfindungsgemäß quanti
tative Messungen der Menge amplifizierter DNA-
Fragmente vorgesehen. Die erfindungsgemäßen ausge
wählten Hybridisierungssonden können quantitativ,
also stöchiometrisch, an die amplifizierten Frag
mente binden. Dabei ist die quantitative Hybridi
sierung insbesondere abhängig von der Temperatur
und dem Homologiegrad der verwendeten Oligo
nucleotid-Sonden mit der detektierten Sequenz auf
dem amplifizierten Fragment.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die vor
genannte fluorimetrische Detektion spezifischer
DNA-Sequenzen in den amplifizierten Fragmenten nach
einer Amplifikation der Fragmente mittels herkömm
licher PCR durchgeführt. In einer besonders bevor
zugten Ausführungsform wird die fluorimetrische De
tektion in einer Echtzeit-PCR während der Amplifi
kationsreaktionen durchgeführt, wobei beispielswei
se die Zunahme an produzierter DNA als Zunahme im
Fluoreszenzsignal verfolgt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform des vorgenann
ten erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die spezi
fische Detektion Art-spezifischer und/oder Gat
tungs-spezifischer Regionen im amplifizierten DNA-
Fragment nach Beendigung der Amplifikationsreakti
on, wobei nach Hybridisierung des Hybridisierungs
sonden-Paars, bevorzugt eines FRET-Paars an die zu
detektierenden Regionen die Temperatur im Rahmen
einer Schmelzkurvenanalyse verändert wird, bevor
zugt kontinuierlich erhöht wird, und gleichzeitig
die in Abhängigkeit von der Temperatur emittierte
Fluoreszenz gemessen wird. Auf diese Weise wird ei
ne Schmelztemperatur bestimmt, bei der die Hybridi
sierungssonden, insbesondere das eingesetzte FRET-
Paar, gerade nicht mehr an die zu detektierende Re
gion des amplifizierten DNA-Fragments hybridisie
ren. Der wesentliche Aspekt einer Schmelzkurvenana
lyse besteht darin, dass es bei Auftreten von Fehl
paarungen zwischen dem eingesetzten Hybridisie
rungssonden-Paar und der Zielregion auf dem ampli
fizierten DNA-Fragment zu einer Reduktion des ge
messenen Schmelzpunktes kommt. Auf diese Weise wer
den erfindungsgemäß mit Hybridisierungssonden, ins
besondere mit einem FRET-Paar, die Regionen von
DNA-Fragmenten identifiziert, deren Sequenzen sich
voneinander nur geringfügig, insbesondere durch ei
ne oder wenige Punktmutationen, in der Nucleotidse
quenz unterscheiden.
In vorteilhafter Weise besitzt das 16S-rRNA-Gen von
Mykobakterien sowohl konservierte als auch hochva
riable Regionen, die beispielsweise eine Gattungs-
spezifische Amplifikation von DNA-Fragmenten mit
tels Gattungs-spezifischer Primer erlaubt. Erfin
dungsgemäß werden daher die vorgenannten Verfahren
der Fluoreszenzdetektion in Verbindung mit der
Schmelzkurvenanalyse zum spezifischen Nachweis der
Gattungs-spezifischen Region III und der hypervari
ablen Art-spezifischen Regionen des M. tuberculo
sis-Komplex und M. avium auf dem 16S-rRNA-Gen ein
gesetzt.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass myko
bakterielle 16S-rRNA-Gene jeweils zwei Art-
spezifische und zwei Gattungs-spezifische Regionen
enthalten, siehe Fig. 1: "species (A)" und "spe
cies (B)" beziehungsweise "genus II" und "genus I".
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine
dritte Gattungs-spezifische Region auf dem 16S-
rRNA-Gen beschrieben, siehe Fig. 1: "genus III"
(erfindungsgemäß).
In Fig. 1 sind zusätzlich schematisch die Primer
paare dargestellt, die zur Amplifikation der ausge
wählten Art-spezifischen beziehungsweise Gattungs-
spezifischen Regionen verwendet werden.
Erfindungsgemäß wird zur Amplifikation der Gat
tungs-spezifischen Region III 16S-rRNA-Gens von My
kobakterien das Primerpaar umfassend die Nucleotid
sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 eingesetzt.
In einer bevorzugten Variante besteht das Primer
paar aus degenerierten oder mutierten Sequenzen
oder Fragmenten davon, die jeweils mit den Nucleo
tidsequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 hybridi
sieren, wovon sie abgeleitet sind, wobei jeweils
ein Homologiegrad von mindestens 90%, bevorzugt
von mindestens 95%, besonders bevorzugt von min
destens 98% besteht.
Das mit den vorgenannten Primerpaar amplifizierte
1000 bp lange Fragment enthält sowohl die konser
vierte Gattungs-spezifische Region III als auch die
hochvariablen Art-spezifischen Regionen des M. tu
berculosis-Komplex und M. avium.
Als besonders überraschend wurde mit dem erfin
dungsgemäßen Verfahren gefunden, dass insbesondere
mit dem LightCycler™-System - im Gegensatz zur gän
gigen Lehrmeinung - eine effektive Amplifikation
dieses 1000 bp Fragments und der erfindungsgemäße
Nachweis der Gattungs- und Art-spezifischen Regio
nen auf diesem Fragment erzielt werden konnte, ob
wohl dieses Fragment aus Mykobakterien einen hohen
GC-Gehalt besitzt. Erfindungsgemäß bevorzugt kann
daher mittels eines einzigen amplifizierten Frag
ments des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien ein Gat
tungs-spezifischer Nachweis einer Mykobakterien-
Infektion gegenüber anderen mikrobiellen Infektio
nen und der Art-spezifische Nachweis des M. tuber
culosis-Komplex und M. avium durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß ist außerdem die zusätzliche oder
alternative Verwendung von zwei weiteren Primerpaa
ren vorgesehen, wobei ein Primerpaar ein insbeson
dere 300 bp langes Fragment des 16S-rRNA-Gens von
Mykobakterien amplifiziert, das die Art-
spezifischen Regionen des M. tuberculosis-Komplex
und M. avium enthält, wobei dieses Primerpaar aus
den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3
besteht, und das zweite Primerpaar ein 100 bp lan
ges Fragment desselben Gens amplifiziert, das die
Gattungs-spezifische Region III enthält, wobei die
ses Primerpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID
NO: 4/SEQ ID NO: 5 umfasst. In einer bevorzugten
Variante bestehen die zwei Primerpaare aus den Paa
ren degenerierter oder mutierter Sequenzen oder
Fragmenten davon, die jeweils mit den Nucleotidse
quenz-Paaren SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 und SEQ ID
NO: 4/SEQ ID NO: 5 hybridisieren, wovon sie abge
leitet sind, wobei jeweils ein Homologiegrad von
mindestens 90%, bevorzugt von mindestens 95%, be
sonders bevorzugt von mindestens 98% besteht.
Erfindungsgemäß wird zur Detektion der vorgenannten
amplifizierten 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakte
rien, die die Gattungs-spezfische Region III
und/oder die Art-spezifischen Regionen des M. tu
berculosis-Komplex und M. avium enthalten, ein Paar
markierter Hybridisierungssonden eingesetzt, das
mit der konservierten Gattungs-spezifischen Region
III hybridisiert, wobei dieses Paar die Nucleotid
sequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder die kom
plementären Sequenzen davon beinhaltet. Bevorzugt
wird dabei das Hybridisierungssonden-Paar als FRET-
Paar ausgeführt, wobei die Hybridisierungssonde mit
der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 10 oder der komple
mentären Sequenz davon als Donor-Komponente (= An
ker-Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 3'-
terminalen Nucleotid mit einem Farbstoff, vorzugs
weise mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, besonders
bevorzugt mit Fluorescein assoziiert ist, und die
zweite Hybridisierungssonde bestehend aus der Nuc
leotidsequenz SEQ ID NO: 11 oder der komplementären
Sequenz davon als Akzeptor-Komponente (= Sensor-
Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 5'-
terminalen Nucleotid mit einem weiteren Farbstoff,
vorzugsweise mit einem Rhodamin-Derivat assoziiert
ist.
Erfindungsgemäß wird die Detektion der vorgenannten
die Art-spezifischen Regionen enthaltenden 16S-
rRNA-Fragmente mit mindestens einem Paar markierter
Hybridisierungssonden durchgeführt, wobei bevorzugt
die markierten Hybridisierungssonden-Paare als
FRET-Paare ausgeführt sind. Dabei werden analog zum
Vorgenannten zur spezifischen Detektion der Myko
bakterienarten M. tuberculosis-Komplex und M. avium
die erfindungsgemäßen Art-spezifischen Hybridisie
rungssonden-Paare eingesetzt, wobei jeweils ein
Hybridisierungssonden-Partner (SEQ ID NO: 6 oder
das Komplement beziehungsweise SEQ ID NO: 8 oder
das Komplement) als Donor-Komponente (= Anker-
Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 3'-
terminalen Nucleotid mit einem Farbstoff, vorzugs
weise mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, besonders
bevorzugt mit Fluorescein assoziiert ist und der
jeweils andere Hybridisierungssonden-Partner (SEQ
ID NO: 7 oder Komplement beziehungsweise SEQ ID
NO: 9 oder Komplement) als Akzeptor-Komponente (=
Sensor-Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am
5'-terminalen Nucleotid mit einem weiteren Farb
stoff, vorzugsweise mit einem Rhodamin-Derivat as
soziiert ist.
In bevorzugten Varianten der vorgenannten Ausfüh
rungsformen ist das Rhodamin-Derivat LightCycler-
Red 640; in weiteren bevorzugten Varianten der vor
genannten Ausführungsform ist das Rhodamin-Derivat
LightCycler-Red 705; in weiteren bevorzugten Vari
anten der vorgenannten Ausführungsform ist das Rho
damin-Derivat Cy5.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Nachweis
verfahrens werden zur Markierung der Hybridisie
rungssonden-Paare jeweils dieselben Donor-
Akzeptor-Farbstoffe verwendet, bevorzugt Fluores
cein/LightCycler-Red 640, wobei die Schmelzkurven
analyse mit dem Gattungs-spezifischen Sonden-Paar
zum Nachweis von Mykobakterien zeitlich oder räum
lich getrennt von der Schmelzkurvenanalyse mit ei
nem der Art-spezifischen Hybridisierungssonden-
Paare zum Nachweis des M. tuberculosis-Komplex oder
von M. avium insbesondere in jeweils parallelen An
sätzen erfolgt.
In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen
Nachweisverfahrens werden zur Markierung der Hybri
disierungssonden-Paare jeweils verschiedene Donor-
Akzeptor-Farbstoffe verwendet, wobei die Schmelz
kurvenanalyse mit dem Gattungs-spezifischen Sonden-
Paar zum Nachweis von Mykobakterien, das bevorzugt
mit Fluorescein/LightCycler-Red 640 markiert ist,
zeitlich und räumlich zusammen in einem Ansatz mit
der Schmelzkurvenanalyse mit einem der Art-
spezifischen Hybridisierungssonden-Paare, das be
vorzugt mit Fluorescein/LightCycler-Red 705 mar
kiert ist, zum Nachweis des M. tuberculosis-Komplex
oder von M. avium erfolgt, wobei bevorzugt im
LightCycler™-System die Fluoreszenz des Gattungs-
spezifischen Sonden-Paars mit einem Photodetektor-
Kanal und die Fluoreszenz eines Art-spezifischen
Sonden-Paars mit dem zweiten Photodektor-Kanal re
gistriert wird.
In diesem Zusammenhang sind ein weiterer Gegenstand
der vorliegenden Erfindung Oligonucleotid-Primer-
Paare zur Vervielfältigung von 16S-rRNA-Fragmenten
aus extrahierter bakterieller DNA zum spezifischen
Nachweis von Mykobakterien und zur Unterscheidung
des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und Mycobac
terium avium von anderen Mykobakterienarten in kli
nischem Material, wobei ein Primerpaar die Nucleo
tidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 oder ein
Paar degenerierter oder mutierter Nucleotidsequen
zen oder Fragmente davon umfasst. Die degenerierten
oder mutierten Nucleotidsequenzen haben die Eigen
schaft, jeweils mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ
ID NO: 3 zu hybridisieren, wobei jeweils ein Homo
logiegrad von mindestens 90%, bevorzugt von min
destens 95%, besonders bevorzugt von mindestens
98%, bevorzugt ist.
Die Erfindung betrifft auch ein zweites Primerpaar
mit einem Primer mit der Nucleotidsequenz SEQ ID
NO: 4 oder einer degenerierten oder mutierten Nuc
leotidsequenz oder ein Fragment davon, das mit der
Sequenz SEQ ID NO: 4 hybridisiert, wobei ein Homo
logiegrad von mindestens 90%, bevorzugt von min
destens 95%, besonders bevorzugt von mindestens
98% bevorzugt ist.
In diesem Zusammenhang sind ein weiterer Gegenstand
der vorliegenden Erfindung Oligonucleotid-
Hybridisierungssonden-Paare zum spezifischen Nach
weis von Mykobakterien und zur Unterscheidung des
Mycobacterium tuberculosis-Komplex und Mycobacteri
um avium von anderen Mykobakterienarten in klini
schem Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID
NO: 11 oder dem Paar der komplementären Sequenzen
davon, den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID
NO: 7 oder dem Paar der komplementären Sequenzen
davon und den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 8/SEQ
ID NO: 9 oder dem Paar der komplementären Sequenzen
davon.
In diesem Zusammenhang ist ein weiterer Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ein künstliches Plasmid,
Kontrollplasmid, vorzugsweise erhalten durch Subc
lonierung des 16S-rRNA-Gens in pGEM-T, das als in
terne Kontrolle der Amplifikation (Inhibiti
onskontrolle) und des spezifischen Nachweises von
16S-rRNA-Fragmenten von Mykobakterien dient und ei
ne Nucleinsäuresequenz der modifizierten Gattungs-
spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens enthält.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Kontroll
plasmid durch Nucleotid-Austausch, Nucleotid-
Addition, Nucleotid-Deletion und/oder Nucleotid-
Inversion mindestens eines Nucleotids, bevorzugt
zweier Nucleotide von der Wildtyp-Nuclein
säuresequenz der Gattungs-spezifischen Region III
des 16S-rRNA-Gens abgeleitet. In einer weiteren Va
riante umfasst das künstliche Plasmid die Nucleo
tidsequenz SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 15, worin
jeweils ein Nucleotid gegenüber der Wildtyp-Sequenz
ausgetauscht ist. Besonders überraschend wurde da
bei gefunden, dass durch den Ersatz des einen
Nucleotids eine Reduktion der Schmelztemperatur der
Gattungs-spezifischen Hybridisierungssonden von
ungefähr 1°C eintritt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante
umfasst das künstliche Plasmid die Nucleotidsequenz
SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 17, worin jeweils
zwei Nucleotide gegenüber der Wildtyp-Sequenz aus
getauscht sind. Besonders überraschend wurde dabei
gefunden, dass durch den Ersatz der zwei Nucleotide
eine Reduktion der Schmelztemperatur der Gattungs-
spezifischen Hybridisierungssonden von ungefähr
14,5°C eintritt. Dies erlaubt vorteilhafter Weise
den gleichzeitigen Einsatz der modifizierten 16S-
rRNA zusammen mit der nachzuweisenden Wildtyp-16S-
rRNA in einem Ansatz zur Schmelzkurvenanalyse, ins
besondere mittels des erfindungsgemäßen Gattungs-
spezifischen Hybridisierungssonden-Paars, da ihre
Schmelztemperaturen unterscheidbar weit auseinan
derliegen und somit das nachzuweisende Wildtyp-16S-
rRNA-Fragment unbeeinflusst vom internen Standard
detektiert und erkannt werden kann.
In diesem Zusammenhang ist ein weiterer Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ein Diagnose-Kit zum
spezifischen Nachweis einer Mycobakterien-Infektion
und von M. tuberculosis und M. avium in klinischem
Material gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren, das
mindestens eine Polymerase, mindestens eines, vor
zugsweise alle der vorgenannten Primerpaare und
mindestens eines, vorzugsweise alle der vorgenann
ten Hybridisierungssonden-Paare umfasst. Erfin
dungsgemäß bevorzugt umfasst das Diagnosekit zu
sätzlich mindestens ein erfindungsgemäßes künstli
ches Kontrollplasmid als internen Standard.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich
aus den Unteransprüchen.
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Die Erfindung wird anhand des Sequenzprotokolls,
das die Sequenzen Nr. 1 bis 17 enthält, anhand der
Fig. 1 bis 4 sowie anhand der Beispiele 1 bis 8
näher erläutert.
SEQ ID NO: 1 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 1000 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, ent haltend die Art-spezifische Regionen des M. tuber culosis-Komplex und von M. avium und die Gattungs- spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 2 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 300 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, ent haltend die Art-spezifische Regionen des M. tuber culosis-Komplex und von M. avium,
SEQ ID NO: 3 - "antisense"-Primer ("reverse"- Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 300 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakte rien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium,
SEQ ID NO: 4 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 100 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, ent haltend die Gattungs-spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 5 - "antisense"-Primer ("reverse"- Primer) a) des Primer-Paares zur Amplifikation ei nes 1000 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Myko bakterien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium und die Gattungs-spezifische Region III der Gattung My cobacterium, und b) des Primer-Paares zur Amplifi kation eines 100 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, enthaltend die Gattungs-spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 6 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tuber culosis-Komplex,
SEQ ID NO: 7 - "sense"-Hybridisierungssonde, insbe sondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tuber culosis-Komplex,
SEQ ID NO: 8 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium,
SEQ ID NO: 9 - "sense"-Hybridisierungssonde, insbe sondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium,
SEQ ID NO: 10 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 11 - "sense"-Hybridisierungssonde, ins besondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 12 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation des kompletten 16S-rRNA-Gens (1523 bp) von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 13 - "antisense"-Primer ("reverse"- Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation zur Amplifikation des kompletten 16S-rRNA-Gens (1523 bp) von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 14 - modifizierter "sense"-Primer ("for ward"-Primer) zur Amplifikation eines kompletten Kontrollplasmids, enthaltend eine modifizierte Gat tungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 15 - modifizierter "antisense"-Primer ("reverse"-Primer) zur Amplifikation eines komplet ten Kontrollplasmids, enthaltend eine modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 16 - modifizierter "sense"-Primer ("for ward"-Primer) zur Amplifikation eines weiteren kom pletten Kontrollplasmids, enthaltend eine weitere modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 17 - modifizierter "antisense"-Primer ("reverse"-Primer) zur Amplifikation eines weiteren kompletten Kontrollplasmids, enthaltend eine weite re modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien.
SEQ ID NO: 1 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 1000 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, ent haltend die Art-spezifische Regionen des M. tuber culosis-Komplex und von M. avium und die Gattungs- spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 2 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 300 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, ent haltend die Art-spezifische Regionen des M. tuber culosis-Komplex und von M. avium,
SEQ ID NO: 3 - "antisense"-Primer ("reverse"- Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 300 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakte rien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium,
SEQ ID NO: 4 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 100 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, ent haltend die Gattungs-spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 5 - "antisense"-Primer ("reverse"- Primer) a) des Primer-Paares zur Amplifikation ei nes 1000 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Myko bakterien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium und die Gattungs-spezifische Region III der Gattung My cobacterium, und b) des Primer-Paares zur Amplifi kation eines 100 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, enthaltend die Gattungs-spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 6 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tuber culosis-Komplex,
SEQ ID NO: 7 - "sense"-Hybridisierungssonde, insbe sondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tuber culosis-Komplex,
SEQ ID NO: 8 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium,
SEQ ID NO: 9 - "sense"-Hybridisierungssonde, insbe sondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium,
SEQ ID NO: 10 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 11 - "sense"-Hybridisierungssonde, ins besondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 12 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation des kompletten 16S-rRNA-Gens (1523 bp) von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 13 - "antisense"-Primer ("reverse"- Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation zur Amplifikation des kompletten 16S-rRNA-Gens (1523 bp) von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 14 - modifizierter "sense"-Primer ("for ward"-Primer) zur Amplifikation eines kompletten Kontrollplasmids, enthaltend eine modifizierte Gat tungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 15 - modifizierter "antisense"-Primer ("reverse"-Primer) zur Amplifikation eines komplet ten Kontrollplasmids, enthaltend eine modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 16 - modifizierter "sense"-Primer ("for ward"-Primer) zur Amplifikation eines weiteren kom pletten Kontrollplasmids, enthaltend eine weitere modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 17 - modifizierter "antisense"-Primer ("reverse"-Primer) zur Amplifikation eines weiteren kompletten Kontrollplasmids, enthaltend eine weite re modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Ausfüh
rungsbeispiele und den dazugehörigen Figuren näher
erläutert:
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 Schematische Darstellung des 16S-rRNA-
Gens von Mykobakterien (Länge: 1523 bp),
der Position der Art-spezifischen Regio
nen, "species(A)" und "species(B)", so
wie der Gattungs-spezifischen Regionen
"genus I", "genus II" und "genus III",
sowie der Lage und Größe der mittels der
Primer-Paare (1) und (5), (2) und (3)
sowie (4) und (5) amplifizierten Frag
mente.
Fig. 2 Sensitivität des Art-spezifischen Nach
weises des PL tuberculosis-Komplexes:
Schmelzkurven der Hybridisierung der er
findungsgemäßen Art-spezifischen Hybri
disierungssonden mit der Artspezi
fischen Region des M. tuberculosis-
Komplexes im amplifizierten 1000 bp-
Fragment der 16S-rRNA von Mykobakterien.
Fig. 3 Modifiziertes 16S-rRNA-Fragment als in
terner Standard (pJL6): Schmelzkurven
der Hybridisierung der Gattungs-
spezifischen Hybrid Schmelzkurven der
Hybridisierung isierungssonden mit der
Gattungs-spezifischen Region III und der
modifizierten Gattungs-spezifischen Re
gion III des internen Standards (pJL6)
bei unterschiedlicher Anzahl an Genomko
pien der nachzuweisenden Gattungs-
spezifischen Region III.
Fig. 4 Modifiziertes 16S-rRNA-Fragment als in
terner Standard (pJL6): Schmelzkurven
der Hybridisierung der Gattungs-
spezifischen Hybridisierungssonden mit
der Gattungs-spezifischen Region III und
der modifizierten Gattungs-spezifischen
Region III des internen Standards (pJL6)
in Gegenwart unterschiedlicher Menge an
"Hintergrund"-DNA aus E. coli.
Mikrobielle DNA wird aus klinischen Proben beste
hend aus Sputum, Bronchiallavage, Magensaft, Urin,
Stuhl, Liquor, Knochenmark, Blut oder Punktat-
Biopsien in an sich bekannter Weise zum Beispiel
mittels eines QiampMiniKit (Firma Qiagen, Katalog-
Nr. 51 306) aufgereinigt, das heißt extrahiert.
Chromosomale DNA wird dabei mittels PicoGreen-
System (Firma Molecular Probes) quantifiziert.
Verschiedene Anzahlen genomischer Kopien pro Nach
weis-Ansatz (siehe unten) werden durch Molekularge
wichtsberechnungen und die Durchführung von Verdün
nungsreihen erhalten.
Insbesondere zur Evaluation der erfindungsgemäßen
Nachweisverfahren wird mikrobielle DNA verschiede
ner Kulturen von Mikroorganismen, zum Beispiel der
in Tabelle 1 aufgeführten Organismen, isoliert.
Insbesondere zur Anwendung der erfindungsgemäßen
Nachweisverfahren auf aus Patienten-Proben gewonne
nen (Bouillon-)Kulturen von zu diagnostizierenden
Mikroorgansmen wird mikrobielle DNA aus diesen Kul
turen isoliert.
Anschließend wird die mikrobielle DNA in an sich
bekannter Weise zum Beispiel mittels eines QiampMi
niKit™ (Firma Qiagen, Katalog-Nr. 51 306) aufgerei
nigt, das heißt extrahiert. Chromosomale DNA wird
dabei in an sich bekannter Weise zum Beispiel mit
tels PicoGreen™-System (Firma Molecular Probes)
quantifiziert.
Zur Amplifikation in einer optimierten LightCyc
ler™-PCR (siehe Beispiel 3) wird ein Ansatz bein
haltend die fertig erhältliche Mischung "LightCyc
ler FastStart DNA Master Hybridisation Probes" (Ka
talog-Nr. 239 272, Firma Roche Molecular Biochemi
cals) gewählt.
Es wird folgende Reaktionsmischung für die Light-
Cycler-Reaktion hergestellt:
- - Taq Polymerase
- - Reaktionspuffer
- - Desoxi-Nucleosid-Triphosphat-Mischung (dNTP)
- - 3 mmol/l MgCl2
Primer-Paar a) oder b)
je Primer: 18 µmol, entsprechend 1,1 µmol/l Endkonzentration:- a) Primer-Paar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5
oder - b) Primer-Paar SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 und Primer-Paar SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5
- a) Primer-Paar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5
Erfindungsgemäß wird zur Amplifikation das
Primer-Paar a) SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 ein
gesetzt, das ein 1000 bp langes Fragment der
16S-rRNA, enthaltend die Gattungs-spezifische
Region III und die Art-spezifischen Regionen,
amplifiziert.
Alternativ werden erfindungsgemäß die beiden
Primer-Paare b) gleichzeitig in einem Mu
litplex-PCR-Ansatz, in parallelen Ansätzen
oder zeitlich getrennt eingesetzt, wobei das
Primer-Paar enthaltend SEQ ID NO: 2/SEQ ID
NO: 3 ein 300 bp langes Fragment der 16S-rRNA,
enthaltend die Art-spezifischen Regionen,
amplifiziert und zum anschließenden Nachweis
des M. tuberculosis-Komplex und/oder von M.
avium dient, und wobei das Primer-Paar enthal
tend SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 ein 100 bp lan
ges Fragment der 16S-rRNA, enthaltend die Gat
tung sspezifische Region III, amplifiziert und
zum anschließenden Nachweis einer Mykobakte
rien-Infektion dient.
- - Oligonucleotid-FRET-Sonden-Paare c) bis e)
je Sonde: 2 µmol, entsprechend 120 nmol/l End
konzentration:
- a) SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III,
- b) SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tubercu losis-Komplex,
- c) SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium
Erfindungsgemäß wird das Sondenpaar c) SEQ ID
NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder ein komplementäres
oder mutiertes oder degeneriertes Paar davon
zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region
III eingesetzt. Soll im erfindungsgemäßen Ver
fahren lediglich zusätzlich zu der Gattungs-
spezifischen Detektion der M. tuberculosis-
Komplex detektiert werden, wird das Sondenpaar
d) SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 beziehungsweise
deren Äquivalente, das heißt mutierte oder
komplementäre Paare davon, eingesetzt. Sollen
dagegen zusätzlich zur Gattungs-spezifischen
Detektion lediglich Mykobaktieren der Art M.
avium nachgewiesen werden, wird das Sondenpaar
e) SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 beziehungsweise
deren Äquivalente, das heißt mutierte oder
komplementäre Paare davon, eingesetzt. Sollen
gemeinsam mit der Gattungs-spezifischen Region
III sowohl der M. tuberculosis-Komplex also
auch M. avium nachgewiesen werden, werden ne
ben dem Sondenpaar c) entsprechend beide Son
denpaare d) und e) eingesetzt.
Diese Reaktionsmischung wird durch Puls-
Zentrifugation in die Glaskapillaren des LightCyc
ler-Systems verbracht und die Amplifikation nach
dem "Hot Start"-Prinzip nach einer anfänglichen De
naturierung bei 95°C für 10 Minuten mit den folgen
den Schritten durchgeführt:
- 1. Denaturierung bei 95°C für 3 Sekunden
- 2. Primer-Hybridisierung bei Temperaturen von 68°C bis 62°C für 2 Sekunden ("touch-down- annealing")
- 3. Polymerisation bei 72°C für 40 Sekunden.
Die Schritte 1 bis 3 werden insgesamt 50 mal zyk
lisch abgearbeitet, wobei für die ersten 5 Zyklen
die Hybridisierung in Schritt 2 bei 68°C erfolgt
und bei den nachfolgenden 6 Zyklen die Temperatur
auf 62°C in Schritten von 1°C pro Zyklus reduziert
wird und für die restlichen Zyklen bei 62°C durch
geführt wird. Die Rate der Temperaturänderung liegt
bei allen Schritten bei 20°C pro Sekunde.
Zur Detektion der amplifizierten Fragmente werden
die in der Reaktionsmischung eingesetzten FRET-
markierten Hybridisierungssonden-Paare verwendet,
wobei jeweils ein Hybridisierungssonden-Partner
(SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6 beziehungsweise SEQ ID
NO: 8) als Donor-Komponente am 3'-terminalen Nucle
otid mit Fluorescein assoziiert ist, und der je
weils andere Hybridisationssonden-Partner (SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 7 beziehungsweise SEQ ID NO: 9)
als Akzeptor-Komponente am 5'-terminalen Nucleotid
mit LightCycler-Green 640 assoziiert ist.
Die im Verlauf der Detektion erfolgende Schmelzkur
venanalyse beginnt mit der Denaturierung der ampli
fizierten Fragmente bei 95°C für 30 Sekunden, wor
auf eine Hybridisierung mit den vorgenannten FRET-
Paaren bei 38°C für 30 Sekunden folgt. Zur Bestim
mung der Schmelzkurve der Hybridisierung wird die
Temperatur anschließend kontinuierlich von 38°C auf
80°C mit einer Rate von 0,2°C/sec erhöht, wobei die
von den FRET-Paaren emittierte Fluoreszenz kontinu
ierlich aufgezeichnet wird. Zur Auswertung des Flu
oreszenzsignals wird das LightCycler-"Run Profile"-
Programm in der Version 3.5.3 eingesetzt, wobei die
Verstärkung des F2-Kanals des photometrischen De
tektors des LightCycler-Systems automatisch einge
stellt wird.
Um einen internen Standard zur Kontrolle der er
folgreichen selektiven Amplifikation der gewünsch
ten Fragmente des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien
gemäß Beispiel 1 zur Verfügung zu haben (Inhibiti
onskontrolle), wird zunächst das gesamte 16S-rRNA-
Gen von Mykobakterien (1523 bp) mit einem PCR-
Primerpaar amplifiziert, wobei der "sense"-Primer
aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 12 und der "an
tisense"-Primer aus der Nucleotidsequenz SEQ ID
NO: 13 besteht. Zur Amplifikation werden 40 Zyklen
der folgenden Schritte durchgeführt:
- 1. Denaturierung bei 95°C
- 2. Primer-Hybridisierung bei 56,5°C
- 3. Polymerisation bei 72°C.
Anschließend werden die amplifizierten Fragmente in
an sich bekannter Weise zum Beispiel in pGEM-T
(Firma Promega) subcloniert.
Um das künstliche Plasmid als internen Standard
einsetzen zu können, soll sich die im künstlichen
Plasmid (= pIJ6) enthaltene Gattungs-spezifische Re
gion III der 16S-rRNA durch mindestens eine Punkt
mutation von der Wildtyp-Nucleotidsequenz der Gat
tungs-spezifischen Region III unterschieden. Um
mindestens eine gezielte Punktmutation in die Gat
tung sspezifische Region III des 16S-rRNA-Fragments
einzuführen, werden zur Vervielfältigung der die
subclonierten Fragmente enthaltenden Plasmide modi
fizierte Primerpaare eingesetzt, bei denen jeweils
ein oder zwei Nucleotide in den Nucleotidsequenzen
gegenüber den Wildtyp-Nucleotidsequenzen ausge
tauscht wurden.
Dazu werden folgende Primerpaare, abgeleitet von
der Wildtyp-Sequenz der Gattungs-spezifischen Regi
on III, insbesondere von der die Akzeptor-
Komponente des erfindungsgemäßen FRET-Paars, SEQ ID
NO: 11, bindenden Region verwendet:
- a) Austausch eines Nucleotids:
"forward"-Primer: (SEQ ID NO: 14)
"forward"-Primer: (SEQ ID NO: 15) - b) Austausch von zwei Nucleotiden:
"forward"-Primer: (SEQ ID NO: 16) "reverse"-Primer: (SEQ ID NO: 17)
In den erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen der
vorgenannten modifizierten Primerpaare wurde je
weils das unterstrichene Nucleotid gegenüber der
Wildtyp-Sequenz der Gattungs-spezifischen Region
III ersetzt.
Die Vervielfachung der Kontrollplasmide mit den mo
difizierten Primerpaaren wird jeweils in einer
"long range"-PCR mit einer Pfu-Polymerase, Typ:
"Pfu Turbo Hot Start DNA" (Firma Stratagene) in an
sich bekannter Weise in einem "Hot Start" PCR-
Verfahren durchgeführt mit jeweils 18 Zyklen der
folgenden Schritte:
- 1. Denaturierung bei 95°C
- 2. Primer-Hybridisierung bei 50°C
- 3. Polymerisation bei 68°C.
- a) Die erhaltenen Amplicons werden zusätzlich über ein Gel aufgereinigt und die Punktmutationen können anschließend werden mittels Sequenzierung bestätigt werden.
- b) Der Ersatz des Nucleotids "T" mit dem Nucleotid "C" am 3'-Ende der die Akzeptor-Komponente des FRET-Paars bindenden Region der Gattungs- spezifischen Region III führt zu einer Reduktion der Schmelztemperatur von ungefähr 1°C.
- c) Wird am 5'-Ende das Nucleotid "G" mit dem Nucle otid "A" und vier Nucleotide entfernt davon das Nucleotid "A" mit dem Nucleotid "T" ersetzt, kommt es zu einer signifikanten Reduktion der Schmelztem peratur um cirka 14,5°C.
Als besonders überraschend wird gefunden, dass eine
zwei Nucleotide umfassende Modifikation der die Ak
zeptor-Komponente des FRET-Paars bindenden Region
der Gattungs-spezifischen Region III ausreicht, um
eine Differenzierung der so modifizierten 16S-rRNA,
enthalten in einem künstlichen Plasmid, von der
Wildtyp-16S-rRNA zu unterscheiden. Die Verwendung
des erfindungsgemäßen modifizierten 16S-rRNA-
Fragments als interner Standard, enthalten in einem
künstlichen Plasmid, im erfindungsgemäßen Verfahren
gemäß Beispiel 1 ist somit besonders vorteilhaft
zur Kontrolle der Amplifikation und zur Verifikati
on des Nachweises einer Mykobakterien-Infektion.
In einem weiteren Experiment wird zunächst, wie un
ter a) beschrieben, durch Einsatz der erfindungsge
mäßen Primer SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein
Kontrollplasmid erhalten, das ein durch Austausch
zweier Nukleotide modifiziertes 16S-rRNA-Fragment
enthält. Jeweils 50 Kopien des Kontrollplasmids
werden als interner Standard mit verschiedenen An
zahlen von Genkopien des 16S-rRNA-Gens von M. tu
berculosis gemischt und dem Nachweisverfahren gemäß
Beispiel 1 unterzogen.
In Gegenwart von 50 Kopien des internen Standards
konnten bereits 10 Genkopien des 16S-rRNA-Fragments
von M. tuberculosis eindeutig mittels Schmelzkur
venanalyse nachgewiesen werden. Bei einer Anzahl
von 5 Genkopien ist das dabei erhaltene Fluores
zenzsignal zwar nicht mit einfachen statistischen
Mitteln auswertbar, jedoch lässt sich in der
Schmelzkurvenschar in Fig. 3 eine deutliche Spitze
bei der entsprechenden Schmelztemperatur nachwei
sen.
Die Verwendung dieses internen Standards ist somit
auch dann möglich, wenn zu erwarten ist, dass die
Anzahl an nachzuweisenden Genkopien im klinischen
Material um eine Größenordnung geringer ist als die
Zahl der als interner Standard eingesetzten Plas
midkopien.
In einem weiteren Experiment wird zunächst, wie un
ter a) beschrieben, durch Einsatz der erfindungsge
mäßen Primer SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein
Kontrollplasmid (erhalten, das ein durch Austausch
zweier Nukleotide modifiziertes 16S-rRNA-Fragment
enthält. Jeweils 50 Kopien des Kontrollplasmids und
10 Genkopien des 16S-rRNA-Gens von M. tuberculosis
werden mit unterschiedlichen Mengen an "Hinter
grund"-DNA von E. coli im Bereich von 1 pg bis
200 ng versetzt und anschließend dem Nachweisver
fahren gemäß Beispiel 1 unterzogen.
In Gegenwart von bis zu 200 ng fremder DNA, soge
nannter "Hintergrund"-DNA, pro Ansatz konnten 10
Genkopien des 16S-rRNA-Fragments von M. tuberculo
sis noch eindeutig mittels Schmelzkurvenanalyse
nachgewiesen werden (Fig. 4).
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren, insbesonde
re unter Verwendung dieses internen Standards, ist
somit auch dann möglich, wenn zu erwarten ist, dass
im isolierten klinischen Material eine große Menge
an fremder DNA, Hintergrund-DNA, vorhanden ist.
Zur Untersuchung der auf dem LightCycler™-System
basierten Amplifikation und Hybridisierung (siehe
Beispiel 1) wird als "Template" genomische DNA des
Bakterienstammes Mycobacterium bovis BCG des M. tu
berculosis-Komplex verwendet.
Verschiedene Anzahlen genomischer Kopien pro PCR-
Reaktion werden durch Molekulargewichtsberechnungen
und die Durchführung von Verdünnungsreihen erhal
ten.
Folgende Parameter wurden für die kombinierte
Amplifikations- und Hybridisierungsreaktion einge
setzt:
- - MgCl2-Konzentration 3 mmol/l
- - Primer-Konzentration: 18 pmol pro Reaktion, entspricht einer Endkonzentration von 1,1 µmol/l
- - "Hot Start"-Taq Polymerase des Typs "LightCyc ler™ FastStart DNA Master SYBR Green I" (Kata log-Nr. 3003230)
- - Polymerisationszeit: 40 Sekunden
- - Hybridisierungs-Zeit: 3 Sekunden
- - Hybridisierungs-Temperatur: 62°C, bei schritt weiser Reduzierung ausgehend von 68°C nach 5 Zyklen mit 1°C pro Zyklus.
Eine Zahl von 5 Genomkopien kann reproduzierbar in
Verdünnungsreihen nachgewiesen werden.
Sowohl der Einsatz einer "Hot Start"-Polymerase als
auch die zyklusweise Reduktion der Hybridisierungs-
Temperatur verhindert die Bildung von Primer-
Dimeren und die erhöht die Sensitivität der Ampli
fikation.
In einem ersten Ansatz gemäß Beispiel 1 wird mit
den entsprechenden erfindungsgemäßen Primerpaaren
ein jeweils 100 bp langes Fragment der Gattungs-
spezifischen Region III (SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5)
und ein 300 bp langes Fragment der Art-spezifischen
Regionen (SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3) amplifiziert.
In einem zweiten Ansatz gemäß Beispiel 1 wird ein
1000 bp langes Fragment, das sowohl die Gattungs-
spezifische Region III als auch die beiden Art-
spezifischen Regionen enthält, mit dem entsprechen
den Primerpaar (SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5) amplifi
ziert.
Anschließend wird die Sensitivität des erfindungs
gemäßen Nachweisverfahrens gemäß Beispiel 1 getes
tet.
Überraschenderweise ergibt sich, dass das 1000 bp
lange Fragment gegenüber den beiden 100 bp und
300 bp langen Fragmenten dieselbe Sensitivität des
Nachweises besitzt. Dieses Ergebnis steht im Gegen
satz zu dem Vorurteil aus dem Stand der Technik,
wonach es aufgrund des hohen CG-Nucleotidgehalts im
16S-rRNA-Gen von Mykobakterien zu unspezifischen
Störungen bei dem Nachweisverfahren gemäß Beispiel
1 in einem LightCycler™-System kommt.
Zur Überprüfung der Sensitivität wird im erfin
dungsgemäßen Nachweisverfahren (Beispiel 1) das mit
dem Primer-Paar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 amplifi
zierte 1000 bp-Fragment eingesetzt.
Zunächst wird eine Verdünnungsreihe des Genoms von
M. bovis BCG aus dem M. tuberculosis-Komplex wird
erstellt, die jeweils 5, 50, 500 beziehungsweise
5000 Genomkopien enthält.
In weiteren Ansätzen werden Verdünnungsreihen wei
terer tuberkulöser und nicht-tuberkulöser Mykobak
terienarten untersucht.
- a) Bereits bei 5 Genomkopien lässt sich eindeutig eine Schmelzkurve bestimmen, wobei der Schmelzpunkt der Gattungs-spezifischen Region III für alle Myko bakterienarten bei mindestens 55°C liegt. Bei M. chelonae liegt der Schmelzpunkt bei 55°C, bei allen anderen Mykobakterienarten bei 61,5°C.
- b) Darüber hinaus zeigt sich, dass bei einer Viel zahl anderer Mykobakterienarten, beispielsweise von M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. intracellu lare, M. paratuberculosis, M. kansasii, M. marinum, M. abcessus, M. fortuitum, ein eindeutiger Nachweis der Gattungs-spezifischen Region III bei einer Zahl von 5 Genomkopien erfolgen kann.
Gemäß a) wird eine Verdünnungsreihe des M. tubercu
losis-Genoms erstellt, die jeweils 5, 50, 500 be
ziehungsweise 5000 Kopien enthält.
Bereits bei 5 Genomkopien kann die Schmelzkurve der
Art-spezifischen Region von M. tuberculosis eindeu
tig bestimmt werden (Fig. 2). Dabei liegt der er
mittelte Schmelzpunkt bei 64°C (Tabelle 1).
Entsprechend a) und b) wird eine Verdünnungsreihe
des Genoms von M. avium angefertigt und mit den
entsprechenden Hybridisierungssonden-Paaren eine
Schmelzkurvenanalyse der amplifizierten Fragmente
durchgeführt.
Bereits ausgehend von 5 Genomkopien ist eine
Schmelzkurvenanalyse des Amplicons möglich, wobei
ein Schmelzpunkt von 61,0°C festgestellt wird (Ta
belle 1).
Aus den Mikroorganismen aus Tabelle 1 wird pro An
satz jeweils 2,5 ng genomische DNA, entsprechend
500 000 Genomkopien, extrahiert und in das erfin
dungsgemäße Nachweisverfahren eingesetzt.
Wie in Beispiel 5 wird dabei mit dem Gattungs-
spezifischen Primerpaar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5
ein 1000 bp langes Fragment des 16S-rRNA-Gens
amplifiziert.
- a) Bei sämtlichen untersuchten Mykobakterienarten findet Amplifikation statt.
- b) Das eingesetzte Primer-Paar zeigt eine fast vollständige Gattungs-Spezifität für Mykobakterien: Ausgewählt aus der Vielzahl verschiedener bakteri eller und pilzlicher Mikroorganismen findet ledig lich bei der Gattung Corynebakterium eine Amplifi kation des 16S-rRNA-Gens statt.
Eine Schmelzkurvenanalyse der in amplifizierten
Fragmente mittels des erfindungsgemäßen Hybridisie
rungssonden-Paars SEQ ID NO: 10 /SEQ ID NO: 11,
spezifisch für die Gattungs-spezifische Region III,
wird durchgeführt.
- a) Sämtliche Mykobakterienarten weisen einen Schmelzpunkt von mindestens 55°C auf.
- b) Bei M. chelonae liegt der Schmelzpunkt bei 55°C, bei allen anderen Mykobakterienarten bei 61,5°C.
- c) Der Schmelzpunkt bei amplifizierten 16S-rRNA- Fragmenten der Gattung Corynebakterium liegt bei 43°C, beziehungsweise es kann überhaupt kein Hybri disierungssignal detektiert werden.
- d) Mittels des erfindungsgemäßen Gattungs- spezifischen Nachweisverfahrens lassen sich sämtli che Mykobakterienarten eindeutig gegenüber anderen Mikroorganismen identifizieren.
Entsprechend a) werden zunächst jeweils 2,5 ng ge
nomischer DNA der in Tabelle 1 aufgelisteten Mikro
organismen eingesetzt und jeweils ein 1000 bp lan
ges Fragment amplifiziert.
Anschließend wird mit dem Art-spezifischen Hybridi
sierungssonden-Paar SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 eine
Schmelzkurvenanalyse der Amplicons durchgeführt.
Während die Schmelztemperatur bei den Arten des M.
tuberculosis-Komplex bei einheitlich 64°C liegt,
beträgt die Schmelztemperatur für alle nicht-
tuberkulösen Erreger zwischen 43,5°C und 54°C,
falls überhaupt ein Hybridisierungssignal detek
tiert werden kann (Tabelle 1).
Mittels des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens
lassen sich tuberkulöse Erreger gegenüber allen an
deren nicht-tuberkulösen Erregern selektiv nachwei
sen.
Entsprechend a) werden zunächst jeweils 2,5 ng ge
nomischer DNA der in Tabelle 1 aufgelisteten Mikro
organismen eingesetzt und jeweils ein 1000 bp lan
ges Fragment amplifiziert.
Anschließend wird mit dem Art-spezifischen Hybridi
sierungssonden-Paar SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 eine
Schmelzkurvenanalyse der Amplicons durchgeführt.
Während die Schmelztemperatur bei M. avium bei ein
heitlich 61°C liegt, beträgt die Schmelztemperatur
für alle anderen Erreger zwischen 43°C und 54°C,
falls überhaupt ein Hybridisierungssignal detek
tiert werden kann (Tabelle 1).
Mittels des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens
lässt sich der nicht-tuberkulöse Erreger M. avium
gegenüber allen anderen Erregern selektiv nachwei
sen.
Im Gegensatz zum vorstehenden erfindungsgemäßen
Beispiel 6b) werden zur Schmelzkurvenanalyse des
gemäß 6a) amplifizierten 1000 bp-Fragments des
16S-rRNA-Gens von Mykobakterien aus Tabelle 1 die
aus dem Stand der Technik bekannten Hybridisie
rungssonden verwendet, die für die Gattungs-
spezifische Region II selektiv sind (siehe Fig. 1:
"genus II").
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Schmelzkurven
analyse dargestellt: Während ein Großteil der un
tersuchten Mykobakterienarten einen Schmelzpunkt
von 60,5°C besitzt, ist bei den Mykobakterienarten
M. triviale, M. chitae, M. xenopi und M. agri der
Schmelzpunkt gegenüber den anderen Mykobakterienar
ten erniedrigt (Tabelle 1). Außerdem werden auch
bei der Gattung Cornyebakterium Amplifikate detek
tiert.
Die gefundenen Schmelzpunkte von M. triviale, M.
chitae, M. xenopi, M. agri und allen anderen Myko
bakterienarten lassen sich statistisch nicht von
den gefundenen Schmelzpunkten der Cornyebakterium-
Arten trennen. Ein eindeutiger Nachweis einer Myko
bakterien-Infektion gegenüber zum Beispiel einer
Infektion mit Cornyebakterien ist mittels der Gat
tungs-spezifischen Region II nicht möglich.
In dem erfindungsgemäß eingesetzten FRET-System ist
unter bestimmten Bedingungen das Maß an Fluoreszenz
in diesem Wellenlängenbereich eine Funktion der
Menge an in der Probe vorhandenen und detektierten
DNA. Durch das FRET-System sind quantitative Mes
sungen der Menge amplifizierter DNA-Fragmente mög
lich, wenn die ausgewählten Hybridisierungssonden
quantitativ, also stöchiometrisch, an die amplifi
zierten Fragmente binden.
Zur Quantifizierung von "Target"-DNA, wird diese
mit einer bekannten DNA-Konzentration eines Stan
dards verglichen. Dazu eignet sich das klonierte
16S rRNA-Gen im pGEM-T oder auch das erfindungsge
mäß eingesetzbare Kontrollplasmid (pIJ6).
Die Fluoreszenz wird bei dieser Methode nach jedem
der insgesamt 50 Amplifikationszyklen gemessen. Bei
einer hohen Konzentration des Standards erscheint
ein Fluoreszenzsignal beispielsweise bereits nach
20 Zyklen. Eine niedrige Konzentration führt erst
nach beispielsweise 35 Zyklen zu einem Signal.
Der Standard wird zum einen getrennt von den zu un
tersuchenden Proben gemessen, wobei wenigstens fünf
verschiedene Konzentrationen verwendet werden, um
eine Standardkurve zu erstellen. Wird das Plasmid
pIJ6 verwendet, kann jeweils eine Konzentration des
Standards in jeder untersuchten Probe verwendet
werden. Die Unterscheidung zwischen Standard und
"Target-DNA" erfolgt über den unterschiedlichen
Schmelzpunkt. Der Standard dient insbesondere
gleichzeitig als Kontrolle, dass die Amplifikation
nicht durch Störfaktoren inhibiert wurde (Inhibiti
onskontrolle).
Zur Detektion der amplifizierten Fragmente werden
die in der Reaktionsmischung eingesetzten FRET-
markierten Hybridisierungssondenpaare verwendet.
Die Amplifikationsreaktion läuft wie in Beispiel 1,
wobei nach jedem Amplifikationsschritt die Fluores
zenz gemessen wird. Die optimale "Annealing"-
Temperatur liegt bei 62°C. Die Schmelzpunktanalyse
wird unbeeinträchtigt nach Abschluss der Amplifika
tionsreaktion wie in Beispiel 1c) durchgeführt.
Claims (22)
1. Verfahren zum gemeinsamen und jeweils spezifi
schen Nachweis einer Mykobakterien-Infektion, des
Mycobacterium tuberculosis-Komplex und/oder von My
cobacterium avium in klinischem Material umfassend
die Schritte
- a) Extraktion von mikrobieller DNA aus klinischem Material,
- b) Vervielfachung von mindestens einem Fragment des 16S-rRNA-Gens aus der extrahierten DNA mit tels eines Primerpaares umfassend die Nucleo tidsequenzen SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 oder mittels zweier Primerpaare, wobei das eine Pri merpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 umfasst und das andere Primer paar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 umfasst,
- c) Detektion der Gattungs-spezifischen Region des vervielfachten 16S-rRNA-Fragments von Mykobak terien mittels eines Paares markierter Hybridi sierungssonden, wobei das Paar die Nucleotidse quenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 umfasst,
- d) Detektion der Art-spezifischen Region des ver vielfachten 16S-rRNA-Fragments von Mykobakte rien mittels eines Paares markierter Hybridi sierungssonden, wobei zum Nachweis des Mycobac terium tuberculosis-Komplex das Paar die Nucle otidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder die komplementären Sequenzen davon umfasst und wobei zum Nachweis von Mycobacterium avium das Paar die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder die komplementären Sequen zen davon umfasst, und
- e) wobei der gemeinsame, jeweils spezifische Nach weis von Mykobakterien und des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und/oder von Mycobacterium avium während der Detektion gemäß der Schritte c) und d) mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die extrahierte
mikrobielle DNA in Verfahrensschritt a) mit mindes
tens einem künstlichen Plasmid, die als interner
Standard dient, vermischt wird, wobei das künstli
che Plasmid eine Gattungs-spezifische Region III
der 16S-rRNA von Mykobakterien oder Teile davon um
fasst, welche in ihrer Nucleotidsequenz modifiziert
wurde, und wobei eine Schmelzkurvenanalyse zum spe
zifischen Nachweis der vervielfachten 16S-rRNA-
Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten
16S-rRNA-Fragmente des künstlichen Plasmids durch
geführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die extrahierte
mikrobielle DNA aufgeteilt wird und ein erster Teil
davon im Verfahren nach den Schritten a) bis e) von
Anspruch 1 weiterbehandelt und ein zweiter Teil ei
nem parallelen Verfahren unterzogen wird, umfassend
die Schritte
- 1. a') Vermischen der extrahierten mikrobiellen DNA mit mindestens einem künstlichen Plasmid als interner Standard, wobei das künstliche Plasmi de eine Gattungs-spezifische Region III der 16S-rRNA von Mykobakterien oder Teile davon um fasst, welche in ihrer Nucleotidsequenz modifi ziert wurde,
- 2. b') Vervielfachung der 16S-rRNA-Fragmente mittels mindestens einem Primerpaar ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Nucleotidsequenzen-Paare SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5,
- 3. c') Detektion der vervielfachten 16S-rRNA-Fragmente mittels eines Paars markierter Hybridisierungs sonden, die mit der Gattungs-spezifischen Regi on III des 16S-rRNA-Fragments von Mykobakterien hybridisieren, wobei das Paar die Nucleotidse quenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder die komplementären Sequenzen davon umfasst, und
- 4. d') wobei zum spezifischen Nachweis der verviel fachten 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des mindestens einen künstlichen Plasmids während der Detektion gemäß Schritt c') eine Schmelz kurvenanalyse erfolgt.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
wobei die Vervielfachung der Genfragmente mittels
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Polymerase-
Kettenreaktion (PCR) als Echtzeit-PCR, bevorzugt
mittels LightCycler™-System, durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
wobei die Detektion während oder nach der Verviel
fachung der 16S-rRNA-Fragmente erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
wobei die Detektion mittels Echtzeit-PCR, besonders
bevorzugt mittels LightCycler™-System erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
wobei die Detektion mittels Fluoreszenznachweis
durchgeführt wird und wobei die markierten Hybridi
sierungssonden-Paare als Fluoreszenz-Resonanz-
Energie-Transfer-Paar ausgebildet sind.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
wobei die Schmelzkurvenanalyse im Anschluss an die
Vervielfachung der 16S-rRNA-Fragmente mittels Echt
zeit-PCR, bevorzugt mittels LightCycler™-System,
erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die De
tektion als quantitative Messung durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprü
che, wobei das klinische Material ausgewählt ist
aus der Gruppe klinischer Proben bestehend aus Spu
tum, Bronchiallavage, Magensaft, Urin, Stuhl, Li
quor, Knochenmark, Blut und Biopsien.
12. Oligonucleotid-Primerpaar, welches die Nuclein
säuren mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2 und
SEQ ID NO: 3 aufweist.
13. Oligonucleotid-Primer, welcher die Nucleinsäu
ren mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 4 aufweist.
14. Oligonucleotid-Hybridisierungssonden-Paar, wel
ches die Nucleinsäuren mit den Nucleotidsequenzen
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 oder mit den komple
mentären Sequenzen davon aufweist.
15. Oligonucleotid-Hybridisierungssonden-Paar, wel
ches die Nucleinsäuren mit den Nucleotidsequenzen
SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 oder mit den komple
mentären Sequenzen davon aufweist.
16. Oligonucleotid-Hybridisierungssonden-Paar, wel
ches die Nucleinsäuren mit den Nucleotidsequenzen
SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 oder mit den kom
plementären Sequenzen davon aufweist.
17. Künstliches Plasmid einsetzbar als interne Kon
trolle der Vervielfachung und des Nachweises von
16S-rRNA-Fragmenten von Mykobakterien, umfassend
modifizierte Sequenzen der Gattungs-spezifischen
Region III des 16S-rRNA-Gens.
18. Künstliches Plasmid nach Anspruch 17, wobei das
künstliche Plasmid mindestens einen/eine Nucleotid-
Austausch, -Addition, -Deletion und/oder -Inversion
gegenüber der Wildtyp-Sequenz der Gattungs-
spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens aufweist.
19. Künstliches Plasmid nach Anspruch 17 oder 18,
umfassend die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 14 oder
SEQ ID NO: 15.
20. Künstliches Plasmid nach Anspruch 17 oder 18,
umfassend die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 16 oder
SEQ ID NO: 17.
21. Diagnose-Kit zum spezifischen Nachweis einer
Mykobakterien-Infektion und des Mycobacterium tu
berculosis-Komplex und von Mycobacterium avium in
klinischem Material gemäß dem Verfahren nach einem
der Ansprüche 1 bis 11 umfassend:
- a) mindestens eine Polymerase,
- b) mindestens ein Primerpaar gemäß Anspruch 12,
- c) mindestens ein Primerpaar enthaltend einen Primer gemäß Anspruch 13, das die Gattungs- spezifische Region III von Mykobakterien amplifiziert.
- d) ein Hybridisierungssonden-Paar gemäß Anspruch 16 zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III,
- e) mindestens ein Hybridisierungssonden-Paar ge mäß den Ansprüchen 14 bis 15 zur Detektion der Art-spezifischen Regionen.
22. Diagnose-Kit nach Anspruch 21, beinhaltend ein
künstliches Plasmid gemäß einem der Ansprüche 17
bis 20.
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