JP4551216B2 - 核酸の断片化、標識および固定化の方法 - Google Patents

核酸の断片化、標識および固定化の方法 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年５月１７日付で出願した米国仮出願第６０／３８１，４５７号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は、全体が本明細書中に参考として援用される。
（技術分野）
本発明は、核酸の断片化および／または標識および／または固定化の方法に関する。より詳細には、本発明は、無塩基部位における標識および／または切断および／または固定化を含む、核酸の断片化および／または標識および／または固定化の方法に関する。
（背景技術）
核酸の断片化および標識は、核酸配列内に含まれる遺伝情報の解析のために重要である。例えば、核酸の断片化および／または標識は、通例、検体核酸を、表面、例えば、マイクロアレイに固定化した相補性配列に結合させることにより配列を検出するのに必要とされる。また、検体核酸を小断片（例えば、５０乃至１００塩基対）に切断すると、この表面への拡散が円滑化され、ハイブリッド形成を容易にすることができる。例えば、ハイブリッド形成させた核酸の大きさと共に、立体および帯電障害の影響が増大することが知られている。さらに、検体核酸を小断片に切断することによって、検体中の２種の目的の配列が、同じ鋳型核酸とは、単にこの検査用核酸と近くにあるからといって結合しないと考えられることを裏付けることができる。また、多くの検出方法の場合と同様に、シグナルの大きさが結合断片の大きさに比例する場合、核酸の切断により、ハイブリッド形成した核酸の検出が容易になるので、断片の大きさを制御することが望ましい。現在、チップを用いた分析に必要な感度で非標識核酸を直接検出する技術が殆どないので、核酸の標識は核酸分析の多くの方法において必要である。核酸を断片化し、標識する方法は、当該分野では公知である。例えば、米国特許第５，０８２，８３０号、第４，９９６，１４３号、第５，６８８，６４８号、第６，３２６，１４２号、世界特許第ＷＯ０２／０９０５８４号、およびこれらに引用されている文献を参照されたい。
例えば、マイクロアレイもしくはタグ化被分析物を作製するのに核酸を固定化することは、例えば、核酸およびタグ化被分析物を検出し、分析するのに有用である。核酸の固定化方法については当該分野では公知である。例えば、米国特許第５，６６７，９７９号、第６，０７７，６７４号、第６，２８０，９３５号、およびこれらに引用されている文献を参照されたい。
核酸を標識し、および／または断片化し、および／または表面、例えば、マイクロアレイに固定化する方法については、これを改良することが大いに必要とされている。
特許出願および刊行物を含め、本明細書に引用した参考文献は全て、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
（発明の要旨）
本発明は、ポリヌクレオチドを標識し、および／または断片化し、および／または基体に固定化するための新規な方法およびキットを提供する。
一態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを断片化し、標識する方法であって、（ａ）少なくとも１種の非共通（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ヌクレオチドの存在下に鋳型からポリヌクレオチドを合成することにより、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する工程、（ｂ）この合成ポリヌクレオチドと、この合成ポリヌクレオチドから上記非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素とを接触させる（即ち、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素を用いて非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する）ことにより、無塩基部位を作製する工程、（ｃ）この無塩基部位でホスホジエステル骨格を切断する工程、および（ｄ）この無塩基部位を標識することができる物質とこの合成ポリヌクレオチドを接触させる（即ち、無塩基部位を標識する）ことにより、標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程を含む方法を提供する。
一態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを断片化し、標識する方法であって、（ａ）共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素と接触させることにより、無塩基部位を作製し、非共通ヌクレオチドを含むこのポリヌクレオチドは少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から作製するものとする工程、（ｂ）この無塩基部位でホスホジエステル骨格を切断する工程、および（ｃ）この無塩基部位を標識することができる物質と上記ポリヌクレオチドとを接触させる（即ち、無塩基部位を標識する）ことにより、標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程を含む方法を提供する。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを断片化し、標識する方法であって、（ａ）無塩基部位を含むポリヌクレオチドのこの無塩基部位でホスホジエステル骨格を切断し、この無塩基部位を含むポリヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素とを接触させることにより作製するものとし、これにより無塩基部位を作製し、非共通ヌクレオチドを含むこのポリヌクレオチドは少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から作製するものとする工程、および（ｂ）上記無塩基部位を標識することができる物質とこのポリヌクレオチドとを接触させることにより、このポリヌクレオチドの標識断片を作製する工程を含む方法を提供する。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを断片化し、標識する方法であって、無塩基部位を含むポリヌクレオチドを、この無塩基部位を標識することができる物質と接触させ、このポリヌクレオチドは、無塩基部位を含むポリヌクレオチドのその無塩基部位でホスホジエステル骨格を切断することにより作製するものとし、この無塩基部位を含むポリヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素とを接触させることにより作製するものとし、これにより無塩基部位を作製し、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から合成するものとし、これによりこのポリヌクレオチドの標識断片を作製することを含む方法を提供する。
別の態様として、本発明は、（ａ）（ｉ）鋳型および（ｉｉ）非共通ヌクレオチドを含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの形成を可能にする条件下で行うものとする工程、（ｂ）（ｉ）非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）非共通ヌクレオチドの塩基部分を特異的に切断することができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、この非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を可能にする条件下で行うものとし、これにより無塩基部位を含むポリヌクレオチドを作製する工程、（ｃ）（ｉ）無塩基部位を含むポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）この無塩基部位でホスホジエステル骨格の切断を（通常、特異的に）行うことができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、上記無塩基部位でのホスホジエステル骨格の切断を可能にする条件下で行うものとし、これによりこのポリヌクレオチドの断片を作製する工程、（ｄ）（ｉ）無塩基部位を含むポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）この無塩基部位を標識することができる物質を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、上記無塩基部位での標識を可能にする条件下で行うものとし、これにより、標識断片を作製する工程を含む、ポリヌクレオチドを断片化し、標識する方法を提供する。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識し、断片化する方法であって、（ａ）（ｉ）鋳型および（ｉｉ）非共通ヌクレオチドを含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの形成を可能にする条件下で行うものとし、（ｂ）（ｉ）上記の非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）非共通ヌクレオチドの塩基部分を特異的に切断することができる酵素、（ｉｉｉ）無塩基部位でポリヌクレオチドを切断することができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断および、任意にこの無塩基部位におけるポリヌクレオチドの切断を可能にする条件下で行うものとし、これによりポリヌクレオチドの断片を作製する工程、ならびに（ｂ）（ｉ）無塩基部位を含むポリヌクレオチド断片および（ｉｉ）この無塩基部位を標識することができる物質を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、この無塩基部位での標識を可能にする条件下で行うものとし、これにより、標識断片を作製する工程を含む方法を提供する。
別の態様として、本発明が、ポリヌクレオチドを標識し、断片化する方法であって、（ａ）（ｉ）鋳型、（ｉｉ）非共通ヌクレオチド、（ｉｉｉ）非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素、および（ｉｖ）無塩基部位でポリヌクレオチドを切断することができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの形成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、およびこの無塩基部位におけるポリヌクレオチドの切断を可能にする条件下で行うものとし、これにより、このポリヌクレオチドの断片を作製する工程、ならびに（ｂ）（ｉ）無塩基部位を含むポリヌクレオチド断片、もしくは任意に無塩基部位を含むポリヌクレオチドの断片、および（ｉｉ）この無塩基部位を標識することができる物質を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、この無塩基部位の標識を可能にする条件下で行うものとし、これにより、標識断片を作製する工程を含む方法を提供することを本発明は提供する。
また、当業者には明らかなように、混合し、得られた混合物をインキュベートすることに関連している態様には、種々の混合物を（種々の組合せおよび／または副次的組合せとして）インキュベートすることにより目的の生成物を形成させることを含む方法の実施態様が包含される。これらの反応混合物は、上記の組合せの１つ以上の反応混合物と、どんな形ででも組合せる（従って、インキュベーションの回数を減らす）ことができる。
従って、一部の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成および非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を、同一反応混合物において実施する。他の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、および無塩基部位における上記骨格の切断を、同一反応混合物において実施する。さらに別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成および非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を、同一反応混合物において実施し、無塩基部位における上記骨格の切断およびこの無塩基部位での標識を、同一反応混合物において実施する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、無塩基部位における上記骨格の切断、およびこの無塩基部位での標識を、同一反応混合物において実施する。他の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、無塩基部位における上記骨格の切断、およびこの無塩基部位での標識を、同一反応混合物において実施する。他の実施態様として、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断および無塩基部位における上記骨格の切断を、同一反応混合物において実施する。他の実施態様として、無塩基部位における上記骨格の切断およびこの無塩基部位での標識を、同一反応混合物において実施する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断および無塩基部位での標識を、同一反応混合物において実施する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、および無塩基部位での標識を、同一反応混合物において実施する。以上のインキュベーション工程の任意の組合せ、および任意の単一インキュベーション工程も、このインキュベーションを本明細書に開示した任意の方法の一部として実施される限りにおいては、本発明の範囲内に包含されることは、理解されよう。本明細書で説明したように、標識を断片化（即ち、無塩基部位におけるホスホジエステル骨格の切断）の前に行い、または断片化を標識の前に行い、あるいは、断片化および標識を同時に行うことができる。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識する方法であって、（ａ）少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型からポリヌクレオチドを合成することにより、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する工程、（ｂ）この合成ポリヌクレオチドからこの非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素と合成ポリヌクレオチドとを接触させることにより、無塩基部位を作製する工程、（ｃ）この無塩基部位を標識することができる物質とこの合成ポリヌクレオチドとを接触させることにより、合成ポリヌクレオチドを標識する工程を含む方法を提供する。
一態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識する方法であって、（ａ）非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素と接触させることにより、無塩基部位を作製し、非共通ヌクレオチドを含むこのポリヌクレオチドは少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から合成するものとする工程、（ｂ）この無塩基部位を標識することができる物質とこのポリヌクレオチドとを接触させることにより、ポリヌクレオチドを標識する工程を含む方法を提供する。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識する方法であって、無塩基部位を含むポリヌクレオチドを、この無塩基部位を標識することができる物質と接触させ、この無塩基部位を含むポリヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとこの非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素とを接触させることにより作製するものとし、これにより無塩基部位を作製し、この共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から合成するものとし、これによりポリヌクレオチドを標識する工程を含む方法を提供する。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識する方法であって、（ａ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５のアミノオキシ誘導体を調製する工程、および（ｂ）（本明細書に開示した方法を用いて作製した）無塩基部位を含むポリヌクレオチドとこのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５のアミノオキシ誘導体とを接触させ、これによりこのポリヌクレオチドを標識する工程を含む方法を提供する。別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識する方法であって、（本明細書に開示した方法を用いて作製した）無塩基部位を含むポリヌクレオチドとＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５のアミノオキシ誘導体とを接触させ、それによって該ポリヌクレオチドを標識する工程を含む方法を提供する。
表面（即ち、基体）に固定化したポリヌクレオチドを形成する方法の一部の実施態様では、無塩基部位を含むポリヌクレオチドを無塩基部位において標識する。
別の態様として、本発明は、（ａ）（ｉ）鋳型および（ｉｉ）非共通ヌクレオチドを含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの形成を可能にする条件下で行うものとする工程、（ｂ）（ｉ）非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および（ｉｉ）非共通ヌクレオチドの塩基部分を特異的に切断することができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、この非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を可能にする条件下で行うものとし、これにより無塩基部位を含むポリヌクレオチドを作製する工程、（ｃ）（ｉ）無塩基部位を含むポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）この無塩基部位を標識することができる物質を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、無塩基部位での標識を可能にする条件下で行うものとし、これにより、標識ポリヌクレオチドを作製する工程を含む、ポリヌクレオチドを標識する方法を提供する。
また、当業者には明らかなように、混合して得られた混合物をインキュベートすることに関連している態様には、種々の混合物を（種々の組合せおよび／または副次的組合せとして）インキュベートすることにより所望の生成物を形成させることを含む方法の実施態様が包含される。これらの反応混合物は、上記の組合せの１つ以上の反応混合物と、どんな形ででも組合せる（従って、インキュベーションの回数を減らす）ことができる。
従って、一部の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成および非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を同一反応混合物において実施する。他の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、および無塩基部位の標識を同一反応混合物において実施する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断および無塩基部位の標識を同一反応混合物において実施する。以上のインキュベーション工程の任意の組合せ、および任意の単一インキュベーション工程も、このインキュベーションを本明細書に開示した任意の方法の一部として実施される限りにおいては、本発明の範囲内に包含されることは、理解されよう。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識、および任意に断片化する方法であって、（ａ）非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型ポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを合成することにより、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する工程、（ｂ）この合成ポリヌクレオチドからの非共通ヌクレオチドの塩基部分を、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素を用いて切断し、これにより無塩基部位を作製する工程、（ｃ）任意に、この無塩基部位を含むこのポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断する工程、および（ｄ）この無塩基部位でポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド断片を標識し、これにより標識ポリヌクレオチド、任意に標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程を包含する方法を提供する。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識、および任意に断片化する方法であって、（ａ）（ｉ）鋳型ポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）非共通ヌクレオチドを含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成を可能にする条件下で行うものとし、これにより、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する工程、（ｂ）（ｉ）この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、この非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を可能にする条件下で行うものとし、これにより無塩基部位を含むポリヌクレオチドを作製する工程、（ｃ）任意に、（ｉ）この無塩基部位を含むポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）この無塩基部位を含むポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、上記無塩基部位でのホスホジエステル骨格の切断を可能にする条件下で行うものとし、これによりこのポリヌクレオチドの断片を作製し、（ｄ）（ｉ）この無塩基部位を含むポリヌクレオチドもしくは、任意にこの無塩基部位を含むポリヌクレオチドの断片および（ｉｉ）この無塩基部位を標識することができる物質を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、上記無塩基部位での標識を可能にする条件下で行うものとし、これにより、標識ポリヌクレオチドもしくは、任意に標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程を含む方法を提供する。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識、および任意に断片化する方法であって、（ａ）（ｉ）特許請求の範囲の請求項１の工程（ａ）の非共通ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素、および（ｉｉｉ）任意に、この無塩基部位を含むポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、および任意に、上記無塩基部位でのポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格の切断を可能にする条件下で行うものとし、これにより無塩基部位を含むポリヌクレオチド、もしくは任意に、無塩基部位を含むポリヌクレオチドの断片を作製する工程、ならびに（ｂ）（ｉ）この無塩基部位を含むポリヌクレオチドもしくは、任意にこの無塩基部位を含むポリヌクレオチドの断片および（ｉｉ）この無塩基部位を標識することができる物質を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、上記無塩基部位での標識を可能にする条件下で行うものとし、これにより、標識ポリヌクレオチドもしくは、任意に標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程を含む方法を提供する。
別の態様として、本発明の方法は、ポリヌクレオチドを表面に固定化する方法であって、無塩基部位を含むポリヌクレオチドを表面に固定化する工程を含み、このポリヌクレオチドはこの無塩基部位において固定化するものとする方法を提供する。一部の実施態様として、無塩基部位を含むこのポリヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、このポリヌクレオチドからの非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素と接触させることにより作製し、これにより無塩基部位を作製する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むこのポリヌクレオチドは、少なくとも1種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から合成する。
別の態様として、本発明の方法は、ポリヌクレオチドを表面に固定化する方法であって、（ａ）非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、このポリヌクレオチドからのこの非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素と接触させ、これにより無塩基部位を作製する工程、（ｂ）任意に、この無塩基部位でホスホジエステル骨格を切断し、これにより、このポリヌクレオチドの断片を作製する工程、ならびに（ｃ）無塩基部位を含むこのポリヌクレオチドもしくはその断片を表面に固定化し、このポリヌクレオチドは無塩基部位において固定化するものとする工程を包含する方法を提供する。一部の実施態様として、このポリヌクレオチドは、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から合成する。
別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを表面に固定化する方法であって、（ａ）無塩基部位を含むポリヌクレオチドの無塩基部位でホスホジエステル骨格を切断し、これによりこのポリヌクレオチドの断片を作製する工程、および（ｂ）このポリヌクレオチドの断片を表面に固定化し、このポリヌクレオチドは上記無塩基部位において固定化するものとする工程を包含する方法を提供する。一部の実施態様として、無塩基部位を含むこのポリヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、このポリヌクレオチドからの非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素と接触させることにより作製し、これにより無塩基部位を作製する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むこのポリヌクレオチドは、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から合成する。
別の態様として、本発明は、（ａ）（ｉ）非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）非共通ヌクレオチドの塩基部分を特異的に切断することができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を可能にする条件下で行うものとし、これにより無塩基部位を含むポリヌクレオチドを作製する工程、（ｂ）任意に、（ｉ）無塩基部位を含むポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）この無塩基部位でホスホジエステル骨格の切断を特異的に行うことができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、この無塩基部位でのホスホジエステル骨格の切断を可能にする条件下で行うものとし、これによりこのポリヌクレオチドの断片を作製する工程、（ｃ）（ｉ）無塩基部位を含むポリヌクレオチドもしくはその断片および（ｉｉ）表面（即ち、基体）、および（ｉｉｉ）この無機塩基を含むポリヌクレオチドもしくはその断片をこの無塩基部位において表面に固定化することができる作用因子を含む反応混合物をインキュベートし、このインキュベーションは、このポリヌクレオチドもしくはその断片のこの無塩基部位における表面への固定化を可能にする条件下で行うものとし、これにより、ポリヌクレオチドもしくはその断片を固定化する工程を含む、ポリヌクレオチドを固定化する方法を提供する。一部の実施態様として、このポリヌクレオチドは、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から合成する。
また、当業者には明らかなように、混合して得られた混合物をインキュベートすることに関連している態様には、種々の混合物を（種々の組合せおよび／または副次的組合せとして）インキュベートすることにより目的の生成物を形成させることを含む方法の実施態様が包含される。これらの反応混合物は、上記の組合せの１つ以上の反応混合物と、どんな形ででも組合せる（従って、インキュベーションの回数を減らす）ことができる。以上のインキュベーション工程の任意の組合せ、および任意の単一インキュベーション工程も、このインキュベーションを本明細書に開示した任意の方法の一部として実施される限りにおいては、本発明の範囲内に包含されることは、理解されよう。
本明細書では、本発明の方法について種々の実施態様を記載している。例えば、鋳型からの、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成に係わる実施態様として、この合成をＰＣＲ法、プライマー伸長法、逆転写法、ＤＮＡ複製法、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、多重置換増幅法（ＭＤＡ）などによって行うことができる。一部の実施態様として、このポリヌクレオチドの合成は、例えば、以下の工程、即ち、（ａ）標的配列を含む一本鎖鋳型ＤＮＡを、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマーとハイブリッド形成させる工程、（ｂ）任意に、終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、上記鋳型と複合プライマーとのハイブリッド形成に対して５’末端側にあるこの鋳型の領域とハイブリッド形成させる工程、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用いてこの複合プライマーを伸長する工程、および（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用い、上記のアニーリングした複合プライマーのＲＮＡ部分を切断して、別の複合プライマーを上記鋳型とハイブリッド形成させ、鎖置換によりプライマー伸長を反復させ、これにより、標的配列に対する相補性配列のコピーを複数作製する工程を含む方法を用いて標的ポリヌクレオチドと相補性のポリヌクレオチド配列を増幅させる単一プライマー等温遺伝子増幅法（ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｉｍｅｒ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用して行う。別の実施態様として、このポリヌクレオチドの合成は、以下の工程、即ち、（ａ）（ｉ）鋳型ポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマーを含む複合体内のこの複合プライマーを伸長し、上記鋳型ポリヌクレオチドはこの複合プライマーとハイブリッド形成しているものとする工程、および（ｂ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用い、上記のアニーリングした複合プライマーのＲＮＡ部分を切断することにより、別の複合プライマーを上記鋳型とハイブリッド形成させ、鎖置換によりプライマー伸長を反復させ、これにより、標的配列に対する相補性配列のコピーを複数作製する工程を含む方法を用いて行う。一部の実施態様として、この複合プライマーのＲＮＡ部分は３’ＤＮＡ部分に対して５’末端側にあり、この５’ＲＮＡ部分は３’ＤＮＡ部分に隣接し、この複合プライマーのＲＮＡ部分は約１０乃至約２０ヌクレオチドからなり、この複合プライマーのＤＮＡ部分は約７乃至約２０ヌクレオチドからなる。
別の実施態様として、このポリヌクレオチドの合成は、例えば、以下の工程、即ち、（ａ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて標的ＲＮＡとハイブリッド形成させた第１のプライマーを伸長し、この第１のプライマーはＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマーであるものとし、これにより第１のプライマーの伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体を作製する工程、（ｂ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを切断する工程、（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて上記第１のプライマー伸長産物とハイブリッド形成させた第２のプライマーを伸長することにより第２のプライマーの伸長産物を作製して第１および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する工程、（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用い、上記第１および第２プライマー伸長産物の複合体内の複合プライマーからＲＮＡを切断することにより別の複合プライマーをこの第２のプライマー伸長産物とハイブリッド形成させ、この複合プライマーはＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含むものとする工程、（ｅ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて第２プライマー伸長産物とハイブリッド形成させたこの複合プライマーを伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物を置換し、目的のＲＮＡ配列に相補性のポリヌクレオチド配列のコピーを複数作製する工程を含む方法を用いて、目的のＲＮＡ配列（鋳型）に相補性のポリヌクレオチド配列のコピーを複数作製することができるＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）を使用して行う。一部の実施態様として、工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する（加熱もしくは塩基性条件などの）作用因子により切断する。
一部の実施態様として、合成するポリヌクレオチドは一本鎖である。別の実施態様として、合成するポリヌクレオチドは二本鎖である。さらに別の実施態様として、合成するポリヌクレオチドは部分的に二本鎖である。さらに別の実施態様として、合成するポリヌクレオチドはｃＤＮＡを含む。さらに別の実施態様として、前記鋳型はＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む。別の実施態様として、この鋳型は、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、もしくはサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ライブラリを含む。さらに別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、標識プライマーを用いて合成する。さらに別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドを含むプライマーを用いて合成する。別の実施態様として、２種以上の非共通ヌクレオチドの存在下に非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを合成することにより、２種以上の非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを合成する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、２種以上の鋳型ポリヌクレオチドから合成する。
一部の実施態様として、上記非共通ヌクレオチドはｄＵＴＰである。別の実施態様として、この非共通ヌクレオチドはｄＵＴＰであり、上記合成ポリヌクレオチドからこの非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素は、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（「ＵＮＧとも呼ばれる」）である。
断片化に係わる実施態様として、前記ホスホジエステル骨格は、ホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することができる酵素、アミンなどの作用因子によって切断することができる。一部の実施態様として、この酵素は大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶである。別の実施態様として、上記作用因子はＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンである。さらに別の実施態様として、この作用因子は熱、塩基性条件、もしくは酸性条件である。
断片化に係わる実施態様として、この断片は、ヌクレオチド長として、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６５、約７５、約８５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０もしくはそれ以上である。一部の実施態様として、この断片は、ヌクレオチド長として、少なくとも約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６５、約７５、約８５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０もしくはそれ以上である。別の実施態様として、この断片は、ヌクレオチド長として、約１５未満、約２０未満、約２５未満、約３０未満、約３５未満、約４０未満、約５０未満、約６５未満、約７５未満、約８５未満、約１００未満、約１２５未満、約１５０未満、約１７５未満、約２００未満、約２２５未満、約２５０未満、約３００未満、約３５０未満、約４００未満、約４５０未満、約５００未満、約５５０未満、約６００未満、約６５０未満、もしくはそれ以上である。これらの断片の長さが、本発明の方法により作製される断片群における平均的な大きさを表すことができることは、理解されよう。
一部の実施態様として、これらの断片は、３’端（末端）に無塩基部位を有する。別の実施態様として、これらの断片は、５’端（末端）に無塩基部位を有する。さらに別の実施態様として、これらの断片は、３’端の無塩基部位および５’端の無塩基部位の両方を有する。例えば、ポリヌクレオチド内の全ての無塩基部位で断片化を行うのではない場合のように、ポリヌクレオチド断片がさらに、内部に無塩基部位（即ち、断片の３’もしくは５’端にはない無塩基部位）を含むことができることは理解されよう。
標識に係わる実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドもしくはその断片は、無塩基部位で標識し、これにより標識を含むポリヌクレオチド（もしくはポリヌクレオチド断片）を作製する。いくつかの実施態様として、無塩基部位を含むポリヌクレオチドもしくはその断片は、無塩基部位を標識することができる物質と接触させる。種々の実施態様として、この検出可能な部分（標識）は、無塩基部位と共有もしくは非共有結合させ、または無塩基部位と直接的もしくは間接的に結合させる。いくつかの実施態様として、この標識は直接もしくは間接的に検出することができる。いくつかの実施態様として、この標識は有機分子、ハプテンもしくは（ポリスチレン・ビーズなどの）粒子を含む。いくつかの実施態様として、この標識は、抗体結合、ビオチン結合を利用して、または蛍光もしくは酵素活性を介して検出する。いくつかの実施態様として、この検出可能なシグナルは増幅される。いくつかの実施態様として、この検出可能な部分は有機分子を含む。いくつかの実施態様として、この標識は上記無塩基部位のアルデヒド残基と反応させる。別の実施態様として、この標識は、ヒドラジンもしくはヒドロキシルアミンから選ばれる反応基を含む。いくつかの実施態様として、この標識は、５−（（（２−（カルボヒドラジノ）−メチル）チオ）アセチル）アミノフルオレセイン・アミノオキシアセチルヒドラジド（「ＦＡＲＰ」）である。別の実施態様として、この標識は、Ｎ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジン・トリフルオロ酢酸塩（「ＡＲＰ」）である。さらに別の実施態様として、この標識は、Ａｌｅｘａ ５５５である。さらに別の実施態様として、この標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５のアミノオキシ誘導体である。
別の態様として、本発明は、本明細書に開示した方法により作製するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５のアミノオキシ誘導体を提供する。
固定化に係わるいくつかの実施態様として、このポリヌクレオチドもしくはその断片は、無塩基部位において基体（本明細書では「表面」と同義で用いている）に固定化する。いくつかの実施態様として、この基体は固体もしくは半固体の支持体を含む。いくつかの実施態様として、この基体はマイクロアレイである。別の実施態様として、このマイクロアレイは、紙、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン（および他の金属）ならびに光ファイバーからなる群から選ばれる材料から作製した基体に固定した少なくとも１種のプローブを含む。さらに別の実施態様として、このポリヌクレオチドもしくはその断片は、ピン、棒材、ファイバー、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイター・ウェル、キャピラリ、シリンダを含む二次元構造もしくは三次元構造の基体に固定化する。
別の実施態様として、被分析物である基体は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、有機分子、無機分子、細胞、微生物、ならびにこれらの断片および産物からなる群から選ばれる。別の実施態様として、上記被分析物は、ポリペプチド、抗体、有機分子および無機分子からなる群から選ばれる。
本方法は、例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、クローンＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む任意の目的ポリヌクレオチドから標識ポリヌクレオチド、標識ポリヌクレオチド断片あるいは固定化ポリヌクレオチド（もしくはその断片）または標識固定化ポリヌクレオチド（もしくはその断片）を作製するのに応用することができる。１つ以上の工程を併用し、および／または（必要な産物を形成することができる限り、多くの場合、どんな順序でも）逐次的に実施することができ、また、本発明が、本明細書で開示した工程の種々の組合せを含むことも明らかであろう。また、本発明が、最初の、即ち、第１の工程が本明細書に開示した任意の工程である方法を包含することも明白であり、本明細書に記載されている。本発明の方法は、その先の「下流の」工程が最初の工程になる実施態様も包含する。反応混合物は、上記の組合せの１つ以上の反応混合物と、どんな形ででも組合せる（従って、インキュベーションの回数を減らす）ことができる。従って、いくつかの実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成および非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を同一反応混合物において実施する。他の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、および無塩基部位の標識を同一反応混合物において実施する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、無塩基部位の標識を同一反応混合物において実施し、無塩基部位における固定化を同一反応混合物において実施する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、および無塩基部位における固定化を同一反応混合物において実施する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断および無塩基部位の標識を同一反応混合物において実施する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断および無塩基部位における固定化を同一反応混合物において実施する。別の実施態様として、無塩基部位の標識および無塩基部位における固定化を同一反応混合物において実施する。以上のインキュベーション工程の任意の組合せ、および任意の単一インキュベーション工程も、このインキュベーションを本明細書に開示した任意の方法の一部として実施される限りにおいては、本発明の範囲内に包含されることは、理解されよう。
また、本発明は、核酸配列の変異の有無を検出する方法、鋳型ポリヌクレオチドを特徴付ける（例えば、その有無および／または量を検出する）方法、ハイブリダイゼーション・プローブを作製する方法、ハイブダイゼーション・プローブを用いるハイブリッド形成方法、ハイブダイゼーション・プローブを用いて検出する方法、遺伝子発現プロフィールを測定する方法、比較ハイブリダイゼーション法、ポリヌクレオチドを同定する方法、およびサブトラクティブ・ハイブダイゼーション・プローブの作製方法などの、本発明の標識および／または標識および／または固定化方法による産物を用いる（通常、分析する）方法を提供する。
一態様として、本発明は、（ａ）本明細書に開示した任意の方法により標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を作製し、および（ｂ）この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を分析することにより変異の有無を検出することを含む、鋳型における変異の有無を検出する方法を提供する。いくつかの実施態様として、この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を、標識した対照鋳型もしくはその断片と比較する。標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を分析することにより変異の有無を検出する工程（ｂ）は、当該分野で公知の方法により実施することができる。いくつかの実施態様として、変異を検出するフローブは、マイクロアレイとして設けることができる。
別の態様として、本発明は、（ａ）本明細書に開示した任意の方法により標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を作製し、および（ｂ）このポリヌクレオチドもしくはその断片を分析することを含む、鋳型を特徴付ける方法を提供する。この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を分析する工程（ｂ）は、当該分野で公知の方法もしくは本明細書に記載の任意の方法により、例えば、プローブとハイブリッド形成させた標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を検出および／または定量することにより実施することができる。いくつかの実施態様として、この少なくとも１種のプローブは、マイクロアレイとして設けることができる。このマイクロアレイは、紙、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、他の金属ならびに光ファイバーからなる群から選ばれる材料から作製した固体もしくは半固体の基体に固定した少なくとも１種のプローブを含むことができる。ブローブは、ピン、棒材、ファイバー、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイター・ウェル、キャピラリ、およびシリンダを含む二次元構造もしくは三次元構造の固体もしくは半固体の基体に固定化することができる。いくつかの実施態様として、この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を分析する工程（ｂ）は、該産物の量を測定することを含み、これにより、検体中に存在する上記鋳型の量を定量する。別の実施態様として、この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を分析する工程（ｂ）は、例えば、ハイブリッド形成による配列決定法を用いて、この標識ポリヌクレオチド（もしくはその断片）の配列を決定することを含む。
別の態様として、本発明は、（ａ）本明細書に開示した任意の方法により鋳型ポリヌクレオチドから標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を作製し、および（ｂ）この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を分析することによりこのポリヌクレオチドを同定することを含む、ポリヌクレオチドの同定方法を提供する。いくつかの実施態様として、このポリヌクレオチドを同定する工程（ｂ）は、この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を少なくとも１種のプローブとハイブリッド形成させることを含む。
別の態様として、本発明は、検体の遺伝子発現プロフィールを明らかにする方法であって、（ａ）本明細書に開示した任意の方法により標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を作製し、および（ｂ）各鋳型ポリヌクレオチドから作製した標識ポリヌクレオチドもしくはその断片の量を測定し、各該量が検体中の各鋳型の量を示すものとし、これにより上記遺伝子発現プロフィールを明らかにすることを含む方法を提供する。
以上の用途のいずれにおいても、本明細書に開示した（種々の構成要素およびこれらのうちの任意の構成要素の種々の実施態様を含む）方法のうちの任意の方法を用いることができる。
また、本発明は、本明細書に開示した方法において用いられる種々の構成要素（およびこれらの構成要素の種々の組合せ）を含む配合物、キット、複合体、反応混合物およびシステムを提供する。
（発明を実施するための形態）
（本発明の方法）
（ポリヌクレオチドの標識および断片化方法、ならびにポリヌクレオチドの標識方法）
本発明は、ポリヌクレオチドを標識し、断片化するための新規な方法およびキット、ならびにポリヌクレオチドを標識するための新規な方法およびキットを提供する。これらの方法は、例えば、ハイブリダイゼーション・プローブとして用いる標識ポリヌクレオチドもしくは標識ポリヌクレオチド断片を作製するのに適している。一般に、このポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド内に存在する無塩基部位において標識し、（断片化に係わる実施態様として）ポリヌクレオチド内に存在する無塩基部位において断片化する。通例、このポリヌクレオチド内に存在する無塩基部位は、ポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することにより調製する。従って、（断片化に係わる実施態様として）標識および断片化の対象とするポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチドのスペースは、断片の大きさおよび標識の強度に関係し、これらを決定する。こうした特徴があるため、例えば、鋳型ポリヌクレオチドからのこの非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成において、非共通ヌクレオチドの組み込みを制御することができる条件を用いることにより、断片の大きさおよび／または標識の部位を制御することができる。
従って、一態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識し、断片化するための方法を提供する。概して、この方法は、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製し、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子（例えば、酵素）を用いてポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し（これにより無塩基部位を作製し）、そのホスホジエステル骨格をこの無塩基部位で切断し、およびこの無塩基部位を標識することにより標識ポリヌクレオチド断片を作製することを含む。別の態様として、本発明は、ポリヌクレオチドを標識するための方法を提供する。概して、この方法は、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製し、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子を用いてポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し（これにより無塩基部位を作製し）、および非共通ヌクレオチドの組み込み部位（即ち、無塩基部位）を標識することにより標識ポリヌクレオチドを作製することを含む。
概して、ポリヌクレオチドを標識し、断片化する方法およびポリヌクレオチドを標識する方法は、非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型ポリヌクレオチドから非共通ヌクレオチドを含むこのポリヌクレオチドを合成することにより、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製することを含む。
非共通ヌクレオチドについては当該分野で公知であり、任意の適切な非共通ポリヌクレオチドを用いることができる。一部の実施態様において、２種以上の異なる非共通ヌクレオチドを用いることによって、２種以上の非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する。ポリヌクレオチド鋳型からポリヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で公知であり、本明細書にも記載しており、本発明の方法において任意の適切な方法を用いることができる。一部の実施態様では、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成では、単一プライマー等温増幅（Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号参照）、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭ（Ｋｕｒｎ、米国特許公開第２００３／００８７２５１ Ａ１号参照）、ＰＣＲ、プライマー伸長、逆転写、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、ＤＮＡ複製などを用いている。合成されるポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖または部分的二本鎖とすることができ、これらの鎖のいずれか一方または両方が非共通ヌクレオチドを含むことができる。一部の実施態様において、合成されるポリヌクレオチドはｃＤＮＡを含む。ポリヌクレオチド鋳型（これに沿って、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが合成される）は、標識ポリヌクレオチドまたはその断片が作製されることが所望される任意の鋳型である。一部の実施態様では、この鋳型は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。他の実施態様では、この鋳型は、ｃＤＮＡライブラリー、サブトラクティブハイブリダイゼーションライブラリー、またはゲノムライブラリーを含む。一般に、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドの組み込みを限定および／または制御することにより合成し、これによって、断片化に係わる実施態様では（無塩基部位を作製し、無塩基部位を標識し、（断片化に係わる実施態様では）ホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することにより）所望のサイズ（またはサイズ範囲）の標識断片を作製することができるような出現頻度または割合の非共通ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを作製する。同様に、断片化ではなく標識に係わる実施態様では、（無塩基部位を作製し、無塩基部位を標識することにより）標識ポリヌクレオチドを作製する。
一部の実施態様では、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成の間、標識プライマーを使用する。他の実施態様では、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをの合成の間、（ｄＵＴＰなどの）非共通ヌクレオチドを含むプライマーを使用する。他の実施態様では、このプライマーは、複合プライマーであり、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む。
非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを多様な（低分子から極めて大きな分子までの）種々のポリヌクレオチド分子とすることができることが理解される。このような集団は、配列において関連があるもの（例えば、遺伝子ファミリーまたはスーパーファミリーのメンバー）とすることができ、または配列が極めて異なるもの（例えば、あらゆるｍＲＮＡから得られた、あらゆるゲノムＤＮＡから得られた、など）とすることができる。また、ポリヌクレオチドは、（公知の遺伝子の一部または全部、例えば、コドン領域、ゲノム部分などとすることができる）単独の配列に相当するものとすることもできる。
非共通ヌクレオチドの塩基部分は、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（酵素などの）作用因子によって切断される。このような作用因子は、当該分野で公知であり、本明細書にも記載している。一実施態様では、非共通ヌクレオチドの塩基部分を特異的に切断することができる作用因子は、Ｎ−グリコシラーゼである。別の実施態様では、この作用因子は、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（「ＵＮＧ」または「ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ」と交換可能に呼ばれる）である。
無塩基部位を含むポリヌクレオチドは、無塩基部位を標識することができる物質を用いて標識され、断片化に係わる実施態様では、この無塩基部位を含むポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を、非共通ヌクレオチドの組み込み部位において（即ち、このホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することによって２つ以上の断片を作製することができる作用因子によりこの無塩基部位において）切断する。本明細書に用いる場合、「この主鎖またはホスホジエステル骨格を切断すること」は、「断片化」または「断片化すること」とも言う。断片化に係わる実施態様では、断片化の前に標識を行うことができ、または標識の前に断片化を行うことができ、または、断片化と標識とを同時に行うことができる。便宜上、これらの工程は、以下では別々に説明する。
無塩基部位を標識（通例、特異的に標識）することにより、標識無塩基部位を含むポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチド断片）を作製することができる作用因子は、当該分野で公知である。一部の実施態様では、この検出可能な部分（標識）を、無塩基部位と共有結合または非共有結合させる。一部の実施態様では、この検出可能な部分は、無塩基部位と直接または間接的に結合させる。一部の実施態様では、この検出可能な部分（標識）は、直接または間接的に検出することができる。一部の実施態様では、この検出可能なシグナルを増幅させる。一部の実施態様では、この検出可能な部分は有機分子を含む。他の実施態様では、この検出可能な部分は抗体を含む。他の実施態様では、この検出可能なシグナルは蛍光性である。他の実施態様では、この検出可能なシグナルは酵素的に生成される。一部の実施態様では、この標識は、５−（（（２−（カルボヒドラジノ）−メチル）チオ）アセチル）アミノフルオレセイン、アミノオキシアセチルヒドラジド（「ＦＡＲＰ」）、Ｎ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジントリフルオロ酢酸塩（ＡＲＰ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、またはアミノオキシ誘導体化Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（本明細書に記載される通り）から選ばれる。
断片化に係わる実施態様では、無塩基部位を含むポリヌクレオチドの骨格をこの無塩基部位で切断することにより、このポリヌクレオチドの２つ以上の断片を作製する。これらの断片の少なくとも１つは、本明細書に説明した通りに標識および／または固定化することができる無塩基部位を含む。ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断する作用因子は、当該分野で公知である。一部の実施態様では、この作用因子は大腸菌ＡＰエンドヌクレアーゼＩＶである。他の実施態様では、この作用因子はＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（「ＤＭＥＤ」と呼ばれる）である。他の実施態様では、この作用因子は、熱、塩基性条件、酸性条件またはアルキル化剤である。用いる作用因子にもよるが、骨格を無塩基部位の５’側で切断することによって（例えば、無塩基残基の５’リン酸基と隣接ヌクレオチドのデオキシリボース環との間で切断し、遊離３’ヒドロキシル基を生じさせることによって）、無塩基部位を、生じた断片の５’末端に位置させることができる。他の実施態様では、切断部位を無塩基部位の３’側とすることによって（例えば、無塩基残基のデオキシリボース環および３’リン酸基と隣接ヌクレオチドのデオキシリボース環との間で切断し、この隣接ヌクレオチドのデオキシリボース環に遊離５’リン酸基を生じさせることによって）、無塩基部位を、生じた断片の３’末端に位置させることができる。さらに他の実施態様では、より複雑な形の切断、例えば、ホスホジエステル骨格の切断および無塩基ヌクレオチドの一部分の切断が生じるような切断が可能である。従って、断片化作用因子を選択することにより、ポリヌクレオチド断片内の無塩基部位の方向、例えば、生じる断片の３’末端か、生じる断片の５’末端かを制御することができる。こうした特徴は、例えば、以下で説明するような固定化に係わる実施態様において利点を有する。また、反応条件を選択することにより、断片化反応の程度、レベルまたは完全性を制御することができる。一部の実施態様では、反応条件を選択することにより、切断反応を大過剰の作用因子の存在下に行わせ、ポリヌクレオチドが過度に切断される懸念を最小にしつつ（即ち、上述の合成工程の間の、組み込まれた非共通ヌクレオチドのスペースを空けることにより決定することができる所望の断片サイズを維持しながら）、完結させることができる。対照的に、当該分野で公知の他の方法（例えば、機械的剪断、ＤＮａｓｅ切断）では、過度の切断が起こらないようにするために、（ＤＮａｓｅを用いる場合に投入ＤＮＡの量を注意深く制御することを含む）反応条件の注意深い決定が必要とされる。他の実施態様では、反応条件を選択することにより、断片化を（骨格の一部の無塩基部位が未切断（未断片化）のままであるという意味で）完結させずに、１箇所より多くの無塩基部位を含むポリヌクレオチド断片を生ずるようにする。このような断片は、内部に（非断片化）無塩基部位を含む。
本発明の方法は、本発明の方法により作製した標識ポリヌクレオチド断片および標識ポリヌクレオチドを用いる方法（いわゆる「用途」）を含む。本発明は、アレイ技術または液相技術に基づく方法などの検出／定量法を用いて標識産物および／または断片化産物を分析することによって、目的の配列を特徴付ける（例えば、配列の有無および／または量を検出する）方法を提供する。一部の実施態様では、本発明は、変異の有無を検出する方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブを作製する方法、このハイブリダイゼーションプローブを用いてハイブリダイゼーションする方法；このハイブリダイゼーションプローブを用いて検出する方法；ならびに核酸を特徴付けする方法、および／または定量する方法、サブトラクティブハイブリダイゼーションプローブを作製し、比較ゲノムハイブリダイゼーションを行い、および本発明の方法により作製した標識核酸および／または断片化核酸を用いて遺伝子発現プロフィールを明らかにする方法を提供する。
（ポリヌクレオチドを無塩基部位において基体に固定化するための方法）
また、本発明は、基体（表面）に固定化したポリヌクレオチドまたはその断片を作製する方法を提供する。一部の実施態様では、（断片化に係わる実施態様での）この固定化ポリヌクレオチドまたは固定化ポリヌクレオチド断片は、本明細書に記載した標識方法によって標識される。これらの方法は、例えば、マイクロアレイまたはタグ化被分析物の作製に適している。
本明細書に記載される場合、無塩基部位は、通例、ポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することにより調製し、従って、固定化、任意に断片化および／または任意に標識の対象とするポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチドのスペースは、固定化の部位、（断片化に係わる実施態様の）断片の大きさ、および（標識に係わる実施態様の）標識の強度に関係し、これらを決定する。こうした特徴があるため、（例えば、ポリヌクレオチド鋳型からの非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成の間に）非共通ヌクレオチドの組み込みを制御することができる条件を用いることにより、（標識に係わる実施態様の）断片の大きさおよび／または標識の強度および位置を制御することができる。
従って、一局面では、本発明は、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子を用いて、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し（これにより、無塩基部位を作製し）；任意に、このポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することにより断片を作製し；そしてこのポリヌクレオチドまたは（断片化に係わる実施態様の）その断片を無塩基部位において基体に固定化することを含む、ポリヌクレオチドの基体への固定化方法を提供する。一般に、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法および本明細書に記載した方法を用いて調製される。非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子、および断片化に係わる実施態様での、ホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することができる作用因子は、本明細書に記載した通りである。
任意に、このポリヌクレオチドまたはその断片は、本明細書に記載した任意の標識方法によって標識する。従って、一部の実施態様では、本発明は、基体に固定化される、標識ポリヌクレオチドまたは標識ポリヌクレオチド断片の作製方法を提供する。一部の実施態様では、このポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片は、本明細書に開示した任意の標識方法によって標識される。
無塩基部位を含むこのポリヌクレオチド（またはその断片）は、その無塩基部位において基体に固定化される。この基体は、固体表面または半固体表面（例えば、マイクロアレイ）であり得る。他の実施態様では、このマイクロアレイとしては、紙、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコンおよび光ファイバーからなる群から選ばれる材料から作製した基体に固定化した少なくとも１種のポリヌクレオチド（またはその断片）が挙げられる。他の実施態様では、このポリヌクレオチド（またはその断片）は、ピン、棒材、ファイバー、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー、シリンダーを含む二次元構造または三次元構造の基体に固定化される。他の実施態様では、無塩基部位を含むポリヌクレオチド（または、断片化に係わる実施態様でのその断片）は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、炭水化物、細胞、微生物、ならびにこれらの断片および産物、有機分子、ならびに無機分子のうちの１種以上からなる群から選ばれる基体に固定化される。さらに他の実施態様では、この基体は、ポリペプチド、抗体、有機分子および無機分子から選ばれる。
一本鎖ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド断片を含む）は、この一本鎖ポリヌクレオチドを含むマイクロアレイの調製に特に好適である。（ホスホジエステル骨格の無塩基部位における切断に係わる実施態様での）一本鎖ポリヌクレオチド断片は有利である。何故なら、ホスホジエステル骨格を切断することによって無塩基部位を断片の３’末端または断片の５’末端に配置するのに用いる方法を選択することにより、（この断片を固定化する）表面に対するこの断片の方向を制御することができるからである。規定の配置（例えば、３’末端、５’末端）でポリヌクレオチドを固定化すると、相補性オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが向上し、より高密度の固定化が可能になる。
本発明の方法は、本発明の方法により作製した固定化ポリヌクレオチドまたは固定化ポリヌクレオチド断片を用いる方法（いわゆる「用途」）を含む。一部の実施態様では、本発明は、核酸配列の変異を検出する方法を提供する。
また、本発明は、この固定化ポリヌクレオチドまたはその断片を用いて目的の配列を特徴付ける（例えば、その有無および／または量を検出する）方法を提供する。
別の実施態様では、本発明は、本発明の方法により作製した固定化ポリヌクレオチドまたはその断片を用いて、遺伝子発現プロフィールを決定する方法を提供する。
（一般的技術）
本発明の実施においては、特に示さない限り、当該分野の技術範囲内にある、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を用いる。このような技術については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７，および定期更新物）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）などの文献に十分説明されている。
本発明に用いるプライマー、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な技術を使用して作製することができる。
（定義）
本明細書に用いられる場合、「鋳型配列」または「鋳型核酸」または「鋳型」とは、目的の配列を含むポリヌクレオチドであって、これに対する、非共通ヌクレオチドを含む相補体の合成が所望されるポリヌクレオチドである。この鋳型配列は、実際の配列の点で、公知のものでも未知のものでもよい。場合によっては、用語「ターゲット」、「鋳型」およびこれらのバリエーションが交換可能に用いられる。
本明細書において交換可能に用いている「ポリヌクレオチド」もしくは「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことを意味し、ＤＮＡを含む。これらのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはこれらのアナログ、またはＤＮＡポリメラーゼによりポリマー中に組み込むことができる任意の基質とすることができる。ヌクレオチドとしては、共通および非共通ヌクレオチドが含まれ、ポリヌクレオチドは共通および非共通ヌクレオチドを含むことができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド構造の修飾および／またはホスホジエステル骨格の修飾などの修飾（改変）ヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載されるように、修飾ヌクレオチドは、共通ヌクレオチドもしくは非共通（切断可能）ヌクレオチドとすることができる。しかしながら、本発明の方法に用いる反応条件下で非共通（切断可能）ヌクレオチドではない修飾ヌクレオチドが、存在したとしても、通例、このポリヌクレオチドが、非共通ヌクレオチドの塩基部分で切断を受けることにより無塩基部位を作製する能力、および／または、ホスホジエステル骨格の無塩基部位での切断を受けることにより断片を形成する能力、および／または本明細書に記載した基体へのポリヌクレオチド（もしくはその断片）の固定化を受ける能力に影響を及ぼさないと考えられることが理解される。ヌクレオチドのメチル化などのヌクレオチド構造の修飾を行うことがあるとすれば、これをポリマーの構築の前もしくは後に行うことができる。ヌクレオチドの配列には非ヌクレオチド成分を割り込ませることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、重合後に、標識成分と結合させるなどにより、修飾することができる。他のタイプの修飾としては、例えば、「キャップ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログによる置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、ペンダント部分、例えば、蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナル・ペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジンなど）を含むもの、インターカレータ（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を含むもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合（例えば、アルファ・アノマー核酸など）を含むもの、ならびにこのポリヌクレオチドの未修飾型が挙げられる。ヌクレオチド間修飾が、例えば、（例えば、本明細書に記載した、ホスホジエステル骨格が無塩基部位で切断される場合の）ホスホジエステル骨格の切断の効率および／または速度を変えることができることが理解される。さらに、糖部分に通常存在する任意の水酸基を、例えば、標準的な保護基により保護し、もしくは活性化して付加的なヌクレオチドに対する付加的な結合を形成させたホスホン酸基、リン酸基によって置換することができる。この５’および３’末端ＯＨは、リン酸化することができ、またはアミンもしくは炭素原子数１〜２０の有機キャッピング基部分によって置換することができる。また、その他の水酸基も標準的な保護基に誘導体化することができる。また、ポリヌクレオチドは、当該分野で一般に公知であるリボース糖もしくはデオキシリボース糖の類似型を含むことができ、この類似型としては、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル−、２’−フルオロ−、もしくは２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、アラビノース、キシロース、リキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、および無塩基ヌクレオシド・アナログが挙げられる。ホスホジエステル結合は、その１つ以上を別の結合基によって置換することができる。こうした別の結合基としては、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によってリン酸を置換し、ＲもしくはＲ’は、独立にＨ、またはエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを任意に含む置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）であるものとする実施態様を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同一である必要はない。このことは、本明細書に記載したＤＮＡを含む全てのポリヌクレオチドに当てはまる。しかしながら、修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド間結合が、および／または存在したとしても、通例、このポリヌクレオチドが、非共通ヌクレオチドの塩基部分での切断を受けることにより無塩基部位を作製する能力、および／または、このポリヌクレオチドが、ホスホジエステル骨格の無塩基部位での切断を受けることにより断片を形成する能力、および／またはこのポリヌクレオチドが、本明細書に記載した基体に（ポリヌクレオチドの末端の無塩基部位および／またはポリヌクレオチドの末端にない無塩基部位などの）無塩基部位で固定化する能力に影響を及ぼさないことが理解される。
一般に、本明細書で用いている「オリゴヌクレオチド」とは、通常約２００ヌクレオチド長未満であるが必ずしもそうとは限らない短鎖の、普通一本鎖で、通例合成のポリヌクレオチドのことを意味する。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互いに相容れないものではない。ポリヌクレオチドについての前記の記述は、オリゴヌクレオチドにも等しく、かつ完全に当てはめることができる。
本明細書で用いている「プライマー」とは、（鋳型ＲＮＡ、プライマー伸長産物などの）鋳型配列とハイブリッドを形成し、この鋳型に相補性のポリヌクレオチドの重合を促進することができる、通例遊離３’−ＯＨ基を有するヌクレオチド配列（ポリヌクレオチド）のことを意味する。「プライマー」は、例えば、オリゴヌクレオチドとすることができる。また、これは、例えば、（プライマー伸長産物、もしくは鋳型ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ分解酵素による切断により作製した鋳型ＲＮＡの断片などの）鋳型の配列であって、この鋳型自体の配列と（例えば、ヘアピン・ループとして）ハイブリッドを形成し、ヌクレオチド重合を促進することができる配列とすることができる。従って、プライマーは、外来性（例えば、添加）プライマーもしくは内在性（例えば、鋳型断片）プライマーとすることができる。
「複合体」とは、成分の組立体である。複合体は、安定であってもなくてもよく、直接もしくは間接的に検出することができるものである。例えば、本明細書で説明したように、特定の反応成分およびその反応生成物の種類が分かると、複合体の存在を推測することができる。本発明の目的では、複合体とは、通例、最終的なポリヌクレオチド断片、標識ポリヌクレオチド、標識ポリヌクレオチド断片および／または固定化ポリヌクレオチドもしくはその断片に対する中間体である。
ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの「断片」とは、２つ以上の塩基の連続した配列である。別の実施態様として、断片（「領域」または「部分」とも言う）は、ヌクレオチド長として、約３、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６５、約７５、約８５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、もしくはそれ以上のうちの任意の長さである。一部の実施態様として、これらの断片は、ヌクレオチド長として、少なくとも約３、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６５、約７５、約８５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、もしくはそれ以上とすることができる。別の実施態様として、これらの断片は、ヌクレオチド長として、約３未満、約５未満、約１０未満、約１５未満、約２０未満、約２５未満、約３０未満、約３５未満、約４０未満、約５０未満、約６５未満、約７５未満、約８５未満、約１００未満、約１２５未満、約１５０未満、約１７５未満、約２００未満、約２２５未満、約２５０未満、約３００未満、約３５０未満、約４００未満、約４５０未満、約５００未満、約５５０未満、約６００未満、約６５０未満、もしくはそれ以上とすることができる。一部の実施態様では、これらの断片の長さは、本発明の方法を用いて作製した断片の群における平均の大きさを表す。
「反応混合物」とは、適当な条件下で反応して（中間体とすることができる）複合体および／または産物を形成する成分の集合体である。
「Ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などは、他に示さない限り、複数形を含む。従って、’’Ａ’’ ｆｒａｇｍｅｎｔは、１つ以上の断片を意味する。’’Ａ’’ ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは、１つ以上の非共通ヌクレオチドを意味する。
「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、特許法の既定の原則に従って、含むことを意味する。
ポリヌクレオチド合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、ホスホジエステル骨格の無塩基部位における切断などの事象が生じることを「可能にする」条件もしくはそのような事象が生じるのに「好適」である条件、または「好適な」条件とは、そのような事象が生じるのを妨げない条件のことである。従って、こうした条件では、そのような事象は、発生可能になり、増進し、円滑に進み、および／または促進される。当該分野で公知であり、本明細書に記載しているこのような条件は、例えば、ポリヌクレオチド配列の性質、温度および緩衝条件によって決まる。また、こうした条件は、ポリヌクレオチド合成、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断、ホスホジエステル骨格の無塩基部位における切断、無塩基部位の標識、ポリヌクレオチド断片もしくはポリヌクレオチドの固定化などの目的とする事象によって決まる。
本明細書において交換可能に用いている「マイクロアレイ」および「アレイ」は、特徴が未確定な場合が多い生化学的検体（目的物）の推定結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位の配列、好ましくは順序付けられた配列を有する表面を含む。好ましい実施態様として、マイクロアレイとは、基体上の限定した位置に固定化した相異なるポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド・プローブの集合体のことを意味する。アレイは、紙、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコンその他の金属、光ファイバーまたは任意の他の好適な固体もしくは半固体支持体のような材料で作製され、平面（例えば、ガラス板、シリコンチップ）もしくは三次元（例えば、ピン、繊維、ビーズ、粒子、マイクロタイター・ウェル、キャピラリ）構造として構成された基体上に、形成される。こうしたアレイを構成するプローブは、多数の方法によって、基体に結合させることができ、このような方法としては、（ｉ）フォトリソグラフィ法を用いるイン・ジッツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）合成（例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ）（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１年），２５１：７６７−７７３；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４年），９１：５０２２−５０２６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６年），１４：１６７５；米国特許第５，５７８，８３２号、第５，５５６，７５２号および第５，５１０，２７０号参照）；（ｉｉ）ガラス、ナイロンもしくはニトロセルロース上への中等度〜低密度スポッティング／焼き付け（例えば、ｃＤＮＡプローブ）（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５年），２７０：４６７−４７０，ＤｅＲｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６年），１４：４５７−４６０；Ｓｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（１９９６年），６：６３９−６４５；およびＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９５年），９３：１０５３９−１１２８６）；（ｉｉｉ）マスキングによるもの（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９２年），２０：１６７９−１６８４）、ならびに（ｉｖ）ナイロンもしくはニトロセルロース・ハイブリダイゼーション膜へのドット・ブロッティングによるもの（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）参照）が挙げられる。また、プローブは、アンカーへのハイブリダイゼーションにより、または磁性ビーズにより、あるいはマイクロタイター・ウェルもしくはキャピラリ内などの流体相中で、非共有結合によって基体に固定化することができる。一般に、プローブ分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ｃＤＮＡなどの核酸であるが、蛋白質、ポリペプチド、オリゴ糖、細胞、組織、および目的分子に特異的に結合することができるこれらの任意の置換体（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を含むことができる。
「３’」という用語は、一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内のある領域もしくは位置から３’末端側（下流）の同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の別の領域もしくは位置のことを意味する。
「５’」という用語は、一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内のある領域もしくは位置から５’末端側（上流）の同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の別の領域もしくは位置のことを意味する。
「３’−ＤＮＡ部分」、「３’−ＤＮＡ領域」、「３’−ＲＮＡ部分」および「３’−ＲＮＡ領域」という用語は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’末端側に位置するこのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの部分もしくは領域のことを意味し、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も３’末端側のヌクレオチドに結合した最も３’末端側のヌクレオチドまたは部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含んでも含まなくてもよい。この最も３’側のヌクレオチドは、好ましくは約１〜５０、より好ましくは約１０〜４０、さらに好ましくは約２０〜３０ヌクレオチドとすることができる。
本明細書で用いている「共通」ヌクレオチドとは、ＤＮＡ内に通常存在する４種の代表的な核酸塩基、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンのうちの１種を含むヌクレオチドのことを意味する。また、この用語は、４種の代表的な核酸塩基、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンのうちの１種を含むそれぞれのデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸を包含する（本明細書で説明したが、この塩基は、例えば、ポリヌクレオチドの定義で説明したように、修飾および／または改変塩基とすることができる）。本明細書で用いている共通ヌクレオチドの塩基部分は、通例、本発明の方法に用いる条件下では切断可能ではない。
本明細書で用いている「非共通ヌクレオチド」（交換可能に「非共通デオキシリボヌクレオシド三リン酸」とも言う）は、上記４種の共通塩基以外の塩基を含むヌクレオチドのことを意味する。また、この用語は、上記４種の共通塩基以外の塩基を含むそれぞれのデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸を包含する。本発明との関連で、（ｄＵＴＰなどの）ウラシルを含むヌクレオチド、もしくはそのそれぞれのデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸は、非共通ヌクレオチドである。本明細書で用いている非共通ヌクレオチドの塩基部分は、本発明の方法に用いる反応条件下で全体的に、もしくは特異的に、または選択的に切断する（ことにより無塩基部位を含むヌクレオチドを作製させる）ことができる。また、本明細書で用いている非共通ヌクレオチドはまた、概して、ポリヌクレオチドの合成過程で（例えば、プライマー伸長および／または複製過程で）ポリヌクレオチド内に組み込むことができ、ヌクレオチドの塩基部分を切断する作用因子により全体的に、もしくは特異的に、または選択的に切断することにより無塩基部位を含むポリヌクレオチドを形成させることができ、（ポリヌクレオチド内に組み込まれる場合に）適切なヌクレオチド間結合を含むことにより、無塩基部位（即ち、塩基部分の切断後の非共通ヌクレオチド）においてホスホジエステル骨格をこれを切断することができる作用因子を用いて切断することができ、（無塩基部位の作製後に）標識することができ、そして／または本明細書に開示した方法によって、（無塩基部位の作製後に）表面に固定化することができる。この非共通ヌクレオチドに対しては、この非共通ヌクレオチドを用いることになる本発明の特定の方法に応じて、上記の特徴の全てを必要とすることができるが、必ずしも必要とは限らないことが理解される。一部の実施態様として、非共通ヌクレオチドは、本明細書で開示した改変および／または修飾ヌクレオチド鎖である。非共通ヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドに組み込まれているヌクレオチド、および単独のヌクレオチドのことを意味する。
本明細書で用いている「被分析物」とは、本発明の方法による検出もしくはアッセイの対象とする物質、例えば、性質、存在部位（ｌｏｃａｔｉｏｎ）、量および／または識別性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を特徴付けることを目的とする化合物のことを意味する。代表的な被分析物としては、蛋白質、ペプチド、核酸セグメント、細胞、微生物ならびにこれらの断片および産物、有機分子、無機分子、または相手（ｐａｒｔｎｅｒ）を結合するための固定化部位を生じさせることができる任意の物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。以上の開示から明瞭に分かるように、被分析物は基体である。
本明細書で用いている「無塩基部位」とは、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子で処理後の非共通ヌクレオチドの組み込み部位のことを意味する。無塩基部位（交換可能に「ＡＰ部位」とも言う）は、ヘミアセタール環を含むことができ、非共通ヌクレオチドの塩基部分を欠く。本明細書で用いている「無塩基部位」は、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子（例えば、酵素、または熱もしくは塩基性条件）により（ポリヌクレオチド鎖内に存在する）非共通ヌクレオチドを処理した後に残るあらゆる化学構造を包含する。従って、本明細書で用いている無塩基部位は、例えば、エンドヌクレアーゼＩＩＩもしくはＯＧＧ１蛋白質を用いて非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する場合のように、ニック・ポリヌクレオチドの３’末端に結合した修飾糖部分を含む。例えば、Ｋｏｗ，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２，１６４−１６９（例えば、図４）を参照されたい。
本明細書で用いている「無塩基部位を標識すること」とは、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子（例えば、酵素もしくは熱）で処理することにより（ポリヌクレオチド鎖内に存在する）非共通ヌクレオチドの塩基部分（塩基全体を含む）を除去した後に残存する任意の化学構造と、標識とを結合させることを意味する。一実施態様として、無塩基部位内の反応性アルデヒド型のヘミアセタール環を標識する。別の実施態様として、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子（例えば、酵素または熱もしくは塩基性条件）で（ポリヌクレオチド鎖内に存在する）非共通ヌクレオチドを処理し、（本明細書で説明したように）骨格を無塩基部位で切断することができる作用因子で無塩基部位を含むポリヌクレオチドを処理した後に、残存する化学構造と標識とを結合させる。
本明細書に用いている、無塩基部位「における」骨格（例えば、ホスホジエステル骨格）の切断とは、この無塩基部位の３’末端側もしくはこの無塩基部位の５’末端側またはこれら両方のホスホジエステル結合を切断することを意味する。以上の開示から明瞭に分かるように、無塩基部位「における」とは、（３’末端のすぐ近く、もしくは５’末端のすぐ近くといった）最も近い、もしくは近接した位置のことを意味する。さらに別の実施態様として、より複雑な形の切断、例えばホスホジエステル骨格の切断と無塩基ヌクレオチド（の一部）の切断とを生じるように切断させることも可能である。
本明細書に用いている「標識」（「検出可能な部分」とも呼ぶ）とは、ポリヌクレオチドと結合もしくは連結させる（「標識する」とも言う）部分のことを意味する。この標識ポリヌクレオチドは、直接もしくは間接的に、通常は検出可能なシグナルを介して検出し得る。この検出可能な部分（標識）は、直接、または、標識される１箇所以上の部位と特異的に結合し得る他の部分を有する非干渉性結合基を介して、接続（もしくは結合）させることができる。この検出可能な部分（標識）は、共有結合もしくは非共有結合により、および直接もしくは間接的に結合させることができる。
以下は、本発明の方法の例である。本明細書に一般的な説明がなされていることからして、種々の他の実施態様を実施し得ることが理解される。例えば、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し得る作用因子の使用について参照するということは、本明細書に記載した非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し得る任意の作用因子を用いることができるということである。
（核酸の標識および断片化方法）
本発明は、核酸の標識断片を作製する方法を提供する。概して、この方法は、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製し、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し得る作用因子を用いて、ポリヌクレオチド内に存在するこの非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する工程、および無塩基部位を含むポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格をこの無塩基部位で切断する工程、ならびにこの無塩基部位を標識することにより標識核酸断片を作製する工程を包含する。通例、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、この合成ポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチドの組み込み部位において断片化され、標識される。従って、この合成ポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチドの出現頻度は、通常、このポリヌクレオチドから作製される標識断片の大きさの範囲に関係し、これを決定する。本発明の方法により、例えば、マイクロアレイとのハイブリッド形成および本明細書に記載した他の用途に有用な標識核酸断片が得られる。
便宜上、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成と、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し得る酵素などの作用因子によるこのポリヌクレオチドの処理とを別々の工程として説明する。これらの工程（例えば、これらの工程の１つ以上）は同時に実施し得るが、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが（増幅の指数的方法、例えば、ＰＣＲの場合のように）更なる増幅の鋳型となり得る必要がある場合は、（通例）非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する前に無塩基部位を含むポリヌクレオチドを合成することが好ましいことが理解される。
この方法は、以下の工程を実施するものである：（ａ）非共通ヌクレオチド（「非共通デオキシリボヌクレオシド・トリホスフェート」もしくは「非共通デオキシリボヌクレオチド」とも呼ぶ）の存在下で鋳型からポリヌクレオチドを合成することにより、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する工程；（ｂ）この共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し得る作用因子と接触させる（即ち、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する）ことにより、無塩基部位を作製する工程；（ｃ）この無塩基部位を含むポリヌクレオチドの骨格を無塩基部位で切断する工程；および（ｄ）この無塩基部位を含むポリヌクレオチドを、この無塩基部位を標識し得る物質と接触させる（即ち、無塩基部位を標識する）ことにより、標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程。
簡単にするために、以下では標識および断片化方法の個々の工程を説明するが、本明細書で説明したように、これらの工程が同時に、および／または多様な順序で実施し得ることが理解される。
（非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成）
この方法は、少なくとも１種の非共通ヌクレオチド（「非共通デオキシリボヌクレオシド・トリホスフェート」とも言う）の存在下で鋳型からポリヌクレオチドを合成することにより、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する工程を包含する。ポリヌクレオチド内に組み込まれた非共通ヌクレオチドの発現頻度は、本発明の方法を用いて作製される断片の大きさに関係する。何故なら、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチド間の間隔は、用いた反応条件と共に、本明細書に説明したようにして非共通ヌクレオチドから無塩基部位を作製し、この無塩基部位で骨格を切断することにより得られる断片の平均的大きさを決定するからである。
通例、このポリヌクレオチドはＤＮＡであるが、本明細書で述べたように、このポリヌクレオチドは改変および／または修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間結合、リボヌクレオチドなどを含むことができる。本明細書において一般的に用いている「ＤＮＡ」がポリヌクレオチド実施態様に当てはまることが理解される。
ポリヌクレオチド、例えば、一本鎖および二本鎖ＤＮＡを鋳型から合成する方法は、当該分野では周知であり、これには、例えば、単一プライマー等温増幅法、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭ法、ＰＣＲ法、逆転写法、プライマー伸長法、限定（ｌｉｍｉｔｅｄ）プライマー伸長法、（ローリングサークル複製法を含む）複製法、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、ニック・トランスレーション法、多重置換増幅法（ＭＤＡ）、および鋳型配列の相補体を合成することにより少なくとも１種の非共通ヌクレオチドをポリヌクレオチド内に組み込ませることができる任意の方法が挙げられる。例えば、Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号、ＫｕｒｎのＷＯ０２／００９３８、Ｋｕｒｎの米国特許公報第２００３／００８７２５１ Ａ１号、Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，５８２，８７７号、Ｗａｌｌａｃｅの米国特許第６，０２７，９２３号、および米国特許第５，５０８，１７８号、同第５，８８８，８１９号、同第６，００４，７４４号、同第５，８８２，８６７号、同第５，７１０，０２８号、同第６，０２７，８８９号、同第６，００４，７４５号、同第５，７６３，１７８号、同第５，０１１，７６９号、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”第２版；Ａｕｓｅｂｅｌ（１９８７年、および改訂版）”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”；Ｍｕｌｌｉｓ，（１９９４年）”ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”を参照されたい。非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製するには当該分野で公知の１つ以上の方法を用いることができる。非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖または部分的二本鎖であり得、そして二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖もしくは二本鎖が非共通ヌクレオチドを含むことができることが理解される。便宜上、本明細書では、ポリヌクレオチドを説明（および例示）するのに「ＤＮＡ」という用語を使用する。好適な方法としては、非共通ヌクレオチドを含む１つの一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチドが得られる方法（例えば、逆転写法、二本鎖ｃＤＮＡの作製法、単一ラウンドのＤＮＡ複製法）、および複数の一本鎖もしくは二本鎖コピーまたは鋳型の相補体のコピーが得られる方法（例えば、単一プライマー等温増幅法すなわちＲｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭ法またはＰＣＲ法）が挙げられる。図１に示した一実施態様では、単一プライマー等温増幅法により非共通ヌクレオチドを含む一本鎖ポリヌクレオチドを合成している。Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号を参照されたい。
通例、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、任意に適切な酵素およびプライマーを含むポリヌクレオチド合成に好適な反応条件で、４種の共通ヌクレオチドの全ておよび少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下で鋳型から作製する。非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを合成するための反応条件およびプライマーなどの試薬については、当該分野で公知であり、さらに本明細書においても議論している。本明細書で説明したように、非共通ヌクレオチドは、通例、重合させることができ（即ち、ＤＮＡポリメラーゼの基質である）、非共通ヌクレオチドの塩基部分を全体的に、もしくは特異的に、または選択的に切断し得る適切な作用因子を用いる処理により無塩基化し得る。好適な非共通ヌクレオチドについては、当該分野で周知であり、例としては、デオキシウリジン・トリホスフェート（ｄＵＴＰ）、デオキシイノシン・トリホスフェート（ｄＩＴＰ）、５−ヒドロキシメチル・デオキシシチジン・トリホスフェート（５−ＯＨ−Ｍｅ−ｄＣＴＰ）が挙げられる。例えば、Ｊｅｎｄｒｉｓａｋの米国特許第６，１９０，８６５ Ｂ１号；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２年）ｐ２５１−６を参照されたい。一般に、（例えば、非共通ヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの複数のコピーを、例えば、ＰＣＲ増幅により合成する場合のように）非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、さらに増幅させるための鋳型とする実施態様では、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、さらに増幅させるための鋳型とし得ることが必要がある。
ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型から合成するポリヌクレオチドに２種以上の非共通ヌクレオチドを組み込むことによって、少なくとも２種の異なる非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製し得ることが理解される。
非共通ヌクレオチドの組み込みを限定および／または制御するための条件については当該分野で公知である。例えば、Ｊｅｎｄｒｉｓａｋの米国特許第６，１９０，８６５ Ｂ１号；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２年）ｐ２５１−６；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３年）２１１：ｐ１６４−９；およびＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，第２版；Ａｕｓｅｂｅｌ（１９８７年、および改訂版）”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”を参照されたい。得られる非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチドの出現頻度（もしくは間隔）、従って、本発明の方法により（即ち、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断およびホスホジエステル骨格の非共通ヌクレオチドにおける切断により）作製した断片の平均的な大きさは、当該分野で公知の変動要素、例えば、鋳型内の非共通ヌクレオチド（類）に相当するヌクレオチド（類）の出現頻度（または、平均Ｇ−Ｃ含量などの配列のヌクレオチド含量の尺度）、反応混合物中の非共通ヌクレオチドに対する共通ヌクレオチドの比率；ポリメラーゼの共通ヌクレオチド組み込み能、共通ヌクレオチドに対する非共通ヌクレオチドの相対的組み込み効率などによって支配される。また、断片の大きさの平均が、本明細書で以下に説明するように、断片化の間に、用いられる反応条件にも関係することが理解される。この反応条件は、例えば、本明細書に教示した本発明の方法を用いて得られた平均断片サイズを評価することにより、実験的に決定し得る。また、本明細書でさらに説明するように、無塩基部位の標識レベルも、非共通ヌクレオチドの組み込み頻度に関係する。
通例、非共通塩基は、得られる非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内にほぼ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６５、７５、８５、１００、１２３、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０塩基もしくはそれ以上の間隔ごとに組み込むことができる。一実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約２００ヌクレオチドごとに、もしくは約１００ヌクレオチドごとに、または約５０ヌクレオチドごとに組み込まれる。別の実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約５０乃至約２００ヌクレオチドごとに組み込まれる。一部の実施態様として、１：５の比率のｄＵＴＰとｄＴＴＰが、この反応混合物に用いられる。
ポリヌクレオチド鋳型（これに沿って非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが合成される）は、標識ポリヌクレオチド断片の作製のために用いることができる任意の鋳型であり得る。本明細書の記載から明らかなように、この標識ポリヌクレオチド断片はポリヌクレオチド鋳型配列の相補体である。この鋳型としては、任意の精製もしくは未精製形態の原料由来の二本鎖、部分的二本鎖および一本鎖の核酸が挙げられ、具体的には、ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）もしくはＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドもしくはこれらの混合体、遺伝子、染色体、プラスミド、微生物（例えば、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、糸状菌、真菌）、植物、動物、ヒトなどの生体材料のゲノム、ならびにこれらの断片であり得る。核酸の取得および精製には、当該分野の標準的な技術を用いる。ＲＮＡは、当該分野の標準的な技術を用いて取得し、精製し得る。ＤＮＡ鋳型（ゲノムＤＮＡ鋳型を含む）は、ＲＮＡの形に転写されることができ、これは、Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号に開示されている方法を用いて、および当該分野で公知の（発現系などの）他の技術により達成し得る。一般に、ゲノムＤＮＡのＲＮＡコピーは、ｍＲＮＡには一般に存在しないイントロン、調節エレメントおよび制御エレメントなどの非転写配列を含む。ＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーは、Ｋｕｒｎの米国特許公報第２００３／００８７２５１ Ａ１号に開示されている方法その他の当該分野で公知の技術を用いて合成し得る。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドからの非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成は、ｓｓＤＮＡおよび／またはＲＮＡを得るためのこのハイブリッドの変性、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断し得る作用因子による切断、および当該分野で公知の他の方法により達成し得る。この鋳型は、生体試料のような複雑な混合物の極微量の画分であり得、当該分野で周知の方法により種々の生体材料から得ることができる。この鋳型は、公知のものでも未知のものでもよく、目的の所望の特定核酸配列を２つ以上含むことができ、これらはそれぞれ同じであっても互いに異なっていてもよい。従って、本発明の方法は、非共通ヌクレオチドを含む１種類の特定ポリヌクレオチドを作製するのに有用であるばかりでなく、非共通ヌクレオチドを含む２種以上の特定ポリヌクレオチドを同時に作製するのにも有用である。この鋳型ＤＮＡは、核酸のサブ集団（例えば、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション・プローブ、総ゲノムＤＮＡ、制限断片、ｃＤＮＡライブラリ、総ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡ、クローン化ライブラリ、もしくは本明細書に記載した任意の鋳型の増幅産物）であり得る。場合によっては、鋳型核酸配列の一部の相補体を合成する最初の工程は、鋳型の変性である。変性工程は、熱変性、もしくはアルカリ処理など当該分野で公知の他の任意の方法によるものであり得る。
簡単にするために、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを単一の核酸として説明する。このポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチドの集団（少数乃至多数乃至非常に多数のポリヌクレオチド）であり得ることが理解される。さらに、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを多様な（低分子乃至極めて高分子）の種々のポリヌクレオチド分子であり得ることも理解される。このような集団は、配列が類縁のもの（例えば、遺伝子ファミリーもしくはスーパーファミリーのメンバー）または配列が極めて異なるもの（例えば、全ｍＲＮＡから作製したもの、全ゲノムＤＮＡから作製したもの、など）であり得る。また、ポリヌクレオチドは、（例えば、コーディング領域、ゲノム部分などの公知遺伝子の一部もしくは全部であり得る）単一配列に相当するものであり得る。特定のポリヌクレオチド配列および多数のポリヌクレオチド配列を作製するための方法、試薬ならびに反応条件については、当該分野では公知である。
一般に、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの好適な合成方法は、（本明細書におおむね説明したように、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドがポリヌクレオチド鋳型に沿って合成されるという意味で）鋳型依存性である。鋳型非依存性の方法を用いる結果として、非共通ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むことができることが理解される。例えば、１つ以上の非共通ヌクレオチドを含むように１種以上のプライマーを設計し得る。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓの米国特許第６，０３７，１５２号、同第５，４２７，９２９号および同第５，８７６，９７６号を参照されたい。本明細書で説明したように、プライマーに少なくとも１種の非共通ヌクレオチドを含ませると、非共通ヌクレオチドの塩基部分が切断され、（すなわち、本明細書で説明したように、無塩基部位が作製された後）この無塩基部位が標識されることにより、プライマーの一部を含むポリヌクレオチド断片もしくは標識ポリヌクレオチド断片が作製される。プライマーに非共通ヌクレオチドを含ませることは、特に、単一プライマー等温増幅などの方法に好適であり得る。Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号、ＫｕｒｎのＷＯ０２／００９３８；およびＫｕｒｎの米国特許公報第２００３／００８７２５１ Ａ１号を参照されたい。また、非共通ヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドを含む別のポリヌクレオチドのテーリングおよび連結などの鋳型非依存性の方法によってもポリヌクレオチドに付加し得る。テーリングおよび連結の方法については当該分野で周知である。
（非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断による無塩基部位の作製）
非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、非共通デオキシリボヌクレオシドの塩基部分を全体的に、または特異的に、または選択的に切断して無塩基部位を作製することができる酵素などの作用因子を用いて処理する。図１に示した例示的な実施形態は、酵素を用いた非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断による無塩基部位の作製を示したものである。本明細書で用いている「無塩基部位」という用語は、ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子を用いて、例えば、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子（例えば、酵素、酸性条件、もしくは化学試薬）で（ポリヌクレオチド鎖内に存在する）非共通ヌクレオチドを処理することにより、塩基部分（塩基全体を含む）を除去した後に残存するあらゆる化学構造を包含する。一部の実施形態において、（酵素などの）作用因子は、非共通ヌクレオチドの塩基部分と非共通ヌクレオチド内の糖との間の結合の加水分解を触媒して、ヘミアセタール環を含みかつその塩基を欠く無塩基部位（互換可能に「ＡＰ」とも言う）を作製するが、その他の切断産物も本発明の方法に使用することを企図している。非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断するための好適な作用因子および反応条件については当該分野で公知であり、例えば、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（「ＵＮＧ」；ｄＵＴＰを特異的に切断する）（互換可能に「ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ」とも呼ばれる）、ヒポキサンチン−Ｎ−グリコシラーゼおよびヒドロキシ−メチルシトシン−Ｎ−グリコシラーゼを含む、Ｎ−グリコシラーゼ（「ＤＮＡグリコシラーゼ」もしくは「グリコシダーゼ」とも呼ばれる）；３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルグアニンＤＮＡグリコシラーゼもしくは７−メチルグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ；Ｔ４エンドヌクレアーゼＶが挙げられる。例えば、Ｌｉｎｄａｈｌ，ＰＮＡＳ（１９７４）７１（９）ｐ３６４９−３６５３およびＪｅｎｄｒｉｓａｋの米国特許第６，１９０，８６５号Ｂ１を参照されたい。一実施形態において、ウラシルＮ−グリコシラーゼを用いて非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する。別の実施形態において、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する作用因子は、ホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断するのと同じ作用因子を用いる。
一般的に、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断は、（非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（酵素などの）作用因子が特定の非共通ヌクレオチドの塩基部分を全体的に、または特異的に、または選択的に切断するという意味で）全体的切断、または特異的切断、または選択的切断であり、このことにより、切断される塩基部分の約９８％超、約９５％超、約９０％超、約８５％超もしくは約８０％超は非共通ヌクレオチドの塩基部分である。しかしながら、切断の程度はより低いことがあり得る。従って、特異的な切断についての基準は例示的なものである。全体的、または特異的、または選択的に切断することは、本発明の標識ポリヌクレオチド断片（即ち、無塩基部位で骨格を切断することにより生じる断片）を作製する方法において断片の大きさを制御するために望ましい。一般的に、反応条件は、無塩基部位を作製する反応が完結し得るように選択する。
一部の実施形態において、（例えば、反応混合物中に残存する遊離非共通ヌクレオチドを除去するために）非共通ポリヌクレオチドの合成後、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを精製する。別の実施形態（実施例４で説明する実施形態など）において、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成と、その後の工程（非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断および無塩基部位におけるホスホジエステル骨格の切断など）との間で中間的な精製を行わない。
本明細書に記載したように、便宜上、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断（これにより無塩基部位を作製する）については、別個の工程として説明した。この工程を、（上述の）非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成、無塩基部位における上記骨格の切断（断片化）および／または無塩基部位の標識と同時に実施し得ることが理解される。
特定の非共通ヌクレオチドが、その非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる特定の酵素によって認識される限りにおいて、非共通ヌクレオチドの選択がその非共通酵素の塩基部分を切断するために使用すべき酵素の選択を決定づけ得ることは、理解される。
（無塩基部位を含むポリヌクレオチドの無塩基部位における骨格の切断およびこの無塩基部位の標識）
ポリヌクレオチドの骨格を無塩基部位で切断し、この無塩基部位を標識することにより、ヌクレオチドの標識断片を作製する。骨格の切断および標識が任意の順序で、もしくは同時に実施することができることについては理解される。しかしながら、便宜上、これらの反応を別々の工程として説明する。
無塩基部位を含むポリヌクレオチドの無塩基部位における骨格の切断
ポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することにより無塩基部位を作製した後、このポリヌクレオチドの骨格を無塩基部位で切断することができる作用因子を用いて、この非共通ヌクレオチドの組み込み部位（非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断により生じる、無塩基部位とも呼ばれる）でこの骨格を切断する。骨格の切断（「断片化」とも言う）によって、（この無塩基部位を含むポリヌクレオチド内に存在する無塩基部位の数および切断の程度に応じて）少なくとも２つの断片が得られる。
この骨格を無塩基部位で切断することができる好適な作用因子（例えば、酵素、化学物質および／または反応条件）については当該分野で周知であり、例としては、加熱処理および／または化学的処理（例えば、塩基性条件、酸性条件、アルキル化条件、もしくは無塩基部位のアミン媒介性切断（例えば、ＭｃＨｕｇｈおよびＫｎｏｗｌａｎｄ， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９５）２３（１０）ｐ１６６４−１６７０；Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９１）７ｐ２３５１；Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９４）７ｐ６７３−８３；Ｈｏｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，（１９８８）１６ｐ１１５５９−７１参照））、および無塩基部位におけるポリヌクレオチドの切断を触媒する酵素、例えばＡＰエンドヌクレアーゼ（「アプリン、アピリミジン・エンドヌクレアーゼ」とも呼ばれる）（例えば、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能な大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶ）、大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩもしくはエンドヌクレアーゼＩＶ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩのカルシウムイオン存在下における使用が挙げられる。例えば、Ｌｉｎｄａｈｌ，ＰＮＡＳ（１９７４）７１（９）ｐ３６４９−３６５３；Ｊｅｎｄｒｉｓａｋの米国特許第６，１９０，８６５号Ｂ１；Ｓｈｉｄａ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９６）２４（２２）ｐ４５７２−７６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（１３）ｐ２１２０３−２０９；Ｃａｒｅｙ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）３８ｐ１６５５３−６０；Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ Ｔｏｘｉｃｏｌ（１９９４）７ｐ６７３−６８３を参照されたい。本明細書に用いている「作用因子」という用語は、加熱などの反応条件を包含する。一実施形態において、ＡＰエンドヌクレアーゼである大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶを用いてホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断する。別の実施形態において、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンなどのアミンを用いて切断を行う。例えば、上記のＭｃＨｕｇｈ ａｎｄ Ｋｎｏｗｌａｎｄの文献を参照されたい。
一般的に、切断は、無塩基残基のすぐ５’側のヌクレオチドと無塩基残基との間、もしくは無塩基残基のすぐ３’側のヌクレオチドと無塩基残基との間で行う（但し、本明細書で説明したように、ホスホジエステル骨格を５’もしくは３’で切断すると、用いる断片化の作用因子に応じて、それぞれ無塩基部位の５’側もしくは３’側のリン酸基が保持されたりされなかったりすることがある）。当該分野では周知であるように、（通常、無塩基残基の５’リン酸基と隣接ヌクレオチドのデオキシリボース環との間で無塩基部位のすぐ５’側の位置で骨格を切断して隣接ヌクレオチドに遊離３’水酸基を形成させるエンドヌクレアーゼＩＶ処理の場合のように）切断部位を無塩基部位の５’末端側とすることにより、無塩基部位を、得られる断片の５’末端に配置することができる。また、切断を無塩基部位の３’末端側で行う（例えば、無塩基部位のデオキシリボース環および３’リン酸基と隣接ヌクレオチドのデオキシリボース環との間で切断して、隣接ヌクレオチドのデオキシリボース環上に遊離５’リン酸基を生成する）ことにより、無塩基部位を、得られる断片の３’末端に配置することができる。塩基性条件もしくは（Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンなどの）アミンを用いて処理すると、ホスホジエステル骨格は無塩基部位のすぐ３’側で切断される。さらに、より複雑な形の切断、例えば、ホスホジエステル骨格の切断および無塩基ヌクレオチド（の部分）の切断が生じるような切断が可能である。例えば、特定の条件下では、化学処理および／または熱処理による切断は、無塩基部位のデオキシリボース環とその３’リン酸との間の結合を切断して、標識することができるかまたはさらに切断および環化反応を行うことができる、反応性α，β−不飽和アルデヒドを形成するβ脱離工程を含み得る。例えば、Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９４）７ｐ６７３−８３；Ｈｏｒｎ， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，（１９８８）１６：１１５５９−７１を参照されたい。２つ以上の切断方法、例えば、複数の異なるタイプの切断産物（例えば、３’末端に無塩基部位を含む断片、および５’末端に無塩基部位を含む断片）を生じる２つ以上の異なる方法を用いることができることは理解される。
一般的に、無塩基部位における骨格の切断は、（無塩基部位で骨格を切断することができる（酵素などの）作用因子が特定の非共通ヌクレオチドの塩基部分を特異的または選択的に切断するという意味で）全体的、または特異的、または選択的切断であり、このことにより、切断の約９８％超、約９５％超、約９０％超、約８５％超もしくは約８０％超は無塩基部位において行われる。しかしながら、切断の程度はより低いことがある。従って、特異的な切断についての基準は例示的なものである。全体的、または特異的、または選択的に切断することは、本発明の標識ポリヌクレオチド断片を作製する方法において断片の大きさを制御するために望ましい。一部の実施形態において、反応条件を選択することにより、切断反応を大過剰の試薬の存在下に実施して、ポリヌクレオチドが過度に切断される懸念を殆ど生じずに（即ち、上述の合成工程で、組み込まれた非共通ヌクレオチドの間隔により決定することができる所望の断片サイズを維持しながら）、完結させることができる。別の実施形態において、切断の程度を少なくすることによって、末端に無塩基部位を含み、そしてそのポリヌクレオチド断片内もしくはその内部に（即ち、末端ではない）無塩基部位を含む、ポリヌクレオチド断片を作製させることができる。本明細書に開示するように、内部に無塩基部位を含むポリヌクレオチド断片は、例えば、（１つの無塩基部位を固定化に用い、もう１つの無塩基部位を無塩基部位で標識する）標識ポリヌクレオチドの固定化に係わる実施形態において、有用である。
本明細書で述べたように、このポリヌクレオチド内への非共通ヌクレオチドの組み込み頻度は、本発明の方法により作製される断片の大きさに関係する。何故なら、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチド間の間隔、および選択される反応条件が（非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することにより無塩基部位を作製し、本明細書で説明した方法で骨格を無塩基部位で切断した後に）得られる断片の近似的大きさを決定するからである。一般的に、好適な断片の大きさは、ヌクレオチド長として、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６５、約７５、約８５、約１００、約１２３、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０もしくはそれ以上である。一部の実施形態において、この断片は、ヌクレオチド長が約２００、約１００、もしくは約５０である。別の実施形態において、群としての断片の大きさは、約５０乃至約２００ヌクレオチドである。特に断片を集団として作製する場合、（切断後の断片の大きさに関係する）非共通ヌクレオチドの組み込みが鋳型によって、また、同じ鋳型でもそのコピー間で異なるので、断片の大きさが近似値であることは理解される。従って、（単一のポリヌクレオチド鋳型などの）同じ出発物質から作製される断片は、異なる（および／または重複する）配列を有し得るが、それでも同じ近似的大きさもしくは大きさ範囲を有する。
ポリヌクレオチド骨格をその無塩基部位で切断した後のあらゆる断片は、切断に用いる作用因子に依存して無塩基部位を欠く最も５’側もしくは最も３’側の断片以外は、（切断が完全に効率的である場合には）１つの無塩基部位を含むことになる。切断を無塩基部位の５’末端側で行う場合、その最も５’側の断片は無塩基部位を含まないことになる。切断を無塩基部位の３’末端側で行う場合、その最も３’側の断片は無塩基部位を含まないことになる。最も５’側の断片中に無塩基部位を組み込むことが所望される場合には、（その合成工程でプライマーが必要とされる場合）、非共通ヌクレオチドを含むプライマーを、本明細書に説明したようにして用いることができ、このプライマー内に生じた無塩基部位を切断することになる。一般に、ホスホジエステル骨格の切断を無塩基残基の５’末端側で行う場合、無塩基部位はプライマー（もしくは、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合プライマーを用いる場合、プライマーのＤＮＡ部分；Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号参照）の５’末端に組み込むべきである。
無塩基部位の標識および検出
無塩基部位を標識することにより、標識を含むポリヌクレオチド（もしくはポリヌクレオチド断片）を作製する。一部の実施形態において、無塩基部位を含むポリヌクレオチド断片を、無塩基部位を標識することができる物質と接触させることにより、このポリヌクレオチドの標識断片を作製する。本明細書に用いている「標識」（「検出可能な部分」とも互換可能に呼ぶ）をポリヌクレオチドと結合させることにより、無塩基部位を含むポリヌクレオチドを標識と結合させる。
従って、一部の実施形態において、この標識は、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子（例えば、酵素、もしくは酸性条件、もしくは化学試薬）で（ポリヌクレオチド鎖内に存在する）非共通ヌクレオチドを処理した後に残存する化学構造と結合する。断片化に係わる実施形態において、この標識は、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子（例えば、酵素、もしくは酸性条件、もしくは化学試薬）で（ポリヌクレオチド鎖内に存在する）非共通ヌクレオチドを処理した後、およびその骨格を無塩基部位で切断することができる作用因子で処理した後に、残存するあらゆる化学構造と結合する。一実施形態において、この標識は、無塩基部位内の反応性アルデヒド型のヘミアセタール環と共有結合する。一部の実施形態において、無塩基部位「において」標識することには、無塩基部位に結合するが、完全な状態の（切断されていない）非共通ヌクレオチドには（これが組み込まれているか単独の非共通ヌクレオチドとして存在しているかに関係なく）結合しない標識が包含される。一部の実施形態において、無塩基部位「において」標識することには、特に、ヌクレオチド（もしくはポリヌクレオチド）のリン酸基または無塩基部位のリン酸基と結合（例えば、共有結合）する標識を含めない。本明細書における開示から明らかなように、「標識」とは、標識系の任意の構成成分のことを意味する。
図１に示した実施形態は、無塩基部位を含むポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することにより切断ポリヌクレオチド断片を作製した後、標識をこの切断断片と共有結合もしくは非共有結合させることによって標識ポリヌクレオチド断片を作製する場合を例示したものである。無塩基部位におけるホスホジエステル骨格の切断および無塩基部位の標識を（例えば、本明細書の実施例４に開示したように）任意の順序で、または同時に実施することができることは理解される。
この標識は検出可能とすることができ、あるいは、例えば、（無塩基残基に結合した）標識が、それ自体が検出される別の部分と共有結合もしくは非共有結合している場合のように、この標識は間接的に検出することができる。例えば、無塩基部位と結合することができる標識にビオチンを結合させることができる。別の例では、（検出可能なように標識することができる）抗体を、無塩基部位に結合している標識に結合させる。一部の実施形態において、この標識は有機分子、ハプテン、もしくは（ポリスチレン・ビーズなどの）粒子を含む。一部の実施形態において、この標識は、抗体結合、ビオチン結合を利用して、または蛍光もしくは酵素活性を介して検出する。一部の実施形態において、この検出可能なシグナルは増幅させる。
概して、無塩基部位の標識は、（無塩基部位を標識することができる物質がこの無塩基部位を特異的もしくは選択的に標識するという意味で）全体的標識、またはは特異的標識、または選択的標識であり、このことにより、標識の約９８％超、約９５％超、約９３％超、約９０％超、約８５％超もしくは約８０％超は無塩基部位に結合する。しかしながら、切断の程度はより低いことがある。従って、特異的な標識についての基準は例示的なものである。一般的に、反応条件は、無塩基部位を標識する反応が完結するように選択する。
一部の実施態様では、（これらのポリヌクレオチド断片の多く、あるいは実質的に全てが単一の無塩基部位を含むという意味で、ホスホジエステル骨格の切断が概して完全であるという程度に）それぞれが単一の標識を含む標識ポリヌクレオチド断片を作製する。この態様は、ハイブリド形成のレベルを定量するのに有用である。何故なら、シグナルは、結合断片数に比例するが、ハイブリド形成している断片の長さもしくは断片当たりの標識数に関係しないからである。従って、概して、ハイブリッド形成の強度は、断片の長さとは無関係に、直接比較することができる。このことは、核酸断片を複数の検出可能部分で標識する従来法、例えば、標識ヌクレオチドの組み込み、および組み込んだヌクレオチドを直接および間接的に検出する他の方法に対して利点となる。一般に、これらの方法ではハイブリッド形成している断片当たり複数の標識が生じるので、定量的な用途には概して余り適していない。核酸当たり複数標識すると、クエンチング、および（核酸当たり複数の標識部分が存在することによる）ハイブリッド形成キネティクスの潜在的な妨害を生じる可能性がある。
別の実施態様として、（３’末端および／または５’末端などの）末端および内部に標識無塩基部位を含む標識断片を作製する。
無塩基部位を標識するための方法および反応条件は当該分野で公知である。例えば、無塩基部位において露出する（従って、標識するのに好適な）代表的官能基は、当該分野で公知の反応条件を用いて標識に共有もしくは非共有結合させることができる高反応性アルデヒド型のヘミアセタール環である。多くの標識は、アルデヒドと容易にイミン結合を形成する置換ヒドラジンもしくはヒドロキシルアミン、例えば、５−（（（２−（カルボヒドラジノ）−メチル）チオ）アセチル）アミノフルオレセイン、アミノオキシアセチルヒドラジド（「ＦＡＲＰ」を含む。ＭａｋｒｏｇｉｏｒｇｏｓのＷＯ ００／３９３４５号を参照されたい。この化合物により形成される安定なオキシムは、蛍光によって直接検出することができ、あるいは、そのシグナルは、抗体−酵素結合体を用いて増幅させることができる。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８年）２７３（３３）：ｐ２１２０３−２０９；Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ，Ｉｎｔｌ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．（１９９８年）７４（ｌ）：ｐ９９−１０９；Ｍａｋｒｏｇｉｏｒｇｏｓの米国特許第６，１７４，６８０号Ｂ１；ＭａｋｒｏｇｉｏｒｇｏｓのＷＯ ００／３９３４５号を参照されたい。（無塩基部位の）アルデヒドと反応する（基体上に存在する）好適な側鎖としては、少なくとも以下のものが挙げられる：（アルデヒドと容易にイミン結合を形成する）置換ヒドラジン、ヒドラジドもしくはヒドロキシルアミン、これらと関連のセミカルバジドおよびチオセミカルバジド基、ならびにその他、安定な炭素−窒素二重結合を形成することができ、切断と結合とを同時に触媒することができるアミン（Ｈｏｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，（１９８８年）１６：ｐ１１５５９−７１参照）または、例えば、還元的アミノ化により、カップリングさせて安定な結合体を形成することができるアミン。無塩基部位内に存在する反応基を標識の反応基と結合させる他の方法については当該分野で公知である。別の例として、無塩基部位を化学的に修飾した後に、この修飾無塩基部位を基体の好適な反応基と共有もしくは非共有結合させることができる。例えば、（無塩基部位内の）アルデヒドを（当該分野で公知の方法により）酸化もしくは還元した後、例えば、還元的アミノ化もしくは種々の酸化方法を用いて、基体に対し共有結合により固定化することができる。
他の好適な試薬についても当該分野で公知であり、例えば蛍光アルデヒド試薬が挙げられる。例えば、Ｂｏｔｕｒｙｎ（１９９９年）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１２：ｐ４７６−４８２を参照されたい。また、Ａｄａｍｅｚｙｋ（１９９８年）Ｂｉｏｏｒｇ，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８（２４）：ｐ３５９９−３６０２；Ａｄａｍｃｚｙｋ（１９９９年）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１（５）：ｐ７７９−７８１；Ｋｏｗ（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２（２）：ｐ１６４−１６９；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ３．２（ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）についても参照されたい。例えば、アミノオキシ基を含む検出可能な部分を利用することができる。Ｂｏｔｕｒｙｎの上記文献を参照されたい。アミノオキシ基は、無塩基部位の高反応性アルデヒド型ヘミアセタール環と容易に反応する。一実施態様として、このアミノオキシ反応基を含む標識は、（モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、ＯＲ、カタログ番号Ａ−１０５５０から入手可能な）Ｎ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジン、トリフルオロ酢酸塩（「ＡＲＰ」）である。例えば、Ｋｕｂｏほか、Ｂｉｏｃｈｅｉｎ ３１：ｐ３７０３−３７０８（１９９２年）；Ｉｄｅほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：ｐ８２７６−８２８３（１９９３年）を参照されたい。
さらに別の例として、ヒドラジド・リンカーを含む標識をアミノオキシ誘導体に変換した後に、これを用い、本明細書で説明したようにして無塩基部位を標識することができる。一実施態様として、この標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５アミノオキシ誘導体試薬を含む。図５に示したように、このＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５アミノオキシ誘導体を用いると、非修飾Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ヒドラジド（製造番号Ａ−２０５０１、モレキュラー・プローブス社、ユージーン、ＯＲ）による標識に比し、標識効率が増大し、蛍光が増強する。
別の例として、（本明細書に説明した方法によるホスホジエステル骨格の切断の前、切断中もしくは切断後に）無塩基部位を化学的に修飾した後に、この修飾無塩基部位を直接または間接的に検出することができる。例えば、蛍光性カダベリンを、Ｈｏｒｎ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，（１９８８年）１６：ｐ１１５５９−７１）の方法により、無塩基部位に組み込むことができる。別の例として、ＮＨＢＡ（０−４−ニトロベンジルヒドロキシルアミン）との反応により無塩基部位を化学的に修飾した後に、このＮＨＢＡ修飾無塩基部位に特異的に結合する抗体を用いて、ＮＨＢＡ修飾無塩基部位を検出する。ＫｏｗほかのＷＯ ９２／０７９５１号（１９９２年）を参照されたい。
別の例として、無塩基部位は、（モノクロナールもしくはポリクロナール抗体または抗原結合断片などの）抗体で標識することができる。特異的な抗体結合を検出する方法は当該分野で公知である。
別の例として、例えば、前記アルデヒドおよび／またはヘミアセタール環の化学構造に特異的な化学もしくは電気化学反応、例えば、酸化反応、デヒドロゲナーゼもしくはオキシダーゼ活性を有する酵素などを用いて検出可能なシグナルを生成させる場合のように、このアルデヒドおよび／またはヘミアセタール環自体を検出することができる。別の例として、多くのアルデヒドが酵素の基質であることにより、アルデヒドの存在下に検出可能な生成物を生成させる。例えば、デヒドロゲナーゼは、通常、アルデヒドの酸化反応とＮＡＤ＋の還元を連結させるが、これを分光光度法で検出することができる。別の例として、グルコース・オキシダーゼは、糖アルデヒドの存在下に過酸化水素を発生させる。この過酸化水素は、適当な基質と共にホースラディッシュ・ペルオキシダーゼにカップリングさせることによって容易に検出することができる。従って、本発明は無塩基部位を検出する方法を提供する。
シグナルの検出方法は当該分野で公知である。シグナルの検出は、目視できるものとすることができ、または分光計、蛍光光度計もしくは顕微鏡など、用いる特定の標識に適した好適な機器を利用することができる。例えば、標識が放射性同位体である場合、例えば、オートラジオグラフィの場合のように、シンチレーション・カウンタもしくは写真用フィルムを用いて検出を行うことができる。蛍光性標識を用いる場合、検出は、適切な波長の光で蛍光色素を励起し、生じた蛍光を、例えば、顕微鏡、目視検査もしくは写真フィルム、蛍光光度計、ＣＣＤカメラ、スキャナーなどにより、検出することにより行うことができる。酵素標識を用いる場合、検出は、酵素の適切な基質を使用し、得られる反応生成物を検出することにより行うことができる。例えば、ｏ−フェニレンジアミンなどのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼの基質の多くは着色生成物を生じる。通常、比色法による（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）単純な標識は、標識に伴う色を目で観察することにより検出することができる；例えば、複合化金コロイドは、ピンク乃至赤みがかった色であり、ビーズはビーズの色に見える。高感度検出に適した機器については当該分野で公知である。
さらに、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成過程で標識ヌクレオチド・アナログを組み込むといったような、当該分野で公知の他の方法を用いてポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド断片を標識することができることは理解されよう。さらに、無塩基部位を含むポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格切断後の５’末端もしくは３’末端に最も近い断片は、（断片化反応を完結させる実施態様の）切断作用因子にもよるが、無塩基部位を欠くことになる。しかしながら、本明細書で説明しているように、その合成工程でプライマーが必要とされる場合、標識プライマーを用いることによって、得られたプライマーを含む断片を標識することができる。好適な標識、およびプライマーの標識方法は公知である。さらに、非共通ヌクレオチドを含むプライマーを用いることができる。無塩基部位を作製し、ホスホジエステル骨格をその無塩基部位で切断し、無塩基部位を標識した後に、このプライマーの少なくとも一部を含む断片を標識することになる。一般に、ホスホジエステル骨格が無塩基残基の５’末端側で切断される場合、無塩基部位はこのプライマー（もしくは、複合プライマーを用いる場合、プライマーのＤＮＡ部分；Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号；米国公開特許第２００３／００８７２５１Ａ１号参照）の５’末端に組み込む必要がある。
標識ポリヌクレオチド断片は、本明細書で説明した方法で、基体に固定化することができる。
核酸の標識方法
本発明は、標識核酸の作製方法を提供する。概して、この方法は、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製し、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子を用いて、ポリヌクレオチド内に存在するこの非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断すること、およびその無塩基部位を標識することにより標識ポリヌクレオチドを作製することを含む。一般に、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、（非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断による無塩基部位の作製後）ポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチドの組み込み部位において標識される。本発明の方法により、例えば、マイクロアレイとのハイブリッド形成その他の本明細書に開示した用途に有用な標識ポリヌクレオチドが作製される。
この方法は、以下の工程を含む：（ａ）少なくとも１種の非共通ヌクレオチド（「非共通デオキシリボヌクレオシド・トリホスフェート」とも言う）の存在下に鋳型からポリヌクレオチドを合成することにより、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する工程；（ｂ）この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子と接触させることにより、無塩基部位を作製する工程；および（ｃ）この無塩基部位を含むポリヌクレオチド内の無塩基部位を標識することにより標識ポリヌクレオチドを作製する工程。本発明の標識方法の一実施態様の概略を図２に示した。
簡単にするために、以下では標識方法の個々の工程を説明するが、本明細書で説明したように、これらの工程が同時に、および／または多様な順序で実施することができることは理解されよう。
（非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成）
この方法は、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型からポリヌクレオチを合成することにより、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製するものである。図２に示した例示的な実施態様は、非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から一本鎖ポリヌクレオチドを合成することによって、非共通ヌクレオチドを含む一本鎖ポリヌクレオチドを作製する場合の例示である。ポリヌクレオチド内に組み込まれた非共通ヌクレオチドの出現頻度は、本発明の方法により作製される標識無塩基部位の出現頻度に関係する。何故なら、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチド間の間隔が標識核酸内の標識部位間のおおよその間隔を決定するからである。
通例、このポリヌクレオチドはＤＮＡであるが、本明細書で述べたように、このポリヌクレオチドは改変および／または修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間結合、リボヌクレオチドなどを含むことができる。本明細書において一般的に用いる場合「ＤＮＡ」はポリヌクレオチド実施態様に当てはまることは理解されよう。
ポリヌクレオチド、例えば、一本鎖および二本鎖ＤＮＡを鋳型から合成する方法は、当該分野では公知であり、本明細書にも記載している。便宜上、本明細書では、ポリヌクレオチドを説明（および例示）するのに「ＤＮＡ」という用語を使用する。
通例、一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチドは、任意に適切な酵素およびプライマーを含むＤＮＡの合成に好適な反応条件で、４種の共通ヌクレオチドの全ておよび少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型から作製される。非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを合成するための反応条件およびプライマーなどの試薬については、当該分野で公知であり、さらに本明細書においても記載している。本明細書で説明したように、通例、非共通ヌクレオチドは、重合させることができ、また、非共通ヌクレオチドの塩基部分を全体的に、もしくは特異的に、または選択的に切断することができる適切な作用因子を用いた処理により無塩基化することができる。好適な非共通ヌクレオチドは、当該分野で公知であり、本明細書においても記載している。一部の実施態様として、この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、単一プライマー等温増幅法（Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号、ＫｕｒｎのＷＯ０２／００９３８号および／またはＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ（Ｋｕｒｎ、米国公開特許第２００３／００８７２５１ Ａ１号）参照）を用いて合成される。
非共通ヌクレオチドの組み込みを限定および／または制御するための条件については当該分野で公知であり、本明細書においても記載している。得られる非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内の非共通塩基の出現頻度（もしくは割合）、従って、標識ポリヌクレオチド内の標識の出現頻度は、当該分野で公知の変動要素、例えば、鋳型内の非共通ヌクレオチド（類）に相当するヌクレオチド（類）の出現頻度（その他、平均Ｇ−Ｃ含量などの配列のヌクレオチド含量の大きさ）、反応混合物中の非共通ヌクレオチドに対する共通ヌクレオチドの比率；ポリメラーゼの非共通ヌクレオチド組み込み能、共通ヌクレオチドに対する非共通ヌクレオチドの相対的組み込み効率などによって支配される。
概して、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、この合成したポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチド（類）の組み込み部位において（即ち、本明細書に説明したように、無塩基部位において）標識される。従って、一般に、合成したポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチドの出現頻度は、標識したポリヌクレオチド内の標識の出現頻度を決定する。通例、非共通塩基は、得られる非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内にほぼ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６５、７５、８５、１００、１２３、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０ヌクレオチドもしくはそれ以上の間隔ごとに組み込まれることができる。一実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約５００ヌクレオチドごとに組み込まれる。一実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約１００ヌクレオチドごとに組み込まれる。別の実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約５０ヌクレオチドごとに組み込まれる。別の実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約５０乃至２００ヌクレオチドごとに組み込まれる。これらの長さが、概して、本発明の方法により作製されるポリヌクレオチドの集団における平均的な大きさを表すことについては、理解されよう。
概して、合成方法は（本明細書に説明したように）鋳型依存性である。しかしながら、本明細書に説明したように、鋳型非依存性の方法（例えば、連結反応、テーリング）を用いる結果として、非共通ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むことができることは理解されよう。
この鋳型は、作製が望まれる標識ポリヌクレオチドからの任意の鋳型とすることができる。この鋳型としては、本明細書に説明したように、任意の精製もしくは未精製原料からの二本鎖、部分的二本鎖および一本鎖の核酸が挙げられる。
簡単にするために、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを単一の核酸として説明する。しかしながら、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、例えば逆転写、第１および第２鎖ｃＤＮＡ産生、または単一サイクルのＮＡ複製により作製されるような単一の核酸とすることができることは理解されよう。また、このポリヌクレオチドは、（少数乃至極めて多数の）増幅産物の集団、例えば、単一プライマー等温増幅法および／またはＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）を用いて作製される一本鎖ＤＮＡ産物の集団（Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号；Ｋｕｒｎ、米国公開特許第２００３／００８７２５１ Ａ１号参照）、あるいは、例えばＰＣＲによって作製される二本鎖ＤＮＡ産物の集団とすることができる。さらに、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを多様な（低分子から極めて大きな分子までの）種々のポリヌクレオチド分子とすることができることも理解されよう。このような集団は、配列が類縁のもの（例えば、遺伝子ファミリーもしくはスーパーファミリーの構成員）または配列が極めて異なるもの（例えば、全ｍＲＮＡから作製したもの、全ゲノムＤＮＡから作製したもの、など）とすることができる。また、ポリヌクレオチドは、（例えば、コーディング領域、ゲノム部分などの公知遺伝子の一部もしくは全部とすることができる）単一配列に相当するものとすることができる。特定のポリヌクレオチド配列および多様なポリヌクレオチド配列を作製するための方法、試薬ならびに反応条件については、当該分野では公知である。
（非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断による無塩基部位の作製）
非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（本明細書中に記載のように、鋳型から合成）を、非共通ヌクレオチドの塩基部分を全体的に切断し得るか、特異的に切断し得るか、または選択的に切断し得る作用因子（例えば、酵素）を用いて処理することにより、無塩基部位を作製する。図２に示した実施形態は、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することによる無塩基部位の作製を例示する。幾つかの実施形態において、作用因子（例えば、酵素）は、非共通ヌクレオチドの塩基部分と非共通ヌクレオチド内の糖との間の結合の加水分解を触媒して、ヘミアセタール環を含み塩基を欠く無塩基部位（相互交換可能に「ＡＰ」という）を作製するが、その他の切断産物を本発明の方法に使用することを企図している。非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断するための好適な作用因子および反応条件は、当該分野で公知であり、本明細書において記載される。一実施形態において、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを用いて非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する。
概して、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断は、全体的切断、特異的切断、または選択的切断であり、これにより、切断される塩基部分の約９８％超、約９５％超、約９０％超、約８５％超もしくは約８０％超は非共通ヌクレオチドの塩基部分である。しかしながら、切断の程度はより低くてもよい。従って、特異的な切断についての基準は例示的なものである。全体的切断、特異的切断、または選択的切断は、本発明の標識ポリヌクレオチドを作製する方法において潜在的標識部位の数（従って、標識の強度）を制御するために望ましい。概して、反応条件は、無塩基部位を作製する反応が完結し得るように選択される。
便宜上、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成と、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し得る酵素によるこのポリヌクレオチドの切断とを別々の工程として説明する。非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが（増幅の指数的方法（例えば、ＰＣＲ）において）更なる増幅の鋳型として寄与し得る必要がある場合を（概して）除いて、これらの工程を同時に実施し得ることが、理解される。
（無塩基部位の標識および検出）
無塩基部位を標識することにより、検出可能な部分を含むポリヌクレオチド（もしくはポリヌクレオチド断片）を作製する。図２に示した実施形態は、無塩基部位を含む一本鎖ポリヌクレオチドの無塩基部位を標識することによる標識ポリヌクレオチドの作製を例示したものである。本明細書中で用いられる場合、「検出可能な部分」（相互交換可能に「標識」と呼ぶ）とは、無塩基部位を含むポリヌクレオチドが検出可能なシグナルと関連づけられるようなポリヌクレオチド内無塩基部位と物質との共有結合もしくは非共有結合（相互交換可能に「標識すること」と呼ぶ）を意味する。従って、幾つかの実施形態において、この検出可能な部分（標識）は、無塩基部位と共有結合もしくは非共有結合させる。幾つかの実施形態において、この検出可能な部分（標識）は、直接もしくは間接的に検出可能である。幾つかの実施形態において、この検出可能なシグナルは増幅される。幾つかの実施形態において、この検出可能な部分は有機分子を含む。他の実施形態において、この検出可能な部分は抗体を含む。他の実施形態において、この検出可能なシグナルは蛍光性である。他の実施形態において、この検出可能なシグナルは、酵素的に産生される。他の標識化実施形態もまた、本明細書中に記載される。
概して、無塩基部位の標識は、全体的標識、特異的標識、または選択的標識であり（無塩基部位を特異的に、もしくは選択的に標識することができる物質がこの無塩基部位を標識するという意味で）、これにより、標識の約９８％超、約９５％超、約９３」％超、約９０％超、約８５％超もしくは約８０％超は無塩基部位に結合する。しかしながら、切断の程度はより低くてもよい。従って、特異的な標識についての基準は例示的なものである。概して、反応条件は、無塩基部位を標識する反応が完結するように選択される。
無塩基部位を全体的に標識するか、特異的に標識するか、または選択的に標識するための方法および反応条件は当該分野で公知であり、本明細書中に記載される。概して、ホスホジエステル骨格の切断をもまた生じる無塩基部位の標識方法は、切断と標識とを同時に行うことが所望されない限り、避けるべきである（例えば、Ｈｏｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８８年）１６：ｐ１１５５９−７１参照）。
幾つかの実施形態において、それぞれが単一の標識を含む標識ポリヌクレオチド断片を（多くの、あるいは実質的に全てのポリヌクレオチド断片が単一の無塩基部位を含むという意味で、ホスホジエステル骨格の切断が概して完全であるという程度に）作製する。別の実施形態において、（３’末端および／または５’末端のような）末端および内部に標識無塩基部位を含む標識断片を作製する。
検出可能なシグナルを検出する方法は当該分野で公知であり、本明細書において記載される。シグナルの検出は、目視できるものであり得るか、または分光計、蛍光光度計もしくは顕微鏡など、用いる特定の標識に適した好適な機器を利用し得る。例えば、標識が放射性同位体である場合、例えば、オートラジオグラフィの場合のように、シンチレーション・カウンタもしくは写真用フィルムを用いて検出を達成し得る。蛍光性標識を用いる場合、検出は、適切な波長の光で蛍光色素を励起し、生じた蛍光を、例えば、顕微鏡、目視検査もしくは写真フィルムなどによって検出することにより行い得る。酵素標識を用いる場合、検出は、酵素の適切な基質を提供し、得られる反応生成物を検出することにより行い得る。通常、比色法による（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）単純な標識は、標識に伴う色を目で観察することにより検出され得る；例えば、複合化金コロイドは、多くの場合、ピンクから赤みがかった色であり、ビーズはビーズの色に見える。
例えば、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成過程で標識ヌクレオチド・アナログを組み込むような、当該分野で公知の他の方法を用いてポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをさらに標識し得ることが理解される。その合成工程でプライマーが必要とされる場合、標識プライマーを用い得る。好適な標識およびプライマーを標識する方法は公知である。さらに、非共通ヌクレオチドを含むプライマーを用い得る。無塩基部位を作製し、ホスホジエステル骨格をこの無塩基部位で切断し、無塩基部位を標識した後に、プライマーを標識する。
標識ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のように、基体に固定化され得る。
（基体に固定化したポリヌクレオチド（もしくはその断片）の作製方法）
本発明は、基体（本明細書中で相互交換可能に「表面」と呼ぶ）に固定化したポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド断片の作製方法を提供する。概して、本方法は、無塩基部位を含むポリヌクレオチドもしくは（断片化に係わる実施形態において）その断片を、その無塩基部位で基体に固定化することを含む。幾つかの実施形態において、この方法は、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し得る作用因子を用いた、ポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断であって、これにより、無塩基部位を作製し、必要に応じて、このポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することによりこの合成核酸の断片を作製し、およびこのポリヌクレオチドもしくはその断片を基体上に固定化し、このポリヌクレオチドもしくはその断片はこの無塩基部位で固定化される、切断を提供する。必要に応じて、無塩基部位を含むポリヌクレオチドは、本明細書に記載の標識方法により、無塩基部位において標識され得る。固定化断片の標識は、（例えば、内部の無塩基部位を標識する場合、もしくはポリヌクレオチド末端の無塩基部位を標識する場合のように）どの位置でも行い得る。該して、無塩基部位を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド内の無塩基部位において固定化される。従って、前述のように、この合成ポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチドの出現頻度は、概して、基体への固定化に利用可能な無塩基部位の数（およびホスホジエステル骨格の切断に係わる実施形態における、ポリヌクレオチドから作製した断片の大きさの範囲）を決定する。本発明の方法は、基体（例えば、マイクロアレイ）に固定化したポリヌクレオチドおよびその断片を作製する。幾つかの実施形態において、１箇所以上の無塩基部位を（本明細書に記載のように）標識し、１箇所以上の無塩基部位を基体に固定化する。
本方法は、以下の工程を包含する：（ａ）共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断し得る酵素と接触させることにより、無塩基部位を作製する工程、（ｂ）必要に応じて、この無塩基部位でホスホジエステル骨格を切断し、これにより、この合成ヌクレオチドの断片を作製する工程、（ｃ）必要に応じて、この無塩基部位でポリヌクレオチドを標識する工程、および（ｄ）このポリヌクレオチド（もしくはポリヌクレオチド断片）を基体に固定化し、このポリヌクレオチドは無塩基部位を介して基体に固定化される工程。幾つかの実施形態において、非共通ヌクレオチドを含むこのポリヌクレオチドは、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下で鋳型から合成される。幾つかの実施形態において、非共通ヌクレオチドを含むこのポリヌクレオチドは、単一プライマー等温増幅法またはＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）を用いて合成される。Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９ 号Ｂ１、Ｋｕｒｎの世界特許第ＷＯ０２／００９３８号およびＫｕｒｎの米国公開特許第２００３／００８７２５１ 号Ａ１を参照されたい。本発明の固定化方法の一実施形態の概略を図３に示した。
簡単にするために、以下ではこの方法の個々の工程を説明するが、本明細書中で考察したように、これらの工程が同時に、および多様な順序で実施され得ることが、理解される。また、本発明が、最初の、即ち、第１の工程が本明細書中に記載の任意の工程である方法を含むことが、理解される。例えば、この方法は、無塩基部位を含むポリヌクレオチドもしくは無塩基部位を含むポリヌクレオチド断片を、本明細書中に記載されるように、基体に固定化する実施形態を含む。
（非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの作製）
幾つかの実施形態において、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、本明細書中で考察されるように、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドの存在下で、鋳型から合成される。図３に示した実施形態は、非共通ヌクレオチドの存在下で、鋳型から一本鎖ポリヌクレオチドを合成することによる非共通ヌクレオチドを含む一本鎖ポリヌクレオチドの作製を例示するが、本発明の方法により、他の実施形態が企図される。テーリング、連結反応、オリゴヌクレオチド合成など、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する他の方法が、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版；Ａｕｓｅｂｅｌ（１９８７、および改訂版）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」を参照されたい。
概して、このポリヌクレオチドはＤＮＡであるが、本明細書で述べたように、このポリヌクレオチドは改変および／または修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間結合、リボヌクレオチドなどを含み得る。本明細書中で一般的に用られいる場合、「ＤＮＡ」は、ポリヌクレオチド実施形態に当てはまることが、理解される。
ポリヌクレオチド、例えば一本鎖および二本鎖ＤＮＡを合成する方法は、当該分野で周知であり、鋳型依存性の方法および鋳型非依存性の方法が、挙げられる。鋳型依存性の方法の例としては、例えば、単一プライマー等温増幅法、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）法、ＰＣＲ法、逆転写法、プライマー伸長法、限定（ｌｉｍｉｔｅｄ）プライマー伸長法、（ローリングサークル複製法を含む）複製法、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、ニック・トランスレーション法、および例えば、鋳型配列の相補体の合成を生じることにより、少なくとも１種の非共通ヌクレオチドをポリヌクレオチド内に組み込ませ得る任意の方法が挙げられる。例えば、Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９号Ｂ１、Ｋｕｒｎの世界特許第ＷＯ０２／００９３８号、Ｋｕｒｎの米国公開特許第２００３／００８７２５１号Ａ１、Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，５８２，８７７号、Ｗａｌｌａｃｅの米国特許第６，０２７，９２３号、および米国特許第５，５０８，１７８号、同第５，８８８，８１９号、同第６，００４，７４４号、同第５，８８２，８６７号、同第５，７１０，０２８号、同第６，０２７，８８９号、同第６，００４，７４５号、同第５，７６３，１７８号、同第５，０１１，７６９号、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版；Ａｕｓｅｂｅｌ（１９８７年、および改訂版）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」；Ｍｕｌｌｉｓ，（１９９４年）「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」を参照されたい。一実施形態において、単一プライマー等温増幅法および／またはＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）法を使用し、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを合成する。Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９号Ｂ１、Ｋｕｒｎの世界特許第ＷＯ０２／００９３８号およびＫｕｒｎの米国公開特許第２００３／００８７２５１号Ａ１を参照されたい。鋳型非依存性の方法としては、本明細書に記載したオリゴヌクレオチド合成、連結反応およびテーリングが挙げられる。
好適な方法としては、非共通ヌクレオチドを含む一本鎖もしくは二本鎖（または部分的二本鎖）ポリヌクレオチドを生じる方法（例えば、逆転写法、二本鎖ｃＤＮＡの作製法、単一ラウンドのＤＮＡ複製法）、および複数の一本鎖もしくは二本鎖コピーまたは鋳型の相補体のコピーが得られる方法（例えば、単一プライマー等温増幅、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）またはＰＣＲ）が挙げられる。Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９号Ｂ１、Ｋｕｒｎの世界特許第ＷＯ０２／００９３８号およびＫｕｒｎの米国公開特許第２００３／００８７２５１号Ａ１を参照されたい。非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製するには当該分野で公知の１つ以上の方法を用いることができる。非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖、例えば、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、もしくは部分的二本鎖であり得、そして二本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれの鎖が非共通ヌクレオチドを含み得ることが、理解される。便宜上、本明細書では、「ＤＮＡ」は、本明細書中で、ポリヌクレオチドを説明（および例示）するために使用される。
非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを産生するための反応条件およびプライマーを含む試薬は、当該分野で公知であり、本明細書において記載される（例えば、本明細書中に記載されるように、無塩基部位を含むポリヌクレオチドを合成する方法を参照されたい）。
概して、無塩基部位を含むこのポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるように、その無塩基部位において基体に固定化される。従って、ポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチドの出現頻度は、（非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断後、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内に）形成される無塩基部位の出現頻度に関係し、従って、本発明の方法によりポリヌクレオチドを固定化するために有用（もしくは利用可能な）無塩基部位を含むポリヌクレオチド内の無塩基部位の数に関係する。概して、非共通塩基は、得られる非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内にほぼ５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６５個、７５個、８５個、１００個、１２３個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、もしくはそれ以上のヌクレオチドの間隔ごとに組み込まれ得る。一実施形態において、この非共通ヌクレオチドは、約５００ヌクレオチドごとに組み込まれる。一実施形態において、この非共通ヌクレオチドは、約１００ヌクレオチドごとに組み込まれる。別の実施形態において、この非共通ヌクレオチドは、約５０ヌクレオチドごとに組み込まれる。さらに別の実施形態において、この非共通ヌクレオチドは、約５０〜２００ヌクレオチドごとに組み込まれる。これらの長さが、概して、本発明の方法を試用して作製されるポリヌクレオチド（もしくは断片化に係わる実施形態においてこれらの断片）の集団における平均的な長さを表すことが、理解される。
一部の実施態様として、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、この合成ポリヌクレオチド内に存在する非共通ヌクレオチドにおいて（即ち、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断後に生じる無塩基部位において）切断される。従って、このポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチドの出現頻度は、通常、このポリヌクレオチドから作製される断片の大きさの範囲を決定する。通例、非共通ヌクレオチドは、得られる非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内にほぼ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６５、７５、８５、１００、１２３、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０ヌクレオチドもしくはそれ以上の間隔ごとに存在し得る。一実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約５００ヌクレオチドごとに組み込まれる。一実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約１００ヌクレオチドごとに組み込まれる。別の実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約５０ヌクレオチドごとに組み込まれる。さらに別の実施態様として、この非共通ヌクレオチドは、約５０〜約２００ヌクレオチドごとに組み込まれる。これらの長さが、概して、本発明の方法により作製されるポリヌクレオチド（もしくは断片化に係わる実施態様としてのこれらの断片）の集団における平均的な長さを表すことが、理解される。非共通ヌクレオチドの組み込みを限定および／または制御するための条件については当該分野で公知であり、本明細書に記載される。得られる非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内の非共通塩基の出現頻度（もしくは割合）、従って、本発明の方法により（即ち、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断およびホスホジエステル結合の非共通ヌクレオチドにおける切断により）作製した断片の平均の大きさは、当該分野で公知の変動要素、例えば、鋳型内の非共通ヌクレオチド（単数または複数）に相当するヌクレオチド（単数または複数）の出現頻度（または、平均Ｇ−Ｃ含量などの配列のヌクレオチド含量の他の測定）、反応混合物中に存在する非共通ヌクレオチドに対する共通ヌクレオチドの比率；ポリメラーゼの非共通ヌクレオチド組み込み能、共通ヌクレオチドに対する非共通ヌクレオチドの相対的組み込み効率などによって支配される。この反応条件は、例えば、本明細書に述べた本発明の方法を用いて得られた平均断片サイズを評価することにより、実験的に決定することができる。
鋳型は、本明細書に説明したように、固定化ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド断片）の作製のために所望される任意の鋳型であり得る。
簡単にするために、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを単一の核酸として説明する。しかしながら、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、例えば逆転写法、第１および第２鎖ｃＤＮＡ産生法、または単一サイクルのＮＡ複製法により作製されるような単一の核酸とすることができることは理解される。また、このポリヌクレオチドは、（少数乃至極めて多数の）増幅産物の集団、例えば、単一プライマー等温増幅法および／またはＲｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭを用いて作製される一本鎖ＤＮＡ産物の集団（Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１号；Ｋｕｒｎ、米国公開特許第２００３／００８７２５１ Ａ１号参照）、あるいは、例えばＰＣＲによって作製される二本鎖ＤＮＡ産物の集団とすることができる。さらに、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを多様な（低分子から極めて大きな分子までの）種々のポリヌクレオチド分子とすることができることが理解される。このような集団は、配列が類縁のもの（例えば、遺伝子ファミリーもしくはスーパーファミリーのメンバー）または配列が極めて異なるもの（例えば、全ｍＲＮＡから作製したもの、全ゲノムＤＮＡから作製したもの、など）とすることができる。また、ポリヌクレオチドは、（例えば、コード領域、ゲノム部分などの公知遺伝子の一部もしくは全部とすることができる）単一配列に相当するものとすることができる。特定のポリヌクレオチド配列および多様なポリヌクレオチド配列を作製するための方法、試薬ならびに反応条件については、当該分野では公知である。
（無塩基部位を含むポリヌクレオチドの作製）
無塩基部位を含むポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法（たとえば、Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ． Ｂｉｏｌ．（１９９８年）７４（１）：９９−１０９）、および本明細書に開示した方法を用いて作製することができる。通例、（本明細書に記載される通り、鋳型から合成することができる）非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドの塩基部分を全体的もしくは特異的または選択的に切断することができる酵素で処理して無塩基部位を作製する。図３に示した実施態様は、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断による無塩基部位の作製を例示したものである。通例、酵素などの作用因子は、非共通ヌクレオチドの塩基部分と非共通ヌクレオチド内の糖との間の結合の加水分解を触媒して、ヘミアセタール環を含み、塩基を欠く無塩基部位（交換可能に「ＡＰ」部位とも言う）を作製するが、その他の切断産物も本発明の方法に使用することを企図している。非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断するための好適な作用因子および反応条件については当該分野で公知であり、本明細書においても記載している。
通例、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断は、全体的、もしくは特異的、または選択的切断であり、このことにより、切断される塩基部分の約９８％超、約９５％超、約９０％超、約８５％超もしくは約８０％超は、非共通ヌクレオチドの塩基部分である。しかしながら、切断の程度はより低くあり得る。従って、特異的な切断についての基準は例示的なものである。ポリヌクレオチド断片の作製に係わる実施態様として、特異的または選択的に切断することは、本発明の固定化ポリヌクレオチド断片（即ち、無塩基部位でホスホジエステル骨格を切断することにより生じる断片）を作製する方法において断片の大きさを制御するのに望ましい。通例、反応条件は、無塩基部位を作製する反応が完結し得るように選択する。
便宜上、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成と、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素によるこのポリヌクレオチドの切断とを別々の工程として説明する。これらの工程が、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが（増幅の指数的方法、例えば、ＰＣＴの場合のように）更なる増幅の鋳型として働き得る必要がある場合を（通例）除いて、同時に実施することができることは理解される。
（無塩基部位を含むポリヌクレオチドの無塩基部位におけるホスホジエステル骨格の切断）
一部の実施態様として、ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を、無塩基部位で骨格を切断することができる作用因子を用いてその無塩基部位で切断することにより、ポリヌクレオチド断片を作製する。図３に示した実施態様は、無塩基部位を含むポリヌクレオチドの無塩基部位の５’末端のすぐ近くで骨格を切断することによる切断断片の作製を例示したものである。骨格の無塩基部位における切断については本明細書中で説明している。骨格を切断するための好適な酵素および／または反応条件については当該分野で周知であり、本明細書に記載している。
本明細書で述べたように、ポリヌクレオチド内への非共通ヌクレオチドの組み込みの発現頻度は、本発明の方法を用いて作製される断片の大きさに関係する。何故なら、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド内の非共通ヌクレオチド間の間隔は、（本明細書に開示した方法により、非共通ヌクレオチドから無塩基部位を作製し、この非共有ヌクレオチド（無塩基部位とも呼ばれる）の組み込み部位においてホスホジエステル主鎖を切断した後に）得られる断片のおよその大きさを決定づけるからである。通例、好適な断片の大きさは、ヌクレオチド長として、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６５、約７５、約８５、約１００、約１２３、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０もしくはそれ以上である。特に断片を集団として作製する場合、（切断後の断片の大きさに関係する）非共通ヌクレオチドの組み込みが鋳型によって、そして、同じ鋳型のコピー間で異なり、断片の大きさが平均であることは理解されよう。従って、同じ出発物質から作製される断片は、異なる（および／または重複する）配列を有し得、一方、それでもおよその大きさもしくは大きさの範囲は同じである。
通例、無塩基部位における骨格の切断は、（無塩基部位で骨格を特異的にまたは選択的に切断することができる（酵素などの）作用因子が特定の非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断するという意味で）全体的、特異的、または選択的切断であり、このことにより、切断の約９８％超、約９５％超、約９０％超、約８５％超もしくは約８０％超は無塩基部位において行われる。しかしながら、切断の程度はより低いことがある。従って、特異的な切断についての基準は例示的なものである。通例、骨格の無塩基部位の約９８％、約９５％、約９０％、約８５％もしくは約８０％が切断されるが、切断の程度がより少ない（このため、未切断の無塩基部位を含む断片を生じる）ことがある。一部の実施態様として、無塩基部位を（本明細書に記載した通り基体に固定する前もしくは後で）標識する。
（無塩基部位の標識）
一部の実施態様として、ポリヌクレオチドもしくはその断片は無塩基部位において標識する。標識方法は、本明細書に記載した通りである。本明細書の開示から明らかなように、標識および断片化工程、もしくは標識および固定化工程、または標識および固定化ならびに断片化工程が任意の順序により、または同時に実施することができることが理解される。
（無塩基部位を含むポリヌクレオチドの基体への固定化）
無塩基部位を含むポリヌクレオチドを作製した後、このポリヌクレオチド（または、その骨格を切断した場合は、ポリヌクレオチド断片）をその無塩基部位において基体に固定化する。骨格の無塩基部位における切断（による合成核酸の断片の作製）に係わる実施態様として、切断断片をその切断無塩基部位において基体に固定化する。図３は、ポリヌクレオチド断片をその切断無塩基部位において基体に固定化する実施態様を図示したものである。ポリヌクレオチドの固定化は、例えば、被分析物をタグ化し、またはマイクロアレイを作製するのに有用である。一本鎖ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド断片を含む）は、一本鎖ポリヌクレオチドを含むマイクロアレイの作製に特に適している。（ホスホジエステル骨格の無塩基部位における切断に係わる実施態様としての）一本鎖ポリヌクレオチド断片は有利である。何故なら、ホスホジエステル骨格を切断することによって無塩基部位を断片の３’末端もしくは断片の５’末端に配置するのに用いる方法を選択することにより、（この断片を固定化する）基体に対するこの断片の位置付けを制御することができるからである。特定の配置（例えば、３’末端、５’末端）でポリヌクレオチドを固定化すると、相補性オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成が向上し、より高密度の固定化が可能になる。
無塩基部位を含むポリヌクレオチドは、以下のようにして、即ち、通例、無塩基部位内に存在する反応基を基体上に存在する反応基に共有もしくは非共有結合させることができる試薬を用いて、基体に固定化する。例えば、無塩基部位において露出する（従って、標識における使用のために好適な）代表的官能基は、当該分野で公知の反応条件を用いて適当な基体の反応基に共有もしくは非共有結合することができるヘミアセタール環のアルデヒドである。（無塩基部位の）アルデヒドと反応する（基体上に存在する）好適な側鎖としては、少なくとも以下のものが挙げられる：（アルデヒドと容易にイミン結合を形成する）置換ヒドラジン、ヒドラジドもしくはヒドロキシルアミン、これらと関連のセミカルバジドおよびチオセミカルバジド基、ならびにその他の、安定な炭素−窒素二重結合を形成することができ、切断と結合とを同時に触媒することができるアミン（Ｈｏｒｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．，（１９８８）１６：１１５５９−７１を参照のこと）または、例えば、還元的アミノ化により、カップリングさせて安定な結合体を形成することができるアミン。
ポリヌクレオチドを固定化する基体は、当該分野で公知の方法を用いて、適切な反応基により機能化することができる。例えば、固体もしくは半固体の基体（例えば、シリコンもしくはスライド・ガラス）を、ヒドラジン、ヒドラジドもしくはアミン誘導体化基質（例えば、セミカルバジド）を含むポリマー（例えば、ポリアクリルアミド、デキストラン、アクリルアミドもしくはラテックス）で被覆することができる。適切な反応基により基体を機能化する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｌｕｋｔａｎｏｖの米国特許第６，３３９，１４７号；Ｖａｎ Ｎｅｓｓの米国特許第５，６６７，９７６号；バングズ・ラボラトリーズ社（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のＴｅｃｈＮｏｔｅ２０５（ｂａｎｇｓｌａｂｓ．ｃｏｍから入手可能）；Ｇｈｏｓｈ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８９）１７８：４３−５１；Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９１：１−８；Ｗｉｌｃｈｅｋ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８７）１３８：４２９−４４２；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８９）１８１：１８２−１８９；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９５）６：１５０−１６５、およびこれらに引用されている文献に開示されている。
これらの反応を行うための方法および反応条件は当該分野で公知である。例えば、Ｌｕｋｔａｎｏｖの米国特許第６，３３９，１４７号；Ｖａｎ Ｎｅｓｓの米国特許第５，６６７，９７６号；バングズ・ラボラトリーズ社のＴｅｃｈＮｏｔｅ２０５（ｂａｎｇｓｌａｂｓ．ｃｏｍから入手可能）；Ｇｈｏｓｈ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８９）１７８：４３−５１；Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９１：１−８；Ｗｉｌｃｈｅｋ， ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ（１９８７）１３８：４２９−４４２；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８９）１８１：１８２−１８９；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９５）６：１５０−１６５、およびこれらに引用されている文献を参照のこと。無塩基部位を標識する方法に関して本明細書に同様な化学反応（即ち、標識の適切な反応基に無塩基部位の反応基を共有もしくは非共有結合させる実施態様）を記載していることは了解されよう。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（３３）：２１２０３−２０９；Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ， Ｉｎｔ Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｂｉｏｌ．（１９９８）７４（１）：９９−１０９；Ｍａｋｒｉｏｇｉｏｒｇｏｓの米国特許第６，１７４，６８０号Ｂ１；ＭａｋｒｏｇｉｏｒｇｏｓのＷＯ００／３９３４５を参照のこと。
別の例として、無塩基部位を化学的に修飾し得、次いでこの修飾無塩基部位を基体の適切な反応基に共有もしくは非共有結合される。例えば、（無塩基部位内の）アルデヒドを（当該分野で公知の方法により）酸化もしくは還元し得、次いで、例えば、還元的アミノ化もしくは種々の酸化方法を用いて、基体に対し共有結合により固定化される。
基体は多くの物質で構成することができるが、これらは、多くの化学反応基のうちの任意の基を固定化する能力（または、一部の実施態様では、誘導体化して固定化する能力）、および無塩基部位を含むポリヌクレオチドを固定化するのに用いる合成化学物質との適合性によって主に限定される。この基体は、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、金属などの他の物質で作ることができる固体もしくは半固体の支持体とすることができる。本明細書に説明したように、この基体は、機能化し、必要な場合、（無塩基部位を共有結合もしくは非共有結合により固定化する）適切な反応基を付加することができる。また、このポリヌクレオチドは、紙、ガラス、プラスチック、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、光ファイバーまたは任意の他の適切な固体もしくは半固体（例えば、本明細書中に記載されるように基体を適切に機能化することができるようなポリアクリルアミド・ゲルの薄層（Ｋｈｒａｐｋｏら、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（１９９１），１：３７５−３８８））を含む基体上にマトリックスとしてスポットすることができる。
アレイは、平面状の基体面に二次元マトリクスとして構築することができ、あるいはピン、棒材、ファイバー、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイター・ウェル、キャピラリ、シリンダ、ならびに鋳型分子のハイブリッド形成および検出に適した他の任意の配列物を含む三次元構造を有するものとすることができる。一実施態様として、ポリヌクレオチド（もしくはその断片）が固定化される基体は、磁性のビーズもしくは粒子である。別の実施態様として、固体の基体は光ファイバーを含む。さらに別の実施態様として、ポリヌクレオチドは、キュピラリ内の流体相に分散させ、これを今度は、固体相に対して固定化する。
別の実施態様として、基体は、ポリペプチド、蛋白質、ペプチド、炭水化物、細胞、微生物、およびこれらの断片および産物、有機分子、無機分子、担体分子、ＰＥＧ、アミノ−デキストラン、炭水化物、超分子集合体、細胞小器官、細胞、微生物、有機分子、無機分子、あるいは無塩基部位を含むポリヌクレオチドの固定化部位が天然に存在し、作製され得（例えば、基体を機能化あるいは修飾することにより）、または形成され得る任意の物質を含む。１実施形態にて、この基体は、ポリヌクレオチドである。
この基体は被分析物とすることができる。代表的な被分析物としては、抗体、（酵素を含む）蛋白質、ペプチド、核酸分子もしくはそのセグメント、担体分子、ＰＥＧ、アミノ−デキストラン、炭水化物、超分子集合体、細胞小器官、細胞、微生物、有機分子、無機分子、あるいは無塩基部位を含むポリヌクレオチドの固定化部位が天然に存在し、もしくは（例えば、この被分析物を機能化することにより）作製され得、または形成され得る任意の物質を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
基体を結合対のメンバーとすることができることは理解されよう。結合対の例としては、蛋白質：蛋白質結合対、および蛋白質：抗体結合対が挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様として、ポリヌクレオチド（もしくはその断片）は、基体の分子ライブラリ、例えば、化合物の分子ライブラリ、ファージペプチドディスプレイライブラリ、もしくは抗体ライブラリに固定化（してタグ化）する。
一部の実施態様として、（ポリヌクレオチドを固定化する）基体を酵素とすることによって、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成の検出を向上させる。例えば、酵素に固定化したポリヌクレオチドはマイクロアレイとハイブリッド形成させることができ、ハイブリッド形成させたポリヌクレオチドは、このマイクロアレイを特定の基体と接触させることにより検出することができる。
また、無塩基部位におけるホスホジエステル骨格の切断（によるこの合成核酸の断片の作製）に係わる本発明の実施態様として、切断断片は、核酸を基体に固定化するための当該分野で公知の任意の方法を用いて基体に固定化することもできる。
例えば、一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチド断片（通常一本鎖）は、固体もしくは半固体の支持体または基体に固定化することができ、この支持体または基体は、例えば、プラスチック、セラミック、金属、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルソエステル、ポリプロピルフマレート、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸、ならびに他の物質で作ることができる。基体は、ゲル、膜、薄膜、ガラス、平板、シリンダ、ビーズ、磁性ビーズ、光ファイバー、繊維織物、マイクロタイターウェル、キャピラリなどのような二次元もしくは三次元の形状とすることができる。例えば、ポリヌクレオチド断片は、このポリヌクレオチド断片にあり共有結合により基体に固定化されることになる反応基と共有結合を形成する反応基で被覆したスライドガラスなどの固体もしくは半固体の基体と接触させることができる。
ヌクレオチド断片を含むマイクロアレイは、Ｂｉｏｄｏｔ（バイオドット社（ＢｉｏＤｏｔ，Ｉｎｃ．）、アーバイン（Ｉｒｖｉｎｅ）、ＣＡ）スポッティング装置およびアルデヒド被覆スライドガラス（ＣＥＬアソシエーツ社（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、ヒューストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ）、ＴＸ）を用いて作製することができる。ポリヌクレオチド断片は、適切な官能基化を行った後、無塩基部位における目的とする他の反応の妨害が起こらないように注意を払うという条件で、報告されている方法（Ｓｃｈｅｎａほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９５年）９３：ｐ１０６１４−１０６１９）により処理したアルデヒド被覆スライド上にスポッティングすることができる。また、アレイは、ロボットシステムにより、ガラス、ナイロン（Ｒａｍｓａｙ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８年），１６：ｐ４０−４４）、ポリプロピレン（Ｍａｔｓｏｎほか、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５年），２２４（１）：ｐ１１０−６）およびシリコンスライド（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．、Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８年），１６：ｐ２７−３１）上にプリントすることができる。アレイ構築の他の方法としては、電場内への精密微量分注（ｆｉｎｅ ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）（Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｈｏｄｇｓｏｎの上記文献）、およびポジティブに被覆した平板へのポリヌクレオチドの直接スポッティングが挙げられる。また、アミノプロピルシラン表面化学（ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いるような方法も、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｔ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍおよびｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／に開示されているように、当該分野で公知である。
マイクロアレイを作製する１つの方法は、高密度ポリヌクレオチドアレイを作製することによるものである。ポリヌクレオチドを急速に沈着させる方法は公知である（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１１：６８７−６９０）。原理的に、また前述したように、例えば、ナイロンハイブリッド形成膜へのドットブロットなど、どんなタイプのアレイも使用できよう。しかしながら、ハイブリッド形成量が少ないので極めて微細なアレイが好ましい場合が多いことは、当業者によって認められよう。
（本明細書に記載した）被分析物へのポリヌクレオチド断片の固定化方法は、当該分野では公知である。例えば、米国特許第６，３０９，８４３号、同第６，３０６，３６５号、同第６，２８０，９３５号、同第６，０８７，１０３号（および本明細書に記載の方法）を参照されたい。
本発明の方法によって作製するポリヌクレオチド断片が遊離３’−水酸基もしくは遊離５’−水酸基を含むことができることは理解されよう。遊離水酸基を介してヌクレオチドを固定化するための方法および反応条件は当該分野では公知である。例えば、米国特許第６，１６９，１９４号および同第５，７２６，３２９号を参照されたい。
（反応条件および検出）
本発明の方法を実施するための適切な反応培地および条件とは、本発明の方法による核酸の合成を可能にするもののことである。このような培地および条件については当業者には公知であり、種々の刊行物、例えば、米国特許第６，１９０，８６５号、同第５，５５４，５１６号、同第５，７１６，７８５号、同第５，１３０，２３８号、同第５，１９４，３７０号、同第６，０９０，５９１号、同第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号、同第５，１６９，７６６号、同第５，４８０，７８４号、同第５，３９９，４９１号、同第５，６７９，５１２号、公開ＰＣＴ第Ｗ０９９／４２６１８号、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２年）ｐ２５１−６、およびＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３年）２１１：ｐ１６４−９に記載されている。例えば、緩衝液はトリス緩衝液とすることができるが、緩衝液成分が本発明の方法の酵素成分に対し非阻害性である限り、他の緩衝液も使用することができる。ｐＨは、好ましくは約５乃至約１１、より好ましくは約６乃至約１０、さらに好ましくは約７乃至約９、最も好ましくは約７．５乃至約８．５である。また、反応培地は、約０．０１乃至約１５ｍＭ、最も好ましくは約１乃至約１０ｍＭの範囲内にある遊離イオンの最終濃度でＭｇ２＋もしくはＭｎ２＋などの二価金属イオンを含むことができる。また、反応培地は、培地の全イオン強度に寄与するＫＣｌもしくはＮａＣｌなどの他の塩を含むことができる。例えば、ＫＣｌなどの塩の濃度範囲は、好ましくは約０乃至約１２５ｍＭ、より好ましくは約０乃至１００ｍＭ、最も好ましくは約０乃至約７５ｍＭである。さらに、反応培地は、増幅反応の遂行に影響を与えるかもしれないが、本方法の酵素成分の活性には不可欠ではない添加物を含むことができる。このような添加物としては、ＢＳＡなどの蛋白質、一本鎖結合蛋白質（例えば、Ｔ４遺伝子３２蛋白質）、およびＮＰ４０もしくはトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。また、酵素活性を維持させることができるＤＴＴなどの試薬を添加することもできる。このような試薬は当該分野で公知である。また、適切な場合、本方法に用いるＲＮＡ分解酵素（があったとしても）の活性を阻害しない（ＲＮアシンなどの）ＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加することもできる。本発明の方法のどの態様も同一もしくは種々の温度で実施することができる。この合成反応（特に、第１および第２鎖ｃＤＮＡ合成工程以外のプライマー伸長反応、ならびに鎖置換反応）は等温的に実施することができ、これにより、面倒な熱循環（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）プロセスを省くことができる。この合成反応は、鋳型ポリヌクレオチドおよびプライマー伸長産物への本発明のオリゴヌクレオチド（プライマー）のハイブリッド形成を可能にし、使用酵素の活性を実質的に阻害しない温度で実施する。この温度は、好ましくは約２５℃乃至約８５℃、より好ましくは約３０℃乃至約８０℃、最も好ましくは約３７℃乃至約７５℃の範囲とすることができる。ＲＮＡ転写を含む一部の実施態様として、転写工程の温度は、直前の工程の温度より低くする。この実施態様では、転写工程の温度は、好ましくは約２５℃乃至約８５℃、より好ましくは約３０℃乃至約７５℃、最も好ましくは約３７℃乃至約７０℃の範囲とすることができる。
本発明の方法において非共通ヌクレオチドを含む核酸の合成に用いることができる非共通ヌクレオチド（もしくは他のヌクレオチドアナログ）を含むヌクレオチドは、好ましくは約５０乃至約２，５００μＭ、より好ましくは約１００乃至約２，０００μＭ、さらに好ましくは約２００乃至約１，７００μＭ、最も好ましくは約２５０乃至約１，５００μＭの量で用いることができる。一般に、本発明の合成反応のオリゴヌクレオチド成分は、複製しようとする鋳型核酸配列の数より過剰とする。この成分は、以下の量、即ち、標的核酸の量の１０倍、１０２倍、１０４倍、１０６倍、１０８倍、１０１０倍、１０１２倍のうちのどれかに近い、もしくは少なくとも近い量で用いることができる。複合プライマーは、以下の濃度、即ち、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１，０００ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭのうちのどれかに近い、もしくは少なくとも近い濃度で用いることができる。
任意に、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをヒドロキシルアミン（もしくは他の任意の適切な物質）で処理して核酸内に自然発生的に形成される得るアルデヒドを全て除去することができる。例えば、ＭａｋｒｏｇｉｏｒｇｏｓのＷＯ００／３９３４５号を参照されたい。
便宜上、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成と、この非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素によるこのポリヌクレオチドの塩基部分の切断と、そのホスホジエステル骨格の無塩基部位における切断とを別々の工程として説明する。非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが（増幅の指数的方法、例えば、ＰＣＲの場合のように）更なる増幅の鋳型となり得る必要がある場合を（通例）除いて、これらの工程を同時に実施することができることは理解されよう。
本発明の方法による非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を実施するための適切な反応培地および条件とは、非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を可能にするもののことである。このような培地および条件については当業者には公知であり、種々の刊行物、例えば、Ｌｉｎｄａｈｌ，ＰＮＡＳ（１９７４年）７１（９）：ｐ３６４９−３６５３；Ｊｅｎｄｒｉｓａｋの米国特許第６，１９０，８６５号Ｂ１、同第５，０３５，９９６号、同第５，４１８，１４９号に記載されている。例えば、緩衝条件は、ポリヌクレオチド合成に対して前述の通りとすることができる。一実施態様として、核酸合成反応混液にＵＤＧ（エピセンターテック社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートすることができる。一実施態様として、反応条件は、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを合成し、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する場合と同一とする。別の実施態様として、これらの反応に対して別々の反応条件を用いる。一部の実施態様として、ポリメラーゼによる切断産物末端の伸長が起こらないように、ＵＮＧ添加の前、もしくは添加と同時にキレート試薬（例えば、ＥＤＴＡ）を加える。
ホスホジエステル骨格の切断に係わる実施態様では、本発明の方法によりホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断するための適切な反応培地および条件とは、ホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することを可能にするもののことである。このような培地および条件については当業者には公知であり、種々の刊行物、例えば、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ（１９９１年）７：ｐ２３５１；Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ（１９９４年）７：ｐ６７３−８３；Ｈｏｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，（１９８８年）１６：ｐ１１５５９−７１）；Ｌｉｎｄａｈｌ，ＰＮＡＳ（１９７４年）７１（９）：ｐ３６４９−３６５３；Ｊｅｎｄｒｉｓａｋの米国特許第６，１９０，８６５号Ｂ１；Ｓｈｉｄａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９６年）２４（２２）：ｐ４５７２−７６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９８年）２７３（１３）：ｐ２１２０３−２０９；Ｃａｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９年）３８：ｐ１６５５３−６０；Ｃｈｅｎ：Ｒｅｓ Ｔｏｘｉｃｏｌ（１９９４年）７：ｐ６７３−６８３に記載されている。例えば、前述の反応条件に大腸菌ＡＰエンドヌクレアーゼＩＶを加える。ＡＰエンドヌクレアーゼＩＶは、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（酵素などの）作用因子と同時もしくは別の時間に加えることができる。例えば、ＡＰエンドヌクレアーゼＩＶは、ＵＮＧと同時もしくは種々の時間に加えることができる。ＵＮＧ処理とＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン処理とを同時に行うのに適した反応混合物については、本明細書の実施例４に記載している。
別の例として、無塩基部位を含む核酸は、アミン、例えば２５ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび１乃至５ｍＭのマグネシウムイオンを含む緩衝液中、７０℃乃至９５℃で１０乃至３０分間加熱する。あるいは、エタノール沈殿させ、真空乾燥した無塩基部位を含むポリヌクレオチドに１．０Ｍのピペリジン（塩基）を加える。次いで、この溶液を９０℃で３０分間加熱し、凍結乾燥してピペリジンを除去する。別の例として、切断は、塩基性溶液、例えば、０．２Ｍの水酸化ナトリウムで３７℃、１５分間処理することにより行う。Ｎａｋａｍｕｒａ（１９９８年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：ｐ２２２−２２５を参照されたい。さらに別の例として、切断は、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンアセテートと３７℃でインキュベーションすることにより行う。ＭｃＨｕｇｈ、Ｋｎｏｗｌａｎｄ，（１９９５年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３（１０）ｐ１６６４−１６７０を参照されたい。
一実施態様として、反応条件は、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断する場合、およびホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断する場合と同一とする。別の実施態様として、これらの反応には別々の反応条件を用いる。
無塩基部位の標識に係わる実施態様では、本発明の方法により無塩基部位を標識するための適切な反応培地および条件とは、無塩基部位で標識することを可能にするもののことである。このような反応混合物および条件については当業者には公知であり、種々の刊行物、例えば、ＭａｋｒｏｇｉｏｒｇｏｓのＷＯ００／３９３４５号；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８年）２７３（３３）：ｐ２１２０３−２０９；Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ，Ｉｎｔ Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．（１９９８年）７４（ｌ）：ｐ９９−１０９；Ｍａｋｒｏｇｉｏｒｇｏｓの米国特許第６，１７４，６８０号Ｂ１；ＭａｋｒｏｇｉｏｒｇｏｓのＷＯ００／３９３４５号；Ｂｏｔｕｒｙｎ（１９９９年）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１２：ｐ４７６−４８２に記載されている。また、Ａｄａｍｃｚｙｋ（１９９８年）Ｂｉｏｏｒｇ，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８（２４）：ｐ３５９９−３６０２；Ａｄａｍｃｚｙｋ（１９９９年）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１（５）：ｐ７７９−７８１；Ｋｏｗ（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ２２（２）：ｐ１６４−１６９；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ３．２（ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）；Ｈｏｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，（１９８８年）１６：ｐ１１５５９−７１についても参照されたい。例えば、５−（（（２−（カルボヒドラジノ）−メチル）チオ）アセチル）アミノフルオレセイン、アミノオキシアセチルヒドラジド（「ＦＡＲＰ」）、Ｎ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジン、トリフルオロ酢酸塩（ＡＲＰ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（モレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、アミノオキシ誘導体化Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、および他のアルデヒド反応性試薬は、無塩基部位を含むポリヌクレオチドと反応させることができる。緩衝液はクエン酸ナトリウムもしくはリン酸ナトリウム緩衝液とすることができるが、緩衝液成分が本発明の方法に用いる酵素成分および／または所望の化学反応に対し非阻害性である限り、他の緩衝液も許容範囲にある。ｐＨは、好ましくは約３乃至約１１、より好ましくは約４乃至約１０、さらに好ましくは約４乃至約８、最も好ましくは約４乃至約７である。反応は室温乃至３７℃で行うことができるが、温度が本発明の方法に用いる酵素成分および／または所望の化学反応に対し非阻害性である限り、他の温度も適合する。通例、標識（例えば、ＡＲＰもしくはＦＡＲＰ）は、約１乃至１０ｍＭ、好ましくは２乃至５ｍＭの濃度で加えるが、他の濃度も適合する。抗体標識を用いる場合、抗体を結合させるための条件は当該分野で周知であり、本明細書に記載した通りとすることができる。任意に、標識反応のｐＨを中和する停止緩衝液（ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ）を用いることによって、標識反応を停止させ、状況に応じて、その後の標識産物の精製を容易にすることができる。
無塩基部位におけるポリヌクレオチドの固定化に係わる実施態様では、本発明の方法により無塩基部位においてポリヌクレオチドを固定化するための適切な反応培地および条件とは、無塩基部位における固定化することを可能にするもののことである。このような反応混合物および条件については当業者には公知であり、種々の刊行物、例えば、Ｌｕｋｔａｎｏｖの米国特許第６，３３９，１４７号；Ｖａｎ Ｎｅｓｓの米国特許第５，６６７，９７６号；バングズラボラトリーズ社（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のＴｅｃｈＮｏｔｅ２０５（ｂａｎｇｓｌａｂｓ．ｃｏｍから入手可能）；Ｇｈｏｓｈ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８９年）１７８：ｐ４３−５１；Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０年）１９１：ｐ１−８；Ｗｉｌｃｈｅｋ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７年）１３８：ｐ４２９−４４２；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８９年）１８１：ｐ１８２−１８９；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９５年）６：ｐ１５０−１６５、およびこれらに引用されている文献に記載されている。場合によっては、最初の生成物は、シアノボロ水素化ナトリウムもしくは当該分野で公知の同様な物質との反応により安定化することができる。例えば、上記Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙの文献を参照されたい。
一実施態様として、上記諸成分は、断片化および／または標識および／または固定化プロセスの合成工程の開始時に同時に加える。別の実施態様として、諸成分は、合成工程における適切な時点の前もしくは後に、任意の順序で加えることができる。このような時点については、その一部を以下に述べるが、当業者には容易に特定することができる。これらの実施態様では、反応条件および成分は、個別の反応間で変更することができる。
断片化および／または標識および／または固定化プロセスは、様々な時点で停止させ、後に再開させることができる。該時点は、当業者には容易に特定することができる。反応を停止させる方法については当該分野では公知であり、この方法としては、例えば、酵素活性を阻害する温度まで反応混液を冷却する方法、または酵素を破壊する温度まで反応混液を加熱する方法が挙げられる。また、反応を再開させる方法についても当該分野では公知であり、この方法としては、例えば、酵素活性の発現を可能にする温度まで反応混液の温度を上げる方法、または破壊された（枯渇した）酵素その他の試薬を補充する方法が挙げられる。一部の実施態様として、反応再開の前、再開時、もしくは再開後に、反応成分の１種以上を補充する。あるいは、反応は、途切れさせずに（即ち、最初から最後まで）続行させることができる。
反応は、中間複合体の精製、例えば、プライマーの除去を行わずに、続行させることができる。生成物は、当業者には容易に特定することができる様々な時点で精製することができる。
本発明の組成物およびキット
また、本発明は、本明細書に記載した方法に用いる組成物およびキットを提供する。この組成物は、本明細書に記載した任意の成分、反応混合物および／または中間体、ならびに任意の組合せとすることができる。例えば、本発明は、（ＲＮＡ−ＤＮＡ複合プライマーとすることができる）プライマー、非共通ヌクレオチド、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（酵素などの）作用因子、任意に、ホスホジエステル主鎖を無塩基部位で切断することができる（酵素などの）作用因子、および無塩基部位を標識することができる物質を含む組成物を提供する。別の例として、本発明は、鋳型から合成した非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および無塩基部位を標識することができる物質を含む組成物を提供する。さらに別の例として、この組成物は、（ＲＮＡ−ＤＮＡ複合プライマーとすることができる）プライマー、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、（任意に）Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ、およびＮ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジン・トリフルオロ酢酸塩（ＡＲＰ）を含む。
別の実施態様として、本発明は、ＤＮＡ部分および５’ＲＮＡ部分を有する複合プライマー、ならびに（ｄＵＴＰなどの）非共通ヌクレオチドを含む組成物を提供する。別の実施態様として、この組成物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマー、ならびに非共通ヌクレオチドから塩基部分を切断することができる（ＵＮＧなどの）作用因子を含む。別の実施態様として、この組成物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマー、ならびにホスホジエステル主鎖を無塩基部位で切断することができる（Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンなどのアミンのような）作用因子を含む。他の実施態様として、この組成物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマー、ならびに（ＡＲＰなどの）無塩基部位を標識する物質を含む。他の実施態様として、この組成物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマー、ｄＵＴＰ、ならびにＵＮＧを含む。さらに他の実施態様として、この組成物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマー、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、ならびにＡＲＰを含む。さらに他の実施態様として、この組成物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマー、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、ならびにＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンを含む。さらに他の実施態様として、この組成物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマー、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、ならびにＡＲＰを含む。
さらに他の実施態様として、本発明は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマー、非共通ヌクレオチド、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（酵素などの）作用因子、ホスホジエステル主鎖を無塩基部位で切断することができる（酵素などの）作用因子、および無塩基部位を標識することができる物質を含む組成物を提供する。一部の実施態様として、さらに、この組成物は、固定化に好適な基体を提供する。一部の実施態様として、上記ＲＮＡ部分は上記ＤＮＡ部分の５’末端側であり、上記複合プライマーの５’ＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分に隣接し、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は約１０〜約２０ヌクレオチドから構成され、および上記複合プライマーのＤＮＡ部分は約７〜約２０ヌクレオチドから構成される。さらに別の実施態様として、この組成物は、別の異なる複合プライマーを含む。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は、次のリボヌクレオチド配列：５’−ＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵ−３’を含む。
さらに別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、および（ｃ）ＡＲＰを含む組成物を提供する。他の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、（ｃ）ＡＲＰ、（ｄ）ｄＵＴＰ、（ｅ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物、（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに（ｇ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーを含む組成物を提供する。さらに他の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、（ｃ）ＡＲＰ、（ｄ）ｄＵＴＰ、（ｅ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物、（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｇ）ＲＮＡｓｅ Ｈ、ならびに（ｈ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマーを含む組成物を提供する。さらに他の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、（ｃ）ＡＲＰ、（ｄ）ｄＵＴＰ、（ｅ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物、（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｇ）ＲＮＡｓｅ Ｈ、（ｈ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマー、（ｉ）ＭｇＣｌ２溶液、（ｊ）酢酸溶液、ならびに、任意に（ｋ）ｐＨ８．５の１．５Ｍトリスを含む停止緩衝液（ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ）を含む組成物を提供する。一部の実施態様として、ｄＵＴＰと、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物とを併用する。一部の実施態様として、ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡｓｅ Ｈとを混合物として用いる。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分の５’末端側であり、上記５’ＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分に隣接し、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は約１０〜約２０ヌクレオチドから構成され、および上記複合プライマーのＤＮＡ部分は約７〜約２０ヌクレオチドから構成される。さらに別の実施態様として、この組成物は、別の異なる複合プライマーを含む。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は、次のリボヌクレオチド配列：５’−ＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵ−３’を含む。
さらに別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）ＡＲＰ、（ｃ）ｄＵＴＰ、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｅ）ＲＮＡｓｅ Ｈ、ならびに（ｆ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマーを含む組成物を提供する。別の実施態様として、この組成物は、さらに、（ｇ）ＭｇＣｌ２溶液、（ｈ）酢酸溶液、ならびに、任意に（ｉ）ｐＨ８．５の１．５Ｍトリスを含む停止緩衝液を含む。別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）無塩基部位を標識することができる物質（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５もしくはアミノオキシ修飾Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５）、（ｃ）ｄＵＴＰ、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｅ）ＲＮＡｓｅ Ｈ、ならびに（ｆ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマーを含む組成物を提供する。一部の実施態様として、ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡｓｅ Ｈとを混合物として用いる。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分の５’末端側であり、上記５’ＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分に隣接し、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は約１０〜約２０ヌクレオチドから構成され、および上記複合プライマーのＤＮＡ部分は約７〜約２０ヌクレオチドから構成される。さらに別の実施態様として、この組成物は、別の異なる複合プライマーを含む。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は、次のリボヌクレオチド配列：５’−ＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵ−３’を含む。
別の例として、本発明は、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、および任意に機能化することができる、無塩基部位を介して結合させるのに適した基体（例えば、マイクロアレイ；被分析物）を含む組成物を提供する。さらに別の例として、本発明は、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、ＵＮＧ、（任意に）Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ、および任意に機能化することができる、無塩基部位を介して結合させるのに適した基体を含む組成物を提供する。
一般に、以上の組成物は、好ましくは適切な緩衝液の凍結乾燥形態もしくは水性形態（適切な場合）とする。
また、本発明は、本明細書に開示した標識および／または断片化産物を含む組成物を提供する。従って、本発明は、本明細書に開示した任意の方法により作製した標識および／または断片化ポリヌクレオチドの集団（またはこれらの産物を含む組成物）を提供する。
また、本発明は、本明細書に開示した固定化ポリヌクレオチドもしくは固定化ポリヌクレオチド断片を含む組成物を提供する。一部の実施態様として、この固定化ポリヌクレオチド（もしくは断片化に係わる実施態様の固定化断片）は、本明細書に開示した方法により標識する。従って、本発明は、本明細書に開示した任意の方法により作製した固定化ポリヌクレオチドもしくは固定化ポリヌクレオチド断片の集団（またはこれらの産物を含む組成物）を提供する。
通例、この組成物は、適切な媒体中に存在するが、凍結乾燥形態とすることもできる。好適な媒体としては、（純水もしくは緩衝液などの）水性媒体が挙げられるが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、本明細書に記載した種々の組合せの成分を含む反応混合物（もしくは反応混合物を含む組成物）を提供する。反応混合物の例については記載した通りである。一部の実施態様として、本発明は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに（ｄＵＴＰなどの）非共通ヌクレオチドを含む反応混合物を提供する。別の実施態様として、この反応混合物は、複合プライマーを用いて合成した、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、および非共通ヌクレオチドから塩基部分を切断することができる（ＵＮＧなどの）作用因子を含む。別の実施態様として、この反応混合物は、複合プライマーを用いて合成した、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、および無塩基部位でホスホジエステル主鎖を切断することができる（Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンのようなアミンなどの）作用因子を含む。別の実施態様として、この反応混合物は、複合プライマーを用いて合成した、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、および（ＡＲＰなどの）無塩基部位を標識する物質を含む。別の実施態様として、この反応混合物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ｄＵＴＰ、ならびにＵＮＧを含む。さらに別の実施態様として、この反応混合物は、複合プライマーを用いて合成した、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、およびＡＲＰを含む。さらに別の実施態様として、この反応混合物は、複合プライマーを用いて合成した、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、およびＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンを含む。さらに別の実施態様として、この反応混合物は、複合プライマーを用いて合成した、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、およびＡＲＰを含む。さらに別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、および（ｃ）ＡＲＰを含む反応混合物を提供する。別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧおよび（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンを含む反応混合物を提供する。さらに別の実施態様として、本発明は、（ａ）ｄＵＴＰ、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）ＲＮＡｓｅ Ｈ、ならびに（ｄ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマーを含む反応混合物を提供する。さらに別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、（ｂ）ｄＵＴＰ、（ｃ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに（ｅ）ＲＮＡｓｅ Ｈを含む反応混合物を提供する。さらに別の実施態様として、本発明は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに非共通ヌクレオチドを含む反応混合物を提供する。一部の実施態様として、さらに、この反応混合物は固定化に適した基体を提供する。一部の実施態様として、上記複合プライマーの５’ＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分に隣接し、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は約１０〜約２０ヌクレオチドから構成され、および上記複合プライマーのＤＮＡ部分は約７〜約２０ヌクレオチドから構成される。さらに別の実施態様として、この反応混合物は別の異なる複合プライマーを含む。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は、次のリボヌクレオチド配列：５’−ＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵ−３’を含む。
別の実施態様として、この反応混合物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーを用いて合成した、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、ならびに固定化に適した基体を含む。
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。従って、種々のキットを好適なパッケージングとして提供する。これらのキットは、本明細書に開示した用途のうちの任意の１種以上に用いることができ、これに応じて、以下の用途のうちの任意の１種以上に関する使用説明書を含むことができる：ハイブリダイゼーション・プローブの作製方法、核酸の特徴付けおよび／または定量方法、変異の検出方法、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション・プローブの作製方法、（ハイブリダイゼーション・プローブによる）検出方法、ならびに本発明の方法により作製した標識および／または断片化核酸を用いて遺伝子発現プロフィルを明らかにする方法。
本発明のキットは、本明細書に開示した成分の任意の組合せを含む１つ以上の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含み、以下はこのようなキットの例である。キットは、（ＲＮＡ−ＤＮＡ複合プライマーなどの）プライマー、非共通ヌクレオチド、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（酵素などの）作用因子、ホスホジエステル主鎖を無塩基部位で切断することができる（酵素などの）作用因子、および無塩基部位を標識することができる物質を含み、これらは別々に包装する場合もあるし、一括包装とする場合もある。さらに別の例として、キットは、（本明細書に開示した複合プライマーなどの）プライマー、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、（任意に）Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ、およびＮ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジン・トリフルオロ酢酸塩（ＡＲＰ）を含む。別の実施態様として、キットは、（複合プライマーなどの）プライマー、非共通ヌクレオチド、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（酵素などの）作用因子、およびホスホジエステル主鎖を無塩基部位で切断することができる（酵素などの）作用因子を含む。別の実施態様として、キットは、鋳型を用いて合成した、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、および無塩基部位を標識することができる物質を含む。さらに別の例として、キットは、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、ＵＮＧ、（任意に）Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ、および任意に機能化することができる、無塩基部位を介して結合させるのに適した基体（例えば、マイクロアレイ；被分析物）を含む。別の実施態様として、キットは、無塩基部位を含むポリヌクレオチド、および無塩基部位に結合させるのに適した（任意に機能化することができる）基体を含む。
別の実施態様として、本発明は、（ＲＮＡ−ＤＮＡ複合プライマーとすることができる）プライマー、非共通ヌクレオチド、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（酵素などの）作用因子、任意に、ホスホジエステル主鎖を無塩基部位で切断することができる（酵素などの）作用因子、および無塩基部位を標識することができる物質を含むキットを提供する。別の例として、本発明は、鋳型を用いて合成した、非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および無塩基部位を標識することができる物質を含むキットを提供する。さらに別の例として、上記組成物は、（ＲＮＡ−ＤＮＡ複合プライマーとすることができる）プライマー、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、（任意に）Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ、およびＮ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジン・トリフルオロ酢酸塩（ＡＲＰ）を含む。
別の実施態様として、本発明は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに（ｄＵＴＰなどの）非共通ヌクレオチドを含むキットを提供する。別の実施態様として、上記組成物は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（ＵＮＧなどの）作用因子を含む。別の実施態様として、キットは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびにホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することができる（Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンのようなアミンなどの）作用因子を含む。別の実施態様として、キットは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに無塩基部位を標識する（ＡＲＰなどの）物質を含む。別の実施態様として、キットは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ｄＵＴＰ、ならびにＵＮＧを含む。さらに別の実施態様として、キットは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、ならびにＡＲＰを含む。さらに別の実施態様として、キットは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、ならびにＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンを含む。さらに別の実施態様として、キットは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、ならびにＡＲＰを含む。
さらに別の実施態様として、キットは、（ＲＮＡＳＥ Ｈなどの）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断することができる作用因子、非共通ヌクレオチド（ｄＵＴＰ）、および非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる作用因子（ＵＮＧ）を含む。さらに別の実施態様として、キットは、（ＲＮＡＳＥ Ｈなどの）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断することができる作用因子、および（ＡＲＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ヒドラジドもしくはＦＡＲＰなどの）無塩基部位を標識することができる物質を含む。さらに別の実施態様として、キットは、（ＲＮＡＳＥ Ｈなどの）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断することができる作用因子、および（Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンなどのアミンのような）骨格を無塩基部位で切断することができる作用因子を含む。さらに別の実施態様として、キットは、ＲＮＡＳＥ Ｈ、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、およびＡＲＰを含む。
さらに別の実施態様として、本発明は、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、非共通ヌクレオチド、非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる（酵素などの）作用因子、ホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断することができる（酵素などの）作用因子、ならびに無塩基部位を標識することができる物質を含むキットを提供する。一部の実施態様として、さらに、このキットは、固定化に適した基体を提供する。一部の実施態様として、上記複合プライマーの５’ＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分に隣接させ、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は約１０乃至約２０ヌクレオチドで構成し、および上記複合プライマーのＤＮＡ部分は約７乃至約２０ヌクレオチドで構成する。さらに別の実施態様として、このキットは、別の異なる複合プライマーを含む。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は、次のリボヌクレオチド配列：５’−ＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵ−３’を含む。
さらに別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、および（ｃ）ＡＲＰを含むキットを提供する。別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、（ｃ）ＡＲＰ、（ｄ）ＵＴＰ、（ｅ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物、（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに（ｇ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマーを含むキットを提供する。さらに別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、（ｃ）ＡＲＰ、（ｄ）ＵＴＰ、（ｅ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物、（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｇ）ＲＮＡＳＥ Ｈ、ならびに（ｈ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する複合プライマーを含むキットを提供する。さらに別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、（ｃ）ＡＲＰ、（ｄ）ＵＴＰ、（ｅ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物、（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｇ）ＲＮＡＳＥ Ｈ、（ｈ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、（ｉ）ＭｇＣｌ２溶液、（ｊ）酢酸溶液、ならびに任意に、（ｋ）ｐＨ８．５の１．５Ｍトリスを含む停止緩衝液を含むキットを提供する。一部の実施態様として、ｄＵＴＰと、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物とを併用する。一部の実施態様として、ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡＳＥ Ｈとを混合物として用いる。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分の５’末端側とし、上記５’ＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分に隣接させ、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は約１０乃至約２０ヌクレオチドで構成し、および上記複合プライマーのＤＮＡ部分は約７乃至約２０ヌクレオチドで構成する。さらに別の実施態様として、このキットは、別の異なる複合プライマーを含む。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は、次のリボヌクレオチド配列：５’−ＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵ−３’を含む。
さらに別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）ＡＲＰ、（ｃ）ｄＵＴＰ、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｅ）ＲＮＡＳＥ Ｈ、ならびに（ｆ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーを含むキットを提供する。別の実施態様として、このキットは、さらに、（ｇ）ＭｇＣｌ２溶液、（ｈ）酢酸溶液、および任意に、（ｉ）ｐＨ８．５の１．５Ｍトリスを含む停止緩衝液を含む。別の実施態様として、本発明は、（ａ）ＵＮＧ、（ｂ）無塩基部位を標識することができる物質（例えば、ＡＲＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５もしくはアミノオキシ修飾Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５）、（ｃ）ｄＵＴＰ、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｅ）ＲＮＡＳＥ Ｈ、ならびに（ｆ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーを含むキットを提供する。一部の実施態様として、ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡＳＥ Ｈとを混合物として用いる。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分の５’末端側とし、上記５’ＲＮＡ部分は上記３’ＤＮＡ部分に隣接させ、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は約１０乃至約２０ヌクレオチドで構成し、および上記複合プライマーのＤＮＡ部分は約７乃至約２０ヌクレオチドで構成する。さらに別の実施態様として、このキットは、別の異なる複合プライマーを含む。一部の実施態様として、上記複合プライマーのＲＮＡ部分は、次のリボヌクレオチド配列：５’−ＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵ−３’を含む。
また、キットは、（本明細書に記載した）適切な緩衝液の１種以上を含む。このキット内の１種以上の試薬は、賦形剤を含む、通常凍結乾燥した乾燥粉末として供給することができ、この粉末は、溶解させると、本明細書に開示した任意の方法を実施するのに適した濃度の試薬溶液となる。各成分は別々の容器に包装することができ、あるいは一部の成分は、交差反応および保存寿命の点で問題のない１つの容器に一緒に入れることができる。
本発明のキットは、任意に、一式の使用説明書、概説された使用説明書を含むが、本発明が対象とする方法のための本発明の方法の諸成分の使用に関する、および／または、任意に、例えばハイブリダイゼーション・プローブの作製、発現プロファイリング、マイクロアレイの作製もしくは核酸の特徴付けなどの目的でこれらの産物を使用することに関する使用説明を含む電子記憶媒体（例えば、磁気ディスクもしくは光ディスク）も用いることができる。一般に、このキットに添付する使用説明書には、本発明の方法を実施するのに必要な（キットに備え付けるかどうかに係わらず）試薬についての情報、キットの使用方法に関する説明、および／または適切な反応条件を含める。
このキットの成分（類）は、簡便で適切な任意の包装方法で包装することができる。こうした成分は、別々に、または１つもしくは複数の組合せで包装することができる。
本明細書に開示した方法を実施するために、および/または、アッセイの感度をさらに最適化するために行わせる必要がある反応を実質的に最適化する試薬の濃度を規定できるように、キット内の種々の成分の相対量を大きく変更することができる。
（本発明の標識および/または断片化および/または固定化方法を用いる用途）
本発明の方法および組成物は、種々の目的に使用することができる。例示のために、ハイブリダイゼーション・プローブを作製し、核酸を特徴付けおよび／または定量し、変異を検出し、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション・プローブを作製し、（ハイブリダイゼーション・プローブを用いて）検出し、および本発明の方法により作製した標識および／または断片化核酸を用いて遺伝子発現プロフィルを明らかにする方法について説明する。
本発明の方法のうちの任意の方法により作製した、例えばマイクロアレイ上の固定化ポリヌクレオチドは、核酸に対してハイブリッドを形成させる方法、核酸を特徴付け、および／または定量する方法、核酸内の変異を検出する方法、および以下に説明する遺伝子発現プロフィルを明らかにする方法を含む、核酸を分析し、特徴付ける方法にも有用であり、これらの用途は、同じように固定化ポリヌクレオチドに当てはまる。
（ハイブリダイゼーション・プローブの作製方法）
本発明の方法により得られる標識ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション・プローブとして有用である。従って、一態様として、本発明は、本明細書に開示した任意の方法を用いて標識ポリヌクレオチドを作製し、およびこの標識ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーション・プローブとして使用することを含むハイブリダイゼーション・プローブを作製する方法を提供する。別の実施態様として、本発明は、本明細書に開示した任意の方法を用いて標識ポリヌクレオチド断片を作製し、この標識ポリヌクレオチド断片をハイブリダイゼーション・プローブとして使用することを含むハイブリダイゼーション・プローブを作製する方法を提供する。この標識ポリヌクレオチド（もしくは標識ポリヌクレオチド断片）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、（ゲノムＤＮＡのグローバル（ｇｌｏｂａｌ）増幅を含む）ゲノムＤＮＡおよび（ｃＤＮＡ、ゲノムもしくはサブトラクション・ハイブリダイゼーション・ライブラリを含む）ライブラリなどの当該分野で公知の任意の鋳型から作製することができる。また、本発明は、本明細書に開示したハイブリダイゼーション・プローブを用いてハイブリッド形成を行う方法を提供する。
（核酸の特徴付け）
本発明の方法により得られる標識および／または断片化核酸は、さらに詳細な特徴付けの対象とすることができる。
この標識および／または断片化核酸（即ち、本明細書に開示した任意の方法による産物）は、例えば、サザンおよびノーザン・ブロッティングならびにプローブアレイへのハイブリッド形成などの当該分野で公知のプローブ・ハイブリダイゼーション法を用いて分析することができる。また、これらは、当該分野で公知のディファレンシャル・ディスプレイおよびサイズ・キャラクタリゼーションなどの電気泳動を利用する方法によって分析することもできる。
一実施態様として、本発明の方法を用いて標識および／または断片化核酸を作製し、この標識および／または断片化核酸をプローブと接触させることにより分析する。この標識および／または断片化核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、（ゲノムＤＮＡのグローバル（ｇｌｏｂａｌ）増幅を含む）ゲノムＤＮＡおよび（ｃＤＮＡ、ゲノムもしくはサブトラクション・ハイブリダイゼーション・ライブラリを含む）ライブラリなどの当該分野で公知の任意の鋳型から作製することができる。
一実施態様として、本発明の方法を用いて標識および／または断片化核酸を作製し、これを、例えば、ｃＤＮＡおよび／またはオリゴヌクレオチド・プローブなどの適切なプローブを含む（ガラス、チップ、プラスチックなどの任意の適切な基体の）マイクロアレイ、ビーズもしくは粒子と接触させることによって、分析（例えば、検出および／または定量）する。従って、本発明は、例えば、固体もしくは半固体の基体の特定の位置に固定したプローブなど、または（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のＢｅａｄ Ａｒｒａｙなどのビーズを含む）特定の粒子に固定したプローブなど、あるいは（膜などの）ブロット、例えば、アレイもしくは多数のアレイに固定したプローブなどに対して、例えば標識産物をハイブリッド形成させることなどにより、この標識産物を分析することによって、標識および／または断片化核酸を特徴付ける（例えば、検出および／または定量および／または同定する）方法を提供する。固定化プローブとしては、本明細書に開示した方法により作製した固定化プローブが挙げられ、また、少なくとも次のものも挙げることができる：基体面で直接合成することができるｃＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチド。
標識産物を分析する他の方法、例えば、プローブを含む溶液とこれを接触させた後、溶液からこの標識産物およびプローブを含む複合体を抽出することによる方法などについては、当該分野で公知である。プローブの識別性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）によりこの産物の配列識別性を特徴付けることによって、外挿により、この産物を作製するための鋳型の識別性（例えば、溶液中のＲＮＡの識別性）を特徴付けることができる。例えば、この標識産物のハイブリッド形成が検出可能であり、検出される特定の標識の量は、特定の対象ＲＮＡ配列から作製する標識産物の量に比例する。この測定法は、例えば、本明細書で説明した遺伝子発現の相対的なレベルに関連している検体内の様々なＲＮＡ種の相対量を測定するのに有用である。アレイ上の特定の位置でハイブリッド形成させた（例えば、標識に伴う検出可能なシグナルによって示されるような）標識産物の量は、検体内の対応する鋳型ＲＮＡ種の検出および／または定量につなげることができる。
特徴付けの方法としては、ハイブリッド形成による配列決定（例えば、Dramanacの米国特許第６，２７０，９６１号参照）およびグローバル・ゲノミック・ハイブリダイゼーション（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（コンパラティブ・ゲノム・ハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）とも呼ばれる）（例えば、Pinkelの米国特許第６，１５９，６８５号参照）が挙げられる。
別の態様として、本発明は、（例えば、マイクロアレイに固定化することができる）特定配列のオリゴヌクレオチド（プローブ）の使用を含む標識および／または断片化核酸を定量する方法を提供する。
（本発明の方法による変異の検出）
また、本発明の方法により作製した標識および／または断片化核酸は、（この標識および／または断片化核酸を合成するために用いる）鋳型核酸配列のあらゆる変化について、この配列変化以外は鋳型核酸と同一である対照核酸配列との比較で、分析するのにも適している。この配列変化は、ゲノム配列内の配列変化とすることができ、あるいはゲノムＤＮＡ配列に反映されない配列変化、例えば、スプライシングによる変異を含む、転写後の変化および／またはｍＲＮＡプロセッシングによる変化とすることができる。配列変化（「変異」とも呼ばれる）としては、１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／またはトランスバージョンが挙げられる。
従って、本発明は、（ａ）本明細書に開示した任意の方法により標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を作製し、および（ｂ）この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を分析することにより変異の有無を検出することを含む、鋳型内の変異の有無を検出する方法を提供する。一部の実施態様として、この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片は、標識対照鋳型もしくはその断片と比較する。標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を分析することにより変異の有無を検出する工程（ｂ）は、当該分野で公知の任意の方法により実施することができる。一部の実施態様として、変異を検出するためのプローブをマイクロアレイとして提供する。
試験核酸配列内の塩基の置換、挿入、欠失などのどんな変化もこの方法により検出できよう。この方法は、特定単一塩基の多型性、ＳＮＰの検出、および新規ＳＮＰの発見に有用と考えられる。
対照核酸配列に対する鋳型核酸配列のあらゆる変化を検出するための当該分野で認められている他の分析方法は、本発明の方法において用いるのに適している。例えば、ハイブリッド形成を利用する変異検出方法は、基本的にどの方法も、本発明の方法により作製した標識および／または断片化核酸を用いるのに適している。
（遺伝子発現プロフィールの決定）
本発明の方法により作製した標識および／または断片化核酸は、検体中の１種以上の遺伝子の発現レベル測定用に特に適している。前述のように、標識および／または断片化核酸は、本明細書に開示した、および／または当該分野で公知の種々の方法により検出し定量することができる。ＲＮＡは遺伝子発現の産物であるので、検体中のｍＲＮＡなどの種々のＲＮＡ種のレベルは種々の遺伝子の相対的発現レベルを示すものである（遺伝子発現プロフィール）。従って、配列の産物（例えば、増幅産物）の定量により測定されるような、検体中に存在する対象ＲＮＡ配列の量の測定法は、検体供給源の遺伝子発現プロフィールを明らかにする方法となる。
従って、本発明は、検体の遺伝子発現プロフィールを明らかにする方法であって、本明細書に開示した任意の方法を用いて、検体中の少なくとも１種の対象ＲＮＡ配列からの一本鎖（もしくは二本鎖）産物を増幅し、非共通ヌクレオチドはポリヌクレオチドの合成過程で組み込まれるものとし；この非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを標識および／または断片化し；および各対象ＲＮＡ配列から作製した標識および／または断片化核酸の量を測定し、各該量は検体中の各対象ＲＮＡ配列の量を示すものとし、これにより検体の遺伝子発現プロフィールを明らかにすることを含む方法を提供する。
従って、本発明は、検体の遺伝子発現プロフィールを明らかにする方法であって、（ａ）本明細書に開示した任意の方法を用いて、検体中の少なくとも１種の鋳型ポリヌクレオチドから標識ポリヌクレオチドもしくはその断片を作製し、および（ｂ）各鋳型ポリヌクレオチドの標識ポリヌクレオチドもしくはその断片の量を測定することにより（ここで、各該量は、検体中の各鋳型ポリヌクレオチドの量を示す）、検体の遺伝子発現プロフィールを明らかにすることを含む方法を提供する。
産生された標識および／または断片化核酸の量（従って、産物の量）については定性的および／または定量的方法を用いて測定することができることは理解されよう。標識および／または断片化核酸の量の測定は、標識および／または断片化核酸の有無を測定することを含む。従って、遺伝子発現プロフィールは、１種以上の対象ＲＮＡ配列の有無についての情報を含むことができる。本明細書に用いている場合、産物の「存在しない」もしくは「非存在」、および「産物が検出されないこと」という用語は、有意でない、もしくは最小の（ｄｅ ｍｉｎｉｍｕｓ）レベルを含む。
発現プロファイリングの方法は、多種多様な分子診断、および特に、（単一細胞を含む）実質的にあらゆる細胞、もしくは細胞集団の遺伝子発現に関する研究に有用である。細胞もしくは細胞集団（例えば、組織）は、例えば、血液、脳、脾臓、骨、心臓、血管、肺、腎臓、下垂体、内分泌腺、胚細胞、腫瘍などに由来するものとすることができる。また、発現プロファイリングは、発症、治療などの前、後および／または発症、治療などの間を含む異なる時期に採集した試験試料を含む試験試料と、対照（正常）試料とを比較するのにも有用である。
（サブトラクティブ・ハイブダイゼーション・プローブの作製方法）
本発明の標識および／または断片化核酸による方法は、特に、標識および／または断片化サブトラクティブ・ハイブダイゼーション・プローブの作製に用いるのに適している。例えば、１つのセンスおよび１つのアンチセンスの２つの核酸集団は、過剰モル濃度で存在する１つの集団（「ドライバー」）と混ぜ合わせることができる。両集団に存在する配列はハイブリッドを形成するが、１つの集団にのみ存在する配列は一本鎖のままである。この後、種々の公知の技術を用いて、識別的に発現された配列を示す、ハイブリッドを形成しなかった分子を分離する。例えば、Ｈａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，５８９，３３９号；Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒの米国特許第６，２９１，１７０号を参照されたい。次に、本明細書に開示した本発明の方法によって、標識および／または断片化サブトラクティブ・ハイブダイゼーション・プローブを標識および／または断片化する。
（比較ハイブリッド形成法）
別の態様として、本発明は、（比較ゲノムハイブリッド形成などの）比較ハイブリッド形成の方法であって、（ａ）本明細書に開示した任意の方法を用いて、第１の鋳型ポリヌクレオチド検体から標識ポリヌクレオチドもしくはその断片の第１の集団を作製し、（ｂ）少なくとも１種のプローブへのこの第１の集団のハイブリッド形成と、標識ポリヌクレオチドもしくはその断片の第２の集団のハイブリッド形成とを比較することを含む方法を提供する。一部の実施態様として、この少なくとも１種のプローブは、染色体スプレッドである。さらに別の実施態様として、この少なくとも１種のプローブは、マイクロアレイとして用いる。一部の実施態様として、上記第１および第２の集団は、検出可能なように異なる標識を含む。別の実施態様として、この標識ポリヌクレオチドもしくはその断片の第２の集団は、本明細書に開示した任意の方法を用いて、第２のポリヌクレオチド検体から作製する。上記第１の集団および第２の集団が検出可能なように異なる標識を含む特許請求の範囲の請求項５７による方法。一部の実施態様として、比較する工程（ｂ）は、該産物の量を測定することを含み、これにより、上記第１および第２の鋳型ポリヌクレオチドの量を定量する。
一部の実施態様として、比較ハイブリッド形成法は、本明細書に開示した任意の方法によって（ポリヌクレオチド断片とすることができる）標識ポリヌクレオチドの第１の集団を作製する工程であって、この第１の集団を合成するための鋳型はゲノムＤＮＡであるものとする工程を含む。（この第１の集団に対して比較することを目的とする）標識ポリヌクレオチドの第２の集団は、第２の鋳型ゲノムＤＮＡから作製する。第１および第２の集団は、異なる標識を用いて標識する。ハイブリッド形成させた第１および第２の集団を混合し、これをアレイもしくは染色体スプレッドへハイブリッド形成させる。これらの異なる標識を検出し、比較する。
以下の実施例は、例示のために示すものであって、本発明を限定するものではない。
（実施例１：合成オリゴヌクレオチドの無塩基部位における断片化およびビオチンによる標識の実証）
オペロン社（Ｏｐｅｒｏｎ）（アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ）、ＣＡ）から、５’末端から４９番目の位置に単一のデオキシウリジンを組み込んだ合成７５ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチド（配列１）を入手して、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶かし、０．４ｍｇ／ｍＬの濃度とした。
配列１：
５’−ＧＧＡ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＡＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＴＡＴ ＣＴＴ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＣＣ ＣＧＧ ＵＧＡ ＣＣＡ ＴＡＣ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ−３’（配列番号：１）
このオリゴヌクレオチド原液５μＬを、３５μＬのＩｓｏｔｈｅｒｍ（登録商標）緩衝液（エピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩ）および２単位のＵＮＧ（エピセンター社、マジソン、ＷＩ）と混合し、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）内の薄肉のポリプロピレン・チューブ中でこの混液を３７℃、６０分間インキュベートすることによって、（無塩基部位を作製し）ウラシルを除去した。次に、この混液を９９℃で３０分間インキュベートすることによって、無塩基部位を含むこのオリゴヌクレオチドをその無塩基部位で（ホスホジエステル骨格を無塩基部位で切断して）断片化した。次いで、この切断オリゴヌクレオチド産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、メーカーの使用説明書に従って、精製し、約３５μＬの水で回収した。次いで、ｐＨ３．８の１００ｍＭ酢酸／テトラメチルエチレンジアミン緩衝液（１００ｍＭの酢酸を調製し、ＴＥＭＥＤによりｐＨを３．８に調整して作製）４μＬ、および２２．５ｍＭのＡＲＰ（Ｎ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジン・トリフルオロ酢酸塩）水溶液（モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、ＯＲ）４μＬを加え、３７℃で６０分間インキュベートすることによって、この断片化産物を標識した。標識反応は、ｐＨ８．５の１Ｍトリス緩衝液５μＬを加えることにより停止させ、得られた産物は、上記のようにして再度精製し、約３５μＬの水で回収した。ＵＮＧ（データとして示していない）または標識試薬（ＡＲＰ）を含まない適切な対照を用いた。
この産物中に（ＡＲＰを用いた無塩基部位の標識により）組み込んだビオチンについては、５μＬの産物を３μＬの２．５ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ）水溶液と混合した後、電気泳動にかけることによって検出した。反応産物は、ＰＡＧＥゲル（４乃至２０％；インビトロジェン社（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、サンジェゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ）で分析した。ＤＮＡは臭化エチジウムを用いて可視化した。
この実験の結果については、図４のゲルの写真に示した。レーン１は５０および１００ｂｐ二本鎖ＤＮＡマーカを示し、レーン２（「非標識」と表示）は非標識の対照を示し、レーン３（「Ｌ３．８＋Ｓｔｒｅｐ」と表示）はストレプトアビジンで処理した断片化および標識オリゴヌクレオチドを示し、レーン４（「Ｌ３．８」と表示）は断片化および標識オリゴヌクレオチドを示す。一本鎖オリゴヌクレオチドが二本鎖マーカよりも遅く泳動することに留意されたい。
非標識の対照（レーン１）では、約５０ヌクレオチド長の強いバンドが出現し、約７５ヌクレオチドの出発物質のバンドがほぼ消失したことから明らかなように、ウラシルの切除およびオリゴヌクレオチドの切断はほぼ完全であることが分かった。標識で処理した反応産物（レーン４に示すように、Ｌ３．８と表示）は見かけ上同様であったが、（レーン「Ｌ３．８＋Ｓｔｒｅｐ」に示した）さらにストレプトアビジンで処理した産物は著しく遅れて、見かけの長さが数百ヌクレオチドのぼやけたバンドとして現れた。ごく一部の断片化産物はストレプトアビジンと反応しなかった。断片はＡＲＰによりほぼ完全に標識されたと結論した。
（実施例２：断片化を伴わない、ビオチンによる合成オリゴヌクレオチド無塩基部位の標識）
実施例１の９９℃断片化工程を省略し、出発オリゴヌクレオチドを配列２とした以外は、実施例１の実験を繰り返した。追加の反応として、実施例１の緩衝液をｐＨ６の１００ｍＭ酢酸／テトラメチルエチレンジアミン緩衝液（１００ｍＭの酢酸を調製し、ＴＥＭＥＤによりｐＨを６に調整して作製）とした以外は、実施例１に記載した方法による標識反応を実施した。
配列２：
５’−ＧＧＡ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＡＣ ＵＣＴ ＧＣＡ ＴＡＴ ＣＴＴ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＣＣ ＣＧＧ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＡＣ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ−３’（配列番号２）
この実験の結果については、図５に示した。レーン１は（図１に記載したように）分子量マーカを示す。一本鎖オリゴヌクレオチドが二本鎖マーカよりも遅く泳動することに留意されたい。「ＮＬ」は非標識の対照であり、「Ｌ６」は標識をｐＨ６で行った反応であり、「Ｌ３．８」は標識をｐＨ３．８で行った反応である。「−」と表示したレーンはストレプトアビジンで処理しなかった反応検体を示し、「＋」と表示したレーンはストレプトアビジンで処理した反応検体を示す。下部の矢印はストレプトアビジンにより遅延しなかったオリゴヌクレオチドの予想分子量を示し、上部の矢印はストレプトアビジンで処理したゲル遅延産物の予想位置を示す。
レーン「Ｌ６」および「Ｌ３．８」に示したように、標識と反応した産物の殆ど全てがストレプトアビジン処理により遅延させることができた。ごく一部の標識産物はストレプトアビジンと反応しなかった。断片はＡＲＰによりほぼ完全に標識されたと結論した。
これに対して、標識と反応しなかった産物（「ＮＬ」、即ち、非標識対照）はストレプトアビジン処理により遅延させることができなかった。
（実施例３：Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）産物の断片化およびビオチンによる標識の実証）
以下のように、乳癌腫瘍からの市販の総ＲＮＡ調製物（ＣＬＯＮＴＥＣＨ；カタログ番号：６４０１５−１）を用いて、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）増幅法によりデオキシウリジンを組み込んだＤＮＡ産物の混合物を調製した：
プライマー配列：
Figure 0004551216
 ここで、ｄＮは変性ヌクレオチドを表し（即ち、これはｄＡ、ｄＴ、ｄＣおよびｄＧとすることができる）、イタリック体の下線を付した文字はリボヌクレオチドを表す。
Figure 0004551216
 ここで、イタリック体の下線を付した文字はリボヌクレオチドを表す。
工程１：第１鎖ｃＤＮＡの合成。各反応混合物は以下のものを含有した：
４μｌの５Ｘ緩衝液（ｐＨ８．３の２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ；３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２）
ＭＴＢ４プライマー ＠１μＭ
２５ｍＭのｄＮＴＰ
０．２μｌのＲＮアシンリボヌクレアーゼインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎ２５１１、４０ｕ／μｌ）
１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ
１反応当たり２０ｎｇのトータルＲＮＡ
ＤＥＰＣ処理水を加えて全量１９μｌとした。
この反応混合物は、７５℃で２分間プレインキュベートした後、４２℃まで冷却した。各反応物に１反応当たり１μＬのＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、カタログ番号：２０５２１１）を加え、この反応物を４２℃で５０分間インキュベートした。
工程２：第２鎖ｃＤＮＡの合成。個々の反応チューブに、１０μｌの第１鎖ｃＤＮＡ合成反応混合物を分割した。各チューブに２０μｌの第２鎖合成ストック反応混合物を加えた。第２鎖合成ストック反応混合物は以下のものを含有した：
２μｌの１０Ｘクレノウ反応緩衝液（１０Ｘ緩衝液：ｐＨ８．０の５００ｍＭトリス−ＨＣｌ；１００ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｍＭのＮａＣｌ）
２ＵのクレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ １８０１２−０２１）
０．１μｌのＡＭＶ逆転写酵素（ＢＲＬ１８０２０−０１６、２５Ｕ／μｌ）
０．２μｌのＥ ｃｏｌｉ ＲＮＡ分解酵素Ｈ（ＢＲＬ １８０２１−０１４、４Ｕ／μｌ）
０．２μｌ（２５ｍＭ）のｄＮＴＰ
０または０．２μｌのＥ ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ１８０５２−０１９、１０Ｕ／μｌ）
これらの反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。５分間で７５℃まで加熱して酵素を不活化することにより反応を停止させた。
工程３：トータルｃＤＮＡの増幅。１μｌの上記第２鎖ｃＤＮＡ反応混液に、Ｔ４遺伝子３２蛋白質の存在下にＭＴＡ４合成プライマーを用い、５０℃で６０分間増幅を行った。各反応混合物は以下のものを含んだ：
２μｌの１０Ｘ緩衝液（ｐＨ８．５の２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のＮＰ−４０）
０．２μｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（２５ｍＭ）
２０ｍＭのｄＴＴＰおよび５ｍＭのｄＵＴＰを含むストック溶液０．２μｌ
０．２μｌのＭＴＡ４（１００μＭ）
１μｌの第２鎖ｃＤＮＡ合成混合物
０．１μｌのＲＮアシン
０．１μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ）
ＤＥＰＣ処理水を加えて全量１８．８μｌとした。
反応物を５０℃まで加熱し、８単位のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、０．０２Ｕのハイブリダーゼ・サーモステイブル・ＲｎアーゼＨ（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＲｎａｓｅＨ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｈ３９１００）および０．３μｇのＴ４遺伝子３２蛋白質（ＵＳＢ ７００２９Ｚ）を加え、この反応物をさらにこの温度で６０分間インキュベートした。
増幅させた一本鎖ＤＮＡ産物を以下の通り断片化および標識した：約２μｇのＤＮＡ産物を４０μｌのＩｓｏｔｈｅｒｍ（商標）緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に溶かした溶液を２単位のＵＮＧで処理した後、実施例１に記載した方法により、断片化し、標識した。コントロールとして、ＵＮＧおよび標識（ＡＲＰ）を用いず、加熱処理をしない反応を行った。実施例１に記載した方法により、この断片化および標識した産物の一部をアビジンで処理した。反応産物は、実施例１に記載した方法により分析し、その結果を図６に示した。
図６では以下のことを示す：
レーン１：実施例１に記載したＤＮＡ分子量マーカー
レーン２：増幅一本鎖ＤＮＡ産物
レーン３：ＵＮＧで処理し、ビオチンで標識し、加熱処理により切断した増幅一本鎖ＤＮＡ産物
レーン４：ＤＮＡ分子量マーカー
レーン５：ＵＮＧで処理し、ビオチンで標識し、加熱処理により断片化したストレプトアビジン処理増幅一本鎖ＤＮＡ産物
レーン６：（レーン３に示した、ＵＮＧで処理し、ビオチンで標識し、加熱処理により断片化した増幅一本鎖ＤＮＡ産物を含む）非ストレプトアビジン対照。
反応混合物中のＤＮＡの平均の大きさを分析した結果、レーン２のコントロール産物は平均の長さが約４００ヌクレオチド（最大の産物は約１，０００塩基超）であることが明らかになった。これに対して、レーン３のＵＮＧ処理および加熱断片化産物は、ＵＮＧおよび加熱処理後、平均の長さが１５０ヌクレオチドであり、（約１，０００塩基超の）最大の産物はほぼ完全に消失した。
ＵＮＧ処理、加熱断片化産物のアリコートをストレプトアビジンで処理した結果をレーン５に示す。レーン６はストレプトアビジン処理しなかった対照を示す。ストレプトアビジン処理により、産物のほぼ全体がより大きなサイズへとシフトし、このことは、ＵＮＧで処理し、ビオチンで標識し、加熱処理で断片化した一本鎖ＤＮＡ産物がほぼ完全に標識されたことを示す。
（実施例４：中間精製工程を実施しない、無塩基部位の作製および無塩基部位における断片化のための単一反応混合物を用いたＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ産物の効率的な標識および断片化）
マウス脳からのトータルＲＮＡ調製物（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡから入手；許可を受けて使用）を用いて、デオキシウリジン組み込みＤＮＡ産物の混合物を以下のように調製した：
工程１：第１鎖ｃＤＮＡの合成。各反応混合物は以下のものを含んだ：
４μｌの５Ｘ緩衝液（ｐＨ８．３の２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ；３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２）
ＭＴＢ４プライマー＠０．２５μＭ
０．２μＬの２５ｍＭのｄＮＴＰ
０．２５μｌのＲＮアシンリボヌクレアーゼインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎ２５１１、４０ｕ／μｌ）
１反応当たり２０ｎｇのトータルＲＮＡ
ＤＥＰＣ処理水を加えて全量１９μｌとした。
これらの反応混合物は、６５℃で２分間プレインキュベートした後、４２℃まで冷却した。各反応物に１反応当たり１μＬのＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、カタログ番号：２０５２１１）を加え、これらの反応物を４８℃で６０分間、次いで、７０℃で１５分間インキュベートした。
工程２：第２鎖ｃＤＮＡの合成。個々の反応チューブに全量２０μｌの第１鎖ｃＤＮＡ合成反応混合物を分割した後、各チューブに２０μｌの第２鎖合成ストック反応混合物を加え、混合した。第２鎖合成ストック反応混合物は以下のものを含んだ：
１μｌの１０Ｘクレノウ反応緩衝液（１０Ｘ緩衝液：ｐＨ８．０の５００ｍＭトリス−ＨＣｌ；１００ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｍＭのＮａＣｌ）
１ｍＭのＤＴＴ
１Ｕ／μｌのエキソ−クレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢカタログ番号：７００５７Ｚ）
０．０２Ｕ／μｌのＲＮＡ分解酵素Ｈ（ＵＳＢカタログ番号：７００５４Ｚ）
０．２μｌ（２５ｍＭ）のｄＮＴＰ
０．４Ｕ／μｌのＲＮアシン（ＵＳＢカタログ番号：７１５７１）
水を加えて全量２０μｌとした。
これらの反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。反応は、２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えて停止させた。
工程３：トータルｃＤＮＡの増幅：５μｌの第２鎖ｃＤＮＡ反応混合物を８つの２０μｌ反応混合物に分割した。各反応混合物は、以下のものを含んだ：
２μｌの１０Ｘ緩衝液（ｐＨ８．５の２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のＮＰ−４０）
０．２μｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（２５ｍＭ）
２０ｍＭのｄＴＴＰおよび５ｍＭのｄＵＴＰを含むストック０．２μＬ
０．２μｌのＭＴＡ４（１００μＭ）
５μｌの第２鎖ｃＤＮＡ合成混合物
０．１μｌのＲＮアシン
ＤＥＰＣ処理水を加えて全量１８．８μｌとした。
反応物を氷上に置き、８単位のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、０．０２ＵのハイブリダーゼサーモステイブルＲｎアーゼＨ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｈ３９１００）、および０．３μｇのＴ４遺伝子３２蛋白質（ＵＳＢ７００２９Ｚ）を加えた。反応物を５０℃で６０分間置いた後、８０℃で５分間加熱することにより増幅を停止させた。
ウラシルの除去（による無塩基部位の作製）および無塩基部位の断片化を同一反応混合物で以下の通り行った：７６μｌの未精製増幅反応産物を、３．２μＬのＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン緩衝液（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；水で０．５Ｍ溶液に希釈することにより調製し、ＨＣＬでｐＨを８．５に調整して調製）および４単位のＨＫ−ＵＮＧ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と混合した。この混合物を、３７℃で６０分間インキュベートした後、６．８μＬの１Ｍ酢酸水溶液、２μＬの０．２Ｍ ＭｇＣｌ２水溶液および８μＬのＡＲＰ溶液（２２．５ｍＭのＮ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジントリフルオロ酢酸塩水溶液；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから入手；カタログ番号：Ａ−１０５５０）を加えた。この反応混合物を３７℃でさらに６０分間インキュベートした後、反応混合物を２本のチューブに分割し、実施例１〜３に記載した通りに精製した。断片化および標識した反応産物を、水で溶出して回収した。この断片化および標識産物の一部を、基本的に実施例１に記載した通りに、ストレプトアビジンで処理した。
コントロール反応混合物としては、ＨＫ−ＵＮＧを含まない反応混合物、もしくはＱｌＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、メーカーの使用説明書に従って、先ずＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）産物を精製した後に、前述の通りに断片化および標識を行う反応混合物を用いた。この断片化および標識産物の一部は、基本的に実施例１に記載した通りに、ストレプトアビジンで処理した。
以下の反応は、実施例１に記載した通りにＰＡＧＥゲルを用いて分析した（データは示されていない）：
レーン１：５０および１００ｂｐ二本鎖ＤＮＡ分子量マーカー。
レーン２：ＵＮＧを含まないコントロール。
レーン３：ストレプトアビジンと反応させたこと以外はレーン２と同じ。
レーン４：精製Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）産物を用いて調製した実施例４の反応産物。
レーン５：ストレプトアビジンと反応させたこと以外はレーン４と同じ。
レーン６：未精製Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）産物を用いて調製した実施例４の反応産物。
レーン７：ストレプトアビジンと反応させたこと以外はレーン６と同じ。
反応混合物中のＤＮＡの平均の大きさを分析した結果、レーン２のＵＮＧを含まないコントロール産物は平均の長さが約４００ヌクレオチド（最大の産物は約１，０００塩基超）であることが明らかになった。ＵＮＧを含まないコントロール産物のアリコートをストレプトアビジンで処理した。ストレプトアビジン処理ではこの産物のバンドのより大きなサイズへのシフトは生じず、この一本鎖ＤＮＡ産物が、予想通り、ビオチンで標識されなかったこと、およびストレプトアビジンとＤＮＡとの非特異的相互作用がゲル上のシフトをもたらさないことが明らかとなった。
これに対して、レーン４および６のＵＮＧ処理、ジメチルエチレンジアミン断片化産物は、ＵＮＧおよびジメチルエチレンジアミン処理後、平均の長さが約２５０ヌクレオチドとなり、（約１，０００塩基超の）最大の産物はほぼ完全に消失した。未精製Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ一本鎖ＤＮＡを用いて調製したＵＮＧ処理、ジメチルエチレンジアミン断片化産物（レーン６）と、精製Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ一本鎖ＤＮＡを用いて調製したＵＮＧ処理、ジメチルエチレンジアミン断片化産物（レーン４）との間に、産物の長さに差は認められなかった。
未精製Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ一本鎖ＤＮＡを用いて調製したＵＮＧ処理、ジメチルエチレンジアミン断片化産物（レーン６）のアリコート、および精製Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ一本鎖ＤＮＡを用いて調製したＵＮＧ処理、ジメチルエチレンジアミン断片化産物（レーン４）のアリコートをストレプトアビジンで処理した結果を、それぞれレーン５およびレーン７に示した。ストレプトアビジン処理により、産物のほぼ全体がより大きなサイズへとシフトし、ＵＮＧで処理し、ビオチンで標識し、ジメチルエチレンジアミン処理で断片化した一本鎖ＤＮＡ産物がほぼ完全に標識されたことが示された。
ＵＮＧ非処理対照産物（上記レーン２に該当）のアリコート、および精製Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ一本鎖ＤＮＡを用いて調製したＵＮＧ処理、ジメチルエチレンジアミン断片化産物（上記レーン４に該当）のアリコートは、さらに、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ）、マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）、ＣＡ）を用いるゲル電気泳動により分析した。図７は、重ね合わせて得られた以下の通りのエレクトロフェログラムを示す：
・１９秒（「ｓｅｃ」）の位置で狭い間隔で並んだピーク（「Ａ」と表示）は全ての検体に含ませた内部マーカである。ほぼ一致した溶出時間は、この機器が再現性よく動作していることを示すものである。
・２２秒の位置の鋭いピークは、サイズ・マーカとして用いた合成一本鎖７５ｍｅｒオリゴヌクレオチドである（「Ｂ」と表示）。
・２１秒の位置に中心がある幅広のピークは、精製Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ一本鎖ＤＮＡを用いて調製したＵＮＧ処理、ジメチルエチレンジアミン断片化産物である（「Ｃ」と表示）；レーン６からの物質が極めて似ているように思われた。
・約４２秒の位置にまで及ぶさらに幅広のピークは、非断片化対照（ＵＮＧ非処理対照産物）である（「Ｄ」と表示）。
比較のため、一連のＲＮＡマーカー（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）、オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）、ＴＸ）についても図７に示す。マーカ・サイズは、（それぞれ、約２１、２３．５、２７、３０、３４、および３９秒の位置に並んでいる）０．２、０．５、１、２、４、および６ｋｂである。
上記の従来のゲルによる結果およびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによる結果は共に、ＵＮＧ非処理対照と比べて、ＵＮＧ処理Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭ産物が断片化されることを証明している。この相違はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースにおいてさらに著しい。何故なら、この従来のゲルの染色では、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで用いる染色剤に比し小さな一本鎖ＤＮＡを十分に染色しない臭化エチジウムを使用したからである。
（実施例５：アミノオキシ誘導体化色素によるＲｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭ産物の標識）
Ｉｄｅほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２：ｐ８２７６−８３（１９９３年）に（化合物２の化合物５への変換として）開示されている合成プロトコルを用い、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５のヒドラジド（「ＡＦ５５５」もしくは「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒヒドラジド」）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をアミノオキシ誘導体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５−ＮＨＮＨＣＯＣＨ２ＯＮＨ２（「ＡＦ５５５−アミノオキシ」）に変換した。Ｉｄｅの文献で化合物２として示された出発物質ＢＯＣ−アミノオキシ酢酸はアルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手可能である。最終産物をＨＰＬＣで精製した後、この産物の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をＨＰＬＣおよび質量分析法により確認し、これにより出発物質より７３質量単位大きい質量であることが示された。
このアミノオキシ誘導体化色素を水に溶かして２．１ｍＭ溶液とした。アリコートを水で１：１０００に希釈し、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＤＵ５２０分光光度計で分析した。このアミノオキシ誘導体化色素は、非修飾Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５と同じＵＶスペクトルを保持していた（データには示されていない）。
ユニバーサル・ヒューマン・リファレンス（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）ＲＮＡ（ストラテジーン社（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、カタログ番号Ａ７４００００）（反応「Ｕ」）もしくはヒューマン・ユニバーサル・リファレンス（Ｈｕｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）トータルＲＮＡ（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）カタログ番号６４１１５−１）（反応「Ｃ」）から、基本的に実施例４に記載した通りに、ｄＵＴＰを含む一本鎖増幅ＤＮＡ産物を調製した。次いで、実施例４に記載した方法で、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを用いて、一本鎖ＤＮＡ産物（「Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭ」産物と呼ぶ）を精製した。
精製Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭ産物の標識は以下のように行った：ＳｐｅｅｄＶａｃを用い、反応ＵもしくはＣからのＲｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭＤＮＡ産物約１０μｇを８０μＬの水溶液に濃縮した。各産物に、ＨＫ−ＵＮＧ（１０単位；エピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩ）および８μＬの１０×Ｉｓｏｔｈｅｒｍ（登録商標）緩衝液（エピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩ）を加え、この混液を３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、各反応混液を０．２ｍＬチューブ中に分割した。各検体の一方のチューブには１．７μＬの１Ｍ酢酸水溶液および３μＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ヒドラジド水溶液（総量７．１ｍＭもしくは２１．３ｎｍｏｌ）を加え、他方のチューブには１．７μＬの１Ｍ酢酸水溶液および１０．２μＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５のアミノオキシ誘導体水溶液（総量２．１ｍＭもしくは２１．４ｎｍｏｌ）を加えた。これをさらに３７℃で６０分間インキュベートし、−２０℃で一夜貯蔵した後、各チューブに５μＬの１Ｍトリス（ｐＨ８．５）を加えた。全ての産物は、前述のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲカラムを用いて精製し、各産物を６０μＬの水中に溶出させた。
断片化Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ産物内へ組み込んだ色素については、５５１ｎｍの色素吸光度と２６０ｎｍのＤＮＡ吸光度とを、色素の減衰係数を１５０，０００とし、ＤＮＡの１ＯＤ＝３３μｇ／ｍＬと仮定して比較することにより分析した。この分析の結果はｐｍｏｌ色素／ｕｇ ＤＮＡで表し、表１に「色素」の名称を付したカラムに示した。
（表１）
Figure 0004551216
 断片化Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ産物に組み込まれた色素の蛍光強度は、さらに以下の通り分析した。０．５μｇの検体を１５μｌの水に溶かした溶液を４容量のＧｅｎｅＴａｃハイブリダイゼーション緩衝液（ジェノミック・ソリューション社（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、ＭＩ）で希釈し、前述のＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを用いて再精製し、精製産物を真空下に８μｌに減じた。次いで、２μｌのアリコートを１６０μｌの水で希釈した。２つの８０μｌのアリコートについて、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２蛍光光度計（Ｅｘ＝５４４ ｎｍ；Ｅｍ＝５９５ｎｍ）を用い、蛍光を測定し、その結果を平均した。この分析の結果については表１の「蛍光」の名称を付したカラムに示す。
色素の吸光度および蛍光分析のデータは、色素がＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ産物に組み込まれたことを示すものである。以上の結果は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ヒドラジドなどの市販の色素含有ヒドラジド試薬を用いて、ＵＮＧ処理により調製した無塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ産物を標識することができることを証明している。
Ａｌｅｘａ５５５のアミノオキシ誘導体を用いると、非修飾Ａｌｅｘａ−５５５−ヒドラジド色素を用いて取り込まれる色素に比し、３．２乃至４．１倍多い色素が取り込まれた。この結果から、Ａｌｅｘａ５５５色素をアミノオキシ誘導体に変換すると、標識がより効率的になることが分かった。
Ａｌｅｘａ−５５５ヒドラジド（非修飾）−標識検体に比し、約３０倍強い蛍光をＡｌｅｘａ−５５５−アミノオキシ（誘導体化）−標識検体から検出した。従って、Ａｌｅｘａ−５５５色素のアミノオキシ誘導体は、より高い輝度を示す。
これらの検体はさらに精製したことを述べておく。蛍光強度の比率が増大したことは、Ａｌｅｘａ−５５５ヒドラジド−標識検体内の色素の一部が共有結合していなかったことにより、蛍光分析の前の更なる精製工程によって除去されたことを示すものと考えられる。あるいは、またはさらに、このアミノオキシ誘導体の色素部分からの蛍光は、Ａｌｅｘａ−５５５−アミノオキシ誘導体中に存在するリンカーがより長いため、ＤＮＡとの相互作用により消光されにくいのかも知れない。
（実施例６：マイクロアレイにハイブリッド形成させた断片化、標識ポリヌクレオチドの検出）
ラット脳およびラット腎臓からの総ＲＮＡ（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）、オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）、ＴＸ、Ｃａｔ．Ｎｏｓ７９１２および７９２６）から総ｍＲＮＡを増幅した後、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡＴＭ産物を精製後に断片化および標識を行う実施例４の対照反応で説明したようにして、これを断片化し、ビオチンで標識した。ハイブリッド形成用の断片化および標識プローブは、以下のようにして調製した：各断片化および標識産物の２μｇのアリコートを水６５μＬに溶かした溶液を６５μＬのホルムアミドと混合し、これを０．２ｍＬの肉薄ＰＣＴチューブ中、９９℃で２分間加熱して変性させた後、氷上で冷やした。これに、等量の２×ＧｅｎｅＴＡＣ緩衝液（ジェノミック・ソリューション社（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、ＭＩ）を加え、この混液をＣｏｄｅＬｉｎｋマイクロアレイ（Ｕｎｉｓｅｔ Ｒａｔ １、Ｐａｒｔ＃３０００１２−０３、モトローラ・ライフ・サイエンシーズ社（Ｍｏｔｏｒｏｌａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、ノースブルック（Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏｋ）、ＩＬ）にアプライし、メーカーの使用説明書に従ってハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成後の処理として、１時間の１回インキュベーションではなく、４６℃で３０分間のインキュベーションを２回行ったが、他の点ではメーカーの使用説明書にも従った。検出には、メーカーの説明通り、１：１００希釈のストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７を用いた。スライドは、Ａｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ ６０００スキャナー（アクソン・インストルメンツ社（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）、ユニオンシティー（Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ）、ＣＡ）でスキャンした。
出発ｍＲＮＡ検体（即ち、脳と腎臓）によって異なるスポット・パターンが認められ、本発明の方法により調製した標識および断片化ポリヌクレオチドを用いる発現分析によって種々組織のＲＮＡの差次的発現を検出し得ることが示された。広範囲のシグナル強度が認められたことから、結合は、表面のＤＮＡに対する非特異的な結合ではなく、異なるスポットに固定化された異なる捕捉配列に特異的であることが明らかとなった。
別の実験では、前記ＳＰＩＡＴＭ産物を精製後に断片化および標識を行う実施例４の対照反応で説明したようにして、ラット腎臓からの総ＲＮＡ（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）、オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）、ＴＸ、Ｃａｔ．Ｎｏ７９２６）を増幅し、断片化し、２連で（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ビオチン標識した。ハイブリッド形成用のプローブは、以下のようにして調製した：各断片化および標識産物の２μｇのアリコートを水６５μＬに溶かした溶液を６５μＬのホルムアミドと混合し、これを０．２ｍＬの肉薄ＰＣＴチューブ中、９９℃で２分間加熱して変性させた後、氷上で冷やした。これに、等量の２ｘＧｅｎｅＴＡＣ緩衝液（ジェノミック・ソリューション社（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、ＭＩ）を加え、この混液をＣｏｄｅＬｉｎｋマイクロアレイ（Ｕｎｉｓｅｔ Ｒａｔ １、Ｐａｒｔ＃３０００１２−０３、モトローラ・ライフ・サイエンシーズ社（Ｍｏｔｏｒｏｌａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、ノースブルック（Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏｋ）、ＩＬ）にアプライし、メーカーの使用説明書に従ってハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成後の処理として、１時間の１回インキュベーションではなく、４６℃で３０分間のインキュベーションを２回行ったが、他の点ではメーカーの使用説明書にも従った。検出には、メーカーの説明通り、１：１００希釈のストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７を用いた。スライドは、Ａｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ ６０００スキャナー（アクソン・インストルメンツ社（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）、ユニオンシティー（Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ）、ＣＡ）でスキャンした。
ハイブリッド形成の強度を２連のハイブリッド形成間で比較した。モトローラ・ライフ・サイエンシーズ社から入手可能なＣｏｄｅｌｉｎｋＴＭシステム・ソフトウェアにより算出したピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数を用いて、相関関係を算定した。２つの独立したハイブリッド形成反応間に認められた相関関係については、アレイ上の各スポットに見られた強度間でプロットし、図８に示した。少なくとも３桁の有用なシグナル・レンジ（ダイナミック・レンジ）が得られ、断片化および標識反応によりビオチン標識が十分に組み込まれて広いレンジにわたって遺伝子発現の検出が可能となることが分かった。バックグラウンドに対して３桁強いシグナルが認められたことから、アレイ上のスポットに対する結合は個々のスポットに固定化される配列に特異的であることが明らかになった。さらに、２連のアレイ間の相関が良好である（相関係数ｒ＝０．９８）ことから、増幅および検出プロセス全体の特異性が確認された。
これまで本発明について、理解し易くするために説明および実施例によっていくらか詳しく述べてきたが、特定の変更および修正をおこなうことができることは当業者には明瞭に理解されよう。従って、以上の説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
図１は、核酸を断片化し、標識する方法の概略図を示す。「Ｒ」は核酸残基を表す。 図２は、核酸を標識する方法の概略図を示す。「Ｒ」は核酸残基を表す。 図３は、核酸を表面に固定化する方法の概略図を示す。「Ｒ」は核酸残基を表す。 図４は、（１）オリゴヌクレオチド中に存在する非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断により無塩基部位を作製し、（２）そのホスホジエステル骨格をこの無塩基部位で切断し、および（３）無塩基部位を特異的に標識することができる物質を用いてこの無塩基部位を標識することによって作製した断片化された標識ポリヌクレオチド断片を呈示するゲルを示す。 図５は、（１）オリゴヌクレオチド中に存在する非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断により無塩基部位を作製し、および（２）無塩基部位を特異的に標識することができる物質を用いてこの無塩基部位を標識することによって作製した標識ポリヌクレオチドを呈示するゲルを示す。 図６は、本発明の断片化および標識方法によって合成した標識ポリヌクレオチドの断片であって、この合成ポリヌクレオチドを、全文引用により本明細書に組み込まれているＫｕｒｎの米国公開特許第２００３／００８７２５１Ａ１号に開示されている単一プライマー増幅（ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｉｍｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いて増幅した断片を呈示するゲルを示す。 図７は、本発明の断片化および標識方法によって合成した標識ポリヌクレオチドの断片であって、この合成ポリヌクレオチドを、全文引用により本明細書に組み込まれているＫｕｒｎの米国公開特許第２００３／００８７２５１Ａ１号に開示されている単一プライマー増幅（ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｉｍｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いて増幅し、ＵＮＧ処理およびアミンによる断片化工程を同一反応混合物において実施した断片を呈示する電気泳動図を示す。 図８は、Ｋｕｒｎの米国公開特許第２００３／００８７２５１Ａ１号に開示されている単一プライマー増幅法を用いる２つの個別のＲｉｂｏＳＰＩＡ（登録商標）増幅反応により作製された２群の標識断片間に認められた相関関係を表すグラフを示す。各検体を２つの同一アレイにハイブリッド形成させた後、これらのアレイのスポットごとに認められた強度間でプロットした。ピアソン相関係数を算出したところ、２つ組のアレイ間で統計的に有意な相関が認められた（相関係数ｒ＝０．９８）。

Claims (63)

  1. ポリヌクレオチドを断片化し、そして標識する方法であって、
    （ａ）非共通ヌクレオチドの存在下に鋳型ポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを合成することにより、該非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する工程、
    （ｂ）非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素を用いて該合成ポリヌクレオチドから非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することにより、無塩基部位を作製し、そして、同じ反応および同じ条件下において該無塩基部位を含む該ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格をアミンを用いて該無塩基部位において切断する工程、および
    （ｃ）該ポリヌクレオチドの断片を該無塩基部位において標識する工程、を包含し、
    これにより標識ポリヌクレオチド断片を作製する、方法。
  2. ポリヌクレオチドを断片化し、そして標識する方法であって、
    （ａ）反応混合物をインキュベートし、該反応混合物が
    （ｉ）鋳型ポリヌクレオチドおよび
    （ｉｉ）非共通ヌクレオチドを含むものとし、該インキュベーションを、該非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成を可能にする条件下で行うことにより、該非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを作製する工程、
    （ｂ）反応混合物をインキュベートし、該反応混合物が
    （ｉ）該非共通ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチド、
    （ｉｉ）該非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素、および
    （ｉｉｉ）該無塩基部位を含む該ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を該無塩基部位において切断することができるアミン
    を含むものとし、該インキュベーションを、該非共通ヌクレオチドの該塩基部分の切断を可能にする条件下で行うことにより、無塩基部位を含むポリヌクレオチドを作製し、該インキュベーションを、該ポリヌクレオチドの該ホスホジエステル骨格の該無塩基部位における切断を可能にする条件下で行うことにより、該ポリヌクレオチドの断片を作製する工程、
    （ｃ）反応混合物をインキュベートし、該反応混合物が
    （ｉ）該無塩基部位を含む該ポリヌクレオチドの断片、および
    （ｉｉ）該無塩基部位を標識することができる物質
    を含むものとし、該インキュベーションを、該無塩基部位における標識を可能にする条件下で行うことにより、標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程、
    を含む、方法であって、
    ここで、該非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を可能にする条件と、該無塩基部位において該ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格の切断を可能にする条件とが同一の条件である、方法。
  3. ポリヌクレオチドを断片化し、そして標識する方法であって、
    （ａ）反応混合物をインキュベートし、該反応混合物が
    （ｉ）請求項１の工程（ａ）の該非共通ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチド、
    （ｉｉ）該非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素、および
    （ｉｉｉ）該無塩基部位を含む該ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格を該無塩基部位において切断することができるアミンを含むものとし、該インキュベーションを、該非共通ヌクレオチドの該塩基部分の切断、および該ポリヌクレオチドの該ホスホジエステル骨格の該無塩基部位における切断を可能にする条件下で行うことにより、該無塩基部位を含む該ポリヌクレオチドの断片を作製する工程であって、ここで、該非共通ヌクレオチドの塩基部分の切断を可能にする条件と、該無塩基部位において該ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格の切断を可能にする条件とが同一の条件である、工程、ならびに
    （ｂ）反応混合物をインキュベートし、該反応混合物が
    （ｉ）該無塩基部位を含む該ポリヌクレオチドの断片、および
    （ｉｉ）該無塩基部位を標識することができる物質を含むものとし、該インキュベーションを、該無塩基部位の標識を可能にする条件下で行うことにより、該ポリヌクレオチドの標識断片を作製する工程、
    を含む、方法。
  4. 請求項１〜３のうちの任意の１項の方法であって、該無塩基部位を含む該ポリヌクレオチドの該ホスホジエステル骨格は該無塩基部位において切断される、方法。
  5. 請求項１〜４のうちの任意の１項の方法であって、該非共通ヌクレオチドがｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、および５−ＯＨ−Ｍｅ−ｄＣＴＰからなる群から選ばれる、方法。
  6. 請求項１〜５のうちの任意の１項の方法であって、該非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる該酵素がＮ−グリコシラーゼである、方法。
  7. 請求項１〜６のうちの任意の１項の方法であって、該非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる該酵素がウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ヒポキサンチン−Ｎ−グリコシラーゼ、およびヒドロキシメチルシトシン−Ｎ−グリコシラーゼからなる群から選ばれる、方法。
  8. 請求項１〜７のうちの任意の１項の方法であって、該非共通ヌクレオチドがｄＵＴＰであり、該非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる該酵素がウラシルＮ−グリコシラーゼである、方法。
  9. 請求項１〜８のうちの任意の１項の方法であって、該ホスホジエステル骨格はＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンによって切断される、方法。
  10. 請求項１〜９のうちの任意の１項の方法であって、該非共通ヌクレオチドがｄＵＴＰであり、該非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる該酵素がウラシルＮ−グリコシラーゼであり、該ホスホジエステル骨格はＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンによって切断される、方法。
  11. 請求項１〜１０のうちの任意の１項の方法であって、該ホスホジエステル骨格は該無塩基部位の３’末端側で切断される、方法。
  12. 請求項１〜１１のうちの任意の１項の方法であって、該ホスホジエステル骨格は該無塩基部位の５’末端側で切断される、方法。
  13. 請求項１〜１２のうちの任意の１項の方法であって、該無塩基部位はＮ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジン・トリフルオロ酢酸塩（ＡＲＰ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（登録商標）、もしくはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（登録商標）のアミノオキシ誘導体により標識される、方法。
  14. 請求項１〜１３のうちの任意の１項の方法であって、該標識が該無塩基部位のアルデヒド残基と反応することができる、方法。
  15. 請求項１〜１４のうちの任意の１項の方法であって、該非共通ヌクレオチドがｄＵＴＰであり、該非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる該酵素がウラシルＮ−グリコシラーゼであり、および該ホスホジエステル骨格はＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンによって切断され、および該無塩基部位はＡＲＰにより標識される、方法。
  16. 請求項１〜１５のうちの任意の１項の方法であって、該鋳型ポリヌクレオチドがＤＮＡもしくはＲＮＡを含む、方法。
  17. 請求項１〜１６のうちの任意の１項の方法であって、該鋳型ポリヌクレオチドがＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡからなる群から選ばれる、方法。
  18. 請求項１〜１７のうちの任意の１項の方法であって、非共通ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチドが一本鎖である、方法。
  19. 請求項１〜１８のうちの任意の１項の方法であって、非共通ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチドが二本鎖である、方法。
  20. 請求項１〜１９のうちの任意の１項の方法であって、該非共通ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチドが以下の工程；
    （ａ）（ｉ）鋳型ポリヌクレオチド、および
    （ｉｉ）ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー
    を含む複合体内の該複合プライマーを伸長し、該鋳型ポリヌクレオチドは該複合プライマーとハイブリッドを形成するものとする工程、ならびに
    （ｂ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて該アニーリングした複合プライマーのＲＮＡを切断することにより、別の複合プライマーを該鋳型とハイブリッド形成させ、鎖置換によるプライマー伸長を反復させることによって、該鋳型ポリヌクレオチドの相補性配列の複数のコピーを作製する工程
    を含む方法を用いて合成される、方法。
  21. 請求項２０の方法であって、工程（ａ）の複合体が
    （ｉ）第１および第２のプライマー伸長産物の複合体であって、該第１のプライマー伸長産物は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を用いて目的ＲＮＡとハイブリッド形成した第１のプライマーを伸長させることにより作製され、該第１のプライマーはＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、該第１および第２のプライマー伸長産物の複合体内のＲＮＡは、該第２のプライマー伸長産物に複合プライマーをハイブリッド形成させられるように、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する少なくとも１種の酵素を用いて切断される複合体、ならびに
    （ｉｉ）該複合プライマー
    を含む、方法。
  22. 請求項１乃至１９のうちの任意の１項の方法であって、非共通ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチドはＰＣＲ法、逆転写法、プライマー伸長法、限定プライマー伸長法、複製法、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、もしくはニック・トランスレーション法により合成される、方法。
  23. 請求項１〜２２のうちの任意の１項の方法であって、非共通ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチドは標識プライマーを用いて合成される、方法。
  24. 請求項１〜２３のうちの任意の１項の方法であって、非共通ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチドは、非共通ヌクレオチドを含むプライマーを用いて合成される、方法。
  25. 請求項１〜２４のうちの任意の１項の方法であって、非共通ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチドは２種以上の異なる非共通ヌクレオチドの存在下に合成され、これにより、２種以上の異なる非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが合成される、方法。
  26. 請求項１〜２５のうちの任意の１項の方法であって、２種以上の異なる鋳型ポリヌクレオチドから非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを合成することを含む、方法。
  27. 請求項１もしくは２の方法であって、工程（ｂ）および（ｃ）は同じ反応混合物において実施される、方法。
  28. 請求項１もしくは２の方法であって、工程（ｂ）は工程（ｃ）の前に実施される、方法。
  29. 請求項１もしくは２の方法であって、工程（ｃ）は工程（ｂ）の前に実施される、方法。
  30. 請求項１〜２９のうちの任意の１項の方法であって、さらに、該標識ポリヌクレオチド断片を基体に固定化することを含み、該ポリヌクレオチドを無塩基部位において固定化するものとする、方法。
  31. ポリヌクレオチド断片を固定化する方法であって、
    （ａ）非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することができる酵素を用いて該非共通ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドから非共通ヌクレオチドの塩基部分を切断することにより、無塩基部位を含むポリヌクレオチドを作製し；そして、同じ反応および同じ条件下において該無塩基部位を含む該ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格をアミンを用いて該無塩基部位において切断する工程；および
    （ｂ）工程（ａ）の該無塩基部位を含む該ポリヌクレオチドの該断片を固定化する工程を含み、ポリヌクレオチドの該断片が該無塩基部位において基体に固定化されるものとする、方法。
  32. 請求項３０もしくは３１の方法であって、該基体が紙、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、もしくは光ファイバーである、方法。
  33. 請求項３０もしくは３１の方法であって、該基体がマイクロアレイである、方法。
  34. 請求項３３の方法であって、該基体がピン、棒材、ファイバー、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイター・ウェル、キャピラリ、光ファイバー、もしくはシリンダを含む、方法。
  35. 請求項３０もしくは３１の方法であって、該基体が蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、炭水化物、細胞、有機分子、および無機分子からなる群から選ばれる、方法。
  36. 対象とするポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、（ａ）請求項１乃至２９のうちの任意の１項の方法を用いて標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程、ならびに（ｂ）該標識ポリヌクレオチド断片を分析する工程を含む、方法。
  37. 請求項３６の方法であって、該標識ポリヌクレオチド断片を分析する工程（ｂ）が該ポリヌクレオチド断片の量を測定することを含むことにより該鋳型ポリヌクレオチドの量が定量されるものとする、方法。
  38. 請求項３６の方法であって、工程（ｂ）が該標識ポリヌクレオチド断片を少なくとも１種のプローブと接触させることを含む、方法。
  39. 請求項３８の方法であって、該少なくとも１種のプローブはマイクロアレイとして設けられる、方法。
  40. 請求項３９の方法であって、該マイクロアレイが紙、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、および光ファイバーからなる群から選ばれる物質から作製した基体に固定化した少なくとも１種のプローブを含む、方法。
  41. 請求項４０の方法であって、該プローブがピン、棒材、ファイバー、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイター・ウェル、キャピラリ、およびシリンダを含む二次元構造もしくは三次元構造の基体に固定化される、方法。
  42. 検体の遺伝子発現プロフィルを明らかにする方法であって、
    （ａ）請求項１乃至２９のうちの任意の１項の方法を用いて該検体中の少なくとも１種の鋳型ポリヌクレオチドから標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程、ならびに
    （ｂ）各鋳型ポリヌクレオチドの標識ポリヌクレオチド断片の量を測定し、各該量が該検体中の各鋳型ポリヌクレオチドの量を示すものとし、これにより、該検体中の遺伝子発現プロフィルを明らかにする工程、
    を含む、方法。
  43. 請求項４２の方法であって、該鋳型ポリヌクレオチドがＲＮＡもしくはｍＲＮＡである、方法。
  44. 請求項１乃至２９のうちの任意の１項の方法を用いて標識ポリヌクレオチド断片を作製することを含む、ハイブリダイゼーション・プローブを作製する、方法。
  45. （ａ）請求項１乃至２９のうちの任意の１項の方法を用いて標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程、ならびに
    （ｂ）該標識ポリヌクレオチド断片を少なくとも１種のプローブとハイブリッド形成させる工程、
    を含む核酸のハイブリッド形成、方法。
  46. 比較ハイブリダイゼーションの方法であって、
    （ａ）請求項１乃至２９のうちの任意の１項による方法を用いて第１の鋳型ポリヌクレオチド検体から標識ポリヌクレオチド断片の第１の集団を調製する工程、および
    （ｂ）該第１の集団の少なくとも１種のプローブとのハイブリッド形成と、標識ポリヌクレオチド断片の第２の集団のハイブリッド形成とを比較する工程、
    を含む、方法。
  47. 請求項４６の方法であって、該第１の集団および第２の集団が検出可能なように異なる標識を含む、方法。
  48. 請求項４６もしくは４７による方法であって、標識ポリヌクレオチド断片の該第２の集団が、請求項１乃至２９のうちの任意の１項による方法を用いて第２のポリヌクレオチド検体から調製される、方法。
  49. 請求項４６、４７もしくは４８の方法であって、比較する工程（ｂ）が該産物の量を測定することを含むことにより、第１および第２の鋳型ポリヌクレオチドの量が定量される、方法。
  50. 請求項４６、４７、４８もしくは４９の方法であって、該第１および第２の鋳型ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡを含む、方法。
  51. （ａ）請求項１乃至２９の方法のうちの任意の方法により標識ポリヌクレオチド断片を作製する工程、および
    （ｂ）該標識ポリヌクレオチド断片を分析することにより変異の有無を検出する工程
    を含む、鋳型内の変異の有無を検出する、方法。
  52. 請求項５１の方法であって、該標識ポリヌクレオチド断片を対照鋳型と比較する、方法。
  53. 請求項５１もしくは５２の方法であって、該変異が塩基置換、塩基挿入、塩基欠失および単一ヌクレオチド多型性からなる群から選ばれる、方法。
  54. 請求項１乃至３０および３１乃至５３のうちの任意の１項の方法に用いるためのキットであって、（ａ）非共通ヌクレオチド、（ｂ）ＵＮＧ、（ｃ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、（ｄ）無塩基部位を標識することができる物質、（ｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｆ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに（ｇ）ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断することができる作用因子を含む、キット。
  55. 請求項５４のキットであって、さらに（ｈ）酢酸溶液、および（Ｉ）ＭｇＣｌ２溶液を含む、キット。
  56. 請求項５４もしくは５５のキットであって、（ｄ）がＡＲＰである、キット。
  57. 請求項５４、５５もしくは５６のキットであって、（ａ）がｄＵＴＰである、キット。
  58. 請求項１乃至３０および３１乃至５３のうちの任意の１項の方法に用いるためのキットであって、（ａ）（ｉ）非共通ヌクレオチド、（ｉｉ）ＵＮＧ、（ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、および（ｉｖ）無塩基部位を標識することができる物質のうちの１種以上、ならびに（ｂ）ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーを含む、キット。
  59. 請求項１乃至３０および３１乃至５３のうちの任意の１項の方法に用いるためのキットであって、（ａ）（ｉ）非共通ヌクレオチド、（ｉｉ）ＵＮＧ、（ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、および（ｉｖ）無塩基部位を標識することができる物質のうちの１種以上、ならびに（ｂ）ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断することができる作用因子を含む、キット。
  60. 請求項５８もしくは５９のキットであって、（ｉ）がｄＵＴＰである、キット。
  61. 請求項５８もしくは５９のキットであって、（ｉｖ）がＡＲＰである、キット。
  62. 請求項５８のキットであって、該複合プライマーの該ＲＮＡ部分が該３’ＤＮＡ部分に対して５’末端側であり、該５’ＲＮＡ部分が該３’ＤＮＡ部分に隣接し、該複合プライマーの該ＲＮＡ部分が１０乃至２０ヌクレオチドからなり、および該複合プライマーの該ＤＮＡ部分が７乃至２０ヌクレオチドからなる、キット。
  63. 請求項５９のキットであって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する該作用因子がＲＮＡアーゼＨである、キット。
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