DE60132924T2 - Zusammensetzungen und methoden zur detektion von humanem immundefizienz virus 2 (hiv-2) - Google Patents

Zusammensetzungen und methoden zur detektion von humanem immundefizienz virus 2 (hiv-2) Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biotechnologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf diagnostische Assays zum Nachweis von HIV-2 Nukleinsäuresequenzen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Obwohl die HIV/AIDS Pandemie hauptsächlich auf die Infektion durch HIV-1 zurückzuführen ist, ist ein anderer Retrovirus als eine andere Ursache von AIDS aufgetaucht. Dieser sogenannte „HIV-2" Virus wurde zuerst 1986 aus AIDS-Patienten in West-Afrika isoliert und wurde danach zum ersten Mal im folgenden Jahr als ein infektiöses Agens in den Vereinigten Staaten nachgewiesen. Bis Ende 1994 wurden weniger als 100 Fälle von HIV-2 in den Vereinigten Staaten berichtet. Trotz dieser anscheinend geringen Anzahl wird HIV-2 in einer wachsenden Anzahl von immunsuppressiven Erkrankungen, die klinisch von AIDS-Fällen, die von einer HIV-1 Infektion herrühren, nicht unterscheidbar sind, als das ätiologische Agens identifiziert (Kanki et al., Science 232: 238 (1986); Kanki et al., Science 236: 827 (1987); Clavel et al., Science 233: 343 (1986); Clavel et al., N. Engl. J. Med 316: 1180 (1987)). Obwohl HIV-2 mit HIV-1 in seiner Morphologie und dem Tropismus für CD4+ Zellen verwandt ist, ist es eindeutig ein anderer Virus und nicht nur eine Hüllvariante von HIV-1.
  • In der Tat wird, da HIV-2 mit ungefähr 50% Aminosäure-Konservierung in den Gag- und Pol-Proteinen und weniger als 30% Konservierung in dem Env-Genprodukten nur entfernt mit HIV-1 verwandt ist, sein Vorhandensein durch serologische Tests, die zum Nachweis einer HIV-1 Infektion verwendet werden, nicht wirksam nachgewiesen (Constantine NT, AIDS 7: 1 (1993); Markovitz DM, Ann. Intern. Med. 118: 211 (1993)). Als Ergebnis wurden Versuche gemacht, Nukleinsäure-Sonden zu entwickeln, die verwendet werden können, um spezifisch virale HIV-2 Nukleinsäuren nachzuweisen.
  • Interessanterweise zeigen die Genome von sowohl HIV-1 als auch HIV-2 zwischen verschiedenen Isolaten deutliche Sequenzheterogenität. Als Konsequenz dieser Heterogenität war es unmöglich, umfangreiche Regionen absoluter Sequenz-Konservierung zwischen allen Isolaten von HIV-1 oder allen Isolaten von HIV-2 zu finden (siehe veröffentlichte Europäische Patentanmeldung EP 0 887 427 ).
  • Tatsächlich wurden für jedes dieser Viren zahlreiche virale Isolate mit einzigartigen Polynukleotid-Sequenzen identifiziert, ein Faktor, der die Konstruktion von Sonden für verlässliche und wirksame Nukleinsäuretests weiter kompliziert.
  • Da, wie HIV-1, HIV-2 ebenfalls über den Austausch von Körperflüssigkeiten, einschließlich Blut und Plasma, übertragbar ist, ist es wichtig, infizierte Körperflüssigkeiten nachweisen zu können, bevor Antikörper gegen das Virus nachweisbar oder Symptome in einem infizierten Individuum offensichtlich sind. Zum Schutz von Patienten, die ansonsten eine HIV-2 infizierte Körperflüssigkeit (z. B. Vollblut oder Plasma während einer Transfusion) oder Produkte, die von Spenderblut oder Plasma abgeleitet sind, erhalten würden, ist es besonders wichtig, das Vorhandensein des Virus in der Körperflüssigkeit des Spenders nachzuweisen, um deren Verwendung in solchen Verfahren oder Produkten zu verhindern. Es ist ebenfalls wichtig, dass Verfahren und Reagenzien, die zum Nachweis von HIV-2 verwendet werden, relativ geringe Anzahlen von Virenkopien, die in einem infizierten Individuum, der ein Spender sein kann, vorhanden sein können, während der frühen Stadien der Infektion nachweisen können.
  • Tests und Reagenzien zum Nachweis von HIV-2 wurden zuvor z. B. in U.S. Patent Nr. 6,020,123 , Nr. 5,688,637 , Nr. 5,545,726 und Nr. 5,310,651 ; Europäischen Patenten Nr. EP 0 404 625 B1 und Nr. EP 0 239 425 B1 ; und der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. EP 1 026 236 A2 und Nr. EP 0 887 427 A2 offenbart.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein erster Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Kit zum Nachweis einer HIV-2 Nukleinsäuresequenz. Der Kit schließt ein erstes Amplifizierungs-Oligonukleotid, das SEQ ID NO: 10 umfasst, und gegebenenfalls eine 5'-Promotorsequenz, die zu der HIV-2 Nukleinsäure nicht komplementär ist, ein. Ebenfalls in dem Kit enthalten ist ein zweites Amplifizierungs-Oligonukleotid, das eine Länge von bis zu 100 Nukleotiden besitzt. Dieses zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid schließt eine Sequenz von 19–40 aufeinanderfolgenden Basen aus der Sequenz von SEQ ID NO: 1 ein. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Länge des zweiten Amplifizierungs-Oligonukleotids 19–40 Nukleotide. Ein erstes Amplifizierungs-Oligonukleotid, das eine Länge von 25 Nukleotiden besitzt, wird durch SEQ ID NO: 10 angegeben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, beträgt die Länge des ersten Amplifizierungs-Oligonukleotids bis zu 60 Nukleotiden und schließt eine Promotorsequenz ein, wenn die Länge des zweiten Amplifizierungs-Oligonukleotids im Bereich von 19–40 Nukleotiden liegt.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die Länge des zweiten Amplifizierungs-Oligonukleotids im Bereich von 19–21 Nukleotiden. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in der das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von bis zu 60 Nukleotiden besitzt, hat das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von 19–21 Nukleotiden. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in der das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von bis zu 60 Nukleotiden und das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von 19–40 Nukleotiden hat, ist das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid ein Promotor-Primer, der die Sequenz von SEQ ID NO: 15 besitzt. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in der das das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von bis zu 60 Nukleotiden besitzt und das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von 19–21 Nukleotiden besitzt, kann das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid die Sequenz von jeder der SEQ ID NOS: 2–7 besitzen. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in der das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von bis zu 60 Nukleotiden besitzt und das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von 19–21 Nukleotiden besitzt, kann das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid ferner eine Promotorsequenz einschließen. Z. B. kann das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid ein Promotor-Primer sein, der die Sequenz von SEQ ID NO: 15 besitzt. Alternativ kann, wenn das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von bis zu 60 Nukleotiden hat und wenn das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von 19–21 Nukleotiden hat, und wenn das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid ferner eine Promotorsequenz einschließt, die Sequenz des zweiten Amplifizierungs-Oligonukleotids jede von SEQ ID NOS: 2–7 sein. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in der das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von bis zu 60 Nukleotiden besitzt, in der das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Länge von 19–21 Nukleotiden besitzt und in der das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid ein Promotor-Primer ist, der die Sequenz von SEQ ID NO: 15 besitzt, kann das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Sequenz besitzen, die durch eine der Sequenzen SEQ ID NOS: 2–7 angegeben wird. Gemäß einer andern bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid aus SEQ ID NO: 10 und die Länge des zweiten Amplifizierungs-Oligonukleotids beträgt 19–21 Nukleotide. Wenn dies der Fall ist, kann das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Sequenz besitzen, die z. B. SEQ ID NO: 10 ist. Alternativ kann, wenn die Länge des ersten Amplifizierungs-Oligonukleotids 25 Nukleotide beträgt und die Länge des zweiten Amplifizierungs-Oligonukleotids 19–21 Nukleotide beträgt, kann das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid eine Sequenz besitzen, die durch eine von SEQ ID NOS: 2–7 angegeben wird. In noch einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in der die Länge des zweiten Amplifizierungs- Oligonukleotids 19–21 Nukleotide beträgt und in der das erste Amplifizierungs-Oligonukleotid die Sequenz, die durch SEQ ID NO: 10 angegeben wird, besitzt, kann das zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid eine der SEQ ID NOs: 2–7 sein. Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung, die das erste und zweite Amplifizierungs-Oligonukleotid einschließt, wobei das letztere eine Länge von bis zu 100 Nukleotiden besitzt, ferner eine Oligonukleotid-Nachweissonde einschließen, die eine Sequenz besitzt, die SEQ ID NO: 21 oder das Komplementär davon und einen nachweisbaren Marker einschließt. Vorzugsweise besitzt die Nachweissonde eine Länge von bis zu 18 Nukleotiden und bevorzugter besitzt sie die Sequenz von einer von SEQ ID NOs: 22–27. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Sequenz des ersten Amplifizierungs-Oligonukleotids SEQ ID NO: 10 oder 15, die Sequenz des zweiten Amplifizierungs-Oligonukleotids ist eine von SEQ ID NOs: 2–7 und die Sequenz der Oligonukleotid-Nachweissonde ist eine von SEQ ID NOs: 22–27.
  • Die Oligonukleotid-Nachweissonde besitzt eine Länge von bis zu 35 Nukleotiden und die Sequenz von SEQ ID NO: 21 oder das Komplementär davon und einen nachweisbaren Marker. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen besitzt die markierte Oligonukleotid-Sonde eine Länge von bis zu 22 Nukleotiden. Vorzugsweise besitzt die Oligonukleotid-Sonde mindestens 16 aufeinanderfolgende Nukleotide, die in der Sequenz von SEQ ID NO: 20 oder dem Komplementär davon enthalten sind. In einer Ausführungsform besitzt die Oligonukleotid-Sonde die Sequenz von SEQ ID NO: 20 oder das Komplementär davon. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzt die Oligonukleotid-Sonde, die die Sequenz von SEQ ID NO: 21 oder das Komplementär davon einschließt, eine Länge von bis zu 18 Nukleotiden. Z. B. kann die Oligonukleotid-Sonde die Sequenz von SEQ ID NO: 22 oder dem Komplementär davon, SEQ ID NO: 23 oder dem Komplementär davon, SEQ ID NO: 24 oder dem Komplementär davon, SEQ ID NO: 25 oder dem Komplementär davon, SEQ ID NO: 26 oder dem Komplementär davon und SEQ ID NO: 27 oder dem Komplementär davon besitzen. Bestimmte markierte Oligonukleotid-Sonden haben Längen von genau 18 Nukleotiden. In anderen Ausführungsformen der Erfindung, in denen die Oligonukleotid-Sonde eine Länge von bis zu 22 Nukleotiden besitzt und die Sequenz von SEQ ID NO: 21 oder das Komplementär davon einschließt, kann die Oligonukleotid-Sonde DNA sein, aber kann alternativ mindestens ein Nukleotid-Analog einschließen. Vorzugsweise besitzt das Nukleotid-Analog eine Methoxy-Gruppe an der 2'-Position eines Ribose-Rests. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Oligonukleotid-Sonde, die die Sequenz von SEQ ID NO: 21 oder das Komplementär davon einschließt und eine Länge von bis zu 18 Nukleotiden besitzt, ebenfalls einen nachweisbaren Marker ein. Beispiele von nützlichen nachweisbaren Markern schließen Chemolumineszenzmarker und Radiomarker ein. Ein besonders bevorzugtes Beispiel eines Chemolumineszenzmarkers ist ein Acridiniumester.
  • Die Oligonukleotid-Nachweissonde kann zum Nachweis von HIV-2 Amplicons, die unter Verwendung des ersten und zweiten Amplifizierungs-Oligonukleotids synthetisiert wurden, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Kits können ferner Fänger-Oligonukleotide enthalten, die verwendet werden können, um HIV-2 Template Nukleinsäure von anderen Arten vor dem Durchführen einer Amplifizierung zu reinigen. Beispiele von Fänger-Oligonukleotiden, die in Kits gepackt werden können, besitzen die Sequenzen von SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32.
  • Definitionen
  • Die folgenden Ausdrücke besitzen für den Zweck dieser Offenbarung die folgenden Bedeutungen, sofern nicht hierin ausdrücklich das Gegenteil angegeben wird.
  • Wie hierin verwendet, ist eine „biologische Probe" jedes Gewebe oder Polynukleotid-enthaltendes Material, das von einem Menschen erhalten wird. Biologische Proben gemäß der Erfindung schließen peripheres Blut, Plasma, Serum, Knochenmark, Gewebe aus einer Biopsie einschließlich Lymphknoten, respiratorisches Gewebe oder Exsudate, gastrointestinales Gewebe, Proben von zervikalen Abstrichen, Samen oder andere Körperflüssigkeiten, Gewebe oder Materialien ein. Eine biologische Probe kann behandelt werden, um Gewebe oder die Zellstruktur zu zerstören und dadurch die intrazellulären Bestandteile in eine Lösung freizusetzen, die Enzyme, Puffer, Salze, Detergenzien und Ähnliches enthalten kann.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet „Polynukleotide" entweder RNA oder DNA zusammen mit allen synthetischen Nukleotid-Analoga oder anderen Molekülen, die in der Sequenz vorhanden sein können, und die die Hybridisierung des Polynukleotids mit einem zweiten Molekül, das eine komplementäre Sequenz besitzt, nicht verhindern. Dieser Ausdruck schließt Polymere, die Analoga von natürlich auftretenden Nukleotiden enthalten, ein und schließt insbesondere Analoga ein, die eine Methoxy-Gruppe an der 2'-Position der Ribose besitzen (OMe). Wie hierin verwendet, besitzen Methoxy-Polynukleotide oder Oligonukleotide, die „T" Reste enthalten, eine Methoxy-Gruppe an der 2'-Position des Ribose-Rests und ein Uracil an der Basenposition des Nukleotids. Wenn besonders als „OMeT" bezeichnet, ist gemeint, dass die Basenposition des Nukleotids durch einen Thymin-Rest besetzt ist.
  • Wie hierin verwendet ist ein „nachweisbarer Marker" eine chemische Spezies, die nachgewiesen werden oder zu einer nachweisbaren Antwort führen kann. Nachweisbare Marker gemäß der Erfindung können entweder direkt oder indirekt mit Polynukleotid-Sonden verbunden werden und schließen Radioisotope, Enzyme, Haptene, Chromophore, wie z. B. Farbstoffe oder Partikel, die eine nachweisbare Farbe verleihen (z. B. Latexkügelchen oder Metallpartikel), lumineszente Verbindungen (z. B. biolumineszente, phosphoreszierende oder chemolumineszente Reste) und fluoreszierende Verbindungen ein.
  • Ein „homogener nachweisbarer Marker" bezieht sich auf einen Marker, der in einer homogenen Art und Weise durch die Bestimmung, ob sich der Marker an einer Sonde, die an eine Zielsequenz hybridisiert hat, befindet oder nicht, nachgewiesen werden kann. D. h., homogene nachweisbare Marker können nachgewiesen werden, ohne physikalisch hybridisierte von nicht hybridisierten Formen des Markers oder der markierten Sonde zu entfernen. Diese Marker wurden im Detail von Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174 ; Woodhead et al., U.S. Patent Nr. 5,656,207 ; und Nelson et al., U.S. Patent Nr. 5,658,737 beschrieben.
  • Bevorzugte Marker für die Verwendung in homogenen Assays schließen chemolumineszente Verbindungen ein (z. B. siehe Woodhead et al., U.S. Patent Nr. 5,656,207 ; Nelson et al., U.S. Patent Nr. 5,658,737 ; und Arnold, Jr., et al., U.S. Patent Nr. 5,639,694 ). Bevorzugte chemolumineszente Marker sind Acridiniumester(„AE")-Verbindungen, wie z. B. Standard AE oder Derivate davon (z. B. Naphthyl-AE, ortho-AE, 1- oder 3-Methyl-AE, 2,7-Dimethyl-AE, 4,5-Dimethyl-AE, ortho-Dibrom-AE, ortho-Dimethyl-AE, meta-Dimethyl-AE, ortho-Methoxy-AE, ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE, ortho-Methyl-AE, ortho-Fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-ortho-fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-meta-difluor-AE und 2-Methyl-AE). Die Synthese und die Verfahren zur Bindung dieser Marker an Nukleinsäuren und zum Nachweis der Marker sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10; Nelson et al., U.S. Patent Nr. 5,658,737 ; Woodhead et al., U.S. Patent Nr. 5,656,207 ; Hogan et al., U.S. Patent Nr. 5,547,842 ; Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174 ; Kourilsky et al., U.S. Patent Nr. 4,581,333 ; und Becker et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0 747 706 ).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „Amplifizierung" auf ein in vitro Verfahren zum Erhalt vieler Kopien von Ziel-Nukleinsäuresequenzen, ihrer Komplementäre oder Fragmente davon.
  • Mit „Ziel-Nukleinsäure” oder „Ziel" ist eine Nukleinsäure gemeint, die eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält.
  • Mit „Ziel-Nukleinsäuresequenz", „Ziel-Nukleotidsequenz", „Zielsequenz" oder „Zielregion" ist eine spezifische Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidsequenz gemeint, die die gesamte oder einen Teil der Nukleotid-Sequenz eines einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und die Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidsequenz, die dazu komplementär ist, umfasst.
  • Mit „transkriptions-assoziierte Amplifizierung" ist jede Art von Nukleinsäure-Amplifizierung gemeint, die eine RNA Polymerase verwendet, um von einem Nukleinsäure-Template viele RNA Transkripte zu erzeugen. Ein Beispiel eines transkriptions-assoziierten Amplifizierungsverfahrens, „transkriptions-vermittelte Amplifizierung" (TMA) genannt, verwendet im Allgemeinen eine RNA Polymerase, eine DNA Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate und ein Oligonukleotid, das zu dem Promotor Template komplementär ist) und kann gegebenenfalls ein oder mehrere analoge Oligonukleotide einschließen. Variationen von TMA sind im Stand der Technik gut bekannt, wie im Detail in Burg et al., U.S. Patent Nr. 5,437,990 ; Kacian et al., U.S. Patent Nr. 5,399,491 und Nr. 5,554,516 ; Kacian et al., PCT Nr. WO 93/22461 ; Gingeras et al., PCT Nr. WO 88/01302 ; Gingeras et al., PCT Nr. WO 88/10315 ; Malek et al., U.S. Patent Nr. 5,130,238 ; Urdea et al., U.S. Patent Nr. 4,868,105 und Nr. 5,124,246 ; McDonough et al., PCT Nr. WO 94/03472 , und Ryder et al., PCT Nr. WO 95/03420 , offenbart werden. Die Verfahren von Kacian et al. sind zum Durchführen von Nukleinsäure-Amplifizierungsverfahren der hierin offenbarten Art bevorzugt.
  • Wie hierin verwendet, ist eine „Sonde" ein Nukleinsäure-Oligonukleotid, das unter Bedingungen, die die Hybridisierung fördern, spezifisch an eine Zielsequenz in einer Nukleinsäure, vorzugsweise in einer amplifizierten Nukleinsäure, hybridisiert, um ein nachweisbares Hybrid zu bilden. Eine Sonde kann einen nachweisbaren Rest enthalten, der entweder an das/die Ende(n) der Sonde angeheftet sein kann oder kann intern vorliegen. Die Nukleotide der Sonde, die sich mit den Ziel-Polynukleotid verbinden, müssen nicht strikt aufeinanderfolgend sein, wie es z. B. bei einem nachweisbaren Rest, der sich im Inneren der Sequenz der Sonde befindet, der Fall sein kann. Der Nachweis kann entweder direkt (d. h. von der Sonde, die direkt an eine Zielsequenz oder eine amplifizierte Nukleinsäure hybridisiert, stammen) oder indirekt (d. h. von einer Sonde, die an eine intermediäre Molekularstruktur, die die Sonde mit der Zielsequenz oder amplifizierten Nukleinsäure verbindet, stammen) sein. Das „Ziel" einer Sonde bezieht sich im Allgemeinen auf eine Sequenz, die sich in einer amplifizierten Nukleinsäure-Sequenz befindet, die spezifisch unter Verwendung von Standard-Wasserstoffbrückenbindung (d. h. Basenpaarung) an mindestens ein Teil des Sonden-Oligonukleotids hybridisiert. Eine Sonde kann ziel-spezifische Sequenzen und andere Sequenzen umfassen, die zu der dreidimensionalen Konformation der Sonde beitragen (z. B. wie in Lizardi et al., U.S. Patent Nr. 5,118,801 und Nr. 5,312,728 beschrieben). Sequenzen, die „ausreichend komplementär" sind, erlauben die stabile Hybridisierung eines Sonden-Oligonukleotids an eine Zielsequenz, die nicht vollständig komplementär zu der ziel-spezifischen Sonden-Sequenz ist.
  • Wie hierin verwendet, ist ein „Oligonukleotid" oder „Oligomer" eine polymere Kette von mindestens zwei, im Allgemeinen zwischen ungefähr fünf und ungefähr 100 chemischen Untereinheiten, wobei jede Untereinheit einen Nukleotidbasen-Rest, einen Zucker-Rest und einen verbindenden Rest, der die Untereinheiten in einer linearen räumlichen Konfiguration verbindet, umfasst. Übliche Nukleotidbasen-Reste sind Guanin (G), Adenin (A), Cytosin (C), Thymin (T) und Uracil (U), obwohl andere seltene oder modifizierte Nukleotidbasen, die in der Lage sind, Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden, dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind. Bevorzugte Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung fallen in einen Größenbereich, der eine untere Grenze von ungefähr 10 bis ungefähr 60 Resten besitzt. Oligonukleotide können aus natürlich auftretenden Quellen gereinigt werden, aber werden vorzugsweise unter Verwendung einer Reihe von gut bekannten enzymatischen oder chemischen Verfahren synthetisiert.
  • Wie hierin verwendet, ist ein „Amplifizierungs-Primer" oder ein „Amplifizierungs-Oligonukleotid" ein Oligonukleotid, das an eine Ziel-Nukleinsäure oder ihr Komplementär hybridisiert, und an einer Nukleinsäure-Amplifizierungsreaktion beteiligt ist. Amplifizierungs-Primer oder einfach „Primer" können ein gegebenenfalls modifiziertes Oligonukleotid sein, das in der Lage ist, an eine Template Nukleinsäure zu hybridisieren, und das ein 3'-Ende besitzt, das durch die Aktivität einer DNA Polymerase verlängert werden kann.
  • Mit „im Wesentlichen homolog", „im Wesentlichen entsprechend" oder „im Wesentlichen entspricht" ist gemeint, dass das entsprechende Oligonukleotid eine Basensequenz besitzt, die eine mindestens 10 zusammenhängende Basen lange Region enthält, die mindestens 70% homolog, vorzugsweise mindestens 80% homolog, bevorzugter mindestens 90% homolog, und am bevorzugtesten 100% homolog zu einer mindestens 10 zusammenhängende Basen umfassenden Region, die sich in einer Referenzbasensequenz befindet (mit Ausnahme von RNA- und DNA-Äquivalenten), ist. Der Durchschnittsfachmann wird leicht Modifikationen erkennen, die bei verschiedenen Prozentsätzen an Homologie an den Bedingungen des Hybridisierungs-Assays vorgenommen werden können, um die Hybridisierung des Oligonukleotids an die Zielsequenz zu erlauben, während nicht annehmbare Grade an nicht spezifischer Hybridisierung verhindert werden. Der Grad an Ähnlichkeit wird durch den Vergleich der Anordnung von Nukleobasen, die die zwei Sequenzen ausmachen, bestimmt, und zieht andere strukturelle Unterschiede, die zwischen den beiden Sequenzen bestehen können, nicht in Betracht, vorausgesetzt, dass die strukturellen Unterschiede die Wasserstoffbrückenbindung mit komplementären Basen nicht verhindern. Der Grad an Homologie zwischen den beiden Sequenzen kann ebenfalls in Form der Anzahl von Basen-Fehlpaarungen ausgedrückt werden, die in jedem Satz von mindestens 10 zusammenhängenden Basen, die verglichen werden, vorhanden sind, und kann von 0 bis 2 Basen-Unterschieden reichen.
  • Mit „im Wesentlichen komplementär" ist gemeint, dass das entsprechende Oligonukleotid eine Basensequenz besitzt, die eine mindestens 10 zusammenhängende Basen lange Region enthält, die mindestens 70% komplementär, vorzugsweise mindestens 80% komplementär, bevorzugter mindestens 90% komplementär, und am bevorzugtesten 100% komplementär zu einer mindestens 10 zusammenhängende Basen langen Region, die in einer Ziel-Nukleinsäuresequenz (mit Ausnahme von RNA- und DNA-Äquivalenten) vorhanden ist, ist. (Der Durchschnittsfachmann wird bei verschiedenen Prozentsätzen der Komplementarität einfach Modifikationen erkennen, die an den Hybridisierungs-Assay-Bedingungen vorgenommen werden können, um die Hybridisierung des Oligonukleotids an die Zielsequenz zu erlauben und gleichzeitig nicht annehmbare Grade an nicht-spezifischer Hybridisierung zu verhindern.) Der Grad an Komplementarität wird durch den Vergleich der Anordnung von Nukleobasen, die die beiden Sequenzen bilden, bestimmt und zieht andere strukturelle Unterschiede, die zwischen den beiden Sequenzen bestehen können, nicht in Betracht, vorausgesetzt, dass die strukturellen Unterschiede die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen nicht verhindern. Der Grad an Komplementarität zwischen zwei Sequenzen kann ebenfalls als Anzahl der Basen-Fehlpaarungen ausgedrückt werden, die in jedem Satz von mindestens 10 zusammenhängenden Basen, die verglichen werden, vorhanden sind, und kann von 0 bis 2 Basen-Fehlpaarungen reichen.
  • Mit „ausreichend komplementär" ist eine zusammenhängende Nukleinsäuren-Basensequenz gemeint, die in der Lage ist, über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen einer Reihe von komplementären Basen an eine andere Basensequenz zu hybridisieren. Komplementäre Basensequenzen können an jeder Position in der Basensequenz eines Oligonukleotids unter Verwendung der Standard-Basenpaarung (z. B. G:C, A:T oder A:U Paarung) komplementär sein, oder können einen oder mehrere Reste enthalten, die unter Verwendung der Standard-Wasserstoffbrückenbindung nicht komplementär sind (einschließlich abasische „Nukleotide"), aber in denen die gesamte komplementäre Basensequenz in der Lage ist, unter angemessenen Hybridisierungsbedingungen spezifisch an eine andere Basensequenz zu hybridisieren. Zusammenhängende Basen sind vorzugsweise mindestens ungefähr 80%, bevorzugter mindestens ungefähr 90%, und am bevorzugtesten ungefähr 100% zu der Sequenz komplementär, an welche das Oligonukleotid spezifisch hybridisieren soll. Angemessene Hybridisierungsbedingungen sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt, können einfach basierend auf der Basensequenz Zusammensetzung vorhergesagt werden oder können empirisch durch Routinetestverfahren bestimmt werden (z. B. siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) in §§ 1.90–1.91, 7.37–7.57, 9.47–9.51 und 11.47–11.57, insbesondere in §§ 9.50–9.51, 11.12–11.13, 11.45–11.47 und 11.55–11.57).
  • Mit "Fänger-Oligonukleotid" ist mindestens ein Nukleinsäure-Oligonukleotid gemeint, das ein Mittel liefert, um spezifisch eine Zielsequenz und ein immobilisiertes Oligonukleotid aufgrund der Hybridisierung von Basenpaaren zu verbinden. Ein Fänger-Oligonukleotid schließt vorzugsweise zwei Bindungsregionen ein: eine Zielsequenz-Bindungsregion und eine immobilisierte Sonden-Bindungsregion, gewöhnlich zusammenhängend auf demselben Oligonukleotid, obwohl das Fänger-Oligonukleotid eine Zielsequenz-bindende Region und eine immobilisierte Sonden-bindende Region einschließen kann, die auf zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die über einen oder mehrere Linker miteinander verbunden sind, vorhanden sind. Z. B. kann eine immobilisierte Sonden-bindende Region auf einem ersten Oligonukleotid vorhanden sein, die Zielsequenz-bindende Region kann auf einem zweiten Oligonukleotid vorhanden sein und die beiden verschiedenen Oligonukleotide werden über Wasserstoffbrückenbindungen mit einem Linker, bei dem es sich um ein drittes Oligonukleotid handelt, das Sequenzen enthält, die spezifisch an die Sequenzen der ersten und zweiten Oligonukleotide hybridisieren, verbunden.
  • Mit „immobilisierte Sonde" oder „immobilisierte Nukleinsäure" ist eine Nukleinsäure gemeint, die direkt oder indirekt ein Fänger-Oligonukleotid mit einem immobilisierten Träger verbindet. Eine immobilisierte Sonde ist ein Oligonukleotid, das mit einem festen Träger verbunden ist, und das die Trennung von gebundener Zielsequenz von nicht gebundenem Material in einer Probe ermöglicht.
  • Mit „Trennen" oder „Reinigen" ist gemeint, dass eine oder mehrere Bestandteile der biologischen Probe von einem oder mehreren anderen Bestandteilen der Probe entfernt werden. Beispielbestandteile schließen Nukleinsäuren in einer im Allgemeinen wässerigen Lösungsphase, die ebenfalls Materialien, wie z. B. Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und markierte Sonden einschließen kann, ein. Vorzugsweise entfernt der Trennungs- oder Reinigungsschritt mindestens ungefähr 70%, bevorzugter mindestens ungefähr 90%, und noch bevorzugter mindestens ungefähr 95% der anderen Bestandteile, die in der Probe vorhanden sind.
  • Mit „RNA"- und DNA-Äquivalente" sind DNA- und RNA-Moleküle gemeint, die dieselben komplementären Basenpaar-Hybridisierungseigenschaften besitzen. RNA- und DNA-Äquivalente besitzen unterschiedliche Zucker-Reste (d. h. Ribose gegenüber Desoxyribose) und können sich durch das Vorhandensein von Uracil in RNA und Thymin in DNA unterscheiden. Die Unterscheide zwischen RNA- und DNA-Äquivalenten tragen nicht zu Unterschieden in der Homologie bei, da die Äquivalente denselben Grad an Komplementarität zu einer bestimmten Sequenz besitzen.
  • Mit „bestehend im Wesentlichen aus" ist gemeint, dass ein zusätzlicher Bestandteil/zusätzliche Bestandteile, die/der die grundlegenden und neuartigen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung nicht materiell verändert/verändern, in den Kits der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein kann/können. Solche Eigenschaften schließen die Fähigkeit selektiv HIV-2 Nukleinsäuren in biologischen Proben, wie z. B. Gesamtblut oder Plasma, bei einer Kopienzahl von ungefähr 100 Kopien der HIV-2 Nukleinsäure, ein. Alle Bestandteile, Zusammensetzungen oder Verfahrensschritte, die einen materiellen Effekt auf die grundlegenden und neuartigen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung besitzen, würden aus diesem Ausdruck herausfallen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein schematisches Diagramm, das die verschiedenen Polynukleotide zeigt, die verwendet werden können, um eine Zielregion in der HIV-2 Nukleinsäure nachzuweisen (dargestellt durch eine dicke horizontale Linie). Die Positionen der folgenden Nukleinsäuren sind relativ zu der Zielregion gezeigt: „Fänger-Oligonukleotid" bezieht sich auf die Nukleinsäure, die verwendet wird, um an die Ziel-Nukleinsäure vor der Amplifizierung zu hybridisieren und diese einzufangen, wobei „T" sich auf eine Endsequenz bezieht, die verwendet wird, um ein immobilisiertes Oligonukleotid, das eine komplementäre Sequenz besitzt (nicht gezeigt), zu hybridisieren; „Nicht T7 Primer" und „T7 Promotor-Primer" stellen zwei Amplifizierungs-Primer dar, die zum Durchführen einer TMA verwendet werden, wobei „P" die Promotorsequenz des T7 Promotor-Primers anzeigt; und „Sonde" sich auf die Sonde bezieht, die für den Nachweis der amplifizierten Nukleinsäure verwendet wird.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Kits zum selektiven Nachweis der Nukleinsäuren von HIV-2. Die hierin offenbarten Kits sind zur Amplifizierung und zum Nachweis dieser Nukleinsäuren in biologischen Proben, wie z. B. menschlichem Blut, Serum, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten, oder Geweben, die auf das Vorhandensein von viralen Nukleinsäuren getestet werden sollen, nützlich. Die Amplifizierungs-Primer, die hierin offenbart werden, können vorteilhafterweise als Bestandteile einer Multiplex-Amplifizierungsreaktion verwendet werden, wobei aus einer komplexen Auswahl von Primern und akzessorischen Polynukleotiden mehrere Amplicon-Arten erzeugt werden können. Z. B. können die hierin offenbarten Primer in Multiplex- Amplifizierungsreaktionen verwendet werden, die Amplicons synthetisieren, die Polynukleotiden von miteinander nicht verwandten Viren entsprechen.
  • Die Sonden, Primer und Verfahren, die hierin offenbart werden, können entweder in diagnostischen Anwendungen oder zum Untersuchen von Spenderblut und Blutprodukten oder anderen Geweben, die infektiöse Partikel enthalten können, verwendet werden.
  • Einleitung und Überblick
  • Der Durchschnittsfachmann wird anerkennen, dass Nukleinsäure-Tests ein günstiges und hochsensitives Verfahren zum Nachweis von virus-spezifischen Polynukleotiden in biologischen Proben, wie z. B. Spenderblut oder -plasma, darstellen. Da Individuen, die neu mit HIV-1 infiziert sind, typischerweise 1–2 Monate nach der Infektion nachweisbare Konzentrationen an Antikörpern, die mit den viralen Antigenen reagieren, erzeugen, können serologische Tests während des ersten Monats nach Exposition gegenüber dem Virus ein falsch-negatives Ergebnis ergeben, und zulassen, dass Proben, die mit HIV-1 kontaminiert sind, in den Blutvorrat gelangen, was verheerende Folgen hat. Auf dieselbe Art und Weise wie der frühe Nachweis einer HIV-1 Exposition helfen kann, die Sicherheit der Spenderblut-Versorgung zu sichern, kann der frühe Nachweise von HIV-2 Exposition dieselben Vorteile liefern. Dementsprechend basieren die sensitivsten Testverfahren zum Nachweis von HIV-2 im Gegensatz zum Nachweis der Immunantwort des Wirts auf die Infektion auf dem Nachweis von virus-spezifischen Nukleinsäuren.
  • Die vorliegende Erfindung schließt Kits (die Amplifizierungs-Nukleotide und Sonden enthalten) zum Nachweis von HIV-2 Nukleinsäuren in einer biologischen Probe ein. Um Oligonukleotid-Sequenzen zu entwickeln, die für solche Zwecke geeignet sind, wurden bekannte HIV-2 DNA-Sequenzen, einschließlich Subtypen, zuerst durch das Abgleichen von Regionen, die ähnliche Sequenzen besitzen, gegenübergestellt, und dann die Sequenzen verglichen, um Kandidatenregionen des viralen HIV-2 Genoms zu identifizieren, die als Reagenzien in einem diagnostischen Assay dienen können. Basierend auf diesen Vergleichen wurde die LTR-Region des HIV-2 Genoms für den Nachweis unter Verwendung der Fänger-Oligonukleotide, Primer und Sonden, die schematisch in 1 gezeigt sind, ausgewählt. Teile der Sequenzen, die zwischen den verglichenen Sequenzen relativ wenige Sequenzvarianten enthielten, wurden als Startpunkte für die Entwicklung von synthetischen Oligonukleotiden, die für die Verwendung bei dem Einfangen, der Amplifizierung und dem Nachweis der amplifizierten Sequenzen geeignet sind, gewählt. Andere Erwägungen beim Entwurf der Oligonukleotide schlossen den relativen GC-Gehalt der Sequenz (der von ungefähr 30% bis ungefähr 55% reichte) und die relative Abwesenheit von vorhergesagten Sekundärstrukturen innerhalb einer Sequenz (z. B. Haarnadelschleifen, die intramolekulare Hybride bilden) ein.
  • Basierend auf diesen Analysen wurden die unten dargestellten Fänger-Oligonukleotide, Amplifizierungs-Nukleotide und Sondensequenzen entworfen. Der Durchschnittsfachmann wird anerkennen, dass Primer- Sequenzen, die für HIV-2 spezifisch sind, mit oder ohne die T7 Promotersequenz als Primer in den verschiedenen Primer-basierten in vitro Amplifizierungsverfahren, die unten beschrieben werden, verwendet werden können. Zusätzlich wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass die hierin offenbarten Hybridisierungssonden als Amplifizierungs-Primer verwendet werden könnten, und dass die Amplifizierungs-Primer, die hierin offenbart werden, als Hybridisierungssonden verwendet werden könnten. Der unten detailliert beschriebene Amplifizierungs- und Nachweis-Assay ist zum Nachweis von zumindest den Subtypen A, B, C und D von HIV-2 nützlich. Bemerkenswerterweise besitzt der Teil des HIV-2 Genoms, der für die hierin offenbarten Sonden als Ziel dient, keine korrespondierende Sequenz in dem HIV-1 Genom. Somit sind die Sonden für HIV-2 und nicht HIV-1 spezifisch.
  • Nützliche Amplifizierungsverfahren
  • Amplifizierungsverfahren, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ein: Transkriptions-vermittelte Amplifizierung (TMA), Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Nukleinsäurensequenz-basierte Amplifizierung (NASBA), Strang-Ersatz Amplifizierung (SDA), und Amplifizierungsverfahren, die selbstreplizierende Polynukleotid-Moleküle und Replikations-Enzyme, wie MDV-1 RNA und Q-beta Enzym, verwenden. Verfahren zum Durchführen dieser verschiedenen Amplifizierungstechniken können jeweils in U.S. Patent Nr. 5,399,491 ; U.S. Patent Nr. 4,965,188 ; der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung EP 0 525 882 , U.S. Patent Nr. 5,455,166 , U.S. Patent Nr. 5,472,840 , und Lizardi et al., BioTechnology 6: 1197 (1988) gefunden werden. U.S. Patent Nr. 5,554,516 beschreibt ein Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-RNA Sequenz unter Verwendung eines einzelnen Promotor-Primers in Abwesenheit eines Primers, der ein Hybrid mit dem Komplementär der Ziel-RNA-Sequenz bildet.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden HIV-2 Nukleinsäuren unter Verwendung eines TMA Protokolls amplifiziert. Gemäß diesem Protokoll besitzt die reverse Transkriptase, die die RNA-Polymerase Aktivität liefert, ebenfalls eine endogene RNase-H Aktivität. Einer der Primer, die in diesem Verfahren verwendet werden, enthält eine Promotorsequenz, die stromaufwärts der Sequenz, die zu einem Strang der Ziel-Nukleinsäure, die amplifiziert werden soll, komplementär ist, positioniert ist. In dem ersten Schritt der Amplifizierung hybridisiert ein Promotor-Primer an die HIV-2 Ziel-RNA an einer definierten Stelle. Die reverse Transkriptase erzeugt eine DNA-Kopie der Ziel-RNA durch Extension des 3'-Endes des Promotor-Primers. Der RNA-Strang in der resultierenden RNA:DNA Duplex wird durch eine RNase-H Aktivität, die gegebenenfalls die inhärente Aktivität der reversen Transkriptase sein kann, abgebaut. Ein zweiter Primer bindet dann an den DNA-Strang. Ein zweiter Strang von DNA wird von dem Ende des Primers durch reverse Transkriptase synthetisiert, wodurch ein doppelsträngiges DNA-Molekül erzeugt wird. Die RNA-Polymerase erkennt die Promotorsequenz in dieser doppelsträngigen DNA-Vorlage und beginnt mit der Transkription. Jedes der neu synthetisierten RNA-Amplicons gelangt wieder in den TMA Prozess und dient als Vorlage für eine neue Runde der Replikation, wodurch es zu einer exponentiellen Vermehrung der RNA-Amplicons kommt. Da jede der DNA-Vorlagen 100–1000 Kopien eines RNA-Amplicons erzeugen kann, kann diese Expansion zur Produktion von 10 Billionen Amplicons in weniger als einer Stunde führen. Der gesamte Prozess ist autokatalytisch und wird bei konstanter Temperatur durchgeführt.
  • Verfahren zum Nachweis der HIV-2 Amplicons können so einfach wie das Färben von elektrophoretisch getrennten Nukleinsäuren-Amplifizierungsprodukten, die unter Verwendung eines Paars von Oligonukleotid-Primern erzeugt wurden, sein. Wie unten detailliert beschrieben, verwenden bevorzugte Nachweisverfahren HIV-2 spezifische Hybridisierungssonden.
  • Strukturelle Merkmale von Primern
  • Wie oben angegeben, bezieht sich ein „Primer" auf ein gegebenenfalls modifiziertes Oligonukleotid, das in der Lage ist, an ein Nukleinsäure Template zu hybridisieren, und das ein 3'-Ende besitzt, das durch eine DNA-Polymeraseaktivität verlängert werden kann. Die 5'-Region des Primers kann zu der Ziel-Nukleinsäure nicht komplementär sein. Wenn die nicht komplementäre 5'-Region eine Promotorsequenz einschließt, wird der Primer als „Promotor-Primer" bezeichnet. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass jedes Oligonukleotid, das als Primer fungieren kann (d. h. ein Oligonukleotid, das spezifisch an eine Zielsequenz hybridisiert und ein 3'-Ende besitzt, das in der Lage ist, durch eine DNA-Polymeraseaktivität verlängert zu werden) modifiziert werden kann, um eine 5'-Promotorsequenz einzuschließen und somit als Promotor- Primer dienen kann. Auf die gleiche Weise kann jeder Promotor-Primer durch das Entfernen von einer Promotorsequenz oder die Synthese ohne eine Promotorsequenz modifiziert werden und dennoch als Primer fungieren.
  • Die Nukleotidbasenreste von Primern können modifiziert sein, z. B. durch die Addition von Propin-Gruppen, sofern der modifizierte Basenrest die Fähigkeit beibehält, eine nicht-kovalente Assoziierung mit G, A, C, T oder U zu bilden und ein Oligonukleotid, das mindestens einen modifizierten Nukleotidbasenrest umfasst, nicht sterisch daran gehindert ist, mit einer einzelsträngigen Nukleinsäure zu hybridisieren. Übliche Zucker-Reste, die im Primer-Rückgrat enthalten sind, schließen Ribose und Desoxyribose ein, obwohl 2'-O-Methylribose (OME), halogenierte Zucker und andere modifizierte Zucker ebenfalls verwendet werden können. Gewöhnlich ist die Verbindungsgruppe des Primer-Rückgrats ein phosphor-enthaltender Rest, am häufigsten eine Phosphodiester-Bindung, obwohl andere Bindungen, wie z. B. Phosphorthioate, Methylphosphonate und nicht phosphor-enthaltende Verbindungen, wie z. B. peptid-ähnliche Bindungen, wie sie in „Peptid-Nukleinsäuren" (PNA) gefunden werden, ebenfalls für die Verwendung in dem hierin offenbarten Assay gedacht sind.
  • Nützliche Systeme und nachweisbare Reste zum Markieren von Sonden
  • Im Wesentlichen kann jedes Markierungs- und Nachweissystem, das zum Überwachen der spezifischen Nukleinsäuren-Hybridisierung verwendet werden kann, in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eingeschlossen in die Auswahl von nützlichen Markern sind Radiomarker, Enzyme, Haptene, verbundene Oligonukleotide, chemolumineszente Moleküle und redox-aktive Reste, die gegenüber elektronischen Nachweisverfahren empfänglich sind. Bevorzugte chemolumineszente Moleküle schließen Acridiniumester der Art, wie sie von Arnold et al., in U.S. Patent Nr. 5,283,174 für die Verwendung in Zusammenhang mit homogenen Schutz-Assays und der Art, wie sie von Woodhead et al., in U.S. Patent Nr. 5,656,207 für die Verwendung in Zusammenhang mit Assays, die multiple Ziele in einer einzelnen Reaktion quantifizieren, offenbart werden, ein. Bevorzugte elektronische Markierungs- und Nachweisansätze werden in U.S. Patent Nr. 5,591,578 und Nr. 5,770,369 und der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung WO 98/57158 offenbart. Redox-aktive Reste, die als Marker in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Übergangsmetalle, wie z. B. Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe und Ru ein.
  • Besonders bevorzugte nachweisbare Marker für Sonden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind in homogenen Assay-Systemen (d. h. in denen die gebundene markierte Sonde in einer Mischung verglichen mit ungebundener markierter Sonde eine nachweisbare Veränderung, wie z. B. Stabilität oder differentiellen Abbau, zeigt) nachweisbar. Ein bevorzugter Marker für die Verwendung in homogenen Assays ist eine chemolumineszente Verbindung (z. B. wie von Woodhead et al. in U.S. Patent Nr. 5,656,207 ; von Nelson et al. in U.S. Patent Nr. 5,658,737 ; oder von Arnold et al. in U.S. Patent Nr. 5,639,604 beschrieben). Besonders bevorzugte chemolumineszente Marker schließen Acridiniumester-(„AE")-Verbindungen, wie z. B. Standard-AE oder Derivate davon, wie z. B. Naphthyl-AE, ortho-AE, 1- oder 3-Methyl-AE, 2,7-Dimethyl-AE, 4,5-Dimethyl-AE, ortho-Dibrom-AE, ortho-Dimethyl-AE, meta-Dimethyl-AE, ortho-Methoxy-AE, ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE, ortho-Methyl-AE, ortho-Fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-ortho-fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-meta-difluor-AE und 2-Methyl-AE, ein.
  • In einigen Anwendungen sind Sonden, die zumindest einen gewissen Grad an Selbstkomplementarität zeigen, wünschenswert, um den Nachweis von Sonde:Ziel Duplexen in einer Testprobe zu ermöglichen, ohne vor dem Nachweis zuerst das Entfernen der nicht hybridisierten Sonde zu erfordern. Beispielweise sind Strukturen, die als „Molekulare Fackeln" bezeichnet werden, so entworfen, dass sie verschiedene Regionen der Selbstkomplementarität einschließen („ziel-bindende Domäne” und „ziel-schließende Domäne" genannt), die über eine Verbindungsregion verbunden sind, und die unter festgelegten Hybridisierungs-Assay-Bedingungen aneinander hybridisieren. Wenn sie denaturierenden Bedingungen ausgesetzt werden, schmelzen die beiden komplementären Regionen (die vollständig oder teilweise komplementär sein können) der Molekularen Fackel auf und machen die ziel-bindende Region für die Hybridisierung an eine Zielsequenz verfügbar, wenn die festgelegten Hybridisierungs-Assay-Bedingungen wiederhergestellt werden. Molekulare Fackeln sind so entworfen, dass die ziel-bindende Domäne eine Hybridisierung an die Zielsequenz gegenüber der ziel-schließenden Domäne bevorzugt. Die ziel-bindende Domäne und die ziel-schließende Domäne einer Molekularen Fackel schließen interagierende Marker (z. B. lumineszent:Quencher) ein, die so positioniert sind, dass ein anderes Signal erzeugt wird, wenn die Molekulare Fackel mit sich selbst hybridisiert ist, gegenüber dem Fall, dass die Molekulare Fackel an eine Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, und erlauben dadurch den Nachweis von Sonde:Ziel Duplexen in einer Testprobe in der Gegenwart von nicht hybridisierter Sonde, die einen brauchbaren Marker trägt. Molekulare Fackeln werden vollständig in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 00/01850 beschrieben.
  • Ein anderes Beispiel einer selbstkomplementären Hybridisierungs-Assay-Sonde ist eine Struktur, die gewöhnlich als „Molecular Beacon" bezeichnet wird. Molecular Beacons umfassen Nukleinsäure-Moleküle, die eine ziel-komplementäre Sequenz, ein Affinitätspaar (oder Nukleinsäure-Arme), die beim Fehlen einer Ziel-Nukleinsäure-Sequenz die Sonde in einer geschlossenen Konformation halten, und ein Markerpaar, das interagiert, wenn sich die Sonde in einer geschlossenen Konformation befindet, ein. Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäure und der ziel-komplementären Sequenz trennt die Teile des Affinitätspaars und verschiebt die Sonde so in eine offene Konformation. Die Verschiebung zu der offenen Konformation ist aufgrund der verringerten Interaktion des Markerpaars, das z. B. ein Fluorophor und ein Quencher (z. B. DABCYL und EDANS) sein kann, nachweisbar. Molecular Beacons werden vollständig in U.S. Patent Nr. 5,925,517 beschrieben.
  • Synthetische Techniken und Verfahren zum Binden von Markern an Nukleinsäuren und zum Nachweis von Markern sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10; Nelson et al., U.S. Patent Nr. 5,658,737 ; Woodhead et al., U.S. Patent Nr. 5,656,207 ; Hogan et al., U.S. Patent Nr. 5,547,842 ; Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174 ; und Kourilsky et al., U.S. Patent Nr. 4,581,333 ).
  • Chemische Zusammensetzung von Sonden
  • Sonden gemäß der Erfindung umfassen Polynukleotide oder Polynukleotid-Analoga und können daran kovalent gebunden einen nachweisbaren Marker tragen. Nukleoside oder Nukleosid-Analoga der Sonde umfassen stickstoff-haltige heterocyclische Basen oder Basen-Analoga, in denen die Nukleoside durch z. B. Phosphodiester-Bindungen, z. B. um ein Polynukleotid zu bilden, miteinander verbunden sind. Dementsprechend kann eine Sonde konventionelle Ribonukleinsäure (RNA) und Desoxyribonukleinsäure (DNA) einschließen, aber kann ebenfalls chemische Analoga dieser Moleküle einschließen. Das „Rückgrat" einer Sonde kann aus einer Reihe von Bindungen, die im Stand der Technik bekannt sind, bestehen, einschließlich einer oder mehrerer Zucker-Phosphodiester-Bindungen, Peptid-Nukleinsäure-Bindungen (manchmal als „Peptid-Nukleinsäuren", wie von Hyldig-Nielsen et al., PCT Internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/32305 beschrieben, bezeichnet), Phosphothioat-Bindungen, Methylphosphonat-Bindungen oder Kombinationen davon. Die Zucker-Reste der Sonde können entweder Ribose oder Desoxyribose oder ähnliche Verbindungen, die bekannte Substitutionen, wie z. B. 2'-Methoxy-Substitutionen (OMe) und 2'-Halid-Substitutionen (z. B. 2'-F) besitzen, sein.
  • Die stickstoffhaltigen Basen können die konventionellen Basen (A, G, C, T, U), bekannte Analoga davon (z. B. Inosin oder „I"; siehe The Biochemistry of the Nucleic Acids 5–36, Adams et al., Hrsg., 11. Ausgabe, 1992), bekannte Derivate von Purin- oder Pyrimidin-Basen (z. B. N4-Methyl-desoxyguanosin, Deaza- oder Azapurine und Deaza- oder Azapyrimidine, Pyrimidin-Basen die Substituentengruppen an der 5- oder 6-Position besitzen, Purin-Basen, die einen geänderten oder ersetzten Substituenten an der 2-, 6- oder 8-Position besitzen, 2-Amino-6-methylaminopurin, O6-Methylguanin, 4-Thio-pyrimidine, 4-Amino-pyrimidine, 4-Dimethylhydrazin-pyrimidine und O4-Alkyl-pyrimidine (siehe Cook, Internationale PCT Veröffentlichung Nr. WO 93/13121 ) und „abasische" Reste, in denen das Rückgrat keine stickstoff-haltige Base in einem oder mehreren Resten des Polymers einschließt (siehe Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,585,481 ), sein. Eine Nukleinsäure kann nur konventionelle Zucker, Basen und Bindungen, die in RNA und DNA gefunden werden, einschließen, oder kann sowohl konventionelle Bestandteile als auch Substitutionen (z. B. konventionelle Basen, die über ein Methoxy-Rückgrat verbunden sind, oder eine Nukleinsäure, die konventionelle Basen und ein oder mehrere Basenanaloga einschließt) einschließen.
  • Auswahl von Amplifizierungs-Primern und Nachweissonden, die für HIV-2 spezifisch sind
  • Nützliche Richtlinien zum Entwurf von Amplifizierungs-Primern und Sonden mit gewünschten Eigenschaften werden hierin beschrieben. Die optimalen Stellen zum Amplifizieren und Nachweisen mittels Sonden von HIV-2 Nukleinsäuren enthalten in ungefähr 350 Basen, und vorzugsweise in 150 Basen einer zusammenhängenden Sequenz zwei, und vorzugsweise drei konservierte Regionen, die mehr als ungefähr 15 Basen lang sind. Der Grad an Amplifizierung, der mit einem Satz von Primern oder Promotor-Primern beobachtet wird, hängt von mehreren Faktoren, einschließlich der Fähigkeit der Oligonukleotide, an ihre komplementären Sequenzen zu binden, und ihre Fähigkeit, enzymatisch verlängert zu werden, ab. Da das Ausmaß und die Spezifität der Hybridisierungsreaktion durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst werden, bestimmt die Manipulation dieser Faktoren die exakte Sensitivität und Spezifität eines bestimmten Oligonukleotids, unabhängig davon ob es zu seinem Ziel perfekt komplementär ist oder nicht. Die Auswirkungen von wechselnden Assay-Bedingungen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und werden von Hogan et al., in U.S. Patent Nr. 5,840,488 beschrieben.
  • Die Länge der Ziel-Nukleinsäuresequenz und dementsprechend die Länge der Primer-Sequenz oder Sonden-Sequenz kann wichtig sein. In einigen Fällen kann es mehrere Sequenzen einer bestimmten Zielregion, die sich in Ort und Länge unterscheiden, geben, die Primer oder Sonden ergeben, die die gewünschten Hybridisierungseigenschaften besitzen. Obwohl es für Nukleinsäuren, die nicht perfekt komplementär sind, möglich ist zu hybridisieren, bestimmt hauptsächlich das längste Stück einer perfekt homologen Basensequenz die Stabilität des Hybrids.
  • Amplifizierungs-Primer und Sonden sollten so positioniert werden, dass die Stabilität von Oligonukleotid:Nicht-Ziel Nukleinsäure-Hybriden (d. h. Nukleinsäuren mit einer zu der Ziel-Nukleinsäure ähnlichen Sequenz) minimiert wird. Es wird bevorzugt, dass die Amplifizierungs-Primer und Nachweissonden in der Lage sind, zwischen Ziel und Nicht-Ziel-Sequenzen zu unterscheiden. Beim Entwurf von Primern und Sonden sollten die Unterschiede in diesen Tm-Werten so groß wie möglich sein (z. B. mindestens 2°C und vorzugsweise 5°C).
  • Regionen der Nukleinsäure, für die bekannt ist, dass sie starke interne Strukturen bilden, die die Hybridisierung verhindern, sind als Primer oder Sonden weniger bevorzugt. Beispiele von solchen Strukturen schließen Haarnadelschleifen ein. Auf die gleiche Weise sollten Oligonukleotide mit ausgedehnter Selbstkomplementarität vermieden werden.
  • Der Grad an nicht-spezifischer Verlängerung (Primer-Dimer oder Nicht-Ziel-Kopieren) kann ebenfalls die Effizienz der Amplifizierung beeinflussen. Aus diesem Grund werden Primer ausgewählt, die insbesondere an den 3'-Enden der Sequenz niedrige Selbst- oder Kreuz-Komplementarität besitzen. Lange homopolymere Teile und ein hoher GC-Gehalt werden vermieden, um falsche Primer-Verlängerung zu verringern. Es ist eine kommerziell erhältliche Computersoftware verfügbar, um bei diesem Aspekt des Entwurfs zu helfen. Verfügbare Computerprogramme schließen MacDNASISTM 2.0 (Hitachi Software Engineering American Ltd.) und OLIGO® ver. 4.1 (National Bioscience) ein.
  • Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass Hybridisierung die Assoziierung von zwei Einzelsträngen komplementärer Nukleinsäure, um einen wasserstoffbrückengebundenen Doppelstrang zu bilden, einschließt. Es ist implizit, dass, wenn einer der beiden Stränge vollständig oder teilweise in einem Hybrid gebunden ist, dieser weniger in der Lage sein wird, an der Bildung eines neuen Hybrids teilzunehmen. Durch den Entwurf von Primern und Sonden, so dass wesentliche Teile der Sequenzen von Interesse einzelsträngig sind, kann die Rate und das Ausmaß der Hybridisierung stark erhöht werden. Wenn das Ziel eine integrierte genomische Sequenz ist, wird sie natürlicherweise in doppelsträngiger Form auftreten (wie es bei dem Produkt der Polymerase-Kettenreaktion der Fall ist). Diese doppelsträngigen Ziele hemmen auf natürliche Weise die Hybridisierung mit einer Sonde und erfordern vor dem Hybridisierungsschritt eine Denaturierung.
  • Die Rate der Polynukleotid-Hybridisierung kann durch das Bestimmen von C0t1/2 gemessen werden. Die Rate, mit der ein Polynukleotid an sein Ziel hybridisiert, ist ein Maß der thermalen Stabilität der Zielsekundärstruktur in der Zielbindungsregion. Die Standardmessung der Hybridisierungsrate ist C0t1/2, was als Mol Nukleotid pro Liter multipliziert mit Sekunden gemessen wird. Es ist somit die Konzentration der Sonde multipliziert mit der Zeit, bei der 50% der maximalen Hybridisierung bei dieser Konzentration auftritt. Dieser Wert wird durch das Hybridisieren verschiedener Mengen von Polynukleotid an eine konstante Menge Ziel über einen festgelegten Zeitraum bestimmt. Der C0t1/2 wird graphisch durch Standardverfahren, die dem Durchschnittsfachmann vertraut sind, bestimmt.
  • Bevorzugte Amplifizierungs-Primer
  • Primer, die zum Durchführen von Amplifizierungsreaktionen nützlich sind, können unterschiedliche Längen besitzen. Z. B. besitzen Amplifizierungs-Oligonukleotide, die zu einem Strang der HIV-2 Ziel-Nukleinsäure-Sequenz komplementär sind, vorzugsweise Längen von bis zu 100 Basen, bevorzugter von 18 bis 60 Basen, noch bevorzugter von 18 bis 34 Basen, oder noch bevorzugter von 18 bis 25 Basen, und schließen mindestens 9 und bis zu 34 zusammenhängende Basen ein, die zu der Sequenz, die durch AAAATCCCTAGCAGGTTGGCGCCCGAACAGGGAC (SEQ ID NO: 8) angegeben wird, wesentlich komplementär sind. Anders ausgedrückt, aber dieselben Oligonukleotide identifizierend, schließen diese Primer mindestens 9 und bis zu 34 zusammenhängende Basen ein, die in einer Sequenz, die im Wesentlichen GTCCCTGTTCGGGCGCCAACCTGCTAGGGATTTT (SEQ ID NO: 9) entspricht, ein. Obwohl nicht angenommen wird, dass es für die Ausführbarkeit der Erfindung essentiell ist, besitzen alle Primer, die in Tabelle 2 aufgelistet werden, die gemeinsame Kernsequenz CGGGCGCCA (SEQ ID NO: 34). Unsere Erkenntnis, dass Fehlpaarungen zwischen der Sequenz von SEQ ID NO: 9 und der Primer-Sequenz, die stromabwärts (3') der Sequenz von SEQ ID NO: 34 lokalisiert ist, toleriert werden, zeigt die allgemeine Nützlichkeit von Primern, die eine Untergruppe der Sequenz von SEQ ID NO: 9 besitzen. In anderen Worten, Primer-Sequenzen, die von SEQ ID NO: 9 abgeleitet sind, und die unter Amplifizierungsbedingungen, wie sie z. B. hierin verwendet werden, an ein Ziel hybridisieren, das die Sequenz von SEQ ID NO: 8 besitzt, können bei den hierin beschriebenen Amplifizierungsverfahren verwendet werden. Im Allgemeinen werden Primer, die 9 bis 34 zusammenhängende Basen von SEQ ID NO: 9 besitzen, für die Verwendung als Promotor-Primer, wie z. B. T7 Promotor-Primer, besonders bevorzugt. Natürlich ist, wenn der Primer ein T7 Promotor-Primer ist, am 5'-Ende des Primers eine T7 Promotorsequenz eingeschlossen, die typischerweise ungefähr 27 bis 33 Basen zu der Länge des Primers hinzufügt. Ein Beispiel eines bevorzugten Amplifizierungs-Primers gemäß diesem Aspekt der Erfindung schließt ein Oligonukleotid ein, das die Sequenz, die mit SEQ ID NO: 10 angegeben wird, besitzt. Der hierin offenbarte T7 Promotor-Primer ist insbesondere zum Durchführen von Nukleinsäure-Amplifizierungsreaktionen unter Verwendung der Verfahren, die von Kacian et al., in U.S. Patent Nr. 5,399,491 und Nr. 5,554,516 beschrieben werden, nützlich. Primer können gegebenenfalls modifizierte Oligonukleotide oder Nukleotid-Analoga einschließen. Vorzugsweise wird der Nachweis von Amplicons, die unter Verwendung dieser Primer synthetisiert wurden, durch Verwendung der hierin offenbarten Oligonukleotid-Nachweissonden erreicht.
  • Andere Amplifizierungs-Primer, die in jeder Kombination mit den oben beschriebenen Primern zum Durchführen von Amplifizierungsreaktionen verwendet werden können, sind komplementär zu dem entgegengesetzten Strang der HIV-2 Ziel-Nukleinsäure-Sequenz. Amplifizierungs-Primer, die zu diesem entgegengesetzten Strang der HIV-2 Ziel-Nukleinsäure-Sequenz komplementär sind, besitzen vorzugsweise Längen von bis zu 100 Basen, oder bevorzugter 19 bis 40 Basen, oder noch bevorzugter 19 bis 21 Basen. Diese Primer sind insbesondere als Nicht-Promotor-Primer nützlich. Wie hierin offenbart, besitzen diese Primer mindestens 19 zusammenhängende Basen von einer Sequenz, die im Wesentlichen GTGTGTGTTCCCATCTCTCCTAGTCGCCGCCTGGTCATTC (SEQ ID NO: 1) entspricht. Beispiele von bestimmten Amplifizierungs-Primern, die diese Bedingungen erfüllen, schließen Oligonukleotide ein, die die Sequenzen, die durch SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 angegeben werden, besitzen.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass beabsichtigt ist, dass die oben spezifizierten variablen Längen der Amplifizierungs-Primer und Nachweissonden gedacht sind, externe Sequenzen, die an der Zielbindung nicht teilnehmen und die die Amplifizierungs- oder Nachweisverfahren nicht wesentlich beeinflussen einschließen. Z. B. besitzen Promotor-Primer, die zum Durchführen der Amplifizierungsreaktion gemäß der Erfindung nützlich sind, mindestens eine Minimalsequenz, die an die HIV-2 Ziel-Nukleinsäure hybridisiert, und eine Promotorsequenz, die stromaufwärts dieser Minimalsequenz positioniert ist. Die Insertion von Sequenzen zwischen die ziel-bindende Sequenz und die Promotorsequenz könnte jedoch die Länge des Primers verändern, ohne seine Nützlichkeit in der Amplifizierungsreaktion zu gefährden. Zusätzlich sind die Längen der Amplifizierungs-Primer und Nachweissonden frei wählbar, solange die Sequenzen dieser Oligonukleotide den minimalen essentiellen Erfordernissen zum Hybridisieren der gewünschten komplementären Sequenz entsprechen. Sondensequenzen sollten die 14er Sequenz von SEQ ID NO: 21 oder das Komplementär davon als gemeinsamen Kern einschließen. Das definiert eine Sonden-Bindungsdomäne in der HIV-2 Zielsequenz oder in Amplicons, die durch ein Amplifizierungsverfahren synthetisiert wurden. Amplifizierungs-Primer, die stromabwärts der sonden-bindenden Domäne hybridisieren, sollten Sequenzen besitzen, die SEQ ID NO: 10 und gegebenenfalls eine 5'-Promotorsequenz, die zu der HIV-2 Nukleinsäure nicht komplementär ist, umfassen.
  • Schließlich sollten Amplifizierungs-Primer, die stromaufwärts der sonden-bindenden Domäne hybridisieren, mindestens 19 zusammenhängende Basen der Sequenz von SEQ ID NO: 1 besitzen.
  • Die folgenden beiden Tabellen zeigen spezifische Beispiele von Oligonukleotid-Sequenzen, die als Primer zum Amplifizieren von HIV-2 Nukleinsäuren verwendet wurden. Tabelle 1 präsentiert die Sequenzen von Nicht-T7 Primern, die zu HIV-2 Sequenzen auf einem Strang der Nukleinsäure komplementär waren. Tabelle 2 präsentiert die Sequenzen von sowohl den HIV-2 ziel-komplementären Sequenzen als auch den vollen Sequenzen für T7 Promotor-Primer, die während der Entwicklung der Erfindung verwendet wurden. Verglichen mit den Oligonukleotid-Sequenzen in Tabelle 1 sind die Oligonukleotid-Sequenzen in Tabelle 2 zu dem entgegengesetzten Nukleinsäure-Strang komplementär. Wie oben angegeben, schließen alle T7 Promotor-Primer an ihren 3'-Enden Sequenzen, die zu einem HIV-2 Ziel komplementär sind, und an ihren 5'-Enden eine T7 Promotorsequenz ein.
  • Tabelle 1 Polynukleotid-Sequenzen von Amplifizierungs-Primern
    Figure 00380001
  • Tabelle 2 präsentiert eine zu HIV-2 als Ziel komplementäre Oligonukleotid-Sequenz (SEQ ID NO: 10) und die entsprechende T7 Promotor-Primer-Sequenz (SEQ ID NO: 15).
  • Tabelle 2 Polynukleotid-Sequenzen von Amplifizierungs-Primern
    Figure 00380002
  • Bevorzugte Sätze von Primern zum Amplifizieren der HIV-2 LTR-Region in einer Transkriptions-vermittelten Amplifizierungsreaktion schließen einen ersten Primer, der das HIV-2 LTR-Transkript hybridisiert (wie z. B. einer der Primer, die in Tabelle 2 aufgelistet werden) und einen zweiten Primer, der zu der Sequenz eines Verlängerungsprodukts des ersten Primers komplementär ist (wie z. B. eine der Primer-Sequenzen, die in Tabelle 1 aufgelistet werden), ein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der erste Primer ein Promotor-Primer, der an seinem 5'-Ende eine T7 Promotorsequenz einschließt.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird ein Satz von mindestens zwei Amplifizierungs-Primern zum Amplifizieren von HIV-2 Nukleinsäure bereitgestellt, der einschließt: (i) einen ersten Amplifizierungs-Primer, der aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 10 besteht; und (ii) einen zweiten Amplifizierungs-Primer, der ein Oligonukleotid umfasst, das die Basensequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besitzt oder dieser im Wesentlichen entspricht. In einer besonders bevorzugten Kombination ist der erste Amplifizierungs-Primer ein Promotor-Primer, der ein Oligonukleotid umfasst, das die Basensequenz von SEQ ID NO: 10 besitzt oder dieser im Wesentlichen entspricht, und ein zweiter Amplifizierungs-Primer, der ein Oligonukleotid umfasst, das die Basensequenz von SEQ ID NO: 6 besitzt oder dieser im Wesentlichen entspricht.
  • Bevorzugte Nachweissonden
  • Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, die in der Nukleinsäure von HIV-2 vorhanden ist, können einen zusätzlichen Schritt zum Nachweis von HIV-2 Amplicons einschließen. Dieses Verfahren zum Nachweis von HIV-2 Nukleinsäuren (einschließlich HIV-2 Amplicons) schließt Schritte ein für: Inkontaktbringen einer Testprobe mit einer Hybridisierungs-Assay-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen vorzugsweise an die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz oder das Komplementär davon hybridisiert, und dadurch Bilden einer Sonde:Ziel Duplex, die zum Zwecke des Nachweises stabil ist. Danach gibt es einen Schritt zum Bestimmen, ob das Hybrid in der Testprobe vorhanden ist, als Indikation des Vorhandenseins oder des Fehlens von HIV-2 in der Testprobe. Das kann den Nachweis der Sonde:Ziel Duplex als Indikator des Vorhandenseins von HIV-2 in der biologischen Probe einschließen.
  • Hybridisierungs-Assay-Sonden, die zum Nachweis von HIV-2 Nukleinsäure-Sequenzen nützlich sind, schließen eine Basensequenz ein, die im Wesentlichen zu einem HIV-2 RNA-Transkript oder der kodierenden DNA komplementär ist. Somit hybridisieren Sonden der Erfindung einen Strang einer HIV-2 Ziel-Nukleinsäure-Sequenz oder das Komplementär davon. Alle Sonden der vorliegenden Erfindung hybridisieren unter stringenten Hybridisierungs-Assay-Bedingungen stabil eine HIV-2 Zielsequenz. Diese Sonden können ebenfalls zusätzliche Basen außerhalb der angesteuerten Nukleinsäure-Region besitzen, die zu der HIV-2 Nukleinsäure komplementär sein können oder nicht.
  • Bevorzugte Sonden sind ausreichend homolog zu der Ziel-Nukleinsäure, um unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die ungefähr 60°C entsprechen, wenn die Salzkonzentration im Bereich von 0,6–0,9 M liegt, zu hybridisieren. Bevorzugte Salze schließen Lithiumchlorid ein, aber andere Salze, wie z. B. Natriumchlorid und Natriumcitrat können ebenfalls in der Hybridisierungslösung verwendet werden. Beispielhafte Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz werden alternativ durch 0,48 M Natriumphosphatpuffer, 0,1% Natriumdodecylsulfat und jeweils 1 mM EDTA und EGTA, oder durch 0,6 M LiCl, 1% Lithiumlaurylsulfat, 60 mM Lithiumsuccinat und jeweils 10 mM EDTA und EGTA bereitgestellt.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung besitzen die Sonden vorzugsweise ziel-komplementäre Sequenzen von bis zu 22 Basen, noch bevorzugter bis zu 18 Basen, und noch bevorzugter bis zu 16 Basen; und schließen zwischen 14 und 22 zusammenhängende Nukleotide, die in einer Sequenz, die im Wesentlichen CCTGGTCTGTTAGGACCCTTCT (SEQ ID NO: 20) entspricht, enthalten sind, ein. Bemerkenswerterweise enthält jede der Sonden, die in den hierin offenbarten Beispielen verwendet wird, eine gemeinsame 14 Basensequenz GTCTGTTAGGACCC (SEQ ID NO: 21). Natürlich können Sonden der vorliegenden Erfindung alternativ Sequenzen besitzen, die zu den vorangehenden Sondensequenzen komplementär sind. In allen Fällen betragen, wenn die Sonden vollständig zu HIV-2 Nukleinsäuren komplementär sind (einschließlich HIV-2 Amplicons), die Längen der Sonden vorzugsweise bis zu 35 Nukleotiden, bevorzugter bis zu 22 Nukleotiden, noch bevorzugter bis zu 18 Nukleotiden, und noch bevorzugter bis zu 16 Nukleotiden. Wie oben angegeben, können Sonden aus DNA, RNA, eine Kombination von DNA und RNA oder einem Nukleinsäure-Analog bestehen, oder ein oder mehrere modifizierte Nukleoside enthalten (z. B. ein Ribonukleosid, das eine 2'-O-Methyl-Substitution an dem Ribofuranosyl-Rest besitzt).
  • Spezifische Beispiele von Sonden, die verwendet werden können, um den hierin offenbarten Assay durchzuführen, schließen Oligonukleotide ein, die die Basensequenzen, die durch SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 und SEQ ID NO: 27 angegeben sind, oder Komplementäre davon besitzen oder ihnen im Wesentlichen entsprechen. Es ist ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass Sonden einen Acridiniumester-Marker, der über einen Nicht-Nukleotid-Linker mit der Sonde verbunden ist, einschließen. Z. B. schließt eine besonders bevorzugte Sonde einen Acridiniumester-Marker ein, der mit der Sonde über einen Nicht-Nukleotid-Linker, der zwischen Nukleotiden 9 und 10 (gelesen 5' nach 3') von SEQ ID NO: 26 positioniert ist, ein.
  • Die folgende Tabelle präsentiert die Sequenzen von bevorzugten Nachweissonden, die zum Nachweis von HIV-2 Amplicons verwendet wurden. Da alternative Sonden zum Nachweis von HIV-2 Nukleinsäure-Sequenzen den entgegengesetzten Strang von HIV-2 hybridisieren können, schließt die vorliegende Erfindung ebenfalls Oligonukleotide ein, die zu den Sequenzen, die in Tabelle 3 präsentiert werden, komplementär sind.
  • Tabelle 3 Polynukleotid-Sequenzen von HIV-2 Amplicon Nachweissonden
    Figure 00430001
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung schließt die Sondensequenz zum Nachweis von amplifizierten LTR-Sequenzen ein Methoxy-Rückgrat oder zumindest eine Methoxy-Bindung in dem Nukleinsäure-Rückgrat ein. Vorzugsweise sind die Nachweissonden mit chemolumineszenten AE-Verbindungen, die über einen Linker, im Wesentlichen wie in U.S. Patent Nr. 5,585,481 und in U.S. Patent Nr. 5,639,604 , insbesondere wie in Spalte 10, Zeile 6 bis Spalte 11, Zeile 3 und in Beispiel 8 beschrieben, beschrieben, an die Sondensequenzen gebunden sind, markiert.
  • Auswahl und Verwendung von Fänger-Oligonukleotiden
  • Bevorzugte Fänger-Oligonukleotide schließen eine erste Sequenz ein, die zu einer HIV-2 Sequenz in der LTR-Region komplementär ist (d. h. eine HIV-2-bindende Sequenz), die kovalent an eine zweite Sequenz (d. h. eine „End"-Sequenz), die als Ziel für die Immobilisierung auf einem festen Träger dient, gebunden ist, ein. Um die Basensequenzen eines Fänger-Oligonukleotids zu verbinden, kann jedes Rückgrat verwendet werden. In bestimmen bevorzugten Ausführungsformen schließt das Fänger- Oligonukleotid mindestens eine Methoxy-Bindung im Rückgrat ein. Die Endsequenz, die sich vorzugsweise an dem 3'-Ende eines Fänger-Oligonukleotids befindet, wird verwendet, um an eine komplementäre Basensequenz zu hybridisieren, und um dadurch ein Mittel zu liefern die hybridisierte HIV-2 Ziel-Nukleinsäure bevorzugt gegenüber anderen Bestandteilen in der biologischen Probe einzufangen.
  • Obwohl jede Basensequenz, die an eine komplementäre Basensequenz hybridisiert, in einer Endsequenz verwendet werden kann, wird bevorzugt, dass sich die hybridisierende Sequenz über eine Länge von ungefähr 5 bis 50 Nukleotid-Resten erstreckt. Besonders bevorzugte Endsequenzen sind im Wesentlichen homopolymer und enthalten ungefähr 10 bis ungefähr 40 Nukleotid-Reste, oder bevorzugter ungefähr 14 bis ungefähr 30 Reste. Ein Fänger-Oligonukleotid kann eine erste Sequenz, die spezifisch ein HIV-2 Ziel-Polynukleotid bindet, und eine zweite Sequenz, die spezifisch einen Oligo(dT)Abschnitt, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, bindet, einschließen.
  • Unter Verwendung der Bestandteile, die in 1 illustriert sind, schließt ein Assay zum Nachweis von HIV-2 Sequenzen in einer biologischen Probe die Schritte des Einfangens der Ziel-Nukleinsäure unter Verwendung des Fänger-Oligonukleotids, Amplifizieren der eingefangenen Zielregion unter Verwendung von mindestens zwei Primern und Nachweis der amplifizierten Nukleinsäure durch zuerst das Hybridisieren der markierten Sonde an eine Sequenz, die in der amplifizierten Nukleinsäure enthalten ist, und dann das Nachweisen des Signals, das von der gebundenen, markierten Sonde resultiert, ein.
  • Der Einfangschritt verwendet vorzugsweise ein Fänger-Oligonukleotid, wobei unter Hybridisierungsbedingungen ein Teil des Fänger-Oligonukleotids spezifisch an eine Sequenz in der Ziel-Nukleinsäure hybridisiert und ein Endteil als ein Bestandteil eines Bindungspaars, wie z. B. ein Ligand (z. B. ein Biotin-Avidin-Bindungspaar), dient, das der Zielregion erlaubt, von anderen Bestandteilen der Probe getrennt zu werden. Vorzugsweise ist der Endteil des Fänger-Oligonukleotids eine Sequenz, die an eine komplementäre Sequenz, die an ein festes Trägerpartikel immobilisiert ist, hybridisiert. Vorzugsweise sind das Fänger-Oligonukleotid und die Ziel-Nukleinsäure zuerst in Lösung, um den Vorteil von Hybridisierungs-Kinetiken in der flüssigen Phase auszunutzen. Die Hybridisierung erzeugt einen Fänger-Oligonukleotid:Ziel-Nukleinsäure-Komplex, der über Hybridisierung des Endteils des Fänger-Oligonukleotids mit einer komplementären immobilisierten Sequenz an eine immobilisierte Sonde binden kann. Somit wird unter Hybridisierungsbedingungen ein Komplex, der eine Ziel-Nukleinsäure, ein Fänger-Oligonukleotid und immobilisierte Sonde umfasst, gebildet. Vorzugsweise ist die immobilisierte Sonde eine repetitive Sequenz und bevorzugter eine homopolymere Sequenz (z. B. Poly-A, Poly-T, Poly-C oder Poly-G), die zu der Endsequenz komplementär und an einen festen Träger gebunden ist. Z. B. würde die immobilisierte Sonde, wenn der Endteil des Fänger-Oligonukleotids eine Poly-A-Sequenz enthält, eine Poly-T-Sequenz enthalten, obwohl jede Kombination von komplementären Sequenzen verwendet werden kann. Das Fänger-Oligonukleotid kann ebenfalls „Abstandshalter"- Reste enthalten, bei denen es sich um eine oder mehrere Basen handelt, die zwischen der Basensequenz, die an das Ziel hybridisiert, und der Basensequenz des Endes, das an die immobilisierte Sonde hybridisiert, lokalisiert sind. Für die Bindung des Ziel-Nukleinsäure:Fänger-Oligonukleotid-Komplexes kann jeder feste Träger verwendet werden. Nützliche Träger können entweder Matrizen oder Partikel, die sich frei in Lösung befinden (z. B. Nitrocellulose, Nylon, Glas, Polyacrylat, gemischte Polymere, Polystyrol, Silanpolypropylen, und vorzugsweise magnetisch anziehbare Partikel) sein. Verfahren zum Binden einer immobilisierten Sonde an den festen Träger sind gut bekannt. Der Träger ist vorzugsweise ein Partikel, das unter Verwendung von Standardverfahren (z. B. Zentrifugation, Anziehung von magnetischen Partikeln und ähnliche) aus der Lösung erhalten werden kann. Bevorzugte Träger sind paramagnetische monodisperse Partikel (d. h. einheitlich in ihrer Größe ± ungefähr 5%).
  • Das Wiedergewinnen des Ziel-Nukleinsäure:Fänger-Oligonukleotids:immobilisierte Sonde Komplexes konzentriert die Ziel-Nukleinsäure (relativ zu ihrer Konzentration in der biologischen Probe) wirksam und reinigt die Ziel-Nukleinsäure von Amplifizierungs-Inhibitoren, die in der biologischen Probe vorhanden sein können. Die eingefangene Ziel-Nukleinsäure kann ein oder mehrere Male gewaschen werden, um das Ziel weiter zu reinigen, z. B. durch das Resuspendieren der Partikel mit dem angehefteten Ziel-Nukleinsäure:Fänger-Oligonukleotid:immobilisierte Sonde Komplex in einer Waschlösung und dann, wie oben beschrieben, Wiedergewinnen der Partikel mit dem angehefteten Komplex aus der Waschlösung. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Einfangschritt durch das sequentielle Hybridisieren des Fänger-Oligonukleotids mit der Ziel-Nukleinsäure und dann dem Einstellen der Hybridisierungsbedingungen, um die Hybridisierung des Endteils des Fänger-Oligonukleotids mit einer immobilisierten komplementären Sequenz (z. B. wie in PCT Nr. WO 98/50583 beschrieben) zu erlauben. Nachdem der Einfangschritt und alle optionalen Waschschritte beendet worden sind, kann die Ziel-Nukleinsäure dann amplifiziert werden. Um die Anzahl von Handhabungsschritten zu beschränken, kann die Ziel-Nukleinsäure gegebenenfalls amplifiziert werden, ohne sie von dem Fänger-Oligonukleotid freizusetzen.
  • Bevorzugte Verfahren zur Amplifizierung und zum Nachweis von HIV-2 Polynukleotid-Sequenzen
  • Bevorzugte Verfahren für die Verwendung der Kits der vorliegenden Erfindung werden durch die unten präsentierten Beispiele beschrieben und illustriert. Mit Bezug auf 1 wird ein System zum Nachweis einer Zielregion des HIV-2 Genoms (durch eine dicke durchgehende horizontale Linie angezeigt) illustriert. Dieses System schließt vier Oligonukleotide (durch die kürzeren durchgehenden Linien gezeigt) ein: ein Fänger-Oligonukleotid, das eine Sequenz, die spezifisch an eine HIV-2 Sequenz in der Zielregion hybridisiert, und ein Ende („T"), das an eine komplementäre Sequenz, die auf einem festen Träger immobilisiert ist, hybridisiert, einschließt, um die Zielregion, die in einer biologischen Probe vorhanden ist, einzufangen; einen T7 Promotor-Primer, der eine Sequenz einschließt, die spezifisch an eine HIV-2 Sequenz in der Zielregion hybridisiert, und eine T7 Promotorsequenz („P"), die, wenn doppelsträngig, als ein funktioneller Promotor für die T7 RNA Polymerase dient; einen Nicht-T7 Primer, der eine Sequenz einschließt, die spezifisch an einen ersten Strang cDNA hybridisiert, der von der Zielregion-Sequenz unter Verwendung des T7 Primers hergestellt wurde; und eine markierte Sonde, die eine Sequenz einschließt, die spezifisch an einen Teil der Zielregion, die unter Verwendung der zwei Primer amplifiziert worden ist, hybridisiert.
  • Wie oben angegeben, kann die Amplifizierung der eingefangenen Zielregion unter Verwendung der beiden Primer unter Verwendung einer Reihe von bekannten Nukleinsäure-Amplifizierungsreaktionen erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Transkriptions-assoziierte Amplifizierungsreaktion, wie z. B. TMA, verwendet. In solch einer Ausführungsform werden viele Nukleinsäure-Stränge aus einer einzigen Kopie einer Ziel-Nukleinsäure hergestellt, und erlauben so den Nachweis des Ziels durch Nachweissonden, die an die amplifizierten Sequenzen gebunden sind. Vorzugsweise verwendet die transkriptions-assoziierte Amplifizierung zwei Arten von Primern (einer wird als Promotor-Primer bezeichnet, da er eine Promotorsequenz für eine RNA Polymerase, in 1 als „P" bezeichnet, enthält), zwei Enzyme (eine reverse Transkriptase und eine RNA Polymerase), und Substrate (Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate) mit entsprechenden Salzen und Puffern in einer Lösung, um viele RNA-Transkripte von einem Nukleinsäure-Template zu erzeugen.
  • Bezugnehmend auf 1 wird die eingefangene Ziel-Nukleinsäure während der transkriptions-vermittelten Amplifizierung an einen ersten Primer, der als T7 Promotor-Primer gezeigt ist, hybridisiert. Unter Verwendung von reverser Transkriptase wird von dem T7 Promotor-Primer unter Verwendung der Ziel-RNA als Template cDNA synthetisiert. Der zweite Primer, der als Nicht-T7 Primer gezeigt ist, hybridisiert an den cDNA-Strang und wird durch den Einsatz einer reversen Transkriptase verlängert, um eine DNA Duplex zu bilden, und bildet dadurch eine doppelsträngige T7 Promotorregion. T7 RNA Polymerase erzeugt dann viele RNA-Transkripte unter Verwendung dieses funktionalen T7 Promotors. Der autokatalytische Mechanismus von TMA verwendet repetitive Hybridisierung und Polymerisationsschritte, die dem cDNA-Syntheseschritt folgen, um zusätzliche RNA-Transkripte zu erzeugen, und dadurch zielregions-spezifische Nukleinsäure-Sequenzen zu amplifizieren.
  • Der Nachweisschritt verwendet mindestens eine Nachweissonde, die spezifisch an die amplifizierten RNA-Transkripte oder oben beschriebenen Amplicons bindet. Vorzugsweise ist die Nachweissonde mit einem nachweisbaren Marker markiert, der unter Verwendung eines homogenen Nachweissystems nachgewiesen werden kann. Bevorzugter ist die markierte Sonde mit einer Acridiniumester-Verbindung markiert, die ein chemolumineszentes Signal erzeugt, das wie oben beschrieben nachgewiesen werden kann.
  • Kits zum Nachweis von HIV-2 Nukleinsäuren
  • Die Erfindung bezieht sich auf Kits zum Durchführen von Polynukleotid-Amplifizierungsreaktionen unter Verwendung von HIV-2 Nukleinsäure-Templates. Vorzugsweise enthalten Kits gemäß der vorliegenden Erfindung ein Paar von Oligonukleotid-Primern, die für die Amplifizierung von HIV-2 Nukleinsäuren in einer in vitro Amplifizierungsreaktion verwendet werden können. Beispielhafte Kits können einschließen: (1) ein erstes Amplifizierungs-Oligonukleotid, das SEQ ID NO: 10 und gegebenenfalls eine 5'-Promotorsequenz, die zu der HIV-2 Nukleinsäure nicht komplementär ist, umfasst; und (2) ein zweites Amplifizierungs-Oligonukleotid, das eine Sequenz von 19–40 zusammenhängenden Basen der Sequenz von SEQ ID NO: 1 einschließt, und eine Länge von bis zu 100 Nukleotiden besitzt. Natürlich können kürzere Amplifizierungs-Oligonukleotide, die hierin offenbart sind, ebenfalls in Kit-Formate gepackt werden. Die Kits können ferner eine Oligonukleotid-Nachweissonde enthalten, die die Sequenz von SEQ ID NO: 21 oder das Komplementär davon einschließt. Diese Probe kann bis zu 35 Nukleotide lang sein, aber kann alternativ bis zu 22 Nukleotide lang oder wie hierin offenbart kürzer sein. Des Weiteren können die Kits Fänger-Oligonukleotide zum Reinigen von HIV-2 Template Nukleinsäuren von anderen Arten vor der Amplifizierung enthalten. Beispielhafte Fänger-Oligonukleotide besitzen die Sequenzen von SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32.
  • Multiplex-Amplifizierungsreaktionen
  • Ein günstiges Testformat zum Nachweis von multiplen Polynukleotid-Analyten schließt das Durchführen von gleichzeitigen Amplifizierungsreaktionen unter Verwendung von verschiedenen Primer-Sätzen ein, wobei Amplicons, die in der Reaktion synthetisiert werden, durch Hybridisierung nachgewiesen werden. In dieser Beziehung hat Gen-Probe Incorporated (San Diego, CA) einen HIV-1/HCV-Test entwickelt, der HIV-1 und/oder HCV (Hepatitis C Virus) Nukleinsäuren in einem Multiplexformat in einem einzigen Röhrchen unter Verwendung von drei Schlüsselschritten nachweist. In einem anfänglichen Probenvorbereitungsverfahren wird Plasma mit einem Detergens behandelt, um virale genomische DNA freizusetzen, ziel-spezifische Oligonukleotide werden an das Ziel hybridisiert und an magnetische Mikropartikel gebunden, die in einem magnetischen Feld von dem Plasma getrennt werden. Als Nächstes wird ein Transkriptions-basiertes Polynukleotid-Amplifizierungssystem verwendet, um HIV-1 und/oder HCV Ziel-RNA in einer einzigen Reaktion zu amplifizieren. Schließlich wird der Nachweis unter Verwendung von Nukleinsäure-Hybridisierung mit chemolumineszenten Sonden, die zu den HIV-1 oder HCV Amplicons komplementär sind, erreicht. Wenn der Assay ein positives Ergebnis ergibt, werden Tests zur Unterscheidung zwischen den beiden Viren durchgeführt.
  • Wenn die Anzahl von verschiedenen Primer-Sätzen in einer Multiplex-Amplifizierungsreaktion ansteigt, wobei jeder Satz von Primern spezifisch für ein anderes Polynukleotid-Analyt ist, gibt es verstärkt Gelegenheit für unerwünschte Wechselwirkung zwischen Primern und zwischen Primern und irrelevanten Amplicons. Die hierin offenbarten Primer-Sequenzen können vorteilhafterweise als Reagenzien in einer einzigen Polynukleotid-Amplifizierungsreaktion verwendet werden, die ebenfalls in der Lage ist, virusspezifische Sequenzen von HIV-1, Hepatitis B Virus (HBV) und Hepatitis C Virus (HCV) zu amplifizieren.
  • Die allgemeinen Prinzipien der vorliegenden Erfindung können unter Bezugnahme auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele besser verstanden werden. Das erste Beispiel beschreibt Verfahren zum Identifizieren von nützlichen Amplifizierungs-Primern.
  • Bevorzugte Primer-Kombinationen zur Amplifizierung von Polynukleotid-Sequenzen der langen terminalen Wiederholung (LTR) von HIV-2 wurden in einer Reihe von Verfahren, die verschiedene Anzahlen von Nukleinsäure Template Molekülen verwendeten, identifiziert. Wie unten beschrieben, wurde ein anfänglicher Test unter Verwendung eines synthetischen HIV-2 Templates mit einer Konzentration von 5000 Kopien/Reaktion durchgeführt. Folgende Tests, die durchgeführt wurden, verwendeten entweder 100 oder 500 Kopien/Reaktion und lieferten Information über die Sensitivität des Assays. Die Analyse der Ergebnisse von wiederholten Versuchen ergaben durchschnittliche Werte für die Amplicon-Produktion, sowie Information über die Reproduzierbarkeit des Verfahrens. T7 Promotor-Primer und Nicht-T7 Primer wurden unter Verwendung des unten beschriebenen Verfahrens in Kombination in Lösung getestet. Obwohl die unten beschriebenen Verfahren insbesondere unter Verwendung eines transkriptions-vermittelten Amplifizierungs-(TMA)-Protokolls durchgeführt wurden, können die hierin offenbarten Primer verwendet werden, um Amplicons über alternative Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann vertraut sind, zu erzeugen.
  • Beispiel 1 beschreibt die Verfahren, die für die Identifizierung von Primern, die HIV-2 Polynukleotid-Sequenzen amplifizierten, verwendet wurden.
  • Beispiel 1
  • Identifikation von Amplifizierungs-Primern
  • In vitro transkribierte RNA, die die Sequenz der Basen 1–644 des HIV-2 HIV2FG Subtyp LTR (GenBank Zugangsnummer J03654) einschloss, wurde unter Verwendung eines linearisierten Plasmidklons gemäß Standardlaborverfahren als Template hergestellt. Die resultierenden in vitro Transkripte wurden dann in Amplifizierungsreaktionen, die gepaarte Primer-Sätze in TMA-Reaktionen, im Wesentlichen wie von Kacian et al., in U.S. Patent Nr. 5,399,491 beschrieben, verwendeten, als Template verwendet. Jeder Promotor-Primer schloss entweder eine T7 Promotorsequenz AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA (SEQ ID NO: 28) oder GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACA (SEQ ID NO: 29) an dem 5'-Ende und eine ziel-komplementäre Sequenz an dem 3'-Ende ein. Amplifizierungsreaktionen wurden anfänglich für einige der Primer-Kombinationen unter Verwendung von 5000 Kopien des synthetischen RNA-Templates und 15 pmol von jedem Primer in 100 μl Standardreaktionspuffer durchgeführt. Die Ziel-Nukleinsäure und Primer wurden für 10 Minuten auf 60°C erhitzt und dann auf 42°C gekühlt, um die Primer-Bindung zu ermöglichen. Moloney Maus Leukämie Virus (MMLV), reverse Transkriptase (2000 Einheiten) und T7 RNA Polymerase (2000 Einheiten) wurden dann zu den Mischungen zugegeben. Die endgültigen Amplifizierungsreaktionen enthielten 50 mM Tris HCl (pH 8,5), 35 mM KCl, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 20 mM MgCl2, 20 mM N-Acetyl-L-Cystein und 5% (w/v) Glycerin. Nach einer Stunde Inkubation bei 42°C wurde die gesamte 100 μl Amplifizierungsreaktion mittels Hybridisierung, im Wesentlichen wie von Arnold et al., in U.S. Patent Nr. 5,639,604 , dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben, unter Verwendung einer Acridiniumester-markierten Sonde in einem homogenen Schutzassay untersucht. Eine Sonde, die die Sequenz von SEQ ID NO: 27 besaß, wurde mit AE bis zu einer spezifischen Aktivität von 1,94 × 108 RLU/pmol markiert und dann in einer Menge, die 1,9 × 107 RLU für jede Hybridisierungsreaktion entsprach, verwendet, um HIV-2 Amplicons nachzuweisen. Die Sonden-Hybridisierung wurde in 200 μl einer Lösung, die 0,05 M Lithiumsuccinat (pH 5), 0,6 M LiCl, 1% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, bei 60°C für 10 Minuten, gefolgt von der Zugabe von 300 μl 0,15 M Natriumtetraborat (pH 8,5), 1% TRITON® X-100 (Union Carbide Corporation; Danbury, CT) durchgeführt. Diese Mischung wurde zuerst bei 60°C für 10 Minuten inkubiert, um nicht hybridisierte Sonde zu inaktivieren, und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Die verbleibende Chemoluminenszenz in jeder Probe wurde unter Verwendung eines Gen-Probe LEADER® I Luminometers, das für die automatische Injektion von 1 mM Salpetersäure und 0,1% (v/v) Wasserstoffperoxid gefolgt von einer Injektion einer Lösung, die 1 N Natriumhydroxid enthielt, eingestellt war, untersucht. Ergebnisse, die in dieser Chemolumineszenz-Reaktion gemessen wurden, wurden in relativen Lichteinheiten (RLU) ausgedrückt.
  • Tabelle 4 präsentiert die Ergebnisse von Amplifizierungsverfahren, die unter Verwendung von 5000 Kopien eines Template Polynukleotids durchgeführt wurden. In besonderem Maße wirksam amplifiziert der Promotor-Primer, der die Sequenz von SEQ ID NO: 17 besaß, HIV-1 Polynukleotid-Sequenzen (Daten nicht gezeigt) und wurde in dem vorliegenden Verfahren eingeschlossen, um zu bestimmen, ob HIV-1 und HIV-2 Nukleinsäuren unter Verwendung eines gemeinsamen Primers ko-amplifiziert werden können. Die Sequenz dieses Primers überspannt eine Sequenzregion, in der HIV-1 und HIV-2 sich durch eine Insertion/Deletion unterscheiden. Somit hatte der HIV-2 ziel-komplementäre Teil des Promotor-Primers, verglichen mit der Sequenz von SEQ ID NO: 9 (von der die Promotor-Primer-Sequenzen der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind), eine Fehlpaarung an der Nukleotid-Position 28 und zwei Nukleotid-Deletionen, die einem AC Nukleotid-Paar an Positionen 19–20 in der Sequenz von SEQ ID NO: 9 entsprach. Die Ergebnisse, die in der Tabelle gezeigt sind, sind aus Wiederholungen von vier Versuchen (für den Promotor-Primer, der die Sequenz von SEQ ID NO: 16 besaß) oder fünf Versuchen (für die Promotor-Primer, die die Sequenzen von SEQ ID NO: 15 und 17 besaßen) des Amplifizierungs- und Nachweisverfahrens abgeleitet. Einige der negativen Kontroll-Einträge („neg. Kontrolle), die in der Tabelle gezeigt sind, wurden von Assay erhalten, die an anderen Zeitpunkten durchgeführt wurden. Alle negativen Kontrollwerte wurden von Versuchen erhalten, die in der Abwesenheit von HIV-2 Template durchgeführt wurden. Angesichts der hohen Reproduzierbarkeit des Assays nahmen wir vernünftigerweise an, dass das Ausmaß der negativen Kontrollreaktionen über unterschiedliche Experimente ebenfalls vergleichbar sein würde. Daten, die nicht verfügbar sind, sind in der Tabelle durch „NA" angegeben. Tabelle 4 Amplifizierung von HIV-2 Polynukleotid-Sequenzen unter Verwendung von verschiedenen Primer-Kombinationen
    Nicht-T7 Primer Identifikation
    T7 Promotor-Primer Identifikation Ergebnis SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 7
    SEQ ID NO: 15 Durchschnitts-RLU 12002375 11450076 11701970
    neg. Kontrolle 400916 27993 53954
    %CV 4 7 5
    SEQ ID NO: 16 Durchschnitts-RLU 12160598 4894812 11501174
    neg. Kontrolle NA NA 29936
    %CV 5 5 6
    SEQ ID NO: 17 Durchschnitts-RLU 9712454 4989813 11032883
    neg. Kontrolle NA 115172 NA
    %CV 15 62 6
  • Die Ergebnisse, die in Tabelle 4 präsentiert werden, zeigen, dass jede der Primer-Kombinationen, die bei Template-Konzentration von 5000 Kopien/Reaktion getestet wurden, positive Ergebnisse ergaben. Obwohl alle der Promotor-Primer in dem Verfahren einfach nachweisbare Amplifizierungssignale ergaben, ergab der Promotor-Primer, der als SEQ ID NO: 15 identifiziert ist, in vorteilhafter Weise gute Ergebnisse, wenn er in Kombination mit jedem der Nicht-T7 Primer, die getestet wurden, verwendet wurde. In besonderem Maße waren die Amplifizierungsreaktionen, die den Promotor-Primer, der die Sequenz von SEQ ID NO: 15 besaß, einheitlich mit niedrigen %CV-Werten assoziiert und zeigen dadurch einen hohen Grad an Reproduzierbarkeit und besondere Robustheit der Amplifizierungsreaktionen, die diesen Primer einschlossen, an. Interessanterweise zeigen die Ergebnisse in der Tabelle, dass sogar der Promotor-Primer, der die Sequenz von SEQ ID NO: 17 besaß, die HIV-1 Sequenzen in einer hocheffizienten Art und Weise amplifiziert, in diesem Verfahren ebenfalls HIV-2 Sequenzen amplifizierte.
  • Basierend auf den Ergebnissen, die in Tabelle 4 präsentiert sind, wurden weitere Tests unter Verwendung von zusätzlichen Promotor-Primern und niedrigen Konzentrationen von Template durchgeführt, um Flexibilität in Bezug auf den Entwurf von nützlichen Promotor-Primern und die Sensitivität des Assays zu demonstrieren. Insbesondere wurden die oben beschriebenen Amplifizierungs- und Nachweisverfahren unter Verwendung der Promotor-Primer, die die Sequenzen von SEQ ID NOs: 15 und 17 besaßen, in Kombination mit Nicht-T7 Primern und entweder 100 oder 500 Kopien des HIV-2 Templates in jeder Reaktion wiederholt. Danach wurde einer der Nicht-T7 Primer für Tests in Kombination mit einer Auswahl von T7 Promotor-Primern, die T7 Promotorsequenzen und ziel-komplementäre Sequenzen, die sich von denen, die in jedem der Promotor-Primern, die Sequenzen besitzen, die durch SEQ ID NOs: 15–17 identifiziert werden, unterschieden, ausgewählt. Die Ergebnisse dieser Verfahren sind in den Tabellen 5–8 präsentiert. Tabelle 5 Amplifizierung von HIV-2 Polynukleotid-Sequenzen bei 500 Kopien/Reaktion unter Verwendung von verschiedenen Primer-Kombinationen
    Nicht-T7 Primer Identifikation
    T7 Promotor-Primer Identifikation Ergebnis SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 7
    SEQ ID NO: 15 Durchschnitts-RLU 11551224 11709201 10728899
    neg. Kontrolle 91900 84559 93300
    %CV 7 3 10
    SEQ ID NO: 17 Durchschnitts-RLU 158707 2813144 1416150
    neg. Kontrolle NA 115172 99001
    %CV 19 128 182
    Tabelle 6 Amplifizierung von HIV-2 Polynukleotid-Sequenzen mit 100 Kopien/Reaktion unter Verwendung von verschiedenen Primer-Kombinationen
    Nicht-T7 Primer Identifikation
    T7 Promotor-Primer Identifikation Ergebnis SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 7
    SEQ ID NO: 15 Durchschnitts-RLU 10805600 9581007 11022067
    neg. Kontrolle 91900 84559 93300
    %CV 11 17 4
    SEQ ID NO: 17 Durchschnitts-RLU 1710494 129235 846399
    neg. Kontrolle 497960 115172 99001
    %CV 184 19 165
  • Die Ergebnisse, die in den Tabellen 5 und 6 präsentiert werden, bestätigen, dass der Promotor-Primer, der durch SEQ ID NO: 15 identifiziert wird, wirksam HIV-2 Polynukleotid-Sequenzen mit jedem der angegebenen Nicht-T7 Primer amplifizierte, sogar bei anfänglichen Template-Konzentrationen von nur 100 Kopien/Reaktion. Der Promotor-Primer, der die Sequenz von SEQ ID NO: 17 besaß, war ebenfalls als ein Bestandteil in der Amplifizierungsreaktion nützlich, obwohl, verglichen mit dem Promotor-Primer, der die Sequenz von SEQ ID NO: 15 besaß, nur mit einem etwas verringerten Grad. Diese beiden Primer definierten somit klar eine Region des LTR, die als Ziel für die Primer-Bindung in dem HIV-2 Nukleinsäure-Amplifizierungs-Assay nützlich war.
  • Es wurden drei zusätzliche Nicht-T7 Primer synthetisiert und in Kombination mit dem Promotor-Primer mit SEQ ID NO: 15 in dem HIV-2 Amplifizierungs-Assay getestet. Diese zusätzlichen Primer besaßen die Sequenzen, die durch SEQ ID NOs: 4–6 angegeben sind, wobei die Positionen 1–4 von jedem Oligonukleotid durch 2'-Methoxy-Reste besetzt waren. Tabelle 7 präsentiert Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn diese Primer-Sätze in dem oben beschriebenen Amplifizierungsprotokoll unter Verwendung von 100 Kopien der synthetischen HIV-2 Template RNA in jeder Reaktion getestet und die Amplifizierungsprodukte im Wesentlichen wie oben beschrieben bestimmt wurden. Tabelle 7 Amplifizierung von HIV-2 Polynukleotid-Sequenzen bei 100 Kopien/Reaktion unter Verwendung von verschiedenen Primer-Kombinationen
    Nicht-T7 Primer Identifikation
    T7 Promotor-Primer Identifikation Ergebnis SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 7
    SEQ ID NO: 15 Durchschnitts-RLU 15143148 15149932 13731644
    neg. Kontrolle 133313 82829 11547
    %CV 4,3 5,5 8,5
  • Die Ergebnisse, die in Tabelle 7 präsentiert werden, zeigen, dass alle drei Primer-Kombinationen ausnehmend gute Ergebnisse in dem Amplifizierungsverfahren ergaben.
  • In besonderem Maße wirksam amplifizierte die Kombination des Primers, der die Sequenz von SEQ ID NO: 6 besaß, und des Promotor-Primers, der die Sequenz von SEQ ID NO: 15 besaß, die HIV-2 Template Sequenz und ergab vorteilhafterweise ein sehr niedriges Ergebnis für die negative Kontrollreaktion. Die Kombination des Primers, der die Sequenz von SEQ ID NO: 6 besitzt, und des Promotor-Primers, der die Sequenz von SEQ ID NO: 15 besitzt, ist eine besonders bevorzugte Kombination zur Amplifizierung von HIV-2 Polynukleotid-Sequenzen.
  • Schließlich wurde der Primer, der die Sequenz von SEQ ID NO: 6 besaß, in Kombination mit Promotor-Primern, die durch SEQ ID NOs: 18 und 19 identifiziert werden, in Amplifizierungsreaktionen getestet, die unter Verwendung von entweder 500 oder 100 Kopien/Reaktion des HIV-2 Templates durchgeführt wurden. Bedeutsamerweise unterschieden sich sowohl die ziel-komplementäre Sequenz als auch die T7 Promotorsequenz in den beiden Primern von der T7 Promotorsequenz, die in den Promotor-Primern von SEQ ID NOs: 15–17 verwendet wurde. Ebenfalls bedeutsam ist die Tatsache, dass der Promotor-Primer, der durch SEQ ID NO: 18 identifiziert wird, eine einzelne Basen-Deletion, die dem A-Rest an Position 19 der Sequenz, die durch SEQ ID NO: 9 angegeben wird, entspricht, besaß. Die numerischen Werte, die in Tabelle 8 präsentiert werden, sind die Ergebnisse von 5 bzw. 4 wiederholten Versuchen, die unter Verwendung von 500 und 100 Kopien/Reaktion des HIV-2 Ziels durchgeführt wurden. Tabelle 8 Amplifizierung von HIV-2 Polynukleotid-Sequenzen bei 500 oder 100 Kopien/Reaktion unter Verwendung von verschiedenen Primer-Kombinationen
    Nicht-T7 Primer Identifikation
    T7 Promotor-Primer Identifikation HIV-2 Ziel Kopienanzahl Ergebnis SEQ ID NO: 6
    SEQ ID NO: 18 500 Durchschnitts-RLU 2800000
    neg. Kontrolle 4778
    %CV 8
    100 Durchschnitts-RLU 2800000
    neg. Kontrolle 7367
    %CV 6
    SEQ ID NO: 19 500 Durchschnitts-RLU 2700000
    neg. Kontrolle 2710
    %CV 10
    100 Durchschnitts-RLU 2800000
    neg. Kontrolle 36207
    %CV 8
  • Die Ergebnisse, die in Tabelle 8 präsentiert werden, zeigen, dass beide T7 Promotor-Primer, die durch SEQ ID NOs: 18–19 identifiziert werden, in dem Amplifizierungs-Assay gute Ergebnisse ergaben, wobei die positiven Signale 500- bis 1000-fach über den Signalen, die in den negativen Kontrollreaktionen, die unter Verwendung von 500 Kopien/Reaktion des HIV-2 Ziels durchgeführt wurden, lagen. Bemerkenswerterweise waren die Sonden-Hybridisierungssignale, die in den negativen Kontrollreaktionen, die diese Promotor-Primer verwendeten, vorteilhafterweise sehr niedrig. Diese Ergebnisse zeigten ferner, dass verschiedene T7 Promotorsequenzen in den Amplifizierungsverfahren mit guten Ergebnissen verwendet werden können.
  • Die zusammengefassten Ergebnisse, die in den Tabellen 3–7 präsentiert werden, zeigen, dass die LTR-Zielregion, die durch jeden der oben beschriebenen Nicht-T7 Primer gebunden wird, eine Domäne definiert, die für den Entwurf zusätzlicher Primer für die Verwendung in Kombination mit T7 Promotor-Primern zur Amplifizierung von HIV-2 Sequenzen verwendet werden kann. Diese Domäne umfasst die 40 Nukleotide lange Sequenz, die durch GTGTGTGTTCCCATCTCTCCTAGTCGCCGCCTGGTCATTC (SEQ ID NO: 1) abgegeben wird. Oligonukleotide, die Sequenzen besitzen, die im Wesentlichen dieser Sequenz entsprechen oder eine Untergruppe davon können in den hierin beschriebenen Amplifizierungsreaktionen als Primer eingesetzt werden. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse in den Tabellen 4–8, dass die LTR-Zielregion, die durch jeden der oben beschriebenen T7 Promotor-Primer gebunden wurde, eine Domäne definiert, die in Kombination mit Nicht-T7 Primern verwendet werden kann, um HIV-2 Sequenzen zu amplifizieren. Diese Domäne umfasst die 34 Nukleotide lange Sequenz AAAATCCCTAGCAGGTTGGCGCCCGAACAGGGAC (SEQ ID NO: 8). Oligonukleotide, die zu dieser Sequenz oder zu einer Sequenz, die im Wesentlichen zu dieser Sequenz komplementär ist, komplementär sind, können in den hierin beschriebenen Amplifizierungsreaktionen als Primer verwendet werden.
  • Beispiel 2 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um Sonden zu identifizieren, die zum Nachweis von HIV-2 Amplicons nützlich sind. In diesem Verfahren diente ein einzelnes synthetisches Oligonukleotid-Ziel, das zu einer Reihe von verschiedenen Sondensequenzen komplementär war, in einem Sonden-Bindungs-Assay als Ziel.
  • Beispiel 2
  • Oligonukleotid-Sonden zum Nachweis von HIV-2
  • Ein synthetisches Antisense HIV-2 Oligonukleotid, das die Sequenz GAAGGGUCCUAACAGACCAGGGUCUUGUUA (SEQ ID NO: 30) besaß, wurde unter Verwendung von 2'-Methoxy Nukleotiden gemäß Standardlaborverfahren hergestellt. Dieses Oligonukleotid diente als ein RNA-Zielmodell. Sechs verschiedene Oligonukleotide, die unter Verwendung von 2'-Methoxy Nukleotiden hergestellt wurden und als Sonden getestet wurden, besaßen die Sequenzen, die in Tabelle 3 angegeben sind.
  • Die Hybridisierungsreaktionen bestanden aus 100 μl Volumina Sonden-Schutzpuffer, der Mengen an AE-markierter Sonde, die 1 × 106 RLUs entsprachen, enthielt, und 100 μl enthielten 2 pmol des synthetischen HIV-2 RNA-Ziels. Die Pufferlösung schloss 75 mM Bernsteinsäure, 129 mM Lithiumlaurylsulfat, 75 mM Lithiumhydroxid, 15 mM Aldrithiol-2, 1,0 M Lithiumchlorid, 1 mM EDTA und 3% v/v Ethylalkohol ein und wurde auf einen pH-Wert von 4,2 eingestellt. Die Mischungen wurden für 15 Minuten bei 60°C hybridisiert und dann mit 250 μl der Selektionsreagenzlösung, die 600 mM Borsäure, 235 mM NaOH und 1% vol/vol TRITON X-100 (wobei die Lösung auf pH 9 eingestellt wurde) enthielt, für 10 Minuten selektiert und dann für 10 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt.
  • Negative Kontrollhybridisierungsreaktionen enthielten kein Antisense HIV-2 Ziel-Oligonukleotid. Die Chemolumineszenz, die die Menge des AE-Markers, der mit der hybridisierten Sonde verbunden war, widerspiegelte, wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens bestimmt. Die Ergebnisse dieses Verfahrens werden in Tabelle 9 präsentiert. Tabelle 9 Sonden-Hybridisierungsergebnisse
    Durchschnittliche Hybridisierung (% der Eingabe)
    Hybridisierungsreaktion SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26
    negative Kontrolle 0,07 0,22 0,10 0,09 0,06
    synthetisches HIV-2 RNA Amplicon 22 15 21 54 97
  • Wie durch die Ergebnisse, die in Tabelle 9 präsentiert werden, angezeigt wird, ergab jede der Sonden, die in dem Verfahren getestet wurden, niedrige Mengen an Hintergrundhybridisierung und mindestens moderate Grade an positiver Reaktion mit der HIV-2 Zielsequenz. Insbesondere waren die negativen Kontrollwerte alle niedriger als 0,25%, während die Reaktionen, die in Gegenwart der HIV-2 Zielsequenz durchgeführt wurden, alle größer als 15% der Eingabekonzentration der Sonde waren. Zusammengenommen mit den Ergebnissen von Beispiel 1, dass die Sonde, die die Sequenz von SEQ ID NO: 27 besitzt, nützlich für den Nachweis von HIV-2 Amplicons war, zeigen die Ergebnisse in Tabelle 9, dass alle der Sequenzen, die in Tabelle 3 präsentiert sind, nützlich als Nachweissonden sind.
  • Der Erfolg, der in dem obigen Verfahren erzielt wurde, definierte eine HIV-2 Sequenz-Domäne, die für die Entwicklung zusätzlicher Nachweissonden verwendet werden kann. Insbesondere erstreckt sich diese Domäne über den 22 Nukleotide langen Abschnitt, der die Sequenz CCTGGTCTGTTAGGACCCTTCT (SEQ ID NO: 20) besitzt. Oligonukleotide, die Sequenzen besitzen, die dieser Sequenz im Wesentlichen entsprechen, oder eine Untergruppe oder das Komplementär davon, können als Sonden zum Nachweis der HIV-2 Nukleinsäuren verwendet werden. Natürlich können nützliche Sonden länger als die Länge dieser Domäne sein und der HIV-2 komplementäre Teil von nützlichen Sonden kann in Sonden, wie z. B. Molecular Beacons, die bestimmte Sekundärstrukturen besitzen, eingebunden sein. Da die Sequenz von SEQ ID NO: 20 von einem Teil des HIV-2 Genoms abgeleitet ist, der dem Genom von HIV-1 fehlt, sind diese Sonden spezifisch für HIV-2 und nicht HIV-1.
  • In besonderem Maße ergaben die Sonden, die die Sequenzen SEQ ID NOs: 26 und 25 besaßen, ungewöhnlich gute Ergebnisse in diesem Verfahren. Die Oligonukleotid-Sequenzen dieser Sonden sind für die Verwendung in dem Nachweisschritt des oben beschriebenen Assays besonders bevorzugt. Natürlich kann die Positionierung von jedem nachweisbaren Marker variiert werden und dennoch in den Umfang der Erfindung fallen. Z. B. wird besonders bevorzugt, eine Sonde, die die Sequenz von SEQ ID NO: 26 besitzt, mit einem AE-Marker, der zwischen den Positionen 9 und 10 gebunden ist, für den Nachweis von HIV-2 Amplicons unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren zu verwenden.
  • Verfahren zum Bestimmen, ob Kandidaten-Oligonukleotide verwendet werden können, um HIV-2 Nukleinsäuren aus der Lösung einzufangen, wurden unter Verwendung der oben beschriebenen in vitro transkribierten HIV-2 RNA als Modellziel durchgeführt. Jedes der beiden verschiedenen Kandidaten-Fänger-Oligonukleotide schloss eine HIV-2 spezifische Sequenz, die mit einem Oligo-(dA)-Abschnitt verbunden war, ein. Wenn sie mit dem HIV-2 RNA-Ziel kombiniert und magnetische Partikel so modifiziert wurden, dass sie Oligo-(dT) präsentieren, verband ein funktionelles Fänger-Oligonukleotid das HIV-2 Ziel und das Partikel und immobilisierte das HIV-2 Ziel. Das Entfernen der Partikelkomplexe aus der Lösung stellte ein wirksames Mittel zum Anreichern des HIV-2 Templates dar. In dem Verfahren, das in dem folgenden Beispiel beschrieben wird, wurden zwei Fänger-Oligonukleotide getrennt voneinander mit der HIV-2 RNA und magnetischen Partikeln, die mit Oligo-(dT) modifiziert waren, in Kontakt gebracht. Nach dem Sammeln und dann Waschen der Partikel wurden gebundene HIV-2 Sequenzen in homogenen Schutzassays nachgewiesen. In jedem Fall immobilisierte das Fänger-Oligonukleotid die HIV-2 Ziel-RNA auf dem magnetischen Partikel.
  • Das folgende Beispiel beschreibt Verfahren, die verwendet wurden, um HIV-2 Fänger-Oligonukleotide zu identifizieren.
  • Beispiel 3
  • Nachweis von HIV-2 Zielsequenzen unter Verwendung von Fänger-Oligonukleotiden
  • 5 × 1011 Kopien einer in vitro transkribierten HIV-2 LTR Ziel-RNA (oben beschrieben) wurden in 400 μl Lyse/Einfangpuffer, der entweder 0, 1,5 pmol, 3,5 pmol oder 5 pmol Fänger-Oligonukleotide, die die Sequenzen der SEQ ID NOs: 31 und 32 besaßen, und ungefähr 100 μg immobilisiertes poly-(dT14), verbunden mit paramagnetischen Partikeln (0,7–1,05 μ-Partikel, Seradyn, Indianapolis, IN), enthielt, aufgelöst. Der Lyse/Einfangpuffer schloss 790 mM HEPES, 230 mM Bernsteinsäure, 10% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 680 mM Lithiumhydroxidmonohydrat ein. In dem Fänger-Oligonukleotid, das die Sequenz von SEQ ID NO: 31 besaß, waren die Positionen 1–20 mit 2'-Methoxy-Nukleotid-Analoga und die Positionen 21–53 mit Desoxyribonukleotiden besetzt. In dem Fänger-Oligonukleotid, das die Sequenz von SEQ ID NO: 32 besaß, waren die Positionen 1–18 mit 2'-Methoxy-Nukleotid-Analoga und die Positionen 19–51 mit Desoxyribonukleotiden besetzt. Zwischen der HIV-2 komplementären Sequenz und der poly(A)-Endregion war in jedem der Fänger-Oligonukleotide ein Abstandshalter, der durch die Sequenz 5'-TTT-3' dargestellt wird, eingeschoben. Das poly-(dT14) wurde unter Verwendung von Carbodiimid-Chemie an die paramagnetischen Partikel gebunden, wie von Lund et al., in Nuc. Acids Res. 16: 10861–10880 (1998) beschrieben. Die Mischungen wurden für ungefähr 15–30 Minuten auf 55–60°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt, um die Hybridisierung zuzulassen. Ein magnetisches Feld wurde angelegt, um die Partikelkomplexe, die die immobilisierten Fänger-Oligonukleotide und HIV-2 RNA enthielten, unter Verwendung von Verfahren, wie z. B. die, die von Wang in U.S. Patent Nr. 4,895,659 beschrieben werden, einzusammeln. Die Partikel wurden zweimal mit 1 ml eines Waschpuffers (10 mM HEPES, 6,5 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0,3% (v/v) Ethanol, 0,02% (w/v) Methyl-paraben, 0,01% (w/v) Propyl-paraben, 150 mM NaCl, 0,1% (w/v) Natriumlaurylsulfat) durch Resuspension und Wiederholen des magnetischen Trennungsschritts gewaschen. Die gewaschenen Partikel wurden in 100 μl Hybridisierungspuffer suspendiert und die Mischung der Sonden-Hybridisierung und dem Nachweisverfahren, das in dem vorangegangenen Beispiel beschrieben wurde, unterzogen, mit dem Unterschied, dass eine Sonde mit der Sequenz SEQ ID NO: 33 anstelle einer Sonde mit der Sequenz von SEQ ID NO: 27 verwendet wurde. Für jede Assay-Bedingung zeigte eine positive Fängerkontrolle den maximalen Chemolumineszenzwert an, der in dem Assay erzielt werden konnte. Tabelle 10 präsentiert die Chemolumineszenzmessungen für Wiederholungen der beiden Assays für jede Konzentration des Fänger-Oligonukleotids. Tabelle 10 Wirksamkeit der Ziel-Bindung
    Menge an Fänger-Oligonukleotid/Reaktion
    Fänger-Oligonukleotid Ergebnis 1,5 pmol 3,5 pmol 5 pmol
    SEQ ID NO: 31 Durchschnitts-RLU 214064 210545 1033935
    % Wirksamkeit 18,4 18,1 88,9
    %CV 5 6 13
    SEQ ID NO: 32 Durchschnitts-RLU 126948 174640 1.334771
    % Wirksamkeit 10,9 15,0 114,81
    %CV 16 13 4
  • Die Ergebnisse, die in Tabelle 10 präsentiert werden, bestätigen, dass beide Oligonukleotide, die in dem Verfahren getestet wurden, verwendet werden können, um die HIV-2 RNA aus der Lösung einzufangen.
  • Beispiel 4 beschreibt Verfahren, die durchgeführt werden können, um HIV-2 Nukleinsäuren in einer biologischen Probe nachzuweisen. Obwohl dieses Beispiel eine Kontrollprobe beschreibt, die eine bekannte Menge von HIV-2 Nukleinsäuren enthielt, ist selbstverständlich, dass eine Plasmaprobe, die aus einer menschlichen Spender-Blutprobe erhalten wurde, diese ersetzen kann.
  • Ein positives Hybridisierungsergebnis in letzterer würde das Vorhandensein von HIV-2 Nukleinsäuren in der Spenderprobe anzeigen.
  • Beispiel 4
  • Nachweis von HIV-2 Nukleinsäuren unter Verwendung von Nukleinsäure-Amplifizierung
  • Eine erste Probe von menschlichem Plasma, das eine bekannte Menge von HIV-2 enthielt (100 Kopien HIV-2 pro Reaktionsröhrchen) wurde mit einer gleichen Menge eines Lyse/Fänger-Puffers, wie in Beispiel 3 beschrieben, gemischt. Um die HIV-2 Ziel-RNA zu binden, erhielt die Mischung ebenfalls 3,5 pmol Fänger-Oligonukleotid, das die Sequenz von SEQ ID NO: 31 besaß, und ungefähr 100 μg immobilisierte poly-dT14 Sonde, die an paramagnetische Partikel (0,7–1,05 μ-Partikel, Seradyn, Indianapolis, IN) gebunden war. Die Mischung wurde für ungefähr 15 bis 30 Minuten auf 55–60°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt, um die Hybridisierung zuzulassen. Dann wurde ein magnetisches Feld angelegt, um die Partikelkomplexe einzusammeln. Die Partikel wurden zweimal mit 1 ml eines Waschpuffers gewaschen und dann in 75 μl einer Nukleinsäure-Amplifizierungs-Reagenzlösung für Transkriptions-assoziierte Amplifizierung unter Verwendung von Verfahren, wie im Wesentlichen von Kacian et al. in U.S. Patent Nr. 5,399,491 und Nr. 5,554,516 beschrieben, resuspendiert.
  • In Kürze, die gewaschenen Partikel wurden mit den gebundenen Komplexen mit jeweils 15 pmol Amplifizierungs-Oligonukleotiden, die die Sequenzen von SEQ ID NOs: 15 und 6 besaßen, in einer Reaktionsmischung (40 mM Tris-Base (pH 7, 5); 17,5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 Polyvinylpyrrolidon (PVP), jeweils 1 mM dNTP, jeweils 4 mM rNTP) gemischt, mit einer Schicht Inertöl bedeckt, um die Verdunstung zu verhindern, für 10 Minuten bei 60°C und dann für 10 Minuten bei 41,5–42°C inkubiert. Die Enzyme (ungefähr 3000 Einheiten MMLV reverse Transkriptase und ungefähr 3000 Einheiten T7 RNA Polymerase pro Reaktion) wurden zugegeben, gemischt und die HIV-2 Ziel-Nukleinsäure bei 41,5–42°C für 1 Stunde amplifiziert.
  • Die amplifizierten HIV-2 Zielsequenzen werden mit einer AE-markierten Sonde, die die Sequenz von SEQ ID NO: 26 besitzt, hybridisiert und dann über Chemolumineszenz nachgewiesen und die Ergebnisse als relative Lichteinheiten (RLU), im Wesentlichen wie zuvor beschrieben, ausgedrückt. Für jede Assay-Bedingung hatten die negativen Kontrollen als Ersatz für die HIV-2 enthaltenden Proben ein gleiches Volumen an Plasma, das keine HIV-2 Nukleinsäure enthielt. Die nachgewiesenen RLU-Ergebnisse dieser Assays wurden dann verglichen.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigen, dass HIV-2 Nukleinsäure-Sequenzen in einer biologischen Probe unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung einfach nachgewiesen werden können. Insbesondere ergeben negative Kontrollproben Sonden-Hybridisierungssignale, die nur den Hintergrundsignalen entsprechen. Im Gegensatz dazu ergeben Proben, die HIV-2 Nukleinsäuren enthalten, Hybridisierungssignale, die mehrfach größer sind als der Hintergrund. Das zeigt an, dass die Amplifizierungs- und Nachweisreaktionen funktionsfähig sind.
  • Diese Erfindung wurde unter Bezugnahme auf eine Reihe von spezifischen Beispielen und Ausführungsformen davon beschrieben. Natürlich bieten sich dem Durchschnittsfachmann bei der Betrachtung der vorangegangenen detaillierten Beschreibung eine Reihe von verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung an. Somit wird der wahre Umfang der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die angefügten Patentansprüche bestimmt.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00730001
  • Figure 00740001
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  • Figure 00770001
  • Figure 00780001

Claims (23)

  1. Kit für den Nachweis von HIV-2 Nukleinsäuren, umfassend: (a) ein erstes Amplifizierungsoligonukleotid, das SEQ ID NO: 10 und gegebenenfalls eine 5' Promotorsequenz, die zu der HIV-2 Nukleinsäure nicht komplementär ist, umfasst; und (b) ein zweites Amplifizierungsoligonukleotid, das eine Sequenz von 19–40 zusammenhängenden Basen der Sequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, wobei das zweite Amplifizierungsoligonukleotid eine Länge von bis zu 100 Nukleotiden hat.
  2. Der Kit nach Anspruch 1, ferner umfassend: (c) eine Oligonukleotidnachweissonde, die die Sequenz von SEQ ID NO: 21 oder das Komplementär davon und einen nachweisbaren Marker umfasst.
  3. Der Kit nach Anspruch 1, wobei die Länge des zweiten Amplifizierungsoligonukleotids 19–40 Nukleotide beträgt.
  4. Der Kit nach Anspruch 3, wobei die Länge des zweiten Amplifizierungsoligonukleotids 19–21 Nukleotide beträgt.
  5. Der Kit nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Länge des ersten Amplifizierungsoligonukleotid bis zu 60 Nukleotide beträgt.
  6. Der Kit nach Anspruch 5, wobei das erste Amplifizierungsoligonukleotid die optionale 5' Promotorsequenz einschließt.
  7. Der Kit nach Anspruch 6, wobei das erste Amplifizierungsoligonukleotid der Promotorprimer mit der Sequenz von SEQ ID NO: 15 ist.
  8. Der Kit nach Anspruch 1, wobei das erste Amplifizierungsoligonukleotid aus SEQ ID NO: 10 besteht und wobei die Länge des zweiten Amplifizierungsoligonukleotids 19–21 Nukleotide beträgt.
  9. Der Kit nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das zweite Amplifizierungsoligonukleotid aus der Gruppe, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 besteht, ausgewählt wird.
  10. Der Kit nach Anspruch 2, wobei die Oligonukleotidnachweissonde eine Länge von bis zu 35 Nukleotiden besitzt.
  11. Der Kit nach Anspruch 10, wobei die Länge der Oligonukleotidnachweissonde bis zu 22 Nukleotide beträgt.
  12. Der Kit nach Anspruch 11, wobei die Oligonukleotidnachweissonde eine Länge von bis zu 18 Nukleotiden besitzt.
  13. Der Kit nach Anspruch 12, wobei die Sequenz der Oligonukleotidnachweissonde aus der Gruppe, die aus SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 und SEQ ID NO: 27 besteht, ausgewählt wird.
  14. Der Kit nach Anspruch 13, wobei die Sequenz des ersten Amplifizierungsoligonukleotids SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 15 ist und wobei die Sequenz des zweiten Amplifizierungsoligonukleotids aus der Gruppe, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 besteht, ausgewählt wird.
  15. Der Kit nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Oligonukleotidnachweissonde mindestens 16 zusammenhängende Nukleotide, die in der Sequenz von SEQ ID NO: 20 oder dem Komplementär davon enthalten sind, umfasst.
  16. Der Kit nach Anspruch 11, wobei die Oligonukleotidnachweissonde die Sequenz von SEQ ID NO: 20 oder dem Komplementär davon besitzt.
  17. Der Kit nach Anspruch 15, wobei die Länge der Oligonukleotidnachweissonde 18 Nukleotide beträgt.
  18. Der Kit nach Anspruch 15, wobei die Oligonukleotidnachweissonde eine Sequenz besitzt, die aus der Gruppe, die aus SEQ ID NO: 22 oder dem Komplementär davon, SEQ ID NO: 23 oder dem Komplementär davon, SEQ ID NO: 24 oder dem Komplementär davon, SEQ ID NO: 25 oder dem Komplementär davon, SEQ ID NO: 26 oder dem Komplementär davon und SEQ ID NO: 27 oder dem Komplementär davon besteht, ausgewählt wird.
  19. Der Kit nach Anspruch 10, wobei die Oligonukleotidnachweissonde DNA umfasst.
  20. Der Kit nach Anspruch 10, wobei die Oligonukleotidnachweissonde mindestens ein Nukleotidanalog umfasst.
  21. Der Kit nach Anspruch 20, wobei das mindestens eine Nukleotidanalog eine Methoxygruppe an der 2' Position eines Riboserests umfasst.
  22. Der Kit nach Anspruch 18, wobei der nachweisbare Marker ein chemolumineszenter Marker oder ein radioaktiver Marker ist.
  23. Der Kit nach Anspruch 22, wobei der nachweisbare Marker ein Acridiniumester ist.
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