KR20070012779A - 반복적 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 조성물, 방법 및검출 기법 - Google Patents

반복적 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 조성물, 방법 및검출 기법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 상의 반복적 효소에 의한 올리고뉴클레오티드 합성 행위를 통해 다중 검출가능한 올리고뉴클레오티드를 발생시키고, 상기 산물을 검출함으로써, 관심 분자의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 다중 불완전 전사의 방법을 제공한다. 다른 한 측면에서, 본 발명은 불완전 프로모터 카세트를 포함하는 덴드리머의 용도를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 사용하기 위해 적당한 불완전 프로모터 카세트를 제공한다. 한 측면에서 불완전 전사의 산물은 질량분석법을 이용하여 검출된다. 다른 한 측면에서, 본 발명은 검출되는 불완전 전사에 의해 다중 검출가능한 RNA 올리고리보뉴클레오티드를 발생시킴으로써, 질량분석법 등에 의해 표적 단백질, DNA 또는 RNA를 검출하는 방법을 제공한다.
불완전 전사, 불완전 프로모터 카세트

Description

반복적 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 조성물, 방법 및 검출 기법 {COMPOSITIONS, METHODS AND DETECTION TECHNOLOGIES FOR REITERATIVE OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS}
본 발명은 일반적으로 불완전(abortive) 전사 개시를 통해 핵산 주형 상의 반복적 합성을 통해 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체를 발생시킴에 의한 관심 분자의 검출에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체는 표적 분자의 존재 및/또는 특별한 특성을 지시하는, 질량분석법을 포함한 방법들을 통해 검출된다. 본 발명의 방법은 병원체, 독소, 단백질, 핵산, 변이체, 암 상태, 또는 기타 분자, 질병 또는 상태를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
핵산 증폭 산물의 검출을 위한 각종 방법들의 발달은, 근년 핵산 서열의 검출, 동정 및 정량화의 진보를 가져왔다. 핵산 검출은 잠재적으로 정성적 및 정량적 분석 모두를 위해 유용하다. 예를 들어, 핵산 검출은 병원체를 검출하고 동정하며; 한정된 표현형에 연결된 유전적 및 비유전적 변화를 검출하고; 유전적 질병, 또는 특별한 질병에 대한 유전적 감수성을 진단하며; 발달 중에 있는 질병, 질병 및/또는 약물을 포함한 한정된 자극에 반응한 유전자 발현을 평가하고; 또한 연구 과학자들에게 세포 활성을 보강하는 분자 및 생화학 메커니즘을 연구하기 위한 부가적 수단을 제공함으로써 당업 기술의 진보를 일반적으로 도모하기 위해 사용될 수 있다.
매우 다양한 핵산 검출 기법들이 개발되었으며, 그것들 중 몇 가지는 시험 샘플 내의 낮은 수준의 표적 핵산의 존재를 검출하기 위한 적당한 수단으로서 진전되었다. 그러한 방법의 한 부류는 표적 서열의 다중 복사체들을 발생시키고, 이 복사체들을 예를 들어, 겔 전기영동과 같은 추가 분석에 적용하는 표적 증폭으로 칭해진다. 다른 방법들은 예를 들어, 혼성화된 프로브를 절단하여 다중 산물을 형성시키거나, 인접한 프로브를 라이게이션하여 독특한 혼성화-의존성 산물을 형성시킴으로써, 혼성화된 프로브 또는 프로브들로부터 다중 산물을 형성시킨다. 또 다른 방법은 표적 서열 결합 도메인 및 표지 보고 서열 결합 도메인을 가지는 분지형의 DNA 프로브의 혼성화에 기초하는 방법과 같이, 혼성화 행위에 의해 발생된 신호를 증폭시킨다.
병원체, 예컨대 세균류, 바이러스류 및 진균류의 빠르고도 정확한 검출, 예를 들어 또한 정상 및 비정상 유전자의 검출을 위한 요구를 충족하기 위해 개발된, 등온 표적 핵산 증폭을 포함한, 당업계에 공지된 많은 표적 핵산 증폭 방법들이 있다. 이 기법들 모두는 샘플 내의 미량의 표적 핵산을 검출하고 동정하기 위한 강력한 툴을 제공하나, 그것들 모두는 각종 문제들을 가지고 있다.
따라서, 낮은 수준의 표적 분자를 검출할 수 있는, 빠르고도 민감하며 표준화된 핵산 신호 검출 방법이 필요하다.
이 필요, 및 기타 필요는 본원의 발명에 의해 충족된다. 불완전 전사 방법 은, 각기 본원에 참고로 전체적으로 인용되는, 국제특허출원 PCT/US02/34419(2002년 10월 29일 출원, 2003년 5월 8일 WO 03/038042로 공개); U.S. 특허출원 연계 No. 09/984,664(2001년 10월 30일 출원, 2003년 5월 29일 U.S. 특허출원 공개 No. US-2003-0099950으로 공개); 및 계류 중인 U.S. 특허출원 No. 10/425,037(2003년 4월 29일 출원, 2004년 5월 18일 U.S. 특허출원 공개 No. US-2004-0054162-A1로 공개)에 기재되어 있다.
불완전 전사는 다른 방법들에 비해 수가지의 이점들을 제공한다. 방법은 매우 적은 단계를 포함하고 있어 비교적 단순하고; 등온으로, 또한 저렴한 시약을 이용하여 수행될 수 있으며; 빠르고; 매우 감도가 크고; 상이한 조건에 쉽게 적합화된다. 증폭되는 핵산은 사실상의 대상 표적 분자일 필요는 없다. 오히려, 증폭된 핵산은 예를 들어, 불완전 전사를 통해 핵산 증폭을 궁극적으로 포함하는 단계들을 이용하여 검출되는, 단백질, 핵산 또는 기타 대상 표적 분자의 존재를 나타낼 수 있다.
본 발명은 다중 올리고뉴클레오티드 전사체를 발생시킴으로써 핵산 주형 상의 반복적 합성 행위를 통해 표적 분자(예컨대, 핵산 서열 또는 단백질)의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 다중 올리고뉴클레오티드 전사체는 FRET, 동위원소 이용 방법, 비색 이용법, 효소법 및 질량 분석법을 포함한 다양한 수단들을 통해 검출될 수 있다. "표지"되지 않은 분자를 검출할 수 있는 질량분석법은 빠르고, 감도있고, 정확하다.
일반적으로, 질량분석법은 분자를 진공 이온화하여, 그것을 휘발에 의해 "비 행"하도록 함으로써, 개별 분자를 "칭량"하는 수단을 제공한다. 전기장 및 자기장의 조합의 영향 하에, 이온은 그것의 개별 질량(m) 및 전하(z)에 따라서, 궤도곡선(trajectory)를 따르게 된다. 질량분석법은 모 분자 이온의 질량의 결정에 의해 유기 분자를 분석하고 단리하기 위해 사용된다. 부가적으로, 이 모 분자 이온의 다른 입자들(예컨대, 아르곤 원자)과 충돌하도록 함으로써, 분자 이온은 소위 충돌 유도 해체(CID)에 의해 단편화되어 2차 이온을 형성한다. 단편화 패턴/경로는 종종 상세한 구조적 정보의 이탈을 허용한다. 질량분석 방법은 [Methods of Enzymology, 제193권: "Mass Spectrometry"(J. A. McCloskey 편저), 1990, Academic Press, New York]에 요약되어 있음을 알 수 있다.
높은 검출 감도, 질량 측정의 정확도, MS/MS 구성형태 및 속도와 함께 CID에 의한 상세한 구조적 정보, 및 컴퓨터로의 온라인 데이터 전송의, 질량분석법의 분석적 이점들로 인해, 핵산의 구조적 분석을 위한 질량분석법의 사용에 상당한 관심이 있어 왔다. 최근 이 분야를 요약하는 평론에는 [K. H. Schram, "Mass Spectrometry of Nucleic Acid Components, Biomedical Applications of Mass Spectrometry" 34, 203-287(1990); 및 P. F. Crain, "Mass Spectrometric Techniques in Nucleic Acid Research", Mass Spectrometry Reviews 9, 505-554(1990), 및 U.S. 특허 No 6,602,662]가 포함된다.
질량분석 검출은 일반적으로, 모 분자 이온의 질량을 결정하고, 이를 통해 이미 알려진 올리고뉴클레오티드 서열을 확인하거나, 대안적으로는 특히 이온화 및 휘발을 위해 고속 원자 충격(FAB 질량분석법) 또는 플라즈마 탈착(PD 질량분석법) 을 이용하는 MS/MS 구성형태에서 CID를 통해 2차 이온(단편 이온)을 발생시킴으로써 공지된 서열을 확인함으로써, 저분자량 합성 올리고뉴클레오티드에 제한되어 왔었다. 한 예로서, 올리고데옥시뉴클레오티드의 화학적 합성을 위한 보호된 이량체성 블록의 분석에 FAB를 적용하는 것이 기재되었다(Wolter 등, Biomedical Environmental Mass Spectrometry 14, 111-116(1987)).
추가 2가지의 최근 이온화/탈착 기법은 전자분무/이온분무(ES) 및 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화(MALDI)이다.
전자분무 이온화 및 매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화 질량분석법은 샘플을 분석하여, 주로 분자량 정보를 산출하도록 하는 "유연성" 이온화 기법이다.
전자분무 이온화도 마찬가지로, 대부분의 유기 소분자, 및 단백질 및 기타 높은 분자 질량의 바이오분자의 질량 측정에 적당하다. 일반적으로, 양이온화 전자분무는 펩티드, 단백질, 당단백질, 및 아민 및 양전하를 고정할 수 있는 기타 관능기를 포함하는 소분자의 분석을 위해 사용된다. 음이온화 전자분무는 올리고뉴클레오티드, 당류, 및 산성 관능기 및 음전하를 고정할 수 있는 기타 기를 포함하는 유기 소분자의 분석을 위해 사용된다.
전자분무 이온화에서는, 샘플을 용액 내에서 질량분석기에 도입하고, 이에 기법을 HPLC 또는 CZE와 직접적으로 결부시켜, 모든 성분들에 대한 분자량 정보를 제공하는 온라인 크로마토그래피 데이터를 발생시키고, 이에 따라 오프라인 분리, 및 그에 이어지는 개별 분획의 단리 및 분석이 필요없게 된다. ES/EIS 질량분석법의 추가 논의에 대해, 예컨대 [Yamashita 등의 (J. Phys. Chem. 88, 4451- 59(1984); PCT 특허출원 No. WO 90/14148)]를 참고한다. 본 출원들은 최근 평론문들, 예컨대 [R. D. Smith 등, Anal. Chem. 62, 882-89(1990) 및 B. Ardrey, Electrospray Mass Spectrometry, Spectroscopy Europe 4, 10-18(1992)]에 요약되어 있다. 테트라데카뉴클레오티드의 분자량[Covey 등, "The Crystal of Protein, Oligonucleotide and Peptide Molecular weights by lonspray Mass Spectrometry, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2, 249-256(1988)), 및 21량체(Methods in Enzymology, 193, "Mass Spectrometry"(McCloskey, 편저), p. 425, 1990, Academic Press, New York]이 결정되었다. 질량분석기로서, 사중극(quadrupole)이 가장 빈번하게 사용된다. 샘플의 펨토몰(femtomole) 양의 분자량 결정은, 질량 계산을 위해 모두 사용될 수 있는 다중 이온 피크들의 존재로 인해 매우 정확하다.
대조적으로, MALDI 질량분석법은 비행시간(TOF) 구성형태가 질량 분석기로 사용될 때 특히 선호적일 수있다. MALDI-TOF 질량분석법은 Hillenkamp 등에 의해 도입되었다("Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules", Biological Mass Spectrometry(Burlingame 및 McCloskey 편저), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 49-60, 1990). 대부분의 경우들에서는 이 기법으로 다중 분자 이온 피크들이 발생되지 않기 때문에, 질량 스펙트럼이 원칙적으로 ES 질량분석법에 비해 더 간단해 보인다.
상이한 크기의 DNA를 분석하기 위해 각종 질량분석 기법들이 사용되었 다(Nelson 등, "Volatilization of High Molecular Weight DNA by Pulsed Laser Ablation of Frozen Aqueous Solutions, Science, 246, 1585-87(1989); Huth-Fehre 등, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 6, 209-13(1992); K. Tang 등, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 8, 727-730(1994); Williams 등, "Time-of Flight Mass Spectrometry of Nucleic Acids by Laser Ablation and Ionization from a Frozen Aqueous Matrix", Rapid Communications in Mass Spectrometry, 4, 348-351(1990)). 일본 특허 No. 59-131909는 전기영동, 액체 크로마토그래피 또는 고속 겔 여과에 의해 분리된 핵산 단편을 검출하는 기구를 기재하고 있다. S, Br, I 또는 Ag, Au, Pt, Os, Hg와 같은, DNA 내에서는 정상적으로 발생하지 않는 원자를 핵산에 혼입함으로써, 질량분석 검출이 달성된다.
본 출원에 인용되거나 명시된 모든 문헌들 또는 공보들은, 각 개별 문헌이 구체적으로 또한 개별적으로 참고로 전체적으로 인용되는 것과 동일한 정도로, 참고로 전체적으로 인용된다.
발명의 개요
본 발명은 표적 분자의 검출을 위해, 폴리뉴클레오티드 주형 상의 반복적 올리고뉴클레오티드 합성 반응을 통해 다중 검출가능한 신호를 발생시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하며, 상기 신호는 질량분석법의 사용을 통해 검출되는 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체이다. 본 발명은 또한 반복적 합성 및 검출 방법을 위한 용도를 제공한다. 본 발명의 방법 및 키트의 용도는 변이체 및 단일 뉴클레오티드 다형체, RNA 분자, 병원체의 검출, 및 전암성 또는 암성 변이체 또는 상태의 검출 을 포함하나, 이들에 제한되지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드로부터 다중 반복 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공한다. 다중 반복 올리고뉴클레오티드 전사체가 생성되도록 하는 주형은 표적 분자이거나 그렇지 않을 수 있다. 방법은 (a) 단일 가닥의 표적 폴리뉴클레오티드를, 개시자, 폴리머라아제, 임의적으로 부가적 리보뉴클레오티드 및 임의적으로 표적 부위 프로브 및 임의적으로 사슬 종결 뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하고; (b) 상기 표적 폴리뉴클레오티드로부터 다중 올리고뉴클레오티드를 합성하며(여기에서, 상기 개시자는, 상기 종결자가 상기 올리고뉴클레오티드에 혼입됨으로써, 다중 반복적 올리고뉴클레오티드를 합성할 때까지 확장됨); 및 (c) 질량분석법으로 관심 폴리뉴클레오티드의 상기 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체를 검출 또는 정량화하는 것(여기에서, 합성되는 상기 올리고뉴클레오티드는 약 2 내지 약 26 뉴클레오티드, 약 26 내지 약 50 뉴클레오티드 및 약 50 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 및 100 초과의 뉴클레오티드로 이루어지는 길이들의 군으로부터 선택되는 길이를 가짐)을 포함한다.
상기 방법의 다른 변형법들이, 각기 본원에 참고로 전체적으로 인용되는, 국제특허출원 WO 03/038042(2003년 5월 8일 공개) 및 U.S. 특허출원 공개 No. US-2003-0099950(2003년 5월 29일 공개)에 기재되었다. 그러한 변형법들에는 비메틸화 사이토신 잔기를 우라실 잔기로 전환시키나, 메틸화 사이토신 잔기를 우라실로 전환시키지 않는 조건 하에서 단일-가닥의 표적 DNA 서열을 탈아민화하는 것과 같은 부가적 단계의 사용; 포착 프로브 또는 고정화 서열의 사용; 단일 뉴클레오티드 다 형체 및 메틸화 변화를 검출하기 위한 표적 부위 프로브, 개시자 등의 변형; 불완전 프로모터 카세트의 사용; 다중 표적 부위 프로브, 개시자 등의 사용; 상이한 반응 조건, 폴리머라아제, 뉴클레오티드, 표지 등의 사용; 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오시드; 및 본 발명의 키트가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
한 구현예에서, 본 발명은 (a) 핵산 주형 상의 불완전 반복적 합성을 통해 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체를 합성하고; (b) 질량분석법에 의해 상기 표적 분자의 존재를 결정함로써, 상기 표적 분자의 존재를 검출하는 것을 포함하는 표적 분자의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 다른 한 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체의 분자 질량 및/또는 존재비(abundance)도 또한 결정된다.
한 구현예에서, 표적 분자는 핵산 주형을 포함한다. 다른 한 구현예에서는, 표적 분자가 상기 핵산 주형과 구분된다. 또한 불완전 프로모터 카세트로부터도 불완전 전사가 일어날 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 불완전 프로모터 카세트를 포함한다. 특정 불완전 프로모터 카세트의 종류 및 특정 구현예의 설명도 또한 제공되어 있다. 관련 구현예들에서, 본 발명은 불완전 전사 및 관련 방법을 위해 상기 불완전 카세트를 사용하는 방법을 포함한다.
그러한 불완전 프로모터 카세트는 일부 구현예들에서 DNA 서열; RNA 서열; PNA(단백질 핵산) 서열; 항체; 결합 단백질; 신호전달 분자; 합텐; 바이오틴; 결합 뉴클레오시드; 결합 뉴클레오티드; 효소 기질; 효소 기질 유도체; 및 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 표적 분자에 대한 특이성을 갖는 제2 분자에 연결 될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 주형 폴리뉴클레오티드를 개시자 및 폴리머라아제와 함께 인큐베이션하고; 상기 주형 폴리뉴클레오티드로부터 다중 올리고뉴클레오티드를 합성하며(여기에서, 상기 개시자는 전사체가 종결되어 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체가 합성되도록 할 때까지 확장됨); 질량분석법에 의해 상기 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체의 분자 질량 및/또는 존재비를 결정함으로써, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 표적 분자의 존재를 검출하는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예들에서, 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체는 변형된 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 다른 구현예들에서, 방법은 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 개시자, 폴리머라아제, 종결자 및 표적 부위 프로브와 함께 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다. 그러한 표적 부위 프로브는 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드; 약 51 내지 약 75 뉴클레오티드; 약 75 내지 약 100 뉴클레오티드; 및 100 초과의 뉴클레오티드로 이루어지는(단, 수치 포함) 군으로부터 선택되는 크기를 가질 수 있다.
일부 구현예들에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA이고, 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체는 RNA를 포함한다.
표적 분자의 성질도 또한 다양할 수 있다. 일부 구현예들에서, 방법은 단백질; 핵산; RNA; DNA; 탄수화물; 지질; 항원; 합텐; 및 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표적 분자를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 병원체를 검출하는 방법을 제공한다. 다른 구현예들에서, 방법은 HIV-1; HIV-2; HIV-LP; 소아마비 바이러스; A형 간염 바이러스; 엔테로 바이러스; 인간 콕사키 바이러스류, 라이노바이러스; 에코바이러스; 칼시비리다에(Calciviridae); 토가비리다에(Togaviridae); 말열 뇌염 바이러스; 풍진 바이러스; 플라비리다에(Flaviridae); 뎅그 바이러스; 뇌염 바이러스, 황열 바이러스; 코로나비리다에(Coronaviridae); SARS; 라브도비리다에(Rhabdoviridae); 수포성 구내염 바이러스; 광견병 바이러스; 필로비리다에(Filoviridae); 에볼라 바이러스; 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae); 파라인플루엔자 바이러스, 멈프스 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스; 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae); 인플루엔자 바이러스; 부니아비리다에(Bunyaviridae); 한탄 바이러스; 번야 바이러스, 플레보 바이러스; 나이로 바이러스; 아레나비리다에(Arenaviridae); 레오비리다에(Reoviridae); 레오바이러스; 오르비바이러스; 로타바이러스; 비르나비리다에(Birnaviridae); 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae); B형 간염 바이러스; 파르보비리다에(Parvoviridae); 파포바비리다에(Papovaviridae); 파필로마 바이러스; 폴리오마 바이러스; 아데노비리다에(Adenoviridae); 헤르페스비리다에(Herpesviridae); HSV 1; HSV 2; 수두대상포진 바이러스; 사이토메갈로바이러스(CMV); 폭스비리다에(Poxviridae); 천연두 바이러스; 우두 바이러스; 이리도비리다에(Iridoviridae); 아프리카 돼지 열 바이러스; 간염 C; 노르워크 바이러스 헬리고박터 파이롤리(Helicobacter pylori), 보렐리아 부르도르페리(Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis), M. 아비움(M. avium), M. 인트라셀룰라레(M. intracellulare), M. 칸사이(M. kansaii), M. 고르도나에(M. gordonae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitides), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(A군 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae)(B 군 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 비리단스(Streptococcus viridans) 군, 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 혐기성 스트렙토코쿠스 종, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 병원체성 캄필로박터(Campylobacter) 종, 엔테로코코스(Enterococcus) 종, 헤모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코르니네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 코르니네박테리움 종, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 페르프리겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 멀토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스(Bacteroides) 종, 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리듐(Treponema palladium), 트레포네마 페르테누에(Treponema pertenue), 레프토 스피라(Leptospira), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelli); 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라즈마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 코시디오데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans); 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum); 및 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체로부터 분자를 검출하는 방법을 포함한다. 그러한 분자는 예를 들어, DNA, RNA, 단백질, 독소, 탄수화물, 지질, 항원 또는 합텐일 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 핵산 주형 상의 불완전 반복적 합성을 통해 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체를 합성하고; (b) 질량분석법에 의해 상기 표적 분자의 존재를 결정함으로써, 상기 표적 분자의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 암, DNA 메틸화, 변이, 질병을 검출하는 방법을 포함한다. 다른 한 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체의 분자 질량 및 존재비가 또한 결정된다.
본 발명은 또한 RNA 발현을 검출하고 정량화하는 방법을 포함한다.
고속 원자 충격(FAB) 질량분석법, 플라즈마 탈착(PD) 질량분석법, 전자분무/이온분무(ES) 질량분석법, 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량분석법, 및 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화 비행 시간 분석(MALDI-TOF)을 (비제한적으로) 포함한 다양한 질량분석법 방법들이 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 조성물을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 불완전 프로모터 카세트가 연결되는 덴드리머를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 덴드리머에 연결된 다중 불완전 프로모터 카세트는 동일하다. 다른 한 구현예에서는, 상기 덴드리머에 연결된 다중 불완전 프로모터 카세트는 동일하지 않다.
다른 구현예들에서, 본 발명은 대상 표적 분자에 대해 특이성을 갖는 제2 분자에 추가로 연결된 불완전 프로모터 카세트들 중 하나 이상이 연결되어 있는 덴드리머를 포함한다. 그러한 제2 분자는 DNA 서열; RNA 서열; PNA 서열; 항체; 결합 단백질; 신호전달 분자; 합텐; 바이오틴; 결합 뉴클레오시드; 결합 뉴클레오티드; 효소 기질; 효소 기질 유도체; 및 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 불완전 프로모터 카세트들 중 하나 이상이 연결되어 있는 덴드리머를 포함하는 키트를 포함한다. 다른 한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 조성물 또는 장치이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 핵산 주형 상의 불완전 반복적 합성을 통해 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체를 합성하고; 불완전 반복 합성 전사체의 상기 다중 복사체를 신호 증폭 캐스케이드에 도입하며; 상기 신호 캐스케이드로부터 신호의 존재를 결정함으로써, 상기 표적 분자의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 표적 분자의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 신호 캐스케이드는 PCR; 불완전 전사; FRET; 양고추냉이 퍼옥시다제; 알칼리성 포스파타제; 및 기타 효소에 의한 합성된 전사체에 의해 촉발되는 신호의 기타 효소에 의한 증폭을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 한 구현예에서, 본 발명은 핵산 주형 상의 불완전 반복적 합성을 통해 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체를 합성하고; 핵산 주형 상의 불완전 반복적 합성을 통한 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체의 하나 이상의 상이한 합성을 동시에 수행하며; 상기 하나 이상의 표적 분자의 존재를 결정하는 것을 포함하는, 하나 이상의 표적 분자의 존재를 검출하는 방법을 포함한다.
도 1: 불완전 프로모터 카세트. 불완전 프로모터 카세트(APC)는, 폴리머라아제 결합 부위를 형성하고 APC 링커라고 불리는 특정 핵산 서열과의 상호 작용을 통해 다른 거대 분자에 부착될 수 있는 핵산의 영역이다. APC 링커는 표적 핵산의 주형 또는 비주형 가닥 상의 상보적 서열에 대한 혼성화에 의해 표적 핵산(DNA 또는 RNA)에 부착될 수 있다. APC 링커는 또한 상기 단백질에 결합하는 분자의 검출을 위해, 단백질과 같은 임의의 표적 분자 상에 위치한 상보적 서열에 혼성화할 수 있다. 다중 검출가능한 올리고뉴클레오티드는 불완전 프로모터 카세트에 결합된 폴리머라아제에 의해 발생된다. 이 도면에서, 표시된 APC는 "버블 영역"에 의해 분리되는 본질적 상보성(A, A' 및 C, C')의 두 영역을 포함한다. 이 개략도에서, 두 가닥의 영역이 비상보적이기 때문에(B 및 E), "버블 영역"이 발생된다. 대안적으로, APC는 2개의 완전히 상보적인 가닥을 가질 수 있다. RNA 폴리머라아제의 결합 시에, DNA 가닥이 분리되고, 이는 "버블 영역"의 형성을 초래한다.
영역 A, B 및 C은 하나의 가닥 상에 있다. 영역 C', E 및 A'는 상보적 가닥 상에 있다. APC는 2개의 분리된 가닥(ABC 및 C'EA')로부터 될 수 있거나, 모든 6개 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 상에 있을 수 있고, 여기에서 영역 C 및 C'는 필요한 경우에 한 해 변형될 수 있는 링커 영역 D에 의해 분리된다. 링커 영역 D는 단지 C 및 C'를 결합시키는 작용을 할 수 있거나, 영역 D의 서열은 EcoRI QIII 변이체, lac 리프레서 및 기타 RNA 폴리머라아제를 비제한적으로 포함하는, 전사 봉쇄 단백질과 같은, 불완전 전사를 증진시킬 수 있는 기타 요소를 위한 결합 부위로 작용할 수 있다. 링커 영역 D는 단일 봉쇄 단백질, 또는 다중 봉쇄 단백질을 위해 설계될 수 있다. 링커 영역 D의 길이는 링커 영역의 기능에 의존할 것이다.
도 2: 반복적 올리고뉴클레오티드 합성에 의한 신호 발생. 뉴클레오티드의 효소에 의한 혼입에 의해 신호가 발생되어, 다중 올리고뉴클레오티드 전사체를 형성한다. 적절한 조건 하에서, 프로모터의 부재 하에 RNA 올리고뉴클레오티드가 핵산 주형으로부터 제조될 수 있다. 개시자는 하나 이상의 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 유사체, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 개시자는 1-25 뉴클레오티드, 26-50 뉴클레오티드, 51-75 뉴클레오티드, 76-100 뉴클레오티드, 101-125 뉴클레오티드, 및 126-150 뉴클레오티드, 151-175 뉴클레오티드, 176-200 뉴클레오티드, 201-225 뉴클레오티드, 226-250 뉴클레오티드 및 250 초과의 뉴클레오티드를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 공유 결합된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, R 관능성 기를 포함할 수 있다. 개시자(n 복사체)는 종결자의 n 복사체로 직접적으로 신장되어 사슬 신장을 마칠 수 있고, (Y 위치의) 다른 신장자 뉴클레오티드의 n 복사체가 개시자와 종결자 사이에 혼입되어, 보다 긴 올리고뉴클 레오티드를 형성시킬 수 있다. 종결자는 제2 관능기를 포함할 수 있다. NI = 개시 모노뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체, NE = 신장 모노뉴클레오티드 또는 유사체, NT = 종결 모노뉴클레오티드 또는 유사체, Z = x + y; R1 = H, OH 또는 리포터기; R2 = H, OH 또는 리포터기; N = 데옥시 또는 리보뉴클레오티드; 폴리머라아제 = RNA-의존성 또는 DNA-의존성 RNA 폴리머라아제. DNA 또는 RNA는 단백질과 같은 다른 분자에 부착될 수 있다.
이어서, 질량분석법을 이용하여 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체가 검출된다. 질량분석법은 어떠한 "표지" 부분도 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드 전사체에 대해 수행될 수 있다. 그러나, 개시자, 혼입된 뉴클레오티드 또는 종결자 분자들 중 임의의 하나에서의 뉴클레오티드 유사체의 사용은 수득되는 종의 분자량을 변화시킬 것이고, 동일한 뉴클레오티드 길이의 다중 올리고뉴클레오티드를 차별화하기 위해 질량분석법에 사용될 수 있다.
도 3: 단일-가닥의 DNA 또는 RNA 상의 불완전 개시를 통한 디뉴클레오티드 합성. 단일 가닥의(ss) 핵산은 DNA 또는 RNA이다. 폴리머라아제는 DNA-의존성 또는 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제이다. NI = 3'-OH 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 개시자; NT = 5'-삼인산염 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 종결자. R1은 5' 인산염기, 당의 2' 위치, 또는 퓨린 또는 피리미딘 염기 상에 있을 수 있다. R2는 피리미딘 또는 퓨린 염기, 또는 당/리보스 또는 데옥시리보스의 2' 또는 3' 위치 상에 있을 수 있다. R1 = H, OH, 및/또는 본원에 기재된, 임의의 리포터기 또는 리포터기 전구체. R2 = H, OH, 및/또는 본원에 기재된, 임의의 리포터기 또는 리포터기 전구체.
도 4: 표적 부위 프로브. RNA 폴리머라아제는 유전자-특이적 또는 영역-특이적 표적 부위 프로브(TSP)의 혼성화에 의해 표적 핵산 내의 특정 뉴클레오티드 위치(부위)에 지정될 수 있다. 표적 부위는 (단일 뉴클레오티드 다형체의 검출에서와 같은) 서열 또는 (특정 뉴클레오티드의 메틸화 현황의 평가에서와 같은) 구조에 대해 분석될 DNA 내의 뉴클레오티드 위치이고, 그것은 표적 서열 내의 영역 E 및 C'의 접합부에서의 표적 서열의 주형 가닥 상에 있다. TSP는 대략 8-14 뉴클레오티드에서 시작하고, 표적 부위 뉴클레오티드의 상류에 있는 대략 15-35 뉴클레오티드에서 끝나는 표적 핵산(영역 A)에 대한 상동성의 영역을 포함한다. TSP의 제2 영역은 표적 부위(영역 B)의 바로 상류에 있는 8-14 뉴클레오티드에 대해 상보적으로 되도록 설계되고, 이에 따라 TSP가 표적 핵산에 혼성화될 때, 용융된 "버블" 영역이 형성된다. TSP는 표적 부위 뉴클레오티드의 바로 하류에 있는 5-25 뉴클레오티드에 대해 본질적으로 상보적인 제3 영역(영역 C)을 포함한다. RNA 폴리머라아제는 버블 착체에 결합할 것이며, 이에 따라 전사가 E/C' 접합부에서 시작하여, C/C' 혼성체로 하류 이동할 것이다.
도 5: DNA 내의 비메틸화 사이토신기의 탈아민화 전환. 탈아민화는 비메틸화 C를 U로 전환시킨다. 메틸화 C기, 예컨대 진핵세포 유전자를 제어하는 CpG 섬 내에 있는 그 기는 탈아민화에 대해 내성이 있고, 산물 DNA 내에 C로 남는다. 100% 탈아민화가 일어날 경우, 메틸화 DNA가 CpG 이중선을 여전히 포함할 것이고, 반면 비메틸화 DNA는 사이토신을 포함하지 않고, CpG 이중선이 탈아민화 전에 있을 때 이제 UpG를 포함할 것이다. DNA 서열에 있어 이 차이는, 2개의 DNA가 상이한 디뉴클레오티드(서열번호 4 및 5)를 코딩하기 때문에, 불완전 전사에 의해 메틸화 DNA와 비메틸화 DNA를 구분하는데 사용될 수 있다.
디뉴클레오티드 합성은 DNA의 전체 메틸화 상태를 평가하기 위해 사용될 수 있다. RNA 폴리머라아제, CTP 또는 CTP 유사체(R1-C-OH), 및 GTP 또는 GTP 유사체(R1-CpG-R2)의 존재 하에, 탈아민화된 메틸화 DNA 주형은 표지 디뉴클레오티드 산물의 n개 복사체를 발생시킬 것이며, 여기에서 n은 출발 DNA 내의 메틸화 CpG 디뉴클레오티드의 수에 비례한다. 탈아민화된 비메틸화 DNA 주형은, 그 주형이 임의의 위치에서 "C"를 더 이상 코딩하지 않기 때문에, 디뉴클레오티드를 생산할 수 없다.
C(ApC, CpC, GpC, UpC)에서 끝나는 표지 디뉴클레오티드로의 전사 개시, 및 GTP로의 종결에 의한 트리뉴클레오티드의 불완전 합성을 사용하여, 탈아민화된 비메틸화 주형이 아닌, 탈아민화된 메틸화 주형으로부터 신호를 발생시킬 수 있다. 이 트리뉴클레오티드 합성법은, 도 6에 도시된 바와 같이, 전체 섬이 아닌, 특정 CpG 부위의 메틸화 현황이 평가되도록 하는 부위-특이적 올리고뉴클레오티드의 부가에 의해 확대될 수 있다.
도 6: 불완전 개시에 의한 CpG 섬 내의 특정 CpG 부위의 메틸화 현황의 평 가. 표적 부위 프로브를 사용하여, 특정 유전자 내의 특정 CpG 섬의 메틸화 현황을 조사할 수 있다. 탈아민화된 메틸화 DNA에서, 디뉴클레오티드 CpG는, 비메틸화 부위 2에 의해서가 아니라, 3개의 메틸화 부위 1, 3 및 4에서 주형에 의해 코딩된다. 부위 3이 메틸화되었는지의 여부, 또한 메틸화된 경우에는 어느 정도인지를 구체적으로 결정하기 위해, 도 4에 기재된 바와 같이 위치(C21)를 표적 부위 프로브로 표지할 수 있다. 문제의 주형 C가 버블 영역와 하류 이중선의 접합부에 위치하여, 그것이 버블 영역에 결합하는, 적절하게 프라이밍된 RNA 폴리머라아제를 위해 그 다음에 혼입된 뉴클레오티드를 코딩한다. 개시자 R1-NxpC-OH(여기에서, Nx는 디뉴클레오티드 CpC 개시자의 경우에는 C일 수 있거나, Nx는 트리뉴클레오티드 개시자의 경우에는 CpC일 수 있음)가 사용되면, 개시자가 GTP 또는 GTP 유사체 pppG-R2G로 신장되어, 트리뉴클레오티드 R1NxCpG-R2를 형성할 수 있다. 유사하게, 문제의 C가 메틸화되지 않은 경우, 위치가 이제 U일 것이며, 뉴클레오티드 A를 코딩할 것이다. ATP 또는 ATP 유사체 pppA-R2A가 존재하는 경우, 그것은 C가 메틸화되지 않은 위치(서열번호 6 및 7)와 대향하여 혼입된다.
분자 질량을 기초로 하여 상이한 트리뉴클레오티드 서열을 용이하게 구분할 수 있는 질량분석법을 수행하여, A에서 종결하는 올리고뉴클레오티드 대비의, G에서 종결하는 올리고뉴클레오티드의 상대량을 결정한다. A-종결 및 G-종결 트리뉴클레오티드 양자 모두의 총 피크에 대한, G-종결 트리뉴클레오티드에 대응하는 피크 의 크기의 비는 메틸화 지수(M)에 대응한다. 그 위치의 C 모두가 메틸화되는 경우, M = 1이다. 그 부위가 모두 메틸화되지 않으면, M = 0이다. 이 또한, 뉴클레오티드 유사체도 수득되는 올리고뉴클레오티드에 상이한 분자량을 부여하기 위해 본 발명에 사용될 수 있다.
도 7: 불완전 전사에 의한 단일 뉴클레오티드 다형체(SNP)의 검출 및 동정. 특정 DNA 뉴클레오티드(A, C, G, T/dU)의 동일도는, 표적 부위 프로브(TSP)를 사용하여 불완전 전사에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, DNA가 정상 뉴클레오티드(야생형) 또는 변이체 뉴클레오티드(점돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형체/SNP)를 포함하는지의 여부를 결정하기 위해, 유전자-특이적 TSP를 표적 DNA(또는 증폭/복제 산물)에 부가하여, SNP 위치가 하류 이중선 및 버블 영역의 접합부에 있는 C/C' 혼성체 내의 마지막 뉴클레오티드에 상응할 수 있다. SNP 부위의 영역 상류에 상보적인 개시자 올리고뉴클레오티드(R1NI-OH)는 RNA 폴리머라아제에 의해 신장되어, SNP에 상응하는 그 다음 코딩된 뉴클레오티드를 부가할 수 있다. 수득되는 올리고뉴클레오티드가 검출되어, 질량분석법에 의해 상호 구분될 수 있다.
도 8: 불완전 전사에 의한 핵산, 단백질 등의 간접적 검출. 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체의 합성에 의해, 특정 질병, 또는 바이러스성 또는 세균성 병원체와 연관된 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 직접적으로 검출하기 위해, 불완전 전사가 사용될 수 있다. 대안적으로, a) 상기 단백질, 탄수화물, 지질, 합텐 또는 기타 분자를 인식하는 항체, 상보적 핵산 서열, 화학적 부분 등을, b) 하나 이상의 불완 전 프로모터 카세트(APC)에 연결함으로써, 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 합텐 또는 기타 분자의 존재를 간접적으로 검출할 수 있다. APC로부터의 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체의 생성이 검출될 수 있고, 이는 표적 분자의 존재를 가리킨다.
APC는 인공 프로모터를 포함하거나, 특정 RNA 폴리머라아제에 대한 프로모터를 포함할 수 있다. 분자 표적의 증진된 검출은, 수십, 수백, 수천, 수백만 이상의 불완전 프로모터 카세트(APC)를 포함한 다중 복사체가 부착된 입자를 사용함으로써 달성될 수 있다. 도 8은 APC이 사용이 핵산의 검출을 위한 포착 서열을 커플링함을 도시한다.
도 9. 화학적으로 변형된 서열-특이적 표적 부위 프로브를 혼성화함으로써, RNA 또는 DNA 표적이 검출될 수 있다. 핵산 표적이 표적 분자 상에 직접적으로 불완전 전사에 의해 겸출될 수 있으나, 그것은 또한 불완전 프로모터 카세트(APC)가 부착되는 프로브 서열에의 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 다중 APC가 부착될 수 있고, 이로써 단일 결합 행위가 증가되고, 이에 따라 감도도 증가된다. 감도 및 특이성도 또한 한 반응으로부터 다중 상이한 신호를 발생시키는 것을 복합시킴으로써 증가될 수 있다. 동일한 표적 분자의 상이한 영역에 각기 혼성화하고 상이한 APC로 각기 표지되는 3개 프로브가 표적 핵산에 혼성화된다. 1개의 APC를 사용하는 것보다 3개의 APC를 사용함으로써 감도가 증가된다. 1개의 표적 분자로부터 3개의 독립적 신호가 생성됨으로써, 일어날 수 있는 가(false)양성이 감소되기 때문에, 특이성도 또한 증가된다.
다중 APC를 포함하는 덴드리머가 이종이관능성 링커를 통해 표적-부위 프로브에 부착된다. 각 덴드리머는 동일한 APC의 다중 복사체를 포함하고, 단일 압스크립트를 코딩한다. 각기 상이한 APC를 포함하는 다중 덴드리머가 합성될 수 있다. 모든 APC는 동시에 검출 및 정량화될 수 있다. 상이한 APC 산물들 각각의 비율을 봄으로써, 특이성이 결정될 수 있다. 상이한 압스크립트를 코딩하는 APC로 태그된 부가적 덴드리머를 사용함으로써, 증가된 특이성이 수득될 수 있다. 각기 동일한 산물을 코딩하는 다중 덴드리머를 사용함으로써, 증가된 감도가 달성될 수 있다.
또한, APC-태그된 덴드리머를 단백질, 예컨대 항체에 부착시키는 것도 가능하다.
도 10. 핵산에서와 같이, 다중화는 감도 및 특이성을 향상시킬 수 있다. 포착 항체의 사용은, (단지 특정 단백질만이 결합되어) 특이성을 더 향상시킬 수 있고, 또한 포착 항체가 큰 체적의 샘플로부터 표적 분자를 추출할 수 있으므로 감도를 향상시킬 수 있다. 설명된 구현예에서, 단백질 독소가 포착 항체로 고정화된다. 각기 불완전 프로모터 카세트로 태그된 추가 2개의 독소 에피토프-특이적 펩티드 항체가 첨가된다. 압스크립션 기질이 첨가되어, 각 APC는 상이한 압스크립션 산물을 만들고, 이는 다시 검출 및 정량화된다. 더 많은 독소-특이적 항체를 첨가함으로써, 보다 높은 수준의 특이성이 달성될 수 있다. 포지티브 신호는 적절한 비율의 이 항체들 각각으로부터의 압스크립트 생성을 필요로 할 것이다. 예를 들어, APC1는 ApUpA를 코딩하고, APC2는 ApUpC를 코딩하며, APC3는 ApUpG를 코딩한다. 3개의 모든 압스크립트는 동일한 ApU 개시자를 사용한다. 각각은 위치 3으로서 상이한 뉴 클레오티드를 혼입함으로써, 상이한 질량의 압스크립트를 생성시킨다. 대안적으로, A, C 및 G는 상이하게 표지되어, 각기 상이한 신호를 생성시킬 수 있다.
도 11. 반복적 올리고뉴클레오티드 합성을 이용한 텔로머라아제 활성의 검출. DNA 폴리머라아제를 이용한 반복적 올리고뉴클레오티드 합성도 또한 신호 발생을 위해 사용될 수 있으나, 산물 올리고뉴클레오티드는 방출될 필요가 없으나, 산물 내에 텐덤 결합될 수 있다. 한 예로서, 텔로머라아제-특이적 프로브를 고체 매트릭스에 고정화하여, DNA 합성을 위한 자체 RNA 주형을 담지하는 세포 텔로머라아제를 포착함으로써, 텔로머라아제 활성이 검출될 수 있다. 예를 들어, 인간 텔로머라아제를 이용하여, 효소 상의 RNA 주형이 DNA 서열 GGGTTA를 코딩한다. 포착 프로브는 서열 GGGTTA를 포함할 수 있고, 이는 텔로머라아제가 샘플 내에 존재하는 경우, 텔로머라아제 포착 프로브의 말단에 반복적으로 첨가될 것이다. 신호 발생은 수가지 방식으로 달성될 수 있으며, 그 방식 중 하나는 합성 반응에 하나 이상의 리포터 태그된 dNTP를 포함시켜, DNA 산물의 골격을 따라 다중 R1가 결합된 산물을 생성시키는 것을 포함한다. 도11은 불완전 전사 반응을 위한 주형 서열을 보여준다. 도 11a: 폴리[dG-dC]는 반복 dCpdG의 합성 데옥시리보뉴클레오티드 중합체이다. 개별 가닥은 가변 수의 디뉴클레오티드 반복체(서열번호 8)들을 포함한다. 도 11b: 합성의 부분 상보적 주형 및 비주형 가닥(서열번호 9 및 10)을 어닐링함으로써 버블 착체 1을 제조하였다. 비주형 가닥의 수직 오프셋은 분자의 단일-가닥의, 버블 부분을 나타낸다. 좌표계는 버블의 하류 가장자리에 기초한다. 이중-가닥의 세그먼트 다음에 있는 외짝 염기는 위치 +1에 있다. 위치 +1의 좌측(상류) 에 있는 위치는 -1로 출발하는 음의 수로 주어진다. 리보뉴클레오티드 개시자의 3' 말단의 위치를 가리키기 위해 좌표계를 사용한다. 개시자 AA의 3' 말단이 +1에 배치되고, 개시자 AU의 3' 말단이 +2에 배치된다. 전사 반응은 이론에 따라, 개시자의 3' 말단에서 좌측에서 우측으로 진행한다. 도 11c는 상보적 비 주형 가닥이 없는 주형 가닥을 나타낸다. 서열은 3' → 5' 방향으로 나와 있다(서열번호 10).
도 12: 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한, 신장자 또는 종결자일 수 있는 일부 뉴클레오티드. 올리고뉴클레오티드의 내부 또는 3' 말단 위치에 포함될 수 있는 뉴클레오티드 유사체가 나와 있다. 이 유사체 모두가 단순히 3' OH 기의 치환에 의해 종결자로 전환될 수 있다. 이 유사체는 또한 특별한 반응 조건 하에서 3' OH 기를 갖는 종결자로 기능할 수도 있다.
도 13: R일 수 있는 기타 형광기. 그러한 기는, 피리미딘 내의 5-S-위치, 또는 퓨린 내의 8-S-위치로의 부가 후에 본 발명의 방법 및 조성물에 유용하다.
도 14: 뉴클레오티드의 기타 R 기 변형: 화학식 NucSR(식 중에서, a는 1 내지 2임)의 5-S-치환 피리미딘 또는 8-S-치환 퓨린
도 15: 다중 DNA 검출. 각기 표적 DNA 분자의 상이한 영역에 혼성화하고 대략 100 뉴클레오티드에 가까운 다중 표적 특정 프로브를 표적 DNA 분자를 포함하는 샘플에 첨가한다. TSP가 동일한 서열 및 리포터를 갖는 불완전 전사 산물을 코딩하는 경우, 이 방법은 증가된 감도를 초래할 것이다.
TSP가 상이한 서열 및 리포터를 갖는 불완전 전사 산물을 코딩할 경우, 높은 선택도 및 다중화가 일어날수 있다.
도 16: 모듈 APC. TSP 링커, 또는 표적 서열에 대해 특이한 핵산 프로브로 APC가 설계될 수 있다. APC가 동일한 서열 및 리포터를 갖는 불완전 전사 산물을 코딩할 경우, 이 방법은 증가된 감도를 초래할 것이다.
APC가 상이한 서열 및 리포터를 갖는 불완전 전사 산물을 코딩할 경우, 높은 선택도 및 다중화가 일어날 수 있다.
도 17: APC를 이용하는 단백질 검출.
도 18. 50 pmol의 AUG 및 AAG 트리뉴클레오티드로부터의 질량 스펙트럼 비교.
도 19. 50% CH3CN/H2O 중 50, 5 및 0.5 pmol에서의 AAG 트리뉴클레오티드를 검출하기 위한 질량분석법 방법의 감도
도 20(A). 10 및 100 μM AAG으로 스파이크된 압스크립션 반응을 위한, 스캔 190-210(~3.5 내지 3.8분)에서 요약된 질량 스펙트럼. 468 Da 부근의 AAG 신호가 -2 하전 이온으로부터 일어난다.
도 20(B). 100 μM 스파이크된 샘플으로부터의, 질량 범위 468 내지 469 Da(AAG) 및 593 내지 594 Da(ApA)로부터의 신호에 대한 크로마토그램.
도 21. 실시예 다중화 반응에 사용된 불완전 프로모터 카세트. 압스크립션 착체의 버블 부분은 굵은 체로 나와 있고, 주형 가닥 상의 개시 부위는 회색으로 강조되어 있다. 양 불완전 프로모터 카세트 모두는 동일한 표적 부위 프로브(TSP), A192 (TSP A195, 서열번호 11)로, 다만 상이한 주형 가닥(TEM), A197 (TEM A197, 서열번호 12) 또는 A56 (TEM A56, 서열번호 13)로 구축되었다. 버블 4에 대한 개시자는 ApA이고, UC2361를 위한 개시자는 UpC이며, 혼입 뉴클레오티드는 GTP이다. 버블 4로부터의 예상된 압스크립트 산물은 AAG이고, UC2361로부터의 예상된 압스크립트 산물은 UCG이다.
도 22. TLC에 의한 혼합 APC 실험으로부터의 압스크립션 산물의 분석. 레인 1-3은 버블 4(최종 100 fmol)을 가지로, ApA(레인 1), UpC(레인 2), ApA + UpC(레인 3)로 개시하였다. 레인 4-6는 버블 4(최종 100 fmol) 및 APC UC2361(최종 100 fmol)의 동몰 농도를 가지고, 그것들은 레인 4에서 ApA로 개시되었고, 레인 5에서 UpC로 개시되었으며, 레인 6에서 ApA + UpC 모두로 개시되었다. 레인 7-9는 APC UC2361(최종 100 fmol)를 가지고, UpC(레인 7), ApA(레인 8), 및 ApA + UpC(레인 9)로 개시되었다. 레인 10은 ApA로 개시된 TEM A197이고, 레인 11은 UpC로 개시된 TEM A57이며, 레인 12는 개시자 ApA + UpC를 갖는 APC가 없는 콘트롤이다. 레인 13은 α32P-GTP에 대한 콘트롤이다. 개시자 농도는 각기 최종 1 mM이었다.
도 23. 다중 압스크립션 반응에 사용하기 위한, 올리고뉴클레오티드 가닥의 상이한 조합으로 된 10개의 불완전 프로모터 카세트의 도시. 압스크립션 착체의 버블 부분은 굵은 체로 나와 있고, 주형 가닥 상의 개시 부위는 회색으로 강조되어 있다. APC를 구축하기 위해 사용된 각 표적 부위 프로브(TSP) 및 주형 가닥(TEM)의 동일도가 APC에 따라 열거되어 있다. 또한, 개시자 및 예상된 압스크립션 산물(서 열번호 14 내지 31)이 열거되어 있다.
도 24. 도 23에 나타낸 APC를 형성하기 위한 올리고뉴클레오티드 가닥의 어닐링은 4% 아가로스 겔 상의 전기영동에 의해 결정된다. APC의 4% 아가로스 겔 분석. 5 ㎕의 1 pmol/㎕의 APC를 각 레인(1-10)에 로딩하였다. 단일 가닥과의 비교를 나타내기 위해, TEM A191(5 ㎕의 50 pmol/㎕)을 레인 11에 로딩하였고, 레인 12는 50 bp 래더(ladder)를 가진다.
도 25. APC 4, 12, 24, 25 및 32로 된 압스크립트의 TLC 분석. 각 압스크립션은, 1 ㎕의 압스크립타제와 함께 도면에 열거된 1 mM 최종 농도의 NTP와 함께, 1 mM 최종 농도의 개시자를 갖는 100 fmol의 APC로 행해졌다. 압스크립션은 45℃에서 60분간 행해졌다. 각 반응으로부터의 2 ㎕을 TLC 판에 스포팅하여, 6:3:1의 이소프로판올: NH4OH:H2O로 전개하였다. TLC 판을 10분간 형광체 영상기 스크린에 노출시켰다.
도 26. 발생된 압스크립트(y-축)에 대한 샌드위치 ELISA(x-축)에서의 SEB 단백질의 농도
도 27. 개별 런으로부터의 10개 트리뉴클레오티드의 조합 크로마토그램. 삽입된 차트는 어떠한 수의 피크가 어떠한 압스크립트를 가리키는지, 및 적절한 체류 시간, m/z 값, 및 피크 면적을 보여준다. 아틀란티스(Atlantis) dC18 3 μm 2.1 mm × 30 mm 칼럼에 의해, 10 ㎕의 10 μM 용액을 분석하였다(100 pmol). 사용된 MS 조정 화일(tune file)은 "압스크립트"였다.
도 28. 질량분석법에 의해 동시에 검출된 압스크립트들의 혼합물. 각 압스크립트는 그것의 상응 m/z 비 다음에 나와 있다. 아틀란티스 dC18 3 μm 2.1 mm × 30 mm 칼럼에 의해, 10 ㎕의 10 μM 용액을 분석하였다(100 pmol). 사용된 MS 조정 화일은 "압스크립트"였다.
도 29. 다중 압스크립션 반응에 사용된 2개의 불완전 프로모터 카세트의 도시. 압스크립션 착체의 버블 부분은 굵은 체로 나와 있고, 주형 가닥 상의 개시 부위는 회색으로 강조되어 있다. APC를 구축하기 위해 사용된 주형 가닥(TEM) 및 각 표적 부위 프로브(TSP)의 동일도가 APC에 따라 열거되어 있다. 또한, 개시자 및 예상 압스크립션 산물(서열번호 32 내지 35)이 열거되어 있다.
도 30. 콘트롤 반응과 비교되는, 다중 압스크립션 반응으로부터 발생된 총 신호.
도 31. 2개 APC, 즉 APC 2-1 및 APC 12-1을 이용한 다중 반응으로부터 질량 스펙트로그램. 450.0895에서의 피크는 AAU에 상응하고, 469.5732에서의 피크는 AAG에 상응한다. 아틀란티스 dC18 3 μm 2.1 mm × 30 mm 칼럼을 사용하였고, 사용된 MS 조정 화일은 "압스크립트"였다.
본 발명은 질량분석법으로 검출되는 다중 올리고뉴클레오티드를 발생시킴에 의한, 핵산 주형 상의 반복적 합성을 통해 표적 분자(예컨대, 핵산 서열 또는 단백질)의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 방법은 일반적으로, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 전사 개시자를 사용하여, 표적 핵산 상의 부위에 실질적으로 상보적인 불완전 올리고뉴클레오티드 산물의 합성을 개시하고; (예컨대, 뉴클레오티드 상실, 사슬 종결 뉴클레오티드의 혼입, 또는 주형 서열 내의 전사 종결 신호의 존재를 통해) 중합 반응을 종결하며; 임의적으로, (1) 단일-가닥의 표적 부위의 어느 한 측에 이중-가닥의 세그먼트를 포함하는 전사 버블 착체를 형성하기 위한 표적 부위 프로브, 또는 (2) 표적 부위를 포함하는 전사 버블 영역을 포함하는 불완전 프로모터 카세트, 또는 (3) 임의의 표적 분자에 부착된 후, 신호를 발생시키기 위해 사용되는 불완전 프로모터 카세트를 사용하는 것을 포함한다. 신호는 질량분석법에 의해 검출되는 다중 올리고뉴클레오티드 전사체를 포함한다.
한 측면에 따라, 본 발명은 표적 DNA 또는 RNA 서열의 부분으로부터 다중 불완전 올리고뉴클레오티드 전사체를 사용하여 표적 분자를 검출하는 방법으로서, (a) 하나 이상의 표적 부위를 포함하는 단일-가닥의 표적 핵산; (b) 표적 부위의 상류에 있는 표적 핵산 상의 부위에 대해 상보적인 RNA 개시자; (c) RNA 폴리머라아제; (d) 임의적으로, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체; (e) 사슬 종결자; 및 (f) 임의적으로, (1) 표적 핵산 상의 표적 영역에 부분적으로 혼성화하여, 단일-가닥의 표적 부위의 한 측 상의 제1 및 제2 이중-가닥의 영역을 포함하는 전사 버블 착체를 형성하는 표적 부위 프로브, 또는 (2) 전사 개시 부위를 포함하는 전사 버블 영역을 포함하는 불완전 프로모터 카세트를 조합하고 반응시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 조합을 이하 기재된 바와 같은 적당한 조건들에 적용시켜, (a) 표적 부위 프로브가 표적 부위를 포함하는 표적 영역 내의 표적 핵산과 혼성화하도록 하고; (b) RNA 개시자가 표적 부위의 상류에 혼성화하도록 하며; (c) RNA 폴리머라아제가 RNA 개시자를 이용하여 표적 부위에서의 전사를 개시하고, 신장이 일어나며, 올리고뉴클레오티드 전사체가 합성되도록 하고; (d) 사슬 종결자가 신장 동안 전사를 종결시키고; (e) 폴리머라아제 결합 부위로부터 실질적으로 전위하거나 주형으로부터 분리되지 않으면서, RNA 폴리머라아제가 짧은 불완전 올리고뉴클레오티드 전사체를 방출하도록 하며; 및 (f) 충분한 신호가 발생되고 반응이 중단될 때까지, (c) 내지 (e)를 반복하도록 한다. 대안적으로, (a) 불완전 프로모터 카세트는 표적 핵산의 말단과 혼성화하고; (b) RNA 개시자는 전사 개시 부위의 상류와 혼성화하며; (c) RNA 폴리머라아제가 RNA 개시자를 이용하여 표적 부위에서의 전사를 개시하고, 신장이 일어나며, 올리고뉴클레오티드 전사체가 합성되고; (d) 사슬 종결자가 신장 동안 전사를 종결시키며; (e) RNA 폴리머라아제가 폴리머라아제 결합 부위로부터 실질적으로 전위하거나 주형으로부터 분리되지 않으면서, 짧은 불완전 올리고뉴클레오티드 전사체를 방출하도록 하며; 및 (f) 충분한 신호가 발생되고 반응이 중단될 때까지, (c) 내지 (e)를 반복하도록 한다.
이에 따라 발생된 다중 올리고뉴클레오티드 전사체, 즉 신호는 질량분석법에 의해 검출 및 정량화되고, 이는 표적 분자의 존재를 가리킨다. 일부 측면들에서, 본 발명의 방법은 또한 표적 분자의 성질, 또는 표적 분자의 풀(pool)의 성질을 나타낼 수 있다.
일반 기법
본 발명의 수행은 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 통상적 숙련가의 기술 내에 족히 포함되는, 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적 기법들을 이용할 것이다.
용어
본 발명의 이해를 도모하고자, 명백히 달리 언급되지 않는 한, 하기 용어들은 하기 의미들을 가진다. 본원에 사용된 많은 용어들의 부가적 상세설명이 국제특허출원 WO 03/038042(2003년 5월 8일 공개); U.S. 특허출원 공개 US-2003-0099950(2003년 5월 29일 공개); 및 계류 중인 U.S. 특허출원 No. 10/425,037(2003년 4월 29일 출원)에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 "약"은, "약"으로 칭해진 숫자가 언급된 수 ± 언급된 수의 1-10%를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "약" 50 뉴클레오티드는 45-55 뉴클레오티드, 또는 상황에 따라, 49-51 뉴클레오티드를 의미할 수 있다.
"불완전 전사"는 상보적 핵산 주형 서열의 하나 이상의 부분, 또는 표적 부위에 상응하는 올리고뉴클레오티드의 합성을 반복적으로 개시하고 종결하는 효소-매개 공정이다. 합성된 불완전 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 길이가 다양하고, 약 2 내지 약 26 뉴클레오티드, 약 26 내지 약 50 뉴클레오티드, 및 약 50 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 및 100 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
"불완전 전사"는 3가지 상태, 즉 개시, 신장 및 종결을 포함할 수 있다. 개시 상태 동안, 폴리머라아제는 개시자와 제2 NTP 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성한 후, 후속하는 NTP 등을 부가하고, 주형 서열을 전사하여, 길이가 약 2 내지 약 50 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 전사체를 합성한 후, 폴리머라아제 결합 부위로부터 실질적으로 전위하거나 주형으로부터 분리되는 폴리머라아제 없이, 신생 올리고뉴클레오티드 전사체를 방출함으로써 전사 행위를 종결한다. 즉, RNA 폴리머라아제는 실질적으로 주형 상의 초기 결합 부위에 남고, 제1 신생 올리고뉴클레오티드 전사체를 방출한 후, 다른 한 전사 개시 행위에 관여하여, 제1 올리고뉴클레오티드 전사체를 생성시키기 위해 전사된, 실질적으로 동일한 표적 부위에 대해 실질적으로 상보적인 제2 올리고뉴클레오티드 전사체를 생성시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 폴리머라아제는 주형의 단일 부분(즉, 표적 영역)을 반복적으로 전사하고, 실질적으로 동일한 신생 올리고뉴클레오티드 전사체의 다중 복사체를 방출한다.
"반복적"은 관심 서열의 동일하거나 매우 유사한 다중 복사체를 가리킨다.
"올리고뉴클레오티드 산물"은 본 발명의 반복적 합성 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드를 가리킨다. 올리고뉴클레오티드 산물은, 중합 반응이 RNA 폴리머라아제에 의해 촉매되는 전사 반응인 경우에는 "올리고뉴클레오티드 전사체"이거나, 중 반응이 텔로머라아제 또는 DNA 폴리머라아제에 의해 촉매되는 DNA 합성 반응인 경우에는 "올리고뉴클레오티드 반복체"일 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 필수적이지 않으나 일반적으로는 길이가 약 200 뉴클레오티드 미만인 짧은, 전형적으로 단일-가닥의, 합성 폴리뉴클레오티드를 가리킨다.
"종결"은 폴리머라아제에 의해 촉매되는 사슬 신장 또는 프라이머 확장 반응을 포함하는 사슬 종결자의 사용을 가리킨다. "사슬 종결자" 또는 "종결자"는 (개시 및/또는 신장 상태를 지나 폴리머라아제에 의한 전사의 연속을 억제하는 (화합물, 반응물 또는 반응 조건을 포함하는) 임의의 화합물, 조성물, 착체, 반응물, 반응 조건 또는 공정을 포함할 수 있다. "사슬 종결 뉴클레오티드"는, 복사 또는 전사되는 핵산의 서열 또는 뉴클레오티드 유사체의 구조로 인해, 일단 혼입되면 추가 사슬 신장을 억제하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 사슬 종결자이다.
"표적 서열" 또는 "표적 폴리뉴클레오티드"는 검출, 단리 또는 정량화가 요망되는 관심 폴리뉴클레오티드 서열이다. 표적 서열의 사실상의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있거나 알려져 있지 않다. "표적 서열"은 사실상의 관심 분자이거나 사실상의 관심 분자가 아니다.
"표적 부위"는 올리고뉴클레오티드 산물을 형성하기 위한 폴리머라아제에 의한 전사에 의해 검출되는, 표적 서열의 부분이다. 본 발명에 따라, 표적 핵산 상에 하나 이상의 표적 부위가 있다. 표적 부위의 서열은 구체적으로 알려져 있거나 알려져 있지 않을 수 있는데, 즉 표적 핵산의 사실상의 유전적 서열을 알 수 있는 경우, 폴리머라아제에 의해 전사되거나 복제되는 특별한 표적 부위의 유전적 서열은 알려져 있을 필요가 없다.
"표적 영역"은, 이하 상세히 기재되는 바와 같이, 표적 부위 프로브가 부분적으로 혼성화하여 버블 착체를 형성하는 표적 서열의 부분이다. 본 발명에 따라, 표적 핵산 상에 하나 이상의 표적 영역이 있고, 각 표적 영역은 표적 부위를 포함한다. 표적 영역의 서열은 상보적 표적 부위 프로브의 충분히 엄격한 혼성화를 허용하도록 충분히 구체적으로 알려져 있어, 표적 부위 프로브는 표적 영역과 버블 착체를 형성한다.
일반적으로, "주형"은 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 예들에서, 용어 "표적 서열", "주형 폴리뉴클레오티드", "표적 핵산", "표적 폴리뉴클레오티드", "핵산 주형", "주형 서열" 및 이들의 변형 표현들이 상호 교환적으로 사용된다. 구체적으로, 용어 "주형" 또는 "주형 가닥"은 주형-의존성 핵산 폴리머라아제의 활성을 통해 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로부터 상보적 복사체가 합성되는 핵산의 가닥을 가리킨다.
"뉴클레오티드"는 사이토신(C), 티민(T), 및 우라실(U), 아데닌(A) 및 구아닌(G) 뉴클레오티드 및 유사체를 포함한다.
용어 "개시자"는 신생 RNA 분자의 5' 말단에 혼입되는 모노뉴클레오시드, 모노뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 유사체를 가리키고, RNA 합성을 위한 "프라이머"("개시자 프라이머")로 간주될 수 있다.
"혼입"은 핵산 중합체의 일부분이 됨을 가리킨다. 핵산 전구체의 혼입에 관한 용어들에 관해 공지된 유연성(flexibility)이 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 dGTP는 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산염이다. DNA로의 혼입 시에, dGTP는 dGMP, 즉 데옥시구아노신 모노인산염 부분이 된다. DNA는 dGTP 분자를 포함하지 않으나, dGTP가 DNA에 혼입된 것으로 말해질 수 있다.
"동일도" 또는 "동일한"은 당업계에 통상 이해되는 바와 같이 본원에 사용된다. 예를 들어, 기준 뉴클레오티드 서열과 예를 들어 95% 이상이 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이, 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각 100 뉴클레오티드 당, 5 이하의 미스매치를 포함할 수 있음을 제외하고는, 관심 영역 상의 기준 성려과 동일하다는 것을 의미한다. 즉, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상이 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열 내의 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 다른 한 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 혹은 기준 서열 내의 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 수많은뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준(질의) 서열은 나와 있는 전체 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 임의의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다.
실제적 문제로서, 임의의 특별한 핵산 분자가 예를 들어 뉴클레오티드 서열과 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이 동일한지의 여부는, 베스트피트(Bestfit) 프로그램(위스콘신(Wisconsin) 서열 분석 팩키지, 유닉스용 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 리서치 파크 대학(University Research Park), 미국 53711 위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브 소재)와 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 베스트피트는 두 서열 간의 상동성의 최량의 세그먼트를 찾기 위해, [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489(1981)]의 로컬 상동성 알고리즘을 이용한다. 한 특별한 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과, 예를 들어, 95% 동일한지의 여부를 결정하기 위해 베스트피트 또는 임의의 다른 서열 배열 프로그램을 사용할 때, 파라미터들은 물론, 동일도 퍼센티지가 기준 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 대해 계산되도록, 또한 기준 서열 내의 뉴클레오티드의 총수의 5% 이하의 상동성에서의 갭이 허용되도록 설정된다.
기준(질의) 서열(본 발명의 서열)과 글로벌 서열 배열이라고도 칭해지는 대상 서열 간의 동일도는 또한 Brutlag 등의 알고리즘(Comp. App. Biosci. 6: 237-245(1990))에 기초하는 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 동일도 퍼센티지를 계산하기 위해 DNA 서열의 FASTDB 배열에 사용되는 바람직한 파라미터는 다음과 같다: 행렬=유니터리, k-터플=4, 미스매치 패널티=1, 결합 패널티=30, 랜덤화 군 길이=0, 컷오프 점수=1, 갭 패널티=5, 갭 크기 패널티=0.05, 윈도우 크기=500, 또는 대상 뉴클레오티드 서열의 길이=보다 짧음. 이 구현예에 따라, 내부 결실이 아닌, 5' 또는 3' 결실로 인해 대상 서열이 질의 서열보다 짧은 경우, FASTDB 프로그램이 대상 서열의 5' 및 3' 절단에 기여하지 않는다는 사실을 고려하여 결과에 수동 보정을 행한다. 5' 또는 3' 말단에서 절단된 대상 서열에서는, 질의 서열에 대한 동일도 %는, 질의 서열의 총 염기들의 퍼센트로서, 매치/배치되지 않은 대상 서열의 5' 및 3'인 질의 서열의 염기들의 수를 계산함으로써 보정된다. 뉴클레오티드가 매치/배치되는지의 여부의 결정은, FASTDB 서열 배열의 결과에 의해 결정된다. 이어서, 이 퍼센티지를 특정화된 파라미터를 이용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일도 %에서 빼서, 최종 동일도 % 점수를 얻는다. 이 보정된 점수는, 이 구현예의 목적을 위해 사용되는 것이다. 질의 서열과 매치/배치되지 않은, FASTDB 배열에 의해 표시되는, 대상 서열의 5' 및 3' 염기의 외부에 있은 염기만이 동일도 % 점수를 수동적으로 조정하기 위한 목적을 위해 계산된다. 예를 들어, 90 염기 대상 서열은 100 염기 질의 서열에 배치되어, 동일도 %를 결정한다. 대상 서열의 5' 말단에서 결실이 일어나고, 이에 따라 FASTDB 배열은 5' 말단에서 처음 10 염기의 매치/배열을 나타내지 않는다. 10 외짝 염기는 서열의 10%를 나타내고(5' 및 3' 말단에서의 염기의 수는 질의 서열에서의 염기의 매치/총 수임), 이로써 10%를 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일도 % 점수에서 뺀다. 남은 90 염기가 완전히 매치되면, 최종 동일도 %는 90%일 것이다. 다른 한 예에서, 90 염기 대상 서열을 100 염기 질의 서열과 비교한다. 이 때, 결실은 내부 결실이므로, 그 질의와 매치/배치되지 않은 대상 서열의 5' 또는 3' 상의 염기가 없다. 이 경우에서, FASTDB에 의해 계산된 동일도 %는 수동적으로 보정되지 않는다. 다시 한번, 질의 서열과 매치/배치되지 않은 대상 서열의 5' 및 3' 염기들만이 수동적으로 보정된다. 이 구현예의 목적을 위해, 다른 수동적 보정은 행해지지 않는다.
용어 "표지"는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공하기 위해 사용될 수 있고, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오시드 모노-, 디-, 또는 삼인산염, 뉴클레오시드 모노-, 디-, 또는 삼인산염 유사체, 폴리뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있는 임의의 원자, 분자, 또는 부분을 가리킨다. 일부 구현예들에서, 표지화 부분이 수득되는 올리고뉴클레오티드에 부여하는 질량 변경에 의해 표지가 검출된다. 검출가능한 분자도 또한 정량화가능하다. 그러한 질량-표지도 또한 당업계에 공지된 기타 수단에 의해 검출될 수 있다.
용어 "다중"은 동일한 반응으로부터 수개의 메시지 또는 신호를 동시에 발생시키는 시스템을 생성시키거나 그러한 시스템에 관한 것이다.
용어 "질량분석법"은 높은 진공에서 샘플로부터 생성된 분자 단편 또는 이온화 분자의 빔 내의 성분의 상대적 질량 및/또는 상대적 존재비를 결정하기 위한 분석적 방법을 가리킨다. 본원에 사용되는 그 용어는, 무엇보다도 고속 원자 충격(FAB) 질량분석법, 플라즈마 탈착(PD) 질량분석법, 전자분무/이온분무(ES) 질량분석법, 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량분석법, 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화 비행 시간 분석(MALDI-TOF)를 포함하고, 전기영동, 액체 크로마토그래피, 고속 겔 여과 등을 포함하는 다른 기법과 조합될 수 있다. 질량분석 검출은 S, Br, I 또는 Ag, Au, Pt, Os, Hg와 같이 DNA에서 정상적으로 일어나지 않는, 동위원소, 분자, 또는 원자를 핵산에 혼입함으로써 보강될 수 있다.
용어 "덴드리머"(나무에 관하여 그리스 덴드라(dendra)에서 기원함)는 전형적으로 제조 또는 합성된 분지형의 중합체인 분지형의 구조를 가리킨다.
성분 및 반응 조건
표적 핵산
표적 핵산은 자연 발생 또는 합성 폴리뉴클레오티드 세그먼트일 수 있고, 당업계에 공지된 기법에 의해 수득되거나 합성될 수 있다. 시험 샘플에서 검출되는 표적 서열은 초기에 구별되는 분자로 존재할 수 있거나, 보다 큰 분자의 단지 한 성분으로 존재할 수 있거나, 생물학적 샘플과 같은 착체 혼합물의 비주요부 또는 주요부 분획일 수 있다. 검출되는 표적 핵산은 DNA(이중-가닥의(ds) DNA 및 단일-가닥의(ss) DNA 포함) 또는 RNA(tRNA, mRNA, rRNA 포함), 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 이들의 혼합물; 유전자, 염색체 또는 플라스미드; 및 생물학적 물질의 게놈, 예컨대 미생물, 식물, 동물, 인간의 게놈으로부터의 DNA일 수 있는, 정제되거나 비정제된 형태의 임의의 원(source)으로부터의 핵산을 포함할 수 있다. 당업계의 표준 기법을 사용하여, 시험 샘플로부터의 핵산을 수득하고 정제할 수 있다. RNA 표적의 검출은 당업계에 공지된 바와 같이, 초기 상보적 DNA(cDNA) 합성을 필요로 하거나 필요로 하지 않을 수 있다. DNA-RNA 혼성체의 검출은, ssDNA를 수득하기 위한 혼성체를 변형시키거나, 변성 후에 역전사에 의해 cDNA를 수득하는 것을 필요로 할 수 있다.
기타 표적 분자
본 발명의 다른 한 구현예에서, 표적은 반복적 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 사용될 수 있는 핵산 서열의 공유 또는 비공유 결합에 의해 표지되는, 단백질과 같은 다른 한 분자일 수 있다. 예를 들어, 분자는 다중 반복적 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 주형으로 작용할 수 있는 핵산 서열에 커플링되는 항체에 의해 검출될 수 있다. 검출되는 표적 분자는, 정제되거나 비정제된 형태의, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질, 합텐 또는 임의의 원 기원의 기타 분자를 포함할 수 있다. 당업계의 표준 기법을 사용하여, 시험 샘플로부터의 분자를 수득하고 정제할 수 있다.
고정화
본 발명의 한 구현예에서, 표적 분자는 기질 상에 고정화될 수 있다. 다른 한 구현예에서, 표적 분자가 고정화되어, 예를 들어 마이크로어레이를 형성할 수 있다. 이 구현예에 따른 한 단일 분자 어레이는 고체 매트릭스, 생물반응성 또는 생물접착성 층, 및 생물내성 층을 포함한다. 본 발명을 위한 매트릭스로서 유용한 고체상은 시험관, 비이드 마이크로입자, 딥-스틱(dip-stick), 멤브레인, 미적정판, 시험관, 및 에펜도르프관, 유리 비이드, 유리 시험관의 모양, 및 유리로 된 임의의 기타 적절한 모양인, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 또는 임의의 고체 물질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적당한 고체 매트릭스는 생물접착성 층, 예컨대 리간드-결합제가 결합될 수 있는 임의의 표면, 또는 리간드 결합 부위를 자체 제공하는 표면을 포함한다.
항체 또는 올리고뉴클레오티드 포착 프로브는 폴리히스티딘 택 또는 가교결합 시약을 제공하는 것을 포함한. 당업계에 공지된 방법에 의해 생물접착성 패턴에 결합될 수 있다.
한 구현예에서, 고체 매트릭스는 고정화된 포착 프로브를 지나 흐르도록 허용되는 다중 용액 및 반응물을 수용하는 입구 및 출구를 갖는 유동 체임버 내에 내장될 수 있다. 유동 체임버는 플라스틱 또는 유리로 되어 있을 수 있고, 현미경 또는 광학 리더에 의해 보여지는 판에서 개방되거나 투명할 수 있다. 전기-삼투 유동은 고체 지지체 상의 고정된 전하, 및 고체 지지체의 대향 말단에 놓인 두 전극 사이에 퉁과하는 구배(전류)를 포함한다.
프라이머
본 발명의 한 구현예에 따라, 프라이머는 표적 핵산 상의 표적 부위의 폴리머라아제에 의해 전사를 개시하기 위해 사용되고, 리보뉴클레오티드 또는데옥시리보뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 한 구현예에서, 프라이머는 길이가 약 25 미만 뉴클레오티드, 통상은 길이가 약 1 내지 약 10 뉴클레오티드이고, 바람직하게는 길이가 약 2 내지 3 뉴클레오티드이다. 프라이머의 하나 이상의 위치에서 뉴클레오티드 또는 포스포디에스테르 연결기를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다.
표적 부위 프로브
본 발명의 한 구현예에 따라, 올리고뉴클레오티드 표적 부위 프로브는 폴리머라아제를 표적 핵산의 표적 부위에 지정하기 위해 사용된다(도 4). 표적 부위 프로브는 또한 "비주형 가닥"으로 칭해질 수도 있다. 표적 부위 프로브는 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 51 내지 약 75 뉴클레오티드, 약 76 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 100 초과의 뉴클레오티드를 비제한적으로 포함하는 뉴클레오티드의 길이가 다양할 수 있다. 버블 착체는 표적 부위를 포함하는 단일-가닥의 영역의 어느 한 측에 이중-가닥의 영역을 포함한다. 표적 영역 내의 버블 착체는 표적 부위 프로브의 구조에 의해 형성될 수 있다. 한 구현예에서, 표적 부위 프로브는 하기와 같은 3개 영역을 포함한다: 주형 서열 상의 표적 부위의 상류에 있는 주형 서열에 대해 상보적이고 그와 혼성화하는, 표적 부위 프로브의 5' 말단 상의 제1 영역; 제1 영역의 3'이고, 주형 서열에 대해 비상보적이고, 이에 따라 주형 서열과 혼성화하지 않는 제2 영역; 및 표적 부위 프로브의 3' 말단 상에 있고, 표적 부위의 하류에 있는 주형 서열에 대해 상보적이고 그와 혼성화하는 제3 영역. 다른 한 구현예에서, 표적 부위 프로브는 단일-가닥의 영역에 대해 실질적으로 상보적이고, 버블 착체는 폴리머라아제의 작용에 의해 형성된다.
표적 부위 프로브의 사용은, 특별한 표적 부위에서의 전사의 개시를 촉진하기 위해, 주형 서열 상의 특별한 효소 결합 부위(즉, 주형 서열 및 프라이머에 의해 표적 부위의 상류에 형성된 버블 및 이중-가닥의 세그먼트)에 폴리머라아제를 지정한다. 즉, 이 구현예는, 상기 기재된 바대로 단일-가닥의 주형 서열의 길이를 따라 폴리머라아제에 의한 합성 반응을 랜덤하게 개시하는 것을 촉진하기 위해서라기 보다, 표적 부위 프로브에 의해 형성된 버블 착체에 의해 포괄되는 특별한 표적 부위의 검출을 위한 폴리머라아제의 표적화 결합을 제공한다.
표적 부위 프로브의 서열은 표적 서열에 따라 다양할 것이다. 표적 서열과의 제1 및 제3 영역의 혼성화, 및 제2 비혼성화된 영역의 길이의 최적화를 제공하도록, 표적 부위 프로브의 전체 길이가 선택된다. 표적 부위 프로브의 제1 및 제3 영역은 표적 핵산 주형 상의 공지 부위에 혼성화되도록 설계된다. 용도에 따라, 표적 부위 프로브 상의 제2 영역의 서열은, 제2 영역이 자기-상보적이거나 자기-상보적이지 않도록 설계될 수 있다.
한 구현예에서, 핵산 주형 상의 하나 이상의 표적 부위에서의 불완전 올리고뉴클레오티드 합성을 특이적으로 개시하여, 다중 올리고뉴클레오티드 산물을 생성시키기 위해, 하나 이상의 표적 부위 프로브가 사용된다. 다른 한 구현예에서, 표적 부위 프로브는 주형 프로모터 서열의 부재 하에, 단일-가닥의 표적 부위 상의 불완전 전사의 개시를 지정한다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 5,571, 669; Daube 및 von Hippel, Science, 258: 1320-1324(1992)를 참고한다.
(불완전 버블 카세트로도 알려진) 불완전 프로모터 카세트
본 발명에 따라, 시험 샘플 내의 표적의 존재를 가리키는 다중 검출가능한 올리고뉴클레오티드 산물을 발생시키는 서열에 표적을 연결하기 위해, 불완전 프로모터 카세트(APC)가 사용될 수 있다. APC는 또한 불완전 버블 카세트(ABC)로도 칭해질 수 있다. APC는 (1) RNA 폴리머라아제가 결합하여 전사 버블을 형성시킬 수 있는 하나의 인접 올리고뉴클레오티드; (2) 개시자 및 적당한 RNA 폴리머라아제가 불완전 올리고뉴클레오티드 산물을 합성할 수 있도록 하는 부위를 포함하는 단일-가닥의 전사 버블 영역을 형성하는, 2개의 부분 상보적 상위 및 하위 올리고뉴클레오티드; 또는 (3) 불완전 올리고뉴클레오티드 산물의 합성을 허용하는, RNA 폴리머라아제의 존재 하에 전사 버블 영역을 형성하는 2개의 상보적 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있는 DNA의 자기-상보적 서열이다. APC는 인공 프로모터를 포함할 수 있거나, 특정 RNA 폴리머라아제를 위한 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 통상의 파지 RNA 폴리머라아제로 발생될 수 있는 트리뉴클레오티드 또는 테트라뉴클레오티드 산물은 GpA 또는 GpApA 개시자 및 pppG 또는 pppA 종결자로 될 수 있다.
한 예시적 구현예에서, 도 4에 나타낸 바와 같이, APC는 3' 또는 5'단일-가닥의 위에 걸린 영역(즉, "점착성 말단")을 포함하는 APC 링커 서열을 포함하는 3개 영역을 포함한다. APC의 5' 말단 상의 제1 영역(A)는 APC의 3' 말단 부근의 제2 영역(A')에 대해 상보적이다. 제3 영역(B) 및 제4 영역(E)은 영역 C, D 및 C'에 의해 상호 분리되고, 상호 비상보적이며, 이에 따라 영역 B 및 E는 APC의 자기-상보적 영역이 하나의 다른 자기-상보적 영역과 상호 작용할 때, APC 상에 단일-가닥의 버블 영역을 형성한다. 영역 C 및 C'는 실질적으로 자기-상보적이며, 이에 따라 영역 C의 5' 말단은 영역 C'의 3' 말단에 대해 상보적이다. 영역 D는 인접 APC에 대해서는 짧은 서열 결합 C 및 C'일 수 있고, 혹은 2-부 APC에 대해서는 2개의 분리된 상위 및 하위 올리고뉴클레오티드의 유리 3' 또는 5' 말단을 포함하는 영역일 수 있다. 마지막으로, APC는 또한 영역 A 및 A'의 상보적 상호 작용을 통해 형성되는 APC 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 상의 단일-가닥의 영역, APC 링커를 포함한다. APC 링커는 APC가 예를 들어, 포착된 표적 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 다른 표적 분자에 부착하는 것을 촉진한다.
수많은 APC가 본 발명에서 구체화된다. 일부 구현예들에서, APC는 하기 특성들을 가진다:
상류 팔(arm) 길이 > 13 nt
하류 팔 길이 > 13 nt
버블 세그먼트 길이 = 11 내지 14 nt
버블 서열: 비주형 가닥 일치:
상류 5'TANNNTN5 -8 (서열번호 1의 일부)
바람직한 서열: 5'TATAATN5 -8 (서열번호 1의 일부)
버블 서열: 주형 가닥 상류 3'C(C 또는 G 또는 A)N9-13 또는 A(C 또는 G 또는 A) N9-13(이는 T(C 또는 G 또는 A)N9-13 또는 G(C 또는 G 또는 A)N9-13보다 바람직함).
하기 총칭의 APC 구조에서, 밑줄 그어진 뉴클레오티드는 버블 내에 있고, "nn"은 개시 부위를 나타낸다. 처음 APC 밑에 나와 있는 숫자는 처음 APC 내의 가능한 (대안적) 개시자 부위를 나타낸다:
1. 버블 내의 2개의 최하류에 있는 부위.
2. 버블 및 하류 팔의 접합부에 걸치는 부위.
3. 버블에 바로 인접하는 하류 2 nt.
4. 버블의 가장자리로부터 갈라져 나온 하류 부위 1 nt.
유사한 개시자 부위가 부가적 예시적 APC에서 발견되나, 나와 있지는 않음.
Figure 112006038069477-PCT00001
상기 기재된 총칭의 APC 구조로 표시되는 APC의 특정 비제한적 예는 도 21, 23 에서 찾아볼 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 APC로서, 서열: 5'-GGATACTTACAGCCATTATATTTAGCCCTACTCCATTCCATCCCGGGTTCGTCC-3'(서열번호 2)와 약 80% 이상의 동일도를 가지는 서열을 갖는 표적 부위 프로브를 포함하고/하거나, 서열: 3'- CCTATGAATGTCGGTACCTGTGCCGCTTATGAGGTAAGGTAGGGCCCAAGCAGG-5'(서열번호 3)와 약 80% 이상의 동일도를 가지는 서열을 포함하는 주형 가닥; 또는 그것의 역 또는 상보적 가닥을 포함하는 APC는 배제하는 APC를 제공한다.
본 발명의 수행에 사용되는 APC는 효소에 의해, 또는 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, WO 03/038042 및 U.S. 특허출원공보 No. US-2003-0099950에 기재된 바와 같이, 버블 영역의 안정성을 최적화화고, APC 링커 서열의 표적 서열과의 혼성화를 제공하는 APC의 길이가 선택된다.
대상 표적 분자에 대한 특이성을 갖는 단일 분자가 하나 또는 다중 APC에 결합될 수 있다. 전형적으로, 동일한 유형의 APC는 하나의 분자에 결합된다. 일부 구현예들에서, 그러나, 상이한 APC들이 동일한 표적 분자에 결합될 수 있다. 도 9에 도시된 바와 같이, 많은 수의 APC들이 단일 분자에 부착될 수 있고, 이는 단일 결합 행위에 의해 발생되는 신호를 증가시킨다. APC는 핵산, 항체, 또는 임의의 다른 분자에 결합될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 화학적 커플링에 의해 요망되는 임의의 분자에 결합될 수 있는 APC를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 APC를 이용하여 표적 분자를 검출하는 방법을 포함한다.
덴드리머 구조
덴드리머는 전형적으로, 인공적으로 제조되거나 합성된 분지형의 중합체인 분지형의 구조이다. 예를 들어, 덴드리머는 아크릴산 및 디아민으로부터 될 수 있다. 덴드리머는 예컨대, 덴드리테크 인코포레이티드(Dendritech, Inc.)(미국 48642 미시간주 미들랜드 3110 슈에트 드라이브 소재)로부터 시중 입수될 수 있다.
덴드리머 합성은 단분산, 나무상, 또는 세대상 구조를 수득케 하는, 정규의 고분지형 단량체에 의해 한정되는 고분자 화학 분야이다. 단분산 중합체의 합성은, 한 번에 한 단량체 층, 즉 "세대"까지 덴드리머를 구축하는 단계별 반응을 통해 달성되는 높은 수준의 합성 조절을 필요로 한다. 각 덴드리머는 각 관능성 부위에 결합된 수지상 웨지를 갖는 다관능성 코어 분자로 구성된다. 코어 분자는 " 세대 0"으로 칭해진다. 모든 분지들을 따라 있는 각 연속적 반복 단위는 그 다음의 세대, " 세대 1", "세대 2" 등을 발생이 종결될 때까지 형성한다.
덴드리머 합성의 2가지 정의된 방법, 즉 확산 2 및 수렴 3이 있다. 확산 방법에서는, 분자가 코어로부터 주변으로 조립되고; 수렴 방법에서는, 덴드리머가 외측에서 시작하여 코어에서 종결되어 합성된다. 어느 방법에서도, 합성은 한 세대를 마지막 세대에 결합시키고, 정제한 후, 관능기를 그 다음 단계의 반응을 위해 변화시키는, 단계별 공정을 필요로 한다. 이 관능기 변형은 억제되지 않는 중합을 막기 위해 필요하다. 그러한 중합은 초고분지형 중합체로도 알려져 있는, 단분산이 아닌, 고분지형의 분자를 수득케 할 것이다. 초고분지형의 중합체를 위한 많은 용도들이 있으나, 이 시도는 그것들을 조사하지 않는다.
확산 방법에서는, 표면 기들이 초기에 미반응성 또는 보호된 종이며, 이는 반응의 그 다음 단계를 위해 반응성 종으로 전환된다. 수렴 방법에서는, 반응성 종이 수지상 웨지의 초점 상에 있어야 하므로, 그 반대이다.
입체적 효과로 인해, 계속 덴드리머 반복 단위를 반응시키는 것은, 입체 과밀이 한 특정 세대에서 완전한 반응을 막고 분자의 단분산성을 파괴할 때까지, 구 모양이거나 소구형(globular)인 분자를 수득케 한다. 가능한 세대의 수는 코어 분자의 분지에서의 보다 긴 간격 단위를 사용함으로써 증가될 수 있다. 덴드리머의 단분산성 및 구형 입체 팽창은 다양한 흥미로운 성질들을 초래한다.
수지상 웨지 길이의 입체적 제한은 작은 분자 크기를 초래하나, 소구형 모양의 밀도는 매우 높은 분자량을 초래한다. 구형 모양은 또한 분자 위상기하학에 있어 흥미로운 연구를 제공한다. 덴드리머는 2가지 주요 화학적 환경, 즉 수지상 구의 표면인 종결 세대 상의 관능기로 인한 표면 화학, 및 덴드리머 구조의 구형 모양으로 인한 외부 환경으로부터 대체로 차폐되는 구의 내부를 가진다. 그러한 분자 내에서의 2개의 구별되는 화학적 환경의 존재는 덴드리머 용도에 대한 많은 가능성들을 의미한다.
이론적으로, 소수성/친수성 및 극성/비극성 상호작용은 2가지 환경에서 변화될 수 있다. 덴드리머 내의 공극의 존재는 덴드리머 화학에 있어 중요한 역할을 하는 2가지 이질적 환경의 가능성을 더한다. 덴드리머 연구는 수지상 공극에서의 게스트 분자를 수용하는 덴드리머의 능력을 확인시켰다.
덴드리머는 몇가지 들자면, 분자량 및 표준, 유전자 트랜스펙션 제제로서, 생물학적으로 중요한 게스트의 수송을 위한 호스트로서, 또한 항암제로서의 사실상의 가능한 용도들을 가진다. 덴드리머에서의 많은 관심은 그것의 높은 표면 관능성 및 회수 용이성을 이용하는, 덴드리머의 촉매제서의 용도와 관련된다. 그러나, 덴드리머의 소구형 모양 및 분자 위상기하학은 또한 그것이 생물학적 시스템에 매우 유용하도록 한다.
본 발명의 일부 구현예들에서, APC는 덴드리머의 분지에, 전형적으로 화학적 커플링에 의해, 결합된다. 덴드리머 구조의 표면 상의 APC의 결합은 APC의 높은 밀도를 초래할 수 있다. APC-덴드리머의 한 분지는 대상 표적 분자에 대한 특이성을 갖는 제2 분자, 예컨대 프로브, 항체, 결합 단백질 등에 연결된다. 그 결과로서, 대상 표적 분자에 대한 제2 분자의 결합은 APC의 높은 밀도를 초래할 것이고, 이에 따라 APC로부터의 수많은 불완전 올리고뉴클레오티드 전사체를 초래할 것이다. 이에 따라, 덴드리머는 표적 분자의 검출과 연관된 신호의 대규모 증폭을 가능하게 하고, 그 결과로서 감도 및 (가능하게는) 속도를 증가시킨다.
폴리머라아제
본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 주형-의존성 폴리머라아제는 당업계에 공지되어 있고, 이는 진핵세포 또는 원핵세포 폴리머라아제의 양자 모두, 열안정한 폴리머라아제, DNA-의존성 RNA-폴리머라아제, DNA-의존성 DNA-폴리머라아제, RNA-의존성 RNA-폴리머라아제, RNA-의존성 DNA-폴리머라아제, DNA-의존성 RNA-폴리머라아제(폴리머라아제는 인산염기, 뉴클레아제, 및/또는 비혼입된 뉴클레오티드의 오탄당 환 상의 표지 부분을 수용할 수 있음), 프로모터 서열 없이 단일-가닥의 DNA 주형을 전사할 수 있는 폴리머라아제, 및 전술된 기타 폴리머라아제를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 방법에 포함되는 효소는 바람직하게 그 방법에 의해 생성된 핵산 성분의 실질적 분해를 일으키지 않는다.
뉴클레오티드
본 발명에 따라, 폴리머라아제는 올리고뉴클레오티드 산물 상의 통상적 5'-3' 방향으로의 반응을 촉매하고, 뉴클레오티드 유사체(NTP 유사체)를 포함하거나 표지 또는 비표지될 수 있는 뉴클레오티드(NTP)의 순차적 첨가를 통해, 개시자 또는 프라이머의 3' 말단을 확장시킴으로써 표적 핵산을 전사하거나 복제한다.
일부 구현예들에서, 방법은 동위원소, 합텐, 바이오틴, 효소(예컨대, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제), 단백질, 인공 프로모터 카세트, 광가교제, 화학적 가교제, 스텝타비딘, 형광 부분, 비색 부분, 발광 부분, 화학발광 부분, 금속(예컨대, 금, 은) 또는 염료 중 어느 하나로 유도화된 뉴클레오티드를 사용한다.
다른 구현예들에서, 방법은 화학식 NucSR
(여기에서, Nuc는 피리미디닐 또는 푸리닐이고;
S는 황이며;
R은 H, 합텐, 바이오틴, 효소(예컨대, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제), 단백질, 인공 프로모터 카세트, 광가교제, 화학적 가교제, 스텝타비딘, 형광 부분, 비색 부분, 발광 부분, 화학발광 부분, 금속(예컨대, 금, 은), 염료, 핵산 세포 흡수 기, C6-10 아릴, C6-10 아르(C1-6) 알킬, C6-10 아릴아미노(C1-6) 알킬, C6-10 아릴옥시(C1-6)알킬, C6-10 아르(C1-6)알킬아미노(C1-6)알킬, C6-10 아르(C1-6)알킬옥시(C1-6)알킬, C6-10 아르(C1-6 알킬) 카르보닐아미노(C1-6)알킬, C6-10 아르(C1-6 알킬) 카르보닐옥시(C1-6) 알킬, (C6-10 아릴)카르보닐아미노(C1-6)알킬,(C6-10 아릴)카르보닐옥시(C1-6)알킬, (C6-10 아릴)카르보닐(C1-6)알킬 및 C6-10 아르(C1-6 알킬)카르보닐(C1-6) 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택됨{[여기에서, 상기 기들 중 각각의 아릴 부분은 할로, 히드록실, C1-6 알킬, C3-8 시클로알킬, C1-6 할로알킬, C1-6 히드록시알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 알콕시, (C1-6 알킬)카르보닐, (C1-6 알콕시)카르보닐, 아미노, 아미노(C1-6)알킬, 아미노카르보닐, 모노(C1-6 알킬)아미노카르보닐, 디(C1-6 알킬)아미노카르보닐, C1-6 알킬아미노, 디(C1-6)알킬아미노, (C1-6 알킬)카르보닐아미노, C6-10 아릴아미노, (C6-10 아릴)카르보닐아미노, 모노(C6-10 아릴)아미노카르보닐, 디(C6-10 아릴)아미노카르보닐, 모노(C6-10 아르(C1-6 알킬))아미노카르보닐, 디(C6-10 아르(C1-6 알킬))아미노카르보닐, N-(C6-10)아릴-N-(C1-6 알킬)아미노카르보닐, N-(C6-10)아르(C1-6)알킬-N-(C1-6 알킬) 아미노카르보닐, N-(C6-10)아르(C1-6)알킬-N-(C6-10 아릴)아미노카르보닐, C1-6 알킬티오, C6-10 아릴티오, C6-10 아르(C1-6)알킬티오, 카르복시, 카르복시(C1-6)알킬, 니트로, 시아노, 헤테로아릴 및 포화 또는 부분 불포화 복소환[여기에서 헤테로아릴 및 포화 또는 부분 불포화 복소환은 독립적으로 단환 또는 융합 이환이고, 독립적으로 5 내지 10 환 원자를 가지며(여기에서, 환 원자들 중 하나 이상은 산소, 질소 및 황으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택됨)]으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1-4개 치환기로 임의적으로 치환됨}의 5-S-치환 피리미딘 또는 8-S-치환 퓨린을 포함하는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산을 사용한다. 변형된 뉴클레오티드 유사체, 및 적절한 변형기의 예가 도 12 내지 14에 나와 있다.
반복적, 불완전 합성 개시 행위를 촉진하기 위해, 합성 반응 전 및/또는 중에 반응 혼합물에 첨가될 수 있는 NTP 및/또는 NTP 유사체는, 폴리머라아제에 의해 개시되는 합성 행위를 종결시킬 수 있는 사슬 종결자를 포함한다. 사슬 종결자의 사용은 합성 반응 중에 폴리머라아제를 막고, 진행적 신장 착체의 형성을 억제하며, 이로써 표적 부위로부터의 짧은 불완전 올리고뉴클레오티드의 반복적 합성을 촉진한다. (Daube 및 von Hippel, Science, 258: 1320-1324(1992)).
본 발명에 따라, 사슬 종결자는 프라이머 확장 반응 중에 폴리머라아제에 의한 전사 또는 복제가 연속되는 것을 막을 수 있는, 임의의 화합물, 조성물, 착체, 반응물, 반응 조건 또는 공정(화합물, 반응물 또는 반응 조건의 저지를 포함함)을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 한 적당한 사슬 종결자는 NTP 상실이며, 즉 후속 상보적 뉴클레오티드에 상응하는 특별한 NTP의 폴리머라아제에서 주형 서열을 상실시킴으로써 사슬 종결이 초래된다. 즉, 사슬 신장을 위한 NTP 요건이 상보적 가닥 서열, 주어진 한정된 주형 서열 및 한정된 프라이머 길이에 의해 지배되기 때문에, 선택된 NTP는, 반응 혼합물이 주형 서열의 전사 또는 복제를 계속하기 위해 필요한 NTP를 갖는 폴리머라아제를 제공하지 못할 때, 폴리머라아제에 의한 사슬 신장의 종결이 초래되도록, 반응 혼합물로부터 저지될 수 있다.
대안적으로, 다른 한 구현예에서, 사슬 종결자는, 폴리머라아제에 의해 올리고뉴클레오티드 산물로 혼입될 때 뉴클레오티드 중합의 종결을 행하는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
반응 조건, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 분자과 관련된 부가적 정보가 WO 03/038042 및 U.S. 특허출원공보 No. US-2003-0099950에 기재되었다.
반응 조건
본 발명의 방법을 수행하기 위한 적절한 반응 매체 및 조건은 전사 인자들(시그마, NusA, Rho, 리소자임, GreA, GreB, NusG 등)을 비롯한, 각종 이온, 완충액, 킬레이트화제, 폴리음이온성 또는 양이온성 분자, 단백질 담체 또는 기타 단백질로 보충되거나 보충되지 않을 수 있는 특별한 폴리머라아제를 위해 최적화된 수성 완충 매체를 포함할 수 있다. 모든 반응 성분들의 변화는 잠재적으로 전장 전사체에 대한 불완전 전사체의 비를 변경할 수 있다. 예를 들어, 주형에 대한 RNA 폴리머라아제의 높은 몰비는 람다 PR 프로모터 상의 전장 전사에 대한 불완전 전사의 빈도를 증진시킨다. 이 효과는 분명히 프로모터에 있는 텐덤 폴리머라아제들 사이의 충돌로부터 일어난다. 특정 RNA 폴리머라아제 변이체는 야생형 폴리머라아제에 비해, 상승된 불완전 전사 속도를 가진다. 불완전 전사의 상대적 수준은 프로모터의 뉴클레오티드 서열에 민감한다. 본 발명의 방법의 임의의 측면은 등온을 비롯한, 동일 온도 또는 가변 온도에서 일어날 수 있거나, 일부 구현예들에서는 전사 또는 복제를 위한 온도가 검정에서 다른 경우에 사용된 온도(들)와 상이할 수 있다.
본 발명의 각종 측면들 및 구현예들에 따라, 표적 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드 포착 프로브, 표적 핵산의 부분에 대해 상보적인 모노뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 개시자, 표적 핵산의 부분에 대해 상보적인 APC 링커 서열, 및/또는 표적 부위의 어느 한 측의 영역에 대해 상보적인 표적 부위 프로브에 혼성화될 수 있다. 혼성화는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 요망되는 특이도를 달성하기 위해 필요한 조건 하에서 수행된다. 혼성화 전에, 시험 샘플 내의 표적 핵산을 변성시킬 필요가 있을 수 있다.
전사 조건 및 시약이 당업계에 공지되어 있고, 다른 곳에 기재되었다. Lu 등의 U.S. 특허 No. 5,571,669에 기재된 바와 같이, 인공 전사 버블 착체로부터 개시되는 전사를 위한 폴리머라아제 농도는 일반적으로 프로모터-개시, 또는 회문식 서열-개시 전사를 위한 이상적 폴리머라아제 농도보다 약 1 등급 정도 더 높다.
한 구현예에서, 불완전 합성 및 검출 방법의 개시 시에 성분들을 동시에 첨가한다. 다른 한 구현예에서, 성분들은 각종 방법에 의해 요구되고/되거나 허용되는 바와 같이, 방법 중에 적절한 시점 전 또는 후에 임의의 순서로 첨가된다. 그러한 시점은 당업자에 의해 용이하게 규명될 수 있다. 본 발명의 방법에서의 각종 반응들은 각종 시점에서 중단된 후, 나중의 한 시간에 개시될 수 있다. 이 시점은 당업자에 의해 용이하게 규명될 수 있다. 예를 들어, 반응 혼합물을 효소 활성을 억제하는 온도로 냉각시키는 것을 포함한, 반응을 중단하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 불완전 합성 및 검출 방법
본 발명의 한 측면에 따라, 검출가능한 올리고뉴클레오티드 산물이 표적 핵산 주형으로부터 합성된다. 올리고뉴클레오티드 산물은 또한 개시자 상의 표지 부분, 및/또는 표적 핵산 상에서, 및/또는 합성 착체의 부분이거나 합성 착체의 하나 이상의 성분과 상호 작용하는 다른 분자 상에서 합성된 각 올리고뉴클레오티드 산물에 폴리머라아제에 의해 혼입된 NTP 또는 NTP 유사체 상의 표지 부분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 올리고뉴클레오티드 산물의 검출은 표적 서열의 존재를 가리킨다. 일부 구현예들에서, 표적 서열은 대상 표적 분자를 포함한다. 다른 구현예들에서, 대상 표적 분자는 올리고뉴클레오티드 산물이 생성된 표적 서열과 구분되고; 이에 따라 올리고뉴클레오티드의 검출은 대상 표적 분자의 존재를 가리키는 표적 서열의 존재를 가리킨다. 이 구현예들에서, 관심 분자는 예를 들어, 단백질, 펩티드, 합텐, 탄수화물, 독소, 지질, 이온, 또는 다른 한 핵산일 수 있다. 이에 따라, 일부 구현예들에서, 표적 서열의 존재는 관심 단백질의 존재를 가리킬 수 있다. 일부 구현예들에서, 불완전 프로모터 카세트는 DNA, RNA, PNA(단백질 핵산, 여기에서, 뉴클레오티드 골격은 인산염 연결기가 아닌, 아미노기 연결기로 치환됨), 항체, 결합 단백질, 합텐, 신호전달 단백질, 이온 또는 관심 분자에 대한 특이성을 갖는 기타 분자에 커플링된다.
정량적 분석도 또한 실행가능하다. 직접적 및 간접적 검출 방법(정량화 포함)이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미지량의 표적 핵산을 포함하는 시험 샘플로부터 발생된 올리고뉴클레오티드 산물의 양을, 기지량의 표적 핵산을 갖는 기준 샘플로부터 발생된 올리고뉴클레오티드 산물의 양을 비교함으로써, 시험 샘플 내의 표적 핵산의 양을 결정할 수 있다. 본 발명의 반복적 불완전 합성 개시 및 검출 방법도 또한 이하 추가 기재되는 바와 같이, 표적 핵산 내의 유전적 서열 변경의 분석에 확장될 수 있다.
본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위해, 본 발명의 불완전 합성 및 검출 방법의 하기 실시예들이 제공된다. 이 예시적 방법들은 상기 제시된 기재 내용을 단지 설명하기 위한 것으로서, 제한하고자 함이 아니다. 상기 일반적 기재 내용이 제시되어 있는 바, 각종 다른 구현예들이 수행될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 프라이머의 사용에 대한 언급은, RNA 개시자를 비롯한, 본원에 기재된 프라이머들 중 임의의 것을 사용할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 한 측면에 따라, 표적 폴리뉴클레오티드 상의 반복적 합성 개시 행위를 통해 다중 검출가능한 올리고뉴클레오티드 산물을 발생시킴으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법이 제공된다.
도 2는 RNA 폴리머라아제의 존재 하에 조합 및 반응하여, 다중 검출가능한 올리고뉴클레오티드 산물을 합성할 수 있는 각종 반응물들을 개략적으로 도시한다. 본 발명의 방법은 표적 서열을 잠재적으로 포함하는 시험 샘플을 이용하여 수행될 수 있다. 시험 서열은 직접적으로 검출될 수 있거나, 프라이머-확장 또는 표적의 역전사의 산물이 검출될 수 있다. 서열 또는 택이 표적의 복사체(예컨대, 바이오틴, ssDNA 영역)에 부가될 수 있다. 시험 샘플은 이중-가닥의 DNA, 단일-가닥의 DNA, 또는 RNA를 포함할 수 있다. DNA 또는 RNA는 세포, 조직 또는 기타 샘플로부터 DNA 또는 RNA를 단리하기 위한 표준 기법에 의해 단리 및 정제될 수 있다.
한 구현예에서, 표적 서열은 고체 매트릭스, 예컨대 미적정판에 결합된 서열-특이적(예컨대, 유전자-특이적) 올리고뉴클레오티드 포착 프로브에 의해 고정화된다. 단일-가닥의 DNA(즉, 변성 DNA) 또는 RNA를 포함하는 시험 샘플을 이용하여, 혼성화 조건 하에서 고정화된 포착 프로브를 처리한다. 시험 샘플 내에 존재하는 임의의 표적 서열은 포착 프로브에 혼성화한 후, 본 발명에 따른 부가적 시약에 노출된다.
한 구현예에서, 개시자(n 5'-R1-(NI)x-OH3')는 표적 부위 프로브의 존재 하에 표적 부위의 상류에 있는 표적 서열과 혼성화하고(도 4), 폴리머라아제에 의해 표적 부위에서의 중합 반응의 촉매 작용을 촉진한다. 개시 프라이머는 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 유사체, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 이루어질 수 있고, WO 03/038042 및 U.S. 특허출원공보 No. US-2003-0099950에 기재된 바와 같이, 뉴클레오티드의 수가 다양할 수 있다. 한 적당한 RNA 폴리머라아제를 이용하여, 표적 서열 또는 이의 임의의 부분으로부터 올리고리보뉴클레오티드 산물을 합성한다.
중합 반응 동안, 반응 혼합물에 부가된 뉴클레오티드의 혼입을 통해, 개시자가 폴리머라아제에 의해 확장 또는 신장된다. 폴리머라아제 반응이 진행함에 따라, 폴리머라아제는 반응 혼합물 내에 존재하는 상응 뉴클레오티드를 혼입함으로써, 주형 서열에 의해 지정된 바와 같이, 개시자를 확장한다. 한 구현예에서, 이 반응물 뉴클레오티드들은 사슬 종결자(예컨대, 상기 기재된 바와 같은, n 5'pppNT-R2, 사슬 종결 뉴클레오티드 유사체). 폴리머라아제가 사슬 종결자를 신생 올리고뉴클레오티드 산물에 혼입시킬 때, 폴리머라아제가 사슬 종결자의 오탄당 환 상의 3' 위치에 뉴클레오티드를 부가하는 것을 촉매하지 못함으로 인해, 사슬 신장이 종결된다. 결과적으로, 폴리머라아제는 올리고뉴클레오티드 산물(즉, 5'R1-(NT)ZpNT-R2(여기에서, z = x + y임))를 방출하고, 표적 부위에서 불완전 개시 합성 반응을 재개시함으로써 개시된 합성 행위를 중지한다.
소정의 수의 뉴클레오티드에 의해 개시자를 확장한 후, 폴리머라아제가 합성을 중지하도록, 불완전 개시 반응이 조절될 수 있다. 예를 들어, 개시자가 단일 뉴클레오티드에 의해 확장된 후에 합성 반응을 종결하는 것이 바람직한 경우, 이는 예를 들어, (1) 반응 혼합물에 사슬 종결자인 뉴클레오티드만을 부가하여, 이로써 제1 뉴클레오티드가 폴리머라아제에 의해 혼입된 후에 중합을 개시하거나; (2) 표적 부위의 유전적 서열이 공지된 경우에는, 반응 혼합물에, 표적 부위에 있는 뉴클레오티드에 대해 상보적인 예비선택된 사슬 종결 뉴클레오티드 유사체(즉, A, G, T, C 또는 U 중 하나를 포함하는 뉴클레오티드 유사체)를 부가하는 것에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 소정의 수의 뉴클레오티드에 의해 개시자가 신장된 후에 합성 반응을 종결하는 것이 바람직한 경우에는, 표적 부위의 유전적 서열이 공지된 경우, 이는 예를 들어, 반응 혼합물에, 표적 부위로부터 N번째(여기에서, N은 개시자를 배제한, 올리고뉴클레오티드 산물이 포함하는 뉴클레오티드의 소정의 수임) 뉴클레오티드에 대해 상보적인 예비선택된 사슬 종결 뉴클레오티드 유사체(즉, A, G, T, C, 또는 U 중 하나를 포함하는 뉴클레오티드 유사체)를 부가함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방식으로, 개시자 및 사슬 종결 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 다중 불완전 올리고뉴클레오티드 산물이 폴리머라아제에 의해 합성된다.
폴리머라아제는 효소 결합 부위로부터 전위하거나 표적 폴리뉴클레오티드 서열로부터 분리되지 않으면서, 올리고뉴클레오티드 산물을 방출한다. 뉴클레오티드 상실을 이용하여, 폴리머라아제 결합 부위에 폴리머라아제를 봉쇄시킬 수 있다. 예를 들어, 개시자 및 종결자만이 공급되는 경우, 폴리머라아제에 의한 신장은 가능하지 않을 것이다.
또한, 불완전 전사 개시를 위해 반응 조건이 최적화될 수 있고, 이로써 신장 뉴클레오티드의 존재 하에서도 폴리머라아제가 폴리머라아제 결합 부위에 결합된 채로 남아 있는 것이 바람직하다. 염의 농도, 이가 양이온, 글리세롤 함량, 및 사용되는 환원제의 양 및 유형을 조정함으로써, 불완전 행위를 증가시키도록 불완전 개시 반응 완충액이 최적화될 것이다. 부가적으로, "봉쇄(roadblock)" 단백질을 사용하여, 폴리머라아제가 전위하는 것을 막을 수 있다.
본 발명의 다른 한 측면에서, 도 4에 개략적으로 도시되어 있는 바와 같이, 표적 부위 프로브를 사용하여, 표적 서열 내에 버블 착체를 형성할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 버블 착체는 표적 부위를 포함하는 단일-가닥의 영역의 측면에 위치하는 이중-가닥의 영역을 포함한다. 이 구현예에서, 표적 서열 상의 단일-가닥의 버블 영역과 하류 이중선 영역의 접합부에 표적 부위를 위치시킴으로써, 표적 부위에 폴리머라아제를 지정하기 위해 표적 부위 프로브를 사용한다. 폴리머라아제는 개시자와 연합하여, 주형 서열 상의 표적 부위에서 합성 반응을 개시한다. 폴리머라아제는 개시자를 신장시켜, 적당한 사슬 종결자를 포함하는 뉴클레오티드의 혼입을 통해 불완전 올리고뉴클레오티드 산물을 합성한다. 개시자, 및 사슬 종결 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 양자 모두는 표지 부분으로 변형될 수 있다.
그러므로, 표적 서열 상의 반복적 합성 개시 행위를 통해 다중 올리고뉴클레오티드 산물을 검출하기 위한 한 예시적 절차는, (a) 특정 또는 일반 표적 서열과 혼성화하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 포착 프로브를 고정화하고; (b) 올리고뉴클레오티드 포착 프로브를, 표적 서열을 잠재적으로 포함하는 시험 샘플과 혼성화시키고; (c) 표적 서열을 표적 부위 프로브와 혼성화시키며; (d) 폴리머라아제에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드 산물의 검출을 가능하도록, 개시자, 및 사슬 종결자를 포함하는 뉴클레오티드 중 하나 이상을 변형시키고; (e) 표적 서열을 프라이머와 혼성화시키며; (f) 개시자를 폴리머라아제로 확장시켜, 사슬 종결자를 포함하는 상보적 뉴클레오티드를 혼입하고, 효소 결합 부위로부터 전위하거나 표적 서열로부터 분리하지 않으면서 불완전 올리고뉴클레오티드 산물을 방출함으로써, 폴리머라아제가 표적 부위에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 산물을 반복적으로 합성하도록 하는 것을 포함할 수 있다.
RNA 폴리머라아제에 의해 주형을 전사하는 동안, RNA 개시자는 반응 혼합물에 부가된 뉴클레오티드의 혼입을 통해 RNA 폴리머라아제에 의해 확장된다. 폴리머라아제 반응이 진행함에 따라, RNA 폴리머라아제는 반응 혼합물 내에 존재하는 상응 뉴클레오티드를 혼입함으로써, 주형 서열에 의해 지정되는 바대로, RNA 개시자를 확장시킨다. 한 구현예에서, 이 반응물 뉴클레오티드는 사슬 종결자(예컨대, 상기 기재된 바와 같은, n 5'pppNT-R2, 사슬 종결 뉴클레오티드 유사체)를 포함한다. RNA 폴리머라아제가 사슬 종결자를 신생 전사체에 혼입할 때, 폴리머라아제가 사슬 종결자의 리보스 환 상의 3' 위치에 뉴클레오티드를 부가하는 것을 촉매하지 못함으로 인해 사슬 신장이 종결되고, RNA 폴리머라아제는 표적 부위에서 전사체를 방출하고 전사를 재개시함으로써 개시된 전사 행위를 중지한다. 소정의 길이를 가지고, RNA 프라이머 및 사슬 종결 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 다중 불완전 올리고뉴클레오티드 전사체가 발생되도록, 불완전 전사 개시 반응이 조절될 수 있다.
한 예시적 구현예에서, RNA 개시자는 모노뉴클레오티드일 수 있고, 반응 혼합물 내에 제공된 뉴클레오티드는 단독 사슬 종결자만을 포함할 수 있다. 이 구현예에서, RNA 개시자가 단일 뉴클레오티드에 의해 확장된 후에 RNA 폴리머라아제에 의해 전사가 중지되고, 불완전 디뉴클레오티드 전사체가 발생된다. 다른 한 구현예에서, RNA 개시자는 예를 들어, 디뉴클레오티드 또는 트리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 불완전 전사 개시 행위는 트리뉴클레오티드 또는 테트라뉴클레오티드를 각기 포함하는 불완전 전사체를 발생시킬 수 있다. RNA 개시자의 길이, 및 반응 혼합물 내에 포함되도록 선택된 반응물 뉴클레오티드의 성질 및 조성에 따라, 임의의 요망되는 길이의 불완전 전사체가 수득될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 주형의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있는 경우, 임의의 요망되는 길이의 불완전 전사체가 본 발명의 방법에 의해 발생되도록, 전사 반응의 성분(예컨대, 표적 부위, 개시자, 및 반응물 뉴클레오티드)이 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 한 측면에서, RNA 개시자는 5' 인산염기, 리보스 환의 2'위치, 또는 RNA 개시자에 혼입된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 중 하나의 퓨린 또는 피리미딘 염기에 공유 결합될 수 있는 부분(예컨대, 도 3에 나타낸 바와 같은 R1)을 포함한다. 부가적으로, RNA 폴리머라아제에 의해 올리고뉴클레오티드 전사체에 혼입하기 위한 반응 혼합물 내에 포함된 반응물 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 각기 또한 핵염기, 또는 리보스 환의 2' 위치 또는 3' 위치에 공유 결합된, 부분(예컨대, 도 3에 나타낸 바와 같은 R2)을 포함할 수 있다. 부분 R1 및 R2는 각기 상기 더욱 구체적으로 기재된 바와 같이, H, OH, 또는 임의의 적당한 표지 부분, 리포터기 또는 리포터기 전구체를 포함할 수 있다.
그러므로, 표적 서열 상의 반복적 전사 개시 행위를 통해 다중 올리고뉴클레오티드 전사체를 검출하기 위한 한 예시적 절차는, (a) 임의적으로, 특정 또는 일반 표적 서열과 혼성화하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 포착 프로브를 고정화하고; (b) 임의적으로, 올리고뉴클레오티드 포착 프로브를, 표적 서열을 잠재적으로 포함하는 시험 샘플과 혼성화시키고; (c) 임의적으로, 표적 서열을 표적 부위 프로브와 혼성화시키며; (d) RNA 폴리머라아제에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드 전사체의 검출을 가능하도록, RNA 개시자, 및 사슬 종결자를 포함하는 뉴클레오티드 중 하나 이상을 변형시키고; (e) 표적 서열을 RNA 개시자와 혼성화시키며; (f) RNA 개시자를 RNA 폴리머라아제로 확장시켜, 사슬 종결자를 포함하는 상보적 뉴클레오티드를 혼입하고, 효소 결합 부위로부터 전위하거나 표적 서열로부터 분리하지 않으면서 불완전 올리고뉴클레오티드 산물을 방출함으로써, 폴리머라아제가 표적 부위에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 산물을 반복적으로 합성하도록 하는 것을 포함할 수 있다.
다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체는 질량분석법으로 급속히 검출 및 정량화될 수 있다. 예를 들어, 표 1a 및 1b, 실시예 2에 나와 있는 바와 같이, 질량분석법은 임의의 트리뉴클레오티드를 구별할 수 있다. 트리뉴클레오티드 간의 차이는 금속 이온, 동위원소 또는 기타 분자를 포함한, 표지의 사용에 의해 현저하게 될 수 있다. 트리뉴클레오티드에 상응하는 피크 아래의 적분 면적은 트리뉴클레오티드의 (절대 또는 상대적 측면에서의) 양을 가리킬 것이다. 마지막으로, 샘플은 거의 실시간의로 분석될 수 있다. 이에 따라, 샘플은 불완전 전사에 적용될 수 있고, 실시간에 가깝게 결과가 표적 분자, 그것의 존재비, 및 어떠한 종의 올리고뉴클레오티드 전사체가 생성되었는지의 여부를 결정함에 의한 표적 분자의 성질을 가리키도록 해석된다.
다중화
본 발명의 방법은 한 번에 단일 유형의 불완전 전사 반응에 제한되지 않으나, 한 번에 다중 반응을 동시에 수행하는 것, 즉 다중화도 또한 포함한다. 즉, 다중 상이한 압스크립션 반응들이 단일 샘플에서 동시에 일어날 수 있다.
다중화는 수많은 이점들을 가진다. 다중 검출가능한 신호의 존재는 감도를 증가시킨다. 특이성은 또한 다중 검출가능한 신호의 사용에 의해 증가된다. 예를 들어, 4개의 프로브가 사용될 경우, 4개의 상이한 불완전 전사 산물이 수득될 것이다. 4개의 압스크립션 산물의 존재를 검출하는 것은 대상 표적 분자의 존재를 확인할 것이며, 반면 단 1개의 압스크립션 산물의 검출은 가양성 반응으로 간주될 수 있다.
한 구현예에서, 동일한 대상 표적 분자 상에 다중화가 수행된다. 한 구현예에서, 표적 핵산으로부터의 DNA의 상이한 구획에 대해 각기 특이적인 다중 TSP가 사용된다. 다른 한 구현예에서, 상이한 APC 또는 APC-덴드리머 착체에 각기 결합된 상이한 DNA 프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 허용된다. 다른 한 구현예에서, 상이한 APC 또는 APC-덴드리머 착체에 각기 결합된 상이한 항체가 사용된다. 압스크립션 반응이 수행될 때, 그것은 상이한 유형의 APC가 존재함에 따라 많은 유형의 신호들을 발생시킬 것이다. 수득된 다중 신호는 예를 들어 질량 분석법에 의해 조사된다.
일부 구현예들에서, 대상 표적 분자의 혼합 집단을 포함하는 샘플에 대해 다중 구분 반응들이 수행된다. 한 구현예에서, 샘플은 각 병원에 대해 독특한 DNA의 구획에 특이적인 개별 TSP에 의해 각기 검출될 수 있는 관심 다중 병원체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 병원체는 표적 병원체로부터의 서열 또는 항원에 대해 특이적인 핵산 프로브 또는 항체에 연결된 APC (또는 APC-덴드리머 착체)에 의해 검출될 수 있다. 다중화에 의해, 일정 범위의 상이한 표적 분자가 증가된 속도로, 또한 개별적으로 각 표적 분자를 검출함에 의해 수득되는 비용보다 낮은 비용으로 동시에 검출될 수 있다.
일부 다른 구현예들에서, 다중 반응은 각 표적 분자가 하나 이상의 불완전 전사 반응에 의해 검출되는, 다중 표적 분자의 검출을 포함할 수 있다.
추가 신호 증폭
불완전 반복적 전사의 산물은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 한 구현예에서, 산물에 추가 직접적 증폭을 적용한다. 다른 한 구현예에서, 산물을 신호 증폭 캐스케이드에 도입하여, 표적 분자의 검출 감도를 증가시킨다.
한 신호 캐스케이드 구현예에서, 불완전 올리고뉴클레오티드 전사체가 바이오틴으로 표지되고; 이어서, 그러한 바이오틴-표지된 분자는, 예를 들어 검출가능한 신호(예컨대, HRP)를 생성시키는 효소에 커플링된 아비딘으로 검출될 수 있다. 다른 한 구현예에서, 아비딘은 APC 또는 APC-덴드리머 착체에 결합될 수 있고, 이로부터 추가 불완전 올리고뉴클레오티드 전사체가 합성될 수 있다.
다른 한 구현예에서, 불완전 올리고뉴클레오티드 전사체는 후속 반응에서의 시약, 예컨대 전사 반응에서의 개시자 또는 PCR 반응을 위한 프라이머로서 사용된다.
불완전 합성 및 검출 방법의 용도
본 발명의 방법은 특정 유전자의 메틸화 상태의 평가, 공지 유전적 변이체의 존재의 검출, 병원체성 유기체의 존재의 검출, mRNA 발현 수준의 검출 및 단백질의 검출을 비제한적으로 포함하는 다양한 진단적 및 분석적 영역들에서 사용될 수 있다. 형광법, 방사성동위원소 또는 기타 방법을 통하지 않고, 질량분석법을 사용하여, 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체를 검출한다. 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체를 생성시키기 위한 방법 및 그것의 용도가 설명적이나 비제한적인 목적을 위해 본원에 단지 요약되어 있다. 그러한 방법에 관한 부가적 상세내용은 WO 03/038042 및 U.S. 특허출원 공개 No. US-2003-0099950에서 찾아볼 수 있다.
DNA 메틸화
본 발명의 방법은 특별한 질병 상태와 연관된 것으로 알려진 특정 유전자 및 그것의 제어 영역의 메틸화 상태를 평가함으로서 질병 개시 및 진전과 연관된 비유전적 변화를 검출하는 진단적 검정에 사용될 수 있다. DNA 메틸화는 DNA 서열의 코딩 기능을 변경시키지 않으면서, 그 DNA의 성질을 변경시키기 위한 한 세포 메커니즘이다. CpG 메틸화는 잠재적으로 암 진단의 강력한 마커이고, 또한 유전자 임프린팅, 전이 요소의 불활성화 및 여성의 X-염색체의 불활성화와 연관될 수도 있다. 디뉴클레오티드 서열 CpG 내의 C에 대해 인간 게놈의 DNA 메틸화가 가장 빈번하다.
이에 따라, 한 구현예에서, 본 발명의 방법은 변경된 메틸화 상태 및 패턴을 검출할 수 있는, 진단적 기법을 제공함으로써, 질병 개시, 진전, 전이, 재발, 및 치료법에 대한 임의의 반응을 모니터하기 위해 사용될 수 있다. DNA 단편 내의 메틸화 사이토신 잔기는 예를 들어, 탈아민화제, 예컨대 나트륨 비술파이트에 의한 탈아민화에 대한 그 잔기의 내성을 기초로 하여 검출될 수 있다. 도 5에 도시되어 있는 바와 같이, 변성 (즉, 단일-가닥의) DNA가 나트륨 비술파이트와 같은 탈아민화제에 노출될 때, 비메틸화 사이토신(C) 잔기는 우라실 잔기(U)로 전환되고, 한편 메틸화 사이토신 잔기(5-mCyt)은 변화되지 않은 채 남아, 그것의 상보적 염기-쌍 파트너를 구아닌에서(G) 아데노신(A)으로 변화시킨다. 그러나, 메틸화 사이토신(5-mCyt)은 G에 대해 염기-쌍 특이성을 보유한다. 상기 측면에서, 비변경된 CpG 부위의 상대적 수준을 측정함으로써, 표적 DNA 서열 내의 CpG 섬의 메틸화 수준이 결정될 수 있다.
다른 한 구현예에서, 도 6에 다이어그램으로 도시된 바와 같이, 표적 DNA 서열을 예를 들어, 나트륨 비술파이트로 처리하는 것 등에 의해, 표적 DNA 서열이 탈아민화된 후에, 표적 부위 프로브가 사용되어, 표적 DNA 서열 상에 표적 CpG 부위를 포함하는 버블 착체를 형성할 수 있다. 이 구현예에서, 표적 부위 프로브가 사용되어, 표적 DNA 서열 상의 단일-가닥의 버블 영역과 하류 이중선 영역의 접합부에 표적 CpG 부위를 위치시킴으로써, RNA 폴리머라아제를 표적 CpG 부위에 지정한다. 설명된 구현예에서, 표적 부위 프로브는 약 18-54 뉴클레오티드를 포함한다: 표적 부위에 상류에 있는 표적 DNA 서열에 혼성화하는 제1 영역은 약 5-20 뉴클레오티드를 포함하고; 염기-쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 내부 제2 영역은 약 8-14 뉴클레오티드를 포함하며; 표적 부위의 하류에 있는 표적 DNA 서열에 혼성화하는 제3 영역은 약 5-20 뉴클레오티드를 포함한다. 표적 부위 프로브는 DNA 표적 서열이 RNA 폴리머라아제 및 적당한 RNA 개시자와 함께 인큐베이션하기 전 또는 중에, 표적 DNA 서열에 혼성화될 수 있다. 폴리머라아제는 RNA 개시자에 연합하고, DNA 주형 상의 CpG 부위에서 전사 및 RNA 합성을 개시한다. 폴리머라아제는 개시자를 확장시켜, 적당한 사슬 종결자의 혼입을 통해 불완전 올리고뉴클레오티드 전사체를 합성한다. 개시자 및 사슬 종결 뉴클레오티드 중 하나 또는 양자 모두가 변형될 수 있다.
다른 한 구현예에서, 포착 프로브는 관심 유전자를 포착하기 위해 설계될 수 있고, 불완전 전사 개시는 요망되는 유전자의 메틸화 현황을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 각 관심 유전자는, 관심 유전자에 대해 독특한 포착 서열에 혼성화함으로써, 샘플로부터 제거될 수 있다.
유전적 변이체
본 발명의 다른 한 측면에서, 본원에 개시된 방법을 총 염색체 재배치, 또는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 변경, 치환, 삽입 또는 결실의 형태의 변이체를 검출하는 진단적 검정에 사용될 수 있다.
병원체성 유기체
본 발명의 다른 한 측면에서, 본원에 개시된 방법은, 특별한 핵산(DNA 또는 RNA)의 존재를 검출함으로써, 유전자를 배양할 필요없이 특별한 유전자의 유전형화를 허용하거나 그 유전자를 포함하는 특별하거나 총칭의 유기체의 존재를 가리키는 작용을 하는, 진단적 검정에 사용될 수 있다. 시험 샘플은 특별한 미생물, 예컨대 세균류, 효모, 바이러스류, 비로이드, 사상균, 진균류 등으로부터의 표적 핵산 서열을 포함하는 것으로 추정될 수 있다. 시험 샘플은 동물, 식물 또는 인간 조직, 혈액, 침, 정액, 소변, 혈청, 뇌 또는 척수액, 흉막액, 림프, 유방 세척으로부터의 유체, 점액 분비물, 동물 고체, 대변, 미생물 배양액, 액체 및 고체 식품 및 사료-산물, 폐기물, 화장품, 공기 및 물을 비제한적으로 포함하는 다양한 출처로부터 수집될 수 있다.
일부 구현예들에서, 표적 병원체 폴리뉴클레오티드에 대해 서열-특이적인 올리고뉴클레오티드 포착 프로브는 고체 매트릭스에 결합된다. 시험 샘플 내에 존재하는 표적 병원체 폴리뉴클레오티드는 포착 프로브에 혼성화되고, 이어서 세척을 행하여, 포착 프로브에 의해 고정화되지 않은 시험 샘플의 임의 성분들을 제거한다. 표적 DNA 또는 RNA는 예를 들어, 프라이머 확장을 통한 특정 서열의 부가에 의해 회수될 수 있다. 한 구현예에서, 포착된 표적 병원체 폴리뉴클레오티드는 불완전 프로모터 카세트(APC)와 혼성화된다. APC 링커 서열은 (포착 프로브와 역평행 혼성체를 발생시키기 위해 필요한 배양에 따라) 그것의 3' 또는 5' 말단 상에 단일-가닥의 오버행 영역을 포함한다. 즉, APC 링커는 포착된 표적 병원체 폴리뉴클레오티드의 자유 말단 상의 서열에 대해 상보적이고, 이로써 APC 링커가 표적 병원체 폴리뉴클레오티드에 혼성화되도록 한다. 이어서, 불완전 전사를 본원에 기재된 바대로 수행하여, 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체를 발생시키고, 이를 이어서 질량분석법으로 검출한다.
그러므로, 병원체의 존재를 검출하기 위한 한 설명적 절차(도 8)는 (a) 임의적으로, 표적 병원체 폴리뉴클레오티드와 혼성화하도록 설계된 포착 프로브를 고정화하고; (b) 임의적으로, 표적 병원체 폴리뉴클레오티드를 잠재적으로 포함하는 시험 샘플과 혼성화하며[여기에서, 표적 핵산은 (RNA 병원체에 대한) 역전사 또는 (DNA 병원체에 대한) 프라이머 확장을 통해 DNA에 복사될 수 있다. 양 경우 모두에서, 불완전 프로모터 카세트(APC) 링커에 상응하는 DNA 서열이 표적 복사체에 첨가될 것임(도 1)]; (c) 임의적으로 포착된 표적 병원체 폴리뉴클레오티드를 세척하여, 시험 샘플의 임의의 혼성화된 성분들을 제거하고; (d) 포착된 표적 병원체 폴리뉴클레오티드를 불완전 프로모터 카세트와 혼성화하며; (e) 폴리머라아제에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드 산물의 검출이 가능하도록, 개시자, 및 사슬 종결자를 포함하는 뉴클레오티드 중 하나 이상을 변형시키며; (f) 불완전 프로모터 카세트를 개시자와 혼성화하고; (g) 개시자를 폴리머라아제로 확장시켜, 사슬 종결자를 포함하는 상보적 뉴클레오티드를 혼입하고, 효소 결합 부위로부터 전위하거나 APC로부터 분리되지 않도록 하면서 불완전 올리고뉴클레오티드 산물을 방출시킴에 의해, 표적 부위에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 산물을 폴리머라아제가 반복적으로 합성하도록 하며; (h) 질량분석법을 이용하여 다중 불완전 올리고뉴클레오티드 산물을 검출하고, 임의적으로 정량화하는 것을 포함할 수 있다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 질량분석법을 이용하여 시험 샘플 내의 병원체의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 방법은 (a) 상기 시험 샘플 내의 표적 병원체 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을, 폴리머라아제에 의한 전사에 의해 검출될 수 있는 영역을 포함하는 인공 프로모터 카세트에 결합시키고; (b) 상기 APC-태그된 표적 분자를 개시자, RNA-폴리머라아제, 신장자 및/또는 종결자와 함께 인큐베이션하며;(c) APC의 개시 부위에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 전사체를 합성하고(여기에서, 상기 개시자는 전사가 종결되고 올리고뉴클레오티드가 방출될 때까지 확장됨으로써, 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체를 합성함); (d) 질량분석법을 이용하여 상기 시험 샘플로부터 합성된, 상기 반복적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 전사체를 검출 또는 정량화함으로써 병원체의 존재를 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 한 측면에서, 본 발명은 포착 프로브 및 질량분석법을 이용하여 시험 샘플 내의 병원체를 검출하는 방법을 제공한다. 방법은 (a) 상기 시험 샘플 내의 표적 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 상호 작용하도록 설계된 포착 프로브를 고정화하고; (b) 상기 포착 프로브를, 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 잠재적으로 포함하는 시험 샘플과 혼합하며; (c) 상기 시험 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드를, 표적 병원체 폴리뉴클레오티드와 상호 작용하는 영역, 및 폴리머라아제에 의한 전사에 의해 검출될 수 있는 영역을 포함하는 인공 프로모터 카세트에 결합시키고; (d) 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 RNA-폴리머라아제, 개시자, 신장자 및/또는 종결자와 함께 인큐베이션하며; (e) APC의 상기 개시 전사 개시 부위에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 전사체를 합성하고(여기에서, 상기 개시자는 전사가 종결되고 올리고뉴클레오티드가 방출될 때까지 확장됨으로써, 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체를 합성함); (f) 질량분석법을 이용하여 상기 반복적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 전사체를 검출 또는 정량화함으로써 병원체의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 병원체성 핵산 및 단백질의 존재 또는 부재를 모니터하기 위해 특히 유용하다. 본 발명은 병원체성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련된 질병 및/또는 장애를 검출, 진단 및 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 이상 발현의 검출을 제공한다. 방법은 (a) 상기 기재된 불완전 개시 전사의 방법을 이용하여, 개인의 세포, 조직 또는 체액 내의 관심 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 검정하고, (b) 유전자 발현의 수준, 단백질 발현, 또는 표준 유전자를 갖는 관심 서열의 존재, 또는 단백질 발현 수준 또는 관심 서열을 비교하고, 이로써 표준 수준 대비의 검정된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 수준의 증가 또는 감소는 관심 병원체의 존재를 가리키는 이상 발현을 나타내도록 하는 것을 포함한다.
개인으로부터의 생체검사된 조직 또는 체액 내의 전사체의 비정상적 양의 존재는, 실제 임상 증상이 나타나기 전에 질병을 검출하는 수단을 제공할 수 있다. 이 유형의 보다 명확한 진단은 보건 전문가들이 보다 조기에 예방적 수단 도는 공격적 치료를 이용할 수 있도록 함으로써, 병원체에 의해 유발된 질병이 발달하거나 더 진전되지 않도록 막을 수 있도로 한다.
본 발명은 E. 콜라이, 스트렙토코쿠스, 바실러스, 마이코박테리움, HIV 및 간염을 비제한적으로 포함하는 병원체성 유기체의 존재를 모니터하기 위해 특히 유용하다.
본 발명의 방법은 수성 유체, 특히 물(예컨대, 마시는 물 또는 수영하거나 목욕하는 물), 또는 기타 수용액(예컨대, 발효액, 및 세포 배양에 사용되는 용액), 또는 기체, 및 통기 에어와 같은 기체들의 혼합물, 및 표면에서 입상물을 살포, 퍼징 또는 제거하기 위해 사용되는 기체에서 병원체성 미생물에 대해 시험하기 위해 사용될 수 있다. 집, 학교, 교실, 작업장, 비행기, 우주항공기, 차, 기차, 버스, 및 사람들이 모이는 임의의 기타 건물 또는 구조물을 비제한적으로 포함하는 임의의 원으로부터의 통기 에어가 병원체성 미생물의 존재에 대해 시험될 수 있다.
mRNA 발현
본 발명의 다른 한 측면에서, 본원에 개시된 방법은 정량적 또는 비정량적 방식으로 메신저 RNA(mRNA) 발현 수준을 검출하는 진단적 검정에 사용될 수 있다.
단백질 검출
본 발명의 다른 한 측면에서, 본원에 개시된 방법은 단백질을 검출하는 진단적 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 불완전 프로모터 카세트 링커는 단백질 변형자 기가 결합되도록 제조되어, APC를 단백질에 연결시키는데 사용될 수 있다. 적당한 단백질은 항체, 결합 단백질, 아비딘, 신호전달 분자, 단백질 A 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예들에서, APC는 관심 표적 단백질 분자에 대해 특이적인 항체에 연결된다. 항체가 관심 표적 단백질 분자에 결합되고, 결합된 APC가 사용되어 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체가 생성되고, 이는 이어서 질량분석법으로 검출된다. APC를 표적 분자에 대해 특이적 항체 또는 기타 단백질에 연결시킴으로써, 이 방법은 또한 관심 비단백질성 표적 분자과 함께 사용될 수 있다.
질병 검출
본 발명은 DNA 메틸화, 유전적 변이, mRNA 발현 패턴 및 단백질 발현 패턴의 현황을 모니터함으로써 동물에 있어 질병을 검출하기 위해 유용하다. 본 발명은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 및/또는 장애를 검출, 진단 및 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 이상 발현, 변이의 존재, 및 DNA의 메틸화 현황의 변화의 검출을 제공한다. 본 발명의 진단적 검정은 알츠하이머씨병, 근육이영양증, 암, 유방암, 결장암, 낭포성 섬유증, 취약성 X 염색체 증후군, 혈우병 A 및 B, 케니디병, 난소암, 폐암, 전립선암, 망막모세포종, 근육긴장성 장애, 테이 삭스병, 윌슨병, 및 윌리엄스병을 비제한적으로 포함하는 임의의 질병의 진단 및 예후를 위해 사용될 수 있다. 이 검정들은 모든 유형의 암들의 진단 및 예후에 특히 유용한 것으로 믿어진다.
키트
일부 구현예들에서, 본 발명은 키트이다. 한 구현예에서, 키트는 APC를 대상 표적 분자에 대한 특이성을 갖는 분자(예컨대, 핵산 또는 항체)에 커플링하기 위한 링커를 갖는 불완전 프로모터 카세트를 포함하는 바이얼을 포함한다. 다른 한 구현예에서, 키트는 덴드리머, APC 및 커플링 시약을 포함한다. 다른 한 구현예에서, 덴드리머는 APC에 커플링된다. 다른 바이얼은 상기 커플링을 행하기에 적당한 시약을 포함한다. 키트는 또한 폴리머라아제, APC에 적당한 개시자, 및 불완전 전사에 적당한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
검출 장치
불완전 전사 기술은 대상 표적 분자의 존재를 빠르고 휴대가능한 방식으로 검출할 수 있도록 장치 내에 혼입될 수 있다. 그러한 장치는 샘플이 한 포트에서 장치에 부가될 수 있고, 올리고뉴클레오티드 전사체가 제2 포트에서 수득된 후, 질량분석기에 공급되도록 하는 반응 성분이 혼입된 미세유동 장치일 수 있다. 일부 구현예들에서, 단일 장치는 한 단일 장치 내에 샘플 수집, 불완전 전사 반응 및 질량분석 검출을 결합할 수 있다.
하기 실시예는 제한하고자 함이 아닌, 단지 설명하기 위한 목적으로 제공된다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 얻기 위해 변화되거나 변형될 수 있는 다양한 비임계적 파라미터들을 용이하게 인식할 것이다. 예를 들어, 인용된 개별 작용들은 본원에 제시된 순서에 반드시 제한될 필요가 없을 수 있다.
실시예 1
RNA 폴리머라아제를 이용한 RNA 프라이머-개시 불완전 전사
반응 조건을 불완전 전사 개시를 위해 최적화하였다. 완충액 T의 성분 및 농도는 불완전 전사 개시를 촉진한다. 완충액 T는 20 mM 트리스-HCl pH 7.9, 5 mM MgCl2, 5 mM 베타-메르캅토에탄올, 2.8%(v/v) 글리세롤로 이루어진다. 프라이머는 0.2 내지 1.3 mM 농도 범위의 리보뉴클레오시드-삼인산염(NTP) 또는 디뉴클레오티드이다. 최종 NTP 농도 범위는 0.2 내지 1.3 mM이다. 농도의 상한치는 예비 불완전 전사를 위해 설계된다. 주형 DNA 농도는 인산염의 측면에서 2 μM 미만이다. E. 콜라이 RNA 폴리머라아제를 15 nM 내지 400 nM의 최종 농도로 첨가한다. 전효소 또는 코어는 단일-가닥의 주형 DNA와 함께 사용될 수 있다. 효모 무기 파이로포스파타제를 예비 반응에서 1 단위/ml로 첨가하여, 파이로인산염의 축적을 막는다. 높은 농도에서 파이로인산염은 RNA 폴리머라아제가 RNA 산물을 희생하여 NTP를 재생하도록 하는 합성 반응을 반전시킬 수 있다. 파이로포스파타제의 한 단위는 25℃ 및 pH 7.2에서 분당, 1.0 μM의 무기 오르토인산염을 자유화하는 효소의 양으로 정의된다. 예비 반응을 위해, 반응물을 72시간 이하 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 이 조건들은 대표적인 것으로서; 특정 주형들에 대해 특별한 성분 및 농도의 최적화로 불완전 개시의 효율을 증진시킬 수 있다.
이 실시예에는 3개의 상이한 개시자, 즉 (1) TAMARA-ApG; (2) 바이오틴 ApG; 및 (3) ApG가 사용된다. 표적 핵산 주형을 95℃에서 5분간 비등시킨 직후, 얼음 위에 둠으로써 변성시킨다. 각 반응물은 다음과 같이 제조된다:
5.0 ㎕의 1X 완충액 T
2.5 ㎕의 a-32P-UTP
14.3 ㎕의 ddH20
1 ㎕의 E. 콜라이 RNA 폴리머라아제(lU/㎕)
100 ng(2 ㎕)의 주형 DNA
10 nmole(1.2 ㎕)의 개시자
22.8 ㎕의 반응 완충액
12 내지 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션함. 샘플을 질량분석법에 적용하고, TAMARA-ApG; 바이오틴 ApG; ApG, 및 이의 분해 산물의 분자량에 상응하는 수득된 피크를 사용하여, 표적 분자의 존재를 결정한다. 종의 존재를 또한 당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 박막 크로마토그래피로써 확인하여, 제3 위치에서의 UTP의 혼입 정도를 결정할 수 있다.
실시예 2
표지 종결자를 이용한 불완전 개시 반응
표지 개시자 및/또는 표지 종결자를 이용하여 불완전 전사 개시 반응을 수행한다. 하기 반응 조건을 사용하여, 표지 종결자를 혼입한다:
5 ㎕의 1X 완충액 T
3 ㎕의 100 ng 변성 DNA 주형(pBR322)
13.5 ㎕의 ddH20
1 ㎕의 E. 콜라이 RNA 폴리머라아제
1.2 ㎕의 디뉴클레오티드 개시자 ApG
1.5 ㎕의 7 mM SF-UTP
혼합물을 온도 제어 미적정판 리더에서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 박막 크로마토그래피를 수행함으로써, 표지 트리뉴클레오티드 ApGpU가 발생되었음을 입증한다. 샘플을 질량분석법으로 조사하여, 트리뉴클레오티드 ApGpU가 생성되었음을 결정한다. 표 1에서 예측되는 바와 같이, 질량분석법은 트리뉴클레오티드 종들 간을 바로 구분할 수 있어야 한다.
질량분석법을 통한 검출은 리포터 태그된 리보뉴클레오티드 유사체 필요없이, 다중 표적 분자 또는 표적 서열의 동시 검출을 허용한다. 표 1(a)은 상이한 MW를 갖는 20개 트리뉴클레오티드를 나타낸다. 표 1(b)는 분자량에 의해 분류된 동일한 20개 트리뉴클레오티드를 나타낸다. 또한, 리포터-태그된 개시 및/또는 종결자 뉴클레오티드를 이용함으로써, 다중화가 또한 달성될 수 있다.
Figure 112006038069477-PCT00002
Figure 112006038069477-PCT00003
실시예 3
E. 콜라이 RNA 폴리머라아제 전효소를 이용한 RNA 프라이머-개시 불완전 전사
E. 콜라이 RNA 폴리머라아제 전효소는 프로모터 서열이 결핍된 단일-가닥의 DNA 분자로부터 전사를 개시할 수 있다. E. 콜라이 RNA 폴리머라아제 전효소(1.9 pmole/반응물)를 이용하여 변성 폴리[dG-dC](10 μg/25㎕ 반응)를 전사한다. 디뉴클레오티드 GpC로 불완전 전사를 개시한다. GTP는 프라이머를 신장하기 위해 이용가능한 단독 뉴클레오시드-삼인산염이다. 주형 가닥(CTP)에 의해 코딩된 다른 뉴클레오시드-삼인산염은 생략된다. 트리뉴클레오티드 산물 GpCpG의 존재가 GTP 농도에 의존하는 것과, 검출가능한 산물이 하나의 크기인 것(이는 CTP의 생략이 트리뉴클레오티드 산물의 형성 후 전사를 효과적으로 종결하였음을 제시함)을 가리키는 질량분석법을 수행한다.
E. 콜라이 RNA 폴리머라아제 전효소는 부분 상보적 비주형 파트너가 결핍된 주형 가닥 상의 버블 착체 기질을 강하게 선호할 것이다. 상응 단일 주형 가닥과 대비되는, DNA 버블 착체와 함께 E. 콜라이 RNA 폴리머라아제 전효소에 의한 상대적 전사 활성을 결정하고, 이는 RNA 폴리머라아제가 동등 몰량의 주형 가닥만이 단독으로 제공될 때보다 버블 착체 1로 70-배 더 높은 수준의 활성을 나타냄을 보여준다. T7 RNA 폴리머라아제의 버블 착체 DNA에 대한 선호를 조사하는 실험에서도 유사한 결과가 수득될 것이다.
다양한 프로모터 인식 성질을 갖는 RNA 폴리머라아제는 불완전 전사를 위한 기질로서 버블 착체 1을 사용하는 것으로 나타났다. 본 실험에서, 버블 착체 1을 E. 콜라이 전효소, E. 콜라이 코어 RNA 폴리머라아제, 파지 T7 및 파지 SP6 RNA 폴리머라아제와 함께 인큐베이션한다. E. 콜라이 전효소 및 E. 콜라이 코어 폴리머라아제를 위한 반응 완충액은 150 mM Na-아세테이트를 포함한다. Na-아세테이트는 T7 및 SP6 반응에서 생략되며, 이는 높은 염 농도가 이 효소들을 억제하기 때문이다. 모든 반응물은 20 mM HEPES pH 8 완충액, 10 mM MgCl2 및 2 mM DTT를 포함한다. 개시자 ApA 및 UTP는 각기 모든 반응물들 중 1 mM로 제공된다. E. 콜라이 전효소는 E. 콜라이 코어 폴리머라아제보다 약 2-배 더 많은 산물을, 또한 T7 및 SP6 폴리머라아제보다는 폴리머라아제 당 약 10-배 더 많은 산물을 생성시킬 것으로 예측된다.
방사능 전구체를 이용한 프라이머-개시 불완전 전사, 및 자가방사법 검출에 기초하는 검정의 감도.
프라이머-개시 불완전 전사 반응에 기초하는 검출 검정의 감도는 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 버블 착체 1의 최소량을 한정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 버블 착체 1의 양을 감소시키면서(10 펨토몰 -1 젭토몰/25 ㎕ 반응), 일련의 불완전 전사 반응들을 수행할 수 있다. ApA 및 방사능 UTP로 전사를 개시한다. UTP는 트리뉴클레오티드 ApApU에 대해 산물을 제한하기 위해 반응에 포함되는 단독의 뉴클레오시드 삼인산염이다. 질량분석법을 이용하여, 각 전사 반응에 대한 시간 경로를 수행한다. 3시간 동안의 RNA 폴리머라아제 불완전 전사 반응 후에, 10 펨토몰의 버블 착체로부터의 신호가 명료하게 검출가능할 것이며, 1 펨토몰의 버블 착체로부터의 희미한 신호는 질량분석법을 통해 식별가능하다. 24시간의 전사 후에, 100 애토몰(attomole)의 버블 착체 1로부터의 ApApU 신호가 검출가능하다.
실시예 4
역상 HPLC/전자분무 이온화 질량분석법에 의한 불완전 전사 산물(압스크립트)의 정량화를 위한 프로토콜
전자분무 이온화 질량분석법(ESI-MS)에 의한 압스크립트의 검출은 반응 용액 내에 존재하는 다른 염 및 이온으로부터 압스크립트를 분리할 것을 필요로 한다. 이러한 분리 없이, 이온 억제는 압스크립트의 검출을 막는다. 이 프로토콜은 표준 압스크립션 반응으로부터 발생된 압스크립트의 검출 및 정량화를 위해 사용된 크로마토그래피 및 ESI-MS 설정을 설명한다. 프로토콜은 정상적 용액 압스크립션 반응과 함께 사용하기 위한 표준 및 샘플 제제의 예, 및 압스크립션 반응에서 발생된 압스크립트의 정량화를 위한 발생 데이터를 처리하는 법을 포함한다. 당업자는 상이한 조건에 사용하기 위해 프로토콜을 더욱 변형 및 적합화할 수 있다.
HPLC
PC에서 매스린크스(MassLynx) 소프트웨어로 제어되는 워터스 얼라이언스(Waters Alliance) 2795 분리 모듈.
워터스 아틀란티스(Waters Atlantis) C18 칼럼: 2.1×30 mm, 300 μm 입자 크기
HPLC용 아세토니트릴 및 물
구배 조건:
유동 속도 = 0.4 mL/min.
용매 A = 물
용매 B = 아세토니트릴
0.00 분 0% B 100% A
3.00 분 7.5 % B 92.5% 선형 증가
3.10 분 80% B 20% 선형 증가
4.00 80% B 20% 중단
다음 런(운용) 전에 출발 조건에서의 1 분간의 재평형화
주입 체적: 10 ㎕
ESI-MS
중심 데이터 수집을 이용하는, PC에서 매스린크스) 소프트웨어로 제어되는 음이온 V-방식의, 워터스/마이크로매스(Micromass) LCT 프리미어(Premier) ESI-MS w/록스프레이(Lockspray) 부착 런. 질소 발생기(피크 사이언티픽(Peak Scientific), NM30LA)에 의해 공급되는 고순도 N2 기체, 록스프레이 기준 질량 표준으로 사용하기 위한 류신 엔케팔린(1 ng/mL). HPLC 칼럼으로부터의 유출물을 MS 소스로 비분리 도입한다.
ESI-MS 소스 설정:
모세관 전압: 2700
샘플 콘: 50
탈용매화 기체 온도: 300℃
소스 온도: 100℃
탈용매화 기체 유동: 400
콘 기체 유동: 0
록스프레이 유동 속도: 4 ㎕/분
ESI-MS 이온 가이드 설정:
이온 가이드 1 5.0
개구 1 5.0
이온 에너지 105.0
개구 2 4.0
헥사폴 DC 6.0
개구 3 4.0
가속화 200.0
Y 초점 3.0
조종 0.2
관 렌즈 200.0
감소된 Z-초점 500.0
정상 Z 초점 65.0
ESI-MS 푸셔(pusher), 비행관, 및 검출기 셋팅
TOF 비행관 5630.0
리프렉트론 1780.0
푸셔 820.0
푸셔 오프셋 -0.2
풀러(puller) 720.0
풀러 오프셋 0.0
MCP 검출기 2700.0
푸셔 주파수 29,411.76 Hz
표준 및 샘플 제제
IDT 이중 완충액:
30 mM HEPES
100 mM 아세트산칼륨
pH 7.5
이중 완충액 중 5 mM의, 다마콘 인코포레이티드(Dharmacon, Inc.)로부터 구매된 RNA 트리뉴클레오티드 표준
5X 버블 완충액
100 mM HEPES, pH 8
50 mM MgCl2
0.5 mM EDTA
40 mM 스페르미딘
5 mM DTT
750 mM 아세트산나트륨
150 μg/mL 아세틸화 BSA
14% 글리세롤
(뉴클레아제-비포함 물 중)
리보메이커(Ribomaker) 폴리머라아제(883 fmol/㎕)
50 fmol/㎕의 APC 버블
이중 완충액 중 5 mM의 적절한 NpN 개시자
이중 완충액 중 5 mM의 적절한 NTP
표준 제제:
1X 버블 완충액의 매트릭스 중 0.5, 1, 5, 10, 50 및 100 μM의 트리뉴클레오티드 농도, 70.6 fmol/㎕ 리보메이커 폴리머라아제, 8 fmol/㎕ APC 버블, 1 mM 적절한 NTP, 및 1 mM 적절한 NpN 개시자를 이용하여 20 ㎕ 용액을 제조하였다. 표준 용액을 빙상에서 또는 4℃에서 냉장시켜, 모든 압스크립션 발생을 막는다. 대안적으로, 용액 중 개시자/NTP 조합으로부터 압스크립트를 발생시키지 않는 APC 버블을 또한 사용할 수도 있다.
샘플 제제:
본원에 다른 부분에서 상세하게 설명된 바와 같이 압스크립션 프로토콜을 수행하였다. 표준 및 평가 샘플을 HPLC용 물로 1/10로 희석하였고, 상기 열거된 HPLC/ESI-MS 조건을 이용하여, 운용하였다.
데이터 처리
평가하는 압스크립트에 대해 적절한 M/Z 값을 이용하여 크로마토그램을 발생시켰다. 이중 하전 신호의 사용은 일반적으로 보다 높은 감도를 가져올 것이다. 압스크립트 및 개시자는 2 내지 3 분의 체류 시간을 가진다. 디폴트 적분 파라미터를 이용하여, 크로마토그램을 적분하였다. 표준 제제로부터의 데이터를 직선으로 맞추어 표준 곡선을 발생시켰고, 이를 사용하여 압스크립션 반응 중 발생된 압스크립트의 농도를 계산하였다.
실시예 5
AAG 및 AUG 콘트롤의 질량분석법 검출
전자분무 이온화 질량분석기(ESI-MS)를 이용하여, 화학적으로 합성된 AAG 및 AUG 트리뉴클레오티드를 검출하였다.
재료:
AAG 및 AUG 트리뉴클레오티드
HPLC용 아세토니트릴(EM 사이언스(EM science)) 및 물(피셔(Fisher)).
아세트산트리에틸아민, pH 7
방법:
샘플을 10 ㎕/min으로 직접적 주입에 의해 MS에 도입하고, V-옵틱스(V-optics)를 이용하여 음이온 방식으로 평가하였다. 소스 조건: 2500 V 모세관, 35 V 콘, 150° 탈용매화 온도, 80° 소스, 550 L/min 탈용매화 유동. 10 ㎕ 샘플을 평가하였고, 이에 따라 스캔 간격을 0.1초로 하여, 일련의 1초 스캔으로 1분 동안 데이터를 습득하였다.
결과
50 pmol의 AAG 및 AUG 트리뉴클레오티드의 질량 스펙트럼이 도 18에 나와 있다. 모 이온이 AAG 및 AUG에 대해서는 936.9 Da 및 914.0 Da에서 관찰되었고, 사실상의 MW는 941.6 및 918.6인 것으로 예측된다. 양 경우 모두에서의 모 이온으로부터의 신호는 매우 약했으나, 이중 하전 이온으로부터의 신호는 더 강했다. 이 신호는 각기 468.3 및 456.8 Da에서의 모 이온의 질량의 반에서 일어난다. 도 19는 50, 5 및 0.5 pmol의 수준으로 AAG에 대한 스펙트럼을 나타낸다. 0.5 pmol에서 AAG가 검출가능하였다.
실시예 6.
RP-HPLC/MS에 의한 트리뉴클레오티드의 정량적 평가
역상 HPLC/질량분석법을 사용하여, 압스크립션 반응 혼합물 내에 현탁된 AAG의 스파이크 샘플 내의 트리뉴클레오티드 AAG, 및 (2) 사실상의 압스크립션 반응에 의해 발생된 AAG을 검출 및 정량화하였다.
실험 방법
재료:
아틀란티스 C18 칼럼: 2.1×30 mm, 300 μm 입자 크기
HPLC용 아세토니트릴(EM 사이언스) 및 물(피셔).
AAG 트리뉴클레오티드
버블 22(AAG 압스크립트 발생)
방법:
압스크립션
50, 35, 20 및 5 fmol/㎕의 스톡 버블 농도를 이용하여, 표준 프로토콜에 따라 압스크립션 반응을 운용시켰다.
압스크립션 혼합물:
물 2 ㎕
버블 완충액(5× 농축물) 2.5 ㎕
스톡 버블 용액 2 ㎕
압스크립타제(883 fmol/㎕) 1 ㎕
ApA(5 mM) 2.5 ㎕
GTP(5 mM) 2.5 ㎕
압스크립션 반응을 30 분간 45℃에서 운용한 후, LC/MS 상에 운용하기 전에 물로 20 ㎕에서 200 ㎕로 희석시켰다.
RP-HPLC/MS 조건
이동상:
성분 A: 물
성분 B: 아세토니트릴
구배 조건:
0 분 100% A
1.4 분 70% B로 선형 증가
7.0 분 70% B에서 유지
12 분 7분 후, 100% A로 즉시 전환하여, 5 분간 유지
유동 속도: 0. 2 mL/min
주입 체적: 10 ㎕
MS 조건:
모세관 전압: 2500
소스 전압: 35
탈용매화 온도: 180℃
소스 온도: 80℃
탈용매화 기체 유동 속도: 750 L/hr
V-방식의 런
샘플 런:
물 중에서 100, 70, 40 및 10 μM의 농도를 갖는 AAG 용액을 제조하였다. 이 샘플은 압스크립션 반응에서 통상 관찰되는 10% 내지 1% 범위의 전환을 두루 나타낸다. 상기 동일한 농도로, 단 압스크립션 시약의 정상적 농도를 포함하는 혼합물 내에서 AAG-스파이크 샘플을 제조하였다. 50, 35, 20 및 5 fmol/㎕의 버블 스톡 농도를 이용하여 압스크립션 반응을 셋업하였다. 주형 가닥만을 포함하는 네가티브 콘트롤도 또한 운용시켰다. 모든 샘플들을 운용 전에 물로 20 ㎕에서 200 ㎕로 희석시켰다.
결과
도 20A은 10 및 100 μM AAG로 스파이크된 2개 압스크립션 반응에서 발생된 질량 스펙트럼을 나타낸다. 양 경우 모두에서, 주된 신호가 반응 혼합물 내에 존재하는 1 mM ApA로부터의 593 Da에서 있다. 사용된 HPLC 조건은 도 20B에 나와 있는 바와 같은 AAG 및 ApA의 근접 동시 용리를 초래한다. 도 20A 및 20B는 반응으로부터 발생된 압스크립트의 양을 정량화하기 위해 사용되는 데이터의 2개의 상이한 도시를 나타낸다. 도 20A는 도 20B에 나와 있는 크로마토그래피 피크의 폭에 대해 요약된 개별 질량 스펙트럼으로부터 생기는 신호 강도 형태의 압스크립트의 양을 제시한다.
표 2는 상이한 공지량의 AAG와 수득된 신호 사이의 관계를 입증한다. 물 단독에서, 또한 압스크립션 반응과 동일한 용액 매트릭스에서 모두 샘플을 제조하였다. 3가지 정량 방법을 취하여, 데이터를 평가하였다:
1. MS 강도: 도 20B에 나와 있는 바와 같은, 크로마토그래피 피크를 포함하는 개별 스캔을 함께 요약하여, 도 20A에 나와 있는 바와 같은 단일 질량 스펙트럼을 수득하였으며, 이의 강도는 압스크립트의 양과 상관 관계가 있게 된다.
2. 피크 높이 및 3. 피크 면적: 표준 크로마토그래피법에 따라, AAG 신호의 크로마토그램은, 도 20B에서의 것과 마찬가지로, 피크 높이 또는 피크 면적에 의해 정량화될 수 있다.
공지량의 트리뉴클레오티드를 이용하여 용액으로부터 생성된 신호. 표의 마지막 행은 AAG 농도의 함수로서 플로팅된 관심 신호에 대한 최소자승법으로 정해진 선을 위한 결정 계수이다.
AAG 농도 (uM) 물 내 스크립션 반응물 내
MS 강도 피크 높이 피크 면적 MS 강도 피크 높이 피크 면적
10 40 70 100 1245 4121 6545 11442 3749 12470 18785 29863 499.62 1693.787 2672.618 4601.606 1359 4530 7629 10652 4265 14119 22735 30113 519.077 1799.24 3084.891 4239.686
R2 0.974 0.989 0.974 1 0.996 0.999
표 2는 3개의 정량적 방법 모두가 물 또는 압스크립션 반응 매트릭스에서 압스크립트에 대한 비교적 선형 반응을 나타냄을 입증한다. 성능 수준은, 표 2에서의 데이터를 발생시키는데 사용된 것들과 같은 스파이크 용액으로부터 발생된 적정 곡선이 비공지 샘플 내의 압스크립트의 농도를 결정하기 위해 정확히 사용될 수 있음을 가리킨다. 부가적 데이터 포인트 및 이중화를 또한 사용하여, 적적 곡선의 정확성을 증가시킬 수 있다.
이 방법에 따라, 표 2에서의 데이터로부터의 발생된 MS 강도, 피크 높이 및 피크 면적의 3가지 정량적 측정법에 대한 적정 곡선을 사용하여, 새 샘플 내의 압스크립트의 농도를 계산하였다. 수가지 기지 농도의 APC를 이용하는 반응들은 미지의 농도의 압스크립트를 포함하는 수개의 용액을 초래하였다. 상기 기재된 3가지 정량적 측정법 및 LC/MS 방법을 이용하여, 이 용액을 평가하였다. 기지 농도의 APC와 함께, 수득된 농도 값들을 사용하여, 시험 APC의 턴오버율을 계산하였다. 결과가 표 3에 제시되어 있고, 이는 APC의 증가량이 증가된 턴오버와 상관 관계가 있다는 것을 가리킨다. 그러나, 적정 곡선을 벗어난 샘플에 대해서는, 적정 고선으로부터의 외삽이 항상 일관된 턴오버율 계산을 가져오는 것은 아니었다(예컨대, 5 fmol/㎕ APC 농도 참고). 이 문제는 적정 곡선에서 더 큰 수 및 범위의 데이터 포인트에 의해 수정된다.
각종 양의 APC를 이용하여 압스크립션 반응에 의해 발생된 턴오버율의 검출 및 계산. 스파이크 반응으로부터의 데이터를 표준 곡선으로서 사용하여, 생성된 AAG의 양을 정량화하였고, 이 양을 턴오버 계산에 사용하였다.
버블 22 농도 (fmol/㎕) MS 강도 피크 높이 피크 면적 계산 턴오버율
MS 강도 피크 높이 피크 면적
5 20 35 50 467 1505 2934 4518 1251 4711 9571 14627 153.196 574.306 1204.808 1880.771 42 115 148 168 -110 98 157 183 25 112 154 176
주형 119 212 31.295 -10 -26 -10
R2 0.992 0.993 0.990
실시예 7.
다중 불완전 전사 반응
한 번에 다중 불완전 전사(압스크립션) 반응들을 동시 수행하는 능력, 즉 다중화가, 2개 APC를 포함하는 반응 혼합물 상에 입증되었다. 도 21에 나와 있는 2개의 APC, 버블 4 및 APC UC2361를 이 목적을 위해 선택하였다. 동일한 표적 부위 프로브(TSP), A192로, 단 상이한 주형 가닥(TEM), A197 또는 A56으로 양 불완전 프로모터 카세트 모두를 구축하였다. 버블 4에 대한 개시자는 ApA이고, UC2361에 대한 개시자는 UpC이며, 혼입 뉴클레오티드는 GTP이다. 버블 4로부터의 예상된 압스크립션 산물은 AAG이고, UC2361로부터의 예상된 압스크립션 산물은 UCG이며, 이들은 TLC 및 질량분석법에 의해 구분가능하다.
반응 성분들이 표 4에 열거되어 있다. 각 칼럼에 제시된 체적은 복제가 운용될 수 있도록 하는 2개 반응을 위한 것이다. 복제에 있어 각 반응을 수행하였다. 반응 당 최종 체적은 12.5 ㎕이었다. 반응 성분들을 표 4에 열거된 순서로 PCR 관에 조립하였다. 30분 동안 45℃에서 반응물을 인큐베이션하였고, 2 ㎕의 압스크립션 산물을 실리카 겔(Al-배킹) TLC 판 상에 스포팅하였다. TLC를 6:3:1의 이소프로판올:NH40H:H20의 용액 혼합물에서 전개한 후, 건조시켰다. 이어서, TLC 판을 20분 동안 형광체 영상기 스크린에 노출시키고, 스폿의 강도로부터 회전수(전사체/주형/분)를 계산하였다. 도 22는 TLC에 의한 혼합 APC 실험으로부터의 압스크립션 산물을 나타낸다. 레인 1-3은 버블 4(최종 100 fmol)을 가지고, ApA(레인 1), UpC(레인 2), ApA + UpC(레인 3)로 개시되었다. 레인 4-6은 버블 4(최종 100 fmol) 및 APCUC2361(100 fmol 최종)의 동몰 농도를 가지고, 그것들은 레인 4에서는 ApA로, 레인 5에서는 UpC로, 또한 레인 6에서는 ApA + UpC로 개시되었다. 레인 7-9는 APCUC2361(최종 100 fmol)을 가지고, UpC(레인 7), ApA(레인8) 및 ApA + UpC(레인 9)로 개시되었다. 레인 10은 ApA로 개시된 TEMA197이고, 레인 11은 UpC로 개시된 TEM A57이며, 레인 12는 개시자 ApA + UpC를 갖는 APC가 없는 콘트롤이다. 레인 13은 32P-GTP에 대한 콘트롤이다. 각각에 대한 개시자 농도는 최종 1 mM이었다.
이 실험에서, 각 압스크립션 반응은 상이한 주형 및 상이한 개시자를 사용하였으나, 양자 모두 GTP를 혼입한다. 결과는, 2개의 상이한 APC가 동일한 반응 혼합물 내에 존재하고, 다른 APC의 존재로 인해 하나의 압스크립션 반응의 억제가 없다는 것을 입증한다. 동일한 GTP 뉴클레오티드가 혼입될 경우에도(레인 4-6), APC들이 함께 혼합될 때, 총 턴오버의 상당한 증가가 없었다. APC와 함께 상호 작용하는 비적절 개시자를 가리킬 수 있는 부적절 혼입이 관찰되지 않았다(레인 2, 3, 6, 8 및 9).
Figure 112006038069477-PCT00004
실시예 8.
다중 불완전 전사 반응
상이한 압스크립트를 생성시키는 10개 APC가 발생되었다. 도 23은 다중 압스크립션 반응에 사용하기 위한, 상이한 조합의 올리고뉴클레오티드 가닥으로 된 10개의 불완전 프로모터 카세트를 도시한다.
도 23에 나와 있는 APC를 형성하기 위한 올리고뉴클레오티드 가닥의 어닐링을, 도 24에 나와 있는 바와 같이, 4% 아가로스 겔 상의 전기영동에 의해 결정하였다. APC의 4% 아가로스 겔 분석. 5 ㎕의 1 pmol/㎕의 APC를 각 레인(1-10)에 로딩하였다. 단일 가닥과의 비교를 나타내기 위해, TEMA191(5 ㎕의 50 pmol/㎕)을 레인 11에 로딩하였고, 레인 12는 50 bp 래더를 가진다.
APC 4, 12, 24, 25 및 32 상에서 압스크립션을 행하였고, 압스크립트를 TLC 상에 운용시켰다. 1 ㎕의 압스크립타제와 함께 도면에 열거된 NTP의 1 mM 최종 농도와 함께 개시자의 1 mM 최종 농도로 100 fmol의 APC를 이용하여 각 압스크립션을 행하였다. 45℃에서 60분 동안 압스크립션을 행하였다. 각 반응으로부터 2 ㎕를 TLC 판 상에 스포팅하여, 6:3:1의 이소프로판올:NH40H:H20로 전개하였다. TLC 판을 10분 동안 형광체 영상기 스크린에 노출시켰다.
도 25에 나와 있는 방사능활성을 이용하여, 각 APC로부터의 압스크립션을 검출하였다. AAG 및 AAU는 TLC에 의해 용이하게 구별될 수 없었으나, 각 APC는 상이한 압스크립트를 제시하였다.
실시예 9.
항-SEB 항체-APC 착체를 이용한 SEB 단백질의 압스크립션에 기초한 검출
불완전 프로모터 카세트에 커플링된 SEB에 대한 항체 및 샌드위치 ELISA를 이용하여, 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 내독소 B(SEB)를 검출하였다.
실험 방법
커플링
AAG 압스크립트를 발생시키는 APC 22(APCAA2361)를 아민 변형시켜, SEB에 대한 항체에 커플링시켰다. 커플링 후, Ab-APC 접합체 및 미반응 성분들의 혼합물을 HPLC를 이용하여 분획으로 분리시켰다. 분획 17-19 및 22-24을 풀링하고 조사하였다. 30 kDa 스핀 필터를 이용하여, 풀링된 샘플을 농축시켰다. 마이크로 BCA 검정(피어스(Pierce))을 이용하여, 이 샘플 내의 항체 농도를 결정하였다.
샌드위치 ELISA
SEB-코팅 판을 1시간 동안 2% BSA/PBS-트윈(Tween)으로 블록킹하였다. 10 μg/mL IgG의 항체 접합체 용액 및 ½의 연계 희석액들을 칼럼 1-11에서 판에 부가하고, 이에 따라 칼럼 1에서의 항체 농도는 10 μg/mL이었고, 칼럼 2에서는 5 μg/mL이었으며, 칼럼 3에서는 2.5 μg/mL 등이었으며, 칼럼 11에서의 농도는 9.77 ng/mL이었다. 각 웰에서의 최종 체적는 50 ㎕이었다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 로킹(rocking)한 후, 다음과 같이 압스크립션 반응을 셋업하였다. 버블 완충액 내의 10 ㎕의 883 nM 압스크립타제를 각 웰에 부가한 후, 버블 완충액 내에 2 mM I-ApA, 2 mM T-GTP, 0.1 μCi/㎕ α32P-GTP를 포함하는, 10 ㎕의 압스크립션 시약을 부가하였다. 버블 완충액 내의 1 mM T-030, 0.1 μCi/㎕ α-32P-GTP의 20 ㎕ 용액 콘트롤을 비점유 웰에 두었다. 판을 2시간 동안 써모믹서(에펜도르프(Eppendorf))에서 진탕하면서 400 rpm으로 45℃에서 인큐베이션한 후, 4℃로 냉각시켜, 하룻밤 동안 저장하였다. 2 ㎕의 반응 용액 및 콘트롤을 알루미늄 배킹 실리카 겔 TLC 판(와트만(Whatman))에 두고, 전개시켰다. 형광체 스크린(몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics))을 20분 동안 TLC 판에 노출시키고, 포스포영상기: SI(몰레큘라 다이나믹스를 이용하여 영상화시켰으며, 이미지퀀트(ImageQuant) 소프트웨어(분자 다이나믹스)를 이용하여 평가 및 정량화하였다. 교정기는 데이터가 영상기의 선형 범위 내에 있음을 보여주었다.
결과
2개 접합체 풀에 의해 발생된 신호에 대한 적정 곡선이 도 26에 나와 있다. 풀 22-24은 최대 접합체 밴드에 대한 피크 분획에 상응하고, 풀 17-19는 약간 더 일찍 용리하는 두 번째 피크에 상응한다. 이 2개 밴드로부터의 접합체는, 비환원 SDS-PAGE 겔 상에 운용 시에 상이한 이동성을 가진다(도시되지 않음). 상이한 용리 시간 및 전기영동 이동성은, 17-19 분획에서 용리하는 물질은 2개 APC가 결합된 접합체이고, 한편 22-24 분획으로부터의 물질은 단일 APC가 결합된 접합체임을 제시한다. 압스크립션 반응의 이 적정은, 2개 접합체의 특정 압스크립션 활성의 구분된 차이를 보여주고, 풀 22-24에서 단일 APC가 결합된 것에 대항하는, 2개 APC가 결합된 풀 17-19의 구상을 지지한다. 비교 지정 ELISA 검정은 접합체에 대한 결합 능력에 상당한 차이를 보이지 않았고, 이에 따라 관찰된 신호 차이는 주로 압스크립션 능력의 차이로 인한 것이다.
실시예 10
질량분석법에 의한 10개 트리뉴클레오티드의 동시 검출
10개 이상의 압스크립트가 질량분석법에 의해 분리하여 검출될 수 있음을 입증하기 위해, 10개의 화학적으로 합성된 트리뉴클레오티드를 각기 개별적으로 또한 단일 혼합물로서 조사하였다. 도 27은 그것의 개별 런으로부터의 모든 10개 트리뉴클레오티드들의 조합 크로마토그램을 나타낸다. 삽입된 차트는 넘버링된 피크가 어느 압스크립트를 가리키는지, 또한 적절한 체류 시간, m/z 값 및 피크 면적을 나타낸다. 도 27는 대부분의 트리뉴클레오티드는 약간 상이한 체류 시간을 가짐을 입증하였다. 그러나, LC 체류 시간이 유사하거나 동일한 경우에도, 질량분석법와 독립적으로 샘플을 평가할 수 있다. 예를 들어, 피크 7(AUU) 및 8(AAU)는 동일한 체류 시간을 나타내나, 구별되는 m/z 값을 산출하였다.
10개 압스크립트들의 풀로부터 상이한 압스크립트를 구별하는 질량분석법의 능력은 다음과 같이 입증되었다. 10개의 정제된 트리뉴클레오티드의 혼합물을 동몰 농도로 함께 혼합하여, 질량분석법으로 분석하였다. 도 28은 질량분광법에 의해 동시에 검출된 트리뉴클레오티드의 혼합물의 산출을 나타낸다. 상응 m/z 비 다음에 각 트리뉴클레오티드가 나와 있다. 10 ㎕의 10 μM 용액을 아틀란티스 dC18 3 μm 2.1 mm × 30 mm 칼럼에 의해 분석하였다(100 pmol). 사용된 MS 조정 화일은 "압스크립트"였다.
표 5는 각 압스크립트에 있어, 질량분석법에 의해 관찰된 이중 하전 이온에 대한 계산된 분자량 및 관찰된 m/z 값을 나타낸다.
Figure 112006038069477-PCT00005
따라서, 질량분석법은 10개 이상의 상이한 APC들을 포함하는 다중 반응의 산물을 구별하기 위해 사용되고, 이에 따라 10개 이상의 상이한 표적 분자들을 검출하거나, 보다 큰 감도 및 정확도로 더욱 제한된 수의 표적들을 검출할 수 있어야 한다.
실시예 11
질량분석법을 이용한 다중 불완전 전사 및 검출
도 29에 나와 있는 2개의 APC, 즉 APC 2-1 및 12-1를 혼합하였고, 45℃에서 29분 동안 압스크립션 반응을 수행하였으며, 모두 전술된 프로토콜에 따라 LC-MS에 의해 압스크립트를 분석하였다. APC 2-1에 의해 제조된 압스크립트는 AAG(APC 4와 유사)였고, APC 12-1에 의해 제조된 압스크립트는 AAU였다. 도 25에 나와 있는 바와 같이, 압스크립트 AAG 및 AAU는 TLC에 의해 분리될 수 없었다. 그러나, 이 압스크립트는 질량분석법에 의해 분리될 수 있다. 도 31은 m/z 값에 기초하여 용이해 분리된 2개의 APC로의 다중 반응으로부터 질량 분광도를 나타낸다. 데이터는 또한 1개의 APC로부터의 불완전 전사는 다른 APC로부터 일어나는 불완전 전사의 존재에 의해 억제되지 않음을 입증한다.
도 30은 콘트롤 반응 대비의, 다중 압스크립션 반응으로부터 발생된 AAU 및 AAG 신호의 개요를 나타낸다. 개별 ABC 2-1 반응 데이터가 칼럼 1 및 2에 있다. 개별 ABC 12-1 반응 데이터는 칼럼 5 및 6에 있다. 조합된 반응 데이터(반응을 이중 행함)가 칼럼 9-12에 있다. AAG, AAU 및 AAG+AAU 콘트롤이 칼럼 13-16에 있다.
상기 명세서에서, 본 발명은 특정 구현예들과 관련하여 기재되었다. 그러나, 이하 특허청구범위에 설명된 바와 같은 본 밟명의 범주를 벗어나지 않는 한, 각종 변형 및 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 명세서 및 도면은 제한적인 것이 아닌, 설명적 방식으로 간주되도록 하며, 그러한 모든 변형들은 본 발명의 범주 내에 포함되도록 의도된다. 언급된 모든 참고문헌들은 명세서에 참고로 전부 인용된다. 구현예들은 각종 요소 및 특성들을 포함할 수 있고, 또한 그러한 구현예도 또한 상기 요소 또는 특성으로 구성되거나 본질적으로 구성될 수 있는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> Ribomed Biotechnologies, Inc. <120> Compositions, Methods and Detection Technologies for Reiterative Oligonucleotide Synthesis <130> 2072.006PC01 <140> PCT/US2004/035740 <141> 2004-10-29 <150> US 60/514,908 <151> 2003-10-29 <160> 35 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APC with possible alternative initiator sites <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> n can represent any nucleotide: a, t, c, g <220> <221> misc_feature <222> (20)..(39) <223> n can represent any nucleotide: a, t, c, g <400> 1 nnnnnnnnnn nnntataatn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 39 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APC with specific target site probe <400> 2 ggatacttac agccattata tttagcccta ctccattcca tcccgggttc gtcc 54 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APC with specific target site probe <400> 3 ggacgaaccc gggatggaat ggagtattcg ccgtgtccat ggctgtaagt atcc 54 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Deamination conversion of unmethylated cytosine groups <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n can be either cytosine or guanine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> n can be either cytosine or guanine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n can be either cytosine or guanine <400> 4 unnuuuaaan nggtuuggag ugautnntua 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Deamination conversion of unmethylated cytosine groups <400> 5 uuguuuaaau gggtuuggag ugautugtua 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Deaminated target DNA <400> 6 ucguuuaaac gggtuuggag ugautcgtua 30 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n can represent any nucleotide: a, t, c, g <220> <221> misc_feature <222> (11)..(22) <223> n can represent any nucleotide: a, t, c, g <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n can represent any nucleotide: a, t, c, g <220> <221> misc_feature <222> (11)..(24) <223> There are from 8 nucleotides to 14 nucleotides present <400> 7 ntaacgaatc nnnnnnnnnn nnnngtttaa acgan 35 <210> 8 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic deoxyribonucleotide polymer of repeating dCpdG <400> 8 gcgcgcgcgc gcgc 14 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bubble complex 1 comprising template and non-template strands <400> 9 ggatacttac agccattata tttagcccta ctccattcca tcccgggttc gtcc 54 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bubble complex 1 comprising template and non-template strands <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n can be adenine or uracil <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n can be adenine or thymine <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n can be adenine or thymine <400> 10 ggacgaaccc gggatggaat ggagtnnncg ccgtgtccat ggctgtaagt atcc 54 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP A192 <400> 11 gctgctggag gcgggtataa tttagccagc accgaatagt tacggtcg 48 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM A197 <400> 12 cgaccgtaac tattcggtgc ttagggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM A56 <400> 13 cgaccgtaac tattcggtgc gatgggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 14 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP 2361 <400> 14 gctgctggag gcgggtataa tttagccagc accgaatagt tacggtcg 48 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM2361AA-2 <400> 15 cgaccgtaac tattcggtgc ttagggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP2361AAC <400> 16 gctgctggag gcgggtataa tttagccacc accgaatagt tacggtcg 48 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM2361AAC <400> 17 cgaccgtaac tattcggtgg ttagggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP2361AAU <400> 18 gctgctggag gcgggtataa tttagccatc accgaatagt tacggtcg 48 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM2361AA <400> 19 cgaccgtaac tattcggtga ttagggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP2361AAA <400> 20 gctgctggag gcgggtataa tttagccaac accgaatagt tacggtcg 48 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM2361AA-2 <400> 21 cgaccgtaac tattcggtgt ttagggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP2361UCA <400> 22 gctgctggag gcgggtataa tttagcccac accgaatagt tacggtcg 48 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM2361UCA <400> 23 cgaccgtaac tattcggtgt gatgggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 24 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEMUC2361 <400> 24 cgaccgtaac tattcggtgc gatgggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP2361CA <400> 25 gctgctggag gcgggtataa tttagctcgc accgaatagt tacggtcg 48 <210> 26 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM-CpA-2361 <400> 26 cgaccgtaac tattcggtgc tgtgggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 27 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSPT71 <400> 27 agtattgact taaagtctaa cctataggat ataatagatt cacgagaggg acacggcga 59 <210> 28 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM2361AU <400> 28 tcgccgtgtc cctctcgatg gctgtaagta tcctataggt tagactttaa gtcaatact 59 <210> 29 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM2361AU <400> 29 cgaccgtaac tattcggtgc tatgggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 30 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP2361bub15 <400> 30 gctgctggag gcgggtataa tttagctcct accgaatagt tacggtcg 48 <210> 31 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM-CpG-2361 <400> 31 cgaccgtaac tattcggtgc cgtgggcagc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 32 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP 2-1 <400> 32 gctgctggag gcggtataat ttagtcaagc accgaatagt tacggtcg 48 <210> 33 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM 2-1 <400> 33 cgaccgtaac tattcggtgc ttagggccgc gcccccgcct ccagcagc 48 <210> 34 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP 12-1 <400> 34 gctgctggag gcgggtataa tttagccaat caccgaatag ttacggtc 48 <210> 35 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM 12-1 <400> 35 gaccgtaact attcggtgat tacgggccgc gcccccgcct ccagcagc 48

Claims (44)

  1. (a) 핵산 주형 상의 불완전(abortive) 반복적 합성을 통해 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체를 합성하는 단계; 및
    (b) 질량분석법에 의해 상기 표적 분자의 존재를 결정함으로써, 상기 표적 분자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 표적 분자의 존재를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체의 분자 질량 및 존재비(abundance)를 결정하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자는 상기 핵산 주형을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자는 상기 핵산 주형과 다른 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 핵산 주형은 불완전 프로모터 카세트인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 표적 분자에 대해 특이성을 갖는 하나 이상의 제2 분자에 연결되는 다중 불완전 프로모터 카세트를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 다중 불완전 프로모터 카세트는 덴드리머를 통해 상기 제2 분자에 연결하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 불완전 프로모터 카세트는 표적 분자에 대해 특이성을 갖는 제2 분자에 연결되고, 상기 제2 분자는
    (a) DNA 서열;
    (b) RNA 서열;
    (c) PNA 서열;
    (d) 항체;
    (e) 결합 단백질;
    (f) 신호전달 분자;
    (g) 합텐;
    (h) 바이오틴; 및
    (i) 이온
    으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  9. (a) 주형 폴리뉴클레오티드를 개시자 및 폴리머라아제와 함께 인큐베이션하는 단계;
    (b) 상기 주형 폴리뉴클레오티드로부터 다중 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계 (여기에서, 상기 개시자는 전사체가 종결될 때까지 확장되어, 다중 반복적 올 리고뉴클레오티드 전사체가 합성되도록 함); 및
    (c) 질량분석법에 의해 상기 표적 분자의 존재를 결정하는 단계
    를 포함하는 표적 분자의 존재를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체는 변형된 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 표적 부위 프로브와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표적 부위 프로브는 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드; 약 51 내지 약 75 뉴클레오티드; 약 75 내지 약 100 뉴클레오티드; 및 100 초과의 뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 크기를 갖는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA이고, 상기 다중 반복적 올리고뉴클레오티드 전사체는 RNA를 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자는
    (a) 단백질;
    (b) 핵산;
    (c) RNA;
    (d) DNA;
    (e) 탄수화물;
    (f) 지질;
    (g) 항원;
    (h) 합텐; 및
    (i) 이온
    으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 병원체를 검출하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 분자가 HIV-1; HIV-2; HIV-LP; 소아마비 바이러스; A형 간염 바이러스; 엔테로 바이러스; 인간 콕사키 바이러스류, 라이노바이러스; 에코바이러스; 칼시비리다에(Calciviridae); 토가비리다에(Togaviridae); 말열 뇌염 바이러스; 풍진 바이러스; 플라비리다에(Flaviridae); 뎅그 바이러스; 뇌염 바이러스, 황열 바이러스; 코로나비리다에 ( Coronaviridae ); SARS; 라브도비리다에(Rhabdoviridae); 수포성 구내염 바이러스; 광견병 바이러스; 필로비리다에(Filoviridae); 에볼라 바이러스; 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae); 파라인플루엔자 바이러스, 멈프스 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스; 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae); 인플루엔자 바이러스; 부니아비리다 에(Bunyaviridae); 한탄 바이러스; 번야 바이러스, 플레보 바이러스; 나이로 바이러스; 아레나비리다에(Arenaviridae); 레오비리다에(Reoviridae); 레오바이러스; 오르비바이러스; 로타바이러스; 비르나비리다에(Birnaviridae); 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae); B형 간염 바이러스; 파르보비리다에 ( Parvoviridae ); 파포바비리다에(Papovaviridae); 파필로마 바이러스; 폴리오마 바이러스; 아데노비리다에(Adenoviridae); 헤르페스비리다에(Herpesviridae); HSV 1; HSV 2; 수두대상포진 바이러스; 사이토메갈로바이러스(CMV); 폭스비리다에(Poxviridae); 천연두 바이러스; 우두 바이러스; 이리도비리다에(Iridoviridae); 아프리카 돼지 열 바이러스; 간염 C; 노르워크 바이러스 헬리고박터 파이롤리(Helicobacter pylori), 보렐리아 부르도르페리(Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis), M. 아비움(M. avium), M. 인트라셀룰라레(M. intracellulare), M. 칸사이(M. kansaii), M. 고르도나에(M. gordonae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae ), 네이세리아 메닌기티디스( Neisseria meningitides), 리스테리아 모노사이토게네스 ( Listeria monocytogenes ), 스트렙토코쿠스 피오게네스 ( Streptococcus pyogenes )(A군 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae )(B 군 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 비리단스(Streptococcus viridans) 군, 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 혐기성 스트렙토코쿠스 종, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 병원체성 캄필로박 터(Campylobacter) 종, 엔테로코코스(Enterococcus) 종, 헤모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코르니네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 코르니네박테리움 종, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 페르프리겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 멀토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스(Bacteroides) 종, 푸소박테리움 누클레아툼 ( Fusobacterium nucleatum ), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리듐(Treponema palladium), 트레포네마 페르테누에(Treponema pertenue), 레프토스피라(Leptospira), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelli); 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라즈마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 코시디오데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans); 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum); 및 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유기체에서 유래하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 암을 검출하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, DNA 메틸화를 검출하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 변이를 검출하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 질병을 검출하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, RNA 발현을 정량화하는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 질량분석법은
    (a) 고속 원자 충격(FAB) 질량분석법;
    (b) 플라즈마 탈착(PD) 질량분석법;
    (c) 전자분무/이온분무(ES) 질량분석법;
    (d) 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량분석법; 및
    (e) 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화 비행 시간 분석(MALDI-TOF)
    로부터 선택된 방법들 중 임의의 하나로 이루어지는 것인 방법.
  23. 하나 이상의 불완전 프로모터 카세트가 연결되는 덴드리머를 포함하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 다중 불완전 프로모터 카세트가 연결되는 덴드리머를 포함 하는 것인 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 덴드리머에 연결된 상기 다중 불완전 프로모터 카세트가 동일한 것인 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 덴드리머에 연결된 상기 다중 불완전 프로모터 카세트가 동일하지 않은 것인 조성물.
  27. 제23항에 있어서, 대상 표적 분자에 대한 특이성을 갖는 제2 분자에 추가로 연결되는 것인 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제2 분자는
    (a) DNA 서열;
    (b) RNA 서열;
    (c) PNA 서열;
    (d) 항체;
    (e) 결합 단백질;
    (f) 신호전달 분자;
    (g) 합텐;
    (h) 바이오틴; 및
    (i) 이온
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제2 분자는 항체인 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 상기 제2 분자는 DNA 서열인 조성물.
  31. 제23항의 조성물, 및 하나 이상의 완충액 및 하나 이상의 커플링 시약을 포함하는 키트.
  32. (a) 핵산 주형 상의 불완전 반복적 합성을 통해 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체를 합성하는 단계;
    (b) 불완전 반복 합성 전사체의 상기 다중 복사체를 신호 증폭 캐스케이드에 도입하는 단계; 및
    (c) 상기 신호 캐스케이드로부터 신호의 존재를 결정함으로써, 상기 표적 분자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 표적 분자의 존재를 검출하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 신호 증폭 캐스케이드는
    (a) PCR;
    (b) 불완전 전사;
    (c) FRET; 및
    (d) 효소에 의한 증폭
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. (a) 핵산 주형 상의 불완전 반복적 합성을 통해 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체의 2 이상의 상이한 합성을 동시에 수행하는 단계; 및
    (b) 상기 표적 분자의 존재를 결정함으로써, 2 이상의 표적 분자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 하나 이상의 표적 분자의 존재를 검출하는 방법.
  35. (a) 13 nt 초과의 상류 팔(arm) 길이 및 13 nt 초과의 하류 팔 길이;
    (b) (i) 서열: 5' TANNNTN5 -8을 포함하는 비주형 가닥, 및
    (ii) A) 3'C(C 또는 G 또는 A)N9-13;
    B) A(C 또는 G 또는 A) N9-13;
    C) T(C 또는 G 또는 A)N9-13; 및
    D) G(C 또는 G 또는 A)N9-13
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 주형 가닥을 포함하는 11 내지 14 nt의 버블 세그먼트 길이
    를 포함하는 불완전 프로모터 카세트로서, 불완전 전사는 상기 불완전 프로모터 카세트를 벗어나 진행되는 것인 불완전 프로모터 카세트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 비주형 가닥은 서열: 5' TATAATN5 -8 (서열번호 1의 일부)을 포함하는 것인 불완전 프로모터 카세트.
  37. 제36항에 있어서, 상기 불완전 프로모터 카세트는 하기 것들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 불완전 프로모터 카세트:
  38. 제35항에 있어서,
    (a) TSP2361 (서열번호 14);
    (b) TSP2361AAC (서열번호 16);
    (c) TSP2361AAU (서열번호 18);
    (d) TSP2361AAA (서열번호 20);
    (e) TSP2361UCA (서열번호 22);
    (f) TSP2361CA (서열번호 25);
    (g) TSP2361bub15 (서열번호 30);
    (h) 버블 4의 표적 부위 프로브 (서열번호 11);
    (i) TSP2-1 (서열번호 32); 및
    (j) TSP12-1 (서열번호 34)
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 약 80% 이상의 동일도를 가지는 서열을 포함하는 표적 부위 프로브를 포함하는 것인 불완전 프로모터 카세트.
  39. 제38항에 있어서,
    (a) TSP2361 (서열번호 14);
    (b) TSP2361AAC (서열번호 16);
    (c) TSP2361AAU (서열번호 18);
    (d) TSP2361AAA (서열번호 20);
    (e) TSP2361UCA (서열번호 22);
    (f) TSP2361CA (서열번호 25);
    (g) TSP2361bub15 (서열번호 30);
    (h) 버블 4의 표적 부위 프로브 (서열번호 11);
    (i) TSP2-1 (서열번호 32); 및
    (j) TSP12-1 (서열번호 34)
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 표적 부위 프로브를 포함하는 것인 불완전 프로모터 카세트.
  40. 제35항에 있어서,
    (a) TEM2361AA-2 (서열번호 15);
    (b) TEM2361AAC (서열번호 17);
    (c) TEM2361AA (서열번호 19);
    (d) TEM2361UCA (서열번호 23);
    (e) TEMUC2361 (서열번호 24);
    (f) TEM-CpA-2361 (서열번호 26);
    (g) TEM2361AU (서열번호 28);
    (h) TEM-CpG-2361 (서열번호 31);
    (i) 버블 4의 주형 가닥 (서열번호 12);
    (j) TEM2-1 (서열번호 33); 및
    (k) TEM12-1 (서열번호 35)
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 약 80% 이상의 동일도를 가지는 서열을 포함하는 주형 가닥을 포함하는 것인 불완전 프로모터 카세트.
  41. 제40항에 있어서,
    (a) TEM2361AA-2 (서열번호 15);
    (b) TEM2361AAC (서열번호 17);
    (c) TEM2361AA (서열번호 19);
    (d) TEM2361UCA (서열번호 23);
    (e) TEMUC2361 (서열번호 24);
    (f) TEM-CpA-2361 (서열번호 26);
    (g) TEM2361AU (서열번호 28);
    (h) TEM-CpG-2361 (서열번호 31);
    (i) 버블 4의 주형 가닥 (서열번호 12);
    (j) TEM2-1 (서열번호 33); 및
    (k) TEM12-1 (서열번호 35)
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 주형 가닥을 포함하는 것인 불완전 프로모터 카세트.
  42. 제35항에 있어서,
    (a) APC4;
    (b) APC11;
    (c) APC12;
    (d) APC14;
    (e) APC13;
    (f) APC24;
    (g) APC25;
    (h) APC30;
    (i) APC32;
    (j) APC33;
    (k) 버블 4;
    (l) APC UC2361;
    (m) APC2-1; 및
    (n) APC12-1
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 불완전 프로모터 카세트를 포함하는 것인 불완전 프로모터 카세트.
  43. 불완전 프로모터 카세트 표적 부위 프로브 및 주형 가닥의 서열이 제42항의 불완전 프로모터 카세트에 대해 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 이상의 동일도를 가지는 것인 불완전 프로모터 카세트.
  44. (a) 제35항의 불완전 프로모터 카세트로부터의 불완전 반복적 합성을 통해 올리고뉴클레오티드의 다중 복사체를 합성하는 단계; 및
    (b) 신호의 존재를 결정함으로써, 상기 표적 분자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 표적 분자의 존재를 검출하는 방법.
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