CN113226049A - 酶颗粒的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及低粉尘酶颗粒用于丸粒化后液体施用(PPLA)或在其他类型的非丸粒化饲料如粉状饲料上液体施用的用途。本发明还涉及生产用于液体施用的低粉尘酶颗粒的方法。

Description

酶颗粒的用途
技术领域
本发明涉及低粉尘酶颗粒用于丸粒化后液体施用(PPLA)或在其他类型的非丸粒化饲料如粉状饲料上液体施用的用途。本发明还涉及生产用于液体施用的低粉尘酶颗粒的方法。
背景技术
含有诸如维生素、氨基酸、矿物质和酶等成分的动物饲料通常以饲料丸粒的形式提供。丸粒是在操作温度高于70℃-80℃的饲料制粒机上制备的，以避免细菌生长并提高丸粒质量和消化率。诸如酶之类的成分通常以固体成分的形式添加到饲料研磨机中。然而，酶可能对热敏感而可能无法在热处理中存活。而且，许多固体成分(特别是酶)的问题是，它们倾向于在物理处理过程中，例如在混合和包装机器的加工过程中，或甚至在通过设备、鞋或车轮粉碎溢出的粒子之后形成粉尘。这不仅产生废产品，而且粉尘还可能引起严重的卫生和健康问题。
为了克服这个问题，可以通过丸粒化后液体施用(PPLA)将酶添加到饲料丸粒中。通常，通过喷在模具上，喷雾到螺旋输送机中，喷入集气室或堰中，或使用旋转盘进行喷雾以雾化液体，将酶作为液体组合物施用到热处理的丸粒上。酶也可以作为液体组合物添加到其他类型的饲料如非丸粒化粉状饲料中。传统上，已经完成从酶液体组合物将酶直接施用到粉状饲料或饲料丸粒上。尽管液体组合物具有抑制酶粉尘形成的固有优点，但与固体配制品相比它们具有几个缺点，例如较差的稳定性。WO 09/102770描述了直径为约150至约355微米的含酶颗粒，其包含单个核心和包覆在核心上的含酶层，其中该核心由一种或多种无机盐组成。WO 06/034710描述了包含含有核心和包衣的颗粒的蒸汽处理的丸粒化饲料组合物，其中该核心包含活性化合物并且该包衣包含盐。WO 07/044968披露了用于饲料组合物的颗粒，其包含：核心、活性剂和至少一种包衣，其中这些颗粒特别适合包含在蒸汽处理过程中，包括饲料的制粒和压片过程以及蒸汽处理，而不会明显损失活性剂的活性。WO9739116涉及一种含酶颗粒，其包含酶和能够吸收至少5％水的核心。WO 17/162610涉及呈干燥形式的酶组合物，其包含一种或多种水溶性饲料酶、苯甲酸的盐和弱酸，并且涉及这些酶组合物用于制备呈液体形式的酶组合物的用途。
WO 05/074707、WO 18/007154、WO 2009/152176披露了不同的液体酶配制品。
以液体组合物形式储存的酶需要大量的储存设备，并且通常比呈干燥形式的酶更不稳定。呈干燥形式的酶(例如冻干或喷雾干燥的酶)通常具有形成粉尘的趋势。因此，需要用于在饲料上进行丸粒化后液体施用(PPLA)或其他液体施用的酶组合物。
发明内容
本发明提供了低粉尘酶颗粒用于丸粒化后液体施用(PPLA)或在至少一种酶的其他类型的非丸粒化饲料如粉状饲料上液体施用的用途，其中该酶颗粒在施用前溶解于水中。
通过喷雾可以将用于本发明的溶解的颗粒作为液体组合物施用于丸粒或粉状饲料上。在本发明的一个方面，将颗粒溶解并喷雾到在饲料研磨机中的饲料丸粒上。
本发明进一步提供了生产用于液体施用的低粉尘酶颗粒的方法，其中该方法包括制备包含核心和至少一种酶的颗粒，其中该酶分布在该核心中和/或在该核心上分层，以及将外层施加到该核心或层状颗粒上以获得包衣颗粒。在本发明的一个方面，在流化床装置中制备颗粒。
具体实施方式
定义
动物饲料：术语“动物饲料”是指适合于或打算用于由动物摄入的任何化合物、制剂或混合物。单胃动物的动物饲料典型地包含浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(如在预混物中)，而反刍动物的动物饲料通常包含饲草(包括粗粮和青贮)，并且可以进一步包含浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(如在预混物中)。
粉尘：与颗粒或粉末有关的术语“粉尘”是指颗粒或粉末在处理时释放出细小的空气传播的粒子的趋势。颗粒或粉末粉尘在工业上是常规测量的，并且可以通过几种不同的技术测量。用于测量酶粉尘的熟知的方法例如包括淘洗测定和霍伊巴赫1型测定(HeubachType 1assay)。
酶：本发明内容中的酶可以是任何酶或不同酶的组合。因此，当提及“酶”时，一般可以理解为包含一种酶或多种酶的组合。应该理解的是，酶变体(例如由重组技术产生)被包括在术语“酶”的含义内。在以下文献中披露了此类酶变体的实例，例如，EP 251,446(杰能科公司(Genencor))、WO 91/00345(诺和诺德公司(Novo Nordisk))、EP 525,610(苏威公司(Solvay))和WO 94/02618(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades NV))。
低粉尘酶颗粒：“低粉尘酶颗粒”在本文中用于如下酶颗粒，当通过如“分析方法”一节中“霍伊巴赫1型测定的总粉尘”、“淘洗测定的总粉尘”中分别描述的霍伊巴赫1型测定或淘洗测定进行测量时，该酶颗粒导致在处理过程中很少或没有总粉尘释放(即，该酶颗粒从活性和非活性颗粒成分形成粉尘的趋势较低)。在一个方面，霍伊巴赫1型测定中的粉尘低于1000μg/g和/或淘洗测定中的粉尘低于1000μg/g。在另一个方面，霍伊巴赫1型测定中的粉尘低于500μg/g，霍伊巴赫1型测定中的粉尘低于250μg/g，霍伊巴赫1型测定中的粉尘低于100μg/g，或霍伊巴赫1型测定中的粉尘低于50μg/g。在又另一个方面，淘洗测定中的粉尘低于500μg/g，淘洗测定中的粉尘低于250μg/g，淘洗测定中的粉尘低于100μg/g，或淘洗测定中的粉尘低于50μg/g。
低活性粉尘酶颗粒：低活性粉尘酶颗粒是一种低粉尘酶颗粒，当通过如“分析方法”一节中“霍伊巴赫1型粉尘计测定的活性粉尘分数”、“淘洗测定的活性粉尘分数”中分别描述的霍伊巴赫1型测定或淘洗测定进行测量时，该低粉尘酶颗粒导致很少或没有活性酶粉尘分数。在一个方面，霍伊巴赫1型测定中的活性粉尘分数低于20ppm和/或淘洗测定中的活性粉尘分数低于80ppm。在另一个方面，霍伊巴赫1型测定中的活性粉尘分数低于10ppm，霍伊巴赫1型测定中的活性粉尘分数低于6ppm、低于2ppm或低于0.5ppm。在又另一个方面，淘洗测定中的活性粉尘分数低于40ppm，淘洗测定中的活性粉尘分数低于20ppm、低于10ppm、低于4ppm、低于2ppm或低于0.5ppm。
惰性材料：惰性材料是不具有化学反应性的材料。惰性材料的实例是例如盐，例如硫酸钠、氯化钠或碳水化合物。
粒度分布(PSD)：术语“粒度分布”或“PSD”在本文中用于本发明的颗粒，并且定义了根据尺寸存在的粒子的相对量，通常是按体积计。PSD被描述为D值D10、D50和D90，其中D10是指粒度分布的10％百分位数(意味着粒子体积的10％具有等于或小于给定值的尺寸)，D50描述了50％百分位数，D90描述了90％百分位数。粒度分布可以用激光衍射法或光学数字成像法或筛分分析法测量。本文报道的D值通过激光衍射测量，其中将粒度报告为体积当量球直径。
丸粒：术语“丸粒”和/或“丸粒化”是指固体圆形、球形和/或圆柱形片或丸粒，以及用于形成此类固体形状的过程，特别是饲料丸粒和固体挤出的动物饲料。如本文所用的，术语“挤出(extrusion或extruding)”是本领域熟知的术语，并且是指如本文描述的，在压力下使组合物通过孔口的过程。
百分比(％)：当在本文中使用时，“％”是指重量百分比，有时也写为％w/w。例如，当写明颗粒包含至少10％的活性酶时，这意味着该颗粒的重量的10％是活性酶。
丸粒化后液体施用(PPLA)：丸粒化后液体施用(PPLA)是在通过蒸汽加热的丸粒化工艺制备丸粒后，将来自液体组合物的成分(例如像脂肪、维生素、酶和/或益生菌)添加到饲料丸粒中。
本发明
通过本发明，我们描述了低粉尘酶颗粒用于丸粒化后液体施用(PPLA)至饲料丸粒或在其他类型的非丸粒化饲料如粉状饲料上液体施用的用途，其中这些酶颗粒在施用前溶解于水中。
本文披露的酶颗粒特别适合使用，因为它们是低粉尘酶颗粒，并因此处理起来更安全，易于处理且易于运输。用于本发明的酶颗粒具有高密度和高酶含量。在本发明的一个方面，酶颗粒具有至少0.6g/mL的堆积密度。在本发明的另一个方面，酶颗粒的活性酶含量为至少10％w/w，优选至少20％w/w，并且甚至更优选至少30％w/w。高堆积密度和高活性酶含量具有例如压实值高、运输和包装成本较低的优点。
此外，用于本发明的酶颗粒具有优异的流动性，这可以通过本领域技术人员已知的方法，例如通过测量静止角来测量。由机械分配器***执行的配料的精度取决于产品的流动性。粘性产品将通常分解成团块，从而使重量目标很容易溢出。从机械处理(例如振动输送机)离析出的产品可能导致粒度分布(PSD)发生变化，将该粒度分布分配给分配器产生的各个电荷。低堆积密度粒子(特别是与宽PSD组合的粒子)在处理较小粒子所需的机械冲击水平上可能流动得太容易，并导致溢出。
粉末或颗粒的流动性在很大程度上受到其粒度分布的影响。与较大的粒子相比，小尺寸粒子的流动性较差。具有良好流动性的小尺寸粒子容易形成粉尘。通过添加所谓的除尘剂或凝集剂可以减少粉尘，然而通常以影响流动性为代价。根据本发明使用的颗粒具有有利的PSD。
酶颗粒的另一个优点是它们的快速溶解特性。在本发明的一个方面，在将颗粒溶解于水中之后没有观察到沉淀物。在本发明的另一个方面，通过以下方式测定颗粒的溶解度：a)将颗粒以1.5％的浓度溶解在水中，b)将来自步骤a)的溶液通过100微米的筛网过筛，c)干燥筛网，以及d)检查被筛网捕获的不溶物的重量，其中如果残留物少于0.5％，则颗粒可溶于水。又另一个优点在于颗粒是稳定的。在本发明的一个方面，在溶解于水中后至少12小时颗粒的酶具有活性，在另一个方面，在溶解后至少16小时颗粒的酶具有活性。在一个优选的方面，在溶解于水中后至少24小时颗粒的酶具有活性。在一个方面，颗粒是物理稳定的。在其中颗粒是物理稳定的本发明的另一个方面，在30℃溶解于水中24小时后不形成沉淀物。在一个方面，颗粒是酶稳定的。在其中颗粒是酶稳定的另一个方面，在30℃溶解于水中24小时后酶活性为初始酶活性的至少95％。在一个方面，颗粒具有微生物稳定性。在另一个方面，根据美国食品和药物管理局(FDA)的要求，颗粒具有微生物稳定性。在本发明的一个方面，将微生物稳定剂引入颗粒中。在另一个方面，将一种或多种微生物稳定剂引入颗粒中，其中与不含一种或多种微生物稳定剂的颗粒相比，该颗粒中含有酶含量。
颗粒
根据本发明使用的酶颗粒可以具有基质结构，其中组分已经被均匀地混合。可替代地，酶颗粒包含核心粒子和一种或多种包衣，例如像盐和/或蜡包衣，其中该核心粒子包含酶，任选地作为一种或多种酶与一种或多种盐或添加剂的混合物，或在其上施用一种或多种酶的惰性粒子。
蜡包衣的实例是聚乙二醇、聚丙烯、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、蜂蜡、氢化植物油或动物脂油(例如氢化牛脂、氢化棕榈油、氢化棉籽和/或氢化大豆油)、脂肪酸醇、单甘油酯和/或二甘油酯(例如甘油硬脂酸酯)，其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕榈酸的混合物，微晶蜡、石蜡和脂肪酸(例如氢化的线性长链脂肪酸及其衍生物)。其他实例包括聚合物包衣，例如像描述于WO 2001/00042中。优选的蜡是棕榈油或氢化棕榈油。
盐包衣的实例是Na2SO4、K2SO4、MgSO4、柠檬酸钠和盐的混合物。其他实例是描述于例如WO 2008/017659、WO 2006/034710、WO 1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO 2000/70034中的那些。盐包衣的厚度通常为至少1μm。
在一方面，核心粒子包含惰性材料，该惰性材料选自由以下组成的组：有机或无机盐(例如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉、糖、碳水化合物(例如像蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质以及粘土矿物质(也称作水性页硅酸铝)及其混合物。在一个优选的方面，核心包含无机盐，例如硫酸钠或氯化钠。
在替代性或另一个方面，核心粒子包含微生物稳定剂，该微生物稳定剂选自由以下组成的组：山梨酸、抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸、山梨酸的盐、抗坏血酸的盐、柠檬酸的盐、苯甲酸的盐、山梨酸钾、柠檬酸钠、苯甲酸钠及其组合。
在一方面，固体组合物呈颗粒形式，并且包含核心粒子、含有一种或多种酶的酶层以及盐包衣。
在另一个方面，颗粒包含配制剂，该配制剂选自以下化合物中的一种或多种：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇或其他多元醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉或其他碳水化合物、高岭土和纤维素。在一个优选的方面，该配制剂选自以下化合物中的一种或多种：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、蔗糖、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。
在一方面，颗粒包含酶稳定剂。在另一个方面，颗粒包含锌或镁作为酶稳定剂。在又另一个方面，颗粒包含镁盐或锌盐，例如像硫酸镁和硫酸锌。
酶
应该理解的是，酶变体(例如由重组技术产生)被包括在术语“酶”的含义内。在以下文献中披露了此类酶变体的实例，例如，EP 251,446(杰能科公司)、WO 91/00345(诺和诺德公司)、EP 525,610(苏威公司)和WO 94/02618(吉斯特布罗卡德斯公司)。
可以根据handbook Enzyme Nomenclature[酶命名手册](来自NC-IUBMB,1992)对酶进行分类，还参见因特网上的ENZYME网站：http://www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是相对于酶命名法的信息储库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB),Academic Press,Inc.[学术出版社公司],1992的推荐并且描述了所表征的酶的每种类型，为该酶提供EC(酶委员会)编号(Bairoch A.The ENZYME database[酶数据库],2000,Nucleic Acids Res[核酸研究]28:304-305)。这种IUB-MB酶命名法是基于它们的底物特异性，有时基于它们的分子机制；这种分类不反映这些酶的结构特征。
在给予氨基酸序列相似性的家族中，某些糖苷水解酶的另一种分类，如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、右旋糖酐酶和α-半乳糖苷酶，在几年前已经提出了。它们目前分为90个不同的家族：参见CAZy(ModO)因特网网站(Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)Carbohydrate-Active Enzymes[碳水化合物活性酶服务器],URL:http://afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html(相应的论文：Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)Carbohydrate-active enzymes:an integrated database approach[碳水化合物活性酶：综合数据库方法].“Recent Advances in CarbohydrateBioengineering[碳水化合物生物工程的最新进展]”,H.J.Gilbert,G.Davies,B.Henrissat和B.Svensson编辑,The Royal Society of Chemistry[英国皇家化学学会],剑桥,第3-12页；Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)The modular structure ofcellulases and other carbohydrate-active enzymes:an integrated databaseapproach[纤维素酶和其他碳水化合物活性酶的模块化结构：综合数据库方法].该文收集于“Genetics,Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation[纤维素降解的遗传学、生物化学和生态学]”.；“Genetics,Biochemistry and Ecology of CelluloseDegradation[纤维素降解的遗传学、生物化学和生态学]”.,K.Ohmiya,K.Hayashi,K.Sakka,Y.Kobayashi,S.Karita和T.Kimura编,Uni Publishers Co.[联合出版公司],东京,第15-23页)。
可以掺入本发明颗粒中的酶的类型包括氧化还原酶(EC 1.-.-.-)、转移酶(EC2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂解酶(EC 4.-.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)和连接酶(EC6.-.-.-)。
在本发明的上下文中优选的氧化还原酶是过氧化物酶(EC 1.11.1)、漆酶(EC1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)。可商购的氧化还原酶(EC 1.-.-.-)的实例是GluzymeTM(可从诺维信公司(Novozymes A/S)获得的酶)。
在本发明的上下文中优选的水解酶是：羧酸酯水解酶(EC 3.1.1.-)如脂肪酶(EC3.1.1.3)；植酸酶(EC 3.1.3.-)，例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)；糖苷酶(EC 3.2，其属于本文称作“糖酶”的组)，如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；肽酶(EC 3.4，也称为蛋白酶)；和其他羰基水解酶。可商购的植酸酶的实例包括
Figure BDA0003111790090000091
植酸酶(诺维信公司)、
Figure BDA0003111790090000092
HiPhos(帝斯曼营养产品公司(DSM Nutritional Products))、RonozymeTM P(帝斯曼营养产品公司)、NatuphosTM(巴斯夫公司(BASF))、FinaseTM(AB酶公司(AB Enzymes))和PhyzymeTM产品系列(丹斯尼克公司(Danisco))。其他优选的植酸酶包括描述于WO 98/28408、WO00/43503和WO 03/066847中的那些。
在本发明上下文中，术语“糖酶”不仅用于表示能够分解尤其是五元和六元环结构的碳水化合物链(例如淀粉或纤维素)的酶(即糖苷酶，EC 3.2)，而且表示能够使碳水化合物，例如六元环结构如D-葡萄糖异构成五元环结构如D-果糖的酶。
相关的糖酶包括如下(括号中是EC编号)：
α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC3.2.1.3)、内切-1,4-β-葡聚糖酶(纤维素酶、EC 3.2.1.4)、内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)、内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、右旋糖酐酶(EC 3.2.1.11)、几丁质酶(EC3.2.1.14)、聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、溶菌酶(EC 3.2.1.17)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、淀粉-1,6-葡糖苷酶(EC 3.2.1.33)、木聚糖1,4-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、葡聚糖内切-1,3-β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.39)、α-糊精内切-1,6-α-葡糖苷酶(EC3.2.1.41)、蔗糖α-葡糖苷酶(EC3.2.1.48)、葡聚糖内切-1,3-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.59)、葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶(EC3.2.1.74)、葡聚糖内切-1,6-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.75)、半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、***聚糖内切-1,5-α-L-***糖苷酶(EC 3.2.1.99)、乳糖酶(EC 3.2.1.108)、壳聚糖酶(EC3.2.1.132)和木糖异构酶(EC 5.3.1.5)。
在本发明上下文中，植酸酶是一种催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解为(1)肌醇和/或(2)它的单-，二-，三-，四-和/或五-磷酸盐和(3)无机磷酸盐的酶。
根据上面提到的ENZYME网站，已知不同类型的植酸酶：所谓的3-植酸酶(肌醇六磷酸盐3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)和所谓的6-植酸酶(肌醇六磷酸盐6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26)。出于本发明的目的，两种类型都包括在植酸酶的定义中。
出于本发明的目的，植酸酶活性可以是，优选的是以FYT单位测定的，一个FYT是在以下条件下释放1微摩无机正磷酸盐/min的酶的量：pH 5.5；温度37℃；底物：0.0050mol/l浓度的植酸钠(C6H6O24P6Na12)。适合的植酸酶测定描述于WO 00/20569的实例1中。FTU是用于测定饲料和预混物中的植酸酶活性。在可替代方案中，与实例1中所述例如用于内切葡聚糖酶和木聚糖酶测定的相同的提取原理可用于测定饲料和预混物中的植酸酶活性。
植酸酶的实例披露于WO 99/49022(植酸酶变体)、WO99/48380、WO 00/43503(共有植酸酶)、EP 0897010(经修饰的植酸酶)、EP 0897985(共有植酸酶)。
在本发明的一个特定方面，酶选自由以下组成的组：内切葡聚糖酶、内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、右旋糖酐酶和α-半乳糖苷酶，并且参考WO 2003/062409，将其通过引用特此并入。
特别适合的饲料酶包括：淀粉酶、磷酸酶，例如植酸酶和/或酸性磷酸酶；糖酶，例如淀粉分解酶和/或植物细胞壁降解酶，包括纤维素酶(例如β-葡聚糖酶)和/或半纤维素酶(例如木聚糖酶或半乳聚糖酶)；蛋白酶或肽酶，例如溶菌酶；半乳糖苷酶、果胶酶、酯酶、脂肪酶，特别是磷脂酶，例如哺乳动物的胰腺磷脂酶A2和葡萄糖氧化酶。特别地，这些饲料酶具有中性和/或酸性pH最佳值。
在本发明的一个特定方面，酶选自由以下组成的组：淀粉酶、蛋白酶、胞壁质酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、磷脂酶和葡萄糖氧化酶。
颗粒的制备
颗粒的核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，例如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床凝集、旋转雾化、挤出、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小法、转鼓造粒(drum granulation)、滚压和/或高剪切造粒。
用于制备颗粒的核心的方法可见于Handbook of Powder Technology[粉末技术手册]；C.E.Capes的Particle size enlargement[粒度增大]；第1卷；1980；Elsevier[爱思唯尔]。
制备方法包括已知的饲料和颗粒配制技术，例如：
a)喷雾干燥产品，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含酶溶液以形成小液滴，在它们在沿干燥塔下降的过程中干燥形成含酶的微粒状材料。可以用这种方法产生非常小的粒子(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant ScienceSeries[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔出版社])。
b)层状产品，其中酶在预形成的核心粒子周围包衣成层，其中含酶溶液通常在流化床装置中被雾化，在该流化床装置中预形成的核心粒子被流体化并且含酶溶液附着到核心粒子上并干燥，直到使得干的酶层留在核心粒子的表面上。如果可以发现具有期望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有期望尺寸的粒子。这种类型的产品描述于例如WO 97/23606中。
c)吸收的核心粒子，其中不是将该酶在核心周围包衣成层，而是在核心的表面上和/或表面中吸收该酶。这样的方法描述于WO97/39116中。
d)挤出或丸粒化的产品，其中将含酶糊剂压成丸粒或在压力下通过小的开口挤出并切割为粒子，随后干燥这些粒子。此类粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压力降。此外，当使用小开口时，非常高的挤出压力增加了酶糊剂中的热发生，这对酶是有害的。(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；马塞尔德克尔出版社)。
e)颗粒化的产品，其中含酶的粉末悬浮于熔化的蜡中并且例如通过转盘喷雾器将悬浮液喷洒到冷却室中，在此液滴快速地固化(Michael S.Showell(编辑)；Powdereddetergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；马塞尔德克尔出版社)。所获得的产品是酶均匀分布遍及整个惰性材料而不是集中在其表面上的产品。此外，US4,016,040和US 4,713,245是与此技术有关的文献。
f)混合器造粒产品，其中将酶以干燥形式连同液体或液体形式添加到常规造粒组分的干粉组合物中。将液体和粉末以适合的比例混合，并且因为液体的水分为干燥粉末所吸收，干燥粉末的组分开始附着并凝集，并且粒子将累积，形成包含酶的颗粒。此种方法描述于US 4,106,991和有关的文献EP 170360、EP 304332、EP 304331、WO 90/09440和WO 90/09428中。在其中可以用各种高剪切混合器作为造粒机的此方法的具体产品中，使用熔融造粒将由酶、填料和粘合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以强化粒子，而得到所谓的T-颗粒(T-granule)。经强化的粒子更加坚固，酶粉尘释放更少。
g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含酶的较大的粒子、丸粒、平片体、坯块(briquette)等产生核心。通过将碾磨或压碎的产品过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子。粒度减小描述于Martin Rhodes(编辑)；Principles ofPowder Technology[粉末技术原理]；1990；第10章；John Wiley&Sons[约翰威利父子公司]中。最初的较大粒子可以通过诸如滚压粉末的方法获得。
h)流化床造粒。流化床造粒涉及将微粒悬浮于空气流中并经喷嘴喷射液体到流态化粒子上。被喷洒的液滴击中的粒子湿润并发粘。
i)这些核心可经受干燥，例如在流化床干燥器中。本领域技术人员可以使用在饲料或酶工业中用于干燥颗粒的其他已知的方法。干燥优选在从25℃至90℃的产品温度下进行。对于一些酶来说，重要的是包含酶的核心在用盐包衣之前含有少量的水。如果在过量水去除之前水敏性酶被盐包衣，则水分会截留在核心中并可能消极地影响酶的活性。干燥之后，这些核心优选含有0.1-10％w/w的水。
除上述包衣之外，颗粒还可以任选地被至少一个包衣包围，例如以改进储存稳定性或减少粉尘形成。一个或多个任选的包衣可以包括下面描述的盐包衣和/或另一种类型的包衣。
任选的盐包衣
任选的盐包衣可以包含按颗粒的重量w/w计的至多30％。
可以将该包衣按核心的重量计以至少1％(例如，至少3％或5％)的量施加。该量可以为按核心的重量计的至多30％，例如至多20％、15％或10％。
为了提供可接受的保护，盐包衣的厚度优选为至少1μm。在一个特定方面，盐包衣的厚度低于25μm。在一个更特定方面，盐包衣的厚度低于20μm。在一个甚至更特定方面，盐包衣的总厚度低于15μm。
该包衣应当通过形成基本上连续的层来密封该核心单元。基本上连续的层应当理解为具有极少或没有孔洞的包衣，使得密封/封闭的核心单元具有极少或没有未包衣的区域。层或包衣特别应在厚度上是均匀的。该盐可以从盐溶液(其中该盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中该细粒子是小于50μm，如小于10μm)中添加。
该盐包衣可以进一步含有其他如本领域已知的材料，例如填料、防粘剂、颜料、染料、增塑剂和/或粘合剂，例如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。
盐
该盐包衣可以包含单一盐或者两种或更多种盐的混合物。该盐可以是水溶性的，特别地具有在20℃下在100g水中至少0.1克的溶解度，优选地至少0.5g/100g水，例如，至少1g/100g水，例如，至少5g/100g水。
该盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯盐或碳酸盐或者简单有机酸(少于10个碳原子，例如6个或更少的碳原子)的盐例如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子、铵离子或第一过渡系的金属离子，例如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、二碱式磷酸根、次磷酸根、焦磷酸二氢根、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、乙酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、山梨酸根、酒石酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。特别地，可以使用硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、膦酸根、硝酸根、氯或碳酸根的碱或碱土金属盐或者简单有机酸的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。
在包衣中的盐可以在20℃下具有超过60％的恒定湿度，特别是超过70％、超过80％或超过85％，或者它可以是此盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。该盐包衣可以如在WO 00/01793或WO 2006/034710中所描述。
适合的盐的具体实例是NaCl(CH20℃＝76％)、Na2CO3(CH20℃＝92％)、NaNO3(CH20℃＝73％)、Na2HPO4(CH20℃＝95％)、Na3PO4(CH25℃＝92％)、NH4Cl(CH20℃＝79.5％)、(NH4)2HPO4(CH20℃＝93,0％)、NH4H2PO4(CH20℃＝93.1％)、(NH4)2SO4(CH20℃＝81.1％)、KCl(CH20℃＝85％)、K2HPO4(CH20℃＝92％)、KH2PO4(CH20℃＝96.5％)、KNO3(CH20℃＝93.5％)、Na2SO4(CH20℃＝93％)、K2SO4(CH20℃＝98％)、KHSO4(CH20℃＝86％)、MgSO4(CH20℃＝90％)、ZnSO4(CH20℃＝90％)以及柠檬酸钠(CH25℃＝86％)。其他实例包括NaH2PO4、(NH4)H2PO4、CuSO4、Mg(NO3)2以及乙酸镁。
该盐可以处于无水形式，或者它可以是水合盐，即具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物，例如描述于WO 99/32595中。具体实例包括无水硫酸钠(Na2SO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、七水硫酸镁(MgSO4 .7H2O)、七水硫酸锌(ZnSO4 .7H2O)、七水磷酸氢二钠(Na2HPO4 .7H2O)、六水硝酸镁(Mg(NO3)2(6H2O))、二水柠檬酸钠和四水乙酸镁。
优选地，作为盐溶液使用该盐，例如使用流化床。
任选的另外的包衣
颗粒可以任选地具有一种或多种另外的包衣。适合的包衣材料的实例是聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)以及聚乙烯醇(PVA)。
优选的实施例
本发明进一步由以下优选的实施例描述：
1.低粉尘酶颗粒用于丸粒化后液体施用(PPLA)或在至少一种酶的其他类型的非丸粒化饲料如粉状饲料上液体施用的用途，其中该酶颗粒在施用前溶解于水中。
2.酶颗粒用于丸粒化后液体施用(PPLA)或在至少一种酶的其他类型的非丸粒化饲料如粉状饲料上液体施用的用途，其中该酶颗粒具有低的粉尘形成趋势，并且其中该酶颗粒在施用前溶解于水中。
3.根据实施例1或2所述的用途，其中通过喷雾将该溶解的颗粒作为液体组合物施用于丸粒或粉状饲料上。
4.根据实施例3所述的用途，其中将该溶解的颗粒施用于丸粒上。
5.根据实施例4所述的用途，其中将该溶解的颗粒施用于热处理的丸粒上。
6.根据实施例1至5中任一项所述的用途，其中通过喷在模具上，喷雾到螺旋输送机中，喷入集气室或堰中，或使用旋转盘进行喷雾以雾化液体，将该溶解的颗粒作为液体组合物喷雾到丸粒或粉状饲料上。
7.根据实施例6所述的用途，将该颗粒溶解并喷雾到在饲料研磨机中的饲料丸粒或粉状饲料上。
8.根据实施例1至7中任一项所述的用途，其中在施用之前将酸与该颗粒一起溶解于水中。
9.根据实施例8所述的用途，其中该酸选自由以下组成的组：山梨酸、抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸及其混合物。
10.根据实施例9所述的用途，其中该酸是柠檬酸。
11.根据实施例1至10中任一项所述的用途，其中该酶颗粒导致在处理过程中很少或没有总粉尘释放。
12.根据实施例1至11中任一项所述的用途，其中当在霍伊巴赫1型测定中测量时，总粉尘低于1000μg/g，和/或当在淘洗测定中测量时，总粉尘低于1000μg/g。
13.根据实施例1至12中任一项所述的用途，其中当在霍伊巴赫1型测定中测量时，总粉尘低于500μg/g，霍伊巴赫1型测定中的总粉尘低于250μg/g，霍伊巴赫1型测定中的总粉尘低于100μg/g，或霍伊巴赫1型测定中的总粉尘低于50μg/g。
14.根据实施例1至13中任一项所述的用途，其中当在淘洗测定中测量时，总粉尘低于500μg/g，淘洗测定中的总粉尘低于250μg/g，淘洗测定中的总粉尘低于100μg/g，或淘洗测定中的总粉尘低于50μg/g。
15.根据实施例1至14中任一项所述的用途，其中当在霍伊巴赫1型测定中测量时，活性粉尘分数低于20ppm，和/或当在淘洗测定中测量时，活性粉尘分数低于80ppm。
16.根据实施例1至15中任一项所述的用途，其中当在霍伊巴赫1型测定中测量时，活性粉尘分数低于10ppm，霍伊巴赫1型测定中的活性粉尘分数低于6ppm、低于2ppm或低于0.5ppm。
17.根据实施例1至16中任一项所述的用途，其中当在淘洗测定中测量时，活性粉尘分数低于40ppm，淘洗测定中的活性粉尘分数低于20ppm、低于10ppm、低于4ppm、低于2ppm或低于0.5ppm。
18.根据实施例1至17中任一项所述的用途，其中该颗粒是混合器造粒产品、压实粉末颗粒、颗粒化颗粒、挤出颗粒或层状颗粒。
19.根据实施例18所述的用途，其中该颗粒是层状颗粒。
20.根据实施例1至19中任一项所述的用途，其中该颗粒包含核心和一个或多个含酶层，其中该含酶层包含酶和粘合剂，例如碳水化合物。
21.根据实施例1至20中任一项所述的用途，其中该颗粒在该含酶层上具有外包衣。
22.根据实施例1至21中任一项所述的用途，其中该颗粒进一步包含微生物稳定剂。
23.根据实施例22所述的用途，其中该颗粒中的微生物稳定剂存在于该核心、该含酶层、该外包衣或其任何组合中。
24.根据实施例22至23中任一项所述的用途，其中该微生物稳定剂的存在量为该颗粒的5％至50％。
25.根据实施例22至24中任一项所述的用途，其中该微生物稳定剂的存在量为该颗粒的20％至40％。
26.根据实施例1至25中任一项所述的用途，其中该颗粒包含核心和一个或多个含酶层，其中该核心包含惰性材料和/或微生物稳定剂，并且该含酶层包含酶和粘合剂，例如碳水化合物。
27.根据实施例26所述的用途，其中该颗粒包含一个包覆在该核心上的含酶层，并且该含酶层包含酶和粘合剂，例如碳水化合物。
28.根据实施例1至27中任一项所述的用途，其中该颗粒包含核心和包覆在该核心上的含酶层，其中该核心包含惰性材料，并且该含酶层包含酶和粘合剂，例如碳水化合物。
29.根据实施例1至28中任一项所述的用途，其中该颗粒包含核心和包覆在该核心上的含酶层，其中该核心包含微生物稳定剂，并且该含酶层包含酶和粘合剂，例如碳水化合物。
30.根据实施例20至29中任一项所述的用途，其中该粘合剂是碳水化合物。
31.根据实施例20至30中任一项所述的用途，其中该碳水化合物选自由以下组成的组：果糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、麦芽糖糊精、半乳糖、甘露糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖和山梨醇。
32.根据实施例20至31中任一项所述的用途，其中该碳水化合物选自由以下组成的组：糊精和蔗糖。
33.根据实施例20至32中任一项所述的用途，其中该碳水化合物是糊精。
34.根据实施例20至32中任一项所述的用途，其中该碳水化合物是蔗糖。
35.根据实施例20至34中任一项所述的用途，其中该颗粒中该碳水化合物与该活性酶之间的比率使得当以干固体形式测量时，该碳水化合物在该颗粒中的存在量为该活性酶量的30％至130％。
36.根据实施例1至35中任一项所述的用途，其中该颗粒包含核心和包覆在该核心上的含酶层，其中该核心包含惰性材料，并且该含酶层包含酶和糊精。
37.根据实施例20至36中任一项所述的用途，其中该核心包含选自由以下组成的组的其他成分：粘合剂、活性成分、酶稳定剂、微生物稳定剂及其组合。
38.根据实施例20至37中任一项所述的用途，其中该核心包含选自由以下组成的组的惰性材料：硫酸钠、氯化钠、碳酸钠、硝酸钠、磷酸钠、磷酸氢钠、硫酸铵、氯化铵、碳酸铵、硝酸铵、磷酸铵、磷酸氢铵、硫酸钾、氯化钾、碳酸钾、硝酸钾、磷酸钾、磷酸氢钾、硫酸镁、硫酸锌、柠檬酸钠、糖、碳水化合物(例如像蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖或山梨醇)及其组合。
39.根据实施例20至38中任一项所述的用途，其中该核心包含选自由以下组成的组的惰性材料：硫酸钠、氯化钠及其混合物。
40.根据实施例20至39中任一项所述的用途，其中该核心包含选自由以下组成的组的微生物稳定剂：山梨酸、抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸、山梨酸的盐、抗坏血酸的盐、柠檬酸的盐、苯甲酸的盐、山梨酸钾、柠檬酸钠、苯甲酸钠及其组合。
41.根据实施例20至40中任一项所述的用途，其中该核心中的微生物稳定剂选自由以下组成的组：山梨酸及其盐、抗坏血酸及其盐、柠檬酸及其盐、苯甲酸及其盐、山梨酸钾、柠檬酸钠和/或苯甲酸钠及其组合。
42.根据实施例40或41所述的用途，其中该山梨酸的盐是山梨酸钠或山梨酸钾，该抗坏血酸的盐是抗坏血酸钠或抗坏血酸钾，该柠檬酸的盐是柠檬酸钠或柠檬酸钾，和/或该苯甲酸的盐是苯甲酸钠或苯甲酸钾。
43.根据实施例20至42中任一项所述的用途，其中该核心中的微生物稳定剂选自：苯甲酸、山梨酸、苯甲酸的盐、山梨酸的盐及其组合。
44.根据实施例20至43中任一项所述的用途，其中该核心中的微生物稳定剂是苯甲酸钠或苯甲酸钾。
45.根据实施例20至44中任一项所述的用途，其中该核心中的微生物稳定剂进一步包含弱酸，例如苯甲酸、柠檬酸、山梨酸或乙酸。
46.根据实施例20至45中任一项所述的用途，其中该微生物稳定剂是山梨酸和山梨酸钾的混合物。
47.根据实施例20至46中任一项所述的用途，其中该核心中的微生物稳定剂是山梨酸，并且其中将山梨酸钾添加到该酶层中。
48.根据实施例21至47中任一项所述的用途，其中该外包衣包含盐和任选的一种或多种有机包衣材料，例如蜡(例如聚乙二醇、聚丙烯、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、蜂蜡、氢化植物油或动物脂油、氢化棕榈油、脂肪酸醇、单甘油酯和/或二甘油酯、微晶蜡、石蜡和/或脂肪酸)。
49.根据实施例21至48中任一项所述的用途，其中该外包衣进一步包含微生物稳定剂。
50.根据实施例49所述的用途，其中该外包衣中的微生物稳定剂选自由以下组成的组：山梨酸、抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸、山梨酸的盐、抗坏血酸的盐、柠檬酸的盐、苯甲酸的盐、山梨酸钾、柠檬酸钠、苯甲酸钠及其组合。
51.根据实施例49至50中任一项所述的用途，其中该外包衣中的微生物稳定剂选自由以下组成的组：山梨酸及其盐、抗坏血酸及其盐、柠檬酸及其盐、苯甲酸及其盐、山梨酸钾、柠檬酸钠、苯甲酸钠及其组合。
52.根据实施例51所述的用途，其中该山梨酸的盐是山梨酸钠或山梨酸钾，该抗坏血酸的盐是抗坏血酸钠或抗坏血酸钾，该柠檬酸的盐是柠檬酸钠或柠檬酸钾，和/或该苯甲酸的盐是苯甲酸钠或苯甲酸钾。
53.根据实施例49至52中任一项所述的用途，其中该外包衣中的微生物稳定剂选自由以下组成的组：山梨酸、抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸、山梨酸钾、柠檬酸钠、苯甲酸钠及其组合。
54.根据实施例49至53中任一项所述的用途，其中该外包衣中的微生物稳定剂是抗坏血酸和/或柠檬酸。
55.根据实施例49至53中任一项所述的用途，其中该外包衣中的微生物稳定剂是山梨酸和山梨酸钾的混合物。
56.根据实施例48至55中任一项所述的用途，其中该外包衣中的盐选自由以下组成的组：硫酸钠、氯化钠、碳酸钠、硝酸钠、磷酸钠、磷酸氢钠、硫酸铵、氯化铵、碳酸铵、硝酸铵、磷酸铵、磷酸氢铵、硫酸钾、氯化钾、碳酸钾、硝酸钾、磷酸钾、磷酸氢钾、硫酸镁、硫酸锌、柠檬酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、抗坏血酸钠及其混合物。
57.根据实施例48至56中任一项所述的用途，其中该外包衣中的盐选自由以下组成的组：柠檬酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和抗坏血酸钠。
58.根据实施例56所述的用途，其中该外包衣中的盐是硫酸钠。
59.根据实施例20至58中任一项所述的用途，其中该微生物稳定剂存在于该颗粒的核心、含酶层和外包衣中。
60.根据实施例59所述的用途，其中山梨酸存在于该核心中，山梨酸钾存在于该酶层中，并且硫酸钠存在于该外包衣中。
61.根据实施例1至60中任一项所述的用途，其中该颗粒包含至少10％的活性酶，例如至少20％的活性酶或至少30％的活性酶。
62.根据实施例1至61中任一项所述的用途，其中该酶选自由以下组成的组：淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、胞壁质酶、木聚糖酶、磷脂酶和糖氧化酶或其混合物。
63.根据实施例1至62中任一项所述的用途，其中该颗粒是在流化床方法中生产的层状颗粒。
64.根据实施例63所述的用途，其中该颗粒具有特征性的洋葱型结构。
65.根据实施例63或64所述的用途，其中该颗粒具有同心的均匀层。
66.根据实施例1至65中任一项所述的用途，其中该颗粒的粒度分布(PSD)具有至少400μm的D50和至少300μm的D10。
67.根据实施例66所述的用途，其中该颗粒的PSD具有至多1400μm的D90。
68.根据实施例67所述的用途，其中该颗粒的PSD具有至多1200μm的D90。
69.根据实施例66至68中任一项所述的用途，其中该颗粒的PSD具有500至1000μm的D50。
70.根据实施例1至69中任一项所述的用途，其中当将该颗粒在施用前溶解于水中时，其浓度为0.5％至25％。
71.根据实施例70所述的用途，其中该颗粒的浓度为0.5％至10％。
72.根据实施例71所述的用途，其中该颗粒的浓度为0.5％至5％。
73.根据实施例1至72中任一项所述的用途，其中当将该颗粒以1.5％的浓度溶解于水中时，pH为3.5至5.5。
74.根据实施例1至73中任一项所述的用途，其中该颗粒可溶于水。
75.根据实施例74所述的用途，其中通过以下方式测定该颗粒的溶解度：a)将该颗粒以1.5％的浓度溶解于水中，b)将来自步骤a)的溶液通过100微米的筛网过筛，c)干燥该筛网，以及d)检查被该筛网捕获的不溶物的重量；
其中如果残留物少于0.5％，则该颗粒可溶于水。
76.根据实施例75所述的用途，其中如果残留物少于0.25％，则该颗粒可溶于水。
77.根据实施例75所述的用途，其中如果残留物少于0.1％，则该颗粒可溶于水。
78.用于生产根据实施例1至77中任一项所述使用的低粉尘酶颗粒的方法，该方法包括制备包含核心和至少一种酶的颗粒，其中该酶分布在该核心中和/或在该核心上分层，以及将外层施加到该核心或层状颗粒上以获得包衣颗粒。
79.根据实施例78所述的方法，其中该颗粒是在流化床装置中制备的。
实例
分析方法
由霍伊巴赫1型测定的总粉尘
总粉尘(来自活性和非活性颗粒成分的粉尘)通过熟知的霍伊巴赫1型方法进行测定。在测定中，将称量出的样品量置于含有三个整合刀片的转鼓中。水平气流以20L/min的流速通过鼓。该气流引导最细的粒子进一步通过非旋转的水平玻璃柱，其中最大的粒子被分离。空气传播的粉尘被进一步引导并收集在过滤室的过滤器上。通过在分析之前和之后称重过滤室来测定过滤器上酶粉尘的量。结果表示为每g产品释放的μg粉尘。
分析条件：
温度： 室温
样品量： 50.0g
气流速度： 20L/min.
旋转速度： 30rpm
分析时间： 5min.
空气湿度： 30％RH-70％RH
纤维玻璃过滤器： 5cm GF92
由霍伊巴赫1型粉尘计测定的活性粉尘分数
通过用于所讨论的酶的粉尘过滤器的分析方法来测定过滤器上活性酶的量(从如总粉尘测定中说明的霍伊巴赫1型方法获得)。测定酶在粉尘过滤器上的活性，并且通过将每克样品释放的粉尘过滤器上的酶活性除以每克样品的酶总活性来获得活性粉尘分数并表示为ppm(在粉尘过滤器上获得的活性/在产品上的总活性x 106)。
由淘洗测定的总粉尘
在测定中，酶颗粒使用玻璃柱中的空气流化。释放的粉尘被收集在玻璃纤维过滤器上。通过在分析之前和之后称重过滤器来测定过滤器上酶粉尘的量。结果表示为每g产品释放的μg粉尘。
分析条件：
温度： 室温
样品量： 60,0g
气流速度： 2.83m3/小时-0.8m/s
分析时间： 40min.
空气湿度： 0％RH-1％RH
纤维玻璃过滤器：
Figure BDA0003111790090000241
cm Whatman GF/C目录号1822-150
由淘洗测定的活性粉尘分数
通过用于所讨论的酶的粉尘过滤器的分析方法来测定过滤器上活性酶的量(从如总粉尘测定中说明的淘洗方法获得)。测定酶在粉尘过滤器上的活性，并且通过将每克样品释放的粉尘过滤器上的酶活性除以每克样品的酶总活性来获得活性粉尘分数并表示为ppm(在粉尘过滤器上获得的活性/在产品上的总活性x 106)。
活性酶含量的测定
使用相关的酶活性方法测定活性酶含量。可以通过活性测量和蛋白质浓度测定(例如SDS-PAGE、氨基酸分析、从产品中纯化和定量)来确定活性和酶含量(例如，以g/kg材料计的量)之间的相关性。将每克产品的活性除以酶的比活性(每克纯酶释放的活性)来计算活性酶含量并以重量％表示。
例如，通过熟知的FYT方法测定植酸酶活性。可以使用ISO30024:2009认可的其他方法，例如FTU或OTU。以下是有关如何在微量滴定板设置上测定植酸酶活性的实例：
将适当稀释于0.25M乙酸钠、0.005％(w/v)Tween-20(pH 5.5)中的75微升含植酸酶的酶溶液分配在微量滴定板孔例如NUNC269620中，并且添加75微升底物(通过将100mg来自稻的植酸钠(奥德里奇公司(Aldrich)目录号274321)溶解于10ml 0.25M乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中来制备)。将板密封并孵育15min，在37℃下以750rpm振荡。在孵育之后，添加75微升终止剂(该终止剂是通过将10ml钼酸盐溶液(10％(w/v)七钼酸铵于0.25％(w/v)氨溶液中)、10ml钒酸铵(来自Bie&Berntsen公司(Bie&Berntsen)的0.24％商业产品，目录号LAB17650)和20ml 21.7％(w/v)硝酸混合来制备)，并且在微量滴定板分光光度计中测量405nm处的吸光度。植酸酶活性以FYT单位表示，一个FYT是酶在上述条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸盐的量。所测量的植酸酶活性的绝对值可以通过参考从无机磷酸盐的适当稀释物制得的标准曲线或通过参考从具有已知活性的植酸酶酶制剂的稀释物得到的标准曲线获得(这种具有已知活性的标准酶制剂经要求是可从DK-2880巴格斯维尔德的克罗格休约尔36的诺维信公司(Novozymes A/S,Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd)获得的)。
流动性评估
颗粒或粉末样品的流动性可以以不同的方式确定。一种典型的方法是通过评估所谓的“静止角”，在该静止角中测量相对于水平面的最陡下降角，材料可以在不倾塌的情况下堆放到该水平面。在该角度下，倾斜面上的材料处于滑动的边缘。静止角的范围可以是从0°至90°。
实例说明
以下实例中的产品是通过分层造粒方法生产的，其中核心被一系列包含产品中活性成分的层所包覆。
实例1：盐核心上的酶层
实例1涵盖了最简单形式的产品。核心材料是速溶盐，并且酶以单层形式施用。
通过在Russel-Finex C400中过筛来制备Na2SO4核心(PSD 250-355μm)。
将2500g核心加载到Glatt Procell GF3流化床中。
制备饲料：
12300g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000261
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至39,5％DS
632g糊精Avedex W80。
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的核心上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 2,4巴
气流速度： 140-150m3/小时
气温： 100℃
进料流量： 45-55g/min
产品温度，包衣： 50℃-55℃
产品温度，干燥： 60℃。
实例2：盐层包衣产品
根据实例1生产的产品被赋予第二层包衣。以最简单的形式，第二层是由速溶盐制成的。在工艺条件下施用盐以实现层的高度均匀性。
通过在Russel-Finex C400中过筛来制备Na2SO4核心(PSD 250-355μm)。
将2500g核心加载到Glatt Procell GF3流化床中。
制备用于酶层的饲料：
13100g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000271
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至39,5％DS
326g糊精Avedex W80。
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的核心上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 2,4巴
气流速度： 90-130m3/小时
气温： 100℃
进料流量： 45-65g/min
产品温度，包衣： 55℃-63℃
产品温度，干燥： 60℃。
将4000g该产品重新加载到Glatt Procell GF3流化床中。
生产用于盐层的饲料：
348g Na2SO4
852g的40℃-45℃水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,2-1,8巴
气流速度： 140-150m3/小时
气温： 130℃
进料流量： 90-145g/min
产品温度，包衣： 50℃-55℃
产品温度，干燥： 60℃。
实例3：蜡层包衣产品
根据实例2生产的产品被赋予第三层。该层的材料是蜡、聚合物或油或其混合物。
将2500g实例1中生产的产品重新加载到Glatt Procell GF3流化床中。
制备了用于较厚的酶层的饲料：
12300g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000281
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至39,5％DS
632g糊精Avedex W80。
施加与实例1相同的工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上。
将7000g该产品重新加载到Glatt Procell GF3流化床中。
制备用于盐层的饲料：
413g Na2SO4
1011g的40℃-45℃水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 3,0-3,5巴
气流速度： 160m3/小时
气温： 170℃
进料流量： 110-200g/min
产品温度，包衣： 50℃-55℃
产品温度，干燥： 60℃。
将4000g盐层包衣产品重新加载到Glatt Procell GF3流化床中。
制备用于蜡层的饲料：
68g PEG 4000
100g HPMC
1103g水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 2,0巴
气流速度： 150m3/小时
气温： 80℃
进料流量： 20-30g/min
产品温度，包衣： 45℃
实例4：含有微生物稳定剂的产品
在该产品中，将微生物稳定剂苯甲酸钠作为核心材料掺入分层造粒方法中。
通过在Russel-Finex C400中过筛来制备苯甲酸钠核心(PSD 250-500μm)。
将2000g核心加载到Glatt Procell GF3流化床中。
如实例3中的两个步骤施加酶层。
生产用于第一酶层的饲料：
13480g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000291
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至39,5％DS
692g糊精Avedex W80。
施加以下配置和工艺参数将该饲料喷雾到流化床中的核心上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,2-2,0巴
气流速度： 70-150m3/小时
气温： 100℃
进料流量： 10-65g/min
产品温度，包衣： 55℃
产品温度，干燥： 60℃。
将2500g该产品重新加载到Glatt Procell GF3流化床中。
生产用于第二酶层的饲料：
12300g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000292
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至39,5％DS
632g糊精Avedex W80。
施加以下配置和工艺参数将该饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,5-2,0巴
气流速度： 90-130m3/小时
气温： 90℃
进料流量： 10-60g/min
产品温度，包衣： 55℃
产品温度，干燥： 60℃。
将7000g该产品重新加载到Glatt Procell GF3流化床中。
制备用于盐层的饲料：
455g Na2SO4
1114g的40℃-45℃水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,5-2,4巴
气流速度： 160m3/小时
气温： 130℃
进料流量： 45-145g/min
产品温度，包衣： 55℃
产品温度，干燥： 60℃。
将4000g盐层包衣产品重新加载到Glatt Procell GF3流化床中。
制备用于蜡层的饲料：
68g PEG 4000
100g HPMC
904g水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 2,0巴
气流速度： 150m3/小时
气温： 80℃
进料流量： 35-60g/min
产品温度，包衣： 45℃。
实例5：pH控制剂组合微生物稳定剂
该产品包含柠檬酸作为pH控制剂用于完成微生物稳定剂***。柠檬酸作为颗粒掺入配制品中，并且与酶颗粒相匹配的PSD作为用于控制产品均质性的手段。
根据实例4生产1000g产品，最后的蜡包衣除外。
将131g柠檬酸一水合物
合并到滚动混合器中并匀化10min。
选择柠檬酸的量，以使颗粒混合物在水中的溶液在1.5％w/w浓度下的pH在4.0-4.5的范围内。在该低pH下且苯甲酸钠在水中的所得浓度下，溶液是微生物稳定的。
实例6：具有分离层的产品
可以通过盐、糖或糊精的薄层将酶层与核心和外层分离。在该实例中，将酶层与核心中的苯甲酸钠分离以提高生产过程中的稳定性。
通过在Russel-Finex C400中过筛来制备苯甲酸钠核心(PSD 250-800μm)。
将2500g核心加载到Glatt Procell GF3流化床中。
生产用于盐分离层的饲料：
325g Na2SO4
796g的40℃-45℃水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,2-1,8巴
气流速度： 140-150m3/小时
气温： 130℃
进料流量： 90-145g/min
产品温度，包衣： 50℃-55℃
生产用于第一酶层的饲料：
12131g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000321
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至39,5％DS
383g糊精Avedex W80。
施加与实例2中用于酶层的相同的条件，将饲料喷雾到流化床中的材料上。
清除流化床直至剩下2500g产品，并施加第二酶层：
4763g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000322
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至39,5％DS
150g糊精Avedex W80。
生产用于最终盐层的饲料：
315g Na2SO4
771g的40℃-45℃水
施加与实例2中用于盐层的相同的工艺条件，将饲料喷雾到流化床中的第二层材料上。
按照实例5中所述的方法，用控制pH的柠檬酸配制产品：
2000g用盐层包衣的产品
将367g柠檬酸一水合物
合并到滚动混合器中并匀化10min。
实例7：酶稳定剂
可以将用于特定酶的特定稳定剂添加到酶和粘合剂层中。在此引入乙酸锌作为植酸酶的稳定剂。
实例8：颗粒的粉尘、流动性、溶解度和活性
测试实例1至6和9至15中制备的颗粒以及现有技术中市售用于PPLA的水溶性粉末的颗粒的粉尘、流动性、溶解度和活性。测试结果提供于表1中。
表1
Figure BDA0003111790090000331
Figure BDA0003111790090000341
*粉尘测量值存在差异，在不同的运行中获得了16256μg/g，其中没有进行活性粉尘测量。
实例9：酶和微生物稳定剂的完全整合共配制
在该实例中，将完整的微生物稳定剂***整合到单个颗粒中。微生物稳定剂山梨酸被整合为产品中的核心。山梨酸钾用于微生物稳定和pH控制两者。将山梨酸钾引入酶层中。
通过在Russel-Finex C400中过筛来制备山梨酸核心(PSD 150-800μm)。
将800g核心加载到Glatt Procell AGT100流化床中。
生产用于盐分离层的饲料：
112g Na2SO4
274g的40℃-45℃水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,0巴
气流速度： 40m3/小时
气温： 80℃
进料流量： 5-15g/min
产品温度，包衣： 40℃
如实例3中的两个步骤施加酶层。
生产用于第一酶层的饲料：
3630g酶浓缩物，通过UF纯化并浓缩至39,5％DS
114g Avedex W80
101g山梨酸钾。
施加以下配置和工艺参数将该饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,5-2,0巴
气流速度： 40m3/小时
气温： 80℃
进料流量： 12-15g/min
产品温度，包衣： 40℃
产品温度，干燥： 70℃。
将2054g该产品重新加载到Glatt Procell GF3流化床中。
生产用于第二酶层的饲料：
9551g酶浓缩物，通过UF纯化并浓缩至39,5％DS
314g Avedex W80
296g山梨酸钾。
施加以下配置和工艺参数将该饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,2-1,4巴
气流速度： 70-120m3/小时
气温： 90℃
进料流量： 10-40g/min
产品温度，包衣： 50℃-54℃。
产品温度，干燥： 70℃。
生产用于最终盐层的饲料：
376g Na2SO4
920g的40℃-45℃水
施加与实例2中用于盐层的相同的工艺条件，将饲料喷雾到流化床中的第二层材料上。
实例10.将微生物稳定剂***的pH控制元件掺入表面包衣(top coat)中
根据实例4中的描述制备盐包衣产品。将表面包衣施加到该产品(其包括pH控制剂)上。在该实例中，抗坏血酸用于pH控制。抗坏血酸在控制产品的粉尘释放性能方面具有出乎意料的良好效果。
将1000g根据实例4的盐包衣产品加载到Glatt Procell AGT100流化床中。
生产用于表面包衣的饲料：
271g Na2SO4
271g抗坏血酸
700g的40℃-45℃水
施加以下配置和工艺参数将该饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,2-1,4巴
气流速度： 70m3/小时
气温： 120℃
进料流量： 40g/min
产品温度，包衣： 43℃-49℃。
实例11.核心和酶层之间的糊精层以及蔗糖作为酶层的粘合剂
使用了来自圣玛尔塔公司(Santa Marta)，Na-G1(粗)的Na2SO4核心。
将2500g核心加载到Glatt Procell GF3流化床中。
生产用于糊精分离层的饲料：
63g糊精Avedex W 80
188g的40℃-45℃水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,8-2,0巴
气流速度： 90m3/小时
气温： 90℃
进料流量： 7g/min
产品温度，包衣： 59℃-68℃
制备用于酶层的饲料：
9603g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000372
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至34％DS
676g蔗糖。
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的核心上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 2,0巴
气流速度： 110-140m3/小时
气温： 80℃
进料流量： 15-30g/min
产品温度，包衣： 58℃-63℃
生产用于盐层的饲料：
423g Na2SO4
1041g的40℃-45℃水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 2,0巴
气流速度： 140m3/小时
气温： 90℃
进料流量： 40-95g/min
产品温度，包衣： 50℃-63℃
产品温度，干燥： 60℃。
实例12.包含木聚糖酶的盐层包衣颗粒
该实例中的酶是木聚糖酶(
Figure BDA0003111790090000371
WX)，并且基本产品设计与实例2中所述的产品相似。该实例描述了粘合剂的剂量控制，以最佳地控制酶的结合与凝集粒子的大的凝集物形成之间的平衡。需要良好的粘合性，以获得良好的工艺产率和较低的产品粉尘释放量。
通过在Russel-Finex C400中过筛来制备Na2SO4核心(PSD 250-450μm)。
将2500g核心加载到Glatt Procell GF3流化床中。
将酶浓缩物通过UF纯化并浓缩至20,2％DS。粘合剂是糊精Avedex W 80。制备了四种饲料溶液：
饲料1 饲料2 饲料3 饲料4
酶浓缩物 308 g 928g 6220g 11888
粘合剂 186g 189g 620g 600g
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的核心上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,2-1,4巴
气流速度： 90m3/小时逐渐增加到140m3/小时
气温： 85℃逐渐增加到100℃
进料流量： 10g/min逐渐增加到42g/min
产品温度，包衣： 59℃-62℃。
生产用于盐层的饲料：
364g Na2SO4
891g的40℃-45℃水
施加以下配置和工艺参数将饲料喷雾到流化床中的产品上：
操作模式： 底喷
喷嘴： 1,2mm
喷嘴气压： 1,2巴
气流速度： 150m3/小时
气温： 100℃
进料流量： 30-55g/min
产品温度，包衣： 50℃-63℃
产品温度，干燥：70℃。
实例13.包含蛋白酶的盐层包衣颗粒
产品设计与实例2相似，并且施加了相似的工艺条件。
通过在Russel-Finex C400中过筛来制备Na2SO4核心(PSD 250-350μm)。
将2500g核心加载到Glatt Procell GF3流化床中。
制备用于酶层的饲料：
11976g蛋白酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000391
Proact)，通过UF纯化并浓缩至40,7％DS
682g糊精Avedex W 80。
生产用于盐层的饲料：
366g Na2SO4
896g的40℃-45℃水。
实例14.低蔗糖剂量
与实例11类似的产品配方和工艺条件，但与实例11相比，含酶层的蔗糖剂量较低：
10100g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000392
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至34％DS
505g蔗糖。
实例15.糊精作为粘合剂
与实例11类似的产品配方和工艺条件，但含酶层使用糊精Avebe W80剂量代替蔗糖作为粘合剂：
12075g植酸酶浓缩物(
Figure BDA0003111790090000393
HiPhos)，通过UF纯化并浓缩至34％DS
1330g糊精Avebe W80。

Claims (15)

1.低粉尘酶颗粒用于丸粒化后液体施用(PPLA)或在至少一种酶的其他类型的非丸粒化饲料如粉状饲料上施用的用途，其中该酶颗粒在施用前溶解于水中。
2.根据权利要求1所述的用途，其中通过喷雾将该溶解的颗粒作为液体组合物施用于丸粒或粉状饲料上。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中当在霍伊巴赫1型测定中测量时，总粉尘低于1000μg/g，和/或当在淘洗测定中测量时，总粉尘低于1000μg/g。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中当在霍伊巴赫1型测定中测量时，活性粉尘分数低于20ppm，和/或当在淘洗测定中测量时，活性粉尘分数低于80ppm。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中该颗粒是层状颗粒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中该颗粒包含核心和一个或多个含酶层，其中该含酶层包含酶和粘合剂，例如碳水化合物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中该颗粒在该含酶层上具有外包衣。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中该颗粒进一步包含微生物稳定剂。
9.根据权利要求8所述的用途，其中该颗粒中的微生物稳定剂存在于该核心、该含酶层、该外包衣或其任何组合中。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中该微生物稳定剂选自由以下组成的组：山梨酸、抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸、山梨酸的盐、抗坏血酸的盐、柠檬酸的盐、苯甲酸的盐、山梨酸钾、柠檬酸钠、苯甲酸钠及其组合。
11.根据权利要求10所述的用途，其中该微生物稳定剂选自：苯甲酸、山梨酸、苯甲酸的盐、山梨酸的盐及其组合。
12.根据权利要求6至10中任一项所述的用途，其中该核心中的材料是惰性材料和/或微生物稳定剂，
其中该惰性材料选自由以下组成的组：硫酸钠、氯化钠、碳酸钠、硝酸钠、磷酸钠、磷酸氢钠、硫酸铵、氯化铵、碳酸铵、硝酸铵、磷酸铵、磷酸氢铵、硫酸钾、氯化钾、碳酸钾、硝酸钾、磷酸钾、磷酸氢钾、硫酸镁、硫酸锌、柠檬酸钠、糖、碳水化合物(例如像蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖或山梨醇)及其组合，并且
其中该微生物稳定剂选自由以下组成的组：山梨酸、抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸、山梨酸的盐、抗坏血酸的盐、柠檬酸的盐、苯甲酸的盐、山梨酸钾、柠檬酸钠、苯甲酸钠及其组合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用途，其中该酶选自由以下组成的组：淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、胞壁质酶、木聚糖酶、磷脂酶和糖氧化酶或其混合物。
14.用于生产根据权利要求1至13中任一项所述使用的低粉尘酶颗粒的方法，该方法包括制备包含核心和至少一种酶的颗粒，其中该酶分布在该核心中和/或在该核心上分层，以及将外层施加到该核心或层状颗粒上以获得包衣颗粒。
15.根据权利要求14所述的方法，其中该颗粒是在流化床装置中制备的。
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