DE69130071T2 - Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches mittel gegen chronische virale leberkrankheiten - Google Patents
Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches mittel gegen chronische virale leberkrankheitenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, welche eine Polypeptidsequenz und einen Träger umfaßt; zur Bereitstellung eines Heilmittels gegen chronische virale Lebererkrankungen. Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für die Polypeptidsequenzen codieren, und transflzierte Zellen zur Expression derselben.
- Mindestens fünf verschiedene Viren, nämlich Hepatitis-Virus A, B, C, D und E, sind in der Lage, den klinischen Aspekt einer akuten Hepatitis hervorzurufen. Anders als bei Hepatitis A und E, welche enteral übertragen werden und zum Tod des Patienten führen können, können Hepatitis B, C (früher bezeichnet als parenterale Non-A-Non-B-Hepatitis) und D in ein chronisches Entzündungsstadium fortschreiten, das seinerseits zu Leberzurhose und primärem hepatozellulären Karzinom führen kann.
- Es stehen relativ wenig Daten über Hepatitisgruppen C und D, über Verfahren für die Diagnose und ihre Behandlung und über die jeweiligen Viren zur Verfügung. Das Hepatitis-D- Virus ist ein RNA-Virus, welches bekanntermaßen unvollständig ist. Deshalb benötigt es einen Helfervirus, um sich in Patienten zu entwickeln, und wird lediglich in Personen angetroffen, welche mit HBV infiziert sind. Erst vor sehr kurzer Zeit ist das Hepatitis-C-Virus nachgewiesen worden, und ein Antikörpertest (Anti-HCV), der die Diagnose chronischer Hepatitis- C-Infektionen erleichtert, wurde entwickelt. Jedoch besteht ein zunehmend dringlicher Bedarf nach einer Behandlung, um diese Krankheit zu heilen.
- Dasselbe gilt für chronische Hepatitis B, einer viel besser untersuchten Krankheit hinsichtlich ihrer Erkennung mittels immunologischer Methoden, ihres verursachenden Virus und hinsichtlich viralem Lebenszyklus und DNA-Sequenz. Man sagt, daß Patienten chronische Träger des Hepatitis-B-Virus sind, wenn die virale DNA länger als zehn Wochen fortbesteht, das HBe-Antigen (HBeAg) für mehr als zwölf Wochen fortbesteht oder wenn das Hepatitis-B- Oberflächenantigen (HIBsAg) länger als sechs Monate beständig ist.
- Ungefähr dreihundert Millionen Menschen sind dazu verdammt, unter chronischer Hepatitis-B zu leiden, wobei die meisten davon im fernen Osten leben.
- Für diese Menschen scheint das Hauptrisiko, infiziert zu werden, während oder unmittelbar nach der Geburt vorzuliegen, da eine chronisch infizierte Mutter das Virus an ihr Neugeborenes überträgt. 90 Prozent der auf diesem Wege infizierten Kinder werden während ihres späteren Lebens auch chronisch infiziert werden. In der westlichen Welt tritt die Infektion gewöhnlicher später im Leben, während der Kindheit oder sogar der Erwachsenenzeit, auf; und zwar hauptsächlich durch eine parenterale oder sexuelle Übertragung. In diesen Fällen von Hepatitis-B-Infektion nach der Geburt werden lediglich fünf bis zehn Prozent der Infizierten zu chronischen Trägern. Das übertragene Virus ist allerdings nicht für die von infizierten Menschen aufgezeigten unterschiedlichen Reaktionen verantwortlich, das Virus entweder zu eliminieren oder es lebenslang im Körper zu behalten. Folglich scheint es eine Angelegenheit des immunologischen Zustands zu sein, welcher das zukünftige Körperbefinden bestimmt.
- Das HB-Virion (Dane-Partikel) ist aus verschiedenen Strukturproteinen aufgebaut, den Kernproteinen und den Oberflächen-(S)-Proteinen. Die letzteren sind Translationsprodukte eines offenen Leserasters, das sich über die codierende Sequenz von drei S-Typ-Domänen erstreckt, von denen jede mit einem ATG-Triplett beginnt, das fähig zur Initijerung der Translation in vivo ist. Die Domänen werden als prä-S1, prä-S2 und S in der Reihenfolge vom 5'- zum 3'-Ende des Moleküls bezeichnet. Es gibt sechs Proteinprodukte, die aus diesem ORF abgeleitet werden: Eine glykosylierte und eine nicht-glykosylierte Form des Hauptproteins (gp27 und p24), welches nur von der S-Domäne translatiert wird (226 Aminosäuren) (hier nachstehend bezeichnet als HBV-S-Peptide), ein mittleres Protein (281 Aminosäuren) mit einer oder zwei Polysaccharidseitenketten (gp33 bzw. gp36), das von der prä-S2- und S-Region codiert wird (hier nachstehend bezeichnet als HBV-52-Peptide), und schließlich sowohl eine glykosylierte (gp42) und eine nicht-glykosylierte (p39) Form des großen Proteins (389-400 Aminosäuren, abhängig von dem viralen Serotyp), welches durch Translation von prä-S1, prä- S2 und S gebildet wird (hier nachstehend bezeichnet als HBV-S1-Peptide). Die Kernproteine sind HBcAg und HBeAg, wobei das letztgenannte denkbarerweise ein Prozessierungsprodukt von HBcAg ist. Das Kernprotein kann ein prä-Kernpeptid tragen.
- Der Dane-Partikel, welcher das infektiöse Virion ist, umfaßt sowohl Kern- als auch Oberflächenproteine, wohingegen die Filamente aus einer Mischung der sechs Oberflächenantigene bestehen. Die HBV-S-, -S2- und -S1-Peptide (wie hierin definiert) assemblieren sich alleine derartig, daß die sogenannten 20-nm-Partikel gebildet werden, welche vollständig uninfektiös sind.
- Mit dem HB-V rus infizierte Patienten durchlaufen mehrere Stadien der Hepatitis, bevor sie als chronisch HBV infiziert angesehen werden. Unmittelbar nach der Infektion wird ein infektiöses Stadium folgen, das durch die Gegenwart von HBeAg im Serum gekennzeichnet ist. Fortgesetzte HBs-Antigenämie trotz inhibierter HBV-Replikation deutet auf die Gegenwart viraler DNA-Sequenzen hin, welche in das zelluläre Genom des Patienten integriert sind. Die integrierten viralen Sequenzen befähigen die Wirtszelle nicht, das komplette Virus zu synthetisieren. Allerdings sind Leberzellen mit integrierten HBV-Sequenzen dazu fähig, nur HBsAg herzustellen, welches seinerseits im Serum des Patienten nachweisbar ist und ein Indikator für chronische Hepatitis-B ist. Sehr wahrscheinlich werden die transformierten Hepatocyten nicht von cytotoxischen T-Zellen lysiert, sondern proliferieren und induzieren entweder eine chronisch persistente Hepatitis (CPH) oder eine chronisch aktive Hepatitis (CAH), welche dann zu einer Zirrhose der Leber oder zu einem primären hepatozellulären Karzinom fortschreiten können, was zum vorzeitigen Tod des Patienten führt.
- Kürzlich wurde festgestellt, daß Patienten, die chronisch HBV infiziert sind, einen Mangel der endogenen Interferon-Herstellung aufzeigen (Abb et al.,1985: J. Med. Virol 16. 171-176). Dies war die Begründung, Patienten, die unter chronischer Hepatitis-B leiden, wie angezeigt durch das Vorhandensein von HBeAg und HBV-DNA im Serum, mit Interferon-f (IFNa) zu behandeln. Kontrollierte Versuche mit großen Zahlen von Patienten zeigten, daß die Verabreichung von Interferon-α zu einer signifikant erhöhten Eliminierung des Hepatitis-B- Virus im Vergleich mit Kontrollen führte. Allerdings scheinen Personren, die bei oder um die Zeit der Geburt infiziert wurden, keine Serokonversion in Antwort auf diese Therapie aufzuweisen. Dieses Phänomen schließt unglücklicherweise etwa 75% der Träger von der IFNα-Therapie aus.
- Gegenwärtig bleibt die exakte Wirkungsweise von Interferon-α auf chronische Hepatitis-B unklar. Seine antvirale Aktivität könnte nicht-infizierte Zellen vor HBV-Infektion schützen oder die virale Transkription, Translation und Replikation in HBV-infizierten Zellen verringern. Interferon besitzt ferner immunomodulatorische Wirkungen durch Aktivierung von T-Zellen, Makrophagen und NK-Zellen und durch Induzieren der Expression von MHC-Klasse I- Proteinen.
- Eine andere Vorgehensweise zur Behandlung chronischer Hepatitis B basiert auf der Idee, die Replikation des Virus zu inhibieren, womit dessen Verteidigung hinreichend beeinträchtigt würde, um das Wirtsimmunsystem in die Lage zu versetzen, das Virus zu eliminieren. Dies führte zu antiviralen Test-Arzneimitteln, wie Adeninarabinosid und Adeninarabinosidmono phosphat, zur Behandlung von chronisch HBV-infizierten Personen. Allerdings sprachen weniger als die Hälfte der Patienten auf diese Therapie an, und zwar entweder durch eine anhaltende oder vorübergehende Serokonversion (HBeAg&spplus; zu Anti-HBe&spplus;). Ein weiterer negativer Aspekt dieser antiviralen Arzneimittel sind ihre immunsuppressiven Eigenschaften.
- Andere Arzneimittel, die für die Behandlung von chronischen Trägern getestet worden sind, schließen Interferon-β und Acycloguanosin (Acyclovir), Interleukin-2, Steroide, wie Prednisolon, und Kombinationen davon ein. Aber keines von ihnen konnte bessere Ergebnisse als bei der Behandlung mit Interferon-α zur Verfügung stellen. Nur eine Kombinationstherapie, welche die anfängliche Verabreichung von Steroiden, gefolgt von derjenigen von IFNa einschließt, kann die Antwortrate bei ausgewählten Patienten erhöhen.
- Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß chronisch HBV-infizierte Schimpansen weder durch Behandlung mit HBsAg (gebunden an ein Tetanustoxoid) noch mit Anti-HBs- Antikörpern geheilt werden können. Darüber hinaus wurde versucht, chronisch HBV-infizierte Patienten durch Verabreichung von HBV-S-, -S2- und -S1-Peptiden (wie hierin definiert) zu immunisieren. Diese Behandlung führte noch nicht einmal zur Bildung von Anti-HBs- Antikörper in diesen Personen.
- Die WO88/10300 beschreibt die Verwendung von Epitopen von HBV, nämlich Peptiden aus dem HBV-Kern, prä-S1- und prä-S2-Regionen, getragen auf einem immunogenen Teilchen, gebildet aus einem sezernierten Peptid, welches die Erzeugung von Antikörpern in einem Tiermodell verursacht. Die EP-A-243913 beschreibt die Anwendung von Peptiden aus den prä-S1- und/oder prä-S2-codierenden Regionen des HBV-Genoms auf einen Träger, um eine Antikörperherstellung hervorzurufen. Jedoch wurde in keiner der obenstehend erwähnten Anmeldungen offenbart, daß die Erzeugung dieser Antikörper irgendeine Auswirkung zur Eliminerung von ruhenden oder latenten Viruspartikeln in Hepatocyten von mit Hepatitis infizierten Tieren besitzt. Im Lichte des obenstehend, zuvor erwähnten Stands der Technik, in welchem Anti-HBs-Antikörper infizierte Schimpansen nicht heilten, erschien ein heilender Effekt als unwahrscheinlich.
- Zusätzlich sind, gemäß der Definition, chronische Träger des Hepatitis-B-Virus dadurch gekennzeichnet, daß HBsAg in ihrem Serum nachweisbar ist. Deshalb ist es absolut unvorhersehbar gewesen, daß eine Kombination, umfassend ein T-Zell-aktivierendes Epitop, das von der prä-S1-prä-S2-S-Region des HBV-Genoms codiert wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, fähig ist, eine Immunisierung in und eine letztliche Heilung von chronischen Trägern des Hepatitisvirus-B herbeizuführen.
- Angesichts des obenstehend erörterten Stands der Technik ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein wirksames therapeutisches Mittel für die Behandlung von viralen chronischen Lebererkrankungen zur Verfügung zu stellen, das zu einer vollständigen Antwort führt (d. h. zu einer anhaltenden Inhibition der HBV-Replikation, dem Verlust von HBV-DNA und -DNA- Polymerase und zu einem Absinken und schließlich dem Verschwinden von HBeAg und HBsAg im Serum von Patienten).
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dieses Ziel erreicht durch eine Kombination von
- a) mindestens einer Polypeptidsequenz mit einem oder mehreren antigenen T-Zellaktivierenden Epitopen und
- b) einem Träger, der zur Präsentation der Epitopsequenz(en) a) in der Lage ist, wobei die Polypeptidsequenz(en) a) am Träger b) durch kovalente oder hyrophobe Bindung gebunden ist/sind.
- Diese Erfindung richtet sich auf die Verwendung dieser Kombination zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von chronischer viraler Hepatitis.
- Es ist wichtig, daß die Polypeptidsequenz a), bei welcher es sich um ein oder mehrere verschiedene Polypeptide handeln kann, die Antigenizität eines T-Zellaktivierenden Epitops auf eine direkte oder indirekte Weise vermittelt.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Polypeptidsequenz(en) a) ein Polypeptid oder eine Kombination von zwei oder mehreren Polypeptiden des Hepatitis-B-Virus eines jeglichen Subtyps, insbesondere adw, ayw, adr und ady, sein. Die Polypeptidsequenz(en) a) kann/können deshalb die Aminosäuresequenz von einem oder mehreren Vertretern, die aus HB-viralen prä- S1-, prä-S2- und S-Peptiden (wie hierin definiert) und den HB-Kern-Antigenen gewählt sind, sein.
- Als Polypeptidsequenz(en) a) sind weiterhin jegliche der obenstehend angegebenen Polypeptide oder eine Kombination von zwei oder mehreren Polypeptiden verwendbar, welche modifiziert sind entweder durch Aminosäuredeletionen, wobei ein mindestens sechs auf einanderfolgende Aminosäurereste umfassendes Epitop konserviert sein muß, oder durch Hinzufügen weiterer Aminosäuren entweder an dem N-Terminus, dem C-Terminus oder als Insertionen in der/den Polypeptidsequenz(en) a). In jedem dieser Fälle ist es allerdings wesentlich, daß die biologische Aktivität beibehalten wird. Somit kann/können die Polypeptidsequenz(en) a) ein Polypeptid vom Hepatitis-B-Virus sein, modifiziert:
- i) durch das Vorhandensein von willkürlichen Deletionen, wobei ein mindestens sechs auf einanderfolgende Aminosäurereste umfassendes Epitop konserviert ist,
- ii) durch das Vorhandensein von Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren oder
- iii) durch das Tragen einer zusätzlichen Aminosäuresequenz an ihrem N-Terminus, an ihrem C-Terminus oder als eine Insertion.
- Genauer gesagt, kann es sich bei der/den Polypeptidsequenz(en) a) um die Aminosäuresequenz von einem oder mehreren Vertretern, die aus HB-viralen prä-S1-, prä-S2- und S-Peptiden und HB-Kern-Antigenen gewählt sind, modifiziert wie obenstehend, handeln.
- Um die hydrophobe Bindung oder Verankerung zu unterstützen, wird/werden die Polypeptidsequenz(en) a) vorteilhafterweise myristyliert.
- Um die passende pharmakologische Aktivität aufzuzeigen, ist es notwendig, daß in der Kombination der vorliegenden Erfindung die Polypeptidsequenz(en) a) auf einem Träger b) präsentiert wird/werden. Dieser Träger besteht aus einer besonderen Substanz, welche zum Beispiel aus Teilchen eines hydrophoben Polymers, aus anorganischen Teilchen oder aus Teilchen eines Polysaccharids bestehen kann. Vorzugsweise ist der Träger b) eine zweite Polypeptidsequenz, welche bei der Sekretion Teilchen bildet, wobei die Teilchen vorzugsweise einen Durchmesser von mindestens 10 nm aufweisen.
- Es wird bevorzugt, daß die teilchenbildende Polypeptidsequenz b) ein wesentlicher Teil von oder die komplette Aminosäuresequenz eines Polypeptids ist, welches gewählt werden kann aus HBV-S-Peptid (wie hierin definiert), HBV-Kernantigen, HAV-Kernantigen, HAV-Oberflächenantigen, HIV-Oberflächenantigen und HIV-Kernantigen, als auch dem Oberflächenantigen des Poliovirus. Als der teilchenbildende Träger b) wird HBV-S-Peptid und/oder - Kernpeptid bevorzugt.
- Bei Verwendung als Trägersequenz b) können die obenstehend angegebenen Polypeptide durch willkürliche Deletionen von Aminosäuren, durch Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren oder durch Hinzufügen einer oder mehrerer Aminosäuren entweder an dem N- Terminus, dem C-Terminus oder durch Insertion einer oder mehrer Aminosäuren in die Polypeptidsequenz b) modifiziert werden, vorausgesetzt daß das Teilchenbildungsvermögen erhalten bleibt. Somit kann die Polypeptidsequenz b) ein wesentlicher Teil von oder die komplette Aminosäuresequenz eines Polypeptids sein, das aus HBV-S-Peptid; HBV-Kern-, HAV-Kern- und HIV-Kernantigenen; und Oberflächenantigenen von Poliovirus, HAV und HIV gewählt ist, modifiziert
- i) durch das Vorhandensein von willkürlichen Deletionen, wobei Teilchenbildungsvermögen erhalten bleibt,
- ii) durch das Vorhandensein von Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren oder
- iii) durch das Tragen einer zusätzlichen Aminosäuresequenz an ihrem N-Terminus, an ihrem C-Terminus oder als eine Insertion.
- Um die hydrophobe Bindung zu unterstützen, wird die Polypeptidsequenz b) vorteilhafterweise myristyliert.
- Wenn der Träger b) eine Polypeptidsequenz ist, können die beiden Sequenzen a) und b) über eine oder mehrere der folgenden Wechselwirkungen verknüpft sein: hydrophobe Verankerung (vermittelt durch Myristinsäure), Disulfidbrückenbildung, oder beide Sequenzen können durch eine Peptidbindung verknüpft sein, wodurch ein Fusionspeptid gebildet wird. Im letztgenannten Fall kann wahlweise eine Spacersequenz zwischen den Polypeptidsequenz(en) a) und Polypeptidsequenz b) inseriert werden, wobei die Spacersequenz an beide Polypeptide über Peptidbindungen geknüpft ist.
- Die Polypeptidsequenz(en) a) bzw. b) können durch Expression eines rekombinanten DNA- Moleküls hergestellt werden. Das rekombinante DNA-Molekül kann für die Kombination von den Polypeptidsequenz(en) a) und b) codieren. Das rekombinante DNA-Molekül kann deshalb mindestens eine erste DNA-Sequenz und gegebenenfalls eine zweite, eine dritte und/oder eine vierte DNA-Sequenz umfassen, wobei
- i) die mindestens eine erste DNA-Sequenz für mindestens eine Polypeptidsequenz a), wie obenstehend definiert, codiert,
- ii) die zweite DNA-Sequenz für eine Polypeptidsequenz b) gemäß der obenstehenden Definition des teilchenbildenden Peptids codiert,
- iii) die dritte DNA-Sequenz für eine Spacersequenz codiert, und
- iv) die vierte DNA-Sequenz für einen Selektionsmarker codiert, und wobei die DNA-Sequenzen durch für die Expression wesentliche DNA-Elemente gesteuert werden, und gegebenenfalls ein gemeinsames Leseraster aufweisen.
- Die Polypeptidsequenz(en) a) und die Polypeptidsequenz(en) b) können deshalb auf dem gleichen rekombinanten DNA-Molekül in Tandemanordnung codiert sein. Die Polypeptidsequenz(en) a) und die Polypeptidsequenz(en) b) können daher von einem einzelnen offen Leseraster auf dem DNA-Molekül exprimiert werden und sind wahlweise durch eine Spacer- Polypeptidsequenz getrennt, die ebenfalls in dem einzelnen offenen Leseraster codiert ist.
- Bedingt durch die Tatsache, daß viele Aminosäuren durch mehr als ein Triplett bestimmt werden, gibt es mehrere DNA-Sequenzen, die für die obenstehend definierten Peptidsequenzen a) und b) codieren.
- Daneben können rekombinante DNA-Moleküle, welche sich von den obenstehend definierten rekombinanten DNA-Molekülen durch die Tatsache unterscheiden, daß bis zu 30% der · Nukleotide substituiert sein können, verwendet werden.
- Eine Wirtszelle wird mit einem für die obenstehende Kombination, welche nützlich zur Behandlung von chronisch HBV-infizierten Patienten ist, codierenden rekombinanten DNA- Molekül transflziert. Diese Wirtszelle kann eine Säuger-, eine Hefe- oder eine Bakterienzelle sein. Für den Zweck dieser Erfindung wird es bevorzugt, daß diese Zelle keinerlei humane Serumproteine oder jedewede Primaten-Serumproteine herstellt, außer die Polypeptid(e), welche innerhalb der obenstehenden Kombination eingeschlossen sind.
- Der Begriff "HBV-S-Peptid", wie hierin verwendet, bezeichnet das Peptid, welches von der gesamten S-Region des HBV-Genoms codiert wird, d. h. unter Ausschluß der prä-S 1- und prä- S2-Regionen. Der Begriff "HBV-prä-52-Peptid", wie hierin verwendet, bezeichnet das von den gesamten prä-S2- und S-Regionen des HBV-Genoms codierte Peptid. Der Begriff "HBV-prä- S1-Peptid", wie hierin verwendet, bezeichnet das Polypeptid, welches von den gesamten prä- S1-, prä-S2- und S-Regionen des HBV-Genoms codiert wird. Der Begriff "Epitop", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Sequenz von mindestens sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die von der angegebenen Genomregion codiert werden (z. B. bezeichnet ein "HBV-prä-S2- Epitop" eine Sequenz von mindestens sechs Aminosäuren, die von der prä-S2-Region des HBV-Genoms codiert werden). Der Begriff "T-Zell-Epitop", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Epitop, das mit Rezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen interagiert, um eine Immunantwort zu steigern oder anderweitig zu bewirken.
- Wie hierin verwendet, bedeutet "Antigenizität" das Vermögen, eine Immunantwort hervorzurufen (z. B. durch Wirken als ein Antigen), das Vermögen, die Herstellung von Antikörpern zu verursachen (z. B. durch Wirken als Antigen) und/oder das Vermögen, mit einem Zelloberflächenrezeptor wechselzuwirken, um eine Immunantwort oder die Herstellung von Antikörpern zu erhöhen.
- Der Begriff "HBV" bedeutet jedweden Subtyp des Virus, insbesondere adw, ayw, adr und ayr, beschrieben in der Literatur (P. Valenzuela, Nature, Band 280, S. 815 (1979), Gerlich, EP-A- 85 111 361, Neurath, EP-A-85 102 250). Beispiele für Peptidsequenzen davon, welche die Polypeptidsequenz(en) a) bilden, die die Antigenizität eines oder mehrerer Epitope vermitteln, sind in der Sequenzauflistung (SEQ a-Nr. 17-20, 22) gezeigt.
- Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Kombinationen:
- - HBV-S-Antigenteilchen mit spezifischen Epitopen (Determinanten) der prä-S1-, prä-S2- und/oder Kernpeptide;
- - HBV-Kern-Antigenteilchen mit spezifischen Epitopen (Determinanten) der prä-S1-, prä- S2-, S-Peptide und/oder der Kernantigene;
- - Hepatitis-A-Antigenteilchen mit spezifischen Epitopen (Determinanten) von den Hepatitis- B-S-, -prä-S1-, -prä-S2- und/oder -Kernpeptiden.
- Für die vorliegende Erfindung bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle sind gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Sequenzen, welche für Polypeptidsequenz(en) a), die die Antigenizität eines oder mehrerer T-Zell-Epitope vermitteln, und für das Polypeptid b), das bei der Sekretion Teilchen mit einem Durchmesser von 10 nm oder mehr bildet, codieren, wobei beide davon unter der Steuerung eines geeigneten Promoters ( = Promotors) stehen. Als Beispiele von für a) codierenden Sequenzen kann jegliche der Sequenzen erwähnt werden, welche unter den a-Nummern 1 bis 24 in der Sequenzauflistung aufgeführt sind. Beispiele der DNA- Sequenz, die für die Polypeptidsequenz b) codiert, sind durch jedewede der a-Sequenzen 25 bis 27 oder 35 in der Sequenzauflistung repräsentiert.
- Jede der 24 Sequenzen (a-Nummern 1 bis 24) kann mit jeder Sequenz kombiniert werden, die unter a-Nummer 25 bis 27 in der Sequenzauflistung beschrieben ist, wobei sowohl die Reihenfolgen a-b und b-a eingeschlossen sind.
- Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Kombination der Epitop-Sequenz a-Nr. 28 (entsprechend der Sequenz, welche die Aminosäuren 9 bis 28 der S1-Sequenz von HBV beinhaltet) in Kombination mit Sequenz a- Nr. 26 und/oder 27 als einem Teilchenbildner.
- Hepatitis-Virussequenzen, die in dem rekombinanten DNA-Konstrukt verwendet werden, können auf jeglichem Wege gebildet oder isoliert werden, einschließlich der Isolierung und Ligation von Restriktionsfragmenten, chemischer Synthese von Oligonukleotiden unter Verwendung eines Synthesizers (Cyclon, Biosearch) und Synthese durch das PCR Verfahren (T. J. White, N. Arnleim, H. E. Erlich, 1989; The Polymerase Chain Reaction, Technical Focus 5 (6)).
- Bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle wurden durch die Ligation von synthetischen Oligonukleotiden an ein 5'-XbaI-BgIII-3'-Fragment (ID-Nummer 27) aus der S-Region des HBV-Genoms, welches abgeleitet ist aus einem BglII-Bglll-HBV-Fragment, das die gesamte prä-S1-prä-S2-S-Region einschließt, oder Ligation an die gesamte S-Region gebildet. Bei der Herstellung derartiger Konstrukte verwendete Oligonukleotide sind in der nachstehenden Tabelle T zusammengefaßt. Tabelle I
- * aa = Aminosäure
- Andere bevorzugte DNA-Moleküle wurden durch Ligation von Kern-Sequenzen, welche durch das PCR Verfahren hergestellt werden und welche für T-Zell-Epitope codieren, an die Kern-Sequenz von HBV (SEQ a-Nr.: 25), die als Polypeptidsequenz b) fungiert, gebildet. Die bei der Herstellung dieser Konstrukte verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle II-1 angegeben. Tabelle II-1
- Die Tabelle II-2 zeigt mehrere Beispiele, worin die T-Zell-Epitop-codierenden DNA- Sequenzen durch Restriktionsfragmentierung des HBV-Genoms isoliert worden sind und an die DNA-Sequenz ligiert wurden, welche für die Polypeptidsequenz b), wie obenstehend definiert, codiert. Tabelle II-2
- ** Sequenz wurde veröffentlicht von Galibert, F. et al., (1979: Nature 281, 646-650) und von Ono, Y. et al., (1983: Nucl. Acid Res. 11(6), 1747-1757)
- In der Tabelle II-3 sind spezifische rekombinante DNA-Molekül aufgelistet. Das Verfahren für ihre Konstruktion wird in den Beispielen ausführlicher beschrieben werden. Tabelle II-3
- # egpt E. coli-Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
- Bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, neben den für die Polypeptide a) und b) codierenden Regionen, eine zusätzliche DNA-Sequenz, welche für einen Selektionsmarker codiert. Darüber hinaus umfassen sie alle üblichen für die Expression wesentlichen Elemente, wie Promotersequenz, Start-Codon und ein Polyadenylierungssignal.
- Beispiele von geeigneten Promotoren sind der Methallothionein (MT)-, der U2- und der H&sub2;K- Promoter im Falle der Verwendung von Säugerzellen als Wirtszelle. Wenn Hefe- oder Bakterienzellen angewandt werden sollen, können jeweils geeignete Hefe- bzw. Bakterienpromotoren, wie der GCN4- und der GAL 1/10-Promoter oder die prokaryotischen trp- und tac-Promotoren verwendet werden.
- Um die Kombination von Polypeptid(en) a) und Polypeptid b) gemäß dieser Anmeldung herzustellen, wird das rekombinante DNA-Molekül in Wirtszellen durch Transfektion (im Falle von Säugerzellen), durch Transformation (im Falle von Hefe- und Bakterienzellen) oder auf anderem Wege eingeführt. Als Wirt können Zellen eines jeglichen Organismus verwendet werden, welche fähig zur Transkription und Translation rekombinanter DNA-Moleküle sind, wie Säuger-, Bakterien- und Hefe-Zellen.
- Geeignete Säugerzellen gemäß dieser Erfindung sind zum Beispiel VERO-Zellen (eine Affennierenzelllinie), 3T3-, C127- und L-Zellen (Mäuse-Fibroblastenzelllinien) und CHO- (chinesische Hamsterovar-)Zellen, welche bezüglich Dehydrofolatreduktase entweder positiv oder negativ sind.
- Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin möglich, daß die obenstehend definierte erste DNA-Sequenz und die obenstehend definierte zweite DNA-Sequenz, welche für die Polypeptidsequenz(en) a) bzw. für eine Polypeptidsequenz b) codieren, in verschiedenen rekombinanten DNA-Molekülen vorhanden sind, in welchem Falle die Wirtszellen mit beiden dieser rekombinanten DNA-Moleküle cotransflziert werden. Tabelle III Mögliche Alternativen von Zusammensetzungen für Teilchen mit T-Zell- Epitopen, die auf chronische Hepatitis-Träger abzielen. Tabelle III Mögliche Alternativen von Zusammensetzungen für Teilchen mit T-Zell- Epitopen, die auf chronische Hepatitis-Träger abzielen.
- Die Tabelle III gibt einen Überblick darüber, wie man geeignete DNA-Sequenzen kombiniert, um DNA-Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Es sollte angemerkt werden, daß jegliche in dieser Tabelle beschriebene Bestandteile kombiniert werden können, um eine DNA-Sequenz bereitzustellen, welche, wenn in eine Wirtszelle eintransflziert, herangezogen werden kann, um eine Kombination (umfassend die Polypeptid(e) a) und b)) als Medikament für die Behandlung von chronischer viraler Hepatitis herzustellen. Die für die T-Zell-Epitopsequenzen codierenden DNA-Sequenzen wurden synthetisch (SYN) mit einem Biosearch Cyclon-Synthesizer, durch eine PCR-Vorgehensweise (PCR) oder durch Restriktionsenzym-Fragmentierung des viralen Genoms (GEN) hergestellt.
- Für die Behandlung von Patienten, die unter chronischer viraler Hepatitis leiden, kann die Kombination von Polypeptidsequenz(en) a) und einem Träger b) in irgendeinem Typ einer pharmazeutischen Zusammensetzung zubereitet werden, welche darüber hinaus ein geeignetes Verdünnungsmittel oder pharmazeutisches Trägermaterial, wie eine Pufferlösung, umfaßt.
- Die Verabreichung kann durch jedwedes Verfahren bewirkt werden, d. h. durch parenterale (z. B. intravenöse oder intramuskuläre) oder orale (z. B. unter Verwendung typhoider Bakterienzellen zur Einkapselung der aktiven Substanz) Verabreichung.
- Die pharmazeutische Zubereitung umfaßt die obenstehend beschriebene Kombination in ausreichender Konzentration, um eine Antwort nach der Verabreichung hervorzurufen.
- Fig. I zeigt ein DNA-Konstrukt, codierend für einen Promoter, eine Teilchenbildnersequenz und ein Selektionsgen (beschrieben in Beispiel 3/4).
- Fig. II zeigt ein DNA-Gen-Konstrukt, enthaltend einen Promoter, ein Epitop mit dem gesamten HB-S-Ag und ein Selektionsgen (beschrieben in Beispiel 3/18).
- Fig. III zeigt ein DNA-Konstrukt, das einen Promoter, ein T-Zell-Epitop mit einem Teilchenbildner-Rest und ein Selektionsgen aufzeigt (beschrieben in Beispiel 3/21).
- Fig. IV zeigt die AST-Werte von Schimpanse 1 während der Hepa-Care- Behandlung (beschrieben in Beispiel 10/l).
- Fig. V zeigt die Antigenwerte von Schimpanse 1 während der Hepa-Care- Behandlung (beschrieben in Beispiel 10/l).
- Fig. VI zeigt Werte von Leberenzymen ALT und GGT von Schimpanse 1, der dreimal mit Hepa-Care booster-behandelt worden ist (beschrieben in Beispiel 10/2).
- Fig. VII zeigt Werte von Leberenzymen ALT, AST und GGT und von Antigen von Schimpanse 2 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 10/3).
- Fig. VIII zeigt die Leberenzyme, wie bei einem unbehandelten Kontroll- Schimpansen bestimmt (beschrieben in Beispiel 10/3).
- Fig. IX & X zeigen die Antigen- bzw. Antikörpertiter von Patient 1 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 11).
- Fig. XI & XII zeigen die Antigen- bzw. Antikörpertiter von Patient 2 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 11).
- Fig. XIII & XIV zeigen die Antigen- bzw. Antikörpertiter von Patient 2 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 11).
- Die Erfindung wird spezifischer durch die folgenden Beispiele beschrieben.
- Der Überstand von HBV-Protein-herstellenden Kulturen wurde gesammelt und in Portionen von 2 400 ml aufgeteilt. Zu jeder Portion wurden 144 g PEG-6000 (Serva) zugegeben und durch 20 Minuten langes Rühren bei Raumtemperatur aufgelöst, und es wurde weitere 6 Stunden lang bei 4ºC gerührt. Der Niederschlag wurde durch 30 Minuten lange Zentrifugation in 500 ml großen Flaschen in einem G53-Rotor bei 9 000 Upm (15 000 · g) bei 10ºC abgetrennt. Der Überstand wurde gesammelt und 144 g PEG-6000 wurden zugegeben und wie obenstehend beschrieben aufgelöst. Die Lösung wurde 3 Stunden lang bei 4ºC gerührt. Der Niederschlag aus dieser Lösung wurde wie obenstehend beschrieben gewonnen, außer daß die Zentrifugation 60 Minuten lang fortgesetzt wurde.
- Das nach PEG-Fällung erhaltene Material wurde in 20 ml PBS erneut gelöst und einer Gelchromatographie auf A-Sm (BioRad) unterzogen. Die Säulenabmessungen waren 25 · 1 000 mm und 480 ml Bettvolumen. In einem typischen Fraktionierungsdurchlauf wurden 1 000 ug PEG-präzipitiertes HBV-Protein in 10 bis 15 ml geladen und mit PBS bei einer Geschwindigkeit von 6 Tropfen/Minute (18 ml/h) eluiert. Es wurden 3 ml große Fraktionen aufgefangen. Das HBV-Protein eluierte mit dem ersten Peak. Die gesammelten Fraktionen wurden einem CsCl-Gradienten unterzogen.
- Etwa 30 Fraktionen, welche den ersten Peak in der Säulenchromatographie auf A-Sm überspannen und vorgereinigtes HBV-Protein enthalten, wurden auf etwa 100 ml gesammelt bzw. zusammengefaßt. Diese Lösung wurde mit CsCI auf eine Dichte von 1,30 g/cm³ eingestellt und anschließend in ein Polyallomerröhrchen-Verbindungsstück in einen SW 27/28- Rotor (Beckman) überführt. Ein Gradient wurde gesetzt, indem 4 ml einer CsCl-Lösung von 1,35 g/cm³ unterschichtet und 4 ml von 1,25 g/cm³, gefolgt von 4 ml von 1,20 g/cm³ Dichte überschichtet wurden. Dieser Gradient wurde 50 Stunden lang bei 28 000 Upm bei 10ºC laufen gelassen. Danach wurde der Gradient fraktioniert und gereinigtes HBV-Protein, das in der Schicht von 1,20 g/cm³ Dichte schwebte, wurde abgesammelt. Die Lösung wurde durch drei Dialysezyklen in Beuteln gegen Wasser entsalzt.
- Im AUSRIA II-125-"Sandwich"-Radioimmunoassay (im Handel erhältlich von Abbot) wurden Perlen, die mit Meerschweinchen-Antikörper gegen Hepatitis-B-Oberflächenantigen (Anti- HBs) beschichtet waren, mit Serum oder Plasma oder gereinigtem Protein und geeigneten Kontrollen inkubiert. Jedwedes vorhandene HBsAg wurde an den Festphasen-Antikörper gebunden. Nach Absaugen des ungebundenen Materials und Waschen der Perlen wurde humanes 1251-Anti-HBs mit dem Antikörper-Antigen-Komplex auf den Perlen reagieren gelassen. Die Perlen wurden dann gewaschen, um ungebundenes ¹²&sup5;1-Anti-HBs zu entfernen.
- )-Anti-HBs HBsAg
- )-Anti-HBs · HBsAg ¹²&sup5;I-Anti-HRs
- )-Anti-HBs · HBsAg. ¹²&sup5;I-Anti-HRs
- Die auf den Perlen verbleibende Radioaktivität wurde in einem Gamma-Szintillationszähler gezählt.
- Im Enzygnost-HBsAg-Mikro-"Sandwich"-Assay (im Handel erhältlich von Behring) wurden Vertiefungen mit Anti-HBs beschichtet. Serum, Plasma oder gereinigtes Protein und geeignete Kontrollen wurden den Vertiefungen zugegeben und inkubiert. Nach dem Waschen wurden Peroxidase-markierte Antikörper gegen HBsAg mit den verbleibenden antigenen Determinanten zur Reaktion gebracht. Die ungebundenen Enzym-verknüpften Antikörper wurden durch Waschen entfernt und die Enzymaktivität auf der Festphase wurde ermittelt. Die enzymatisch katalysierte Reaktion von Wasserstoffperoxid und Chromogen wurde durch Zugeben von verdünnter Schwefelsäure angehalten. Die Farbintensität war proportional zur HBsAg-Konzentration der Probe und wurde durch photometrisches Vergleichen der Farbintensität der unbekannten Proben mit den Farbintensitäten der begleitenden Negativ- und Positivkontollseren erhalten.
- Das Plasmid pBPV-342-12 (ATCC 37224) wurde mit den Endonukleasen BgIIi und BamHI verdaut. Es wurden drei DNA-Moleküle erzeugt. Das Fragment von Interesse enthält den Metallothionein-Promoter und eine pBR322-Sequenz, umfassend 4, 5 kb, und ist leicht von den anderen Fragmenten (2,0 kb und 7,6 kb Größe) nachzuweisen.
- Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 200 ul Reaktionspuffer bei einer Endkonzentration von 0,5 ug/u1 DNA einschließlich 100 Units eines jeden Restriktionsenzyms durchgeführt. Die Vervollständigung des Verdaus wurde nach dreistündiger Inkubation bei 37ºC durch Agarosegelelektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel überprüft. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 4 ul 0,5 M EDTA gestoppt.
- Das 4,5 kb große Fragment wurde von den anderen Fragmenten durch präparative 1, 2%ige Agarosegelelektrophorese getrennt. Die DNA wurde aus dem Agarosegel auf DE-81-Whatman-Filterpapier eluiert, aus welchem die DNA in einem Hochsalzpuffer entfernt wurde. Die DNA wurde durch eine PhenoUChloroform-Extraktion und zwei Ethanolfällungen gereinigt.
- Ein 1,8 kb großes BamHI-BamHI-Fragment, enthaltend die HBV-Kern-codierenden Regionen, wurde aus HBV-enthaltender DNA isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem 4, 5 kb großen Fragment mit dem MT-Promoter und dem pBR-Rest (beschrieben in 1) zusammenligiert.
- Zwei ul des 1,8 kb großen Fragmentes wurden mit 3 ul des 4, 5 kb großen Fragmentes gemischt und in einem Gesamtvolumen von 10 ul Ligationspuffer, enthaltend 2 Units T4- DNA-Ligase und 2 mM ATP, bei 14ºC über Nacht zusammenligiert.
- Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150 ul einer Suspension von kompetenten Bakterienzellen hinzugesetzt. Nach der DNA-Aufnahme wurden die Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, welche 50 u1/ml Ampicillin enthielten, bei Volumina von 50 bis 300 ul Zellsuspension pro Platte aufgebracht. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins eines Plasmids mit den gewünschten Fragmenten gescreent.
- Einzelne Kolonien wurden mit einem Zahnstocher aufgenommen und in ein Röhrchen (5 ml) mit LB-Ampicillin-Medium überführt. Die Röhrchen wurden über Nacht bei 37ºC in einer Umgebung unter schnellem Schütteln inkubiert. Eine Mini-Plasmidpräparation jeder herangewachsenen Bakteriensuspension wurde durchgeführt. Die verschiedenen resultierenden DNAs wurden durch Verdau mit der Restriktionsendonuklease Bg111 überprüft. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 400 bp großes Fragment und ein 5,9 kb großes Fragment. Der Verdau wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Plasmid-DNA wurde aus den Bakterienzellen isoliert.
- Das aus obenstehendem (3) resultierende Plasmid wurde durch Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 ul und bei einer Endkonzentration von 1 ug/u1 Plasmid-DNA durchgeführt. Es wurden 50 Units EcoRI zugesetzt und der Verdau wurde nach 3 Stunden langer Inkubation bei 37ºC durch Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 1 ul 0,5 M EDTA gestoppt und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat und 3-4 Volumen Ethanol 30 Minuten lang bei -80ºC gefällt. Die gefällte DNA wurde in 50 ul destilliertem Wasser gelöst.
- 2 ul des linearisierten Plasmids wurden mit 3 ul des DNA-Fragments mit dem Metallothionein- Promoter und dem Neomycin-Selektionsgen (isoliert aus dem Plasmid pMT-neo-E (erhältlich von ATCC/Exogene) durch Verdau mit der Endonuklease EcoRI als ein 3,9 kb großes Fragment) gemischt und zusammenligiert. Einzelne Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent.
- Das Plasmid pUC-8-42 (erhältlich von Exogene) wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Apal verdaut. Es wurden zwei DNA-Moleküle erzeugt. Das Fragment von Interesse enthält den U2-Promoter, der 340 bp umfaßt, und ist leicht von dem anderen Fragment (3160 bp) nachzuweisen. Der Verdau wurde in einem Gesamtvolumen von 200 ul Reaktionspuffer bei einer Endkonzentration von 0,5 ug/ul DNA einschließlich 100 Units eines jeden Restriktionsenzyms durchgeführt. Die Vervollständigung des Verdaus wurde nach dreistündiger Inkubation bei 37ºC durch Agarosegelelektrophorese in einem 0,7%igen Agarosegel überprüft. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 4 ul 0,5 M EDTA gestoppt. Das 340 bp große Fragment wurde von der Plasmid-DNA durch präparative 1, 2%ige Agarosegelelektrophorese getrennt. Die DNA wurde aus dem Agarosegel auf DE-81-Whatman- Filterpapier eluiert, aus welchem die DNA in einem Hochsalzpuffer entfernt wurde. Die DNA wurde durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion und zwei Ethanolfällungen gereinigt.
- Das Plasmid pSP165 (im Handel erhältlich von Promega Biotec), enthaltend eine Polylinkersequenz (mit den folgenden Restriktionsstellen: EcoRI, SacI, SmaI, Aval, BamHI, BglII, SalI, PstI, HindIII), wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 ul und bei einer Endkonzentration von 1 ug/u1 Plasmid-DNA durchgeführt. 50 Units EcoRI wurden zugesetzt und der Verdau wurde nach dreistündiger Inkubation bei 37ºC durch Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 1 ul 0,5 M EDTA gestoppt und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat und 3-4 Volumen Ethanol 30 Minuten lang bei -80ºC gefällt. Die gefällte DNA wurde in 50 ul destilliertem Wasser gelöst.
- 2 ul der Plasmid-DNA wurden mit 10 ul der Fragment-DNA mit der U2-Promotersequenz vermischt und in einem Gesamtvolumen von 25 ul Ligationspuffer, enthaltend 2 Units T4- DNA-Ligase und 2 mM ATP, bei 14ºC über Nacht zusammenligiert. Danach wurde die DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktionen, gefolgt von zwei Ethanolfällungen, gereinigt und in 10 ul destilliertem Wasser gelöst. Die resultierenden überhängenden Enden von EcoRI und ApaI mußten in glatte Enden umgewandelt und ligiert werden. Die überhängenden Enden wurden wie folgend durch Reaktion mit der Mung-Bean-Nuclease in glatte Enden umge wandelt: zu 25 ul DNA (Konzentration 1 ug/u1) in Reaktionspuffer wurden 20 Units Enzym zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1% Glycerin und ein Endreaktionsvolumen von 3 5 ul zu ergeben. Nach einer 30 Minuten langen Inkubation bei 30ºC wurde die DNA durch PhenollChloroform-Extraktionen, gefolgt von zwei Ethanolfällungen, gereinigt. Die DNA wurde erneut in 5 ul destilliertem Wasser gelöst. Die resultierenden glatten Enden wurden in 15 ul Reaktionsvolumen mit 10 · mehr T4-Ligase, als obenstehend verwendet, und 2 mM ATP bei 14ºC über Nacht zusammenligiert.
- Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150-ul-Suspension von kompetenten Bakterienzellen hinzugesetzt. Nach der DNA-Aufnahme wurden die Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, welche 50 ug/ml Ampicillin enthielten, bei Volumina von 50 bis 300 ul Zellsuspension pro Platte ausgebreitet. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins eines Plasmids mit dem gewünschten U2-Promoterfragment gescreent. Das resultierende Plasmid wurde aus den Bakterienzellen isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse charakterisiert.
- Das 4, 5 kb große Fragment (beschrieben in 1) mit dem MT-Promoter und einem pBR-Rest wurde mit dem synthetischen Oligonukleotid 89 (SEQ a-Nr.: 30) zusammenligiert. Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150-ul-Suspension von kompetenten Bakterienzellen hinzugesetzt. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Das neue Plasmid wurde durch einen Verdau mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und XbaI überprüft. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 2,0 kb großes und ein 2,6 kb großes.
- 8. Zusammenligieren des synthetischen Oligonukleotides 101 (SEQ 1D-Nr.: 32) mit dem Plasmid (beschrieben in 7).
- Das Plasmid (beschrieben in 7) wurde mit BglII und BamHI verdaut und ein Fragment von 13 Nukleotiden wurde entfernt (beschrieben in 1). Das resultierende Fragment, welches das erste Oligonukleotid 89 (SEQ a-Nr.: 30) enthielt, wurde mit dem Oligonukleotid 101 (SEQ 117-Nr.: 32), einem BglII-BamHI-Fragment, zusammenligiert. Nach der DNA-Aufnahme wurden einzelne Zellen hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Das neue Plasmid wurde durch einen Verdau mit den Endonukleasen EcoRI und XbaI oder EcoRI und BglII überprüft.
- Das 4, 5 kb große Fragment (BgIII-BamHI) wurde mit dem DNA-Oligonukleotid 99 (SEQ 1D- Nr.: 31) zusammenligiert. Nach Screenen einzelner Bakterienkolonien, welche unterschiedliche DNAs enthielten, wurde das gewünschte Plasmid durch Verdau mit EcoRI, welcher zu zwei Fragmenten, 1,9 kb und 2,7 kb groß, führte, und durch positive Linearisierung mit BgIII oder BamHI charakterisiert.
- Das neue Plasmid wurde dann mit PstI und BamHI verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 2,6 kb großes Fragment mit einem pBR Rest, dem MT-Promoter und dem Oligonukleotid und ein 2,0 kb großer pBR-Rest. Das 2,6 kb große Fragment wurde isoliert.
- Das Plasmid (beschrieben in 8) mit den DNA-Oligonukleotiden 89 und 101 (SEQ ID7-Nr.: 30 bzw. 32) wurde mit PstI und BglII verdaut. Es wurden zwei Fragmente erwartet. Ein 2,5 kb großes Fragment mit einem pBR Rest und dem MT-Promoter und ein 2, 2 kb großes Fragment mit einem pBR-Rest und beiden Oligos.
- Dieses 2, 2 kb große Fragment wurde mit dem in 8 beschriebenen 2,6 kb großen Fragment, das den pBR-Rest, den MT-Promoter und das Oligo 99 (SEQ ID-Nr.: 31) enthielt, zusammenligiert.
- Nach dem Screenen hinsichtlich des gewünschten Plasmids wurde es durch Restriktionsendonuklease-Verdau mit BgIII-XbaI charakterisiert. Es wurden zwei Fragmente erwartet, ein 270 bp großes Fragment der Oligo-DNA-Nukleotide und ein 4,5 kb großes Fragment des MT- Promoters und des pBR.
- Ein 2,3 kb großes BglII-BglII-Fragment mit den codierenden HBV-prä-S1-, -prä-S2- und -S- Regionen wurde aus HBV-enthaltender DNA isoliert. Das 2, 3 kb große Fragment wurde mit dem 4,5 kb großen Fragment (erhalten wie in 1 beschrieben) mit dem Metallothionein- Promoter zusammenligiert.
- 2 ul des 2,3 kb großen Fragmentes wurden mit 3 ul des 4,5 kb großen Fragmentes vermischt und in einem Gesamtvolumen von 10 ul Ligationspuffer, enthaltend 2 Units T4-DNA-Ligase und 2 mM ATP, bei 14ºC über Nacht zusammenligiert.
- Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150-ul-Suspension von kompetenten Bakterienzellen hinzugesetzt. Nach der DNA-Aufnahme wurden die Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, welche 50 ug/ml Ampicillin enthielten, bei Volumina von 50 bis 300 ul Zellsuspension pro Platte verteilt. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins eines Plasmids mit dem gewünschten Fragment gescreent.
- Das aus obenstehendem 11 resultierende Plasmid wurde mit den Endonukleasen BglII und Xbal verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 550 bp großes Fragment und ein 6,25 kb großes Fragment, das nach Agarosegelelektrophorese isoliert wurde.
- Das 6,25 kb-Fragment wurde mit dem 270 bp großen Fragment (nach Verdau mit BglII und XbaI und Fragmentisolierung, wie obenstehend beschrieben) des in 10 beschriebenen, für einen Epitopteil des HBV-Kern-Gens codierenden, Plasmids zusammenligiert.
- Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150-ul-Suspension von kompetenten Bakterienzellen zugesetzt. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Das neue Plasmid wurde durch einen Verdau mit BamHI überprüft. Es wurden drei Moleküle erwartet, ein 950 bp großes, ein 450 bp großes und ein 5150 bp großes Fragment.
- Das (in 11 beschriebene) Plasmid wurde mit EcoRl und XbaI verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 2450 bp großes Fragment und ein 4350 bp großes Fragment, das nach Gelelektrophorese isoliert wurde.
- Dieses 4350 bp große Fragment wurde mit dem Oligo-DNA-Nukleotid 39 (SEQ ID7-Nr.: 29), welches für die gesamte DNA-Sequenz des HBV-S-Gens vom AT6 bis zur XbaI-Stelle codierte, worin das ATG zu ATA verändert worden war, zusammenligiert.
- Dieses "Vehikel"-Plasmid wurde dann mit PstI und XbaI verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 600 bp großer Plasmidrest und ein 3850 bp großes Fragment, welches isoliert und mit einem PstI-XbaI-Fragment von 2800 bp (2700 bp), das nach Verdau des in 10 beschriebenen Plasmides isoliert worden war, zusammenligiert wurde.
- Nach dem Screenen hinsichtlich des gewünschten Plasmids wurde es durch Restriktionsendonuklease-Verdau mit EcoRI und XbaI, EcoRI und BgIII und BamHI charakterisiert.
- Das (in 14 beschriebene) Plasmid wurde mit EcoRI linearisiert. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 ul und bei einer Endkonzentration von 1 ug/ul Plasmid-DNA durchgeführt. Es wurden 50 Units EcoRI zugesetzt und der Verdau wurde nach 3 Stunden langer Inkubation bei 37ºC durch Agarosegelelektrophorese überprüft.
- Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 1 ul 0,5 M EDTA gestoppt und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat und 3-4 Volumen Ethanol 30 Minuten lang bei -80ºC gefällt. Die gefällte DNA wurde in 50 ul destilliertem Wasser gelöst.
- 2 ul des linearisierten Plasmids wurden mit 3 ul des DNA-Fragments mit dem Metallothionein- Promoter und dem Neomycin-Selektionsgen (beschrieben in 4) gemischt und zusammenligiert. Einzelne Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des gewünschten Plasmids gescreent, welches isoliert, gereinigt und charakterisiert wurde.
- Jedes obenstehend beschriebene Genkonstrukt kann ebenfalls mit dem U2-Promoter konstruiert werden, wobei das MT-Promoter-enthaltende DNA-Fragment, nach Verdau mit EcoRI und BglII, durch ein den U2-Promoter enthaltendes DNA-Fragment ersetzt wird, welches nach einem Verdau mit EcoRI und BglII isoliert wurde.
- Das Fragment mit dem egpt-Selektionsgen wurde nach Verdau des Plasmid pMSG mit BamHI und BglII isoliert (1,8 kb) und mit einem 4, 5 kb großen Fragment (BgIII-BamHI, beschrieben in 1), enthaltend den MT-Promoter, zusammenligiert.
- Nach Screenen hinsichtlich des gewünschten Plasmids wurde es isoliert, gereinigt und durch eine Umwandlung der BamHil-Stelle zu einer EcoRI-Stelle finalisiert.
- Ein DNA-Fragment (400 bp) wurde nach Gelelektrophorese isoliert. Es wurde durch das PCR- Verfahren (beschrieben in Beispiel 5) unter Verwendung der spezifischen Oligonukleotide 131 und 132 (SEQ a-Nr.: 33 und 34) als Primer erzeugt.
- Das DNA-Fragment wurde mit den Endonukleasen BamHI und XbaI verdaut und dann durch Gelelektrophorese gereinigt. Das isolierte PCR-Fragment wurde mit einem 6,25 kb großen Fragment zusammenligiert, welches aus dem (in 13 beschriebenen) Plasmid nach Verdau mit BglII und XbaI isoliert worden war. Nach DNA-Aufnahme und Bakterientransformation wurden die einzelnen Bakterienkolonien hinsichtlich des gewünschten Plasmides gescreent.
- Das (in 17 beschriebene) Plasmid wurde durch Hinzufügen eines Selektionsgens in das Plasmid (beschrieben in 15) fertiggestellt.
- Der 112K-Promoter wurde als ein EcoRI- und BglII-Fragment (2 kb) aus pSP65H&sub2; (erhältlich von Exogene) isoliert.
- In allen beschriebenen Konstrukten sind alle Promotoren als EcoRI/BglII-Fragmente austauschbar.
- Das aus obenstehendem 11) resultierende Plasmid wurde mit den Endonukleasen BglII und XbaI verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, von denen eines ein 6,250 kb großes Fragment ist, das nach Agarosegelelektrophorese isoliert wurde.
- Das 6,250 kb große Fragment wurde mit dem Oligo-DNA-Nukleotid 23 (SEQ 1D-Nr.: 28) zusammenligiert. Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu einer 150-ul- Suspension von kompetenten Bakterienzellen zugesetzt. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Das neue Plasmid wurde durch einen Verdau mit den Endonukleasen EcoRI und BgllI überprüft. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 1,9 kb großes und ein 4,450 kb großes.
- Das (in 20 beschriebene) Plasmid wurde mit EcoRI linearisiert. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 100 ul und bei einer Endkonzentration von 0,6 ug/Pl Plasmid-DNA durchgeführt. Es wurden 60 Units EcoRI zugesetzt und der Verdau wurde nach drei Stunden langer Inkubation bei 37ºC durch Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 2 ul 0,5 M EDTA gestoppt und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat und 4 Volumen Ethanol 1 Stunde lang bei -80ºC gefällt. Die geflillte DNA wurde in 50 ul destilliertem Wasser gelöst.
- 2 ul des linearisierten Plasmids wurden mit 3 ul des DNA-Fragments (3,7 kb) mit dem Metallothionein-Promoter und dem egpt-Selektionsgen (beschrieben in 16), erhalten durch Verdau mit EcoRI, gemischt und zusammenligiert. Einzelne Kolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Jedes der beschriebenen Genkonstrukte in Tabelle III ist auf dem gleichen Weg, wie obenstehend beschrieben, herstellbar.
- Um die Sekretion wesentlicher Mengen der von Konstrukten der vorliegenden Erfindung codierten HBV-Peptide zu erreichen, müssen Säugerzellen mit einem DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung transflziert werden. Die Cotransfektion wurde in zwei Schritten (d. h. einer separaten Transfektion für jedes Konstrukt) oder in einem einzigen Schritt (d. h. eine Transfektion unter Verwendung einer Präparation beider Konstrukte) durchgeführt. Die Cotransfektion wurde entweder durch Verwendung verschiedener Selektionsmarker auf den zwei Konstrukten oder durch Nachweis der Sekretion von Expressionsprodukten beider Konstrukte durch Immunoassay bestätigt.
- Alternativ dazu können eine Sequenz, die für die HBV-Peptidsequenz der vorliegenden Erfindung codiert, und eine getrennte Sequenz, welche für das gesamte S- oder Kern- oder HAV-Protein codiert, in einem einzigen Konstrukt kombiniert werden.
- Die Polymerase-Kettenreaktion ermöglicht, spezifische DNA-Nukleotidsequenzen einer gewählten Region einer bekannten genomischen Sequenz in vitro um mehr als das millionenfache zu vervielfältigen (Thomas J. White, Norman Arnleim, Henry A. Erlich, 1989: The polymerase chain reaction. Technical Focus, Band 5, Nr. 6; 5. Kwok und R Higuchi, 1989: Avoiding false positives with PCR Nature, Band 339, S. 237-238).
- Aus Zellen isolierte DNA oder Plasmid-DNA wird behandelt, um ihre komplementären Stränge zu trennen. Diese Stränge werden dann mit einem Überschuß von 2 DNA-Oligonukleotiden (jedes 20-25 Basenpaare lang) "annealed" bzw. zusammengebracht, welche chemisch so synthetisiert worden sind, daß sie an Sequenzen passen, die durch X Nukleotide getrennt sind (wobei X im allgemeinen zwischen 50 bis 2000 Basenpaare beträgt).
- Die zwei Oligonukleotide dienen als spezifische Primer für die in vitro-DNA-Synthese, die durch DNA-Polymerase katalysiert wird, welche die DNA zwischen den zu den zwei Oligonukleotiden entsprechenden Sequenzen kopiert. Wenn die zwei Primer-Oligonukleotide die korrekte Sequenz enthalten, ist es möglich, neue Verdaustellen am 5'- und 3'-Ende zu erzeugen.
- Nach mehreren Reaktionzyklen wurde eine große Menge eines DNA-Fragmentes der gewünschten Länge erhalten, durch Gelelektrophorese gereinigt und durch Restriktionsenzymverdau und Agarosegelelektrophorese charakterisiert. Das vervielfältigte, gereinigte DNA-Fragment wurde dann verwendet, um es mit anderen Fragmenten, d. h. Plasmid, zusammen zu ligieren.
- Die PCR DNA-Fragmente wurden mit glatten Enden amplifiziert. Um (für das Ligationsvorgehen) überhängende Enden zu erhalten, muß das Fragment mit den gewünschten Endonukleasen verdaut und erneut gereinigt werden.
- Die PCR-Reaktion wird 20 bis 30 Zyklen lang andauern. Ein Zyklus ist in drei Schritte mit unterschiedlichen Reaktionszeiten und unterschiedlichen Reaktionstemperaturen unterteilt, was von einem PCR-Thermocycler gesteuert wird. Der erste Schritt ist die "Denaturierung" der Matrizen-DNA (1 min/95ºC), der zweite Schritt ist die "Hybridisierung" der Matrizen-DNA und der Primer (1 min/55ºC), gefolgt von der "Polymerisierung" (2 min/72ºC).
- Das Endvolumen für einen Assay beträgt zum Beispiel 30 Pl. wobei die nachstehenden Endkonzentrationen enthalten sind: PCR Puffer (1 x), Nukleotid-Mix mit 200 uM jedes der vier Nukleotide, 200 ng für 30 ul von jedem der zwei Primer, 0,5 Units Taq-Polymerase pro 30 ul Aqua bidest.
- Die Empfängerzellen (C127- oder CHO-Zellen, erhältlich von ATCC) wurden am Tag 1 in normales Wachstumsmedium (DMEM + 10% fötales Kälberserum, Glucose und Glutamin) in Petrischalen (1-2 · 10&sup6; Zellen pro Schale, φ 10 cm) eingebracht. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt (4 Stunden, bevor das DNA Präzipitat auf die Zellen gegeben wurde), und die Zellen wurden zweimal mit 1 · PBS gewaschen. Danach wurden 8 ml DMEM ohne FCS zugesetzt, 4 Stunden später wurde das DNA-Präzipitat (hergestellt wie nachstehend beschrieben) den Zellen zugegeben. Wiederum nach vier Stunden wurde das Medium entfernt, 3 ml Glycerin-Mix (50 ml 2 · TBS-Puffer, 30 ml Glycerin, 120 ml destilliertes Wasser) wurden zugegeben. Der Glycerin-Mix wurde unmittelbar nach einer drei Minuten langen Inkubation bei 37ºC entfernt und die Zellen wurden mit 1 · PBS gewaschen. Die Zellen wurden über Nacht mit 8 ml DMEM mit 10% FCS kultiviert.
- Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Behandlung mit Trypsin-EDTA-Lösung (0,025% Trypsin + lmM EDTA) aus der Schale gewonnen. Zur Entfernung des Trypsin-EDTA wurden danach die Zellen mit 1 · PBS gewaschen, in DMEM mit 10% FCS suspendiert und in Costar-24-Vertiefungs-Platten verteilt (Zellen aus einer Schale in vier 24-Vertiefungs-Platten). Als die Zellen gut herangewachsen waren, wurde Selektionsmedium zugesetzt (Konzentration
- 0,5-1 mg/ml Neomycin oder: Xanthin (250 ug/ml), Hypoxanthin (15 ug/ml) oder Adenin (25 ug/ml), Thymidin (10 ug/ml), Aminopterin (2 ug/ml), Mycophenolsäure (25 ug/ml) für ecogpt, zum Beispiel). Das Medium wurde jede Woche ausgewechselt. Die ersten wachsenden Zellkolonien wurden nach zwei Wochen beobachtet.
- Zu 10 ug Plasmid-DNA und 20 ug Träger-DNA (Lachssperma-DNA, Kalbsthymus-DNA) wurde TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,05) zu einem Endvolumen von 440 ul zugegeben und zusammen mit 60 ul 2 M CaCl&sub2; vermischt. Danach wurde die gleiche Menge von 2 · TBS (Hepes 50 mM, NaCl 280 mM, Na&sub2;HPO&sub4; 1,5 mM, pH 7,05) zugegeben und gut vermischt. Die Präzipitationslösung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und direkt den Zellen zugegeben, welche transfiziert werden sollten.
- Zu der in steriler Kochsalzlösung suspendierten gewünschten Konzentration an Antigen wurden 1 : 10 000 Volumen Thimerosol, 1/10 Volumen Filter-sterilisiertes 0,2 M KAl(SO&sub4;)&sub2; φ 12 H&sub2;O zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit sterilem 1 N NaOH auf 5,0 eingestellt und die Suspension wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Alum-präzipitierte Antigen wurde durch 10minütige Zentrifugation bei 2 000 Upm gewonnen, in steriler normaler Kochsalzlösung mit 1 : 10 000 Thimerosol resuspendiert und unter sterilen Bedingungen aliquotiert.
- Der Zellüberstand von HB-Kernantigen-sezernierenden Zellen wurde gesammelt und durch Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat wurde durch 15 Minuten lange Zentrifugation bei 20 000 Upm bei 4ºC in einem Beckmann-SW28-Rotor geklärt.
- Die Teilchenbildung wurde durch Sucrose-Dichte-Zentrifugation (0-45% Sucrose) in einem Beckmann-SW28-Rotor 24 Stunden lang bei 28 000 Upm und 4ºC getestet. Der Gradient wurde fraktioniert und die einzelnen Fraktionen wurden mittels ELISA analysiert.
- Die folgenden Tabellen geben einige Resultate der ELISA-Analyse von immunogenen Teilchen der vorliegenden Erfindung wie nachstehend beschrieben wieder:
- Die Tabelle IV zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigenteilchens, hergestellt aus jedwedem HBV-Sequenzkonstrukt der vorliegenden Erfindung, einschließend die prä-S1- Epitope und die S-Region, mit dem monoklonalen Anti-prä-S1-Antikörper MA 18/7 und dem monoklonalen Anti-HBs-Antikörper GO22.
- Die Tabelle IV zeigt die Fraktionen (21), welche nach dem CsCl-Dichtegradienten aufgefangen wurden. Tabelle IV-1 Tabelle IV-2
- Die Tabelle V zeigt die ELISA-Daten der gereinigten HB-Kernantigen-Teilchen, hergestellt aus jeglichem HB-Kernsequenz-Konstrukt der vorliegenden Erfindung, mit polyklonalen Antikörpern gegen HB-Kern und mit monoklonalem Antikörper G022 gegen HB-S-Ag. Tabelle V-1 Tabelle V-2
- "Hepa-Care" sind Teilchen, die Hepatitis-B-Oberflächenantigene (S 1 und S) in einer spezifischen Zubereitung (Verhältnis 50 : 50) präsentieren, welche für die Behandlung von chronischen Trägern des Hepatitis-Virus verwendet werden.
- Ein Hepatitis-B-Träger, der Schimpanse 1, wurde (intramuskulär) mit Hepa-Care bei den Zeiten von 0, 4 und 8 Wochen bei einer Dosierung von 18 ug pro Injektion behandelt.
- Die Leberenzyme wurden überwacht (Fig. IV), ebenso wie der Hepatitis-B-Antigen-Spiegel (Fig. V).
- Dem Schimpansen 1 wurde nach der obenstehend beschriebenen Behandlung eine Booster- Behandlung bei Woche 30, 34 und 38 gegeben. Die Ergebnisse sind in der Fig. VI gezeigt.
- Schimpanse 2 wurde mit Hepa-Care behandelt, jedoch im Gegensatz zu Schimpanse 1 wurde dies intravenös gegeben. Die Dosierung betrug 2 mg. Die Ergebnisse sind in der Fig. VII gezeigt.
- Bei einem Kontroll-Schimpansen 3 wurden ebenfalls die Leberenzyme überwacht und sind in der Fig. VIII gezeigt.
- Behandlung mit Hepa-Care: (zur Definition, siehe Beispiel 10)
- Patient 1 (männlich, Alter = 65 Jahre, Erkrankung seit 2 Jahren): Hepatitis-B-Parameter: HB sAg pos.
- Anti-HBs neg.
- HBeAg neg.
- Anti-HBe pos.
- Anti-HBc neg.
- wurde (i.m.) mit Hepa-Care in Monat 0, 1, 6 und 7 behandelt. Die Ergebnisse der Antigen- und Antikörpermessungen sind in den Fig. IX und X angegeben.
- Patient 2 (weiblich, Alter = 48 Jahre, Erkrankung seit 12 Jahren): Hepatitis-B-Parameter: HB sAg pos.
- HBeAg neg.
- Anti-HBs neg.
- Anti-HBe pos.
- Anti-HBc pos.
- wurde (i.m.) behandelt mit Hepa-Care in Monat 0, 1 und 6. Die Ergebnisse der Antigen- und Antikörpermessungen sind in den Fig. XI und XII gezeigt.
- Patient 3 (weiblich, Alter = 41 Jahre, Erkrankung seit 5 Jahren): Hepatitis-B-Parameter: HBsAg pos.
- HBeAg neg.
- Anti-HBs neg.
- Anti-HBe pos:
- wurde (i.m.) mit Hepa-Care in Monat 0, 1, 2 und 5 behandelt. Die gemessenen Werte von HBs-Antigen und Anti-HBs-Antikörpern sind in den Fig. XIII und XIV gezeigt. SEQUENZ-AUFLISTUNG
Claims (20)
1. Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes für die
Behandlung von chronischer viraler Hepatitis, wobei die Zusammensetzung eine Kombination von
a) mindestens einer Polypeptidsequenz mit einem oder mehreren antigenen
T-Zellaktivierenden Epitopen und
b) einem Träger, der zur Präsentation der Epitopsequenz(en) a) in der Lage ist, wobei
die Polypeptidsequenz(en) a) am Träger b) durch kovalente oder hydrophobe Bindung
gebunden ist/sind,
umfaßt.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Polypeptidsequenz(en) a) ein Polypeptid vom
Hepatitis-B-Virus ist/sind.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2, worin die Polypeptidsequenz(en) a) die
Aminosäuresequenz von einem oder mehreren Vertretern, die aus HB-viralen prä-S1-, prä-S2- und S-
Peptiden und HB-Kern-Antigenen gewählt sind, ist/sind.
4. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Polypeptidsequenz(en) a) ein Polypeptid vom
Hepatitis-B-Virus ist/sind, modifiziert:
i) durch das Vorhandensein von willkürlichen Deletionen, wobei ein mindestes sechs
aufeinanderfolgende Aminosäurereste umfassendes Epitop konserviert ist,
ii) durch das Vorhandensein von Substitutionen aus einer oder mehreren Aminosäuren
oder
iii) durch das Tragen einer zusätzlichen Aminosäuresequenz an ihrem N-Terminus, an
ihrem C-Terminus oder als eine Insertion.
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, worin die Polypeptidsequenz a) die Aminosäuresequenz
von einem oder mehreren Vertretern, die aus HB-viralen prä-S1-, prä-S2- und S-Peptiden
und HB-Kern-Antigenen gewählt sind, ist/sind, modifiziert wie in Anspruch 4 definiert.
6. Verwendung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die
Polypeptidsequenz(en) a) myristyliert ist/sind.
7. Verwendung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die
Polypeptidsequenz(en) a) durch die Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls
hergestellt wird/werden.
8. Verwendung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger
b) ein Polysaccharid, ein hydrophobes Polymer oder ein anorganisches Molekül mit
Teilchenform ist.
9. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der Träger b) eine
zweite Polypeptidsequenz ist.
10. Verwendung gemäß Anspruch 9, worin die Polypeptidsequenz b) bei der Sekretion
Teilchen mit einem Durchmesser von mindestens 10 nm bildet.
11. Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Polypeptidsequenz b) ein wesentlicher
Teil von oder die komplette Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das von HBV-S-
Peptid; HBV-Kern-, HAV-Kern- und HIV-Kernantigenen, und Oberflächenantigenen von
Poliovirus, HAV und HIV gewählt ist, ist.
12. Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Polypeptidsequenz b) ein wesentlicher
Teil von oder die komplette Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das von HBV-S-
Peptid; HBV-Kern-, HAV-Kern- und HIV-Kernantigenen; und Oberflächenantigenen von
Poliovirus, HAV und HIV gewählt ist, ist, modifiziert
i) durch das Vorhandensein von willkürlichen Deletionen, wobei
Teilchenbildungsvermögen erhalten bleibt,
ii) durch das Vorhandensein von Substitutionen aus einer oder mehreren Aminosäuren
oder
iii) durch das Tragen einer zusätzlichen Aminosäuresequenz an ihrem N-Terminus, an
ihrem C-Terminus oder als eine Insertion.
13. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die
Polypeptidsequenz b) myristyliert ist.
14. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die
Polypeptidsequenz b) durch die Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls hergestellt wird.
15. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei die
Polypeptidsequenzen a) und b) über Disulfidbrücken verknüpft sind.
16. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei die
Polypeptidsequenzen a) und b) über "hydrophobe Verankerung" (vermittelt durch Myristinsäure)
verknüpft sind.
17. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei die
Polypeptidsequenz a) und b) durch eine Peptidbindung verknüpft sind, worin wahlweise eine
Spacersequenz zwischen Polypeptidsequenz(en) a) und Polypeptidsequenz b) inseriert ist, wobei
die Spacersequenz über Peptidbindungen an Polypeptidsequenzen a) und b) geknüpft ist.
18. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Polypeptidsequenz(en) a) und die
Polypeptidsequenz b) hergestellt worden sind durch Expression von dem gleichen
rekombinanten DNA-Molekül, auf dem die Sequenzen in Tandemanordnung codiert sind.
19. Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die Polypeptidsequenz(en) a) und die
Polypeptidsequenz b) von einem einzelnen offenen Leseraster auf dem DNA-Molekül
exprimiert werden und wahlweise durch eine Spacer-Polypeptidsequenz getrennt sind, die
ebenfalls in dem einzelnen offenen Leseraster codiert ist.
20. Verwendung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die
Zusammensetzung zur Verabreichung mittels intravenösrn oder intramuskulärer Injektion ist.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988010300A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
EP0491077A1 (de) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches Mittel gegen chronische virale Leberkrankheiten |
DE4107612A1 (de) * | 1991-03-09 | 1992-09-10 | Behringwerke Ag | Rekombinante proteine mit der immunreaktivitaet des hepatitis b virus e antigens (hbeag), verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in immunoassays und impfstoffen |
US6689363B1 (en) | 1992-01-29 | 2004-02-10 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions |
US7611713B2 (en) | 1993-03-05 | 2009-11-03 | Pharmexa Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions |
US6509149B2 (en) * | 1995-06-06 | 2003-01-21 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
BR9709993A (pt) * | 1996-06-25 | 1999-08-10 | Stichting Inst Dierhouderij | Vacina preparação de vacina composição processo para produção de uma preparação imugênica e preparação imugênica |
US7091324B2 (en) | 1998-11-05 | 2006-08-15 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational epitopes |
CN1268345C (zh) * | 2000-03-29 | 2006-08-09 | 乔治敦大学 | 治疗丁型肝炎病毒感染的核苷化合物 |
IL142802A (en) * | 2000-04-27 | 2015-01-29 | Enzo Therapeutics Inc | Use of one or more HBV antigens for the preparation of oral pharmaceutical preparations for the treatment of a person with active HBV infection or hepatocellular carcinoma |
US6787526B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-09-07 | Idenix Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides |
US7022830B2 (en) * | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
KR20030074787A (ko) * | 2001-02-05 | 2003-09-19 | 스트레스젠 바이오테크놀러지스 코포레이션 | B형 간염 바이러스 치료 |
US7351413B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-04-01 | Lorantis, Limited | Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis |
US8420353B2 (en) * | 2002-03-22 | 2013-04-16 | Aprogen, Inc. | Humanized antibody and process for preparing same |
DE10339927A1 (de) * | 2003-08-29 | 2005-03-24 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen |
GB0326416D0 (en) | 2003-11-12 | 2003-12-17 | Karolinska Innovations Ab | Methods and means relating to hepatitis B infection |
WO2005050214A2 (en) * | 2003-11-12 | 2005-06-02 | Hbv Theranostica Ab | Methods and means relating to hepatitis b infection |
US9603921B2 (en) * | 2004-10-27 | 2017-03-28 | Janssen Vaccines Ag | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus |
US8071561B2 (en) * | 2007-08-16 | 2011-12-06 | Chrontech Pharma Ab | Immunogen platform |
WO2009092396A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Universitätsklinikum Heidelberg | Hydrophobic modified pres-derived peptides of hepatitis b virus (hbv) and their use as hbv and hdv entry inhibitors |
CN101485672B (zh) * | 2008-12-05 | 2010-08-25 | 广东粤龙药业有限公司 | 异丙景糖酐在制备治疗人HBeAg阳性慢性乙型肝炎药物中的应用 |
US10076570B2 (en) | 2009-08-07 | 2018-09-18 | Transgene S.A. | Composition for treating HBV infection |
EP2461826A2 (de) | 2009-08-07 | 2012-06-13 | Transgene SA | Zusammensetzung zur behandlung von hbv-infektionen |
Family Cites Families (85)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US34705A (en) * | 1862-03-18 | Improvement in tompions for fire-arms | ||
US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
IN151589B (de) * | 1978-12-22 | 1983-05-28 | Biogen Nv | |
EP0182442B2 (de) * | 1978-12-22 | 1996-04-03 | Biogen, Inc. | Rekombinante DNS-Moleküle und Verfahren zur Herstellung derselben |
US4935235A (en) * | 1979-05-24 | 1990-06-19 | The Regents Of The University Of California | Non-passageable viruses |
IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
US5196194A (en) * | 1979-05-24 | 1993-03-23 | The Regents Of The University Of California | Vaccines containing Hepatitis B S-protein |
USRE34705E (en) | 1979-08-30 | 1994-08-23 | Institut Pasteur | Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby |
US4415491A (en) * | 1980-01-14 | 1983-11-15 | The Regents Of The University Of California | Synthetic vaccine peptide epitomes of hepatitis B surface antigen |
EP0038765B1 (de) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Impfstoff gegen Hepatitis B Virus, Verfahren und transformierte eukaryotische Zellen zur Herstellung dieses Impfstoffes |
FI83662C (fi) * | 1980-07-17 | 1991-08-12 | Scripps Clinic Res | Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning. |
GR76274B (de) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
US4741901A (en) * | 1981-12-03 | 1988-05-03 | Genentech, Inc. | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
JPS58194897A (ja) * | 1982-05-07 | 1983-11-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規dna,その製造方法およびそれで形質転換させた宿主 |
JPS5936698A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Science & Tech Agency | B型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えdnaおよび形質転換動物細胞 |
US4977092A (en) * | 1985-06-26 | 1990-12-11 | Amgen | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
US5198348A (en) * | 1982-08-30 | 1993-03-30 | Amgen Inc. | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
JPS5974985A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-04-27 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規dna |
CA1341116C (en) * | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
US4696898A (en) * | 1984-01-16 | 1987-09-29 | Integrated Genetics, Inc. | Vector encoding hepatitis B surface antigen |
FR2559159B1 (fr) * | 1984-02-02 | 1986-09-12 | Inst Nat Sante Rech Med | Vecteurs viraux de clonage et d'expression d'une proteine dans une cellule eucaryote, comportant au moins une partie du genome d'un retro-virus; cellules eucaryotes transfectees; procede utilisant de telles cellules et proteines obtenues |
FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
US5158769A (en) * | 1984-03-07 | 1992-10-27 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US5324513A (en) * | 1984-03-07 | 1994-06-28 | Institut Pasteur | Composition useful for the fabrication of vaccines |
US5204096A (en) * | 1984-03-07 | 1993-04-20 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US4861588A (en) * | 1985-02-05 | 1989-08-29 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US4847080A (en) * | 1984-03-07 | 1989-07-11 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers |
US4777240A (en) * | 1984-03-08 | 1988-10-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
US4942125A (en) * | 1984-09-07 | 1990-07-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
US4599230A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
US4599231A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
AU579148B2 (en) * | 1984-03-09 | 1988-11-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants |
US5098704A (en) * | 1984-06-18 | 1992-03-24 | Chiron Corporation | Hepatitis surface antigen particle vaccine |
EP0171908A3 (de) * | 1984-07-11 | 1987-07-15 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen und dessen Herstellung |
GB8421282D0 (en) * | 1984-08-22 | 1984-09-26 | Connaught Lab | Multispecific antigenic proteins |
US4722940A (en) * | 1984-08-23 | 1988-02-02 | Georgia Tech Research Corporation | Aminoalkyl phenyl selenides for the treatment of hypertension and nervous system dysfunctions |
US4722840A (en) * | 1984-09-12 | 1988-02-02 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
EP0175261B1 (de) * | 1984-09-12 | 1991-12-11 | Chiron Corporation | Hybridpartikel-Immunogene |
US4639371A (en) * | 1984-10-02 | 1987-01-27 | New York Blood Center, Inc. | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom |
EP0180012A1 (de) * | 1984-10-27 | 1986-05-07 | Wolfram H. Prof. Dr. Gerlich | Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus |
US4683136A (en) * | 1985-03-06 | 1987-07-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Proteinaceous antigens with conformation-independent and conformation-dependent determinants |
CA1324094C (en) * | 1985-04-03 | 1993-11-09 | Dino Dina | Hepatitis a virus vaccines |
FI861417A0 (fi) * | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
US5837249A (en) * | 1985-04-19 | 1998-11-17 | The Wistar Institute | Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus |
US4639271A (en) * | 1985-04-24 | 1987-01-27 | Moore Business Forms, Inc. | Chromogenic mixtures |
FR2581394B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1988-08-05 | Grp Genie Genetique | Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes |
US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
JPH084507B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1996-01-24 | 武田薬品工業株式会社 | 新規dnaおよびポリペプチド |
US4959323A (en) * | 1985-11-04 | 1990-09-25 | Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Production and use of pre S polypeptides of hepatitis B virus |
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
US4742158A (en) * | 1986-04-25 | 1988-05-03 | Merck & Co., Inc. | Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding |
IE59389B1 (en) * | 1986-05-23 | 1994-12-23 | Merck & Co Inc | Method for producing hepatitis b virus core antigen (HBcAg) in yeast |
CA1310602C (en) * | 1986-06-03 | 1992-11-24 | Hajime Horii | Yeast promoter and process for preparing heterologous protein |
JPH01500515A (ja) * | 1986-06-20 | 1989-02-23 | スクリップス クリニック アンド リサーチ ファウンデーション | B型肝炎ウィルス表面抗原のプレs領域のt及びb細胞エピトープ |
US5068185A (en) * | 1986-07-10 | 1991-11-26 | Merck & Co., Inc. | Trains of yeast for the expression of heterologous genes |
IL79740A0 (en) * | 1986-08-17 | 1986-11-30 | Yeda Res & Dev | Hepatitis vaccine |
US4882145A (en) * | 1986-12-09 | 1989-11-21 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
US5143726A (en) * | 1986-12-09 | 1992-09-01 | The Scripps Research Institute | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
US4818527A (en) * | 1986-12-09 | 1989-04-04 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
ZA88488B (en) * | 1987-01-30 | 1988-10-26 | Smith Kline Rit | Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them |
EP1088830A3 (de) * | 1987-06-22 | 2004-04-07 | Medeva Holdings B.V. | Partikel von Hepatitis B Oberflächenantigen |
WO1988010300A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
US4883865A (en) * | 1987-09-30 | 1989-11-28 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+s antigen |
US4963483A (en) * | 1987-10-13 | 1990-10-16 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
US5011915A (en) * | 1987-10-26 | 1991-04-30 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
US5039522A (en) * | 1988-01-29 | 1991-08-13 | New York Blood Center, Inc. | Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen |
NZ229260A (en) * | 1988-06-03 | 1994-02-25 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and |
US5242812A (en) * | 1989-02-07 | 1993-09-07 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification of hepatitis B vaccine |
US5462863A (en) * | 1989-02-09 | 1995-10-31 | Development Center For Biotechnology | Isolation of Hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
GB8903313D0 (en) * | 1989-02-14 | 1989-04-05 | Wellcome Found | Conjugates |
DK0414374T3 (da) * | 1989-07-25 | 1998-03-09 | Smithkline Beecham Biolog | Hidtil ukendte antigener og fremgangsmåder til fremstilling deraf |
EP0421626A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-04-10 | Merck & Co. Inc. | Vakzin gegen AIDS und Hepatitis B |
EP0491077A1 (de) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches Mittel gegen chronische virale Leberkrankheiten |
US5102989A (en) * | 1991-03-15 | 1992-04-07 | Merck & Co., Inc. | Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells |
IL101653A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles |
CA2067003A1 (en) * | 1991-04-29 | 1992-10-30 | Peter J. Kniskern | Hbsag escape mutant vaccine |
US5840303A (en) * | 1991-08-26 | 1998-11-24 | The Scripps Research Foundation | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
JP2501186Y2 (ja) * | 1992-03-31 | 1996-06-12 | 株式会社栗本鐵工所 | ハンマ―ミル |
CN1063343C (zh) * | 1993-04-27 | 2001-03-21 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
CN1094311A (zh) * | 1993-04-27 | 1994-11-02 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
CN1059927C (zh) * | 1994-03-10 | 2000-12-27 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 羧端带有前表面抗原1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因及其编码蛋白 |
US5792163A (en) * | 1996-01-03 | 1998-08-11 | Hitzig; Gary | Linear punch |
-
1990
- 1990-12-19 EP EP90124775A patent/EP0491077A1/de not_active Withdrawn
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