HU216301B - Eljárás krónikus vírusos hepatitisz kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására - Google Patents
Eljárás krónikus vírusos hepatitisz kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU216301B HU216301B HU9301794A HU179493A HU216301B HU 216301 B HU216301 B HU 216301B HU 9301794 A HU9301794 A HU 9301794A HU 179493 A HU179493 A HU 179493A HU 216301 B HU216301 B HU 216301B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- sequence
- dna
- hbv
- polypeptide sequence
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 title description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 13
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 93
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 62
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 57
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims description 5
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 3
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 117
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 75
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 35
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 32
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 26
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 21
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical group C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 14
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 13
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 11
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 6
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 5
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N Ser-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101100310222 Caenorhabditis briggsae she-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100025840 Coiled-coil domain-containing protein 86 Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 101900252899 Escherichia coli Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 2
- 206010019759 Hepatitis chronic persistent Diseases 0.000 description 2
- 101000932708 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 86 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- VWXGFAIZUQBBBG-UWVGGRQHSA-N Pro-His-Gly Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)[O-])NC(=O)[C@H]1[NH2+]CCC1)C1=CN=CN1 VWXGFAIZUQBBBG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 2
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- JTTMYKSFKOOQLP-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxydiphenylamine Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 JTTMYKSFKOOQLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 1
- JTXVXGXTRXMOFJ-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JTXVXGXTRXMOFJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- YRTOMUMWSTUQAX-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YRTOMUMWSTUQAX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N Asn-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VCJCPARXDBEGNE-GUBZILKMSA-N Asn-Pro-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 VCJCPARXDBEGNE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 101000896148 Enterobacteria phage T4 Baseplate central spike complex protein gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101800001466 Envelope glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 1
- 101000597227 Escherichia phage Mu Probable terminase, small subunit gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101000912555 Escherichia phage lambda Tail fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- ONSARSFSJHTMFJ-STQMWFEESA-N Gly-Trp-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONSARSFSJHTMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 101710170470 Glycoprotein 42 Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000764556 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N Leu-Asp-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N Leu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- JRJLGNFWYFSJHB-HOCLYGCPSA-N Leu-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O JRJLGNFWYFSJHB-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N Lys-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KIGGUSRFHJCIEJ-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-His Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O KIGGUSRFHJCIEJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 1
- DINQYZRMXGWWTG-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DINQYZRMXGWWTG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- IRKWVRSEQFTGGV-VEVYYDQMSA-N Thr-Asn-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O IRKWVRSEQFTGGV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- ZCPCXVJOMUPIDD-IHPCNDPISA-N Trp-Asp-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ZCPCXVJOMUPIDD-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHTZMRCNSA-N [(2r,3s,4s,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl dihydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 231100000354 acute hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 108010025826 prolyl-leucyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N s-peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003636 vidarabine Drugs 0.000 description 1
- 230000006656 viral protein synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát egy őlyan készítmény előállítási eljárása képezi,amely legalább egy őlyan pőlipeptidszekvenciát, amely képesbefőlyásőlni egy vagy több epitóp antigenicitását, valamint gy őlyanhőrdőzót tartalmaz, amely képes beműtatni ez(eke)t a pőlipeptid-szekvenciá(ka)t, amelyek nagyőn hasznősak krónikűs virális hepatitiskezelésére. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás olyan gyógyszerkészítmények előállítására, amelyekkel krónikus virális hepatitises betegségeket lehet gyógyítani.
Legalább öt különböző vírus, nevezetesen a Hepatitis A, B, C, D és E képes akut hepatitises klinikai tüneteket okozni. A Hepatitis A és E megbetegedések, amelyek enterálisan terjednek, nem alakulnak át krónikus fertőzéssé, míg a Hepatitis B és C (korábban parenterális non-A, non-B Hepatitisnek hívták), valamint a D krónikus gyulladásos állapotba megy át, amely azután májcirrózist és primer hepatocelluláris karcinómát okoz.
Viszonylag kevés adat hozzáférhető a Hepatitis Cről és D-ről, a diagnosztikai módszereikről, kezelésükről, valamint a betegséget okozó vírusokról. A Hepatitis D vírus egy RNS vírus, amelyről ismert, hogy inkomplett. Ennélfogva helper vírusra van szüksége ahhoz, hogy a betegben kifejlődjön, és csak HBV-vel (Hepatitis B vírussal) fertőzött egyénekben található meg. Csak az utóbbi időben mutatták ki a Hepatitis C vírust (HCVt), és fejlesztettek ki egy antitest tesztet (anti-HCV), amely megkönnyíti a Hepatitis C fertőzések kimutatását. Egyre növekvő igény van azonban ennek a betegségnek a kezelésére.
Ugyanez igaz a krónikus Hepatitis B-re is, amely sokkal jobban kivizsgált betegség, ami az immunológiai módszerekkel való felismerését, a kórokozó vírust, a vírus életciklusát és DNS-szekvenciáját illeti. Betegekről akkor mondják, hogy a Hepatitis B vírus hordozói, ha a virális DNS tíz hétnél tovább marad fenn, a Hepatitis B e-antigén (HBeAg) 12 hétnél tovább marad fenn, vagy a Hepatitis B felszíni antigén (HBsAg) hat hónapnál tovább marad fenn.
Durván hárommillió emberről tételezhető fel, hogy a krónikus Hepatitis B-ben szenved, legtöbbjük a Távol-Keleten él.
Ezen népességnek a fertőzés fő veszélye a születés során vagy közvetlenül utána a legnagyobb, mivel egy krónikusan fertőzött anya átadja a vírust az újszülöttjének. Az ily módon fertőzött gyermekek 90 százaléka krónikusan fertőzötté is válik későbbi életében. A nyugati világban a fertőzés sokkal gyakrabban fordul elő az élet későbbi szakaszában vagy éppen a felnőttkorban, és főleg parenterális vagy szexuális úton terjed. Ezekben az esetekben a születés utáni Hepatitis B fertőzést kapottaknak csak 5-10 százaléka lesz krónikus hordozója a betegségnek. Az átvitt vírus azonban nem felelős a fertőzött emberekben mutatkozó különböző reakciókért, amelyek során a vírus vagy eliminálódik, vagy az egész életükben megmarad a testükben. Ennek következtében valószínűleg az immunológiai állapot határozza meg a jövőbeni fizikai állapotot.
A Hepatitis B virion (Dane-részecske) különböző szerkezeti fehérjékből, a magfehérjékből és a felületi (S) fehéijékből áll. Az utóbbiak egy olyan nyitott leolvasási keret (ORF) transzlációjának az eredményei, amely három S típusú dómén kódolószekvenciájára terjed ki, és ezek mindegyike olyan ATG triplettel indul, amely képes in vivő transzlációt iniciálni. A domének jelzése preSl, preS2 és S, a molekulákat 5’-3’ sorrendben említve. Ebből az ORF-ből hat fehéijetermék származik: egy glikozilezett és egy nem glikozilezett formája a fő fehérjének (gp27 és p24), amely csak az S doménből transzlálódik (226 aminosav), egy középső fehérje (281 aminosav), amely egy vagy két poliszacharid oldallánccal rendelkezik (gp33 és gp36), amelyet a preS2 és S régió kódol, és végezetül, a nagy fehérjének (389-400 aminosav, a vírus szerotípusától függően) mind egy glikozilezett (gp42), mind egy nem glikozilezett (p39) formája, amely a preSl, preS2 és az S transzlációjával jön létre. A magfehérjék jele HBeAg és HBeAg, az utóbbi végezetül a HBeAg feldolgozási terméke.
A Dane-részecske, amely a fertőzőképes virion, mind mag-, mind felszíni fehérjéket tartalmaz, míg a fonalak a hat felszíni antigén keverékéből jönnek létre. Az S peptid egyedül alakítja ki az úgynevezett 20 nm-es részecskét, amely teljesen fertőzésképtelen.
A HBV-vel fertőzött betegek a hepatitis különböző állapotain mennek keresztül, mielőtt krónikusan HBVvel fertőzötteknek tekintik őket. Közvetlenül a fertőzés után egy fertőzési állapot következik, amelyet a HBeAg jelenléte jellemez a szérumban. A folytatódó HB antigenémia, a gátolt HBV replikáció ellenére, azt jelzi, hogy virális DNS-szekvenciák integrálódtak a beteg celluláris genomjába. Az integrálódott virális szekvenciák nem teszik lehetővé a gazdasejt számára, hogy a teljes vírust szintetizálja. Az integrálódott HBV-szekvenciákat tartalmazó májsejtek azonban képesek arra, hogy csak HBsAg-t termeljenek, amely kimutatható a beteg szérumában és a krónikus Hepatitis B indikátora. A transzformált hepatociták a legnagyobb valószínűséggel nem lizálódnak a citotoxikus T-sejtek hatására, hanem szaporodnak, és vagy krónikus perzisztens hepatitist (CPH) vagy krónikus aktív hepatitist (CAH) indukálnak, amelyek azután a máj cirrózisához vagy primer hepatocelluláris karcinómához vezet, és ez a beteg idő előtti halálát okozza.
Újabban kimutatták, hogy azok a betegek, akik krónikusan fertőzöttek HBV-vel, nem képesek endogén interferont termelni [Abb et al., J. Med. Virol., 16, 171-176 (1985)]. Ez adta az alapját annak, hogy azokat a betegeket, akik krónikus hepatitisben szenvednek, amit a HBeAg és a HBV DNS szérumbeli jelenlétével lehet igazolni, interferon α-val (IFNa) kezeljenek. Nagyszámú betegen végzett ellenőrzött vizsgálatok azt mutatták, hogy az interferon a adagolása a kontrolihoz viszonyítva a Hepatitis B vírus jelentősen megnövekedett eliminálását okozza. A születéskor vagy akörül fertőződött személyeknél azonban nem lép fel szerokonverzió erre a terápiára adott válaszként. Ez a jelenség sajnálatos módon a hordozók 75%-át kizárja az IFNa terápiából.
Jelenleg az interferon a pontos hatásmódja a krónikus Hepatitis B-re nem ismert. Antivirális aktivitása megvédheti a fertőzött sejteket a fertőzéstől vagy csökkentheti a virális transzkripciót, transzlációt és replikációt a HBVvel fertőzött sejtekben. Az interferonnak immunmoduláló hatása van a T-sejtek, a makrofágok és az NK-sejtek aktiválása következtében, valamint azért, mert indukálja az MHCI osztályba tartozó fehérjék expresszióját.
A Hepatitis B kezelésének egy másik megközelítése azon az elképzelésen alapul, hogy a vírus replikációját
HU216301 Β gátolni kell, ezáltal a védekezését annyira le kell gyöngíteni, hogy a gazdaszervezet immunrendszere képes legyen eliminálni a vírust. Ez az elképzelés vezetett oda, hogy antivirális anyagokat, azaz például adeninarabinozidot és adenin-arabinozid-monofoszfátot vizsgáltak meg abból a szempontból, hogy lehet-e velük HBV-vel krónikusan fertőzött egyéneket kezelni. A betegeknek azonban kevesebb mint a fele reagált erre a terápiára, akár hosszan tartó, akár tranziens szerokonverzióval (HBeAg+-ról HBe+-ra). Ezeknek az antivirális anyagoknak egy további negatív tulajdonsága az, hogy immunszuppresszívek.
Más, a krónikus betegek kezelésének vizsgálatában alkalmazott hatóanyag az interferon B, az acikloguanozin (aciklovir), az interleukin 2, a szteroidok, például a prednizolon és ezek kombinációja. De egyikkel sem lehetett jobb eredményt elérni, mint az interferon a-val. Csak egy kombinációs terápia, amelynek során először szteroidokat adtak be, majd interferon α-t, növelte meg a reagálók arányát a kiválasztott betegekben.
A WO 88/10300 számú dokumentum olyan immunogén részecskéket ismertet, amelyek kétféle pepiid monomerből állnak. Az egyik fajta peptid monomerek tartalmaznak egy olyan aminosav-szekvenciát, amely egy olyan peptid lényegi részének felel meg, amely a szekréció során legalább 10 nm átmérőjű részecskéket képez, valamint egy olyan aminosav-szekvenciát, amely egy heterológ epitópnak felel meg. A másik fajta peptid monomerek szintén tartalmaznak egy olyan aminosav-szekvenciát, amely egy olyan peptid lényegi részének felel meg, amely a szekréció során legalább 10 nm átmérőjű részecskéket képez, de nem tartalmaznak heterológ epitópnak megfelelő aminosav-szekvenciát. Az első és a második peptid monomer nem azonos, de képes egymáshoz kapcsolódni.
Az EP-A-271 302 számú dokumentum HBV Tsejt epitópokat ismertet, valamint egy olyan módszert, amellyel egy immunogén immunogenitását fokozzák, oly módon, hogy az immunogént magprotein-részecskékhez kapcsolják.
Az EP-A-175261 számú dokumentum olyan immunogén kompozíciókat ismertet, amelyek egy részecskeképző proteinből és legalább egy fontos epitóppal rendelkező polipeptidből álló virális részecskéket tartalmaznak.
Az EP-A-250253 számú dokumentum a HBV pre-S régiójában előforduló T-sejt és B-sejt epitópokat ismertet.
Az EP-A-385 610 számú dokumentum HBV magantigén részecskék vakcinaként történő alkalmazását ismerteti, ahol a részecskék olyan polipeptidet hordoznak, amely egy epitópot mutat be.
Az EP-A-243 913 számú dokumentum a HBV pre-S kódoló régióját, valamint a pre-S régió vakcinákban történő alkalmazását ismerteti.
A T/52556 számon nyilvánosságra hozott magyar szabadalmi bejelentés HBV pre-S2 protein élesztőben történő kifejezésére szolgáló eljárást ismertet.
A szakirodalomból ismert, hogy a HBV-vel krónikusan fertőzött csimpánzok nem gyógyíthatók sem
HBsAg-vel végzett kezeléssel (tetanusz toxoidhoz kapcsolva), sem anti-HBs antitestekkel végzett kezeléssel. Továbbá, megpróbálták azt is, hogy HBV-vel krónikusan fertőzött betegeket S peptidek beadásával immunizáljanak. Ez a kezelés még anti-HBs antitestek képződését sem eredményezte ezekben a személyekben.
Emellett a Hepatitis B vírus krónikus hordozóit - a meghatározás szerint - az jellemzi, hogy a HBsAg kimutatható a szérumukban. Ennélfogva, előre nem volt látható az, hogy egy kombináció, amely a virális S peptid T-sejteket aktiváló epitópját tartalmazza a találmány szerint, képes immunizálást indukálni Hepatitis B vírus krónikus hordozóiban, és ezzel a végső gyógyulásukat előidézni.
A fentiekben megtárgyalt szakirodalmi helyzetet figyelembe véve a találmány célja egy hatékony terápiás ágens kidolgozása a virális krónikus hepatikus betegségek kezelésére, amely teljes reakciót eredményez (azaz a HBV replikáció kitartó gátlását, a HBV DNS és DNSpolimeráz elvesztését, és a HBeAg, valamint a HBsAg csökkenését és végezetül az eltűnését a betegek szérumából).
A találmány szerinti célkitűzést úgy lehet elérni, hogy olyan, krónikus vírusos hepatitis kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményeket állítunk elő, amelyek - farmakológiailag elfogadható hígító-, hordozó- és/vagy egyéb segédanyagok mellett - hatóanyagként a következő komponensek kombinációját tartalmazzák:
a) legalább egy, valamely hepatitis vírus egy vagy több antigén T-sejtaktiváló epitópját tartalmazó polipeptid-szekvencia, valamint
b) egy olyan hordozó, amely képes az a) epitópszekvenciá(ka)t bemutatni, és az a) polipeptid-szekvencia(ák) kovalens vagy hidrofób kötéssel kapcsolódik(nak) a b) hordozóhoz.
A találmány értelmében a polipeptid-szekvencia lehet egy polipeptid, illetve a Hepatitis B vírus bármely altípusa két vagy több polipeptidjének a kombinációja, különösen az adw, adr és az ady. Ezek a Hepatitis B vírusból származó polipeptidek lehetnek a preSl, preS2 vagy S HBV peptidek, illetve a HBV magantigén.
Az a) pontban említett, hasznos polipeptid-szekvenciák lehetnek az előzőekben említett polipeptidek kombinációi, illetve egy vagy több olyan polipeptid kombinációi, amelyeket i) tetszőleges deléciókkal ii) egy vagy több aminosav helyettesítésével, iíí) egy aminosav-szekvenciának az N-terminálison, a C-terminálison vagy inszercióként történő hozzáadásával módosítottunk, és a módosítás során egy legalább hat egymás utáni aminosavat tartalmazó epitópot megtartunk.
Az a) polipeptid-szekvencia előnyösen mirisztilezve van.
Abból a célból, hogy a megfelelő farmakológiai aktivitást kapjuk, szükséges, hogy a találmány szerinti kombinációban az a) polipeptid-szekvencia egy b) hordozóhoz kötve forduljon elő. Ez a hordozó egy olyan anyagot tartalmaz, amely például hidrofób polimer részecskéket, szervetlen részecskéket vagy poliszacharid részecskéket tartalmaz. A b) hordozó előnyösen egy második polipeptid-szekvencia, amely a szekréció so3
HU 216 301 Β rán részecskéket képez, amely részecskéknek előnyösen legalább 10 nm az átmérőjük.
Előnyös, ha a b) részecskeképző polipeptid-szekvencia egy polipeptid komplett aminosav-szekvenciájának a lényeges részét képezi, amely polipeptid lehet a HBV S peptidje, a HBV magantigénje, a HAV mag-antigénje, a HAV felületi antigénje, a HÍV felületi antigénje és a HÍV mag-antigénje, valamint a gyermekbénulás vírus felületi antigénje. A b) részecsekeképző antigén előnyösen a HBV S peptid és/vagy a magpeptid.
Ha az előzőekben említett polipeptideket hordozószekvenciákként alkalmazzuk, akkor ezek módosíthatók i) tetszőleges deléciókkal, ii) egy vagy több aminosav helyettesítésével, iii) egy aminosav-szekvenciának az Nterminálison, a C-terminálison vagy inszercióként történő hozzáadásával, azzal a feltétellel, hogy a módosítás során a részecskeképző képességet megtartjuk. A b) polipeptid-szekvencia előnyösen mirisztilezve van.
Ha a b) hordozó egy polipeptid-szekvencia, akkor az a) és b) szekvenciákat az alábbi kölcsönhatások közül egynek vagy többnek az alkalmazásával kapcsolhatjuk össze: hidrofób lehorgonyzás (a mirisztilsav segítségével), diszulfid-híd képzése, illetve a két szekvenciát egy peptidkötéssel kapcsolhatjuk össze, ezzel egy fúziós peptidet hozva létre. Az utóbbi esetben adott esetben egy térköz-szekvenciát illeszthetünk az a) és b) polipeptid-szekvenciák közé, amely térköz-szekvencia a két polipeptidhez peptidkötések révén kapcsolódik.
Az a) és b) polipeptid olyan rekombináns DNS-molekuláról expresszáltatható, amely a polipeptidek kombinációját kódolja. A DNS-molekula egy gazdasejtben expresszáltatható. Ez a gazdasejt lehet emlőssejt, élesztő vagy baktériumsejt. A találmány szempontjából előnyös, ha ez a sejt nem termel semmilyen humán szérumfehérjét vagy főemlős szérumfehérjét, csak azokat a polipeptide(ke)t, amelyek az előzőekben említett kombinációban megtalálható(k).
A „HBV S peptid” kifejezés jelentése a továbbiakban olyan peptid, amelyet a teljes HBV genom kódol. A „HBV pre-S2 peptid” kifejezés jelentése a továbbiakban olyan peptid, melyet a HBV genom teljes pre-S2 és S régiója kódol. A „HBV pre-Sl peptid” jelentése a továbbiakban olyan polipeptid, amelyet a HBV genom teljes pre-Sl, pre-S2 és S régiója kódol. Az „epitóp” kifejezés jelentése a továbbiakban legalább hat egymást követő aminosavra vonatkozik, amelyet a jelzett genomrégió kódol (például egy „HBV pre-S2 epitóp” egy olyan, legalább hat aminosavból álló szekvenciára vonatkozik, amelyet a HBV genom pre-S2 régiója kódol). A „T-sejt epitóp” kifejezés jelentése a továbbiakban olyan epitópra vonatkozik, amely a T-sejteken található receptorokkal lép kölcsönhatásba, hogy ezzel fokozza, vagy más módon befolyásolja az immunválaszt.
Az „antigenicitás” kifejezés a továbbiakban azt a képességet jelenti, hogy képes immunválaszt kiváltani (azaz képes antigénként működni), képes antitestek termelését kiváltani (azaz képes antigénként működni) és/vagy képes kölcsönhatásba lépni egy sejtfelszíni receptorral, hogy ezzel fokozza az immunválaszt, illetve az antitestek termelődését.
A „HBV” kifejezés jelentése a vírus bármely altípusa, de főleg az adw, ayw, adr és ayr, amelyek leírása megtalálható a szakirodalomban [P. Valenzuela, Natúré, 280, 815 (1979); Gerlich, EP-A-85111361, Neurath, EP-A-85-102-250]. Az említett szakirodalmakban szereplő peptid-szekvenciákra vonatkozó példákat, amelyek tartalmazzák az a) polipeptid-szekvenciákat, és amelyek befolyásolják egy vagy több epitóp antigenicitását, a szekvencialisták között mutatjuk be (SEQ ID NO. 17-20,22).
A találmány szerinti előnyös megvalósítási módoknak az alábbi kombinációk felelnek meg:
- a pre-Sl-, pre-S2 és/vagy magpeptidek specifikus epitópjaival (determinánsok) rendelkező HB Santigén részecskék;
- a pre-Sl-, pre-S2, S-peptid és/vagy magpeptidek specifikus epitópjaival (determinánsok) rendelkező HB mag-antigén részecskék;
- a Hepatitis B S-, pre-Sl-, pre-S2- és/vagy magpeptidjeinek specifikus epitópjaival (determinánsok) rendelkező Hepatitis A antigén részecskék.
A találmány szerinti előnyös rekombináns DNS-molekulákat az a) polipeptid-szekvenciá(ka)t kódoló szekvenciák jelenléte jellemzi, amely polipeptid-szekvenciák befolyásolják egy vagy több T-sejt epitóp antigenicitását, valamint a b) polipeptid-szekvenciákat kódoló szekvenciák jelenléte jellemzi, amely a szekréció során 10 nm vagy annál nagyobb átmérőjű részecskéket hoz létre, és mind a két DNS-szekvencia egy alkalmas promoter szabályozása alatt áll. Az a)-t kódoló szekvencia lehet például bármely, a listában szereplő 1. és 24. közötti számú szekvencia. A b) polipeptid-szekvenciát kódoló DNS-szekvencia lehet például a szekvencialistában szereplő 25-27-es számú szekvencia.
A 24 szekvencia bármelyikét (1 és 24 közötti számú szekvencia) kombinálhatjuk bármelyik, a szekvencialistában 25-27-es számon szereplő szekvenciával, amelybe mind az a-b, mind a b-a elrendezések beleértendők.
A találmány egy különös előnyös megvalósítási módja szerint a 28. számú epitóp-szekvenciát (amely megfelel a HBV SÍ szekvencia 9-28. aminosavának) kombináljuk a 26. és/vagy 27. szekvenciával, mint részecskeformáló elemmel.
A találmány szerinti rekombináns DNS-konstrukciókban alkalmazott Hepatitis B vírus szekvenciákat bármely ismert módon elkészíthetjük, beleértve a restrikciós fragmensek izolálását és ligálását, oligonukleotidok kémiai szintézisét egy szintetizátor felhasználásával [Cyclon, Bio-Search], valamint a PCR módszerrel való szintézisét [T. J. White, N. Amiéin, Η. E. Erlich, The Polymerase Chain Reaction, Technical Focus 5 (6) (1989)].
Az előnyös rekombináns DNS-molekulákat úgy állítjuk elő, hogy szintetikus oligonukleotidokat Egálunk a HBV-genom S régiójából származó 5’XbaI-BglII3’ fragmenshez (27. számú szekvencia), amely egy BglIIBglII HBV ffagmensből származik, amely a teljes preSl-pre-S2-S-régiót tartalmazza, illetve a teljes S régióhoz Egáljuk a szintetikus oligonukleotidokat. Az ilyen konstrukciók készítésében használt oligonukleotidokat az alábbi, I. táblázatban foglaljuk össze.
HU 216 301 Β
I. táblázat
Funkció Definíció Szekvencia száma
mag | (adw) | aa* | 59-87 | 6 |
mag | (adw) | aa | 2-28 | 7 |
mag | (adw) | aa | -10-28 | 8 |
mag | (adw) | aa | 29-58 | 9 |
mag | (adw) | aa | 1-87 | 10 |
mag | (adw) | aa | -10-87 | 11 |
mag | (adw) | aa | 70-110 | 12 |
mag | (adw) | aa | 80-125 | 13 |
mag | (adw) | aa | 88-120 | 15 |
SÍ | (ayw) | aa | 9-28 | 17 |
SÍ | (ayw) | aa | 83-103 | 18 |
SÍ | (ayw) | aa | 20-40 | 19 |
SÍ | (ayw) | aa | 59-94 | 20 |
SÍ | (ayw) | aa | 94-114 | 21 |
SÍ | (ayw) | aa | 70-105 | 22 |
SÍ | (ayw) | aa | 2-21 | 23 |
SÍ | (ayw) | aa | 14-33 | 24 |
*aa=aminosav
Más előnyös DNS-molekulákat PCR módszerrel készített, T-sejt epitópokat kódoló magszekvenciák HBV magszekvenciához (25. számú szekvencia) történő ligálásával állítunk elő, amely b) polipeptidként működik. Az ezeknek a konstrukcióknak a készítésében használt oligonukleotidokat a II -1. táblázatban adjuk meg.
II-1. táblázat
Funkció | Definíció | Szekvencia száma |
mag | komplett, 1901-2500 bp | 1 |
mag | C-terminális deléció, | 2 |
1901-2405 bp mag C-terminális deléció és stop kodon beillesztés 1901-2405 mag/premag 10 así premag, C-terminális deléció, 1871-2405 bp mag/premag 10 as. premag, C-terminális deléció és stop kodon beillesztés 1871-2405 bp
mag | as. (-10-120) | 16 |
mag/premag | 10 as. premag, komplett mag | 35 |
1871-2500 bp |
*aa=aminosav
A II—2. táblázatban néhány olyan példát mutatunk be, amelyekben a T-sejt epitópot kódoló DNS-szekvenciákat a HBV genom restrikciós emésztésével izoláltuk, és a fentiekben meghatározott b) polipeptid-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciához ligáltuk.
HU 216 301 Β
II—2. táblázat Definíció
Funkció
Szekvencia száma
mag/premag | komplett, 1403-31 bp | •k-k |
S2 ay/ad | ** | |
S2 (K) ay/ad | S2-S- 7 kodon deléciő, az ATG startkodon ATA-ra változtatva | 14 |
** A szekvenciákat Galibert, F. és munkatársai [Natúré, 281. 646-650 (1979)], valamint Ono, Y. és munkatársai közölték [Nucleic Acids Research,
11(6), 1747-1757 (1983)].
A II—3. táblázatban a specifikus rekombináns szolgáló eljárásokat a példák között részletesen megDNS-molekulákat soroljuk fel. Az előállításukra 20 adjuk.
II-3. táblázat
VégsS konstrukció T-sejt epitop Részecskeformáló Szelekciós gén
MT-mag (-10-120) +SAg + neo | core(as-10-12 0) | S adw/ayw vagy S/Xbal/BglII | neo |
MT-S1 (as 9-28) —S + egpt | SÍ (as 9-28)ay | S adw/ayw vagy S/Xbal/BglII | egpt# |
MT-mag-neo | mag/premag 1403-31 bp | mag adw | neo |
MT-mag (1-87) + HBsAg - neo | mag (as 1-87) | S adw/ayw vagy S/Xbal/BglII | neo |
# egpt = Escherichia coli xantin-guanin-foszforibozil-£ranszferáz
Az előnyös DNS-molekulák az a) és b) polipeptidet kódoló régiók mellett további, szelekciós markert kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak. Ezenkívül tartalmazzák az összes, az expresszióhoz szükséges lényeges elemet, azaz a promoter-szekvenciát, startkodont és egy poliadenilezési szignált.
Alkalmas promoter lehet például a metallotionein (MT), az U2 és a H2K promoter, ha gazdasejtként emlőssejteket használunk. Ha élesztő- vagy baktériumsejteket használunk, akkor a megfelelő élesztő- és baktériumpromotereket, azaz a GCN4- és a GÁL 1/10 promotert, illetve a prokarióta trp- és tac-promotert lehet használni.
Ahhoz, hogy a találmány szerinti a) és b) polipeptidek kombinációját előállítsuk, a rekombináns molekulát gazdasejtekbe juttatjuk be transzfekcióval (emlőssejtek esetében), illetve transzformációval (élesztőés baktériumsejtek esetében), illetve más eszközök alkalmazásával. Gazdasejtként bármely szervezet hasz45 nálható, amely képes a rekombináns DNS-molekulát átírni és lefordítani, azaz emlős-, baktérium- és élesztősejtek.
Alkalmas emlőssejtek lehetnek például a VERO-sejtek (majomvese sejtvonal), 3T3-, C127- és L-sejtek (rág50 csáló fibroblaszt sejtvonalak), valamint CHO (aranyhörcsög-petefészek) sejtek, amelyek a dihidrofolát-reduktázra nézve vagy pozitívak, vagy negatívak.
A találmány egy specifikus megvalósítási módja szerint lehetséges továbbá, hogy az előzőekben megha55 tározott első DNS-szekvencia, illetve az előzőekben meghatározott második DNS-szekvencia, amelyek az a), illetve a b) polipeptid-szekvenciá(ka)t kódolják, különböző rekombináns DNS-molekulán találhatók, amely esetben a gazdasejteket a két rekombináns DNS60 molekulával kontranszfektáljuk.
HU 216 301 B
1--- ! <*> | τ—- 1 1 | Λ 1 | |
1 ι α | 1 | Ο Ό ϋ | |
I Ν 'β | I | 00 Φ | |
ι ο Ρ | | | β a u | |
ι ·Ρ | >ι ω | ||
! Β Ρ | ι | C ο Ν |
< MD ffl lehetséges összetétel-változatok a T-sejt epitopokat tartalmazó részecskékre, amelyekkel a krónikus Hepatitisz hordozókat célozzuk meg
'φ | 1 | Ρ | Ρ | Ρ | Ρ | Ρ | Ρ | Ρ | Ρ | Ρ | Ρ | |||
θ' | 1 | α | 04 | α | 04 | 04 | 0« | 04 | 04 | α | α | |||
φ | 1 | ο» | Οΐ | Οΐ | Οι | θ' | 0ΐ | θ' | 0» | σι | θ' | |||
Ρ | η | 1 | ·*». | \ | \ | ''s. | ||||||||
φ | Ό | | | 0 | 0 | ο | 0 | 0 | 0 | Ο | ο | ο | 0 | ||
Ν | Ή | φ | φ | φ | φ | φ | φ | Φ | φ | φ | φ | |||
0) | Ο | 1 | | c | β | β | C | β | β | β | β | c | α | ||
Η | Μ | Η | H | |||||||||||
Φ | Η | Ρ | Ρ | Ρ | ||||||||||
Λ! | Ό | | | «Μ» | W | Ρ W | Ρ ÜJ | Ρ | W | Ρ | |||||
α | Ρ | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | θ' 3 | θ' 3 | θ' | 3 | θ' | |||
ο | Μΰ | 1 | Ό | Ό | Ό | Ό | Ό | Ό | η S | η π >ι | ο ίο S | C0 | ο S | η |
φ | ε | 1 | β | β | β | β | β | β | φ β | Φ β | φ β | -χ. | Φ β | |
Μ | ρ | 1 | «·— | >«—' | ’W» | «—« | -ο >>. | η ·ηχ | Η τη | Ρ | τη | Ρ | ||
(0 | 0 | I | Ο> | Ο» | Οι | θ' | Οι | θ' | ρ 3 | β Ρ 3 | β ρ 3 | β | Ρ 3 | β |
'Φ | Μ-4 | I | β | β | β | β | β | β | Φ Ό | Λ Φ Ό | Λ Φ Ό | χ> | Φ Ό | Δ |
Ρί | X | X | X | X | X | X | Ρ β | Μ Ρ β | X Ρ β | X | Ρ β | X | ||
»·»» | ||||||||||||||
W | W | w | W |
β 'Φ
Ü .Ω rp β Ή σ> ω & ι σι β <*> 2 ε ο S I Φ Ρ
I | Ό | 0. | • | |||||||||||||
·· »Ρ | 04 | ·« | l—t | |||||||||||||
ι Ή | Ρ Ο | X) | Ρ | 04 | Ρ | |||||||||||
! :3 | :3 χφ | :3 | 04 | β | ||||||||||||
04 | X 04 X Ρ | ΐΛ | χ η | Ρ | Λ | a | β 04 | ► | 04 | |||||||
0 | 1 Ρ Λ | Ρ φ | ο | Ρ Ρ | β | Ρ | 0 | *β | X) | |||||||
Ρ | | Ό | Μϋ Ό | Ό Ρ | ► | m | θ' | 0ι | Ο 04 | Ο» Ρ | τη | ||||||
•Ρ | ι β Ο | β | ΟΙ | C %β | \β | ο | β | β | •Η | 04 | β Q | Ό | 10 | |||
04 | ι ο | η | β | τη | ε | ε | Ρ * | X) | ε + | •Ρ | Ο | |||||
Φ | θ' ΙΛ | Ο» Ρ | Ρ | θ' Ρ | Ό | 04 | Λβ Ρ | 1 Φ | 0 | «ί | ||||||
X | 1 β ΟΙ | β Ρ | Ο | β ε | Ρ | φ | φ | β β | ιθ | φ Ρ | Μΰ | 04 | ||||
Ρ | ϋ | ι ε ι | ε «ο | σι | ε ρ | Ü | Ρ | Ρ | Ρ | Ρ > | Ο | Ρ Ρ | Ρ | 1 | ||
τη | 04 | ι | ι β | Ρ | 1 Φ | MJ) | Ο | 04 | S | 04 | Ε \β | β· | 04 *β | φ | Ρ | |
Φ | I Φ Ο | φ Ρ | a | Φ Ρ | ι-1 | σι | ο | Ρ τη | οι | β | Ό | |||||
Ο | ι Μ σι | ρ ε | Ρ | Ρ 1 | Φ | Ρ | η | Ρ | Q | Φ Ό | α ρ | C0 | ||||
04 Ρ | 04 Ρ | 04 | 04 U | Ό | < | ιφ | χφ | Ρ Ρ | Ρ | Μΰ Ε | Ρ | Ρ | ||||
Η | 1 · | φ | Ρ | Ο | Ο· | Ρ | «ΰ | |||||||||
1 θ' Ρ | 01 Ρ | «“1 | θ' β | 04 | 0ι | Οι | ·* \φ | C0 | θ' Φ | β | a | |||||
1 β 04 | β 1 | β | β | β | β | X -ι | Ρ | β Ρ | ο» | Ρ | ||||||
1 % | X ο | > | X | X | X | Ο Φ | X 1 | Ρ | 04 | |||||||
I | \β | Ρ Ό | υ | Ν | ||||||||||||
1 ι | β | τη | α |
ο»
C0 ιη
X ο
ΟΙ
I
ΟΙ +
c0 ιη ι
σχ οι
X <Ν
Μ
V
Ρ ε
ο ρ
λ
Οι β X | 0» β X | 0ΐ β X | θ' β X | ||||||
οι | 04 | ΟΙ | 04 | οι | οι | οι | οι | 04 | οι |
Ο | Ο | Ο | Ö | Ο | □ | Ο | Ο | & | Ο |
''χ | \ | ’***. | --S | ’-s. | |||||
οι | οι | οι | 04 | οι | οι | οι | οι | ΟΙ | οι |
X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
*>. | **S. | \ | 'χ | *«>, | |||||
ε* | Η | Η | Η | Η | Η | £-» | Η | ||
X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
0 |
to ρ η η ο* c Μφ ο > 44
0) β I ο» β
ε
I
X
HU 216 301 B m ι « N vttí ra 4-» —I '«4 A P
A* 0 | 1 •ö | Λ4 |
Ö> ’O | Φ | |
«0 | X | M |
>1 | φ | |
C | tt | N |
< | MD | O |
XD | 1 | P | P | P | p | P | P | P | P | XI | P | P | |||||||||||||||||
cn | 1 | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | Λ | CM | |||||||||||||||||
V | 1 | θ' | cn | Ο» | θ' | & | 0» | σ> | Ο» | θ' | 0 | σ' | |||||||||||||||||
r-4 | a | 1 | •x. | •Χχ, | Χχχ, | ·*«*, | \ | *Χχ | **X | *χχ | \ | ·*>» | |||||||||||||||||
Φ | Ό | I | 0 | 0 | 0 | 0 | O | 0 | 0 | 0 | O | 0 | 0 | ||||||||||||||||
N | •rl | 1 | 0) | φ | Φ | Φ | Φ | Φ | φ | Φ | Φ | Φ | φ | ||||||||||||||||
Ül | o | 1 | G | c | G | G | G | G | c | G | c | G | G | ||||||||||||||||
1 | H | H | hí | H | H | w | hí | Hl | Hl | w | Hí | ||||||||||||||||||
φ | 1 | H | K | Hl | M | K | K | Hl | Hl | Hl | 1-4 | Hl | |||||||||||||||||
'0 | ( | w | r-l Ül | H | ül | r-4 | W | ι—1 | W | r-l | ül | r-4 | Ül | r4 | ül | r4 | ül | r4 | Ül | r-l ül | r-4 | ||||||||
a | r4 | I | 5 | θ' | 3 | Ο» | 3 | 0» | 3 | θ' | 3 cn | 3 | σ» | 3 | σ | 3 | σ* | 3 | θ' | 3 θ' | 3 | σ' | |||||||
u | vtí | 1 | 0) | S | m o | S | CQ | o | >1 | CQ | (0 | ca | a | X CQ | (0 | X | n | n | s | n | » X | CQ | a S | CQ | CQ | X CQ 01 | >1 | CQ | |
Φ | 6 | 1 | Φ | tg | o | <0 | Φ | rd | \ | Φ | a | Φ | ni ~-χ | Φ | <0 | Χχ. | Φ | rö | -x | Φ Φ | Φ <e | \ | <D | c0 \ Φ | r0 | “Χχ. | |||
N | w | 1 | •m | \ | Hí -r> | hí | -n | Χχ„ | Hl | •n | X | hí | •o | H | •fi | w | f> | H | •r> **x | Hl | •n -χ | H | -r-> | X K ·Γ> | \ | Hl | |||
a | 0 | r-4 | 3 | <0 r-4 | Φ | r-4 | 3 | <e | f-4 | 3 | (β | >-4 | 3 <0 | r4 | 3 | Φ | r4 | 3 | <0 | r4 3 | Φ | r-l 3 | (0 | r-4 | 3 <0 -4 | 3 | <0 | ||
xu | ή | 1 | Φ | •σ | XI Φ | •o | Δ | Φ | Ό | -Q | Φ | Ό | Φ | Ό Λ | Φ | •ö | Λ | Φ | Ό | Λ | Φ Ό | Λ | W Ό | P | Φ | TJ Λ Φ | Ό | P | |
tó | P | <0 | X P | tű | X | P | Φ | X | X» | «0 | X | X» | cd X | XI | rd | X | P | «0 | X | Ρ <0 | X | x> <d | X | P | <0 X P | <0 | X | ||
-x | x. | *Χχ | Χχ | χχ. | χ. | —x | —x | —x | |||||||||||||||||||||
1 | w | Ül | Ül | ül | Ül | ül | Ül | Ül | ül | ül | ül |
III. táblázat (folytatás) &
O
P ••4
0« tó Φ u 0« P •ΓΊ Φ a ι
H
O
Ol rl σ» + <0 I x o rí
I
X
t | r- | o | O | ||||||||||
1 1 | Γ- | ΙΛ | o | o | co | CO | r4 | ||||||
I | ΟΟ | CM | <N | OJ | J | n | 1 | 1 | 1 | ||||
1 | XX | + | r4 | r-4 | r-4 | 04 | 1 | m | o | σ» | |||
z t | Γ- | l | X | σ» | a — | 04 | in | «-* | |||||
X 1 | ΟΟ | ο | o | o | G0 | X | X X | X X | X | X | X | X | |
ül 1 | ι—ί | Γ» | 00 | co | X | 0 | 10 | — (0 | 40 | —* | (0 | ||
r4 | o | H | 1 | 1 | | | I | ««F | ||||||
1 | 2 | X | X | X | «-4 | t-4 | t-4 | r4 | r-4 | ||||
í | í | ül | CO | ül | w | CO |
σ' | σ' | θ' | θ' | σ' | 0 | |||||||||||||
(0 | (0 | (0 | 10 | (0 | 10 | |||||||||||||
ni | s | S | X | X | X | X | ||||||||||||
P | ||||||||||||||||||
Φ | 04 | οι | 04 | 04 | 04 | 04 | 04 | ΟΙ | 04 | ΟΙ | ΟΙ | |||||||
P | 0 | 0 | 0 | ο | 0 | Ρ | □ | 0 | 0 | Ρ | 0 | |||||||
0 | -*», | -Χχ, | 'χ. | —X» | ·*Χ» | S. | *Χχ | -Χχ | χ>χ | |||||||||
s | 04 | 04 | 04 | 04 | OJ | 04 | 04 | 04 | 04 | 04 | 04 | |||||||
0 | X | 3! | X | S | X | κ | X | X | X | X | 2 | |||||||
)4 | *Χχ. | Χχ, | Χχ. | *Χχ. | *Χχ | -Χχ | *Χχ | |||||||||||
CM | 1 | F4 | Ε4 | Η | Η | Η | Η | Η | Η | Η | Η | Η | ||||||
1 | s | Γ- | S | X | X | X | X | X | X | 2 | X | 2 | ||||||
1 | GO 1 | 0 | σ' | -¾ | Ü1 | |||||||||||||
r-4 | φ | (0 | Ο | ι-4 | 1 | |||||||||||||
w | G | ε | 04 | 0 | Ü1 | «-Χ | ||||||||||||
1 | σ» | γ4 | 0) | 1 | 00 | |||||||||||||
(0 | θ' | Η | + | G | Η | m | ||||||||||||
>0 U | ε | < | X | 1 | X | 2 | ι | Ρ | ||||||||||
<0 CQ | ι | η | Ο | σ* | σν | CM | ||||||||||||
O G | r4 | Η | η | 04 | <Ώ | ιη | νθ | Γ* | Η | ω | 0 | σ' | ο | γ4 | ||||
'Φ 0 | r4 | X | X | τ-4 | r4 | r-l | »-4 | γ4 | »-4 | Ü1 | Η | X | <υ | rí | 04 | 04 | ||
X | ± | 4- |
HU 216 301 B m ( n N XÖ ra •d \d H P
c | » | P | P | 44 | 44 | P | 44 | P | |
XV | 1 | 0« | a | a | a | a | a | a | |
44 | Ο» | O> | σι | oi | Oi | o· | σ* | Oi | |
Ű) | i | ||||||||
rd | a | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
0) | < | 1 | Φ | <v | Φ | φ | Φ | φ | Φ |
H | *d | 1 | c | c | C | c | c | c | c |
1 | H | H | ||||||||||
I | K | rd | hd | K | 3 | |||||||
Φ | 1 w | rd | w | θ' | CQ | H | CQ | K | *0 | |||
44 | Ό | 3 | 0» | 3 | (8 | 3 | 3 rd | 3 | rd | ti | ||
ö) | rd | ! O >i | CQ | 01 | •d | Ό | (0 | >i Oi | co S | Oi | «S. | |
υ | Mti | 1 Φ ti | Φ | ti | ►d | ti | Φ | ti CQ | Φ ti | CQ | 3 | |
Φ | 6 | I -Γ-» \ | H | •m | ''s* | gj | •n | -s. | -ΓΊ | >. | ||
N | M | 1 rd 2 | ti | id | ű | Oi | rd | 3 w | rd 3 | H | ti | |
W | 0 | Φ Ό | A | Φ | Ό | >< | ti | Φ | Ό ti | Φ Ό | ti | |
XV | Md | 44 ti | x | 44 | ti | ε | 4> | ti XI | 44 ti | 43 | CQ | |
Z | w | X | X | |||||||||
1 | w | •«S. | \ | |||||||||
1 | CQ | CQ |
III. táblázat (folytatás)
3 | X |
>1 | |
ti | 7 |
Cd | cd |
CQ | CQ |
a o
P •d a (A φ u a P •n Ql ffi I ω
d
B rd ti
Λ4
H | ti· | in | ||||||||||||||||
rd | o | 00 | rd | m | ti | |||||||||||||
rd | rd | Cd | Cd | n | r4 Φ | |||||||||||||
z | ti· | o | öl | cd | ti· | Jd | P | |||||||||||
X | σ> | >» | r» | >1 | fd | >t | rd | >» | Φ | 0 | ||||||||
CQ | Z | ti | Z | ti | Z | ti | Z | ti | z | ti | P | g | ||||||
'T' | ** | a tat | 0 | |||||||||||||||
rd | 1 rd | 1 rd | ín | 1 cd | <0 Ό | P | ||||||||||||
CQ | CQ | CQ | CQ | CQ | X | 0* | ||||||||||||
4J | ||||||||||||||||||
rd | 44 | +4 | ||||||||||||||||
M | Cd | cd | cd | cd | cd | cd | Cd | Φ | ti | |||||||||
Φ | p | P | p | P | p | P | P | íÖ | -P | |||||||||
44 | Ss, | *«««. | ~'Sx | Ό | xö | |||||||||||||
0 | Cd | cd | Cd | cd | <d | Cd | Cd | p-d | pd | Ό | ||||||||
B | Z | S | S | a | a | a | a | XD | g | rd | ||||||||
0 | \ | ιφ | ||||||||||||||||
U | E-< | Eh | Ed | Ed | Ej | Ed | 04 | Φ | ||||||||||
a | Z | Z | Z | Z | Z | Z | Z | 04 | ||||||||||
• | >1 | |||||||||||||||||
r> | rd | (0 | ||||||||||||||||
Φ | ||||||||||||||||||
Ό | g | Ό | ||||||||||||||||
W | k | in | ||||||||||||||||
r* | • | χσ | xö | XÖ | ||||||||||||||
to | 44 | i-“l | Λ | rd | ||||||||||||||
0 | a | |||||||||||||||||
Öi | c | ín | fO | ti· | m | V0 | c* | 00 | ||||||||||
XV | 0 | 1 | Cd | Cd | Cd | Cd | Cd | cd | cd | ·· | ·* |
> M
HU 216 301 Β
AIII. táblázatban egy áttekintést kapunk arról, hogy a megfelelő DNS-szekvenciákat miként kombinálhatjuk. Meg kell jegyeznünk, hogy bármelyik, az ebben a táblázatban jelzett komponens kombinálható, hogy egy olyan DNS-szekvenciát kapjunk, amelyet, ha egy gazdasejtbe transzfektálunk, akkor egy olyan kombinációt kapunk, amely az a) és b) polipeptide(ke)t tartalmazza, és ez a kombináció krónikus virális hepatitis kezelésében gyógyszerként használható. A T-sejt epitóp-szekvenciákat vagy szintetikusan (SYN) állítottuk elő egy Biosearch Cyclon szintetizátorral, vagy PCR módszerrel (PCR), vagy a virális genom restrikciós enzimes fragmentálásával (GENE).
A krónikus virális hepatitisben szenvedő betegek kezelésére az a) polipeptid-szekvencia és a b) hordozó kombinációját bármely típusú gyógyászati készítménynek megfelelően formulázhatjuk, amely emellett tartalmaz egy megfelelő vivőanyagot vagy gyógyászati hordozót, például pufferoldatot.
A beadást végezhetjük bármely ismert módszerrel, azaz parenterálisan (például intravénásán vagy intramuszkulárisan), orálisan (például typhoid baktériumsejteket alkalmazva az aktív adalékanyag kapszulázására).
A gyógyászati készítmény az előzőekben említett kombinációkat megfelelő koncentrációban tartalmazza ahhoz, hogy a beadással választ váltsunk ki.
Az alábbiakban megadjuk a mellékletben csatolt ábrák leírását.
I. ábra egy olyan DNS-konstrukciót mutat, amely egy promotert, egy részecskeképző szekvenciát és egy szelekciós gént kódol (a 3/4 példában van leírva).
II. ábra egy olyan DNS-génkonstrukciót mutat, amely egy promotert és egy epitópot tartalmaz a teljes HB-S-Ag-vel, valamint egy szelekciós gént (a 3/18-as példában van leírva).
III. ábra egy olyan DNS-konstrukciót mutat, amelyben egy promoter, valamint egy T-sejt epitóp található egy részecskeképző maradékkal és egy szelekciós génnel (a 3/21-es példában leírva).
IV. ábra az I-es csimpánz AST értékeit mutatja a
Hepa-Care kezelés során (a 10/1-es példában van leírva).
V. ábra az I-es csimpánz antigén értékeit mutatja a
Hepa-Care kezelés során (a 10/1-es példában van leírva).
VI. ábra a háromszor Hepa-Care-rel booster kezelt
I-es csimpánz ALT és GGT májenzimeinek értékeit mutatja (a 10/2-es példában van leírva).
VII. ábra a háromszor Hepa-Care-rel booster kezelt
ΙΙ-es csimpánz ALT és GGT májenzimeinek értékeit mutatja (a 10/3-as példában van leírva).
VIII. ábra egy kezeletlen kontroll csimpánznál meghatározott májenzimeket mutatja (a 10/3-as példában van leírva).
IX. és X. ábra az első beteg antigén és antitest titerét mutatja a Hepa-Care kezelés során (all. példában van leírva).
XI. és XII. ábra a második beteg antigén és antitest titerét mutatja a Hepa-Care kezelés során (a 11. példában van leírva).
XIII. és XIV. ábra a harmadik beteg antigén és antitest titerét mutatja a Hepa-Care kezelés során (a 11. példában van leírva).
A találmányt közelebbről az alábbi példákon keresztül mutatjuk be.
1. példa
1. Frakciónak kicsapás polietilén-glikollal (PEG)
A HBV fehérjét termelő tenyészetek felülúszóit összegyűjtjük, majd 2400 ml-es részekre osztjuk. Mindegyik részhez 144 g PEG6000-et adunk (SERVA), majd szobahőmérsékleten kevertetve 20 perc alatt feloldjuk, majd további hat óra hosszat kevertetjük 4 °C-on. A csapadékot centrilügálással elválasztjuk GS 3 rotorban, 500 ml-es palackokban (9000/perc, 15000xg, 30 perc, 10 °C). A felülúszót összegyűjtjük és 144 g PEG6000-et adunk hozzá, majd a fentiekben leírt módon feloldjuk. Az oldatot 3 óra hosszat kevertetjük 4 °C-on. Az ebből az oldatból származó csapadékot a fentiekben leírt módon kinyerjük, azzal a különbséggel, hogy a centrifügálást 60 percig folytatjuk.
2. Gélkromatográfia
A PEG-es kicsapás után kapott anyagot 20 ml PBSben újra oldjuk, és A-5m tölteten (BioRad) gélkromatográfiának vetjük alá. Az oszlop mérete 25 χ 1000 mm, ágytérfogata 480 ml. Egy tipikus frakcionálás során 1000 pg PEG-gel kicsapott HBV fehérjét (10-15 ml térfogatban) viszünk fel az oszlopra, majd PBS-sel eluáljuk 6 csepp/perc (18 ml/ó) sebességgel. 3 ml-es frakciókat szedünk. A HBV fehérje az első csúcsban jön le. Az összegyűjtött frakciókat CsCl gradiensen tisztítjuk.
3. Ülepítés CsCl gradiensen
Körülbelül 30, az A-5m oszlopkromatográfia első csúcsából származó frakciót, amelyek előre tisztított HBV fehérjét tartalmaznak, összegyűjtünk, térfogata körülbelül 100 ml. Ennek az oldatnak a sűrűségét 1,30 g/cm3-re állítjuk CsCl-dal, majd egy SW 27/28 rotorba való poliallomer csőbe (Beckman) visszük át. A gradienst úgy állítjuk elő, hogy az oldat alá rétegzünk 4 ml 1,35 g/cm3 sűrűségű CsCl oldatot, föléje pedig 4 ml 1,25 g/cm3 sűrűségű oldatot, majd pedig 4 ml 1,20 g/cm3 sűrűségű oldatot. Ezt a gradienst 28000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk 50 óra hosszat 10 °C-on. Ezután a gradienst frakcionáljuk, és az 1,20 g/cm3-es sűrűségrétegen úszó tisztított HBV fehérjét összegyűjtjük. Az oldatot három dialízisciklusban zacskókban sómentesítjük vízzel szemben.
2. példa
A HBVfehérje mennyiségi meghatározása
1. Meghatározás radioimmunesszével
Az AUSRIA11-125 „szendvics” radíoimmunesszében (kereskedelmi forgalomban kapható az Abbottól) a Hepatitis B felületi antigénje elleni aranyhörcsög-anti10
HU 216 301 Β testekkel (Anti-HBs) borított gyöngyöket inkubálunk szérummal vagy plazmával vagy tisztított fehérjével és a megfelelő kontrollokkal. Minden jelen levő HBsAg a szilárd fázisban levő antitesthez kötődik. A megkötetlen anyag leszívása, majd a gyöngyök mosása után humán 125T-Anti-HBs-t hagyunk reagálni a gyöngyön levő antitest-antigén komplexszel. A gyöngyöket azután mossuk, a megkötetlen 125I-Anti-HBs eltávolítására.
)-Anti-Hbs HBsAg )-Anti-Hbs HBsAg i25i.Anti-HBs )-Anti-HBs HBsAg l25I-Anti-HBs
A gyöngyökön maradó radioaktivitást gamma szcintillációs számlálóval határozzuk meg.
2. Meghatározás ELISA-val
Az Enzygnost HBsAg mikro „szendvics” vizsgálatban (kereskedelmi forgalomban kapható a Behringtől) a mélyedéseket anti-HBsAg borítja. A mélyedésekhez szérumplazmát vagy tisztított fehérjét és a megfelelő kontrollokat adjuk, majd inkubáljuk. Mosás után peroxidázzal jelzett HBsAg elleni antitesteket reagáltatunk a megmaradt antigén determinánsokkal. A megkötetlen enzimhez kapcsolt antitesteket mosással eltávolítjuk, majd a szilárd fázison megmaradó enzimaktivitást meghatározzuk. A hidrogén-peroxid és a kromogén enzimesen katalizált reakcióját hígított kénsav hozzáadásával állítjuk le. A szín intenzitása arányos a mintában levő HBsAg koncentrációjával, a koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy fotometriásan összehasonlítjuk az ismeretlen minták színintenzitását a negatív és a pozitív kontroll szérumok színintenzitásával.
3. példa
A találmány szerinti génkonstrukciók készítése, amelyekpromotert, a kiválasztott antigén-szekvenciákat és szelekciós gént tartalmaznak
1. Az MT-promoter izolálása
A pBPV-342-12 plazmidot (ATCC 37224) BglII és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. Három DNS-molekulát kapunk. A számunkra érdekes fragmens tartalmazza a metallotionein promotert és egy pBR322 szekvenciát, amely 4,5 kb méretű, és könnyen megkülönböztethető a többi fragmenstől (2,0 kb, illetve
7,6 kb).
A reakciót 200 μΐ-es össztérfogatú reakciópufferben hajtjuk végre, amelyben a DNS végkoncentrációja 0,5 pg/μΐ, és 100 egységet tartalmaz az egyes restrikciós enzimekből. Az emésztés teljes lejátszódását háromórás, 37 °C-on végzett inkubálás után vizsgáljuk meg agaróz gélelektroforézissel, 0,8%-os agarózgélben. A reakciót 4 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le.
A 4,5 kb méretű fragmenst 1,2%-os preparatív gélen végzett gélelektroforézissel választjuk el a többi fragmenstől. A DNS-t kioldjuk a gélből egy DE-81 Whatman szűrőpapírra, amelyről a DNS-t magas sótartalmú pufferrel oldjuk le. A DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extrahálva, majd két etanolos kicsapással tisztítjuk.
2. Egy 1,8 kb méretű, a HBV magantigént kódoló fragmens ligálása
Egy 1,8 kb méretű BamHI-BamHI fragmenst, amely a HBV-mag kódoló régiókat tartalmazza, HBVtartalmú DNS-ből izolálunk. Ezt a fragmenst ligáljunk egy 4,5 kb méretű fragmenssel, amely az MT-promotert és a pBR maradékot tartalmazza (leírása az 1. pontban).
Az 1,8 kb méretű fragmensből 2 μΐ-t keverünk 3 μΐ
4,5 kb méretű fragmenssel, majd 10 μΐ össztérfogatban Egáljuk, amely 2 egység T4-DNS ligázt és 2 mmol/1 ATP-t tartalmaz (14 °C, éjszakát át).
A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejtszuszpenzióhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. A DNS felvétele után a baktériumsejteket LB agarlemezekre szélesztjük, amelyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, a szélesztett szuszpenzió térfogata lemezenként 50-300 μΐ. Az agarlemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on. A különálló, izolált baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett fragmenst hordozó plazmidot.
3. A keresett plazmidot tartalmazó baktériumtelepek keresése
Különálló telepeket izolálunk steril fogpiszkálóval, majd LB-ampicillint tartalmazó csövekbe visszük át őket (5 ml). A csöveket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on, erős rázatás közben. Az egyes baktériumszuszpenziókból mini plazmidpreparátumokat készítünk. A kapott különböző DNS-eket megvizsgáljuk, BglII restrikciós enzimmel végzett emésztéssel. Két molekulát várunk, az egyik 400 bp, a másik 5,9 kb méretű. Az emésztést agaróz gélelektroforézissel végezzük. A plazmid DNS-t izoláljuk a baktériumsejtekből.
4. Neomicin szelekciós marker beépítése
A 3. pontban kapott plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztve linearizáljuk. A reakciót 50 μΐ össztérfogatban végezzük, a végkoncentráció 1 pg/μΐ plazmid DNS. 50 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk hozzá, majd az emésztés megtörténtét (3 órán át 37 °C-on végzett inkubálás után) agaróz gélelektroforézissel igazoljuk. A reakciót 1 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t 0,3 mol/1 végkoncentrációjú nátrium-acetáttal és 3-4-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk (-80 °C, 30 perc). A kicsapott DNS-t 50 μΐ desztillált vízben oldjuk.
A linearizált plazmidból 2 μΐ-t 3 μΐ olyan DNS-fragmenssel keverünk össze, amely a metallotionein promotert és a neomicin szelekciós gént tartalmazza [izolálva a pMT-neo-E plazmidból (hozzáférhető az ATCC/ Exogene-nél) EcoRI restrikciós enzimmel végzett emésztéssel, egy 3,9 kb méretű fragmens formájában], majd Egáljuk őket. Egyedi telepeket izolálunk, és megvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot.
5. Az U2 promoter-szekvenciát tartalmazó fragmens izolálása
A pUC-8-42 plazmidot (hozzáférhető az Exogene-nél) EcoRI és Apai restrikciós enzimmel emésztjük. Két DNS-molekula jön létre. A számunkra érdekes fragmens tartalmazza az U2 promotert, amelynek mérete 340 bp, és könnyen megkülönböztethető a másik fragmenstől (3160 bp). Az emésztést 200 μΐ össztérfogatú reakciópufferben végezzük, a DNS végkoncentrációja 0,5 pg/ml, és 100 egységet tartalmaz az egyes
HU 216 301 Β restrikciós enzimekből. Az emésztés teljes lejátszódását (három órán át 37 °C-on végzett emésztés után) agaróz gélelektroforézíssel ellenőrizzük, 0,7%-os agarózgélben. A reakciót 4 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le. A 340 bp méretű fragmenst a plazmid DNS-től preparatív agaróz gélelektroforézíssel választjuk el, 1,2%-os gélben. A DNS-t kioldjuk a gélből egy DE-81 Whatman szűrőpapírra, amelyről a DNS-t magas sótartalmú pufferrel oldjuk le. A DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd két etanolos kicsapással tisztítjuk.
6. A promoter-szekvenciát tartalmazó fragmens beépítése egy polilinker plazmidba
A pSP165 plazmidot (kereskedelmi forgalomban hozzáférhető a Promega Biotec-nál), amely egy polilinker-szekvenciát tartalmaz (ebben az alábbi restrikciós hasítási helyek találhatók meg: EcoRI, SacI, Smal, Aval, BamHI, BglII, Sáli, PstI, HindlII) EcoRI restrikciós enzimmel linearizáljuk. A reakciót 50 μΐ végtérfogatban hajtjuk végre, 1 μg/μl plazmid DNS végkoncentráció mellett. 50 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk hozzá, majd az emésztés megtörténtét (3 órán át 37 °C-on végzett inkubálás után) agaróz gélelektroforézissel ellenőrizzük. A reakciót 1 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t 0,3 mol/1 végkoncentrációjú nátrium-acetáttal és 3-4-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk (-80 °C, 30 perc). A kicsapott DNS-t 50 μΐ desztillált vízben oldjuk.
μΐ plazmid DNS-t elegyítünk 10 μΐ fragmens DNS-sel, amely tartalmazza az U2 promoter-szekvenciát, majd 25 μΐ össztérfogatú ligáló pufferben ligáljuk a fragmenseket, amely 2 egység T4 DNS ligázt és 2 mmol/1 ATP-t tartalmaz (14 °C, egy éjszakán át). Ezután a DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kétszer kicsapjuk, végül 10 μΐ desztillált vízben oldjuk. A kapott tapadós EcoRI és Apai végeket tompa végekké kell konvertálni, és ligálni kell. A tapadós végeket tompa végekké Mung bean nukleázzal alakítjuk át, az alábbiak szerint: 25 μΐ DNShez (1 μg/μl koncentráció) reakcióelegyben 20 egység enzimet adunk, és annyi glicerint, hogy végkoncentrációja 1% legyen, a végső reakciótérfogat pedig 35 μΐ legyen. 30 percig 30 °C-on végzett inkubálás után a DNS-t fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk és etanollal kétszer kicsapjuk. A DNS-t ismét 5 μΐ desztillált vízben oldjuk. A kapott tompa végeket ligáljuk 15 μΐ reakcióelegyben, amely tízszer több T4 ligázt tartalmaz, mint amennyit az előzőekben használtunk, valamint 2 mmol/1 ATP-t (14 °C, éjszakán át). A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejt-szuszpenzióhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. A DNS felvétele után a baktériumsejteket LB agarlemezekre szélesztjük, amelyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, a szélesztett szuszpenzió térfogata lemezenként 50-300 μΐ. Az agarlemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on. A különálló, izolált baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e az U2 promoter fragmenst hordozó plazmidot. A kapott plazmidokat izoláljuk a baktériumsejtekből és restrikciós enzimes elemzéssel jellemezzük.
7. A 89. számú szintetikus DNS oligonukleotid (30. számú szekvencia) ligálása a 4,5 kb méretű MT-promoter fragmenssel
Az 1. pontban ismertetett 4,5 kb méretű fragmenst, amely az MT-promotert és egy pBR maradékot tartalmaz, a 89. számú szintetikus oligonukleotiddal (30. szekvencia) ligáljuk. A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejt-szuszpenzióhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. Különálló baktériumtelepeket vizsgálunk át, hogy megtalálható-e bennük a keresett plazmid. Az új plazmid szerkezetét EcoRI és Xbal restrikciós enzimmel emésztve igazoljuk. Két molekulát várunk, az egyik mérete 2,0 kb, a másik mérete
2,6 kb.
8. A 101. számú szintetikus oligonukleotid (32. számú szekvencia) ligálása a 7. pontban közölt plazmiddal
A 7. pontban ismertetett plazmidot BglII és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy 13 nukleotidból álló fragmenst (az 1. pontban közöltük) eltávolítunk. A kapott fragmenst, amely az első 89. számú oligonukleotidot tartalmazza (30. szekvencia) a 101. számú oligonukleotiddal (32. szekvencia) ligáljuk, amely egy BglII-BamHI fragmens. A DNS felvétele után az egyedi sejteket megvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot. Az új plazmid szerkezetét EcoRI és Xbal vagy EcoRI és BglII restrikciós enzimmel emésztve igazoljuk.
9. A 99. számú szintetikus DNS oligonukleotid (31. szekvencia) ligálása az 1. pontban ismertetett 4,5 kb méretű fragmenssel
A 4,5 kb méretű BglII-BamHI fragmenst a 99. számú DNS oligonukleotiddal (31. szekvencia) ligáljuk össze. Miután a különböző DNS-eket tartalmazó egyedi baktériumtelepeket átvizsgáltuk, a keresett plazmid szerkezetét EcoRI restrikciós enzimmel emésztve igazoljuk, mikor is két fragmenst kapunk, méretük 1,9 kb és 2,7 kb, illetve azon az alapon azonosítjuk, hogy a BglII vagy BamHI enzimekkel linearizálni tudjuk a plazmidot.
Az új plazmidot PstI és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. Két molekulát várunk, az egyik egy
2,6 kb méretű fragmens, amely egy pBR maradékot, az MT-promotert és az oligonukleotidot tartalmazza, valamint egy 2,0 kb méretű pBR maradékot tartalmaz. A 2,6 kb méretű fragmenst izoláljuk.
10. A 9. pontban ismertetett plazmid 2,6 kb méretű fragmensének ligálása egy, a 8. pontban ismertetett plazmid fragmensével
A 8. pontban ismertetett plazmidot, amely a 89. és 101. számú oligonukleotidokat (30. és 32. szekvencia) tartalmazza, PstI és BglII restrikciós enzimmel emésztjük. Két fragmenst várunk. Egy 2,5 kb méretű fragmenst, amely egy pBR csoportot és az MT-promotert tartalmazza, valamint egy 2,2 kb méretű fragmenst, amely egy pBR csoportot és mindkét oligonukleotidot tartalmazza.
Ezt a 2,2 kb méretű fragmenst a 2,6 kb méretű fragmenssel ligáljuk, amely a pBR maradékot, az MTpromotert és a 99. számú oligonukleotidot (31. szekvencia) tartalmazza, a 8. pontban ismertetettek szerint.
HU 216 301 Β
11. A 2,3 kb méretű HBV BglII—BglII fragmens ligálása
Egy 2,3 kb méretű BglII—BglII fragmenst, amely a pre-Sl, pre-S2 és S kódoló régiókat tartalmazza, a HBV-t tartalmazó DNS-ből izoláljuk. A 2,3 kb méretű fragmenst a 4,5 kb méretű fragmenssel Egáljuk (az 1. pontban ismertetettük az előállítását), amely a metallotionein promotert tartalmazza.
A 2,3 kb méretű fragmensből 2 μΐ-t elegyítünk 3 μΐ
4,5 kb fragmenssel, majd 10 μΐ össztérfogatú ligáló pufferben Egáljuk, amely 2 egység T4 DNS ligázt és 2 mmol/1 ATP-t tartalmaz (14 °C, egy éjszakán át).
A ligáié elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejtszuszpenzióhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. A DNS felvétele után a baktériumsejteket LB agarlemezekre szélesztjük, amelyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, a szélesztett szuszpenzió térfogata lemezenként 50-300 μΐ. Az agarlemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on. A különálló, izolált baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett fragmenst hordozó plazmidot.
12. A HBV génszekvencia egy részének konverziója a HBV-mag epitópokkal
Az előző, 11. pontból származó plazmidot BglII és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. Két molekulát várunk, az egyiknek a mérete 550 bp, a másik mérete 6,25 kb, amelyet agaróz gélelektroforézis után izolálunk.
A 6,25 kb méretű fragmenst a 10. pontban ismertetett 270 bp méretű fragmenssel Egáljuk (BglII és Xbal emésztés, és az előzőkben ismertetett fragmens izolálás után), amely a HBV-mag gén egy epitóp részét kódolja.
A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejtszuszpenzíóhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. A különálló, izolált baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett fragmenst hordozó plazmidot. Az új plazmid jelenlétét BamHI restrikciós enzimmel emésztve igazoljuk. Három molekulát várunk, egy 950 bp, egy 450 bp és egy 5150 bp méretű fragmenst.
13. Egy „hordozó” plazmid készítése
All. pontban ismertetett plazmidot EcoRI és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. Két molekulát várunk, az egyik egy 2450 bp méretű fragmens, a másik egy 4350 bp méretű fragmens, amelyet gélelektroforézis után izolálunk.
Ezt a 4350 bp méretű fragmenst Egáljuk a 39. számú DNS oligonukleotiddal (29. szekvencia), amely a HBV-S gén teljes szekvenciáját tartalmazza az ATG-től az Xbal helyig, amelyben az ATG-t ATA-ra változtattuk.
14. Mag-epitóp a teljes HBV-S gén előtt
Ezt a „hordozó” plazmidot PstI és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, két molekulát várunk, az egyik egy 600 bp méretű plazmidmaradék, a másik egy 3850 bp méretű fragmens, amelyet izolálunk, és a 10. pontban ismertetett plazmid PstI-Xbal restrikciós enzimekkel való emésztése után kapott 2800 (2700) bp méretű fragmenssel Egálunk.
A keresett plazmid megkeresése után EcoRI és Xbal, EcoRI és BglII és BamHI restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel igazoljuk a szerkezetét.
15. Egy szelekciós marker beépítése
A 14. pontban ismertetett plazmidot EcoRI restrikciós enzimes emésztéssel linearizáljuk. A reakciót 50 μΐ össztérfogatban és 1 pg/μΐ plazmid DNS koncentráció mellett hajtjuk végre. 50 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk az elegyhez, és az emésztés lejátszódását (3 óra, 37 °C-on végzett inkubálás után) agaróz gélelektroforézissel igazoljuk.
A reakciót 1 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t 0,3 mol/1 végkoncentrációjú nátrium-acetáttal és 3-4-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk (-80 °C, 30 perc). A kicsapott DNS-t 50 μΐ desztillált vízben oldjuk.
A linearizált plazmidból 2 μΐ-t 3 μΐ DNS-fragmenssel elegyítünk, amely fragmens tartalmazza a metallotionein promotert és a 4. pontban ismertetett neomicin szelekciós gént, majd Egáljuk őket. Egyedi baktériumtelepeket vizsgálunk át, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot, amelyet azután izolálunk, tisztítunk és jellemzünk.
A fentiekben ismertetett mindegyik génkonstrukciót előállíthatjuk az U2 promoterrel is, mikor is az MT-promotert tartalmazó DNS-fragmenst, EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel végzett emésztés után egy olyan DNS-fragmenssel helyettesítjük, amely az U2 promotert tartalmazza, EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel végzett emésztés után.
16. Az Escherichia coli xantin-guanin-foszforiboziltranszferáz (egpt) szelekciós gén izolálása
Az egpt szelekciós gént tartalmazó 1,8 kb méretű fragmenst a pMSG plazmid BamHI és BglII restrikciós enzimekkel végzett emésztése után izoláljuk, és egy
4,5 kb méretű, az 1. pontban ismertetett 4,5 kb méretű BglII-BamHI fragmenssel Egáljuk, amely az MTpromotert tartalmazza.
A keresett plazmidot megkeresése után izoláljuk, tisztítjuk, és véglegesítjük oly módon, hogy a BamHI hasítási helyet EcoRI hellyé alakítjuk.
17. A keresett DNS-szekvenciák izolálása PCR módszerrel
Egy DNS-fragmenst (400 bp) izolálunk gélelektroforézis után. Ezt PCR módszerrel állítjuk elő (leírását lásd az 5. példában), a 131. és 132. számú specifikus nukleotidok mint indítómolekulák felhasználásával (33. és 34. szekvencia).
A DNS-fragmenst BamHI és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, majd gélelektroforézissel tisztítjuk. Az izolált PCR fragmenst egy 6,25 kb méretű fragmenssel Egáljuk, amelyet a 13. pontban ismertetett plazmidból izoláltunk, BglII és Xbal restrikciós enzimekkel végzett emésztés után. Transzformálás után az egyedi baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot.
18. Egy szelekciós marker beépítése
A 17. pontban ismertetett plazmid végső szerkezetét egy szelekciós génnek a plazmidba való építésével hozzuk létre (leírás a 15. pontban).
19. A H2K promoter izolálása
A H2K promotert egy 2 kb méretű EcoRI és egy BglII fragmens formájában izoláljuk a pSP65H2 plazmidból (kapható az Exopgene-tól).
HU 216 301 Β
20. A HBV génszekvencia egy részének konverziója
All. pontban keletkező plazmidot BglII és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. Két molekulát várunk, ezek közül az egyik egy 6,250 kb méretű fragmens, amelyet agaróz gélelektroforézis után izolálunk.
A 6,250 kb méretű fragmenst a 23. számú DNS oligonukleotiddal (28. számú szekvencia) Egáljuk. A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejt-szuszpenzióhoz adjuk a DNS bejuttatása céljából. Az egyedi baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy megtalálható-e bennük a keresett plazmid. Az új plazmid szerkezetét EcoRI és BglII restrikciós enzimmel végzett emésztéssel igazoljuk. Két molekulát várunk, az egyik 1,9 kb, a másik 4,450 kb méretű.
21. Egy egpt szelekciós marker beépítése
A 20. pontban ismertetett plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel linearizáljuk. A reakciót 100 μΐ össztérfogatban hajtjuk végre, 0,6 pg/μΐ plazmid DNS koncentráció mellett. 60 egység EcoRI-et adunk hozzá, és az emésztést agaróz gélelektroforézissel igazoljuk (3 óra, 37 °C). A reakciót 1 μΐ 0,5 mol/l EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t 0,3 mol/l végkoncentrációjú nátrium-acetáttal és 3-4-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk (-80 °C, 30 perc). A kicsapott DNS-t 50 μΐ desztillált vízben oldjuk.
A linearizált plazmidból 2 μΐ-t 3 μΐ DNS-fragmenssel elegyítünk, amely fragmens tartalmazza az egpt szelekciós gént, majd Egáljuk őket. Egyedi baktériumtelepeket vizsgálunk át, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot. A III. táblázatban ismertetett génkonstrukciók ugyanazon az úton állíthatók elő, amint azt az előzőekben ismertettük.
4. példa
Emlőssejtek transzfekciója
Abból a célból, hogy a HBV peptidek jelentős mennyiségének szekrécióját elérjük, az emlőssejteket a találmány szerinti DNS-konstrukcióval kell transzfektálni. A kotranszfekciót vagy két lépésben hajtjuk végre (azaz az egyes konstrukciókat külön-külön transzfektáljuk) vagy egy lépésben (azaz egy transzfekciót végzünk a két konstrukciót tartalmazó készítmény felhasználásával). A kotranszfekció megtörténtét vagy úgy igazoljuk, hogy különböző szelekciós markereket használunk a két konstrukción, vagy úgy, hogy mindkét konstrukció expressziós termékének a szekrécióját igazoljuk immunesszével.
Egy másik módszer szerint egy, a találmány szerinti HBV peptid szekvenciát kódoló szekvenciát és egy másik szekvenciát, amely a teljes S vagy mag vagy HAV fehérjét kódolja, egyetlen konstrukcióban kombinálhatjuk.
5. példa
Polimeráz láncreakció (PCR)
A polimeráz láncreakció lehetővé teszi, hogy egy kiválasztott specifikus DNS nukleotid-szekvencia kiválasztott régióját in vitro körülmények között, több mint egy milliószorosan megsokszorozzuk [Thomas J. White, Norman Amleim, Henry A. Erlich: The polymerase chain reaction. Technical focus, Vol. 5, No 6 (1989); Kwok and R. Higuchi: Avoiding false positives with PCR. Natúré, 339, 237-238 (1989)].
A sejtekből izolált vagy plazmid DNS-t úgy kezeljük, hogy a komplementer szálakat elválasztjuk egymástól. Ezeket a szálakat azután két, feleslegben levő DNS oligonukleotiddal illesztjük (mindegyik 20-25 bázispár hosszú), amelyeket kémiailag szintetizáltunk, és szerkezetük olyan, hogy egymástól X számú nukleotiddal elválasztott szekvenciákhoz illeszkedjenek (X értéke általában 50 és 2000 bázispár között van).
A két oligonukleotid szolgál specifikus indító molekulaként a DNS-polimeráz által katalizált in vitro DNS-szintézishez, amelynek során a DNS-polimeráz a két oligonukleotid közötti szekvenciának megfelelő DNS-szekvenciát lemásolja. Ha a két indítómolekula tartalmazza a megfelelő szekvenciákat, akkor lehetséges, hogy új restrikciós endonukleáz emésztési helyeket hozzunk létre az 5’ és a 3’ végeken.
A reakció többszörös ciklusban való lejátszatása után nagy mennyiségű, keresett hosszúságú DNS-ffagmenst kapunk, ezt gélelektroforézissel tisztítjuk, majd restrikciós enzimes emésztéssel és agaróz gélelektroforézissel jellemezzük. A sokszorozott, tisztított DNS-ffagmenst használjuk azután más fragmensekkel, azaz plazmidokkal való ligáláshoz.
A PCR-DNS-fragmensek tompa végű fragmensekként sokszorozódnak. Ahhoz, hogy fapados végeket kapjunk (a ligálási eljáráshoz), a fragmenst a kívánt restrikciós endonukleázokkal kell emészteni, majd ismét tisztítani kell.
A PCR-reakció 20-30 ciklusban játszódik le. Egy ciklus három lépésből áll, különböző reakcióidőkkel és különböző reakció-hőmérsékletekkel, amit a PCR-thermo-cycler szabályoz. Az első lépés a mátrix DNS denaturálása (1 perc 95 °C-on), a második lépés a mátrix DNS és az indítómolekulák „hibridizálása” (1 perc 55 °C), végül ezt követi a „polimerizálás” (2 perc 72 °C).
Egy vizsgálat végtérfogata 30 μΐ, amely az alábbi végkoncentrációkat tartalmazza: PCRpuffer (lx), nukleotidkeverék, az egyes nukleotidokból 200 pmol/l, a két indítómolekulából 200-200 ng, 0,5 egység Taq polimeráz kétszer desztillált vízben.
6. példa
A transzfektált sejtek tenyésztése a fehérjék szekretédása céljából
A befogadó sejteket (Cl27 vagy CHO sejtek, hozzáférhetők az ATCC-nél) normál növesztő táptalajba oltjuk (DMEM + 10% boíjúmagzat-szérum, glükóz és glutamin) Petri-csészékben (l-2xl05 6 sejt per Petricsésze, átmérője 10 cm) az 1. napon. A következő napon a táptalajt eltávolítjuk (4 órával azelőtt, hogy a DNS-csapadékot hozzáadtuk a sejtekhez), majd a sejteket kétszer mossuk PBS-sel. Ezután 8 ml, FCS nélküli DMEM táptalajt adunk hozzá, 4 órával azután hogy a DNS csapadékot (az alábbiakban leírtak szerint készítve) hozzáadtuk a sejtekhez. Ezután ismét 4 órával később a táptalajt eltávolítjuk, és 3 ml glicerinelegyet (50 ml 2 χ TBS puffer, 30 ml glicerin, 120 ml desztillált
HU 216 301 Β víz) adunk hozzá. A glicerinelegyet rögtön azután eltávolítjuk, hogy 3 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd a sejteket 1 xPBS-sel mostuk. A sejteket egy éjszakán át tenyésztjük 8 ml, 10% FCS-t tartalmazó DMEM-mel.
óra elteltével a sejteket kinyerjük a Petri-csészékből, tripszin-EDTA oldattal való kezeléssel (0,025% tripszin + 1 mmol/1 EDTA). Ezután, a tripszin-EDTA eltávolítása céljából a sejteket lxPBS oldattal mossuk, majd 10% FCS-t tartalmazó DMEM-ben szuszpendáljuk, és 24 mélyedéses lemezekre osztjuk szét (egy Petri-csészéből származó sejteket négy 24 mélyedéses lemezre osztunk szét).
Amikor a sejtek már jól növekszenek, akkor szelekciós táptalajt adunk hozzá (koncentrációk: 0,5-1 mg/ml neomicin, vagy 250 pg/ml xantin, 15 pg/ml hipoxantin vagy 25 pg/ml adenin, 10 pg/ml timidin, 2 pg/ml aminopterin, 25 pg/ml mikofenolsav az eco-gpt-hez például). A táptalajt minden héten cseréljük. Az első növekvő sejttelepeket 2 hét elteltével figyelhetjük meg.
pg plazmid DNS-hez és 20 pg hordozó DNS-hez (lazacsperma DNS, borjútimusz DNS) TE puffért (10 mmol/1 TRIS-HC1, 1 mmol/1 EDTA, pH=7,05) adunk 440 pl végtérfogatban, majd 60 pl 2 mol/1 koncentrációjú CaCl2-vel keverjük össze. Ezután ugyanilyen mennyiségű 2 χ TBS-t adunk hozzá (összetétele: 50 mmol/1 HEPES, 280 mmol/1 NaCl, 1,5 mmol/1 Na2HPO4 pH=7,05), és jól összekeverjük. A csapadékos oldatot 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd közvetlenül azokhoz a sejtekhez adjuk, amelyeket transzfektálni akarunk.
7. példa
A tisztított részecskék adjuvánsának készítése
A steril sóoldatban szuszpendált, kívánt koncentrációjú antigénhez 1:10000 térfogat Thimerosolt, 1/10 térIVCsCl gradiens Frakció sorszám fogat szűréssel sterilezett 0,2 mol/1 KA1(SO4)2x 10H2O-t adunk. A pH értékét 5,0-ra állítjuk steril 1 mol/1 NaOHval, majd a szuszpenziót szobahőmérsékleten kevertetjük 3 óra hosszat. Az alumínium által kicsapott antigént ki5 nyerjük (centrifugálás 10 percig 2000/perc fordulatszámmal), steril normál sóoldatban szuszpendáljuk, amely 1:10 000 Thimerosolt tartalmaz, majd steril körülmények között alikvot részekre osztjuk.
8. példa
Hepatitis B mag-antigén tisztítása A HB-mag-antigént szekretáló sejtek felülúszóját kinyerjük, majd ultraszűréssel töményítjük. A koncentrátumot centrifúgálással tisztítjuk (20 000/perc, 15 perc,
4 °C, Beckman SW28 rotor).
A részecskeképződést szacharóz sűrűséggradiensen végzett centrifúgálással vizsgáljuk (0-45% szacharóz) Beckman SW28 rotorban 24 óra hosszat 28 000/perc fordulatszámmal, 4 °C-on. A gradienst frakcionáljuk, majd az egyes frakciókat ELISA-val elemezzük.
9. példa
Az alábbi táblázatok a találmány szerinti immunogén részecskék ELISA vizsgálatának néhány eredmé25 nyét mutatják be, az alábbiak szerint:
AIV. táblázatban a találmány szerinti bármely HBV részecskekonstrukcióból készített tisztított HBs-antigén ELISA adatait látjuk, beleértve a pre-Sl epitópokat és az S régiót, az MA 18/7 anti-pre-Sl monokloná30 lis antitesttel és a G022 anti-HBs monoklonális antitesttel.
A IV. táblázat a CsCl sűrűségi gradiens utáni 21-es frakciókat mutatja.
. táblázat
ELISA mérés (E=492)
18/7 Monoklonális antitest
19
0,092
0,210
0,388
1,970
2,954
0,967
0,031
HU 216 301 Β
CsCl gradiens Frakció sorszám
IV-2. táblázat
ELISA mérés (E=492)
G022 Monoklonális antitest
19
0,136
0,426
0,822
1,970
2,954
0,967
0,076
Az V. táblázatban a találmány szerinti bármely HBmag-szekvencia konstrukcióból készített tisztított HBmag-antigén részecskék adatait láthatjuk a HB-mag elleni poliklonális antitestekkel és a HB-S-Ag elleni monoklonális antitesttel.
V-l. táblázat
Szacharóz gradiens Frakció sorszám
ELISA mérés (E=492) Poliklonális antitestek
9
0,25
0,922
1,423
1,5
1,5
1,28
0,466
V-2. táblázat
Szacharóz gradiens
ELISA mérés (E=492)
Frakció sorszám | G022 Monoklonális antitest |
6 | 0,020 |
7 | 0,024 |
8 | 0,018 |
9 | 0,011 |
10 | 0,015 |
11 | 0,020 |
12 | 0,022 |
10. példa
A Hepa-Care beadására végzett vizsgálatok csimpánzokban
A Hepa-Care olyan részecskéket jelent, amelyek a Hepatitis B felszíni antigéneket (SÍ és S) specifikus formulában hordozzák (az arány 50:50), amelyet a Hepati55 tis B vírus krónikus hordozóinak kezelésére használunk.
1. kísérlet
Egy Hepatitis B-t hordozó, 1-es csimpánzt intramuszkulárisan kezelünk Hepa-Care-rel a 0., 4. és 8.
héten 18 pg per injekciós dózissal.
HU 216 301 Β
A májenzimeket követjük (IV. ábra), és a Hepatitis B szintet is követjük (V. ábra).
2. kísérlet
Az 1-es csimpánznak az előzőekben leírt kezelése után egy emlékeztető kezelést adunk a 30., 34. és 38. héten. Az eredmények a VI. ábrán láthatók.
3. kísérlet
A 2-es csimpánzt is Hepa-Care-rel kezeljük, de az 1-es csimpánzzal ellentétben ennek intravénásán adjuk be a hatóanyagot. A dózis 2 mg. Az eredmények a VII. ábrán láthatók.
Egy 3-as, kontroll csimpánzban is ellenőrizzük a májenzimeket, és az eredmények a VIIL ábrán láthatók.
Kezelés: Hepa-Care-relintramuszkulárisana0., 1., 6. és 7. hónapban. Az antigén és antitest mérések eredményeit a IX. és X. ábrán mutatjuk be.
2- es beteg (nő, 48 éves, 12 éve beteg):
Hepatitis B paraméterek: HBsAg pozitív anti-HBs negatív
HBeAg negatív anti-HBe pozitív anti-HBc negatív
Kezelés: Hepa-Care-rel intramuszkulárisan a 0., 1. és 6. hónapban. Az antigén és antitest mérések eredményeit a XI. és XII. ábrán mutatjuk be.
3- as beteg (nő, 41 éves, 12 éve beteg):
Hepatitis B paraméterek: HBsAg pozitív
11. példa | 15 | anti-HBs negatív | |||
Kezelés Hepa-Care-rel | HBeAg negatív | ||||
(A meghatározást lásd a | 10. példában) | anti-HBe pozitív | |||
1-es beteg (férfi, 65 éves, 2 éve beteg): | Kezelés: Hepa-Care-rel | intramuszkulárisan a 0., | |||
Hepatitis B paraméterek | : HBsAg | pozitív | 1., 2. és 5. hónapban. A HBs antigén és az anti-HBs | ||
anti-HBs | negatív | 20 | antitestek mért értékeit a XIII. és XIV. ábrákon mutat- | ||
HBeAg | negatív | juk be. | |||
anti-HBe | pozitív | Az alábbiakban a szekvencialistákat mutatjuk be. | |||
anti-HBc | negatív | ||||
SZEKVENCIALISTA | 25 | Topológia: | lineáris | ||
Szekvencia száma (SEQID NO.): 1 | Molekula típusa: | genomi DNS | |||
Szekvencia típusa: | nukleotid | Eredeti forrás: | HBV mag | ||
Szekvencia hossza: | 558 bp | Közvetlen kísérleti forrás: | PCR-amplifikálás | ||
Szálszám: | egyszeres | 30 |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA. | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG · | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
AGA | TCT | CAA | TCT | CGG | GAA | TCT | CAA | TGT | TAG |
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 2
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 504 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
ATG | GAC | ATT | GAC . | CCT | TAT ' | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT: | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT-. | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA- | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC AGA CGT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.) Szekvencia típusa:
Szekvencia hossza:
Szálszám:
nukleotid 504 bp egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ÁCT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC AGA CGT
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 4 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 534 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAÁ | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC AGA CGT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 5 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 534 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC . | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT.,. | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC AGA CGT
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 6 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 87 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG ACT CTA GCT ACC TGG
GTG GGC
AAT AAT TTG GAA GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 7 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 81 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTC TTT CCT TCC GCT AGG
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 8 | Topológia: | lineáris | ||||
Szekvencia típusa: | nukleotid | 20 | Molekula típusa: | genomi DNS | ||
Szekvencia hossza: | 114bp | Eredeti forrás: | HBV mag | |||
Szálszám: | egyszeres | Közvetlen kísérleti forrás: | kémiai szintézis | |||
TCC AAC | CTG TGC CTT GGG | TGG | CTT | TGG GGC ATG GAC | ATT | GAC CCT |
TAT AAA | GAA TTT GGA GCT | ACT | GTG | GAG TTA CTC TCG | TTT | TTG CCT |
TCT GAC | TTC TTT CCT TCC GTC AGG | |||||
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 9 | 30 | Topológia: | lineáris | |||
Szekvencia típusa: | nukleotid | Molekula típusa: | genomi DNS | |||
Szekvencia hossza: | 90 bp | Eredeti forrás: | HBV mag | |||
Szálszám: | egyszeres | Közvetlen kísérleti forrás: | kémiai szintézis | |||
GAT CTC | CTA GAC ACC GCC | TCA | GCT | CTG TAT CGA GAA | GCC | TTA GAG |
TCT CCT GAG CTA TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC AGG
CAA GGT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.) Szekvencia típusa:
Szekvencia hossza:
Szálszám:
nukleotid
261 egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTC | AGG | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CTA | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GGT | ATC | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TGG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGC | AAT. | AAT | TTG | GAA |
GAT | CCA | GCA | TCT | AGG | GAC | CTT | GTA | GTA | AAT |
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 11 | Topológia: | lineáris |
Szekvencia típusa: nukleotid | Molekula típusa: | genomi DNS |
Szekvencia hossza: 291 | Eredeti fonás: | HBV mag |
Szálszám: egyszeres | Közvetlen kísérleti fonás: | kémiai szintézis |
TCC AAC CTG TGC | CTT GGG TGG CTT TGG | GGC |
ATG GAC ATT GAC CCT | TAT AAA GAA TTT GGA | GCT |
ACT GTG GAG TTA CTC | TCG TTT TTG CCT TCT | GAC |
TTC TTT CCT TCC GTC | AGG GAT CTC CTA GAC | ACC |
GCC TCA GCT CTG TAT | CGA GAA GCC TTA GAG | TCT |
CCT GAG CTA TGC TCA | CCT CAC CAT ACT GCA | GTC |
AGG CAA GGT ATC CTC | TGC TGG GGG GAA TGG | ATG |
ACT CTA GCT ACC TGG | GTG GGC AAT AAT TTG | GAA |
GAT CCA GCA TCT AGG | GAC CTT GTA GTA AAT | |
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 12 | 25 Topológia: | lineáris |
Szekvencia típusa: nukleotid | Molekula típusa: | genomi DNS |
Szekvencia hossza: 123 | Eredeti fonás: | HBV mag |
Szálszám: egyszeres | Közvetlen kísérleti fonás: | kémiai szintézis |
ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG | CAA GAT CCA GCA TCC | AGA GAT CTA |
GTA GTC AAT TAT GTT AAT ACT | AAC ATG GGT TTA AAG | ATC AGG CAA |
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT | ||
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 13 | Topológia: | lineáris |
Szekvencia típusa: nukleotid | Molekula típusa: | genomi DNS |
Szekvencia hossza: 13 8 bp | Eredeti fonás: | HBV mag |
Szálszám: egyszeres | Közvetlen kísérleti fonás: | kémiai szintézis |
GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT | GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT |
TTA | AAG | ATC | AGG | CAA | CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT |
TTT | GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT | TTC | GGA | GTG |
TGG
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 14 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 294 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV S2 ayw/adw HBVDNS
ATS | CAG | TGG | AAT |
CAA | GAT | CCC | AGA |
GGT | GGC | TCC | AGT |
ACT | ACT | GCC | TCT |
ATA | GAG | AAC | ATC |
TCC | AGA | ACC | TTC |
GTG | AGA | GGC | CTG |
TCA | GGA | ACA | GTA |
CCC | TTA | TCG | TCA |
ACA | TCA | GGA | TTC |
CAC | CAA | ACT | CTG |
TAT | TTC | CCT | GCT |
AAC | CCT | GTT | CTG |
ATC | TTC | TCG | AGG |
CTA | GGA | CCC | CTT |
HU 216 301 Β
CTC | GTG | TTA | CAG | GCG | GGG | TTT | TTC | TTG | TTG | ACA | AGA |
ATC | CTC | ACA | ATA | CCG | CAG | AGT | CTA | GAC | TCG | TGG | TGG |
ACT | TCT | CTC | AAT | TTT | CTA | GGG | GGA | ACT | ACC | GTG | TGT |
CTT | GGC | CAA | AAT | TCG | CAG | TCC | TCA | ACC | TCC | AAT | CAC |
TCA | CCA | ACC | TCT | TGT | CCT | CCA | ACT | TGT | CCT | GGT | TAT |
CGC | TGG | ATG | TGT | CTG | CGG | CGT | TTT | ATC | ATC | TTC | CTC |
TTC | ATC | CTG | CTG | CTA | TGC | CTC | ATC | TTC | TTG | TTG | GTT |
CTT | CTG | GAC | TAT | CAA | GGT | ATG | TTG | CCC | GTT | TGT | CCT |
CTA | ATT | CCA | GGA | TCC | TCA | ACA | ACC | AGC | ACG | GGA | CCA |
TGC | CGG | ACC | TGC | ATG | ACT | ACT | GCT | CAA | GGA | ACC | TCT |
ATG | TAT | CCC | TCC | TGT | TGC | TGT | ACC | AAA | CCT | TCG | GAC |
GGA | AAT | TGC | ACC | TGT | ATT | CCC | ATC | CCA | TCA | TCC | TGG |
GCT | TTC | GGA | AAA | TTC | CTA | TGG | GAG | TGG | GCC | TCA | GCC |
CGT | TTC | TCC | TGG | CTC | AGT | TTA | CTA | GTG | CCA | TTT | GTT |
CAG | TGG | TTC | GTA | GGG | CTT | TCC | CCC | ACT | GTT | TGG | CTT |
TCA | GTT | ATA | TGG | ATG | ATG | TGG | TAT | TGG | GGG | CCA | AGT |
CTG | TAC | AGC | ATC | TTG | AGT | CCC | TTT | TTA | CCG | CTG | TTA |
CCA | ATT | TTC | TTT | TGT | CTT | TGG | GTA | TAC | ATT |
Szekvencia száma (SEQID NO.): 15
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 99 bp
Szálszám: egyszeres
30 Topológia: | lineáris |
Molekula típusa: | genomi DNS |
Eredeti forrás: | HBV mag |
Közvetlen kísérleti forrás: | kémiai szintézis |
TAT | GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA | CTA | TTG | TGG |
TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT | GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA |
TAT | TTG | GTC |
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 16
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 390 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA' | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC |
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 17
Szekvencia típusa: nukleotid a megfelelő proteinnel
Szekvencia hossza: 60 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ ay kémiai szintézis
AAT CCT CTG GGA TTC TTT CCC GAT CAC CAG TTG GAT CCA GCC TTC AGA GCA AAC ACC GCA
Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro Alá Phe Arg Alá Asn Thr Alá
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 18
Szekvencia típusa: nukleotid a megfelelő proteinnel
Szekvencia hossza: 63 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ ay kémiai szintézis
CCT GCC TCC ACC AAT CGC CAG TCA GGA AGG CAG CCT ACC CCG CTG TCT CCA CCT TTG AGA AAC
Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu Arg Asn
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 19
Szekvencia típusa: nukleotid a megfelelő proteinnel
Szekvencia hossza: 63 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ ay kémiai szintézis
GAT | CCA | GCC | TTC AGA GCA | AAC | ACC | GCA | AAT | CCA | GAT | TGG | GAC | TTC |
AAT | CCC | AAC | AAG GAC ACC | |||||||||
Asp | Pro | Alá | Phe Arg Alá | Asn | Thr | Alá | Asn | Pro | Asp | Trp | Asp | Phe |
Asn | Pro | Asn | Lys Asp Thr |
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 20
Szekvencia típusa:
Szekvencia hossza: Szálszám:
nukleotid a megfelelő proteinnel 108 bp egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ ay kémiai szintézis
CCG CAC GGA GGC CTT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT
CAG | GGC | ATA | CTA | CAA | ACT | TTG | CCA | GCA | AAT | CCG | CCT |
CCT | GCC | TCC | ACC | AAT | CGC | CAG | TCA | GGA | AGG | CAG | CCT |
Pro | His | Gly | Gly | Leu | Leu | Gly | Trp | Ser | Pro | Gin | Alá |
Gin | Gly | He | Leu | Glu | Thr | Leu | Pro | Alá | Asn | Pro | Pro |
Pro | Alá | Ser | Thr | Asn | Arg | Gin | Ser | Gly | Arg | Gin | Pro |
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 21 | Topológia: Molekula típusa: Eredeti forrás: Közvetlen kísérleti forrás: | lineáris genomi DNS HBV SÍ ad kémiai szintézis | |
Szekvencia típusa: Szekvencia hossza: Szálszám: | nukleotid 63 bp egyszeres | ||
CCT GCC TCC | ACC AAT CGG CAG | TCA GGA AGG CAG CCT ACT | CCC ATC |
TCT CCA CCT | CTA AGA GAC - X |
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 22 | Topológia: | lineáris |
Szekvencia típusa: nukleotid a meg- | Molekula típusa: | genomi DNS |
felelő proteinnel | Eredeti forrás: | HBV SÍ ad |
Szekvencia hossza: 108 bp Szálszám: egyszeres | Közvetlen kísérleti forrás: 15 | kémiai szintézis |
CCA | CAC | GGC | GGT | ATT | TTG | GGG | TGG | AGC | CCT | CAG | GCT |
CAG | GGC | ATA | TTG | ACC | ACA | GTG | TCA | ACA | ATT | CCT | CCT |
CCT | GCC | TCC | ACC | AAT | CGG | CAG | TCA | GGA | AGG | CAG | CCT |
Pro | His | Gly | Gly | He | Leu | Gly | Trp | Ser | Pro | Gin | Alá |
Gin | Gly | He | Leu | Thr | Thr | Val | Ser | Thr | He | Pro | Pro |
Pro | Alá | Ser | Thr | Asn | Arg | Gin | Ser | Gly | Arg | Gin · | Pro |
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): | 23 | Topológia: | lineáris |
Szekvencia típusa: | nukleotid | Molekula típusa: | genomi DNS |
Szekvencia hossza: | 60 bp | Eredeti forrás: | HBV S2 ay |
Szálszám: | egyszeres | Közvetlen kísérleti forrás: | kémiai szintézis |
CAG TGG AAT TCC AGA ACC TTC | CAC CAA ACT CTG CAA GAT | CCC AGA |
GTG AGA GGC CTG TAT - X
Szekvencia száma (SEQID NO.): 24 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 60 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia :
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV S2 ay kémiai szintézis
GAT CCC AGA GTG AGA GGC
CTG TAT
TTC CCT GCT GGT GGC
TCC AGT
TCA GGA ACA GTA AAC -X
Szekvencia száma (SEQ ID NO.) Szekvencia típusa: Szekvencia hossza: Szálszám: | : 25 nukleotid 558 bp egyszeres | 50 | Topológia: Molekula típusa: Eredeti forrás: Közvetlen kísérleti forrás: | lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás | ||||||
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT. | TCC | GTA | CGA | GAT. | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
HU 216 301 Β
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ;ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
AGA | TCT | CAA | TCT | CGG | GAA | TCT | CAA | TGT | TAG |
Szekvencia száma (SEQID NO.): 26 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 678 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV S adw/ayw HBV DNS
ATA | GAG | AAC | ATC | ACA | TCA | GGA | TTC | CTA | GGA | CCC | CTT | CTC |
GTG | tta | CAG | GCG | GGG | JTTT ' | TTC | TTG | TTG | ACA | AGA | ATC | CTC |
ACA | ATA | CCG | CAG | AGT | CTA | GAC | TCG | TGG | TGG | ACT | TCT | CTC |
AAT | TTT | CTA | GGG | GGA | ACT | ACC | GTG | TGT | CTT | GGC | CAA | AAT |
TCG | CAG | TCC | TCA | ACC | TCC | AAT | CAC | TCA | CCA | ACC | TCT | TGT |
CCT | CCA | ACT | TGT | CCT | GGT | TAT | CGC | TGG | ATG | TGT | CTG | CGG |
CGT | TTT | ATC | ATC | TTC | CTC | TTC | ATC | CTG | CTG | CTA | TGC | CTC |
ATC | TTC | TTG | TTG | GTT | CTT | CTG | GAC | TAT | CAA | GGT | ATG | TTG |
CCC | GTT | TGT | CCT | CTA | ATT | CCA | GGA | TCC | TCA | ACA | ACC | AGC |
ACG | GGA | CCA | TGC | CGG | ACC | TGC | ATG | ACT | ACT | GCT | CAA | GGA |
ACC | TCT | ATG | TAT | CCC | TCC | TGT | TGC | TGT | ACC | AAA | CCT | TCG |
GAC | GGA | AAT | TGC | ACC | TGT | ATT | CCC | ATC | CCA | TCA | TCC | TGG |
GCT | TTC· | GGA | AAA | TTC | CTA | TGG | GAG | TGG | GCC | TCA | GCC | CGT |
TTC | TCC | TGG | CTC | AGT | TTA | CTA | GTG | CCA | TTT | GTT | CAG | TGG |
TTC | GTA | GGG | CTT | TCC | CCC | ACT | GTT | TGG | CTT | TCA | GTT | ATA |
TGG | ATG | ATG | TGG | TAT | TGG | GGG | CCA | AGT | CTG | TAC | AGC | ATC |
TTG | AGT | CCC | TTT | TTA | CCG | CTG | TTA | CCA | ATT | TTC | TTT | TGT |
CTT | TGG | GTA | TAC | ATT |
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 27 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 585 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV S adw/ayw HBV DNS
CTA | GAC | TCG | TGG | TGG | ACT | TCT | CTC | AAT | TTT | CTA | GGG |
GGA | TCT | CCC | GTG | TGT | CTT | GGC | CAA | AAT | TCG | CAG | TCC |
CCA | ACC | TCC | AAT | CAC | TCA- | -CCA | ACC | TCC | TGT | CCT | CCA |
ATT | TGT | CCT | GGT | TAT | CGC | TGG | ATG | TGT- | CTG | CGG | CGT |
TTT | ATC | ATA | TTC | CTC | TTC | ATC | CTG | CTG | CTA | TGC | CTC |
ATC | TTC | TTA | TTG | GTT | CTT | CTG | GAT | TAT | CAA | GGT | ATG |
TTG | CCC | GTT | TGT | CCT | CTA | ATT | CCA | GGA | TCA | ACA | ACA |
ACC | AGT | ACG | GGA | CCA | TGC | AAA | ACC | TGC | ACG | ACT | CCT |
GCT | CAA | GGC | AAC | TCT | ATG | TTT | CCC | TCA | TGT | TGC | TGT |
ACA | AAA | CCT | ACG | GAT | GGA | AAT | TGC | ACC | TGT | ATT | CCC |
ATC | CCA | TCG | TCC | TGG . | GCT | TTC | GCA | AAA | TAC | CTA | TGG |
GAG | TGG | GCC | TCA | GTC | CGT | TTC | TCT | TGG | CTC | AGT | TTA |
CTA | GTG | CCA | TTT | GTT | CAG | TGG | TTC | GTA | GGG | CTT | TCC |
CCC | ACT | GTT | TGG | CTT | TCA | GCT | ATA | TGG | ATG | ATG | TGG |
TAT | TGG | GGG | CCA | AGT | CTG | TAC | AGC | ATC | GTG | AGT | CCC |
TTT | ATA | CCG | CTG | TTA | CCA | ATT | TTC | TTT | TGT | CTC | TGG |
GTA TAC ATT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 28 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 106 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ kémiai szintézis
5'—GAT—CTT—TAA—CAT—GGA—GAA—CAA—TCC—TCT—G GG—ATT-CTT—TCC—CGA—TCA—CCA—GTT—GGA—TCC—A GC—CTT—CAG—AGC—AAA—CAC—CGC—AAA—TCC—AGA—T
TG—GGA—CTT-CAA—TCC—CAG—(T)-“'
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 29 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 115 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBVS kémiai szintézis
5'—AAT—TCT—AGA—CTC—GAG-TCT-GAA—CAT—AGA—G
AA—CAT—CAC—ATC-AGG—ATT—CCT—AGG—ACC—CCT—T
CT—CGT—GTT—ACA—GGC—GGG-GTT—TTT-CTT—GTT—G
AC-AAG-AAT-CCT-CAC-AAT-ACC-GCA-GAG-CC)-3
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQID NO.): 30 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 108 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis ' -GAT-CTT-TTA—AAG—GGA—TCC-TCT—GCT-GGG—G
GG-AAT-GGA-TGA-CTC-TAG- CTA-CCT-GGG-TGG-G
CA—ATA—ATT—TGG—AAB—ATC—CAG—CAT—CTA-GGG—A
CC-TTG-TAG-TAA-ATC-TAG-AC- (A) -3'
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 31 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 106 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
5' —GAT—CTC-CGG—GAA—7TC-CTG-GGG—CAT-G3A—C
AT-TGA-CCC-TTA—TAA—AGA-ATT-TGG—AGC-TAC-T
57—GGA—G7T—ACT—CTC—5TT—T77—SCC—77C— i GA—C
TT-CTT-TCC-7TC-CGT-CA5- (.G) -3 '
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 32 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 89 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
5'—GAT—CTC-CTA—GAC—ACC-GCC-TCA—GCT—CTG—T
AT-CGA—GAA—GCC-TTA-GAG—TCT-CCT-GAG-CAT-T
GC—TCA—CCT—CAC—CAT—ACT—GCA—CTC—AGG—CAA—3
- (G)- 3'
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 33 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 25 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
5'-TTG-GAT-CCT-CCA-ACC-TGT-GCC-TTG-(G)-3
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 34
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 25 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
5'-CCT-CTA-GAA-CCA-AAT-ATT-CAA-GTA-(C)-3
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 35
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 588 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | ' GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
AGA | TCT | CAA | TCT | CGG | GAA | TCT | CAA | TGT | TAG |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (16)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek hatóanyagként a következő komponensek 40 kombinációját tartalmazzák:(a) legalább egy, valamely Hepatitis vírus egy vagy több antigén T-sejt-aktiváló epitópját tartalmazó polipeptid-szekvencia, valamint (b) egy olyan hordozó, amely képes az (a) epitópszekvenciá(ka)t bemutatni, és az (a) polipeptid-szekvencia(ák) kovalens vagy hidrofób kötéssel kapcsolódiának) a (b) hordozóhoz, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot farmakológiailag elfogadható hígító-, hordozó- és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverve kró- 50 nikus vírusos hepatitis kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményekké alakítjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-szekvenciaként Hepatitis B vírus (HBV) eredetű szekvenciá(ka)t alkalmazunk.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-szekvenciaként HBV preSl, pre-S2 és/vagy S és/vagy HBV mag-antigén aminosav-szekvenciájának megfelelő szekvenciá(ka)t alkalmazunk.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (i) tetszőleges deléciókkal, (ii) egy vagy több aminosav helyettesítésével, (iii) egy aminosav-szekvenciának az N-terminálison, a C-terminálison vagy inszercióként történő hozzáadásával módosított polipeptid-szekvenciá(ka)t alkalmazunk, és a módosítás során egy, legalább hat45 egymás utáni aminosavat tartalmazó epitópot megtartunk.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mirisztilezett (a) polipeptidszekvenciá(ka)t alkalmazunk.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (b) hordozóként poliszacharidot, hidrofób polimert vagy részecske formájú szervetlen molekulát alkalmazunk.
- 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 55 azzal jellemezve, hogy (b) hordozóként egy második polipeptid-szekvenciát alkalmazunk.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szekréció során legalább 10 nm átmérőjű részecskéket képező (b) polipeptid-szekvenciát alkalma60 zunk.HU 216 301 Β
- 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő polipeptidek teljes aminosavszekvenciájával, vagy annak jelentős részével rendelkező (b) polipeptid-szekvenciát alkalmazunk: HBV Speptid; HBV mag-, HAV mag- vagy HÍV magantigén; poliovírus, HAV vagy HÍV felületi antigén.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (i) tetszőleges deléciókkal, (ii) egy vagy több aminosav helyettesítésével, (iii) egy aminosav-szekvenciának az N-terminálison, a C-terminálison vagy inszercióként történő hozzáadásával módosított (b) polipeptid-szekvenciát alkalmazunk, azzal a feltétellel, hogy a módosítás során a részecskeképző képességet megtartjuk.
- 11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mirisztilezett (b) polipeptidszekvenciát alkalmazunk.
- 12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy diszulfid-hidakkal kapcsolt (a) és (b) polipeptid-szekvenciákat alkalmazunk.
- 13. A 7-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy „hidrofób horgonyzás”-sal (mirisztilsavon keresztül) kapcsolt (a) és (b) polipeptidszekvenciákat alkalmazunk.5
- 14. A 7-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy peptidkötéssel kapcsolt (a) és (b) polipeptid-szekvenciákat alkalmazunk, ahol az (a) polipeptid-szekvencia és a (b) polipeptid-szekvencia közé adott esetben egy térköz-szekvenciát inszertálunk,10 amelyet peptidkötésekkel kapcsolunk az (a) és (b) polipeptid-szekvenciákhoz.
- 15. A 7-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (a) és (b) polipeptid-szekvenciaként az említett kombinációt kódoló rekombi15 náns DNS-molekula által expresszált polipeptid-szekvenciát alkalmazunk.
- 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy intravénás vagy intramuszkuláris injektálással történő adagolásra alkalmas gyógyszerkészítményeket állítunk elő.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP90124775A EP0491077A1 (en) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9301794D0 HU9301794D0 (en) | 1993-10-28 |
HUT66437A HUT66437A (en) | 1994-11-28 |
HU216301B true HU216301B (hu) | 1999-06-28 |
Family
ID=8204863
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9301794A HU216301B (hu) | 1990-12-19 | 1991-12-19 | Eljárás krónikus vírusos hepatitisz kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6020167A (hu) |
EP (2) | EP0491077A1 (hu) |
JP (2) | JP3857305B2 (hu) |
KR (1) | KR0156587B1 (hu) |
AT (1) | ATE170220T1 (hu) |
AU (1) | AU657935B2 (hu) |
CA (1) | CA2098021C (hu) |
CZ (1) | CZ290233B6 (hu) |
DE (1) | DE69130071T3 (hu) |
DK (1) | DK0563093T4 (hu) |
ES (1) | ES2121000T5 (hu) |
HK (1) | HK1002901A1 (hu) |
HU (1) | HU216301B (hu) |
SK (1) | SK280551B6 (hu) |
WO (1) | WO1992011368A1 (hu) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988010300A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
DE4107612A1 (de) * | 1991-03-09 | 1992-09-10 | Behringwerke Ag | Rekombinante proteine mit der immunreaktivitaet des hepatitis b virus e antigens (hbeag), verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in immunoassays und impfstoffen |
US6689363B1 (en) | 1992-01-29 | 2004-02-10 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions |
US7611713B2 (en) | 1993-03-05 | 2009-11-03 | Pharmexa Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions |
US6509149B2 (en) * | 1995-06-06 | 2003-01-21 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
BR9709993A (pt) * | 1996-06-25 | 1999-08-10 | Stichting Inst Dierhouderij | Vacina preparação de vacina composição processo para produção de uma preparação imugênica e preparação imugênica |
US7091324B2 (en) | 1998-11-05 | 2006-08-15 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational epitopes |
CN1268345C (zh) * | 2000-03-29 | 2006-08-09 | 乔治敦大学 | 治疗丁型肝炎病毒感染的核苷化合物 |
IL142802A (en) * | 2000-04-27 | 2015-01-29 | Enzo Therapeutics Inc | Use of one or more HBV antigens for the preparation of oral pharmaceutical preparations for the treatment of a person with active HBV infection or hepatocellular carcinoma |
US6787526B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-09-07 | Idenix Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides |
US7022830B2 (en) * | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
KR20030074787A (ko) * | 2001-02-05 | 2003-09-19 | 스트레스젠 바이오테크놀러지스 코포레이션 | B형 간염 바이러스 치료 |
US7351413B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-04-01 | Lorantis, Limited | Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis |
US8420353B2 (en) * | 2002-03-22 | 2013-04-16 | Aprogen, Inc. | Humanized antibody and process for preparing same |
DE10339927A1 (de) * | 2003-08-29 | 2005-03-24 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen |
GB0326416D0 (en) | 2003-11-12 | 2003-12-17 | Karolinska Innovations Ab | Methods and means relating to hepatitis B infection |
WO2005050214A2 (en) * | 2003-11-12 | 2005-06-02 | Hbv Theranostica Ab | Methods and means relating to hepatitis b infection |
US9603921B2 (en) * | 2004-10-27 | 2017-03-28 | Janssen Vaccines Ag | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus |
US8071561B2 (en) * | 2007-08-16 | 2011-12-06 | Chrontech Pharma Ab | Immunogen platform |
WO2009092396A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Universitätsklinikum Heidelberg | Hydrophobic modified pres-derived peptides of hepatitis b virus (hbv) and their use as hbv and hdv entry inhibitors |
CN101485672B (zh) * | 2008-12-05 | 2010-08-25 | 广东粤龙药业有限公司 | 异丙景糖酐在制备治疗人HBeAg阳性慢性乙型肝炎药物中的应用 |
US10076570B2 (en) | 2009-08-07 | 2018-09-18 | Transgene S.A. | Composition for treating HBV infection |
EP2461826A2 (en) | 2009-08-07 | 2012-06-13 | Transgene SA | Composition for treating hbv infection |
Family Cites Families (85)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US34705A (en) * | 1862-03-18 | Improvement in tompions for fire-arms | ||
US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
IN151589B (hu) * | 1978-12-22 | 1983-05-28 | Biogen Nv | |
EP0182442B2 (en) * | 1978-12-22 | 1996-04-03 | Biogen, Inc. | Recombinant DNA molecules and their method of production |
US4935235A (en) * | 1979-05-24 | 1990-06-19 | The Regents Of The University Of California | Non-passageable viruses |
IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
US5196194A (en) * | 1979-05-24 | 1993-03-23 | The Regents Of The University Of California | Vaccines containing Hepatitis B S-protein |
USRE34705E (en) | 1979-08-30 | 1994-08-23 | Institut Pasteur | Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby |
US4415491A (en) * | 1980-01-14 | 1983-11-15 | The Regents Of The University Of California | Synthetic vaccine peptide epitomes of hepatitis B surface antigen |
EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
FI83662C (fi) * | 1980-07-17 | 1991-08-12 | Scripps Clinic Res | Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning. |
GR76274B (hu) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
US4741901A (en) * | 1981-12-03 | 1988-05-03 | Genentech, Inc. | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
JPS58194897A (ja) * | 1982-05-07 | 1983-11-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規dna,その製造方法およびそれで形質転換させた宿主 |
JPS5936698A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Science & Tech Agency | B型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えdnaおよび形質転換動物細胞 |
US4977092A (en) * | 1985-06-26 | 1990-12-11 | Amgen | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
US5198348A (en) * | 1982-08-30 | 1993-03-30 | Amgen Inc. | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
JPS5974985A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-04-27 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規dna |
CA1341116C (en) * | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
US4696898A (en) * | 1984-01-16 | 1987-09-29 | Integrated Genetics, Inc. | Vector encoding hepatitis B surface antigen |
FR2559159B1 (fr) * | 1984-02-02 | 1986-09-12 | Inst Nat Sante Rech Med | Vecteurs viraux de clonage et d'expression d'une proteine dans une cellule eucaryote, comportant au moins une partie du genome d'un retro-virus; cellules eucaryotes transfectees; procede utilisant de telles cellules et proteines obtenues |
FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
US5158769A (en) * | 1984-03-07 | 1992-10-27 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US5324513A (en) * | 1984-03-07 | 1994-06-28 | Institut Pasteur | Composition useful for the fabrication of vaccines |
US5204096A (en) * | 1984-03-07 | 1993-04-20 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US4861588A (en) * | 1985-02-05 | 1989-08-29 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US4847080A (en) * | 1984-03-07 | 1989-07-11 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers |
US4777240A (en) * | 1984-03-08 | 1988-10-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
US4942125A (en) * | 1984-09-07 | 1990-07-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
US4599230A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
US4599231A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
AU579148B2 (en) * | 1984-03-09 | 1988-11-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants |
US5098704A (en) * | 1984-06-18 | 1992-03-24 | Chiron Corporation | Hepatitis surface antigen particle vaccine |
EP0171908A3 (en) * | 1984-07-11 | 1987-07-15 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Hepatitis b virus surface antigen and production thereof |
GB8421282D0 (en) * | 1984-08-22 | 1984-09-26 | Connaught Lab | Multispecific antigenic proteins |
US4722940A (en) * | 1984-08-23 | 1988-02-02 | Georgia Tech Research Corporation | Aminoalkyl phenyl selenides for the treatment of hypertension and nervous system dysfunctions |
US4722840A (en) * | 1984-09-12 | 1988-02-02 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
EP0175261B1 (en) * | 1984-09-12 | 1991-12-11 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
US4639371A (en) * | 1984-10-02 | 1987-01-27 | New York Blood Center, Inc. | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom |
EP0180012A1 (de) * | 1984-10-27 | 1986-05-07 | Wolfram H. Prof. Dr. Gerlich | Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus |
US4683136A (en) * | 1985-03-06 | 1987-07-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Proteinaceous antigens with conformation-independent and conformation-dependent determinants |
CA1324094C (en) * | 1985-04-03 | 1993-11-09 | Dino Dina | Hepatitis a virus vaccines |
FI861417A0 (fi) * | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
US5837249A (en) * | 1985-04-19 | 1998-11-17 | The Wistar Institute | Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus |
US4639271A (en) * | 1985-04-24 | 1987-01-27 | Moore Business Forms, Inc. | Chromogenic mixtures |
FR2581394B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1988-08-05 | Grp Genie Genetique | Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes |
US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
JPH084507B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1996-01-24 | 武田薬品工業株式会社 | 新規dnaおよびポリペプチド |
US4959323A (en) * | 1985-11-04 | 1990-09-25 | Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Production and use of pre S polypeptides of hepatitis B virus |
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
US4742158A (en) * | 1986-04-25 | 1988-05-03 | Merck & Co., Inc. | Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding |
IE59389B1 (en) * | 1986-05-23 | 1994-12-23 | Merck & Co Inc | Method for producing hepatitis b virus core antigen (HBcAg) in yeast |
CA1310602C (en) * | 1986-06-03 | 1992-11-24 | Hajime Horii | Yeast promoter and process for preparing heterologous protein |
JPH01500515A (ja) * | 1986-06-20 | 1989-02-23 | スクリップス クリニック アンド リサーチ ファウンデーション | B型肝炎ウィルス表面抗原のプレs領域のt及びb細胞エピトープ |
US5068185A (en) * | 1986-07-10 | 1991-11-26 | Merck & Co., Inc. | Trains of yeast for the expression of heterologous genes |
IL79740A0 (en) * | 1986-08-17 | 1986-11-30 | Yeda Res & Dev | Hepatitis vaccine |
US4882145A (en) * | 1986-12-09 | 1989-11-21 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
US5143726A (en) * | 1986-12-09 | 1992-09-01 | The Scripps Research Institute | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
US4818527A (en) * | 1986-12-09 | 1989-04-04 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
ZA88488B (en) * | 1987-01-30 | 1988-10-26 | Smith Kline Rit | Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them |
EP1088830A3 (en) * | 1987-06-22 | 2004-04-07 | Medeva Holdings B.V. | Hepatitis b surface antigen particles |
WO1988010300A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
US4883865A (en) * | 1987-09-30 | 1989-11-28 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+s antigen |
US4963483A (en) * | 1987-10-13 | 1990-10-16 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
US5011915A (en) * | 1987-10-26 | 1991-04-30 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
US5039522A (en) * | 1988-01-29 | 1991-08-13 | New York Blood Center, Inc. | Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen |
NZ229260A (en) * | 1988-06-03 | 1994-02-25 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and |
US5242812A (en) * | 1989-02-07 | 1993-09-07 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification of hepatitis B vaccine |
US5462863A (en) * | 1989-02-09 | 1995-10-31 | Development Center For Biotechnology | Isolation of Hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
GB8903313D0 (en) * | 1989-02-14 | 1989-04-05 | Wellcome Found | Conjugates |
DK0414374T3 (da) * | 1989-07-25 | 1998-03-09 | Smithkline Beecham Biolog | Hidtil ukendte antigener og fremgangsmåder til fremstilling deraf |
EP0421626A1 (en) * | 1989-09-19 | 1991-04-10 | Merck & Co. Inc. | Vaccine for aids and hepatitis B |
EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
US5102989A (en) * | 1991-03-15 | 1992-04-07 | Merck & Co., Inc. | Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells |
IL101653A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles |
CA2067003A1 (en) * | 1991-04-29 | 1992-10-30 | Peter J. Kniskern | Hbsag escape mutant vaccine |
US5840303A (en) * | 1991-08-26 | 1998-11-24 | The Scripps Research Foundation | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
JP2501186Y2 (ja) * | 1992-03-31 | 1996-06-12 | 株式会社栗本鐵工所 | ハンマ―ミル |
CN1063343C (zh) * | 1993-04-27 | 2001-03-21 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
CN1094311A (zh) * | 1993-04-27 | 1994-11-02 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
CN1059927C (zh) * | 1994-03-10 | 2000-12-27 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 羧端带有前表面抗原1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因及其编码蛋白 |
US5792163A (en) * | 1996-01-03 | 1998-08-11 | Hitzig; Gary | Linear punch |
-
1990
- 1990-12-19 EP EP90124775A patent/EP0491077A1/en not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-12-19 DK DK92900527T patent/DK0563093T4/da active
- 1991-12-19 ES ES92900527T patent/ES2121000T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 DE DE69130071T patent/DE69130071T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 CZ CZ19931186A patent/CZ290233B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 WO PCT/EP1991/002460 patent/WO1992011368A1/en active IP Right Grant
- 1991-12-19 SK SK636-93A patent/SK280551B6/sk unknown
- 1991-12-19 AU AU90817/91A patent/AU657935B2/en not_active Ceased
- 1991-12-19 JP JP50100592A patent/JP3857305B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 HU HU9301794A patent/HU216301B/hu unknown
- 1991-12-19 CA CA002098021A patent/CA2098021C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 US US08/075,520 patent/US6020167A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 AT AT92900527T patent/ATE170220T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 EP EP92900527A patent/EP0563093B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-06-18 KR KR1019930701862A patent/KR0156587B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-10 HK HK98101997A patent/HK1002901A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-06-07 JP JP2000175584A patent/JP2001019643A/ja active Pending
-
2003
- 2003-03-21 US US10/394,896 patent/US20030235591A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SK63693A3 (en) | 1993-10-06 |
DE69130071T2 (de) | 1999-01-07 |
DE69130071D1 (de) | 1998-10-01 |
WO1992011368A1 (en) | 1992-07-09 |
AU657935B2 (en) | 1995-03-30 |
CA2098021C (en) | 2000-04-25 |
HUT66437A (en) | 1994-11-28 |
US20030235591A1 (en) | 2003-12-25 |
KR0156587B1 (en) | 1998-10-15 |
DK0563093T4 (da) | 2008-01-21 |
CZ118693A3 (en) | 1994-02-16 |
DK0563093T3 (da) | 1999-02-08 |
EP0563093B2 (en) | 2007-10-03 |
HU9301794D0 (en) | 1993-10-28 |
EP0491077A1 (en) | 1992-06-24 |
SK280551B6 (sk) | 2000-03-13 |
CA2098021A1 (en) | 1992-06-20 |
JP2001019643A (ja) | 2001-01-23 |
US6020167A (en) | 2000-02-01 |
HK1002901A1 (en) | 1998-09-25 |
EP0563093A1 (en) | 1993-10-06 |
JPH06507303A (ja) | 1994-08-25 |
AU9081791A (en) | 1992-07-22 |
JP3857305B2 (ja) | 2006-12-13 |
EP0563093B1 (en) | 1998-08-26 |
DE69130071T3 (de) | 2008-02-21 |
ATE170220T1 (de) | 1998-09-15 |
CZ290233B6 (cs) | 2002-06-12 |
ES2121000T5 (es) | 2008-04-16 |
ES2121000T3 (es) | 1998-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU657935B2 (en) | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases | |
US6100065A (en) | Hepatitis B surface antigen vaccine | |
EP0304578B1 (en) | Peptide comprising hepatitis B surface antigen | |
KR100208129B1 (ko) | B형 간염 백신 | |
KR100808313B1 (ko) | 비형 간염 코어 항원 융합 단백질 | |
KR100815408B1 (ko) | 만성 간염용 치료 백신으로서의 안정화된 HBc 키메라입자 | |
US20090239265A1 (en) | Virus like particles | |
US20020165172A1 (en) | Compositions and methods for treating intracellular diseases | |
IE69265B1 (en) | Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins | |
Murray et al. | Protective immunisation against hepatitis B with an internal antigen of the virus | |
US6297048B1 (en) | Hepatitis therapeutics | |
Pride et al. | Evaluation of B and T-cell responses in chimpanzees immunized with Hepagene®, a hepatitis B vaccine containing pre-S1, pre-S2 and S gene products | |
US5324513A (en) | Composition useful for the fabrication of vaccines | |
AU3610293A (en) | Hepatitis therapeutics | |
WO1998028004A1 (en) | Hepatitis delta particle containing a fusion protein immunogen | |
CN101309931A (zh) | 包含截短的hbc核心蛋白和基于皂苷的佐剂的疫苗 | |
Wu et al. | A novel hepatitis B virus variant S 129 (Gln→ Leu): Lack of correlation between antigenicity and immunogenicity | |
WO1988010301A1 (en) | Hepatitis b surface antigen vaccine | |
Murray et al. | S.) zyxwvutsrqpo |