CZ290233B6 - Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy - Google Patents
Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ290233B6 CZ290233B6 CZ19931186A CZ118693A CZ290233B6 CZ 290233 B6 CZ290233 B6 CZ 290233B6 CZ 19931186 A CZ19931186 A CZ 19931186A CZ 118693 A CZ118693 A CZ 118693A CZ 290233 B6 CZ290233 B6 CZ 290233B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- chain
- carrier
- polypeptide
- dna
- combination according
- Prior art date
Links
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 84
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 26
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 120
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 25
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 20
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 10
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 81
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 47
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 42
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 38
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 16
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 6
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N Ala-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 3
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 3
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 3
- AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N Ser-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100025840 Coiled-coil domain-containing protein 86 Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- UESJMAMHDLEHGM-NHCYSSNCSA-N Gly-Ile-Leu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UESJMAMHDLEHGM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N His-Gly-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 101000932708 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 86 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 2
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 2
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- GORKKVHIBWAQHM-GCJQMDKQSA-N Ala-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GORKKVHIBWAQHM-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 1
- DFCIPNHFKOQAME-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFCIPNHFKOQAME-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GOVUDFOGXOONFT-VEVYYDQMSA-N Asn-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GOVUDFOGXOONFT-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N Asn-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DKQCWCQRAMAFLN-UBHSHLNASA-N Asp-Trp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DKQCWCQRAMAFLN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 241000020089 Atacta Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055991 BglII endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 235000020847 Body for Life Nutrition 0.000 description 1
- 101710147327 Calcineurin B homologous protein 1 Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101000896148 Enterobacteria phage T4 Baseplate central spike complex protein gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101800001466 Envelope glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 1
- 101000597227 Escherichia phage Mu Probable terminase, small subunit gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101000912555 Escherichia phage lambda Tail fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- 101710170470 Glycoprotein 42 Proteins 0.000 description 1
- 101000764556 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 206010019759 Hepatitis chronic persistent Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N Ile-Leu-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- CQZNGNCAIXMAIQ-UBHSHLNASA-N Pro-Ala-Phe Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O CQZNGNCAIXMAIQ-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 aluminum compound Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000020403 chronic hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Pou it kombinace s obsahem a) alespo jednoho polypeptidov ho °et zce, obsahuj c ho alespo jeden antigenn epitop pro aktivaci T-bun k viru hepatitidy a b) nosi e, schopn ho umo nit · inek polypeptidov²ch °et zc a) s antigenn m epitopem, p°i em polypeptidov °et zce a) mohou b²t na nosi b) v z ny kovalentn nebo hydrofobn vazbou pro v²robu farmaceutick ho prost°edku pro l en chronick virov hepatitidy.\
Description
Oblast vynálezu
Předkládaný vynález se týká použití prostředku obsahujícího polypeptidový řetězec a nosič pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění chronickou virovou hepatitidou.
Dosavadní stav techniky
Alespoň pět různých virů, zejména viry hepatitidy A, B, C, D a E je schopno vyvolat klinický obraz akutního zánětu jater. Hepatitida A a E, která se přenáší zažívací soustavou, nepřechází do chronické infekce, kdežto hepatitida typu B, C (dříve nazývaná parenterální hepatitida odlišná od typu A a B a D může pokračovat do chronického zánětlivého stádia, v jehož důsledku může dojít k jatemí cirhóze nebo může vzniknout primární karcinom z jatemích buněk.
Existuje poměrně málo údajů, týkající se hepatitidy typu C a D, způsobuje jejich diagnosy, jejich léčení a také příslušného viru. Virus hepatitidy D je RNA-virus, o němž je známo, že je neúplný. Z tohoto důvodu je nutné, aby pro rozvoj onemocnění u nemocných byl přítomen ještě pomocný virus a k onemocnění proto dochází pouze u jednotlivců, infikovaných HBV. V poslední době byl objeven virus hepatitidy C a byl vyvinut test s použitím protilátky (anti-HCV), který usnadňuje diagnosu infekci virem chronické hepatitidy C. Z uvedených důvodů vzniká zvyšující se potřebná léčení uvedených onemocnění.
Totéž platí pro chronickou hepatitidu B, která je daleko dokonaleji prostudovaným onemocněním, zejména pokud jde o diagnosu imunologickými metodami, o virus, který je příčinou tohoto onemocnění, jakož i o životní cyklus tohoto viru a jeho řetězec DNA. Nemocný se označuje jako chronický nosič viru hepatitidy B v případě, že je možno přítomnost DNA viru prokázat v jeho organismu déle než 10 týdnů, antigen HBe (HBeAg) po dobu více než 12 týdnů nebo v případě, že v organismu je možno prokázat povrchový antigen viru hepatitidy V (HBsAg) po dobu delší než 6 měsíců.
Chronickou hepatitidou typu B trpí přibližně 300 milionů lidí, přičemž většina z těchto lidí žije na dálném východě.
V případě těchto lidí dochází k hlavnímu riziku infekce v průběhu porodu nebo bezprostředně po porodu vzhledem k tomu, že matka s chronickou infekcí přenáší virus na svého novorozence. 90 % dětí, infikovaných tímto způsobem bude trpět v pozdějším životě chronickou infekcí.
V západních státech dochází k infekci obvykle později v průběhu života, během dětství nebo i v dospělosti, převážně dochází k přenosu parenterálně nebo při sexuálním styku. V těchto případech je infekce hepatitidou B po porodu vzácnější a pouze 5 až 10 % infikovaných se stává chronickými nosiči. Přenesený virus sám však není zodpovědný za určité reakce infikovaných lidí a není zcela zřejmé, proč u některých lidí dochází k eliminaci viru a u některých k udržení viru v organismu po celý život. Nejpravděpodobněji závidí na stavu imunologického aparátu budoucí tělesný stav infikovaných lidí.
Virion HB (částečně Dane) je tvořen různými strukturními bílkovinami, a to bílkovinami jádra a povrchovými bílkovinami (S). Povrchové bílkoviny jsou produktem translace otevřeného čtecího rámce, který zahrnuje kódové řetězce tří oblastí typu S, z nichž každá začíná kodonem ATG, který je schopen zahájit translaci in vivo. Uvedené tři oblasti se označují preSl, preS2 a S v pořadí od 5'-zakončení ke 3'-zakončení molekuly. Existuje šest bílkovinných produktů, odvozených od tohoto ORF: glykosylovaná a neglykosylovaná forma hlavní bílkoviny, gp27 ap24, k jejíž translaci dochází pouze z oblasti S, obsahující 226 zbytků aminokyselin, střední bílkovina, obsahující 281 zbytků aminokyselin a obsahující jeden nebo dva postranní poly
-1 CZ 290233 B6 sacharidové řetězce gp33 a gp36, pro níž je kódem oblast preS2 a S a konečně glykosylovaná (gp42) a neglykosylovaná (p39) forma bílkoviny s dlouhým řetězcem, obsahující 39 až 400 zbytků aminokyselin v závislosti na serotypu viru, tato bílkovina vzniká translací preSl, preS2 a S. Bílkovinami jádra jsou HBcAg a HBeAg, přičemž druhá z těchto bílkovin vzniká zpracováním první uvedené bílkoviny.
Částice Dane, která je infekčním virionem, obsahuje jak bílkovinu jádra, tak povrchové bílkoviny, zatímco vlákna jsou tvořena směsí šesti povrchových antigenů. Peptidy Sjsou samy o sobě kombinovány v částicích o velikosti 28 nm, které jsou zcela neinfekční.
Nemocní, kteří jsou infikováni virem HB a prošli několika stadii hepatitidy jsou tedy označováni jako nemocní, trpící chronickou infekcí HBV. Bezprostředně po infekci nastává infekční stadium, které je charakterizováno přítomností antigenů HBeAg v krevním séru. Pokračující HBs-antigenemie přes inhibici replikace HBV znamená, že se řetězce DNA viru integrovaly do buněčného genomu nemocného. Tyto integrované řetězce viru však nezpůsobují syntézu úplného viru hostitelskou buňkou. Jatemí buňky, v nichž je integrován řetězec HBV, mohou produkovat pouze antigen HBsAg, který je možno prokázat v krevním séru nemocných a který je tedy indikátorem chronické hepatitidy typu B. Je pravděpodobné, že transformované jatemí buňky nejsou rozrušovány cytotoxickými T-buňkami, avšak proliferují a v důsledku toho se vyvíjí buď chronická přetrvávající hepatitida CPH, nebo chronická aktivní hepatitida CAH, z níž se může dále vyvinout jatemí cirhóza nebo také primární hepatocelulámí karcinom, obě tato onemocnění mohou vést k předčasnému úmrtí nemocného.
V poslední době bylo prokázáno, že nemocní, kteří trpí chronickou infekcí HBV mají rovněž defekt v endogenní produkci interferonu, jak bylo popsáno v publikaci Abb a další, J. Med. Virol., 1985, 16, 171 - 176. Z tohoto důvodu byly činěny pokusy léčit nemocné, trpící chronickou hepatitidou B po průkazu přítomnosti HBaAb a HBV-DNA v krevním séru podáváním interferonu alfa (IFNalfa). Při pokusech na velkém množství nemocných bylo prokázáno, že při podávání interferonu alfa došlo ke statisticky významně zvýšené eliminaci viru hepatitidy B ve srovnání s kontrolními příklady. Avšak nemocní, infikovaní v průběhu porodu nebo těsně po narození na toto léčení odpovídali v daleko nižší míře. Tento fenomén naneštěstí znamená, že uvedeným způsobem není možno léčit přibližně 75 % nosičů tohoto onemocnění.
V současné době zůstává přesný mechanismus působením interferonu alfa na chronickou hepatitidu B nejasný. Protivirový účinek této látky by mohl infikované buňky chránit před infekcí, nebo by mohlo docházet ke snížení transkripce, translace a replikace viru v infikovaných buňkách. Mimoto má interferon také imunomodulační účinky, zejména dochází při jeho aplikaci k aktivaci T-buněk, makrofágů a NK-buněk a k indukci exprese bílkovin HMC skupiny I.
Další přístup k léčení chronické hepatitidy B je založen na myšlence, dosáhnout inhibice replikace viru a tím napomoci imunologickému systému hostitele dosáhnout eliminace viru, kjehož replikaci nemůže dojít. Za tímto účelem byly zkoumány protivirové látky, například ^deninarabinosid a adeninarabinosidmonofosfát jako možné účinné látky pro léčení jednotlivců s chronickou infekcí HBV. Avšak méně než polovina nemocných odpověděla na tuto léčbu buď tak, že přechodně došlo k přeměně HBeAg+ na anti-HBe+ v krevním séru. Dalším negativním hlediskem při použití těchto protivirových látek je skutečnost, že uvedené sloučeniny potlačují imunologický systém nemocného.
U chronických nosičů těchto virů byly zkoumány ještě další účinné látky, například interferon beta, acycloquanosin (acyclovir), interleukin 2, steroidy, například predsolon a kombinace těchto látek. Při použití žádné z uvedených látek však nebylo možno dosáhnout příznivějších výsledků než při léčení interferonem alfa. Pouze kombinační léčbou, při níž se na počátku léčení podávají steroidy a pak se podává ještě interferon alfa, je u některých nemocných možno zvýšit počet zlepšených případů.
-2CZ 290233 B6
EP-A-243 913 (Califomia Institute of Technology) popisuje vakcínu proti HBV obsahující peptid s řetězcem aminokyselin o délce alespoň šest za sebou následujících aminokyselin s kódovací oblasti genu pre-S obálky viru HBV.
WO 88/10 300 (Medico Labs) popisuje imunogenní částici obsahující větší množství monomerů prvního peptidu a větší množství monomerů druhého peptidu, kde každý z uvedených monomerů prvního peptidu obsahuje sekvenci aminokyselin odpovídající podstatné části peptidu, který po sekreci vytvoří částice o průměru alespoň 10 nm, a sekvence aminokyselin odpovídá heterolognímu epitopu, a každý z uvedených monomerů druhého peptidu obsahuje sekvenci aminokyselin odpovídající podstatné části peptidu, který po sekreci tvoří částice o průměru alespoň 10 nm, kde každý z uvedených monomerů druhého peptidu neobsahuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající heterolognímu epitopu, kde uvedený monomer prvního peptidu a uvedený monomer druhého peptidu nejsou identické, ale jsou schopné vzájemné vazby.
EP-A-271 302 (Scripps Clinic and Research Foundation) popisuje polypeptidy odpovídající co se týče sekvence zbytků aminokyselin oblastem stimulujícím T-buňky proteinu nukleokapsidy HBV. Popisuje se také způsob zesílení imunogenicity polypeptidového imunogenu, který zahrnuje operativní spojení polypeptidu přes postranní řetězec aminokyselinového zbytku k proteinovým částicím jádra.
EP-A-385 610 (Wellcome) popisuje částice antigenu jádra HBV (HBcAg), které nesou polypeptid prezentující antigenní epitop, a které jsou vhodné pro použití ve vakcínách. Částice jsou složené z HBcAg opatřené N-koncovým prodlužujícím úsekem obsahujícím zbytek Lys a uvedený polypeptid je navázán na částice přes postranní řetězec aminokyseliny zbytku Lys.
EP-A-175 261 (Chiron) popisuje nové imunogenní prostředky obsahující virové částice, složené alespoň z částice hybridních proteinů alespoň části proteinu tvořícího částice a jednoho nebo více polypeptidů obsahujících alespoň jeden významný epitop.
EP-A250 253 (Scripps Clinic and Research Foundation) popisuje polypeptidy odpovídající sekvencím zbytku aminokyselin buněčným epitopům T a B v přes-S oblasti HBsAg.
Z literatury je již známo, že šimpanzy, trpící chronickou infekcí HBV není možno vyléčit podáváním HBsAg, vázaným na tetanový toxoid, ani podáváním protilátek anti-HBS. Mimoto byly činěny pokusy imunizovat nemocné, trpící chronickou infekcí HBV podáváním peptidů S. Při tomto způsobu léčení však nedošlo u léčených osob ani ke tvorbě protilátek anti-HBS.
Mimoto podle definice uvedené na onemocnění je hlavní vlastností chronických nosičů viru hepatitidy B skutečnost, že v jejich krevním séru je možno prokázat antigen HBsAG. Nebylo tedy vůbec možno předpokládat, že by pomocí kombinace, obsahující epitop virového peptidu S, aktivující T-buňky podle vynálezu bylo možno dosáhnout imunizace a při dostatečně dlouhé době podávání i úplného vyléčení chronických nosičů viru hepatitidy B.
Vynález si klade za úkol navrhnout účinný prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy, při jehož použití by mohlo být dosaženo dobrého účinku, zejména dlouhodobé inhibice replikace viru HBV, ztráty DNA a DNA-polymerázy tohoto viru a současně by mělo být dosaženo také vymizení antigenů HBeAG a HBsAg v krevním séru nemocných, trpících tímto onemocněním.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří použití kombinace.
a) alespoň jednoho polypeptidového řetězce obsahujícího alespoň jeden antigenní epitop pro aktivaci T-buněk viru hepatitidy a
-3CZ 290233 B6
b) nosiče schopného umožnit účinek polypeptidových řetězců s antigenním epitopem přičemž polypeptidové řetězce a) mohou být na nosič b) vázány kovalentní nebo hydrofobní vazbou pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chronické virové hepatitidy.
Podle vynálezu může být polypeptidovým řetězcem a) polypeptid nebo kombinace dvou nebo většího počtu polypeptidů viru hepatitidy B, a to jakékoliv podtypu tohoto viru, zvláště adw, ayw, adr a ady. Tyto peptidy, odvozené od viru hepatitidy B mohou být například peptidy preSl, preS2 nebo S nebo také antigen j ádra HBV.
Jako polypeptidový řetězec (řetězce) a) je možno mimo to použít jakýkoli ze svrchu uvedených polypeptidů nebo kombinací dvou nebo většího počtu polypeptidů, které jsou modifikovány některým z následujících způsobů:
i) je možno vypustit některé části řetězce, přičemž musí být zachován epitop, který obsahuje alespoň šest po sobě následujících zbytků aminokyselin, ii) jednu nebo větší počet aminokyselin v řetězci je možno nahradit, nebo iii) je možno přidat další aminokyseliny nebo řetězce aminokyselin na N-terminálním nebo na C-terminálním zakončení nebo také uvnitř polypeptidového řetězce nebo řetězců a).
Ve výhodném provedení se k tomuto účelu užijí myristylované polypeptidové řetězce a).
Aby bylo možno dosáhnout příslušné farmakologické účinnosti, je zapotřebí, aby v kombinaci podle vynálezu byl polypeptidový řetězec nebo řetězce a) užity na nosiči b). Tento nosič je tvořen zvláštním materiálem, například může být tvořen částicemi hydrofobního polymeru, částicemi anorganického nosiče nebo částicemi polysacharidu. S výhodou je však nosič b) tvořen dalším polypeptidovým řetězcem, který vytváří částice, přičemž průměr těchto částic je alespoň 10 nm.
Ve výhodném provedení obsahují částice, tvořené polypeptidem, který je užit jako nosič b) podstatnou část úplného řetězce aminokyselin polypeptidu, který může být zvolen z peptidů S viru HBV, antigenu jádra HBV, antigenu jádra HAV, povrchového antigenu HA V, povrchového antigenu HTV a antigenu jádra HTV a může jít také o povrchový antigen viru dětské obrny. Výhodným materiálem pro částice nosiče b) je zejména peptid S viru HBV a/nebo peptid jeho jádra.
Při použití jako nosiče b) mohou být výše uvedené polypeptidy modifikovány následujícím způsobem:
(i) je možno vypustit některé části řetězce, přičemž musí být zachována schopnost vytvářet částice, (ii) je možno nahradit jednu nebo několik aminokyselin jinými aminokyselinami, (iii) je možno přidat další řetězce aminokyselin na N-terminální zakončení, C-terminální zakončení nebo dovnitř peptidového řetězce nosiče b).
V případě, že nosiče b) je polypeptidový řetězec, mohou být řetězce vázány jedním nebo větším počtem následujících způsobů: může jít o vazbu přes hydrofobní skupinu (zprostředkovanou myristovou kyselinou), o tvorbu disulfidových můstků nebo mohou být oba řetězce spojeny pomocí peptidové vazby za vzniku složeného peptidů. V tomto posledním případě je možno mezi polypeptidovým řetězcem a) a polypeptidový řetězec nosiče b) vložit ještě další řetězec, který je k oběma polypeptidům vázán peptidovými vazbami.
-4CZ 290233 B6
Polypeptidové řetězce a) a polypeptidový řetězec nosiče b) mohou být kódovány za sebou na stejné rekombinantní molekule DNA.
Molekula DNA může být exprimována v hostitelské buňce. Hostitelská buňka může být savčí, kvasinková nebo bakteriální buňka. Ve výhodném provedení se pro účely vynálezu používají buňky, které samy neprodukují žádnou bílkovinu lidského séra nebo bílkovinu séra primátů s výjimkou polypeptidu (polypeptidů) obsažených ve výše uvedené kombinaci.
Pod pojmem „peptid S viru HBV“ se rozumí peptid, kódovaný celou oblastí S genomu HBV.
Pod pojmem „pre-S2 peptid HBV“ se rozumí v průběhu přihlášky peptid, pro nějž je kódovým řetězcem celá oblast pre-S2 a S genomu HBV. Pod pojmem „pre-Sl peptid HBV“ se v průběhu přihlášky rozumí polypeptid, pro nějž je kódovým řetězcem celá oblast pre-Sl, pre-S2 a S genomu HBV. Pod pojmem „epitop“ se v průběhu přihlášky rozumí řetězec alespoň šesti po sobě následujících zbytků aminokyselin, pro nějž je kódem uvedená oblast genomu, to znamená, že například „pre-S2 epitop HBV“ znamená řetězec, obsahující alespoň šest zbytků aminokyselin, pro nějž je kódem určitá oblast pre-S2 genomu HBV. Pod pojmem „epitop T-buňky“ se v průběhu přihlášky rozumí epitop, schopný interakce s receptory na povrchu T-buněk za současného podporování nebo jiného ovlivnění imunologické odpovědi.
Pod pojmem „antigenita“ se v průběhu přihlášky rozumí schopnost, vyvolat imunologickou odpověď, to znamená například působit jako antigen, dále schopnost vyvolat tvorbu protilátek, to znamená opět působit jako antigen a/nebo schopnost interakce s receptorem na povrhu buňky ke zvýšení imunologické odpovědi nebo k vyvolání produkce protilátek.
Pod pojmem „HBV“ se rozumí jakýkoliv podtyp viru, zejména adw, ayw, adr a ayr, tak jak byly popsány v literatuře, například P. Velanzuela, Nátuře sv. 280, str. 815, 1979, Gerlich, EP-A 180 012, a Neurath, EP-A 154 902. Příklady peptidových řetězců, tvořících polypeptidové řetězce a), schopné zprostředkovat antigenitu jednoho nebo většího počtu epitopů budou dále uvedeny v seznamu řetězců, jde o řetězce ID č. 17 až 20 a 22.
Jako výhodná provedení vynálezu je možno označit následující kombinace:
- částice S-antigenu BH se specifickými epitopy (determinantami) z oblastí pre-Sl, pre-S2 a/nebo může jít o peptidy jádra.
- částice antigenu jádra HB s obsahem specifických epitopů (determinant) z oblasti peptidu pre-Sl, pre-S2, S a/nebo antigenu jádra,
- částice antigenu viru hepatitidy A se specifickými epitopy (determinantami) viru hepatitidy B, a to oblasti S, pre-Sl, pre-S2 a/nebo peptidu jádra.
Rekombinantní molekuly DNA výhodné pro použití v předkládaném vynálezu jsou charakterizovány přítomností řetězců kódujícími polypeptidové řetězce a) zprostředkující antigenitu pro jeden nebo větší počet epitopů T-buněk a také pro polypeptidové řetězce nosiče b), které s výhodou po své sekreci vytvářejí částice o průměru alespoň 10 nm, v obou případech pod řízením vhodného promotoru. Příkladem pro řetězce, které jsou kódovými řetězci pro polypeptidové řetězce a), je možno uvést kterýkoliv z řetězců, které jsou dále uvedeny v seznamu řetězců pod čísly ID 1 až 24. Příklady řetězců DNA, které jsou kódovými řetězci pro polypeptidové řetězce nosiče b), mohou být kterékoliv z dále uvedených řetězců ID 25 až 27.
Kterýkoliv z řetězců ID-1 až 24 je možno kombinovat s kterýmkoliv řetězcem ID-25 až 27 v seznamu řetězců, a to v pořadí a-b i b-a.
-5CZ 290233 B6
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu jde o kombinaci epitopu řetězce ID-28, který odpovídá aminokyselinám 9 až 28 řetězce Sl HBV a řetězce ID 26 a/nebo 27 jako řetězce nosiče, tvořícího částice.
Řetězce viru hepatitidy užité ke konstrukci rekombinantní DNA je možno vytvořit nebo izolovat jakýmkoli způsobem včetně izolace a navázání restrikčních fragmentů, chemické syntézy oligonukleotidů s použitím syntezátoru (Cyclon, BioSearch) a syntézy metodou PCR (T. J. White, N. Amleim, Η. E. Erlich, 1989; The Polymerase Chain Reaction, Technical Focus 5 (6)).
Výhodné molekuly rekombinantní DNA byly vytvořeny vazbou syntetických oligonukleotidů na fragment 5'XBaI-BglII-3', ID-27, z oblasti S genomu HBV, řetězec je odvozen od fragmentu HBV BglII-Bgin včetně celé oblasti pre-Sl-pre-S2-S- nebo celé oblasti S. Oligonukleotidy, užité při tvorbě těchto konstrukcí jsou souhrnně uvedeny v následující tabulce I.
Tabulka I funkce definice řetězec ID č.
jádro (adw) | aax 59-87 | 6 |
jádro (adw) | aa2—28 | 7 |
jádro (adw) | aa-10-28 | 8 |
jádro (adw) | aa 29-58 | 9 |
jádro (adw) | aa 1-87 | 10 |
jádro (adw) | aa-10-87 | 11 |
jádro (adw) | aa 70-110 | 12 |
jádro (adw) | aa 80-125 | 13 |
jádro (adw) | aa 88-120 | 15 |
Sl (ayw) | aa 9-28 | 17 |
Sl (ayw) | aa 83-103 | 18 |
Sl (ayw) | aa20—40 | 19 |
Sl (ayw) | aa 59-94 | 20 |
Sl (ayw) | aa 94-114 | 21 |
Sl (ayw) | aa 70-105 | 22 |
S2 (ayw) | aa2-21 | 23 |
S2 (ayw) | aa 14-33 | 24 |
x aa = aminokyseliny
Další výhodné molekuly DNA byly vytvořeny vazbou řetězce jádra, připraveného metodou PCR (kódované řetězce pro epitopy T-buněk) na řetězce jádra HBV, ID č. 25, užité jako polypeptidový řetězec nosiče b). Použité oligonukleotidy pro tyto konstrukce jsou uvedeny v tabulce Π-1.
-6CZ 290233 B6
Tabulka Π-1
funkce | definice | IDč. |
jádro | úplný řetězec, bp 1901-2500 | 1 |
jádro | C-terminální vypuštění, bp 1901-2450 | 2 |
jádro | C-terminální vypuštění a vložení stop kodonu, bp 1901-2405 | 3 |
jádro/řetězec před jádrem | 10 aminokyselin řetězce před jádrem, C-terminální vypuštění bp 1871-2405 | 4 |
jádro/řetězec před jádrem | 10 aminokyselin řetězce před jádrem, C-terminální vypuštění, uložení stop-kodonu, bp 1871-2405 | 5 |
jádro | aa(-10-120) | 16 |
jádro/řetězec před jádrem | 10 aminokyselin řetězce před jádrem, úplné jádro a bp 1871-2500 | 35 |
V následující tabulce Π-2 je uvedeno několik příkladů, v nichž byl izolován kódový řetězec
DNA pro epitop T-buněk při použití restrikčních fragmentů z genomu viru HBV, tyto fragmenty pak byly navázány na řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro polypeptidový řetězec nosiče b) ve svrchu uvedeném významu.
Tabulka Π-2
funkce | definice | ID č. |
jádro/řetězec před jádrem | úplný řetězec, bp 1403-31 | XX |
s2 ay/ad | XX | |
S2 (K) ay/ad | S2-S, 7 kodonů vypuštěno, kodon ATG pro počátek je nahrazen kodonem ATA | 14 |
“ Řetězce byly zveřejněny v publikacích Galibert F. a další, 1979, Nátuře, 281, 646-650 a Ono Y. a další, 1983, Nucl. Acid. Res, 11(6), 1747-1757.
V následující tabulce Π-3 jsou uvedeny některé specifické rekombinantní molekuly DNA. Konstrukce těchto molekul bude podrobněji popsána v příkladové části přihlášky.
Tabulka Π-3
konečná konstrukce | epitop T-buněk | nosič, tvořící částice | selekční gen |
MT-jádro (-10-120) jádro (aa-10-120) + SAg + neo | S adw/ayw nebo S/XbaII/Bgin | neo | |
MT-S1 (aa 9-28) -S + egpt | SI (aa 9-28) ay | S adw/ayw nebo S/Xball/Bgin | egptx |
MR-jádro-neo | jádro/řetězec před jádrem bp 1403-31 | jádro adw | neo |
MT-jádro (1-87) + HBsAg - neo | jádro (aa 1-87) | S adw/ayw nebo S/Xbal/Bgin | neo |
x egpt = E. coli xanthinguaninfosforibosyltransferáza.
Výhodné rekombinantní molekuly DNA obsahují kromě kódových oblastí pro polypeptidové řetězce a) a polypeptidové řetězce nosiče b) ještě další kódový řetězec pro selekční markek. Mimo to obsahují všechny další obvyklé prvky nezbytné pro expresi jako jsou řetězec promotoru, startovací kodon a polyadenylační signál.
Příkladem vhodných promotorů mohou být methallothionein (MT), promotory U2 a H2K v případě, že se jako hostitelské buňky užití buňky savců. V případě, že mají být použity kvasinkové buňky nebo bakteriální buňky, užijí se příslušné promotory pro tyto typy buněk, například promotor GCN4 a promotor GAL 1/10 nebo prokaryotické promotory trp a tac.
Aby bylo možno produkovat kombinaci polypeptidových řetězců a) a polypeptidových řetězců nosiče b) podle vynálezu, uloží se rekombinantní molekula DNA do hostitelských buněk při použití transfekce (v případě buněk savců), transformace (v případě kvasinkových a bakteriálních buněk) nebo jinými způsoby. Jako hostitelská buňka může být použit jakýkoliv organismus, v němž může dojít k transkripci a translaci rekombinantních molekul DNA, může jít například o buňky savců, bakteriální buňky nebo buňky kvasinek.
Vhodnými buňkami savců pro účely vynálezu jsou například buňky VĚRO (buněčná linie opičích ledvin), buňky 373-C1127 a L (buněčná linie myších fibroblastů) a buňky CHO (vaječníkové buňky čínského křečka), které reagují buď positivně, nebo negativně na dehydrofolátreduktázu.
Dále je možné postupovat tak, že se svrchu uvedený řetězec DNA, který je kódem pro polypeptidové řetězce a) a svrchu definovaný druhý řetězec DNA, který je kódem pro polypeptidový řetězec nosiče b) jsou uloženy v různých rekombinantních molekulách DNA, v tomto případě je nutno provést současnou transfekci hostitelských buněk s použitím obou typů rekombinantních molekul DNA.
-8CZ 290233 B6
Tabulka ΙΠ
Možné složení částic, obsahujících epitopy T-buněk pro zacílení nosiče v kombinaci proti chronické hepatitidě
konečná | promotor2 | epitop T-buněk | částicový | selekční čištění3 | |
konstrukce1 | nosič | gen | |||
SYN PCR | Gen |
MTX12/U2 jádro (adw) neo/egpt
MTX12/U2
MTX12/U2 jádro bez řetězce před jádrem např. bp 1901-2500 jádro bez řetězce před jádrem s vypuštěním C-konce např. bp 1901-2405 jádro bez řetězce před jádrem s vypuštěním C-koncem + stop signál např. bp 1901-2405 jádro (adw) nebo/egpt jádro (adw) neo/egpt
MT-jádro-neo MTX12/U2
jádro a řetězec jádro a jádro (adw) | neo/egpt materiály | |
před jádrem | řetězec | a metody |
10AA | před | |
jádrem | ||
bp 1403-31 |
jádro (adw) neo/egpt
MTX12/U2
MTX12/U2 jádro a řetězec před jádrem 10AA s delekcí na C-konci bp 1871-2405 jádro a řetězec před jádrem s deleci na konci C-konci + stop signál bp 1871-2405 jádro (adw) neo/egpt
MTX12/U2 jádro (AA59-87)
MTX12/U2 jádro (AA228) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt neo/egpt
-9CZ 290233 B6
Tabulka IH - pokračování
konečná konstrukce1 | promotor2 | SYN | epitop T-buněk PCR | částicový nosič Gen | selekční gen | čištění3 |
MTX12/U2 | jádro (AA2- 28) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | jádro (AA10-28) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | jádro (AA29-58) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MR-jádro (1-87) + HBsAg-neo | MTX12/U2 | jádro (AA1- 87) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | ||
MTX12/U2 | jádro (AA-10-87) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | jádro (AA70-110) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | jádro (AA80-125) | celý S adw/ayw S/Xbal/Bgin | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | jádro (AA88-120) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | jádro (AA- 10 + SAIG + AA2-87 | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MT-jádro (-10-120) + SAg + neo | MTX12/U2 | jádro (AA-10-120) | celý S adw/ayw S-Xba I/BglII | neo/egpt | materiály a metody | |
MT-A1 (AA9-28)- S + egpt | MTX12/U2 | S1-(AA 9-28) (ay) | celý S adw/ayw S/Xbal/Bgin | neo/egpt | ||
MTX12/U2 | S1-(AA 83-103)(ay) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | S1(AA 20-40) (ay) | celý S adw/ayw S/Xbal/BGIII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | SI (AA 59-94) (ay) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | S1-(AA 94-114) (ad) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglU | neo/egpt |
-10CZ 290233 B6
Tabulka ΙΠ - pokračování
konečná konstrukce1 | promotor2 | epitop T-buněk | částicový nosič | selekční gen | čištění3 | |
SYN PCR | Gen | |||||
MTX12/U2 | S1-(AA 70-105) (ad) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | materiály a metody | ||
MTX12/U2 | S1-(AA 9-28) (ay) | jádro adw | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | S2-(AA 2-21) (ay) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | S2-(AA 14-33) (ay) | celý S adw/ayw S/Xbal/BglII | neo/egpt | |||
MTX12/U2 | S2 ayw | S ayw/adw | neo/egpt | materiály a metody | ||
MTX12/U2 | adaptor | S2-(K)~ ayw | S ayw/adw | neo/egpt |
vysvětlivky k tabulce:
1: vysvětlení je uvedeno v příkladu 3
2: jakýkoliv z uvedených promotorů je možno použít
3: čištění je podrobněj i uvedeno v příkladové části.
V tabulce ΙΠ je uveden souhrnný přehled kombinací vhodných řetězců DNA.
Je nutno uvést, že jakékoliv složky, které jsou v tabulce uvedeny, je možno kombinovat za získání řetězce DNA, který je možno užít ktransfekci hostitelské buňky, která pak bude 15 produkovat kombinaci polypeptidových řetězců a) a polypeptidových řetězců nosiče b), vhodnou pro léčení chronické virové hepatitidy.
Řetězce DNA, které jsou kódovými řetězci pro řetězce epitopů T-buněk byly připraveny synteticky (SYN) při použití automatického přístroje Biosearch Cyclon Synthesiser, pomocí PCR 20 (PCR) nebo fragmentací virového genomu pomocí restrikčních enzymů (GENE).
Pro léčení nemocných, trpících chronickou virovou hepatitidou je možno zpracovat kombinaci polypeptidových řetězců a) a polypeptidových řetězců nosiče b) do jakéhokoliv typu farmaceutického prostředku, který mimoto bude obsahovat vhodné ředidlo nebo farmaceutický 25 nosič, například roztok pufru.
Takto připravený farmaceutický prostředek je možno podávat jakýmkoliv způsobem, například parenterálně, jako nitrožilně nebo nitrosvalově, nebo perorálně, například při použití tyfoidních bakteriálních buněk k zapouzdření účinného materiálu.
Farmaceutický prostředek má obsahovat svrchu uvedenou kombinaci řetězců v dostatečné koncentraci k vyvolání požadovaného účinku po podání.
Praktické provedení vynálezu bude dále podrobněji popsáno v souvislosti s přiloženými výkresy.
- 11 CZ 290233 B6
Popis výkresů
Na obr. I je znázorněna konstrukce DNA, která je kódovým řetězcem pro promotor, řetězec nosiče, tvořící částice a selekční gen tak, jak je popsána v příkladu 3/4.
Na obr. Π je znázorněna konstrukce DNA genu, obsahující promotor, epitop s úplným HB-S-Ag a gen pro selekci, tak jak je popsána v příkladu 3/18.
Na obr. ΙΠ je znázorněna konstrukce DNA, která je tvořena promotorem, epitopem T-buněk se zbytkem, tvořícím m částice a gen pro selekci, tato konstrukce je popsána v příkladu 3/21.
Na obr. IV jsou uvedeny hodnoty AST pro šimpanze 1 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care, léčení je popsáno v příkladu 10/1.
Na obr. V jsou uvedeny hodnoty antigenu u šimpanze 1 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care tak jak je popsáno v příkladu 10/1.
Na obr. VI jsou uvedeny hodnoty jatemích enzymů ALT a GGT u šimpanze, jemuž byl v určitých intervalech třikrát podán prostředkem Hepa-Care podle příkladu 10/2.
Na obr. VII jsou uvedeny hodnoty jatemích enzymů ALT, AST a GGT a množství antigenu u šimpanze 2 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care způsobem, který je popsán v příkladu 10/3.
Na obr. Vin jsou uvedeny hodnoty jatemích enzymů, stanovená u neléčeného kontrolního šimpanze tak, jak je uvedeno v příkladu 10/3.
Na obr. IX a X jsou uvedeny hodnoty množství antigenu a titr protilátek u nemocného 1 v průběhu jeho léčení prostředkem Hepa-Care, tak jak je popsáno v příkladu 11.
Na obr. XI a ΧΠ je souhrnně uvedeno množství antigenu a titr protilátek u nemocného 2 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care způsobem podle příkladu 11.
Na obr. ΧΙΠ a XTV jsou uvedeny hodnoty množství antigenu a titr protilátek u nemocného 3 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care, tak jak je popsáno v příkladu 11.
Praktické provedení vynálezu bude podrobněji popsáno v následujících příkladech, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
1. Frakcionované srážení polyethylenglykolem (PEG)
Supematant kultury, produkující bílkovinu HBV se odebere a rozdělí na podíly po 2400 ml.
Ke každému podílu se přidá 144 g PEG 6000 (Serva) a po rozpuštění se směs míchá 20 minut při teplotě místnosti a pak ještě 6 hodin při teplotě 4 °C. Vzniklá sraženina se oddělí odstředěním v lahvích s objemem 500 ml při použití rotoru GS 3 při 9000/ot/min, tj. 15 000 g po dobu minut při teplotě 10 °C. Pak se podíly supematantu oddělí a přidá se znovu 144 g PEG 6000 stejným způsobem jako svrchu. Roztok se míchá 3 hodiny při teplotě 4 °C. Vytvořená sraženina z tohoto roztoku se oddělí stejně jako svrchu až na to, že odstředění trvá 60 minut.
- 12CZ 290233 B6
2. Chromatografie na gelu
Materiál, získaný po vysrážení pomocí PEG se znovu rozpustí ve 20 ml PBS a roztok se chromatografuje na A-5m (BioRad). Bylo užito sloupce s rozměry 25 x 1000 mm a 400 ml prostředku. Při typické frakcionaci došlo při použití PEG k vysrážení 1000 mikrogramů bílkoviny HBV v objemu 10 až 15 ml, eluce byla prováděna PBS rychlostí 6 kapek za minutu, tj. 18 ml za hodinu. Byly odebírány frakce s objemem 3 ml. K eluci bílkoviny HBV docházelo v prvním vrcholu. Odebrané frakce byly podrobeny gradientu CsCl.
3. Sedimentace v gradientu CsCl
Přibližně 30 frakcí, tvořících první vrchol při provádění chromatografie na sloupci A-5m a obsahujících částečně čištěnou bílkovinu HBV byly odebrány a spojeny, objem spojených frakcí byl přibližně 100 ml. Tento roztok byl upraven na hustotu 1,30 g/ml přidáním CsCl a pak byl přenesen do polyallomemí zkumavky, kterou je možno použít v rotoru SW 27/28 (Beckman). Gradient byl vytvořen tak, že bylo nejprve uloženo 4 ml roztoku CsCl s hustotou 1,35 g/ml, na tuto vrstvu byla uložena vrstva 4 ml roztoku s hustotou 1,25 g/ml a ta byla ještě převrstvena vrstvou 4 ml roztoku s hustotou 1,20 g/ml. Pak bylo při použití tohoto gradientu prováděno odstřeďování materiálu rychlostí 28000 ot/min celkem 50 hodin při teplotě 10 °C. Pak byl gradient podroben frakcionaci a byla oddělena čištěná bílkovina HBV, nacházejí se ve vrstvě s hustotou 1,20 g/ml. Pak byl roztok zbaven soli dialýzou ve vacích proti vodě, dialýza byla třikrát opakována.
Příklad 2
Kvantitativní stanovení bílkoviny HBV
1. Radioimunologický způsob
Při radioimunologické zkoušce, prováděné v několika vrstvách, AUSTRIA Π-125 (Abbot) se částice, opatřené povlakem morčecí protilátky proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B (Anti-HBs) inkubují se sérem, plazmou nebo čištěnou bílkovinou při použití odpovídajících kontrolních vzorků. Jakýkoliv přítomný antigen HBsAG se váže na protilátku na pevné fázi. Po odsátí nenavázaného materiálu a promytí částic se s komplexem, vázaným na částice nechá reagovat lidský 125I-Anti-HBs. Pak se částice opět promyjí, aby došlo k odstranění nenavázaného značeného 125I-Anti-HBs.
)-Anti-HBs HbsAg )-Anti-HBs. HBsAg 125I-Anti-HBs )-Anti-HBs . HBsAg . 125I-Anti-HBs
Radioaktivita, která zůstává vázána na částice se stanoví pomocí scintilačního gamma-počítače.
2. Zkouška ELISA
Při použití plotny pro mikrostanovení, Enzygnost (Behring) se při stanovení HBsAg vyhloubení povlékají anti-HBs. Pak se přidá sérum, plazma nebo čištěná bílkovina a také kontroly a plotna se inkubuje. Po promytí se se zbývajícími antigenními determinantami nechá reagovat protilátka proti HBsAg, značená peroxidázou. Nenavázaná protilátka s enzymem se odstraní promytím a stanoví se účinnost enzymu, vázaného na pevnou fázi. Enzymaticky katalyzovaná reakce peroxidu vodíku a chromogenu se zastaví přidáním zředěné kyseliny sírové. Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci HBsAg ve vzorku a je možno ji stanovit fotometrickým srovnáním intensity
-13CZ 290233 B6 zabarvení neznámého vzorku s intensitou zbarvení negativního a positivního kontrolního vzorku séra.
Příklad 3
Příprava konstrukcí genů obsahujících promotor, požadované řetězce antigenů a gen usnadňující selekci.
1. Izolace MT-promotoru
Plazmid pBPV-342-12 (ATCC 37224) se rozštěpí působením restrikčních endonukleáz BglII a BamHI. Tímto způsobem vznikly tři molekuly DNA. Požadovaný fragment obsahuje methallothioneionový promotor a řetězec plazmidu pBR322 o velikosti 4,5 kb a je možno jej snadno odlišit od ostatních fragmentů s velikostí 2,0 kb a 7,6 kb.
Reakce se provádí v celkovém objemu 200 mikrolitrů reakčního pufru při konečné koncentraci DNA 0,5 gg/μΐ včetně 100 jednotek každého se svrchu uvedených restrikčních enzymů. Úplnost rozštěpení byla kontrolována po inkubaci 3 hodiny při teplotě 37 °C elektroforézou na 0,8% agarózovém gelu. Pak byla reakce zastavena přidáním 4 mikrolitrů 0·,5 M EDTA.
Fragment s velikostí 4,5 kb byl od ostatních fragmentů oddělen preparativní elektroforézou na 1,2% agarózovém gelu. Eluce DNA zagarózového gelu byla prováděna na Whatmanově filtračním papíru DE-81, DNA byla oddělena pomocí pufru s vysokým obsahem solí. Pak byla DNA čištěna extrakcí směsí fenolu a chloroformu s následným dvojím srážením při použití ethanolu.
2. Vazba fragmentu o 1,8 kb, který je kódem pro antigen jádra HBV
Fragment Bam-HI-BamHI o velikosti 1,8 kb, obsahující kódovou oblast jádra HBV byl izolován z DNA s obsahem HBV. Tento fragment byl pak navázán na fragment s velikostí 4,5 kb, obsahující MT-promotor a zbytek pBR, jakje popsáno v odstavci 1.
mikrolitry fragmentu o velikosti 1,8 kb se smísí se 3 mikrolitry fragmentu o velikosti 4,5 kb, vazba se provádí v celkovém objemu 10 mikrolitrů příslušného pufru, který obsahuje dvě jednotky T4-DNA-ligázy, a 2 mM AT přes noc při teplotě 14 °C.
K vazné směsi se přidá 150 mikrolitrů suspenze bakteriálních buněk pro příjem NA. Po včlenění DNA do bakteriálních buněk se buňky nanesou na plotny LB-agaru s obsahem 50 mikrolitrů/ml ampicilinu, užije se 50 až 300 mikrolitrů buněčné suspenze na jednu plotnu. Pak se agarové plotny inkubují přes noc při teplotě 37 °C a vzniklé jednotlivé izolované kolonie bakteriálních buněk se zkouší na přítomnosti plazmidu, obsahujícího požadované fragmenty.
3. Sledování bakteriálních kolonií, obsahujících požadovaný plazmid
Jednotlivé kolonie se ostrým nástrojem oddělí od agaru a přenesou do zkumavky s objemem 5 ml, obsahující živné prostředí LB s ampicilinem. Zkumavky se inkubují přes noc při teplotě 30 °C za rychlého protřepávání. Pak se z každé suspenze bakteriálních buněk připraví plazmid. Získané od sebe odlišné vzorky DNA se zkouší štěpením restrikční endonukleázou BglII. Očekává se vznik dvou molekul, a to fragmentu o velikosti 400 bp a fragmentu o velikosti 5,9 kb. Rozštěpený materiál se analyzuje elektroforézou na agarózovém gelu, DNA plazmidu se izoluje z bakteriálních buněk.
4. Uložení selekčního označení-genu pro odolnost proti neomycinu
- 14CZ 290233 B6
Plazmid, získaný v předchozím stupni se linearizuje rozštěpením restrikčním enzymem EcoRI. Reakce se provádí v celkovém objemu 50 mikrolitrů při konečné koncentraci DNA plazmidů pg/gl. Přidá se 50 jednotek enzymu EcoRI a štěpení se provádí inkubací 3 hodiny při teplotě 37 °C, průběh štěpení se sleduje elektroforézou na agarózovém gelu.
Reakce se zastaví přidáním 1 mikrolitrů 0,5M EDTA a DNA a vysráží octanem sodným v konečné koncentraci 0,3 M a přidáním tří až čtyř objemů ethanolu při teplotě -80 °C v průběhu 30 minut. Vysrážená DNA se rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.
mikrolitry linearizovaného plazmidů se smísí se 3 mikrolitry fragmentu DNA, obsahujícího methallothioneinový promotor a selekční gen pro odolnost proti neomycinu, izolovaný z plazmidů pMT-neo-E (ATCC/Exogene) rozštěpením endonukleázou EcoRI jako fragment velikosti 3,9 kb a vzniklá směs se naváže. Pak se jednotlivé bakteriální kolonie sledují na přítomnost požadovaného plazmidů.
5. Izolace fragmentu, obsahujícího řetězce promotoru U2
Plazmid pUC-8-42 (Exogene) se rozštěpí působením restrikčních endonukleáz EcoRI a Apal. Získají se 2 molekuly DNA. Požadovaný fragment obsahuje promotor UA o velikosti 340 bp a je možno jej snadno odlišit od zbývajícího fragmentu, který obsahuje 3160 bp. Štěpení se provádí v celkovém objemu 200 mikrolitrů reakčního pufru při konečné koncentraci DNA 0,5 pg/μΐ včetně 100 jednotek každého restrikčního enzymu. Úplnost štěpení se po inkubaci 3 hodiny při teplotě 37 °C kontroluje elektroforézou na 0,7% agarózovém gelu. Reakce se pak zastaví přidáním 4 mikrolitrů 0,5 M EDTA. Fragment o velikosti 340 bp se od DNA plazmidů oddělí preparativní elektroforézou na 1,2% agarózovém gelu. DNA se z agarózového gelu vymývá na Whatmanově filtračním papíru DE-81, DNA se z tohoto materiálu vymyje pufrem s vysokým obsahem solí. Pak se DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu a dvojím srážením ethanolem.
6. Uložení fragmentu s obsahem řetězce promotoru do plazmidů s obsahem spojovníku s větším počtem míst působení restrikčních enzymů
Plazmid pSP165 (Promega Biotec), obsahujíc řetězec spojovníku s obsahem následujících míst působením restrikčních endonukleáz: EcoRI, Sací, Smál, Aval, BanHI, Bgin, Sáli, Pstl, Hindm se linearizuje působením restrikčního enzymu EcoRI. Reakce se provádí v celkovém objemu 50 mikrolitrů při použití konečné koncentrace DNA plazmidů 1 pg/gl. Pak se přidá 50 jednotek enzymu EcoRI a směs se inkubuje 3 hodiny při teplotě 37 °C, štěpení se pak kontroluje elektroforézou na agarózovém gelu. Reakce se zastaví přidáním 1 mikrolitrů 0,5 M EDTA a DNA se vysráží při konečné koncentraci 0,3 M octanu sodného a 3 až 4 objemů ethanolu, srážení se provádí 30 minut při teplotě -80 °C. Vysrážená DNA se rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.
mikrolitry DNA plazmidů se smísí s 10 mikrolitry fragmentu DNA, obsahujícího řetězec promotoru U2 a oba fragmenty se naváží v celkovém objemu 25 mikrolitrů pufru k provedení vazby, obsahujícího dvě jednotky T4-DNA-ligázy a 2-mM ATP, vazba probíhá přes noc při teplotě 14 °C. Pak se DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu, pak se dvakrát vysráží ethanolem a rozpustí v 10 mikrolitrech destilované vody. Výsledná vazná zakončení po štěpení EcoRI a Apal se převedou na zarovnané konce a provede se další vazba. Postup se provádí tak, že se vazná zakončení převedou na zarovnaná zakončení reakcí s nukleázou z bobů následujícím způsobem: k 25 mikrolitrům DNA o koncentraci 1 pg/μΐ se v reakčním pufru přidá 20 jednotek enzymu v konečné koncentraci glycerolu 1 % a v konečném reakčním objemu 35 mikrolitrů. Směs se inkubuje 30 minut při teplotě 30 °C a pak se DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu s následným dvojím vysrážením ethanolem. Pak se DNA znovu rozpustí v 5 mikrolitrech destilované vody. Výsledné zarovnané konce se naváží v 15 mikrolitrech
- 15CZ 290233 B6 reakčního objemu, užije se lOx vyšší množství P4-DNA-ligázy bez svrchu a 2 mM ATP, vazba probíhá přes noc při teplotě 14 °C.
Pak se směs, v níž probíhá vazba přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk pro příjem DNA. Po uložení DNA do bakteriálních buněk se buňky nanesou na plotny LB-agaru, obsahujícího 50 mikrogramů/ml ampicillinu, užije se objem 50 až 300 mikrolitrů buněčné suspenze na jednu plotnu. Pak se agarové plotny inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Jednotlivé izolované bakteriální kolonie se sledují na přítomnost plazmidu, obsahující požadovaný fragment promotoru U2. Výsledný plazmid se z bakteriálních buněk izoluje a provádí se jeho charakteristika analýzou s použitím restrikčních enzymů.
7. Vazba syntetického oligo-DBA-nukleotidu 89 (řetězec ID č. 30) a fragment MT-promotoru o velikosti 4,5 kb
Fragment o velikosti 4,5 kb popsaný ve stupni 1, obsahující MT-promotor a zbytek pBR se vzájemně váže na syntetický oligonukleotid 89 (řetězec ID č. 30). Vazná směs se pak přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk, aby došlo k příjmu DNA těmito buňkami. Pak se buněčná suspenze nanese na plotny a po inkubaci se jednotlivé izolované bakteriální kolonie sledují na přítomnost požadovaného plazmidu. Přítomnost tohoto plazmidu je možno prokázat rozštěpením působením restrikčních endonukleáz EcoRI a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, jedné o velikosti 2,0 kb a druhé s velikostí 2,6 kb.
8. Vazba syntetického oligonukleotidu 101 (řetězec ID č. 32) na plazmid, popsaný ve stupni 7
Plazmid, popsaný v předchozím stupni se rozštěpí působením enzymů Bgin a BamHI a oddělí se fragment, obsahující 13 nukleotidů a popsaný ve stupni 1. Výsledný fragment, který obsahuje první oligonukleotid 89 (řetězec ID č. 30) se naváže na oligonukleotid 101 (řetězec ID č. 32), fragment BglII-BamHL Po příjmu DNA bakteriálními buňkami a inkubací se jednotlivé buňky sledují na přítomnost požadovaného plazmidu. Přítomnost tohoto nového plazmidu je možno prokázat štěpením působením endonukleáz EcoRI a Xbal nebo EcoRI a Bgin.
9. Vazba syntetického DNA-oligonukleotídu 99 (řetězec ID č. 31) na fragment o velikosti 4,4 kb, popsaný ve stupni 1
Fragment o velikosti 4,5 kb po štěpení enzymy BglII-BamHI se naváže na DNA-oligonukleotid 99 (řetězec ID č. 31). Po uložení do bakteriálních buněk a inkubaci se analyzují jednotlivé bakteriální kolonie, které obsahují různé molekuly DNA. Požadovaný plazmid je možno prokázat rozštěpením působením restrikčního enzymu EcoRI, při němž vznikají dva fragmenty, s velikostí 1,9 kb a 2,7 kb a také positivní linearisací při použití restrikčního enzymu BglU nebo BamHI.
Nový plazmid se pak rozštěpí působením enzymu Pstl a BamHI. Očekává se vznik dvou molekul, jedné s fragmentem o velikosti 2,6 kg s obsahem zbytku pBR, MT-promotoru a oligonukleotidu, druhou molekulou je zbytek pBR o velikosti 2,0 kb. Fragment s velikostí 2,6 kb se izoluje.
10. Vazba fragmentu plazmidu, popsaného ve stupni 9 o velikosti 2,6 kb na fragment, izolovaný z plazmidu ze stupně 8
Plazmid, popsaný ve stupni 8 a obsahující DNA-oligonukleotidy 89 a 101 (řetězce ID č. 30 a 32) se rozštěpí působením restrikčních enzymů Pstl a BglII. Očekává se vznik dvou fragmentů. První fragment s velikostí 2,5 kb obsahuje zbytek pBR a MT-promotor a fragment s velikostí 2,2 kb obsahuje zbytek pBR a oba svrchu uvedené oligonukleotidy.
Fragment s velikostí 2,2 kb se oddělí a naváže na fragment s velikostí 2,6 kb, obsahující zbytek pBR, MT-promotor a oligonukleotid 99 (řetězec ID č. 31), popsaný ve stupni 8.
-16CZ 290233 B6
Po analýze jednotlivých bakteriálních kolonií na přítomnost požadovaného plazmidu je možno plazmid charakterizovat štěpením pomocí restrikčních endonukleáz BtlU-Xba. Očekává se vznik dvou fragmentů, jednoho o velikosti 270 bp s obsahem oligo-DNA-nukleotidů a druhého s velikostí 4,5 kb, který obsahuje MT-protomoto a pBR.
11. Vazba fragmentu HBV o velikosti 2,3 kb po štěpení enzymem BglII-BglII
Z DNA, obsahující HBV se izoluje fragment o velikosti 2,3 kb po štěpení enzymem Bgin-BglU, obsahující oblasti HBV pre-Sl, pre-S2 a Sjako kódové oblasti. Fragment s velikostí 2,3 kb se pak naváže na fragment s velikostí 4,5 kb, získaný podle stupně 1 a obsahující methallothioneinový promotor.
mikrolitry fragmentu o velikosti 2,3 se smísí se 3 mikrolitry fragmentu s velikostí 4,5 kb a vazba probíhá v celkovém objemu 10 mikrolitrů pufru k provedení vazby s obsahem 2 jednotek T4-DNA-ligázy a 2 mM ATP přes noc při teplotě 14 °C.
Pak se směs po ukončené vazbě přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk pro příjem DNA. Bakteriální buňky se pak nanesou na plotny LB-agaru s obsahem 50 mikrogramů/ml ampicilinu, užije se 50 až 300 mikrolitrů buněčné suspenze na jednu plotnu. Pak se agarové plotny inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Jednotlivé izolované bakteriální kolonie se pak sledují na přítomnost plazmidu, obsahujícího požadovaný fragment.
12. Přeměna části řetězce genu HBV epitopy jádra HBV
Plazmid, získaný ve stupni 11 se rozštěpí působením endonukleáz Bgin a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, a to fragmentu o 550 bp a fragmentu o velikosti 6,25 kb, který se izoluje elektroforézou na agarózovém gelu.
Pak se fragment s velikostí 6,25 kb naváže n fragment s velikostí 270 bp z plazmidu, popsaného ve stupni 10 po rozštěpení enzymy Bgin a Xbal a po izolaci fragmentu svrchu uvedeným způsobem. Fragment o velikosti 270 bp je kódovým řetězcem pro epitop jádra genu HBV.
Směs po provedené vazbě se přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk pro příjem DNA. Po inkubaci se jednotlivé izolované bakteriální kolonie sledují na přítomnost požadovaného plazmidu. Přítomnost nového plazmidu je možno prokázat jeho rozštěpení pomocí enzymu BamHI. Očekává se vznik 3 molekul s velikostí 950 bp, 450 bp a 5150 bp.
13. Příprava „nosného“ plazmidu
Plazmid ze stupně 11 se rozštěpí působením enzymů EcoRI a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, s velikostí 2450 bp a 4350 bp, tyto fragmenty se izolují elektroforézou na gelu.
Fragment s velikostí 4350 bp se naváže na oligo-DNA-nukleotid 39 (řetězec ID č. 29) jde o kódový řetězec, který je úplný řetězcem pro gen HBV-S od kodonu ATG až do místa působení enzymu Xbal, v řetězci byl kodon ATG nahrazen kodonem ATA.
14. Epitop jádra proti směru exprese úplného genu HBV-S „Nosný“ plazmid, získaný v předchozím stupni se rozštěpí působením enzymů Pstl a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, zbytku plazmidu s velikostí 600 bp a fragmentu s velikostí 3850 bp, který se izoluje a naváže na fragment 2800 bp (2700 bp), izolovaný po rozštěpení plazmidu ze stupně 10 působením enzymů Pstl-Xbal.
-17CZ 290233 B6
Po zavedení plazmidů do bakteriálních buněk, inkubaci a pěstování na agaru je možno požadovaný plazmid charakterizovat štěpením restrikčními endonukleázami EcoRI a Xbal nebo EcoRI a BglH a BamHI.
15. Uložení označení, usnadňujícího selekci
Plazmid ze stupně 14 se linearizuje působením enzymu EcoRI. Reakce se provádí v celkovém objemu 50 mikrolitrů při konečné koncentraci DNA plazmidů 1 pg/μΐ. Přidá se 50 jednotek enzymu EcoRI a po provedení štěpné reakce inkubací 3 hodiny při teplotě 37 °C se materiál analyzuje elektroforézou na agarózovém gelu.
Reakce se zastaví přidáním 1 mikrolitrů 0,5 M EDTA a pak se DNA vysráží octanem sodným do konečné koncentrace 0,3 M a 3 až 4 objemy ethanolu 30 minut při teplotě -80 °C. Vysrážená DNA se rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vodě.
mikrolitry linearizovaného plazmidů se smísí se 3 mikrolitry fragmentu DNA, obsahujícího methallothioneinový promotor a selekční gen pro odolnost proti neomycinu, popsaný ve stupni 4 a nechá se proběhnout vazba. Jednotlivé bakteriální kolonie s obsahem získaného materiálu se analyzují na přítomnost požadovaného plazmidů, který se pak izoluje, čistí a charakterizuje.
Každá svrchu uvedená konstrukce genu může být vytvořena také při použití U2-promotoru tak, že se fragment DNA, obsahující MT-promotor po rozštěpení enzymy EcoRI a BglH nahradí fragmentem DNA, obsahujícím U2-promotoru po rozštěpení týmiž enzymy.
16. Izolace selekčního genu pro xanthinguaninfosforibosyltransferázu (egpt) z E. coli
Fragment, obsahující selekční gen egpt, se izoluje po rozštěpení plazmidů pMSG působením BamHI a Bgin a získaný fragment o velikosti 1,8 kb se naváže na fragment o 4,5 kb, popsaný ve stupni 1 (BglII-BamHI), který obsahuje MT-promotor.
Materiál se užije k uložení do buněk, vzniklé kolonie se analyzují na přítomnost plazmidů, který se izoluje, čistí a nakonec se místo působení enzymu BamHI převede na místo působení enzymu EcoRI.
17. Izolace požadovaných řetězců DNA pomocí PCR
Fragment DNA o velikosti 400 bp se izoluje elektroforézou na gelu. Vzniká při použití PCR podle příkladu 5 a specifických oligonukleotidů 131 až 132 (řetězce ID č. 33 až 34) jako primerů.
Fragment DNA se rozštěpí působením endonukleáz BamHI a Xbal a pak se čistí elektroforézou na gelu. Izolovaný PCR-fragment se naváže na fragment s velikostí 6,25 kb, izolovaný z plazmidů, popsaného ve stupni 13 po rozštěpení enzymy BglH a Xbal. Po příjmu DNA a transformaci bakteriálních buněk se analyzují jednotlivé bakteriální kolonie na přítomnost požadovaného plazmidů.
18. Uložení označení pro selekci
Plazmid, popsaný ve stupni 17 se ještě upraví přidáním selekčního genu, popsaného ve stupni 15.
19. Izolace promotoru H2K
Promotor H2K se izoluje tak, že se plazmid pSP65H2 (Exogene) rozštěpí působením endonukleáz EcoRI a BglII a fragment o velikosti 2 kb se izoluje.
-18CZ 290233 B6
Ve všech svrchu uvedených konstrukcích je možné všechny promotory vzájemně zaměnit ve formě fragmentů po působení enzymů EcoRI/BglII.
20. Přeměna části řetězce genu HBV
Plazmid ze stupně 11 se rozštěpí působením endonukleáz BglI a Xbal. Očekává se získání 2 molekul, z nichž jednou je fragment o velikosti 6250 kb, který se izoluje po elektroforéze na agarózovém gelu.
Fragment o velikosti 6250 kb se naváže na oligo-DNA nukleotid 23 (řetězec ID č. 28). Vazná směs se přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk, aby došlo k příjmu DNA. Pak se jednotlivé izolované bakteriální kolonie analyzují na přítomnost požadovaného plazmidu. Přítomnost nového plazmidu je možno prokázat rozštěpením endonukleázami EcoRI aBgin, při němž mají vzniknout dvě molekuly, jedna s velikostí 1,9 kb a druhá s velikostí 4450 kb.
21. Uložení selekčního označení egpt
Plazmid, popsaný ve stupni 20, se linearizuje působením enzymu EcoRI. Reakce se provádí v konečném objemu 100 mikrolitrů při konečné koncentraci DNA plazmidu 0,6 pg/pl. Přidá se 60 jednotek enzymu EcoRI a směs se inkubuje tři hodiny při teplotě 37 °C, ukončené štěpení se prokáže elektroforézou na agarózovém gelu. Reakce se zastaví přidáním 2 mikrolitrů 0,5 M EDTA a DNA se vysráží octanem sodným v konečné koncentraci 0,3 M a 4 objemy ethanolu při teplotě -80 °C, reakce trvá 1 hodinu. Pak se vysráží DNA rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.
mikrolitry linearizovaného plazmidu se smísí se 3 mikrolitry fragmentu DNA o velikosti 3,7 kb, který obsahuje methallothioneinový promotor a selekční gen egpt, popsaného ve stupni 16 po rozštěpení enzymem EcoRI a směs se naváže. Po uložení vzniklého materiálu do bakteriálních buněk se jednotlivé kolonie analyzují na přítomnost požadovaného plazmidu. Každý z genů, uvedených v tabulce ΙΠ je možno připravit obdobným způsobem jako v popsaných stupních 1 až 21 příkladu 3.
Příklad 4
Transfekce buněk savců
Aby bylo možno dosáhnout sekrece většího množství peptidů HBV, je nutno dosáhnout transfekce buněk savců konstrukcemi DNA. Kotransfekce byla prováděna ve dvou krocích (tj. oddělená transfekce pro každý konstrukt nebo v jednom stupni, v němž byla provedena transfekce oběma konstrukty současně). Současnou transfekci bylo možno provést buď s použitím selekčního značení na obou konstruktech, nebo průkazem sekrece produktů exprese obou konstruktů imunologickými zkouškami.
Je také možno postupovat tak, že se spojí do jediné konstrukce řetězce, který je kódem pro řetězec peptidu HBV podle vynálezu a další řetězec, který je kódem pro úplnou bílkovinu oblasti S nebo j ádra nebo HAV:
-19CZ 290233 B6
Příklad 5
Řetězová reakce se použitím polymerázy (PCR)
Při PCR-reakci je možno dosáhnout amplifikace specifických nukleotidových řetězců DNA nebo zvolené oblasti řetězce známého genomu in vitro více než miliónkrát, jak bylo popsáno v publikacích Thomas J. White, Norman Amleim, Henry A. Erlich, 1989, The polymerase chain reaction. Technical Focus, sv. 5, č. 6, S. Kwok a R. Higuchi 1989, Avoiding falše positives with PCR. nátuře, sv. 339, str. 237-238.
DNA, izolovaná z buněk nebo DNA plazmidu se zpracovává tak, aby bylo možno oddělit její komplementární řetězce. Tyto řetězce se pak spojí s přebytkem dvou DNA-oligonukleotidů s délkou vždy 20 až 25 párů bází, které byly chemicky syntetizovány tak, aby odpovídaly řetězcům X nukleotidů, kde X je obvykle 50 až 2000 párů bází.
Oba nukleotidy jsou použity jako specifické primery pro syntézu DNA in vitro, katalyzovanou DNA-polymerázou, při níž dochází ke vzniku kopií DNA mezi oběma řetězci, odpovídajícími použitým dvěma oligonukleotidům. V případě, že oba oligonukleotidy, použité jako primery obsahují příslušné řetězce, je možno vytvořit nová místa štěpení a obou zakončeních 5' a 3'.
Po mnohonásobném opakování reakčních cyklů je možno získat velké množství fragmentu DNA s požadovanou délkou tento fragment je pak možno čistit elektroforézou na gelu a prokázat jeho vlastnosti štěpením působením restrikčních enzymů a elektroforézou na agarózovém gelu. Amplifikovaný, čištěný fragment DNA je pak možno použít k vazbě na další fragmenty nebo plazmidy.
PCR-fragmenty DNA se amplifikují s zarovnaným zakončením. Aby bylo možno získat zakončení, vhodná pro následující vazbu, je nutno fragment rozštěpit požadovanou endonukleázou a pak znovu čistit.
PCR-reakci je možno uskutečnit ve 20 až 30 cyklech. Každý z těchto cyklů se dělí na tři stupně, které se provádějí po různou dobu při odlišných reakčních teplotách, které jsou řízeny automatickým zařízením, PCR-thermo-cyckler. Prvním stupněm je denaturace matrice DNA (1 minuta při 95 °C), druhým stupněm hydridisace této DNA a primerů (1 minuta při 55 °C), třetím stupněm je polymerace (2 minuty při 72 °C).
Konečný objem pro jednu zkoušku je 30 mikrolitrů v následujících konečných koncentracích: PCR-pufr lx, směs nukleotidů s obsahem 200 mikroM každého ze čtyř nukleotidů, 200 ng každého ze dvou primerů ve 30 mikrolitrech a 0,5 jednotky Taq-polymerázy ve 30 mikrolitrech bidestilované vody.
Příklad 6
Pěstování buněk po transfekci a sekrece bílkoviny
Buňky po transfekci (C127 nebo CHO, ATCC) se naočkují na běžné růstové prostředí DMEM s 10 % fetálního telecího séra, glukosou a glutaminem v Petriho miskách v množství 1 až 2 x 106 buněk na misku s průměrem 10 cm ve dni 1. Následujícího dne se prostředí odstraní 4 hodiny před přidáním sraženiny DNA k buňkám a buňky se dvakrát promyjí lx PBS. Pak se přidá 8 ml prostředí DMEm bez fetálního telecího séra (FCS) a po 4 hodinách se k buňkám přidá vysrážená DNA, připravená dále uvedeným způsobem. Po dalších 4 hodinách se prostředí znovu odstraní a přidají se 3 ml prostředku Glycerol-Mix (50 ml 2 x TBS pufru, 30 ml glycerolu a 120 ml destilované vody). Směs se inkubuje 3 minuty při teplotě 37 °C, pak se prostředí okamžitě odstraní a buňky se promyjí 1 x PBS. Pak se buňky pěstují přes noc v 8 ml prostředí DMEM s 10 % FCS.
-20CZ 290233 B6
Po 48 hodinách se buňky od plotny oddělí působením roztoku trypsinu a EDTA (0,025 % trypsinu + 1 mM EDTA). Pak se buňky promyjí 1 x PBS k odstranění tiyprisnu a EDTA, uvedou se do suspenze v prostředí DMEM s 10 % FCS a rozdělí na plotny s 24 vyhloubeními tak, že se buňky z jedné misky rozdělí do 4 těchto ploten.
V případě, že buňky dobře rostou, přidá se selekční prostředí (0,5 až 1 mg/ml neomycinu nebo 250 pg/ml xanthinu, 15 pg/ml hypoxanthinu a 25 pg/ml adeninu, 10 pg/ml thymidinu, 2 pg/ml aminopterinu, 25 pg/ml kyseliny mykofenolové v případě eco-gpt. Prostředí se mění každý týden. Po dvou týdnech je možno pozorovat růst prvních kolonií buněk.
K 10 mikrogramům DNA plazmidu a 20 mikrogramům DNA jako nosiče (DNA ze spermatu lososa nebo z telecího brzlíku) se přidá pufr TE (10 mM tris-HCl a 1 mM EDTA, pH 7,05) do konečného objemu 440 mikrolitrů a přidá se 60 mikrolitrů 2M chloridu vápenatého. Pak se přidá ještě stejné množství 2 x TBS (Hepes 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,05) a směs se dobře promíchá. Tento roztok se inkubuje 30 minut při teplotě 37 °C a pak se přímo přidá k buňkám, určeným pro transfekci.
Příklad Ί
Příprava pomocného prostředku z čištěných částic
K požadované koncentraci antigenu v suspenzi ve sterilním fyziologickém roztoku se přidá Thimerosol v objemovém poměru 1:10 000, dále 1/10 objemu filtrací sterilizovaného 0,2 M roztoku KAld(SO4) x 12H2O. Pak se upraví pH na 5,0 přidáním IN sterilního roztoku hydroxidu sodného a suspenze se míchá 3 hodiny při teplotě místnosti. Antigen, vysrážený hlinitou sloučeninou se oddělí odstředěním 10 minut při 2000 ot/min, uvede se znovu do suspenze a IN roztoku chloridu sodného s obsahem 1:10 000 Thiomerosolu a pak se za sterilních podmínek dělí na jednotlivé podíly.
Příklad 8
Čištění antigenu jádra viru hepatitidy B
Supematant buněk, vylučujících antigen jádra HB se oddělí a koncentruje ultrafiltrací. Koncentrát se vyčeri odstředěním 15 minut při 20 000 ot/min a teplotě 4 °C při použití rotoru SW28 (Beckman).
Tvorba částic se zkouší odstředěním při použití gradientu 0 až 45 % sacharózy a téhož rotoru 24 hodin při 28 000 ot/min a teplotě 4 °C. Gradient se podrobí frakcionaci a frakce se analyzují zkouškou ELISA.
Příklad 9
V následujících tabulkách jsou uvedeny výsledky zkoušky ELISA s imunogenními částicemi podle vynálezu následujícím způsobem.
V následující tabulce IV jsou uvedeny údaje pro čištěné částice antigenu HBs, získané při použití jakékoliv konstrukce řetězce HBV podle vynálezu včetně epitopů pre-Sl a oblasti S s použitím anti-pre-Sl-monoklonální protilátky MA 18/7 a anti-HBs-monoklonální protilátky G022.
V následující tabulce IV jsou uvedeny frakce, které byly získány při použití gradientu CsCl.
-21 CZ 290233 B6
Tabulka VI-1 gradient CsCl frakce č.
zkouška ELISA (E=492) monoklonální protilátka 18/7
0,092
0,210
0,388
1,662
2,604
0,648
0,031
Tabulka IV-2 gradient CsCl frakce č.
zkouška ELISA (E=492) monoklonální protilátka G022
0,136
0,426
0,822
1,970
2,954
0,967
0,076
V tabulce V jsou uvedeny výsledky zkoušky ELISA s čištěnými částicemi antigenu jádra HB z jakékoliv konstrukce řetězce jádra HB podle vynálezu s polyklonálními protilátkami proti jádru HB a monoklonální protilátkou G022.
Tabulka V-l sacharózový gradient frakce č.
Tabulka V-2 zkouška ELISA (E=492) polyklonální protilátky
0,25
0,922
1,423
1,5
1,5
1,28
0,466 sacharózový gradient frakce č. zkouška ELISA (E=492) monoklonální protilátka G022 proti _______________________________________HB-S-Ag________________ 6 0,020
0,024
0,018
0,011
0,015
0,020
0,022
-22CZ 290233 B6
Příklad 10
Zkoušky s podáváním prostředku Hepa-Care u šimpanzů
Hepa-Care jsou částice s povrchovým antigenem viru hepatitidy B (SI a S2) ve specifickém zpracování v poměru 50 : 50, tento prostředek je možno použít k léčení chronických nosičů viru hepatitidy.
Pokus 1
Šimpanzovi 1, který byl nosičem viru hepatitidy B, byl nitrosvalově podán prostředek Hepa-Care v časovém období 0, 4 a 8 týdnů, vždy v dávce 18 mikrogramů v jedné injekci.
Pak byly sledovány jatemí enzymy, výsledek je znázorněn na obr. IV a množství antigenu hepatitidy B v séru, jak je znázorněno na obr. V.
Pokus 2
Šimpanz 1 byl po ošetření, provedeném podle pokusu 1 ještě léčen dalšími injekcemi, které byly podávány v týdnu 30, 34 a 38. Výsledky tohoto léčení jsou uvedeny na obr. VI.
Pokus 3
Šimpanzovi 2 byl podáván prostředek Hepa-Care, avšak prostředek byl podán nitrožilně vždy v dávce 2 mg. Výsledky jsou znázorněny na obr. VIL
U kontrolního šimpanze 3 byly rovněž sledovány jatemí enzymy, výsledek je znázorněn na obr. Vm.
Příklad 11
Léčení prostředkem Hepa-Care (složení prostředkuje popsáno v příkladu 10)
Pacient 1 (muž, 65 let, nemocí trpí 2 roky):
parametry hepatitidy B: HBsAg pos.
anti-HBs neg.
HBeAg neg.
anti-HBe pos.
anti-HBc neg.
Nemocnému byl nitrosvalově podán prostředek Hepa-Care v měsíci 0, 1, 6 a 7. Výsledky měření množství antigenu a protilátky jsou uvedeny na obr. IX a X.
Pacient 2 (žena, 48 let, onemocnění trvá 12 let):
parametry hepatitidy B: HBsAgpos.
HbeAgneg.
anti-HBsneg.
anti-HBepos.
anti-HBcpos.
-23CZ 290233 B6
Nemocné byl nitrosvalově podán prostředek Hepa-Care v měsíci 0, 1 a 6. Výsledky měření množství antigenu a protilátky jsou uvedeny na obr. XI a ΧΠ.
Pacient 3 (žena, 41 let, onemocnění trvá 5 let):
parametry hepatitidy B: HBsAg pos.
HBeAg neg.
anti-HBs neg.
nati-HBe pos.
Nitrosvalově byl podáván Hepa-Care v měsíci 0, 1, 2 a 5. Hodnoty antigenu a protilátky jsou uvedeny na obr. ΧΠ a XTV.
Seznam řetězců řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
558 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
AGA | TCT | CAA | TCT | CGG | GAA | TCT | CAA | TGT | TAG |
-24CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce:
řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
504 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace
ATG ACT | GAC GTG | ATT. GAG | GAC TTA | CCT CTC | tat TCG | AAA TTT | GAA TTG | TTT CCT | GGA TCT | GCT GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
T^C | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AÁT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | GAC | CGA | |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC | AGA | CGT |
-25CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce:
řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
504 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifíkace
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | ccc | TCG | CCT |
CGC AGA CGT
-26CZ 290233 B6
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: 5 řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj: | 4 nukleotid 534 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace | ||||
TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT |
UUU | AGG | TCC | Λ | AGA | AGA |
10 | AGA | CGT |
GGG | TGG | CTT | TGG | GGC |
AAA | GAA | TTT | GGA | GCT j |
TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ku A | AAT | AAT | TTG | CAA |
CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
-27CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
534 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace
TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT' | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | ’ TTT | |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | TAT | |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
um* | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | ccc | TCG | CCT |
CGC AGA CGT
-28CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG ACT CTA GCT ACC TGG GTG
GGC AAT AAT TTG GAA GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG
TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTC TTT CCT TCC GTC AGG řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid 114bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
TCC | AAC | TTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | ATG |
GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | DAA | GGA | GCT | ACT | |
GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC | TTC |
TTT | CCT | TCC | GTC | AGG |
-29CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
GAT | CTC | CTA | GAC | ACC | GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA |
GAA | GCC | TTA | GAG | TCT | CCT | GAG | CTA | TGC | TCA | CCT |
CAC | CAT | ACT | GCA | CTC | AGG | CAA | GGT |
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj : pokusný zdroj:
nukleotid
261 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTC | AGG | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CTA | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GGT | ATC | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TGG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGC | AAT | AAT | TTG | GAA |
GAT | CCA | GCA | TCT | AGG | GAC | CTT | GTA | GTA | AAT |
-30CZ 290233 B6
řetězec ID č. | 11 |
typ řetězce: | nukleotid |
délka řetězce: | 291 bp |
řetězec: | jednoduchý |
topologie: | lineární |
typ molekuly: | DNA genomu |
původní zdroj: | jádro HBV |
pokusný zdroj: | chemická syntéza |
TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTC | AGG | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CTA | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GGT | ATC | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TGG | ATG |
AÓT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGC | AAT | AAT | TTG | GAA |
GAT | CCA | GCA | TCT | AGG | GAC | CTT | GTA | GTA | AAT |
io řetězec ID č. | 12 |
typ řetězce: | nukleotid |
délka řetězce: | 123 bp |
řetězec: | jednoduchý |
topologie: | lineární |
15 typ molekuly: | DNA genomu |
původní zdroj: | jádro HBV |
pokusný zdroj: | chemická syntéza |
ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA | GAT | CCA | GCA |
TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT | GTT | AAT | ACT |
AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA | CTA | TTG | TGG |
TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
-31 CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: s řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
138 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT | GTT | AAT |
ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA | CTA | TTG |
TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT | GGA | AGA |
GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT | TTC | GGA |
GTG TGG
-32CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
294 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S2 ayw/adw DNA HBV
ATG CAA | CAG GAT | TGG CCC | AAT AGA | TCC GTG | AGA AGA | ACC GGC | TTC CTG | CAC TAT | CAA TTC | ACT CGT | CTG GCT |
GGT | GGC | TCC | AGT | TCA | GGA | ACA | GTA | AAC | CCT | GTT | CTG |
ACT | ACT | GCC | TCT | CCC | TTA | TCG | TCA | ATC | TTC | TCG | AGG |
ATA | GAG | AAC | ATC | ACA | TCA | GGA | TTC | CTA | GGA | CCC | CTT |
CTC | GTG | TTA | CAG | GCG | GGG | TTT | TTC | TTG | TTG | ACA | AGA |
ATC | CTC | ACA | ATA | CCG | CAG | AGT | CTA | GAC | TCG | TGG | TGG |
ACT | TCT | CTC | AAT | TTT | CTA | GGG | GGA | ACT | ACC | GTG | TGT |
CTT | GGC | CAA | AAT | TCG | CAG | TCC | TCA | ACC | TCC | AAT | CAC |
TCA | CCA | ACC | TCT | TGT | CCT | CCA | ACT | TGT | CCT | GGT | TAT |
CGC | TGG | ATG | TGT | CTG | CGG | CGT | TTT | ATC | ATC | TTC | CTC |
TTC | ATC | CTG | CTG | CTA | TGC | CTC | ATC | TTC | TTG | TTG | GTT |
ctt | CTG | GAC | TAT | CAA | GGT | ATG | TTG | CCC | GTT | TGT | CCT |
CTA | ATT | CCA | GGA | TCC | TCA | ACA | ACC | AGC | ACG | GGA | CCA |
TGC | CGG | ACC | TGC | ATG | ACT | ACT | GCT | CAA | GGA | ACC | TCT |
ATG | TAT | CCC | TCC | TGT | TGC | TGT | ACC | AAA | CCT | TCG | GAC |
GGA | AAT | TGC | ACC | TGT | ATT | CCC | ATC | CCA | TCA | TCC | TGG |
GCT | TTC | GGA | AAA | TTC | CTA | TGG | GAG | TGG | GCC | TCA | GCC |
CGT | TTC | TCC | TGG | CTC | AGT | TTA | CTA | GTG | CCA | TTT | GTT |
CAG | TGG | TTC | GTA | GGG | CTT | TCC | CCC | ACT | GTT | TGG | CTT |
TCA | GTT | ATA | TGG | ATG | ATG | TGG | TAT | TGG | GGG | CCA | AGT |
CTG | TAC | AGC | ATC | TTG | AGT | CCC | TTT | TTA | CCG | CTG | TTA |
CCA | ATT | TTC | TTT | TGT | CTT | TGG | GTA | TAC | ATT |
-33CZ 290233 B6 nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
TAT | GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG |
CAA | CTA | TTG | TGG | J JŤ· | CAT | ATA | TCT | TGG | CTT | ACT |
TTT | GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC |
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
390 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace
TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC |
-34CZ 290233 B6 nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV SI ay chemická syntéza řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
AAT CCT | CGT | GGA TTC | TTT |
CCA GCC | TTC | AGA GCA | AAC |
Asn Pro | Leu | Gly Phe | Phe |
Pro Ala | Phe | Arg Ala | Asn |
řetězec ID č. | 18 | ||
typ řetězce: | nukleotid | ||
délka řetězce: | 63 bp | ||
řetězec: | jednoduchý | ||
topologie: | lineární | ||
typ molekuly: | DNA genomu | ||
původní zdroj: | HBV SI ay | ||
pokusný zdroj: | chemická syntéza |
CCC GÁT CAC CAG TTG GAT
ACC GCA
Pro Asp His Gin Leu Asp
Thr Ala
CCT | GCC | TCC | ACC | AAT | CGC |
ACC | CCG | CTG | TCT | CCA | CCT |
Pro | Ala | Ser | Thr | Asn | Arg |
Thr | Pro | Ile | Ser | Pro | Pro |
CAG TTG | TCA AGA | GGA AAC | AGG | CAG | CCT |
Gin | Ser | Gly | Arg | Gin | Pro |
Leu | Arg | Asn |
-35CZ 290233 B6 nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBVS1 ay chemická syntéza řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie; typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
GAT | CCA | GCC | TTC | AGA | GCA | AAC | ACC | GCA | AAT | CCA | GAT |
TGG | GAC | TTC | AAT | CCC | AAC | AAG | GAC | ACC | |||
Asp | Pro | Ala | Phe | Arg | Ala | Asn | Thr | Ala | Asn | Pro | Asp |
Trp | Asp | Phe | Asn | Pro | Asn | Lys | Asp | Thr |
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
108 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S1 ay chemická syntéza
CCG | CAC | GGA | GGC | CTT | TTG | GGG | TGG | AGC | CCT | CAG | GCT |
CAG | GGC | ATA | CTA | CAA | ACT | TTG | CCA | GCA | AAT | CCG | CCT |
CCT | GCC | TCC | ACC | AAT | CGC | CAG | TCA | GGA | AGG | CAG | CCT |
Pro | His | Gly | Gly | Leu | Leu | Gly | Trp | Ser | Pro | Gin | Ala |
Gin | Gly | Ile | Leu | Glu | Thr | Leu | Pro | Ala | Asn | Pro | Pro |
Pro | Ala | Ser | Thr | Asn | Arg | Gin | Ser | Gly | Arg | Gin | Pro |
-36CZ 290233 B6 nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV Sl ad chemická syntéza řetězec ID ě. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
CCT GCC | TCC | ACC AAT | CGG | CAG | TCA | GGA | AGG | CAG | CCT |
ACT CCC | ATC | TCT CCA | CCT | CTA | AGA | GAC | - X | ||
řetězec ID č. | 22 | ||||||||
typ řetězce: | nukleotid | ||||||||
délka řetězce: | 108 bp | ||||||||
řetězec: | jednoduchý | ||||||||
topologie: | lineární | ||||||||
typ molekuly: | DNA genomu | ||||||||
původní zdroj: | HBV Sl ad | ||||||||
pokusný zdroj: | chemická syntéza | ||||||||
CCA CAC | GGC | GGT ATT | TTG | GGG | TGG | AGC | CCT | CAG | GCT |
CAG GGC | ATA | TTG ACC | ACA | GTG | TCA | ACA | ATT | CCT | CCT |
CCT GCC | TCC | ACC AAT | CGG | CAG | TCA | GGA | AGG | CAG | CCT |
Pro | His | Gly | Gly | Ile | Leu | Gly | Trp | Ser | Pro | Gin | Ala |
Gin | Gly | Ile | Leu | Thr | Thr | Val | Ser | Tht | Ile | Pro | Pro |
Pro | Ala | Ser | Thr | Asn | Arg | Gin | Ser | Gly | Arg | Gin | Pro |
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
CAG TGG nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S2 ay chemická syntéza
AAT TCC AGA ACC TTC CAC CAA ACT CTG
CAA
GAT CGC AGA GŤG AGA GGC
CTG TAT
-37CZ 290233 B6
řetězec ID č. | 24 |
typ řetězce: | nukleotid |
délka řetězce: | 60 bp |
řetězec: | jednoduchý |
topologie: | lineární |
typ molekuly: | DNA genomu |
původní zdroj: | HBV S2 ay |
pokusný zdroj: | chemická syntéza |
GAT CCC AGA GTG AGA GGC CTG TAT TTC CCT GCT
GGT GGC TCC AGT TCA GGA ACA GTA AAC - X
10 řetězec ID č. | 25 |
typ řetězce: | nukleotid |
délka řetězce: | 558 bp |
řetězec: | jednoduchý |
topologie: | lineární |
15 typ molekuly: | DNA genomu |
původní zdroj: | jádro HBV adw |
pokusný zdroj: | PCR-amplifikace |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | GTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
AGA | TCT | CAA | TCT | CGG | GAA | TCT | CAA | TGT | TAG |
-38CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce:
délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: 10 pokusný zdroj :
nukleotid
678 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S adw/ayw HBV DNA
ATA | GAG | AAC | ATC | ACA | TCA | GGA | TTC | CTA | GGA | CCC | CTT | CTC |
GTG | TTA | CAG | GCG | GGG | TTT | TTC | TTG | TTG | ACA | AGA | ATC | CTC |
ACA | ATA | CCG | CAG | AGT | CTA | GAC | TCG | TGG | TGG | ACT | TCT | CTC |
AAT | TTT | CTA | GGG | GGA | ACT | ACC | GTG | TGT | CTT | GGC | CAA | AAT |
TCG | CAG | TCC | TCA. | ACC | TCC | AAT | CAC | TCA | CCA | ACC | TCT | TGT |
CCT | CCA | ACT | TGT | CCT | GGT | TAT | CGC | TGG | ATG | TGT | CTG | CGG |
CGT | TTT | ATC | ATC | TTC | CTC | TTC | ATC | CTG | CTG | CTA | TGC | CTC |
ATC | TTC | tomfe X 1 © | TTG | GTT | CTT | CTG | GAC | TAT | CAA | GGT | ATG | TTG |
ccc | GTT | TGT | CTÁ | ATT | CCA | GGA | tcc | TCA | ACA | ACC | AGC | |
ACG | GGA | CCA | TGC | CGG | ACC | TGC | ATG | ACT | ACT | GCT | CAA | GGA |
ACC | TCT | ATG | TAT | CCC | TCC | TGT | Í.V3V. | TGT | ACC | AAA | CCT | TCG |
GAC | fe fe * | AAT | TGC | ACC | TGT | ATT | CCC | ATC | CCA | TCA | TCC | TGG |
GCT | TTC | GGA | AAA | TTC | CTA | TGG | GAG | TGG | GCC | TCA | GCC | CGT |
TTC | TCC | TGG | CTC | AGT | TTA | CTA | GTG | CCA | TTT | GTT | CAG | TGG |
TTC | GTA | fefefe | femm Ci x | TCC | CCC | ACT | GTT | TGG | TCA | GTT | ATA | |
mfefe | ATG | ATG | TGG | TAT | TGG | GGG | CCA | AGT | CTG | TAC | AGC | ATC |
TTG | AGT | CCC | rp φψ- | TTA | CCG | CTG | TTA | CCA. | ATT | TTC | TTT | TGT |
CTT | áier· i <3 VI | GTA | TÁC | ATT |
-39CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce:
řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
585 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S adw/ayw DNA HBV
CTA | GAC | TCG | TGG | ACT | TCT | CTC | AAT | TTT | CTA | ||
GGA | TCT | CCC | GTG | TGT | CTT | GGC | CAA | AAT | TCG | CAG | TCC |
CCA | ACC | TCC | AAT | CAC | TCA | CCA | ACC | TCC | TGT | CCT | CCA |
ATT | TGT. | CCT | GGT | TAT | CGC | TGG | ATG | TGT | CTG | CGG | CGT |
TTT | ATC | ATA | TTC | CTC | TTC | ATC | CTG | CTG | CTA | TGC | CTC |
ATC | TTC | TTA | TTG | GTT | CTT | CTG | GAT | TAT | CAA | GGT | ATG |
TTG | CCC | GTT | TGT | CCT | CTA | ATT | CCA | GGA | TCA | ACA | ACA |
ACC | AGT | ACG | GGA | CCA | TGC | AAA | ACC | TGC | ACG | ACT | CCT |
GCT | CAA | GGC | AAC | TCT | ATG | TTT | CCC | TCA | TGT | TGC | TGT |
ACA | AAA | CCT | ACG | GAT | GGA | AAT | TGC | ACC | TGT | ATT | CCC |
ATC | CCA | TCG | TCC | TGG | GCT | TTC | GCA | AAA | TAC | CTA | TGG |
GAG | TGG | GCC | TCA | GTC | CGT | TTC | TCT | TGG | CTC | AGT | TTA |
CTA | GTG | CCA | TTT | GTT | CAG | TGG | TTC | GTA | GGG | CTT | TCC |
CCC | ACT | GTT | TGG | CTT | TCA | GCT | ATA | TGG | ATG | ATG | TGG |
TAT | TGG | GGG | CCA | AGT | CTG | TAC | AGC | ATC | GTG | ÁGT | CCC |
TTT | ATÁ | CCG | CTG | TTA | CCA | ATT | TTC | TTT | TGT | CTC | TGG |
GTA | TAC | ATT |
-40CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
106 bp jednoduchý lineární
DNA genomu
HBVS1 chemická syntéza
5'-GAT-CTT-TAA-CAT-GGA-GAA-CAA-TCC-TCT-G GG-ATT-CTT-TCC-CGA-TCA-CAA-GTT-GGA-TCC-A gc-ctt-cag-agc-aaa-cac-cgc-aaa-tcc-aga-t TG-GGA-CTT-CAA-TCC-CAG“ CT') - 3* nukleotid
115 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBVS chemická syntéza
5'-AAT-TCT-AGA-CTC-GAG-TCT-GAA-CAT-AGA-G AA-CAT-CAC-ATC-AGG-ATT-CCT-AGG-ACC-CCT-T CT-CGT-GTT-ACA-GGC-GGG-GTT-TTT-CTT-GTT-G AC-AAG-AAT-CCT-CAC-AAT-ACC-GCA-GAG-(C)-3' nukleotid
108 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
5*-GAT-CTT-TTA-AAG-GGA-TCC-TCT-GCT-GGG-G gg-aat-gga-tga-ctc-tag-cta-cct-ggg-tgg-g
CA-ATA-ATT-TGG-AAG-ATC-CAG-CAT-CTA-GGG-A
CC-TTG-TAG-TAA-ATC-TAG-AC- (A)-3*
-41 CZ 290233 B6 řetězec LD č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
řetězec LD č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
řetězec DD č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
106 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza ' -GAT-CTC-CGG-GAA-TTC-CTG-GGG-CAT-GGA-C
AT-TGA-CCC-TTA-TAA-AGA-ATT-TGG-AGC-TAC-T
GT-GGA-GTT-ACT-CTC-GTT-TTT-GCC-TTC-TGA-C
TT-CTT-TCC-TTC-CGT-CAG- (G) -3' nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
5'-gat-ctc-cta-gac-acc-gcc-tca-gct-ctg-t
AT-CGA-GAA-GCC-TTA-GAG-TCT-CCT-GAG-CAT-T
GC-TCA-CCT-CAC-CAT-ACT-GCA-CTC-AGG-CAA-G “(G)-3* nukleotid bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza i '-TTG-GAT-CCT-CCA-ACC-TGT-GCC-TTG G ) -3 '
-42CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
5'-CCT-CTA-GAA-CCA-AAT-ATT-CAA-GTA-(C)-3
10 řetězec ID č. | 35 |
typ řetězce: | nukleotid |
délka řetězce: | 588 bp |
řetězec: | jednoduchý |
topologie: | lineární |
15 typ molekuly: | DNA genomu |
původní zdroj: | jádro HBV |
pokusný zdroj: | chemická syntéza |
TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
CTA | TTG | TGG | T xT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
AGA | TCT | CAA | TCT | CGG | GAA | TCT | CAA | TGT | TAG |
-43CZ 290233 B6
Claims (19)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití kombinacea) alespoň jednoho polypeptidového řetězce, obsahujícího alespoň jeden antigenní epitop pro aktivaci T-buněk viru hepatitidy ab) nosiče, schopného umožnit účinek polypeptidových řetězců a) s antigenním epitopem, přičemž polypeptidové řetězce a) mohou být na nosič b) vázány kovalentní nebo hydrofobní vazbou, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chronické virové hepatitidy.
- 2. Použití kombinace podle nároku 1, kde polypeptidovým řetězcem a) nebo polypeptidovými řetězci a) j sou polypeptidy viru hepatitidy B.
- 3. Použití kombinace podle nároku 1 a 2, kde každým polypeptidovým řetězcem a) přítomným v prostředku je řetězec aminokyselin zvolený ze skupiny, zahrnující peptidy pre Sl, pře S2, S a antigeny jádra viru HB.
- 4. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 3, kde polypeptidové řetězce a) v nativní formě mohou být modifikovány některým z následujících způsobů:i) je možno vypustit některé části řetězce, přičemž musí být zachován epitop, který obsahuje alespoň šest po sobě následujících zbytků aminokyselin, ii) jednu nebo větší počet aminokyselin jev řetězci možno nahradit, nebo iii) je možno přidat další aminokyseliny nebo řetězce aminokyselin na N-terminálním nebo na C-terminálním zakončení nebo také uprostřed polypeptidového řetězce nebo řetězců a).
- 5. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 4, kde polypeptidový řetězec a) je myristylován.
- 6. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 5, kde polypeptidový řetězec nebo řetězce a) jsou produktem exprese rekombinantní molekuly DNA.
- 7. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6, kde řetězcem nosiče b) je polysacharid, hydrofobní polymer nebo anorganická molekula v částicové formě.
- 8. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6, kde řetězcem nosiče b) je další polypeptidový řetězec.
- 9. Použití kombinace podle nároku 8, kde polypeptidový řetězec nosiče b) po své sekreci vytváří částice, které mají průměr alespoň 10 nm.
- 10. Použití kombinace podle nároků 8 nebo 9, kde polypeptidovým řetězcem nosiče b) je podstatná část nebo úplný řetězec aminokyselin polypeptidů ze skupiny S-peptidu HBV, peptidu jádra HBV, antigenu jádra HAV nebo antigenu jádra HIV nebo také povrchového antigenu viru dětské obrny, nebo některého z virů HAV nebo HTV.-44CZ 290233 B6
- 11. Použití kombinace podle některého z nároků 8 až 10, kde polypeptidový řetězec nosiče b) je modifikován některým z následujících způsobů:i) vypuštění některých částí, přičemž schopnost vytvářet částice musí být zachovány, ii) náhradou j edné nebo několika aminokyselin j inými aminokyselinami, nebo nebo uprostřed polypeptidového řetězce nosiče b).
- 12. Použití kombinace podle některého z nároků 8 až 11, kde polypeptidový řetězec nosiče b) je myristylován.
- 13. Použití podle některého z nároků 8 až 12, kde polypeptidový řetězec nosiče b) je produktem exprese rekombinantní DNA.
- 14. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6, nebo 8 až 12, kde polypeptidové řetězce a) a polypeptidové řetězce nosiče b) jsou spolu spojeny disulfidovými můstky.
- 15. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6, nebo 8 až 13, kde polypeptidové řetězce a) a polypeptidové řetězce nosiče b) jsou spolu spojeny hydrofobním spojením, zprostředkovaným kyselinou myristovou.
- 16. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6 a 8 až 14, kde polypeptidové řetězce a) a polypeptidové řetězce nosiče b) jsou spolu spojeny peptidovaný vazbou, přičemž je popřípadě mezi polypeptidový řetězec a) a polypeptidový řetězec nosiče b) uložen další řetězec, který je k polypeptidovému řetězci a) a polypeptidovému řetězci nosiče b) vázán peptidovými vazbami.
- 17. Použití kombinace podle nároku 16, kde polypeptidový řetězec nebo řetězce a) a polypeptidový řetězec nosiče b) jsou kódovány za sebou v téže rekombinantní molekule DNA.
- 18. Použití kombinace podle nároku 17, kde k expresi polypeptidového řetězce nebo řetězců a) a polypeptidového řetězce nosiče b) dochází z téhož otevřeného čtecího rámce uvedené molekuly DNA, přičemž tyto řetězce jsou popřípadě od sebe odděleny dalším peptidovým řetězcem, jehož kód je rovněž uložen v témž otevřeném čtecím rámci.
- 19. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 18, kde prostředek je ve formě určené pro podání nitrožilní nebo nitrosvalové injekcí.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP90124775A EP0491077A1 (en) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
PCT/EP1991/002460 WO1992011368A1 (en) | 1990-12-19 | 1991-12-19 | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ118693A3 CZ118693A3 (en) | 1994-02-16 |
CZ290233B6 true CZ290233B6 (cs) | 2002-06-12 |
Family
ID=8204863
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19931186A CZ290233B6 (cs) | 1990-12-19 | 1991-12-19 | Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6020167A (cs) |
EP (2) | EP0491077A1 (cs) |
JP (2) | JP3857305B2 (cs) |
KR (1) | KR0156587B1 (cs) |
AT (1) | ATE170220T1 (cs) |
AU (1) | AU657935B2 (cs) |
CA (1) | CA2098021C (cs) |
CZ (1) | CZ290233B6 (cs) |
DE (1) | DE69130071T3 (cs) |
DK (1) | DK0563093T4 (cs) |
ES (1) | ES2121000T5 (cs) |
HK (1) | HK1002901A1 (cs) |
HU (1) | HU216301B (cs) |
SK (1) | SK280551B6 (cs) |
WO (1) | WO1992011368A1 (cs) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988010300A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
DE4107612A1 (de) * | 1991-03-09 | 1992-09-10 | Behringwerke Ag | Rekombinante proteine mit der immunreaktivitaet des hepatitis b virus e antigens (hbeag), verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in immunoassays und impfstoffen |
US6689363B1 (en) | 1992-01-29 | 2004-02-10 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions |
US7611713B2 (en) | 1993-03-05 | 2009-11-03 | Pharmexa Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions |
US6509149B2 (en) * | 1995-06-06 | 2003-01-21 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
BR9709993A (pt) * | 1996-06-25 | 1999-08-10 | Stichting Inst Dierhouderij | Vacina preparação de vacina composição processo para produção de uma preparação imugênica e preparação imugênica |
US7091324B2 (en) | 1998-11-05 | 2006-08-15 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational epitopes |
CN1268345C (zh) * | 2000-03-29 | 2006-08-09 | 乔治敦大学 | 治疗丁型肝炎病毒感染的核苷化合物 |
IL142802A (en) * | 2000-04-27 | 2015-01-29 | Enzo Therapeutics Inc | Use of one or more HBV antigens for the preparation of oral pharmaceutical preparations for the treatment of a person with active HBV infection or hepatocellular carcinoma |
US6787526B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-09-07 | Idenix Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides |
US7022830B2 (en) * | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
KR20030074787A (ko) * | 2001-02-05 | 2003-09-19 | 스트레스젠 바이오테크놀러지스 코포레이션 | B형 간염 바이러스 치료 |
US7351413B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-04-01 | Lorantis, Limited | Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis |
US8420353B2 (en) * | 2002-03-22 | 2013-04-16 | Aprogen, Inc. | Humanized antibody and process for preparing same |
DE10339927A1 (de) * | 2003-08-29 | 2005-03-24 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen |
GB0326416D0 (en) | 2003-11-12 | 2003-12-17 | Karolinska Innovations Ab | Methods and means relating to hepatitis B infection |
WO2005050214A2 (en) * | 2003-11-12 | 2005-06-02 | Hbv Theranostica Ab | Methods and means relating to hepatitis b infection |
US9603921B2 (en) * | 2004-10-27 | 2017-03-28 | Janssen Vaccines Ag | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus |
US8071561B2 (en) * | 2007-08-16 | 2011-12-06 | Chrontech Pharma Ab | Immunogen platform |
WO2009092396A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Universitätsklinikum Heidelberg | Hydrophobic modified pres-derived peptides of hepatitis b virus (hbv) and their use as hbv and hdv entry inhibitors |
CN101485672B (zh) * | 2008-12-05 | 2010-08-25 | 广东粤龙药业有限公司 | 异丙景糖酐在制备治疗人HBeAg阳性慢性乙型肝炎药物中的应用 |
US10076570B2 (en) | 2009-08-07 | 2018-09-18 | Transgene S.A. | Composition for treating HBV infection |
EP2461826A2 (en) | 2009-08-07 | 2012-06-13 | Transgene SA | Composition for treating hbv infection |
Family Cites Families (85)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US34705A (en) * | 1862-03-18 | Improvement in tompions for fire-arms | ||
US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
IN151589B (cs) * | 1978-12-22 | 1983-05-28 | Biogen Nv | |
EP0182442B2 (en) * | 1978-12-22 | 1996-04-03 | Biogen, Inc. | Recombinant DNA molecules and their method of production |
US4935235A (en) * | 1979-05-24 | 1990-06-19 | The Regents Of The University Of California | Non-passageable viruses |
IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
US5196194A (en) * | 1979-05-24 | 1993-03-23 | The Regents Of The University Of California | Vaccines containing Hepatitis B S-protein |
USRE34705E (en) | 1979-08-30 | 1994-08-23 | Institut Pasteur | Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby |
US4415491A (en) * | 1980-01-14 | 1983-11-15 | The Regents Of The University Of California | Synthetic vaccine peptide epitomes of hepatitis B surface antigen |
EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
FI83662C (fi) * | 1980-07-17 | 1991-08-12 | Scripps Clinic Res | Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning. |
GR76274B (cs) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
US4741901A (en) * | 1981-12-03 | 1988-05-03 | Genentech, Inc. | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
JPS58194897A (ja) * | 1982-05-07 | 1983-11-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規dna,その製造方法およびそれで形質転換させた宿主 |
JPS5936698A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Science & Tech Agency | B型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えdnaおよび形質転換動物細胞 |
US4977092A (en) * | 1985-06-26 | 1990-12-11 | Amgen | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
US5198348A (en) * | 1982-08-30 | 1993-03-30 | Amgen Inc. | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
JPS5974985A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-04-27 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規dna |
CA1341116C (en) * | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
US4696898A (en) * | 1984-01-16 | 1987-09-29 | Integrated Genetics, Inc. | Vector encoding hepatitis B surface antigen |
FR2559159B1 (fr) * | 1984-02-02 | 1986-09-12 | Inst Nat Sante Rech Med | Vecteurs viraux de clonage et d'expression d'une proteine dans une cellule eucaryote, comportant au moins une partie du genome d'un retro-virus; cellules eucaryotes transfectees; procede utilisant de telles cellules et proteines obtenues |
FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
US5158769A (en) * | 1984-03-07 | 1992-10-27 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US5324513A (en) * | 1984-03-07 | 1994-06-28 | Institut Pasteur | Composition useful for the fabrication of vaccines |
US5204096A (en) * | 1984-03-07 | 1993-04-20 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US4861588A (en) * | 1985-02-05 | 1989-08-29 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US4847080A (en) * | 1984-03-07 | 1989-07-11 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers |
US4777240A (en) * | 1984-03-08 | 1988-10-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
US4942125A (en) * | 1984-09-07 | 1990-07-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
US4599230A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
US4599231A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
AU579148B2 (en) * | 1984-03-09 | 1988-11-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants |
US5098704A (en) * | 1984-06-18 | 1992-03-24 | Chiron Corporation | Hepatitis surface antigen particle vaccine |
EP0171908A3 (en) * | 1984-07-11 | 1987-07-15 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Hepatitis b virus surface antigen and production thereof |
GB8421282D0 (en) * | 1984-08-22 | 1984-09-26 | Connaught Lab | Multispecific antigenic proteins |
US4722940A (en) * | 1984-08-23 | 1988-02-02 | Georgia Tech Research Corporation | Aminoalkyl phenyl selenides for the treatment of hypertension and nervous system dysfunctions |
US4722840A (en) * | 1984-09-12 | 1988-02-02 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
EP0175261B1 (en) * | 1984-09-12 | 1991-12-11 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
US4639371A (en) * | 1984-10-02 | 1987-01-27 | New York Blood Center, Inc. | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom |
EP0180012A1 (de) * | 1984-10-27 | 1986-05-07 | Wolfram H. Prof. Dr. Gerlich | Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus |
US4683136A (en) * | 1985-03-06 | 1987-07-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Proteinaceous antigens with conformation-independent and conformation-dependent determinants |
CA1324094C (en) * | 1985-04-03 | 1993-11-09 | Dino Dina | Hepatitis a virus vaccines |
FI861417A0 (fi) * | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
US5837249A (en) * | 1985-04-19 | 1998-11-17 | The Wistar Institute | Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus |
US4639271A (en) * | 1985-04-24 | 1987-01-27 | Moore Business Forms, Inc. | Chromogenic mixtures |
FR2581394B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1988-08-05 | Grp Genie Genetique | Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes |
US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
JPH084507B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1996-01-24 | 武田薬品工業株式会社 | 新規dnaおよびポリペプチド |
US4959323A (en) * | 1985-11-04 | 1990-09-25 | Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Production and use of pre S polypeptides of hepatitis B virus |
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
US4742158A (en) * | 1986-04-25 | 1988-05-03 | Merck & Co., Inc. | Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding |
IE59389B1 (en) * | 1986-05-23 | 1994-12-23 | Merck & Co Inc | Method for producing hepatitis b virus core antigen (HBcAg) in yeast |
CA1310602C (en) * | 1986-06-03 | 1992-11-24 | Hajime Horii | Yeast promoter and process for preparing heterologous protein |
JPH01500515A (ja) * | 1986-06-20 | 1989-02-23 | スクリップス クリニック アンド リサーチ ファウンデーション | B型肝炎ウィルス表面抗原のプレs領域のt及びb細胞エピトープ |
US5068185A (en) * | 1986-07-10 | 1991-11-26 | Merck & Co., Inc. | Trains of yeast for the expression of heterologous genes |
IL79740A0 (en) * | 1986-08-17 | 1986-11-30 | Yeda Res & Dev | Hepatitis vaccine |
US4882145A (en) * | 1986-12-09 | 1989-11-21 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
US5143726A (en) * | 1986-12-09 | 1992-09-01 | The Scripps Research Institute | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
US4818527A (en) * | 1986-12-09 | 1989-04-04 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
ZA88488B (en) * | 1987-01-30 | 1988-10-26 | Smith Kline Rit | Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them |
EP1088830A3 (en) * | 1987-06-22 | 2004-04-07 | Medeva Holdings B.V. | Hepatitis b surface antigen particles |
WO1988010300A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
US4883865A (en) * | 1987-09-30 | 1989-11-28 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+s antigen |
US4963483A (en) * | 1987-10-13 | 1990-10-16 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
US5011915A (en) * | 1987-10-26 | 1991-04-30 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
US5039522A (en) * | 1988-01-29 | 1991-08-13 | New York Blood Center, Inc. | Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen |
NZ229260A (en) * | 1988-06-03 | 1994-02-25 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and |
US5242812A (en) * | 1989-02-07 | 1993-09-07 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification of hepatitis B vaccine |
US5462863A (en) * | 1989-02-09 | 1995-10-31 | Development Center For Biotechnology | Isolation of Hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
GB8903313D0 (en) * | 1989-02-14 | 1989-04-05 | Wellcome Found | Conjugates |
DK0414374T3 (da) * | 1989-07-25 | 1998-03-09 | Smithkline Beecham Biolog | Hidtil ukendte antigener og fremgangsmåder til fremstilling deraf |
EP0421626A1 (en) * | 1989-09-19 | 1991-04-10 | Merck & Co. Inc. | Vaccine for aids and hepatitis B |
EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
US5102989A (en) * | 1991-03-15 | 1992-04-07 | Merck & Co., Inc. | Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells |
IL101653A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles |
CA2067003A1 (en) * | 1991-04-29 | 1992-10-30 | Peter J. Kniskern | Hbsag escape mutant vaccine |
US5840303A (en) * | 1991-08-26 | 1998-11-24 | The Scripps Research Foundation | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
JP2501186Y2 (ja) * | 1992-03-31 | 1996-06-12 | 株式会社栗本鐵工所 | ハンマ―ミル |
CN1063343C (zh) * | 1993-04-27 | 2001-03-21 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
CN1094311A (zh) * | 1993-04-27 | 1994-11-02 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
CN1059927C (zh) * | 1994-03-10 | 2000-12-27 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 羧端带有前表面抗原1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因及其编码蛋白 |
US5792163A (en) * | 1996-01-03 | 1998-08-11 | Hitzig; Gary | Linear punch |
-
1990
- 1990-12-19 EP EP90124775A patent/EP0491077A1/en not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-12-19 DK DK92900527T patent/DK0563093T4/da active
- 1991-12-19 ES ES92900527T patent/ES2121000T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 DE DE69130071T patent/DE69130071T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 CZ CZ19931186A patent/CZ290233B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 WO PCT/EP1991/002460 patent/WO1992011368A1/en active IP Right Grant
- 1991-12-19 SK SK636-93A patent/SK280551B6/sk unknown
- 1991-12-19 AU AU90817/91A patent/AU657935B2/en not_active Ceased
- 1991-12-19 JP JP50100592A patent/JP3857305B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 HU HU9301794A patent/HU216301B/hu unknown
- 1991-12-19 CA CA002098021A patent/CA2098021C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 US US08/075,520 patent/US6020167A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 AT AT92900527T patent/ATE170220T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 EP EP92900527A patent/EP0563093B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-06-18 KR KR1019930701862A patent/KR0156587B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-10 HK HK98101997A patent/HK1002901A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-06-07 JP JP2000175584A patent/JP2001019643A/ja active Pending
-
2003
- 2003-03-21 US US10/394,896 patent/US20030235591A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SK63693A3 (en) | 1993-10-06 |
DE69130071T2 (de) | 1999-01-07 |
DE69130071D1 (de) | 1998-10-01 |
WO1992011368A1 (en) | 1992-07-09 |
AU657935B2 (en) | 1995-03-30 |
CA2098021C (en) | 2000-04-25 |
HUT66437A (en) | 1994-11-28 |
US20030235591A1 (en) | 2003-12-25 |
KR0156587B1 (en) | 1998-10-15 |
DK0563093T4 (da) | 2008-01-21 |
CZ118693A3 (en) | 1994-02-16 |
DK0563093T3 (da) | 1999-02-08 |
EP0563093B2 (en) | 2007-10-03 |
HU9301794D0 (en) | 1993-10-28 |
EP0491077A1 (en) | 1992-06-24 |
SK280551B6 (sk) | 2000-03-13 |
CA2098021A1 (en) | 1992-06-20 |
JP2001019643A (ja) | 2001-01-23 |
US6020167A (en) | 2000-02-01 |
HU216301B (hu) | 1999-06-28 |
HK1002901A1 (en) | 1998-09-25 |
EP0563093A1 (en) | 1993-10-06 |
JPH06507303A (ja) | 1994-08-25 |
AU9081791A (en) | 1992-07-22 |
JP3857305B2 (ja) | 2006-12-13 |
EP0563093B1 (en) | 1998-08-26 |
DE69130071T3 (de) | 2008-02-21 |
ATE170220T1 (de) | 1998-09-15 |
ES2121000T5 (es) | 2008-04-16 |
ES2121000T3 (es) | 1998-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ290233B6 (cs) | Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy | |
JP2758184B2 (ja) | 肝炎b表面抗原ワクチン | |
Charbit et al. | Presentation of two epitopes of the preS2 region of hepatitis B virus on live recombinant bacteria. | |
KR100208129B1 (ko) | B형 간염 백신 | |
Sureau et al. | Production of infectious hepatitis delta virus in vitro and neutralization with antibodies directed against hepatitis B virus pre-S antigens | |
US20090239265A1 (en) | Virus like particles | |
IE69265B1 (en) | Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins | |
Pride et al. | Evaluation of B and T-cell responses in chimpanzees immunized with Hepagene®, a hepatitis B vaccine containing pre-S1, pre-S2 and S gene products | |
CA2067003A1 (en) | Hbsag escape mutant vaccine | |
JP2000154152A (ja) | 肝炎療剤 | |
Wu et al. | A novel hepatitis B virus variant S 129 (Gln→ Leu): Lack of correlation between antigenicity and immunogenicity | |
NO885658L (no) | Retrovirusekspresjonsvektorer og fremgangsmaater for fremstilling av hbv-antigener. | |
KR970007153B1 (ko) | B형 간염 표면 항원 백신 | |
SK118293A3 (en) | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles | |
KR960004264B1 (ko) | B형 간염 표면항원, 이의 생성 진핵 세포 및 백신의 제조방법, 검정방법 및 진단용 키트 | |
Michel et al. | Synthesis in CHO cells of hepatitis B surface antigen containing the pre-S2 region expression product | |
AU2001276182B2 (en) | Improved virus like particles based on small envelope protein from hepatitis B (HBsAg-S) | |
AU2001276182A1 (en) | Improved virus like particles based on small envelope protein from hepatitis B (HBsAg-S) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20081219 |