CZ290233B6 - Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy - Google Patents

Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy Download PDF

Info

Publication number
CZ290233B6
CZ290233B6 CZ19931186A CZ118693A CZ290233B6 CZ 290233 B6 CZ290233 B6 CZ 290233B6 CZ 19931186 A CZ19931186 A CZ 19931186A CZ 118693 A CZ118693 A CZ 118693A CZ 290233 B6 CZ290233 B6 CZ 290233B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
chain
carrier
polypeptide
dna
combination according
Prior art date
Application number
CZ19931186A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ118693A3 (en
Inventor
Hans Thoma
Original Assignee
Medeva Holdings Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8204863&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ290233(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medeva Holdings Bv filed Critical Medeva Holdings Bv
Publication of CZ118693A3 publication Critical patent/CZ118693A3/cs
Publication of CZ290233B6 publication Critical patent/CZ290233B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Pou it kombinace s obsahem a) alespo jednoho polypeptidov ho °et zce, obsahuj c ho alespo jeden antigenn epitop pro aktivaci T-bun k viru hepatitidy a b) nosi e, schopn ho umo nit · inek polypeptidov²ch °et zc a) s antigenn m epitopem, p°i em polypeptidov °et zce a) mohou b²t na nosi b) v z ny kovalentn nebo hydrofobn vazbou pro v²robu farmaceutick ho prost°edku pro l en chronick virov hepatitidy.\

Description

Oblast vynálezu
Předkládaný vynález se týká použití prostředku obsahujícího polypeptidový řetězec a nosič pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění chronickou virovou hepatitidou.
Dosavadní stav techniky
Alespoň pět různých virů, zejména viry hepatitidy A, B, C, D a E je schopno vyvolat klinický obraz akutního zánětu jater. Hepatitida A a E, která se přenáší zažívací soustavou, nepřechází do chronické infekce, kdežto hepatitida typu B, C (dříve nazývaná parenterální hepatitida odlišná od typu A a B a D může pokračovat do chronického zánětlivého stádia, v jehož důsledku může dojít k jatemí cirhóze nebo může vzniknout primární karcinom z jatemích buněk.
Existuje poměrně málo údajů, týkající se hepatitidy typu C a D, způsobuje jejich diagnosy, jejich léčení a také příslušného viru. Virus hepatitidy D je RNA-virus, o němž je známo, že je neúplný. Z tohoto důvodu je nutné, aby pro rozvoj onemocnění u nemocných byl přítomen ještě pomocný virus a k onemocnění proto dochází pouze u jednotlivců, infikovaných HBV. V poslední době byl objeven virus hepatitidy C a byl vyvinut test s použitím protilátky (anti-HCV), který usnadňuje diagnosu infekci virem chronické hepatitidy C. Z uvedených důvodů vzniká zvyšující se potřebná léčení uvedených onemocnění.
Totéž platí pro chronickou hepatitidu B, která je daleko dokonaleji prostudovaným onemocněním, zejména pokud jde o diagnosu imunologickými metodami, o virus, který je příčinou tohoto onemocnění, jakož i o životní cyklus tohoto viru a jeho řetězec DNA. Nemocný se označuje jako chronický nosič viru hepatitidy B v případě, že je možno přítomnost DNA viru prokázat v jeho organismu déle než 10 týdnů, antigen HBe (HBeAg) po dobu více než 12 týdnů nebo v případě, že v organismu je možno prokázat povrchový antigen viru hepatitidy V (HBsAg) po dobu delší než 6 měsíců.
Chronickou hepatitidou typu B trpí přibližně 300 milionů lidí, přičemž většina z těchto lidí žije na dálném východě.
V případě těchto lidí dochází k hlavnímu riziku infekce v průběhu porodu nebo bezprostředně po porodu vzhledem k tomu, že matka s chronickou infekcí přenáší virus na svého novorozence. 90 % dětí, infikovaných tímto způsobem bude trpět v pozdějším životě chronickou infekcí.
V západních státech dochází k infekci obvykle později v průběhu života, během dětství nebo i v dospělosti, převážně dochází k přenosu parenterálně nebo při sexuálním styku. V těchto případech je infekce hepatitidou B po porodu vzácnější a pouze 5 až 10 % infikovaných se stává chronickými nosiči. Přenesený virus sám však není zodpovědný za určité reakce infikovaných lidí a není zcela zřejmé, proč u některých lidí dochází k eliminaci viru a u některých k udržení viru v organismu po celý život. Nejpravděpodobněji závidí na stavu imunologického aparátu budoucí tělesný stav infikovaných lidí.
Virion HB (částečně Dane) je tvořen různými strukturními bílkovinami, a to bílkovinami jádra a povrchovými bílkovinami (S). Povrchové bílkoviny jsou produktem translace otevřeného čtecího rámce, který zahrnuje kódové řetězce tří oblastí typu S, z nichž každá začíná kodonem ATG, který je schopen zahájit translaci in vivo. Uvedené tři oblasti se označují preSl, preS2 a S v pořadí od 5'-zakončení ke 3'-zakončení molekuly. Existuje šest bílkovinných produktů, odvozených od tohoto ORF: glykosylovaná a neglykosylovaná forma hlavní bílkoviny, gp27 ap24, k jejíž translaci dochází pouze z oblasti S, obsahující 226 zbytků aminokyselin, střední bílkovina, obsahující 281 zbytků aminokyselin a obsahující jeden nebo dva postranní poly
-1 CZ 290233 B6 sacharidové řetězce gp33 a gp36, pro níž je kódem oblast preS2 a S a konečně glykosylovaná (gp42) a neglykosylovaná (p39) forma bílkoviny s dlouhým řetězcem, obsahující 39 až 400 zbytků aminokyselin v závislosti na serotypu viru, tato bílkovina vzniká translací preSl, preS2 a S. Bílkovinami jádra jsou HBcAg a HBeAg, přičemž druhá z těchto bílkovin vzniká zpracováním první uvedené bílkoviny.
Částice Dane, která je infekčním virionem, obsahuje jak bílkovinu jádra, tak povrchové bílkoviny, zatímco vlákna jsou tvořena směsí šesti povrchových antigenů. Peptidy Sjsou samy o sobě kombinovány v částicích o velikosti 28 nm, které jsou zcela neinfekční.
Nemocní, kteří jsou infikováni virem HB a prošli několika stadii hepatitidy jsou tedy označováni jako nemocní, trpící chronickou infekcí HBV. Bezprostředně po infekci nastává infekční stadium, které je charakterizováno přítomností antigenů HBeAg v krevním séru. Pokračující HBs-antigenemie přes inhibici replikace HBV znamená, že se řetězce DNA viru integrovaly do buněčného genomu nemocného. Tyto integrované řetězce viru však nezpůsobují syntézu úplného viru hostitelskou buňkou. Jatemí buňky, v nichž je integrován řetězec HBV, mohou produkovat pouze antigen HBsAg, který je možno prokázat v krevním séru nemocných a který je tedy indikátorem chronické hepatitidy typu B. Je pravděpodobné, že transformované jatemí buňky nejsou rozrušovány cytotoxickými T-buňkami, avšak proliferují a v důsledku toho se vyvíjí buď chronická přetrvávající hepatitida CPH, nebo chronická aktivní hepatitida CAH, z níž se může dále vyvinout jatemí cirhóza nebo také primární hepatocelulámí karcinom, obě tato onemocnění mohou vést k předčasnému úmrtí nemocného.
V poslední době bylo prokázáno, že nemocní, kteří trpí chronickou infekcí HBV mají rovněž defekt v endogenní produkci interferonu, jak bylo popsáno v publikaci Abb a další, J. Med. Virol., 1985, 16, 171 - 176. Z tohoto důvodu byly činěny pokusy léčit nemocné, trpící chronickou hepatitidou B po průkazu přítomnosti HBaAb a HBV-DNA v krevním séru podáváním interferonu alfa (IFNalfa). Při pokusech na velkém množství nemocných bylo prokázáno, že při podávání interferonu alfa došlo ke statisticky významně zvýšené eliminaci viru hepatitidy B ve srovnání s kontrolními příklady. Avšak nemocní, infikovaní v průběhu porodu nebo těsně po narození na toto léčení odpovídali v daleko nižší míře. Tento fenomén naneštěstí znamená, že uvedeným způsobem není možno léčit přibližně 75 % nosičů tohoto onemocnění.
V současné době zůstává přesný mechanismus působením interferonu alfa na chronickou hepatitidu B nejasný. Protivirový účinek této látky by mohl infikované buňky chránit před infekcí, nebo by mohlo docházet ke snížení transkripce, translace a replikace viru v infikovaných buňkách. Mimoto má interferon také imunomodulační účinky, zejména dochází při jeho aplikaci k aktivaci T-buněk, makrofágů a NK-buněk a k indukci exprese bílkovin HMC skupiny I.
Další přístup k léčení chronické hepatitidy B je založen na myšlence, dosáhnout inhibice replikace viru a tím napomoci imunologickému systému hostitele dosáhnout eliminace viru, kjehož replikaci nemůže dojít. Za tímto účelem byly zkoumány protivirové látky, například ^deninarabinosid a adeninarabinosidmonofosfát jako možné účinné látky pro léčení jednotlivců s chronickou infekcí HBV. Avšak méně než polovina nemocných odpověděla na tuto léčbu buď tak, že přechodně došlo k přeměně HBeAg+ na anti-HBe+ v krevním séru. Dalším negativním hlediskem při použití těchto protivirových látek je skutečnost, že uvedené sloučeniny potlačují imunologický systém nemocného.
U chronických nosičů těchto virů byly zkoumány ještě další účinné látky, například interferon beta, acycloquanosin (acyclovir), interleukin 2, steroidy, například predsolon a kombinace těchto látek. Při použití žádné z uvedených látek však nebylo možno dosáhnout příznivějších výsledků než při léčení interferonem alfa. Pouze kombinační léčbou, při níž se na počátku léčení podávají steroidy a pak se podává ještě interferon alfa, je u některých nemocných možno zvýšit počet zlepšených případů.
-2CZ 290233 B6
EP-A-243 913 (Califomia Institute of Technology) popisuje vakcínu proti HBV obsahující peptid s řetězcem aminokyselin o délce alespoň šest za sebou následujících aminokyselin s kódovací oblasti genu pre-S obálky viru HBV.
WO 88/10 300 (Medico Labs) popisuje imunogenní částici obsahující větší množství monomerů prvního peptidu a větší množství monomerů druhého peptidu, kde každý z uvedených monomerů prvního peptidu obsahuje sekvenci aminokyselin odpovídající podstatné části peptidu, který po sekreci vytvoří částice o průměru alespoň 10 nm, a sekvence aminokyselin odpovídá heterolognímu epitopu, a každý z uvedených monomerů druhého peptidu obsahuje sekvenci aminokyselin odpovídající podstatné části peptidu, který po sekreci tvoří částice o průměru alespoň 10 nm, kde každý z uvedených monomerů druhého peptidu neobsahuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající heterolognímu epitopu, kde uvedený monomer prvního peptidu a uvedený monomer druhého peptidu nejsou identické, ale jsou schopné vzájemné vazby.
EP-A-271 302 (Scripps Clinic and Research Foundation) popisuje polypeptidy odpovídající co se týče sekvence zbytků aminokyselin oblastem stimulujícím T-buňky proteinu nukleokapsidy HBV. Popisuje se také způsob zesílení imunogenicity polypeptidového imunogenu, který zahrnuje operativní spojení polypeptidu přes postranní řetězec aminokyselinového zbytku k proteinovým částicím jádra.
EP-A-385 610 (Wellcome) popisuje částice antigenu jádra HBV (HBcAg), které nesou polypeptid prezentující antigenní epitop, a které jsou vhodné pro použití ve vakcínách. Částice jsou složené z HBcAg opatřené N-koncovým prodlužujícím úsekem obsahujícím zbytek Lys a uvedený polypeptid je navázán na částice přes postranní řetězec aminokyseliny zbytku Lys.
EP-A-175 261 (Chiron) popisuje nové imunogenní prostředky obsahující virové částice, složené alespoň z částice hybridních proteinů alespoň části proteinu tvořícího částice a jednoho nebo více polypeptidů obsahujících alespoň jeden významný epitop.
EP-A250 253 (Scripps Clinic and Research Foundation) popisuje polypeptidy odpovídající sekvencím zbytku aminokyselin buněčným epitopům T a B v přes-S oblasti HBsAg.
Z literatury je již známo, že šimpanzy, trpící chronickou infekcí HBV není možno vyléčit podáváním HBsAg, vázaným na tetanový toxoid, ani podáváním protilátek anti-HBS. Mimoto byly činěny pokusy imunizovat nemocné, trpící chronickou infekcí HBV podáváním peptidů S. Při tomto způsobu léčení však nedošlo u léčených osob ani ke tvorbě protilátek anti-HBS.
Mimoto podle definice uvedené na onemocnění je hlavní vlastností chronických nosičů viru hepatitidy B skutečnost, že v jejich krevním séru je možno prokázat antigen HBsAG. Nebylo tedy vůbec možno předpokládat, že by pomocí kombinace, obsahující epitop virového peptidu S, aktivující T-buňky podle vynálezu bylo možno dosáhnout imunizace a při dostatečně dlouhé době podávání i úplného vyléčení chronických nosičů viru hepatitidy B.
Vynález si klade za úkol navrhnout účinný prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy, při jehož použití by mohlo být dosaženo dobrého účinku, zejména dlouhodobé inhibice replikace viru HBV, ztráty DNA a DNA-polymerázy tohoto viru a současně by mělo být dosaženo také vymizení antigenů HBeAG a HBsAg v krevním séru nemocných, trpících tímto onemocněním.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří použití kombinace.
a) alespoň jednoho polypeptidového řetězce obsahujícího alespoň jeden antigenní epitop pro aktivaci T-buněk viru hepatitidy a
-3CZ 290233 B6
b) nosiče schopného umožnit účinek polypeptidových řetězců s antigenním epitopem přičemž polypeptidové řetězce a) mohou být na nosič b) vázány kovalentní nebo hydrofobní vazbou pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chronické virové hepatitidy.
Podle vynálezu může být polypeptidovým řetězcem a) polypeptid nebo kombinace dvou nebo většího počtu polypeptidů viru hepatitidy B, a to jakékoliv podtypu tohoto viru, zvláště adw, ayw, adr a ady. Tyto peptidy, odvozené od viru hepatitidy B mohou být například peptidy preSl, preS2 nebo S nebo také antigen j ádra HBV.
Jako polypeptidový řetězec (řetězce) a) je možno mimo to použít jakýkoli ze svrchu uvedených polypeptidů nebo kombinací dvou nebo většího počtu polypeptidů, které jsou modifikovány některým z následujících způsobů:
i) je možno vypustit některé části řetězce, přičemž musí být zachován epitop, který obsahuje alespoň šest po sobě následujících zbytků aminokyselin, ii) jednu nebo větší počet aminokyselin v řetězci je možno nahradit, nebo iii) je možno přidat další aminokyseliny nebo řetězce aminokyselin na N-terminálním nebo na C-terminálním zakončení nebo také uvnitř polypeptidového řetězce nebo řetězců a).
Ve výhodném provedení se k tomuto účelu užijí myristylované polypeptidové řetězce a).
Aby bylo možno dosáhnout příslušné farmakologické účinnosti, je zapotřebí, aby v kombinaci podle vynálezu byl polypeptidový řetězec nebo řetězce a) užity na nosiči b). Tento nosič je tvořen zvláštním materiálem, například může být tvořen částicemi hydrofobního polymeru, částicemi anorganického nosiče nebo částicemi polysacharidu. S výhodou je však nosič b) tvořen dalším polypeptidovým řetězcem, který vytváří částice, přičemž průměr těchto částic je alespoň 10 nm.
Ve výhodném provedení obsahují částice, tvořené polypeptidem, který je užit jako nosič b) podstatnou část úplného řetězce aminokyselin polypeptidu, který může být zvolen z peptidů S viru HBV, antigenu jádra HBV, antigenu jádra HAV, povrchového antigenu HA V, povrchového antigenu HTV a antigenu jádra HTV a může jít také o povrchový antigen viru dětské obrny. Výhodným materiálem pro částice nosiče b) je zejména peptid S viru HBV a/nebo peptid jeho jádra.
Při použití jako nosiče b) mohou být výše uvedené polypeptidy modifikovány následujícím způsobem:
(i) je možno vypustit některé části řetězce, přičemž musí být zachována schopnost vytvářet částice, (ii) je možno nahradit jednu nebo několik aminokyselin jinými aminokyselinami, (iii) je možno přidat další řetězce aminokyselin na N-terminální zakončení, C-terminální zakončení nebo dovnitř peptidového řetězce nosiče b).
V případě, že nosiče b) je polypeptidový řetězec, mohou být řetězce vázány jedním nebo větším počtem následujících způsobů: může jít o vazbu přes hydrofobní skupinu (zprostředkovanou myristovou kyselinou), o tvorbu disulfidových můstků nebo mohou být oba řetězce spojeny pomocí peptidové vazby za vzniku složeného peptidů. V tomto posledním případě je možno mezi polypeptidovým řetězcem a) a polypeptidový řetězec nosiče b) vložit ještě další řetězec, který je k oběma polypeptidům vázán peptidovými vazbami.
-4CZ 290233 B6
Polypeptidové řetězce a) a polypeptidový řetězec nosiče b) mohou být kódovány za sebou na stejné rekombinantní molekule DNA.
Molekula DNA může být exprimována v hostitelské buňce. Hostitelská buňka může být savčí, kvasinková nebo bakteriální buňka. Ve výhodném provedení se pro účely vynálezu používají buňky, které samy neprodukují žádnou bílkovinu lidského séra nebo bílkovinu séra primátů s výjimkou polypeptidu (polypeptidů) obsažených ve výše uvedené kombinaci.
Pod pojmem „peptid S viru HBV“ se rozumí peptid, kódovaný celou oblastí S genomu HBV.
Pod pojmem „pre-S2 peptid HBV“ se rozumí v průběhu přihlášky peptid, pro nějž je kódovým řetězcem celá oblast pre-S2 a S genomu HBV. Pod pojmem „pre-Sl peptid HBV“ se v průběhu přihlášky rozumí polypeptid, pro nějž je kódovým řetězcem celá oblast pre-Sl, pre-S2 a S genomu HBV. Pod pojmem „epitop“ se v průběhu přihlášky rozumí řetězec alespoň šesti po sobě následujících zbytků aminokyselin, pro nějž je kódem uvedená oblast genomu, to znamená, že například „pre-S2 epitop HBV“ znamená řetězec, obsahující alespoň šest zbytků aminokyselin, pro nějž je kódem určitá oblast pre-S2 genomu HBV. Pod pojmem „epitop T-buňky“ se v průběhu přihlášky rozumí epitop, schopný interakce s receptory na povrchu T-buněk za současného podporování nebo jiného ovlivnění imunologické odpovědi.
Pod pojmem „antigenita“ se v průběhu přihlášky rozumí schopnost, vyvolat imunologickou odpověď, to znamená například působit jako antigen, dále schopnost vyvolat tvorbu protilátek, to znamená opět působit jako antigen a/nebo schopnost interakce s receptorem na povrhu buňky ke zvýšení imunologické odpovědi nebo k vyvolání produkce protilátek.
Pod pojmem „HBV“ se rozumí jakýkoliv podtyp viru, zejména adw, ayw, adr a ayr, tak jak byly popsány v literatuře, například P. Velanzuela, Nátuře sv. 280, str. 815, 1979, Gerlich, EP-A 180 012, a Neurath, EP-A 154 902. Příklady peptidových řetězců, tvořících polypeptidové řetězce a), schopné zprostředkovat antigenitu jednoho nebo většího počtu epitopů budou dále uvedeny v seznamu řetězců, jde o řetězce ID č. 17 až 20 a 22.
Jako výhodná provedení vynálezu je možno označit následující kombinace:
- částice S-antigenu BH se specifickými epitopy (determinantami) z oblastí pre-Sl, pre-S2 a/nebo může jít o peptidy jádra.
- částice antigenu jádra HB s obsahem specifických epitopů (determinant) z oblasti peptidu pre-Sl, pre-S2, S a/nebo antigenu jádra,
- částice antigenu viru hepatitidy A se specifickými epitopy (determinantami) viru hepatitidy B, a to oblasti S, pre-Sl, pre-S2 a/nebo peptidu jádra.
Rekombinantní molekuly DNA výhodné pro použití v předkládaném vynálezu jsou charakterizovány přítomností řetězců kódujícími polypeptidové řetězce a) zprostředkující antigenitu pro jeden nebo větší počet epitopů T-buněk a také pro polypeptidové řetězce nosiče b), které s výhodou po své sekreci vytvářejí částice o průměru alespoň 10 nm, v obou případech pod řízením vhodného promotoru. Příkladem pro řetězce, které jsou kódovými řetězci pro polypeptidové řetězce a), je možno uvést kterýkoliv z řetězců, které jsou dále uvedeny v seznamu řetězců pod čísly ID 1 až 24. Příklady řetězců DNA, které jsou kódovými řetězci pro polypeptidové řetězce nosiče b), mohou být kterékoliv z dále uvedených řetězců ID 25 až 27.
Kterýkoliv z řetězců ID-1 až 24 je možno kombinovat s kterýmkoliv řetězcem ID-25 až 27 v seznamu řetězců, a to v pořadí a-b i b-a.
-5CZ 290233 B6
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu jde o kombinaci epitopu řetězce ID-28, který odpovídá aminokyselinám 9 až 28 řetězce Sl HBV a řetězce ID 26 a/nebo 27 jako řetězce nosiče, tvořícího částice.
Řetězce viru hepatitidy užité ke konstrukci rekombinantní DNA je možno vytvořit nebo izolovat jakýmkoli způsobem včetně izolace a navázání restrikčních fragmentů, chemické syntézy oligonukleotidů s použitím syntezátoru (Cyclon, BioSearch) a syntézy metodou PCR (T. J. White, N. Amleim, Η. E. Erlich, 1989; The Polymerase Chain Reaction, Technical Focus 5 (6)).
Výhodné molekuly rekombinantní DNA byly vytvořeny vazbou syntetických oligonukleotidů na fragment 5'XBaI-BglII-3', ID-27, z oblasti S genomu HBV, řetězec je odvozen od fragmentu HBV BglII-Bgin včetně celé oblasti pre-Sl-pre-S2-S- nebo celé oblasti S. Oligonukleotidy, užité při tvorbě těchto konstrukcí jsou souhrnně uvedeny v následující tabulce I.
Tabulka I funkce definice řetězec ID č.
jádro (adw) aax 59-87 6
jádro (adw) aa2—28 7
jádro (adw) aa-10-28 8
jádro (adw) aa 29-58 9
jádro (adw) aa 1-87 10
jádro (adw) aa-10-87 11
jádro (adw) aa 70-110 12
jádro (adw) aa 80-125 13
jádro (adw) aa 88-120 15
Sl (ayw) aa 9-28 17
Sl (ayw) aa 83-103 18
Sl (ayw) aa20—40 19
Sl (ayw) aa 59-94 20
Sl (ayw) aa 94-114 21
Sl (ayw) aa 70-105 22
S2 (ayw) aa2-21 23
S2 (ayw) aa 14-33 24
x aa = aminokyseliny
Další výhodné molekuly DNA byly vytvořeny vazbou řetězce jádra, připraveného metodou PCR (kódované řetězce pro epitopy T-buněk) na řetězce jádra HBV, ID č. 25, užité jako polypeptidový řetězec nosiče b). Použité oligonukleotidy pro tyto konstrukce jsou uvedeny v tabulce Π-1.
-6CZ 290233 B6
Tabulka Π-1
funkce definice IDč.
jádro úplný řetězec, bp 1901-2500 1
jádro C-terminální vypuštění, bp 1901-2450 2
jádro C-terminální vypuštění a vložení stop kodonu, bp 1901-2405 3
jádro/řetězec před jádrem 10 aminokyselin řetězce před jádrem, C-terminální vypuštění bp 1871-2405 4
jádro/řetězec před jádrem 10 aminokyselin řetězce před jádrem, C-terminální vypuštění, uložení stop-kodonu, bp 1871-2405 5
jádro aa(-10-120) 16
jádro/řetězec před jádrem 10 aminokyselin řetězce před jádrem, úplné jádro a bp 1871-2500 35
V následující tabulce Π-2 je uvedeno několik příkladů, v nichž byl izolován kódový řetězec
DNA pro epitop T-buněk při použití restrikčních fragmentů z genomu viru HBV, tyto fragmenty pak byly navázány na řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro polypeptidový řetězec nosiče b) ve svrchu uvedeném významu.
Tabulka Π-2
funkce definice ID č.
jádro/řetězec před jádrem úplný řetězec, bp 1403-31 XX
s2 ay/ad XX
S2 (K) ay/ad S2-S, 7 kodonů vypuštěno, kodon ATG pro počátek je nahrazen kodonem ATA 14
“ Řetězce byly zveřejněny v publikacích Galibert F. a další, 1979, Nátuře, 281, 646-650 a Ono Y. a další, 1983, Nucl. Acid. Res, 11(6), 1747-1757.
V následující tabulce Π-3 jsou uvedeny některé specifické rekombinantní molekuly DNA. Konstrukce těchto molekul bude podrobněji popsána v příkladové části přihlášky.
Tabulka Π-3
konečná konstrukce epitop T-buněk nosič, tvořící částice selekční gen
MT-jádro (-10-120) jádro (aa-10-120) + SAg + neo S adw/ayw nebo S/XbaII/Bgin neo
MT-S1 (aa 9-28) -S + egpt SI (aa 9-28) ay S adw/ayw nebo S/Xball/Bgin egptx
MR-jádro-neo jádro/řetězec před jádrem bp 1403-31 jádro adw neo
MT-jádro (1-87) + HBsAg - neo jádro (aa 1-87) S adw/ayw nebo S/Xbal/Bgin neo
x egpt = E. coli xanthinguaninfosforibosyltransferáza.
Výhodné rekombinantní molekuly DNA obsahují kromě kódových oblastí pro polypeptidové řetězce a) a polypeptidové řetězce nosiče b) ještě další kódový řetězec pro selekční markek. Mimo to obsahují všechny další obvyklé prvky nezbytné pro expresi jako jsou řetězec promotoru, startovací kodon a polyadenylační signál.
Příkladem vhodných promotorů mohou být methallothionein (MT), promotory U2 a H2K v případě, že se jako hostitelské buňky užití buňky savců. V případě, že mají být použity kvasinkové buňky nebo bakteriální buňky, užijí se příslušné promotory pro tyto typy buněk, například promotor GCN4 a promotor GAL 1/10 nebo prokaryotické promotory trp a tac.
Aby bylo možno produkovat kombinaci polypeptidových řetězců a) a polypeptidových řetězců nosiče b) podle vynálezu, uloží se rekombinantní molekula DNA do hostitelských buněk při použití transfekce (v případě buněk savců), transformace (v případě kvasinkových a bakteriálních buněk) nebo jinými způsoby. Jako hostitelská buňka může být použit jakýkoliv organismus, v němž může dojít k transkripci a translaci rekombinantních molekul DNA, může jít například o buňky savců, bakteriální buňky nebo buňky kvasinek.
Vhodnými buňkami savců pro účely vynálezu jsou například buňky VĚRO (buněčná linie opičích ledvin), buňky 373-C1127 a L (buněčná linie myších fibroblastů) a buňky CHO (vaječníkové buňky čínského křečka), které reagují buď positivně, nebo negativně na dehydrofolátreduktázu.
Dále je možné postupovat tak, že se svrchu uvedený řetězec DNA, který je kódem pro polypeptidové řetězce a) a svrchu definovaný druhý řetězec DNA, který je kódem pro polypeptidový řetězec nosiče b) jsou uloženy v různých rekombinantních molekulách DNA, v tomto případě je nutno provést současnou transfekci hostitelských buněk s použitím obou typů rekombinantních molekul DNA.
-8CZ 290233 B6
Tabulka ΙΠ
Možné složení částic, obsahujících epitopy T-buněk pro zacílení nosiče v kombinaci proti chronické hepatitidě
konečná promotor2 epitop T-buněk částicový selekční čištění3
konstrukce1 nosič gen
SYN PCR Gen
MTX12/U2 jádro (adw) neo/egpt
MTX12/U2
MTX12/U2 jádro bez řetězce před jádrem např. bp 1901-2500 jádro bez řetězce před jádrem s vypuštěním C-konce např. bp 1901-2405 jádro bez řetězce před jádrem s vypuštěním C-koncem + stop signál např. bp 1901-2405 jádro (adw) nebo/egpt jádro (adw) neo/egpt
MT-jádro-neo MTX12/U2
jádro a řetězec jádro a jádro (adw) neo/egpt materiály
před jádrem řetězec a metody
10AA před
jádrem
bp 1403-31
jádro (adw) neo/egpt
MTX12/U2
MTX12/U2 jádro a řetězec před jádrem 10AA s delekcí na C-konci bp 1871-2405 jádro a řetězec před jádrem s deleci na konci C-konci + stop signál bp 1871-2405 jádro (adw) neo/egpt
MTX12/U2 jádro (AA59-87)
MTX12/U2 jádro (AA228) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt neo/egpt
-9CZ 290233 B6
Tabulka IH - pokračování
konečná konstrukce1 promotor2 SYN epitop T-buněk PCR částicový nosič Gen selekční gen čištění3
MTX12/U2 jádro (AA2- 28) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 jádro (AA10-28) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 jádro (AA29-58) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MR-jádro (1-87) + HBsAg-neo MTX12/U2 jádro (AA1- 87) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 jádro (AA-10-87) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 jádro (AA70-110) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 jádro (AA80-125) celý S adw/ayw S/Xbal/Bgin neo/egpt
MTX12/U2 jádro (AA88-120) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 jádro (AA- 10 + SAIG + AA2-87 celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MT-jádro (-10-120) + SAg + neo MTX12/U2 jádro (AA-10-120) celý S adw/ayw S-Xba I/BglII neo/egpt materiály a metody
MT-A1 (AA9-28)- S + egpt MTX12/U2 S1-(AA 9-28) (ay) celý S adw/ayw S/Xbal/Bgin neo/egpt
MTX12/U2 S1-(AA 83-103)(ay) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 S1(AA 20-40) (ay) celý S adw/ayw S/Xbal/BGIII neo/egpt
MTX12/U2 SI (AA 59-94) (ay) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 S1-(AA 94-114) (ad) celý S adw/ayw S/Xbal/BglU neo/egpt
-10CZ 290233 B6
Tabulka ΙΠ - pokračování
konečná konstrukce1 promotor2 epitop T-buněk částicový nosič selekční gen čištění3
SYN PCR Gen
MTX12/U2 S1-(AA 70-105) (ad) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt materiály a metody
MTX12/U2 S1-(AA 9-28) (ay) jádro adw neo/egpt
MTX12/U2 S2-(AA 2-21) (ay) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 S2-(AA 14-33) (ay) celý S adw/ayw S/Xbal/BglII neo/egpt
MTX12/U2 S2 ayw S ayw/adw neo/egpt materiály a metody
MTX12/U2 adaptor S2-(K)~ ayw S ayw/adw neo/egpt
vysvětlivky k tabulce:
1: vysvětlení je uvedeno v příkladu 3
2: jakýkoliv z uvedených promotorů je možno použít
3: čištění je podrobněj i uvedeno v příkladové části.
V tabulce ΙΠ je uveden souhrnný přehled kombinací vhodných řetězců DNA.
Je nutno uvést, že jakékoliv složky, které jsou v tabulce uvedeny, je možno kombinovat za získání řetězce DNA, který je možno užít ktransfekci hostitelské buňky, která pak bude 15 produkovat kombinaci polypeptidových řetězců a) a polypeptidových řetězců nosiče b), vhodnou pro léčení chronické virové hepatitidy.
Řetězce DNA, které jsou kódovými řetězci pro řetězce epitopů T-buněk byly připraveny synteticky (SYN) při použití automatického přístroje Biosearch Cyclon Synthesiser, pomocí PCR 20 (PCR) nebo fragmentací virového genomu pomocí restrikčních enzymů (GENE).
Pro léčení nemocných, trpících chronickou virovou hepatitidou je možno zpracovat kombinaci polypeptidových řetězců a) a polypeptidových řetězců nosiče b) do jakéhokoliv typu farmaceutického prostředku, který mimoto bude obsahovat vhodné ředidlo nebo farmaceutický 25 nosič, například roztok pufru.
Takto připravený farmaceutický prostředek je možno podávat jakýmkoliv způsobem, například parenterálně, jako nitrožilně nebo nitrosvalově, nebo perorálně, například při použití tyfoidních bakteriálních buněk k zapouzdření účinného materiálu.
Farmaceutický prostředek má obsahovat svrchu uvedenou kombinaci řetězců v dostatečné koncentraci k vyvolání požadovaného účinku po podání.
Praktické provedení vynálezu bude dále podrobněji popsáno v souvislosti s přiloženými výkresy.
- 11 CZ 290233 B6
Popis výkresů
Na obr. I je znázorněna konstrukce DNA, která je kódovým řetězcem pro promotor, řetězec nosiče, tvořící částice a selekční gen tak, jak je popsána v příkladu 3/4.
Na obr. Π je znázorněna konstrukce DNA genu, obsahující promotor, epitop s úplným HB-S-Ag a gen pro selekci, tak jak je popsána v příkladu 3/18.
Na obr. ΙΠ je znázorněna konstrukce DNA, která je tvořena promotorem, epitopem T-buněk se zbytkem, tvořícím m částice a gen pro selekci, tato konstrukce je popsána v příkladu 3/21.
Na obr. IV jsou uvedeny hodnoty AST pro šimpanze 1 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care, léčení je popsáno v příkladu 10/1.
Na obr. V jsou uvedeny hodnoty antigenu u šimpanze 1 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care tak jak je popsáno v příkladu 10/1.
Na obr. VI jsou uvedeny hodnoty jatemích enzymů ALT a GGT u šimpanze, jemuž byl v určitých intervalech třikrát podán prostředkem Hepa-Care podle příkladu 10/2.
Na obr. VII jsou uvedeny hodnoty jatemích enzymů ALT, AST a GGT a množství antigenu u šimpanze 2 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care způsobem, který je popsán v příkladu 10/3.
Na obr. Vin jsou uvedeny hodnoty jatemích enzymů, stanovená u neléčeného kontrolního šimpanze tak, jak je uvedeno v příkladu 10/3.
Na obr. IX a X jsou uvedeny hodnoty množství antigenu a titr protilátek u nemocného 1 v průběhu jeho léčení prostředkem Hepa-Care, tak jak je popsáno v příkladu 11.
Na obr. XI a ΧΠ je souhrnně uvedeno množství antigenu a titr protilátek u nemocného 2 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care způsobem podle příkladu 11.
Na obr. ΧΙΠ a XTV jsou uvedeny hodnoty množství antigenu a titr protilátek u nemocného 3 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care, tak jak je popsáno v příkladu 11.
Praktické provedení vynálezu bude podrobněji popsáno v následujících příkladech, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
1. Frakcionované srážení polyethylenglykolem (PEG)
Supematant kultury, produkující bílkovinu HBV se odebere a rozdělí na podíly po 2400 ml.
Ke každému podílu se přidá 144 g PEG 6000 (Serva) a po rozpuštění se směs míchá 20 minut při teplotě místnosti a pak ještě 6 hodin při teplotě 4 °C. Vzniklá sraženina se oddělí odstředěním v lahvích s objemem 500 ml při použití rotoru GS 3 při 9000/ot/min, tj. 15 000 g po dobu minut při teplotě 10 °C. Pak se podíly supematantu oddělí a přidá se znovu 144 g PEG 6000 stejným způsobem jako svrchu. Roztok se míchá 3 hodiny při teplotě 4 °C. Vytvořená sraženina z tohoto roztoku se oddělí stejně jako svrchu až na to, že odstředění trvá 60 minut.
- 12CZ 290233 B6
2. Chromatografie na gelu
Materiál, získaný po vysrážení pomocí PEG se znovu rozpustí ve 20 ml PBS a roztok se chromatografuje na A-5m (BioRad). Bylo užito sloupce s rozměry 25 x 1000 mm a 400 ml prostředku. Při typické frakcionaci došlo při použití PEG k vysrážení 1000 mikrogramů bílkoviny HBV v objemu 10 až 15 ml, eluce byla prováděna PBS rychlostí 6 kapek za minutu, tj. 18 ml za hodinu. Byly odebírány frakce s objemem 3 ml. K eluci bílkoviny HBV docházelo v prvním vrcholu. Odebrané frakce byly podrobeny gradientu CsCl.
3. Sedimentace v gradientu CsCl
Přibližně 30 frakcí, tvořících první vrchol při provádění chromatografie na sloupci A-5m a obsahujících částečně čištěnou bílkovinu HBV byly odebrány a spojeny, objem spojených frakcí byl přibližně 100 ml. Tento roztok byl upraven na hustotu 1,30 g/ml přidáním CsCl a pak byl přenesen do polyallomemí zkumavky, kterou je možno použít v rotoru SW 27/28 (Beckman). Gradient byl vytvořen tak, že bylo nejprve uloženo 4 ml roztoku CsCl s hustotou 1,35 g/ml, na tuto vrstvu byla uložena vrstva 4 ml roztoku s hustotou 1,25 g/ml a ta byla ještě převrstvena vrstvou 4 ml roztoku s hustotou 1,20 g/ml. Pak bylo při použití tohoto gradientu prováděno odstřeďování materiálu rychlostí 28000 ot/min celkem 50 hodin při teplotě 10 °C. Pak byl gradient podroben frakcionaci a byla oddělena čištěná bílkovina HBV, nacházejí se ve vrstvě s hustotou 1,20 g/ml. Pak byl roztok zbaven soli dialýzou ve vacích proti vodě, dialýza byla třikrát opakována.
Příklad 2
Kvantitativní stanovení bílkoviny HBV
1. Radioimunologický způsob
Při radioimunologické zkoušce, prováděné v několika vrstvách, AUSTRIA Π-125 (Abbot) se částice, opatřené povlakem morčecí protilátky proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B (Anti-HBs) inkubují se sérem, plazmou nebo čištěnou bílkovinou při použití odpovídajících kontrolních vzorků. Jakýkoliv přítomný antigen HBsAG se váže na protilátku na pevné fázi. Po odsátí nenavázaného materiálu a promytí částic se s komplexem, vázaným na částice nechá reagovat lidský 125I-Anti-HBs. Pak se částice opět promyjí, aby došlo k odstranění nenavázaného značeného 125I-Anti-HBs.
)-Anti-HBs HbsAg )-Anti-HBs. HBsAg 125I-Anti-HBs )-Anti-HBs . HBsAg . 125I-Anti-HBs
Radioaktivita, která zůstává vázána na částice se stanoví pomocí scintilačního gamma-počítače.
2. Zkouška ELISA
Při použití plotny pro mikrostanovení, Enzygnost (Behring) se při stanovení HBsAg vyhloubení povlékají anti-HBs. Pak se přidá sérum, plazma nebo čištěná bílkovina a také kontroly a plotna se inkubuje. Po promytí se se zbývajícími antigenními determinantami nechá reagovat protilátka proti HBsAg, značená peroxidázou. Nenavázaná protilátka s enzymem se odstraní promytím a stanoví se účinnost enzymu, vázaného na pevnou fázi. Enzymaticky katalyzovaná reakce peroxidu vodíku a chromogenu se zastaví přidáním zředěné kyseliny sírové. Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci HBsAg ve vzorku a je možno ji stanovit fotometrickým srovnáním intensity
-13CZ 290233 B6 zabarvení neznámého vzorku s intensitou zbarvení negativního a positivního kontrolního vzorku séra.
Příklad 3
Příprava konstrukcí genů obsahujících promotor, požadované řetězce antigenů a gen usnadňující selekci.
1. Izolace MT-promotoru
Plazmid pBPV-342-12 (ATCC 37224) se rozštěpí působením restrikčních endonukleáz BglII a BamHI. Tímto způsobem vznikly tři molekuly DNA. Požadovaný fragment obsahuje methallothioneionový promotor a řetězec plazmidu pBR322 o velikosti 4,5 kb a je možno jej snadno odlišit od ostatních fragmentů s velikostí 2,0 kb a 7,6 kb.
Reakce se provádí v celkovém objemu 200 mikrolitrů reakčního pufru při konečné koncentraci DNA 0,5 gg/μΐ včetně 100 jednotek každého se svrchu uvedených restrikčních enzymů. Úplnost rozštěpení byla kontrolována po inkubaci 3 hodiny při teplotě 37 °C elektroforézou na 0,8% agarózovém gelu. Pak byla reakce zastavena přidáním 4 mikrolitrů 0·,5 M EDTA.
Fragment s velikostí 4,5 kb byl od ostatních fragmentů oddělen preparativní elektroforézou na 1,2% agarózovém gelu. Eluce DNA zagarózového gelu byla prováděna na Whatmanově filtračním papíru DE-81, DNA byla oddělena pomocí pufru s vysokým obsahem solí. Pak byla DNA čištěna extrakcí směsí fenolu a chloroformu s následným dvojím srážením při použití ethanolu.
2. Vazba fragmentu o 1,8 kb, který je kódem pro antigen jádra HBV
Fragment Bam-HI-BamHI o velikosti 1,8 kb, obsahující kódovou oblast jádra HBV byl izolován z DNA s obsahem HBV. Tento fragment byl pak navázán na fragment s velikostí 4,5 kb, obsahující MT-promotor a zbytek pBR, jakje popsáno v odstavci 1.
mikrolitry fragmentu o velikosti 1,8 kb se smísí se 3 mikrolitry fragmentu o velikosti 4,5 kb, vazba se provádí v celkovém objemu 10 mikrolitrů příslušného pufru, který obsahuje dvě jednotky T4-DNA-ligázy, a 2 mM AT přes noc při teplotě 14 °C.
K vazné směsi se přidá 150 mikrolitrů suspenze bakteriálních buněk pro příjem NA. Po včlenění DNA do bakteriálních buněk se buňky nanesou na plotny LB-agaru s obsahem 50 mikrolitrů/ml ampicilinu, užije se 50 až 300 mikrolitrů buněčné suspenze na jednu plotnu. Pak se agarové plotny inkubují přes noc při teplotě 37 °C a vzniklé jednotlivé izolované kolonie bakteriálních buněk se zkouší na přítomnosti plazmidu, obsahujícího požadované fragmenty.
3. Sledování bakteriálních kolonií, obsahujících požadovaný plazmid
Jednotlivé kolonie se ostrým nástrojem oddělí od agaru a přenesou do zkumavky s objemem 5 ml, obsahující živné prostředí LB s ampicilinem. Zkumavky se inkubují přes noc při teplotě 30 °C za rychlého protřepávání. Pak se z každé suspenze bakteriálních buněk připraví plazmid. Získané od sebe odlišné vzorky DNA se zkouší štěpením restrikční endonukleázou BglII. Očekává se vznik dvou molekul, a to fragmentu o velikosti 400 bp a fragmentu o velikosti 5,9 kb. Rozštěpený materiál se analyzuje elektroforézou na agarózovém gelu, DNA plazmidu se izoluje z bakteriálních buněk.
4. Uložení selekčního označení-genu pro odolnost proti neomycinu
- 14CZ 290233 B6
Plazmid, získaný v předchozím stupni se linearizuje rozštěpením restrikčním enzymem EcoRI. Reakce se provádí v celkovém objemu 50 mikrolitrů při konečné koncentraci DNA plazmidů pg/gl. Přidá se 50 jednotek enzymu EcoRI a štěpení se provádí inkubací 3 hodiny při teplotě 37 °C, průběh štěpení se sleduje elektroforézou na agarózovém gelu.
Reakce se zastaví přidáním 1 mikrolitrů 0,5M EDTA a DNA a vysráží octanem sodným v konečné koncentraci 0,3 M a přidáním tří až čtyř objemů ethanolu při teplotě -80 °C v průběhu 30 minut. Vysrážená DNA se rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.
mikrolitry linearizovaného plazmidů se smísí se 3 mikrolitry fragmentu DNA, obsahujícího methallothioneinový promotor a selekční gen pro odolnost proti neomycinu, izolovaný z plazmidů pMT-neo-E (ATCC/Exogene) rozštěpením endonukleázou EcoRI jako fragment velikosti 3,9 kb a vzniklá směs se naváže. Pak se jednotlivé bakteriální kolonie sledují na přítomnost požadovaného plazmidů.
5. Izolace fragmentu, obsahujícího řetězce promotoru U2
Plazmid pUC-8-42 (Exogene) se rozštěpí působením restrikčních endonukleáz EcoRI a Apal. Získají se 2 molekuly DNA. Požadovaný fragment obsahuje promotor UA o velikosti 340 bp a je možno jej snadno odlišit od zbývajícího fragmentu, který obsahuje 3160 bp. Štěpení se provádí v celkovém objemu 200 mikrolitrů reakčního pufru při konečné koncentraci DNA 0,5 pg/μΐ včetně 100 jednotek každého restrikčního enzymu. Úplnost štěpení se po inkubaci 3 hodiny při teplotě 37 °C kontroluje elektroforézou na 0,7% agarózovém gelu. Reakce se pak zastaví přidáním 4 mikrolitrů 0,5 M EDTA. Fragment o velikosti 340 bp se od DNA plazmidů oddělí preparativní elektroforézou na 1,2% agarózovém gelu. DNA se z agarózového gelu vymývá na Whatmanově filtračním papíru DE-81, DNA se z tohoto materiálu vymyje pufrem s vysokým obsahem solí. Pak se DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu a dvojím srážením ethanolem.
6. Uložení fragmentu s obsahem řetězce promotoru do plazmidů s obsahem spojovníku s větším počtem míst působení restrikčních enzymů
Plazmid pSP165 (Promega Biotec), obsahujíc řetězec spojovníku s obsahem následujících míst působením restrikčních endonukleáz: EcoRI, Sací, Smál, Aval, BanHI, Bgin, Sáli, Pstl, Hindm se linearizuje působením restrikčního enzymu EcoRI. Reakce se provádí v celkovém objemu 50 mikrolitrů při použití konečné koncentrace DNA plazmidů 1 pg/gl. Pak se přidá 50 jednotek enzymu EcoRI a směs se inkubuje 3 hodiny při teplotě 37 °C, štěpení se pak kontroluje elektroforézou na agarózovém gelu. Reakce se zastaví přidáním 1 mikrolitrů 0,5 M EDTA a DNA se vysráží při konečné koncentraci 0,3 M octanu sodného a 3 až 4 objemů ethanolu, srážení se provádí 30 minut při teplotě -80 °C. Vysrážená DNA se rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.
mikrolitry DNA plazmidů se smísí s 10 mikrolitry fragmentu DNA, obsahujícího řetězec promotoru U2 a oba fragmenty se naváží v celkovém objemu 25 mikrolitrů pufru k provedení vazby, obsahujícího dvě jednotky T4-DNA-ligázy a 2-mM ATP, vazba probíhá přes noc při teplotě 14 °C. Pak se DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu, pak se dvakrát vysráží ethanolem a rozpustí v 10 mikrolitrech destilované vody. Výsledná vazná zakončení po štěpení EcoRI a Apal se převedou na zarovnané konce a provede se další vazba. Postup se provádí tak, že se vazná zakončení převedou na zarovnaná zakončení reakcí s nukleázou z bobů následujícím způsobem: k 25 mikrolitrům DNA o koncentraci 1 pg/μΐ se v reakčním pufru přidá 20 jednotek enzymu v konečné koncentraci glycerolu 1 % a v konečném reakčním objemu 35 mikrolitrů. Směs se inkubuje 30 minut při teplotě 30 °C a pak se DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu s následným dvojím vysrážením ethanolem. Pak se DNA znovu rozpustí v 5 mikrolitrech destilované vody. Výsledné zarovnané konce se naváží v 15 mikrolitrech
- 15CZ 290233 B6 reakčního objemu, užije se lOx vyšší množství P4-DNA-ligázy bez svrchu a 2 mM ATP, vazba probíhá přes noc při teplotě 14 °C.
Pak se směs, v níž probíhá vazba přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk pro příjem DNA. Po uložení DNA do bakteriálních buněk se buňky nanesou na plotny LB-agaru, obsahujícího 50 mikrogramů/ml ampicillinu, užije se objem 50 až 300 mikrolitrů buněčné suspenze na jednu plotnu. Pak se agarové plotny inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Jednotlivé izolované bakteriální kolonie se sledují na přítomnost plazmidu, obsahující požadovaný fragment promotoru U2. Výsledný plazmid se z bakteriálních buněk izoluje a provádí se jeho charakteristika analýzou s použitím restrikčních enzymů.
7. Vazba syntetického oligo-DBA-nukleotidu 89 (řetězec ID č. 30) a fragment MT-promotoru o velikosti 4,5 kb
Fragment o velikosti 4,5 kb popsaný ve stupni 1, obsahující MT-promotor a zbytek pBR se vzájemně váže na syntetický oligonukleotid 89 (řetězec ID č. 30). Vazná směs se pak přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk, aby došlo k příjmu DNA těmito buňkami. Pak se buněčná suspenze nanese na plotny a po inkubaci se jednotlivé izolované bakteriální kolonie sledují na přítomnost požadovaného plazmidu. Přítomnost tohoto plazmidu je možno prokázat rozštěpením působením restrikčních endonukleáz EcoRI a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, jedné o velikosti 2,0 kb a druhé s velikostí 2,6 kb.
8. Vazba syntetického oligonukleotidu 101 (řetězec ID č. 32) na plazmid, popsaný ve stupni 7
Plazmid, popsaný v předchozím stupni se rozštěpí působením enzymů Bgin a BamHI a oddělí se fragment, obsahující 13 nukleotidů a popsaný ve stupni 1. Výsledný fragment, který obsahuje první oligonukleotid 89 (řetězec ID č. 30) se naváže na oligonukleotid 101 (řetězec ID č. 32), fragment BglII-BamHL Po příjmu DNA bakteriálními buňkami a inkubací se jednotlivé buňky sledují na přítomnost požadovaného plazmidu. Přítomnost tohoto nového plazmidu je možno prokázat štěpením působením endonukleáz EcoRI a Xbal nebo EcoRI a Bgin.
9. Vazba syntetického DNA-oligonukleotídu 99 (řetězec ID č. 31) na fragment o velikosti 4,4 kb, popsaný ve stupni 1
Fragment o velikosti 4,5 kb po štěpení enzymy BglII-BamHI se naváže na DNA-oligonukleotid 99 (řetězec ID č. 31). Po uložení do bakteriálních buněk a inkubaci se analyzují jednotlivé bakteriální kolonie, které obsahují různé molekuly DNA. Požadovaný plazmid je možno prokázat rozštěpením působením restrikčního enzymu EcoRI, při němž vznikají dva fragmenty, s velikostí 1,9 kb a 2,7 kb a také positivní linearisací při použití restrikčního enzymu BglU nebo BamHI.
Nový plazmid se pak rozštěpí působením enzymu Pstl a BamHI. Očekává se vznik dvou molekul, jedné s fragmentem o velikosti 2,6 kg s obsahem zbytku pBR, MT-promotoru a oligonukleotidu, druhou molekulou je zbytek pBR o velikosti 2,0 kb. Fragment s velikostí 2,6 kb se izoluje.
10. Vazba fragmentu plazmidu, popsaného ve stupni 9 o velikosti 2,6 kb na fragment, izolovaný z plazmidu ze stupně 8
Plazmid, popsaný ve stupni 8 a obsahující DNA-oligonukleotidy 89 a 101 (řetězce ID č. 30 a 32) se rozštěpí působením restrikčních enzymů Pstl a BglII. Očekává se vznik dvou fragmentů. První fragment s velikostí 2,5 kb obsahuje zbytek pBR a MT-promotor a fragment s velikostí 2,2 kb obsahuje zbytek pBR a oba svrchu uvedené oligonukleotidy.
Fragment s velikostí 2,2 kb se oddělí a naváže na fragment s velikostí 2,6 kb, obsahující zbytek pBR, MT-promotor a oligonukleotid 99 (řetězec ID č. 31), popsaný ve stupni 8.
-16CZ 290233 B6
Po analýze jednotlivých bakteriálních kolonií na přítomnost požadovaného plazmidu je možno plazmid charakterizovat štěpením pomocí restrikčních endonukleáz BtlU-Xba. Očekává se vznik dvou fragmentů, jednoho o velikosti 270 bp s obsahem oligo-DNA-nukleotidů a druhého s velikostí 4,5 kb, který obsahuje MT-protomoto a pBR.
11. Vazba fragmentu HBV o velikosti 2,3 kb po štěpení enzymem BglII-BglII
Z DNA, obsahující HBV se izoluje fragment o velikosti 2,3 kb po štěpení enzymem Bgin-BglU, obsahující oblasti HBV pre-Sl, pre-S2 a Sjako kódové oblasti. Fragment s velikostí 2,3 kb se pak naváže na fragment s velikostí 4,5 kb, získaný podle stupně 1 a obsahující methallothioneinový promotor.
mikrolitry fragmentu o velikosti 2,3 se smísí se 3 mikrolitry fragmentu s velikostí 4,5 kb a vazba probíhá v celkovém objemu 10 mikrolitrů pufru k provedení vazby s obsahem 2 jednotek T4-DNA-ligázy a 2 mM ATP přes noc při teplotě 14 °C.
Pak se směs po ukončené vazbě přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk pro příjem DNA. Bakteriální buňky se pak nanesou na plotny LB-agaru s obsahem 50 mikrogramů/ml ampicilinu, užije se 50 až 300 mikrolitrů buněčné suspenze na jednu plotnu. Pak se agarové plotny inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Jednotlivé izolované bakteriální kolonie se pak sledují na přítomnost plazmidu, obsahujícího požadovaný fragment.
12. Přeměna části řetězce genu HBV epitopy jádra HBV
Plazmid, získaný ve stupni 11 se rozštěpí působením endonukleáz Bgin a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, a to fragmentu o 550 bp a fragmentu o velikosti 6,25 kb, který se izoluje elektroforézou na agarózovém gelu.
Pak se fragment s velikostí 6,25 kb naváže n fragment s velikostí 270 bp z plazmidu, popsaného ve stupni 10 po rozštěpení enzymy Bgin a Xbal a po izolaci fragmentu svrchu uvedeným způsobem. Fragment o velikosti 270 bp je kódovým řetězcem pro epitop jádra genu HBV.
Směs po provedené vazbě se přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk pro příjem DNA. Po inkubaci se jednotlivé izolované bakteriální kolonie sledují na přítomnost požadovaného plazmidu. Přítomnost nového plazmidu je možno prokázat jeho rozštěpení pomocí enzymu BamHI. Očekává se vznik 3 molekul s velikostí 950 bp, 450 bp a 5150 bp.
13. Příprava „nosného“ plazmidu
Plazmid ze stupně 11 se rozštěpí působením enzymů EcoRI a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, s velikostí 2450 bp a 4350 bp, tyto fragmenty se izolují elektroforézou na gelu.
Fragment s velikostí 4350 bp se naváže na oligo-DNA-nukleotid 39 (řetězec ID č. 29) jde o kódový řetězec, který je úplný řetězcem pro gen HBV-S od kodonu ATG až do místa působení enzymu Xbal, v řetězci byl kodon ATG nahrazen kodonem ATA.
14. Epitop jádra proti směru exprese úplného genu HBV-S „Nosný“ plazmid, získaný v předchozím stupni se rozštěpí působením enzymů Pstl a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, zbytku plazmidu s velikostí 600 bp a fragmentu s velikostí 3850 bp, který se izoluje a naváže na fragment 2800 bp (2700 bp), izolovaný po rozštěpení plazmidu ze stupně 10 působením enzymů Pstl-Xbal.
-17CZ 290233 B6
Po zavedení plazmidů do bakteriálních buněk, inkubaci a pěstování na agaru je možno požadovaný plazmid charakterizovat štěpením restrikčními endonukleázami EcoRI a Xbal nebo EcoRI a BglH a BamHI.
15. Uložení označení, usnadňujícího selekci
Plazmid ze stupně 14 se linearizuje působením enzymu EcoRI. Reakce se provádí v celkovém objemu 50 mikrolitrů při konečné koncentraci DNA plazmidů 1 pg/μΐ. Přidá se 50 jednotek enzymu EcoRI a po provedení štěpné reakce inkubací 3 hodiny při teplotě 37 °C se materiál analyzuje elektroforézou na agarózovém gelu.
Reakce se zastaví přidáním 1 mikrolitrů 0,5 M EDTA a pak se DNA vysráží octanem sodným do konečné koncentrace 0,3 M a 3 až 4 objemy ethanolu 30 minut při teplotě -80 °C. Vysrážená DNA se rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vodě.
mikrolitry linearizovaného plazmidů se smísí se 3 mikrolitry fragmentu DNA, obsahujícího methallothioneinový promotor a selekční gen pro odolnost proti neomycinu, popsaný ve stupni 4 a nechá se proběhnout vazba. Jednotlivé bakteriální kolonie s obsahem získaného materiálu se analyzují na přítomnost požadovaného plazmidů, který se pak izoluje, čistí a charakterizuje.
Každá svrchu uvedená konstrukce genu může být vytvořena také při použití U2-promotoru tak, že se fragment DNA, obsahující MT-promotor po rozštěpení enzymy EcoRI a BglH nahradí fragmentem DNA, obsahujícím U2-promotoru po rozštěpení týmiž enzymy.
16. Izolace selekčního genu pro xanthinguaninfosforibosyltransferázu (egpt) z E. coli
Fragment, obsahující selekční gen egpt, se izoluje po rozštěpení plazmidů pMSG působením BamHI a Bgin a získaný fragment o velikosti 1,8 kb se naváže na fragment o 4,5 kb, popsaný ve stupni 1 (BglII-BamHI), který obsahuje MT-promotor.
Materiál se užije k uložení do buněk, vzniklé kolonie se analyzují na přítomnost plazmidů, který se izoluje, čistí a nakonec se místo působení enzymu BamHI převede na místo působení enzymu EcoRI.
17. Izolace požadovaných řetězců DNA pomocí PCR
Fragment DNA o velikosti 400 bp se izoluje elektroforézou na gelu. Vzniká při použití PCR podle příkladu 5 a specifických oligonukleotidů 131 až 132 (řetězce ID č. 33 až 34) jako primerů.
Fragment DNA se rozštěpí působením endonukleáz BamHI a Xbal a pak se čistí elektroforézou na gelu. Izolovaný PCR-fragment se naváže na fragment s velikostí 6,25 kb, izolovaný z plazmidů, popsaného ve stupni 13 po rozštěpení enzymy BglH a Xbal. Po příjmu DNA a transformaci bakteriálních buněk se analyzují jednotlivé bakteriální kolonie na přítomnost požadovaného plazmidů.
18. Uložení označení pro selekci
Plazmid, popsaný ve stupni 17 se ještě upraví přidáním selekčního genu, popsaného ve stupni 15.
19. Izolace promotoru H2K
Promotor H2K se izoluje tak, že se plazmid pSP65H2 (Exogene) rozštěpí působením endonukleáz EcoRI a BglII a fragment o velikosti 2 kb se izoluje.
-18CZ 290233 B6
Ve všech svrchu uvedených konstrukcích je možné všechny promotory vzájemně zaměnit ve formě fragmentů po působení enzymů EcoRI/BglII.
20. Přeměna části řetězce genu HBV
Plazmid ze stupně 11 se rozštěpí působením endonukleáz BglI a Xbal. Očekává se získání 2 molekul, z nichž jednou je fragment o velikosti 6250 kb, který se izoluje po elektroforéze na agarózovém gelu.
Fragment o velikosti 6250 kb se naváže na oligo-DNA nukleotid 23 (řetězec ID č. 28). Vazná směs se přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk, aby došlo k příjmu DNA. Pak se jednotlivé izolované bakteriální kolonie analyzují na přítomnost požadovaného plazmidu. Přítomnost nového plazmidu je možno prokázat rozštěpením endonukleázami EcoRI aBgin, při němž mají vzniknout dvě molekuly, jedna s velikostí 1,9 kb a druhá s velikostí 4450 kb.
21. Uložení selekčního označení egpt
Plazmid, popsaný ve stupni 20, se linearizuje působením enzymu EcoRI. Reakce se provádí v konečném objemu 100 mikrolitrů při konečné koncentraci DNA plazmidu 0,6 pg/pl. Přidá se 60 jednotek enzymu EcoRI a směs se inkubuje tři hodiny při teplotě 37 °C, ukončené štěpení se prokáže elektroforézou na agarózovém gelu. Reakce se zastaví přidáním 2 mikrolitrů 0,5 M EDTA a DNA se vysráží octanem sodným v konečné koncentraci 0,3 M a 4 objemy ethanolu při teplotě -80 °C, reakce trvá 1 hodinu. Pak se vysráží DNA rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.
mikrolitry linearizovaného plazmidu se smísí se 3 mikrolitry fragmentu DNA o velikosti 3,7 kb, který obsahuje methallothioneinový promotor a selekční gen egpt, popsaného ve stupni 16 po rozštěpení enzymem EcoRI a směs se naváže. Po uložení vzniklého materiálu do bakteriálních buněk se jednotlivé kolonie analyzují na přítomnost požadovaného plazmidu. Každý z genů, uvedených v tabulce ΙΠ je možno připravit obdobným způsobem jako v popsaných stupních 1 až 21 příkladu 3.
Příklad 4
Transfekce buněk savců
Aby bylo možno dosáhnout sekrece většího množství peptidů HBV, je nutno dosáhnout transfekce buněk savců konstrukcemi DNA. Kotransfekce byla prováděna ve dvou krocích (tj. oddělená transfekce pro každý konstrukt nebo v jednom stupni, v němž byla provedena transfekce oběma konstrukty současně). Současnou transfekci bylo možno provést buď s použitím selekčního značení na obou konstruktech, nebo průkazem sekrece produktů exprese obou konstruktů imunologickými zkouškami.
Je také možno postupovat tak, že se spojí do jediné konstrukce řetězce, který je kódem pro řetězec peptidu HBV podle vynálezu a další řetězec, který je kódem pro úplnou bílkovinu oblasti S nebo j ádra nebo HAV:
-19CZ 290233 B6
Příklad 5
Řetězová reakce se použitím polymerázy (PCR)
Při PCR-reakci je možno dosáhnout amplifikace specifických nukleotidových řetězců DNA nebo zvolené oblasti řetězce známého genomu in vitro více než miliónkrát, jak bylo popsáno v publikacích Thomas J. White, Norman Amleim, Henry A. Erlich, 1989, The polymerase chain reaction. Technical Focus, sv. 5, č. 6, S. Kwok a R. Higuchi 1989, Avoiding falše positives with PCR. nátuře, sv. 339, str. 237-238.
DNA, izolovaná z buněk nebo DNA plazmidu se zpracovává tak, aby bylo možno oddělit její komplementární řetězce. Tyto řetězce se pak spojí s přebytkem dvou DNA-oligonukleotidů s délkou vždy 20 až 25 párů bází, které byly chemicky syntetizovány tak, aby odpovídaly řetězcům X nukleotidů, kde X je obvykle 50 až 2000 párů bází.
Oba nukleotidy jsou použity jako specifické primery pro syntézu DNA in vitro, katalyzovanou DNA-polymerázou, při níž dochází ke vzniku kopií DNA mezi oběma řetězci, odpovídajícími použitým dvěma oligonukleotidům. V případě, že oba oligonukleotidy, použité jako primery obsahují příslušné řetězce, je možno vytvořit nová místa štěpení a obou zakončeních 5' a 3'.
Po mnohonásobném opakování reakčních cyklů je možno získat velké množství fragmentu DNA s požadovanou délkou tento fragment je pak možno čistit elektroforézou na gelu a prokázat jeho vlastnosti štěpením působením restrikčních enzymů a elektroforézou na agarózovém gelu. Amplifikovaný, čištěný fragment DNA je pak možno použít k vazbě na další fragmenty nebo plazmidy.
PCR-fragmenty DNA se amplifikují s zarovnaným zakončením. Aby bylo možno získat zakončení, vhodná pro následující vazbu, je nutno fragment rozštěpit požadovanou endonukleázou a pak znovu čistit.
PCR-reakci je možno uskutečnit ve 20 až 30 cyklech. Každý z těchto cyklů se dělí na tři stupně, které se provádějí po různou dobu při odlišných reakčních teplotách, které jsou řízeny automatickým zařízením, PCR-thermo-cyckler. Prvním stupněm je denaturace matrice DNA (1 minuta při 95 °C), druhým stupněm hydridisace této DNA a primerů (1 minuta při 55 °C), třetím stupněm je polymerace (2 minuty při 72 °C).
Konečný objem pro jednu zkoušku je 30 mikrolitrů v následujících konečných koncentracích: PCR-pufr lx, směs nukleotidů s obsahem 200 mikroM každého ze čtyř nukleotidů, 200 ng každého ze dvou primerů ve 30 mikrolitrech a 0,5 jednotky Taq-polymerázy ve 30 mikrolitrech bidestilované vody.
Příklad 6
Pěstování buněk po transfekci a sekrece bílkoviny
Buňky po transfekci (C127 nebo CHO, ATCC) se naočkují na běžné růstové prostředí DMEM s 10 % fetálního telecího séra, glukosou a glutaminem v Petriho miskách v množství 1 až 2 x 106 buněk na misku s průměrem 10 cm ve dni 1. Následujícího dne se prostředí odstraní 4 hodiny před přidáním sraženiny DNA k buňkám a buňky se dvakrát promyjí lx PBS. Pak se přidá 8 ml prostředí DMEm bez fetálního telecího séra (FCS) a po 4 hodinách se k buňkám přidá vysrážená DNA, připravená dále uvedeným způsobem. Po dalších 4 hodinách se prostředí znovu odstraní a přidají se 3 ml prostředku Glycerol-Mix (50 ml 2 x TBS pufru, 30 ml glycerolu a 120 ml destilované vody). Směs se inkubuje 3 minuty při teplotě 37 °C, pak se prostředí okamžitě odstraní a buňky se promyjí 1 x PBS. Pak se buňky pěstují přes noc v 8 ml prostředí DMEM s 10 % FCS.
-20CZ 290233 B6
Po 48 hodinách se buňky od plotny oddělí působením roztoku trypsinu a EDTA (0,025 % trypsinu + 1 mM EDTA). Pak se buňky promyjí 1 x PBS k odstranění tiyprisnu a EDTA, uvedou se do suspenze v prostředí DMEM s 10 % FCS a rozdělí na plotny s 24 vyhloubeními tak, že se buňky z jedné misky rozdělí do 4 těchto ploten.
V případě, že buňky dobře rostou, přidá se selekční prostředí (0,5 až 1 mg/ml neomycinu nebo 250 pg/ml xanthinu, 15 pg/ml hypoxanthinu a 25 pg/ml adeninu, 10 pg/ml thymidinu, 2 pg/ml aminopterinu, 25 pg/ml kyseliny mykofenolové v případě eco-gpt. Prostředí se mění každý týden. Po dvou týdnech je možno pozorovat růst prvních kolonií buněk.
K 10 mikrogramům DNA plazmidu a 20 mikrogramům DNA jako nosiče (DNA ze spermatu lososa nebo z telecího brzlíku) se přidá pufr TE (10 mM tris-HCl a 1 mM EDTA, pH 7,05) do konečného objemu 440 mikrolitrů a přidá se 60 mikrolitrů 2M chloridu vápenatého. Pak se přidá ještě stejné množství 2 x TBS (Hepes 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,05) a směs se dobře promíchá. Tento roztok se inkubuje 30 minut při teplotě 37 °C a pak se přímo přidá k buňkám, určeným pro transfekci.
Příklad Ί
Příprava pomocného prostředku z čištěných částic
K požadované koncentraci antigenu v suspenzi ve sterilním fyziologickém roztoku se přidá Thimerosol v objemovém poměru 1:10 000, dále 1/10 objemu filtrací sterilizovaného 0,2 M roztoku KAld(SO4) x 12H2O. Pak se upraví pH na 5,0 přidáním IN sterilního roztoku hydroxidu sodného a suspenze se míchá 3 hodiny při teplotě místnosti. Antigen, vysrážený hlinitou sloučeninou se oddělí odstředěním 10 minut při 2000 ot/min, uvede se znovu do suspenze a IN roztoku chloridu sodného s obsahem 1:10 000 Thiomerosolu a pak se za sterilních podmínek dělí na jednotlivé podíly.
Příklad 8
Čištění antigenu jádra viru hepatitidy B
Supematant buněk, vylučujících antigen jádra HB se oddělí a koncentruje ultrafiltrací. Koncentrát se vyčeri odstředěním 15 minut při 20 000 ot/min a teplotě 4 °C při použití rotoru SW28 (Beckman).
Tvorba částic se zkouší odstředěním při použití gradientu 0 až 45 % sacharózy a téhož rotoru 24 hodin při 28 000 ot/min a teplotě 4 °C. Gradient se podrobí frakcionaci a frakce se analyzují zkouškou ELISA.
Příklad 9
V následujících tabulkách jsou uvedeny výsledky zkoušky ELISA s imunogenními částicemi podle vynálezu následujícím způsobem.
V následující tabulce IV jsou uvedeny údaje pro čištěné částice antigenu HBs, získané při použití jakékoliv konstrukce řetězce HBV podle vynálezu včetně epitopů pre-Sl a oblasti S s použitím anti-pre-Sl-monoklonální protilátky MA 18/7 a anti-HBs-monoklonální protilátky G022.
V následující tabulce IV jsou uvedeny frakce, které byly získány při použití gradientu CsCl.
-21 CZ 290233 B6
Tabulka VI-1 gradient CsCl frakce č.
zkouška ELISA (E=492) monoklonální protilátka 18/7
0,092
0,210
0,388
1,662
2,604
0,648
0,031
Tabulka IV-2 gradient CsCl frakce č.
zkouška ELISA (E=492) monoklonální protilátka G022
0,136
0,426
0,822
1,970
2,954
0,967
0,076
V tabulce V jsou uvedeny výsledky zkoušky ELISA s čištěnými částicemi antigenu jádra HB z jakékoliv konstrukce řetězce jádra HB podle vynálezu s polyklonálními protilátkami proti jádru HB a monoklonální protilátkou G022.
Tabulka V-l sacharózový gradient frakce č.
Tabulka V-2 zkouška ELISA (E=492) polyklonální protilátky
0,25
0,922
1,423
1,5
1,5
1,28
0,466 sacharózový gradient frakce č. zkouška ELISA (E=492) monoklonální protilátka G022 proti _______________________________________HB-S-Ag________________ 6 0,020
0,024
0,018
0,011
0,015
0,020
0,022
-22CZ 290233 B6
Příklad 10
Zkoušky s podáváním prostředku Hepa-Care u šimpanzů
Hepa-Care jsou částice s povrchovým antigenem viru hepatitidy B (SI a S2) ve specifickém zpracování v poměru 50 : 50, tento prostředek je možno použít k léčení chronických nosičů viru hepatitidy.
Pokus 1
Šimpanzovi 1, který byl nosičem viru hepatitidy B, byl nitrosvalově podán prostředek Hepa-Care v časovém období 0, 4 a 8 týdnů, vždy v dávce 18 mikrogramů v jedné injekci.
Pak byly sledovány jatemí enzymy, výsledek je znázorněn na obr. IV a množství antigenu hepatitidy B v séru, jak je znázorněno na obr. V.
Pokus 2
Šimpanz 1 byl po ošetření, provedeném podle pokusu 1 ještě léčen dalšími injekcemi, které byly podávány v týdnu 30, 34 a 38. Výsledky tohoto léčení jsou uvedeny na obr. VI.
Pokus 3
Šimpanzovi 2 byl podáván prostředek Hepa-Care, avšak prostředek byl podán nitrožilně vždy v dávce 2 mg. Výsledky jsou znázorněny na obr. VIL
U kontrolního šimpanze 3 byly rovněž sledovány jatemí enzymy, výsledek je znázorněn na obr. Vm.
Příklad 11
Léčení prostředkem Hepa-Care (složení prostředkuje popsáno v příkladu 10)
Pacient 1 (muž, 65 let, nemocí trpí 2 roky):
parametry hepatitidy B: HBsAg pos.
anti-HBs neg.
HBeAg neg.
anti-HBe pos.
anti-HBc neg.
Nemocnému byl nitrosvalově podán prostředek Hepa-Care v měsíci 0, 1, 6 a 7. Výsledky měření množství antigenu a protilátky jsou uvedeny na obr. IX a X.
Pacient 2 (žena, 48 let, onemocnění trvá 12 let):
parametry hepatitidy B: HBsAgpos.
HbeAgneg.
anti-HBsneg.
anti-HBepos.
anti-HBcpos.
-23CZ 290233 B6
Nemocné byl nitrosvalově podán prostředek Hepa-Care v měsíci 0, 1 a 6. Výsledky měření množství antigenu a protilátky jsou uvedeny na obr. XI a ΧΠ.
Pacient 3 (žena, 41 let, onemocnění trvá 5 let):
parametry hepatitidy B: HBsAg pos.
HBeAg neg.
anti-HBs neg.
nati-HBe pos.
Nitrosvalově byl podáván Hepa-Care v měsíci 0, 1, 2 a 5. Hodnoty antigenu a protilátky jsou uvedeny na obr. ΧΠ a XTV.
Seznam řetězců řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
558 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT AGA TCT CAA TCG CCG CGT CGC AGA
AGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG
-24CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce:
řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
504 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace
ATG ACT GAC GTG ATT. GAG GAC TTA CCT CTC tat TCG AAA TTT GAA TTG TTT CCT GGA TCT GCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
T^C GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AÁT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT
-25CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce:
řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
504 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifíkace
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT ccc TCG CCT
CGC AGA CGT
-26CZ 290233 B6
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: 5 řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj: 4 nukleotid 534 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace
TCC AAC CTG TGC CTT
ATG GAC ATT GAC CCT TAT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG
TTC TTT CCT TCC GTA CGA
GCC TCA GCT CTG TAT CGA
CCT GAG CAT TGC TCA CCT
AGG CAA GCC ATT CTC TGC
ACT CTA GCT ACC TGG GTG
GAT CCA GCA TCC AGA GAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT
CTA TTG TGG TTT CAT ATA
GGA AGA GAG ACT GTA CTT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC
AGA CCA CCA AAT GCC CCT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT
UUU AGG TCC Λ AGA AGA
10 AGA CGT
GGG TGG CTT TGG GGC
AAA GAA TTT GGA GCT j
TTT TTG CCT TCT GAC
GAT CTC CTA GAC ACC
GAA GCC TTA GAG TCT
CAC CAT ACT GCA CTC
TGG GGG GAA TTG ATG
ku A AAT AAT TTG CAA
CTA GTA GTC AAT TAT
TTA AAG ATC AGG CAA
TCT TGC CTT ACT TTT
GAA TAT TTG GTC TCT
ACT CCT CCA GCC TAT
ATG TTA TCA ACA CTT
AGA CGA CGG GAC CGA
AGA ACT CCC TCG CCT
-27CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
534 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT' CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG CAT ATA TCT TGC CTT ACT ’ TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
um* AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT ccc TCG CCT
CGC AGA CGT
-28CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG ACT CTA GCT ACC TGG GTG
GGC AAT AAT TTG GAA GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG
TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTC TTT CCT TCC GTC AGG řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid 114bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
TCC AAC TTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC ATG
GAC ATT GAC CCT TAT AAA DAA GGA GCT ACT
GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTC
TTT CCT TCC GTC AGG
-29CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
GAT CTC CTA GAC ACC GCC TCA GCT CTG TAT CGA
GAA GCC TTA GAG TCT CCT GAG CTA TGC TCA CCT
CAC CAT ACT GCA CTC AGG CAA GGT
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj : pokusný zdroj:
nukleotid
261 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTC AGG GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CTA TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GGT ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGC AAT AAT TTG GAA
GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT
-30CZ 290233 B6
řetězec ID č. 11
typ řetězce: nukleotid
délka řetězce: 291 bp
řetězec: jednoduchý
topologie: lineární
typ molekuly: DNA genomu
původní zdroj: jádro HBV
pokusný zdroj: chemická syntéza
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTC AGG GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CTA TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GGT ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG
AÓT CTA GCT ACC TGG GTG GGC AAT AAT TTG GAA
GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT
io řetězec ID č. 12
typ řetězce: nukleotid
délka řetězce: 123 bp
řetězec: jednoduchý
topologie: lineární
15 typ molekuly: DNA genomu
původní zdroj: jádro HBV
pokusný zdroj: chemická syntéza
ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA GAT CCA GCA
TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT GTT AAT ACT
AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA CTA TTG TGG
TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
-31 CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: s řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
138 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT GTT AAT
ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA CTA TTG
TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT GGA AGA
GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT TTC GGA
GTG TGG
-32CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
294 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S2 ayw/adw DNA HBV
ATG CAA CAG GAT TGG CCC AAT AGA TCC GTG AGA AGA ACC GGC TTC CTG CAC TAT CAA TTC ACT CGT CTG GCT
GGT GGC TCC AGT TCA GGA ACA GTA AAC CCT GTT CTG
ACT ACT GCC TCT CCC TTA TCG TCA ATC TTC TCG AGG
ATA GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTT
CTC GTG TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA
ATC CTC ACA ATA CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG
ACT TCT CTC AAT TTT CTA GGG GGA ACT ACC GTG TGT
CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC TCA ACC TCC AAT CAC
TCA CCA ACC TCT TGT CCT CCA ACT TGT CCT GGT TAT
CGC TGG ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC ATC TTC CTC
TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TTC TTG TTG GTT
ctt CTG GAC TAT CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCT
CTA ATT CCA GGA TCC TCA ACA ACC AGC ACG GGA CCA
TGC CGG ACC TGC ATG ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT
ATG TAT CCC TCC TGT TGC TGT ACC AAA CCT TCG GAC
GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCA TCC TGG
GCT TTC GGA AAA TTC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GCC
CGT TTC TCC TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT
CAG TGG TTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT
TCA GTT ATA TGG ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT
CTG TAC AGC ATC TTG AGT CCC TTT TTA CCG CTG TTA
CCA ATT TTC TTT TGT CTT TGG GTA TAC ATT
-33CZ 290233 B6 nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
TAT GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG
CAA CTA TTG TGG J JŤ· CAT ATA TCT TGG CTT ACT
TTT GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
390 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV PCR-amplifikace
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC
-34CZ 290233 B6 nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV SI ay chemická syntéza řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
AAT CCT CGT GGA TTC TTT
CCA GCC TTC AGA GCA AAC
Asn Pro Leu Gly Phe Phe
Pro Ala Phe Arg Ala Asn
řetězec ID č. 18
typ řetězce: nukleotid
délka řetězce: 63 bp
řetězec: jednoduchý
topologie: lineární
typ molekuly: DNA genomu
původní zdroj: HBV SI ay
pokusný zdroj: chemická syntéza
CCC GÁT CAC CAG TTG GAT
ACC GCA
Pro Asp His Gin Leu Asp
Thr Ala
CCT GCC TCC ACC AAT CGC
ACC CCG CTG TCT CCA CCT
Pro Ala Ser Thr Asn Arg
Thr Pro Ile Ser Pro Pro
CAG TTG TCA AGA GGA AAC AGG CAG CCT
Gin Ser Gly Arg Gin Pro
Leu Arg Asn
-35CZ 290233 B6 nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBVS1 ay chemická syntéza řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie; typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
GAT CCA GCC TTC AGA GCA AAC ACC GCA AAT CCA GAT
TGG GAC TTC AAT CCC AAC AAG GAC ACC
Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp
Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
108 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S1 ay chemická syntéza
CCG CAC GGA GGC CTT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT
CAG GGC ATA CTA CAA ACT TTG CCA GCA AAT CCG CCT
CCT GCC TCC ACC AAT CGC CAG TCA GGA AGG CAG CCT
Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gin Ala
Gin Gly Ile Leu Glu Thr Leu Pro Ala Asn Pro Pro
Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro
-36CZ 290233 B6 nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV Sl ad chemická syntéza řetězec ID ě. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT
ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA AGA GAC - X
řetězec ID č. 22
typ řetězce: nukleotid
délka řetězce: 108 bp
řetězec: jednoduchý
topologie: lineární
typ molekuly: DNA genomu
původní zdroj: HBV Sl ad
pokusný zdroj: chemická syntéza
CCA CAC GGC GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT
CAG GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT CCT
CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT
Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gin Ala
Gin Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Tht Ile Pro Pro
Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
CAG TGG nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S2 ay chemická syntéza
AAT TCC AGA ACC TTC CAC CAA ACT CTG
CAA
GAT CGC AGA GŤG AGA GGC
CTG TAT
-37CZ 290233 B6
řetězec ID č. 24
typ řetězce: nukleotid
délka řetězce: 60 bp
řetězec: jednoduchý
topologie: lineární
typ molekuly: DNA genomu
původní zdroj: HBV S2 ay
pokusný zdroj: chemická syntéza
GAT CCC AGA GTG AGA GGC CTG TAT TTC CCT GCT
GGT GGC TCC AGT TCA GGA ACA GTA AAC - X
10 řetězec ID č. 25
typ řetězce: nukleotid
délka řetězce: 558 bp
řetězec: jednoduchý
topologie: lineární
15 typ molekuly: DNA genomu
původní zdroj: jádro HBV adw
pokusný zdroj: PCR-amplifikace
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA GTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT AGA TCT CAA TCG CCG CGT CGC AGA
AGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG
-38CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce:
délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: 10 pokusný zdroj :
nukleotid
678 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S adw/ayw HBV DNA
ATA GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTT CTC
GTG TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC
ACA ATA CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC
AAT TTT CTA GGG GGA ACT ACC GTG TGT CTT GGC CAA AAT
TCG CAG TCC TCA. ACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCT TGT
CCT CCA ACT TGT CCT GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG
CGT TTT ATC ATC TTC CTC TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC
ATC TTC tomfe X 1 © TTG GTT CTT CTG GAC TAT CAA GGT ATG TTG
ccc GTT TGT CTÁ ATT CCA GGA tcc TCA ACA ACC AGC
ACG GGA CCA TGC CGG ACC TGC ATG ACT ACT GCT CAA GGA
ACC TCT ATG TAT CCC TCC TGT Í.V3V. TGT ACC AAA CCT TCG
GAC fe fe * AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCA TCC TGG
GCT TTC GGA AAA TTC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GCC CGT
TTC TCC TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG
TTC GTA fefefe femm Ci x TCC CCC ACT GTT TGG TCA GTT ATA
mfefe ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC
TTG AGT CCC rp φψ- TTA CCG CTG TTA CCA. ATT TTC TTT TGT
CTT áier· i <3 VI GTA TÁC ATT
-39CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce:
řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
585 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBV S adw/ayw DNA HBV
CTA GAC TCG TGG ACT TCT CTC AAT TTT CTA
GGA TCT CCC GTG TGT CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC
CCA ACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCC TGT CCT CCA
ATT TGT. CCT GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG CGT
TTT ATC ATA TTC CTC TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC
ATC TTC TTA TTG GTT CTT CTG GAT TAT CAA GGT ATG
TTG CCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGA TCA ACA ACA
ACC AGT ACG GGA CCA TGC AAA ACC TGC ACG ACT CCT
GCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT CCC TCA TGT TGC TGT
ACA AAA CCT ACG GAT GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC
ATC CCA TCG TCC TGG GCT TTC GCA AAA TAC CTA TGG
GAG TGG GCC TCA GTC CGT TTC TCT TGG CTC AGT TTA
CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG TTC GTA GGG CTT TCC
CCC ACT GTT TGG CTT TCA GCT ATA TGG ATG ATG TGG
TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC GTG ÁGT CCC
TTT ATÁ CCG CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGT CTC TGG
GTA TAC ATT
-40CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
106 bp jednoduchý lineární
DNA genomu
HBVS1 chemická syntéza
5'-GAT-CTT-TAA-CAT-GGA-GAA-CAA-TCC-TCT-G GG-ATT-CTT-TCC-CGA-TCA-CAA-GTT-GGA-TCC-A gc-ctt-cag-agc-aaa-cac-cgc-aaa-tcc-aga-t TG-GGA-CTT-CAA-TCC-CAG“ CT') - 3* nukleotid
115 bp jednoduchý lineární
DNA genomu HBVS chemická syntéza
5'-AAT-TCT-AGA-CTC-GAG-TCT-GAA-CAT-AGA-G AA-CAT-CAC-ATC-AGG-ATT-CCT-AGG-ACC-CCT-T CT-CGT-GTT-ACA-GGC-GGG-GTT-TTT-CTT-GTT-G AC-AAG-AAT-CCT-CAC-AAT-ACC-GCA-GAG-(C)-3' nukleotid
108 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
5*-GAT-CTT-TTA-AAG-GGA-TCC-TCT-GCT-GGG-G gg-aat-gga-tga-ctc-tag-cta-cct-ggg-tgg-g
CA-ATA-ATT-TGG-AAG-ATC-CAG-CAT-CTA-GGG-A
CC-TTG-TAG-TAA-ATC-TAG-AC- (A)-3*
-41 CZ 290233 B6 řetězec LD č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
řetězec LD č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
řetězec DD č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
106 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza ' -GAT-CTC-CGG-GAA-TTC-CTG-GGG-CAT-GGA-C
AT-TGA-CCC-TTA-TAA-AGA-ATT-TGG-AGC-TAC-T
GT-GGA-GTT-ACT-CTC-GTT-TTT-GCC-TTC-TGA-C
TT-CTT-TCC-TTC-CGT-CAG- (G) -3' nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
5'-gat-ctc-cta-gac-acc-gcc-tca-gct-ctg-t
AT-CGA-GAA-GCC-TTA-GAG-TCT-CCT-GAG-CAT-T
GC-TCA-CCT-CAC-CAT-ACT-GCA-CTC-AGG-CAA-G “(G)-3* nukleotid bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza i '-TTG-GAT-CCT-CCA-ACC-TGT-GCC-TTG G ) -3 '
-42CZ 290233 B6 řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec:
topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
5'-CCT-CTA-GAA-CCA-AAT-ATT-CAA-GTA-(C)-3
10 řetězec ID č. 35
typ řetězce: nukleotid
délka řetězce: 588 bp
řetězec: jednoduchý
topologie: lineární
15 typ molekuly: DNA genomu
původní zdroj: jádro HBV
pokusný zdroj: chemická syntéza
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG T xT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT AGA TCT CAA TCG CCG CGT CGC AGA
AGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG
-43CZ 290233 B6

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití kombinace
    a) alespoň jednoho polypeptidového řetězce, obsahujícího alespoň jeden antigenní epitop pro aktivaci T-buněk viru hepatitidy a
    b) nosiče, schopného umožnit účinek polypeptidových řetězců a) s antigenním epitopem, přičemž polypeptidové řetězce a) mohou být na nosič b) vázány kovalentní nebo hydrofobní vazbou, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chronické virové hepatitidy.
  2. 2. Použití kombinace podle nároku 1, kde polypeptidovým řetězcem a) nebo polypeptidovými řetězci a) j sou polypeptidy viru hepatitidy B.
  3. 3. Použití kombinace podle nároku 1 a 2, kde každým polypeptidovým řetězcem a) přítomným v prostředku je řetězec aminokyselin zvolený ze skupiny, zahrnující peptidy pre Sl, pře S2, S a antigeny jádra viru HB.
  4. 4. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 3, kde polypeptidové řetězce a) v nativní formě mohou být modifikovány některým z následujících způsobů:
    i) je možno vypustit některé části řetězce, přičemž musí být zachován epitop, který obsahuje alespoň šest po sobě následujících zbytků aminokyselin, ii) jednu nebo větší počet aminokyselin jev řetězci možno nahradit, nebo iii) je možno přidat další aminokyseliny nebo řetězce aminokyselin na N-terminálním nebo na C-terminálním zakončení nebo také uprostřed polypeptidového řetězce nebo řetězců a).
  5. 5. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 4, kde polypeptidový řetězec a) je myristylován.
  6. 6. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 5, kde polypeptidový řetězec nebo řetězce a) jsou produktem exprese rekombinantní molekuly DNA.
  7. 7. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6, kde řetězcem nosiče b) je polysacharid, hydrofobní polymer nebo anorganická molekula v částicové formě.
  8. 8. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6, kde řetězcem nosiče b) je další polypeptidový řetězec.
  9. 9. Použití kombinace podle nároku 8, kde polypeptidový řetězec nosiče b) po své sekreci vytváří částice, které mají průměr alespoň 10 nm.
  10. 10. Použití kombinace podle nároků 8 nebo 9, kde polypeptidovým řetězcem nosiče b) je podstatná část nebo úplný řetězec aminokyselin polypeptidů ze skupiny S-peptidu HBV, peptidu jádra HBV, antigenu jádra HAV nebo antigenu jádra HIV nebo také povrchového antigenu viru dětské obrny, nebo některého z virů HAV nebo HTV.
    -44CZ 290233 B6
  11. 11. Použití kombinace podle některého z nároků 8 až 10, kde polypeptidový řetězec nosiče b) je modifikován některým z následujících způsobů:
    i) vypuštění některých částí, přičemž schopnost vytvářet částice musí být zachovány, ii) náhradou j edné nebo několika aminokyselin j inými aminokyselinami, nebo nebo uprostřed polypeptidového řetězce nosiče b).
  12. 12. Použití kombinace podle některého z nároků 8 až 11, kde polypeptidový řetězec nosiče b) je myristylován.
  13. 13. Použití podle některého z nároků 8 až 12, kde polypeptidový řetězec nosiče b) je produktem exprese rekombinantní DNA.
  14. 14. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6, nebo 8 až 12, kde polypeptidové řetězce a) a polypeptidové řetězce nosiče b) jsou spolu spojeny disulfidovými můstky.
  15. 15. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6, nebo 8 až 13, kde polypeptidové řetězce a) a polypeptidové řetězce nosiče b) jsou spolu spojeny hydrofobním spojením, zprostředkovaným kyselinou myristovou.
  16. 16. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 6 a 8 až 14, kde polypeptidové řetězce a) a polypeptidové řetězce nosiče b) jsou spolu spojeny peptidovaný vazbou, přičemž je popřípadě mezi polypeptidový řetězec a) a polypeptidový řetězec nosiče b) uložen další řetězec, který je k polypeptidovému řetězci a) a polypeptidovému řetězci nosiče b) vázán peptidovými vazbami.
  17. 17. Použití kombinace podle nároku 16, kde polypeptidový řetězec nebo řetězce a) a polypeptidový řetězec nosiče b) jsou kódovány za sebou v téže rekombinantní molekule DNA.
  18. 18. Použití kombinace podle nároku 17, kde k expresi polypeptidového řetězce nebo řetězců a) a polypeptidového řetězce nosiče b) dochází z téhož otevřeného čtecího rámce uvedené molekuly DNA, přičemž tyto řetězce jsou popřípadě od sebe odděleny dalším peptidovým řetězcem, jehož kód je rovněž uložen v témž otevřeném čtecím rámci.
  19. 19. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 18, kde prostředek je ve formě určené pro podání nitrožilní nebo nitrosvalové injekcí.
CZ19931186A 1990-12-19 1991-12-19 Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy CZ290233B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP90124775A EP0491077A1 (en) 1990-12-19 1990-12-19 A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
PCT/EP1991/002460 WO1992011368A1 (en) 1990-12-19 1991-12-19 A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ118693A3 CZ118693A3 (en) 1994-02-16
CZ290233B6 true CZ290233B6 (cs) 2002-06-12

Family

ID=8204863

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19931186A CZ290233B6 (cs) 1990-12-19 1991-12-19 Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy

Country Status (15)

Country Link
US (2) US6020167A (cs)
EP (2) EP0491077A1 (cs)
JP (2) JP3857305B2 (cs)
KR (1) KR0156587B1 (cs)
AT (1) ATE170220T1 (cs)
AU (1) AU657935B2 (cs)
CA (1) CA2098021C (cs)
CZ (1) CZ290233B6 (cs)
DE (1) DE69130071T3 (cs)
DK (1) DK0563093T4 (cs)
ES (1) ES2121000T5 (cs)
HK (1) HK1002901A1 (cs)
HU (1) HU216301B (cs)
SK (1) SK280551B6 (cs)
WO (1) WO1992011368A1 (cs)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988010300A1 (en) * 1987-06-22 1988-12-29 Medico Labs Ag Heterologous viral peptide particle immunogens
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
DE4107612A1 (de) * 1991-03-09 1992-09-10 Behringwerke Ag Rekombinante proteine mit der immunreaktivitaet des hepatitis b virus e antigens (hbeag), verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in immunoassays und impfstoffen
US6689363B1 (en) 1992-01-29 2004-02-10 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US7611713B2 (en) 1993-03-05 2009-11-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
BR9709993A (pt) * 1996-06-25 1999-08-10 Stichting Inst Dierhouderij Vacina preparação de vacina composição processo para produção de uma preparação imugênica e preparação imugênica
US7091324B2 (en) 1998-11-05 2006-08-15 Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational epitopes
CN1268345C (zh) * 2000-03-29 2006-08-09 乔治敦大学 治疗丁型肝炎病毒感染的核苷化合物
IL142802A (en) * 2000-04-27 2015-01-29 Enzo Therapeutics Inc Use of one or more HBV antigens for the preparation of oral pharmaceutical preparations for the treatment of a person with active HBV infection or hepatocellular carcinoma
US6787526B1 (en) 2000-05-26 2004-09-07 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides
US7022830B2 (en) * 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
KR20030074787A (ko) * 2001-02-05 2003-09-19 스트레스젠 바이오테크놀러지스 코포레이션 Ｂ형 간염 바이러스 치료
US7351413B2 (en) * 2002-02-21 2008-04-01 Lorantis, Limited Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis
US8420353B2 (en) * 2002-03-22 2013-04-16 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
DE10339927A1 (de) * 2003-08-29 2005-03-24 Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen
GB0326416D0 (en) 2003-11-12 2003-12-17 Karolinska Innovations Ab Methods and means relating to hepatitis B infection
WO2005050214A2 (en) * 2003-11-12 2005-06-02 Hbv Theranostica Ab Methods and means relating to hepatitis b infection
US9603921B2 (en) * 2004-10-27 2017-03-28 Janssen Vaccines Ag Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus
US8071561B2 (en) * 2007-08-16 2011-12-06 Chrontech Pharma Ab Immunogen platform
WO2009092396A1 (en) 2008-01-25 2009-07-30 Universitätsklinikum Heidelberg Hydrophobic modified pres-derived peptides of hepatitis b virus (hbv) and their use as hbv and hdv entry inhibitors
CN101485672B (zh) * 2008-12-05 2010-08-25 广东粤龙药业有限公司 异丙景糖酐在制备治疗人HBeAg阳性慢性乙型肝炎药物中的应用
US10076570B2 (en) 2009-08-07 2018-09-18 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection
EP2461826A2 (en) 2009-08-07 2012-06-13 Transgene SA Composition for treating hbv infection

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US34705A (en) * 1862-03-18 Improvement in tompions for fire-arms
US3636191A (en) * 1969-10-08 1972-01-18 Cancer Res Inst Vaccine against viral hepatitis and process
FR2480779B2 (fr) * 1979-08-30 1986-07-18 Anvar Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur
IN151589B (cs) * 1978-12-22 1983-05-28 Biogen Nv
EP0182442B2 (en) * 1978-12-22 1996-04-03 Biogen, Inc. Recombinant DNA molecules and their method of production
US4935235A (en) * 1979-05-24 1990-06-19 The Regents Of The University Of California Non-passageable viruses
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
US5196194A (en) * 1979-05-24 1993-03-23 The Regents Of The University Of California Vaccines containing Hepatitis B S-protein
USRE34705E (en) 1979-08-30 1994-08-23 Institut Pasteur Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby
US4415491A (en) * 1980-01-14 1983-11-15 The Regents Of The University Of California Synthetic vaccine peptide epitomes of hepatitis B surface antigen
EP0038765B1 (fr) * 1980-04-22 1987-09-02 Institut Pasteur Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin
FI83662C (fi) * 1980-07-17 1991-08-12 Scripps Clinic Res Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning.
GR76274B (cs) * 1981-08-04 1984-08-04 Univ California
AU8746582A (en) * 1981-09-02 1983-03-10 Biogen N.V. Hepatitis b virus e type antigen
US4741901A (en) * 1981-12-03 1988-05-03 Genentech, Inc. Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
JPS58194897A (ja) * 1982-05-07 1983-11-12 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｄｎａ，その製造方法およびそれで形質転換させた宿主
JPS5936698A (ja) * 1982-08-20 1984-02-28 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞
US4977092A (en) * 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US5198348A (en) * 1982-08-30 1993-03-30 Amgen Inc. Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
JPS5974985A (ja) * 1982-10-19 1984-04-27 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｄｎａ
CA1341116C (en) * 1983-02-22 2000-10-17 Rae Lyn Burke Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein
US4696898A (en) * 1984-01-16 1987-09-29 Integrated Genetics, Inc. Vector encoding hepatitis B surface antigen
FR2559159B1 (fr) * 1984-02-02 1986-09-12 Inst Nat Sante Rech Med Vecteurs viraux de clonage et d'expression d'une proteine dans une cellule eucaryote, comportant au moins une partie du genome d'un retro-virus; cellules eucaryotes transfectees; procede utilisant de telles cellules et proteines obtenues
FR2560890B1 (fr) * 1984-03-07 1987-10-16 Grp Genie Genetique Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention
US5158769A (en) * 1984-03-07 1992-10-27 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5324513A (en) * 1984-03-07 1994-06-28 Institut Pasteur Composition useful for the fabrication of vaccines
US5204096A (en) * 1984-03-07 1993-04-20 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US4861588A (en) * 1985-02-05 1989-08-29 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US4847080A (en) * 1984-03-07 1989-07-11 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers
US4777240A (en) * 1984-03-08 1988-10-11 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US4942125A (en) * 1984-09-07 1990-07-17 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
AU579148B2 (en) * 1984-03-09 1988-11-17 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants
US5098704A (en) * 1984-06-18 1992-03-24 Chiron Corporation Hepatitis surface antigen particle vaccine
EP0171908A3 (en) * 1984-07-11 1987-07-15 Takeda Chemical Industries, Ltd. Hepatitis b virus surface antigen and production thereof
GB8421282D0 (en) * 1984-08-22 1984-09-26 Connaught Lab Multispecific antigenic proteins
US4722940A (en) * 1984-08-23 1988-02-02 Georgia Tech Research Corporation Aminoalkyl phenyl selenides for the treatment of hypertension and nervous system dysfunctions
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
EP0175261B1 (en) * 1984-09-12 1991-12-11 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US4639371A (en) * 1984-10-02 1987-01-27 New York Blood Center, Inc. Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom
EP0180012A1 (de) * 1984-10-27 1986-05-07 Wolfram H. Prof. Dr. Gerlich Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus
US4683136A (en) * 1985-03-06 1987-07-28 Scripps Clinic And Research Foundation Proteinaceous antigens with conformation-independent and conformation-dependent determinants
CA1324094C (en) * 1985-04-03 1993-11-09 Dino Dina Hepatitis a virus vaccines
FI861417A0 (fi) * 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US5837249A (en) * 1985-04-19 1998-11-17 The Wistar Institute Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus
US4639271A (en) * 1985-04-24 1987-01-27 Moore Business Forms, Inc. Chromogenic mixtures
FR2581394B1 (fr) * 1985-05-02 1988-08-05 Grp Genie Genetique Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes
US4649192A (en) * 1985-05-30 1987-03-10 Smith Kline-Rit Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate
JPH084507B2 (ja) * 1985-10-03 1996-01-24 武田薬品工業株式会社 新規ｄｎａおよびポリペプチド
US4959323A (en) * 1985-11-04 1990-09-25 Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Production and use of pre S polypeptides of hepatitis B virus
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
US4816564A (en) * 1986-01-31 1989-03-28 Merck & Co., Inc. Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast
US4742158A (en) * 1986-04-25 1988-05-03 Merck & Co., Inc. Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding
IE59389B1 (en) * 1986-05-23 1994-12-23 Merck & Co Inc Method for producing hepatitis b virus core antigen (HBcAg) in yeast
CA1310602C (en) * 1986-06-03 1992-11-24 Hajime Horii Yeast promoter and process for preparing heterologous protein
JPH01500515A (ja) * 1986-06-20 1989-02-23 スクリップス　クリニック　アンド　リサーチ　ファウンデーション Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原のプレｓ領域のｔ及びｂ細胞エピトープ
US5068185A (en) * 1986-07-10 1991-11-26 Merck & Co., Inc. Trains of yeast for the expression of heterologous genes
IL79740A0 (en) * 1986-08-17 1986-11-30 Yeda Res & Dev Hepatitis vaccine
US4882145A (en) * 1986-12-09 1989-11-21 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US5143726A (en) * 1986-12-09 1992-09-01 The Scripps Research Institute T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US4818527A (en) * 1986-12-09 1989-04-04 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
ZA88488B (en) * 1987-01-30 1988-10-26 Smith Kline Rit Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them
EP1088830A3 (en) * 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
WO1988010300A1 (en) * 1987-06-22 1988-12-29 Medico Labs Ag Heterologous viral peptide particle immunogens
US4883865A (en) * 1987-09-30 1989-11-28 Merck & Co. Inc. Recovery of pres2+s antigen
US4963483A (en) * 1987-10-13 1990-10-16 Merck & Co., Inc. Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast
US5011915A (en) * 1987-10-26 1991-04-30 Merck & Co., Inc. Process for purifying recombinant hepatitis antigens
US5039522A (en) * 1988-01-29 1991-08-13 New York Blood Center, Inc. Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen
NZ229260A (en) * 1988-06-03 1994-02-25 Merck & Co Inc Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and
US5242812A (en) * 1989-02-07 1993-09-07 Bio-Technology General Corp. Method for production and purification of hepatitis B vaccine
US5462863A (en) * 1989-02-09 1995-10-31 Development Center For Biotechnology Isolation of Hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells
GB8903313D0 (en) * 1989-02-14 1989-04-05 Wellcome Found Conjugates
DK0414374T3 (da) * 1989-07-25 1998-03-09 Smithkline Beecham Biolog Hidtil ukendte antigener og fremgangsmåder til fremstilling deraf
EP0421626A1 (en) * 1989-09-19 1991-04-10 Merck & Co. Inc. Vaccine for aids and hepatitis B
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
US5102989A (en) * 1991-03-15 1992-04-07 Merck & Co., Inc. Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells
IL101653A0 (en) * 1991-04-29 1992-12-30 Merck & Co Inc Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles
CA2067003A1 (en) * 1991-04-29 1992-10-30 Peter J. Kniskern Hbsag escape mutant vaccine
US5840303A (en) * 1991-08-26 1998-11-24 The Scripps Research Foundation Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus
JP2501186Y2 (ja) * 1992-03-31 1996-06-12 株式会社栗本鐵工所 ハンマ―ミル
CN1063343C (zh) * 1993-04-27 2001-03-21 中国科学院上海生物化学研究所 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白
CN1094311A (zh) * 1993-04-27 1994-11-02 中国科学院上海生物化学研究所 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白
CN1059927C (zh) * 1994-03-10 2000-12-27 中国科学院上海生物化学研究所 羧端带有前表面抗原1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因及其编码蛋白
US5792163A (en) * 1996-01-03 1998-08-11 Hitzig; Gary Linear punch

Also Published As

Publication number Publication date
SK63693A3 (en) 1993-10-06
DE69130071T2 (de) 1999-01-07
DE69130071D1 (de) 1998-10-01
WO1992011368A1 (en) 1992-07-09
AU657935B2 (en) 1995-03-30
CA2098021C (en) 2000-04-25
HUT66437A (en) 1994-11-28
US20030235591A1 (en) 2003-12-25
KR0156587B1 (en) 1998-10-15
DK0563093T4 (da) 2008-01-21
CZ118693A3 (en) 1994-02-16
DK0563093T3 (da) 1999-02-08
EP0563093B2 (en) 2007-10-03
HU9301794D0 (en) 1993-10-28
EP0491077A1 (en) 1992-06-24
SK280551B6 (sk) 2000-03-13
CA2098021A1 (en) 1992-06-20
JP2001019643A (ja) 2001-01-23
US6020167A (en) 2000-02-01
HU216301B (hu) 1999-06-28
HK1002901A1 (en) 1998-09-25
EP0563093A1 (en) 1993-10-06
JPH06507303A (ja) 1994-08-25
AU9081791A (en) 1992-07-22
JP3857305B2 (ja) 2006-12-13
EP0563093B1 (en) 1998-08-26
DE69130071T3 (de) 2008-02-21
ATE170220T1 (de) 1998-09-15
ES2121000T5 (es) 2008-04-16
ES2121000T3 (es) 1998-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ290233B6 (cs) Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy
JP2758184B2 (ja) 肝炎ｂ表面抗原ワクチン
Charbit et al. Presentation of two epitopes of the preS2 region of hepatitis B virus on live recombinant bacteria.
KR100208129B1 (ko) B형 간염 백신
Sureau et al. Production of infectious hepatitis delta virus in vitro and neutralization with antibodies directed against hepatitis B virus pre-S antigens
US20090239265A1 (en) Virus like particles
IE69265B1 (en) Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins
Pride et al. Evaluation of B and T-cell responses in chimpanzees immunized with Hepagene®, a hepatitis B vaccine containing pre-S1, pre-S2 and S gene products
CA2067003A1 (en) Hbsag escape mutant vaccine
JP2000154152A (ja) 肝炎療剤
Wu et al. A novel hepatitis B virus variant S 129 (Gln→ Leu): Lack of correlation between antigenicity and immunogenicity
NO885658L (no) Retrovirusekspresjonsvektorer og fremgangsmaater for fremstilling av hbv-antigener.
KR970007153B1 (ko) B형 간염 표면 항원 백신
SK118293A3 (en) Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles
KR960004264B1 (ko) B형 간염 표면항원, 이의 생성 진핵 세포 및 백신의 제조방법, 검정방법 및 진단용 키트
Michel et al. Synthesis in CHO cells of hepatitis B surface antigen containing the pre-S2 region expression product
AU2001276182B2 (en) Improved virus like particles based on small envelope protein from hepatitis B (HBsAg-S)
AU2001276182A1 (en) Improved virus like particles based on small envelope protein from hepatitis B (HBsAg-S)

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20081219