SK280551B6 - Použitie kombinovaného prípravku na výrobu liečiva - Google Patents
Použitie kombinovaného prípravku na výrobu liečiva Download PDFInfo
- Publication number
- SK280551B6 SK280551B6 SK636-93A SK63693A SK280551B6 SK 280551 B6 SK280551 B6 SK 280551B6 SK 63693 A SK63693 A SK 63693A SK 280551 B6 SK280551 B6 SK 280551B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- chain
- polypeptide chain
- polypeptide
- dna
- string
- Prior art date
Links
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 26
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 title abstract description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title abstract 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 74
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 122
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 27
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 25
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 21
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 16
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 5
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N s-peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N 0.000 claims 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 84
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 43
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 17
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 17
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 16
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 6
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N Ala-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 3
- 108010055991 BglII endonuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 3
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- IRKWVRSEQFTGGV-VEVYYDQMSA-N Thr-Asn-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O IRKWVRSEQFTGGV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100025840 Coiled-coil domain-containing protein 86 Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 2
- FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N His-Gly-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 101000932708 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 86 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JRJLGNFWYFSJHB-HOCLYGCPSA-N Leu-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O JRJLGNFWYFSJHB-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 2
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 2
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 2
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- -1 prednisolone Chemical class 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GORKKVHIBWAQHM-GCJQMDKQSA-N Ala-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GORKKVHIBWAQHM-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 1
- DFCIPNHFKOQAME-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFCIPNHFKOQAME-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N Asn-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IDDMGSKZQDEDGA-SRVKXCTJSA-N Asp-Phe-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IDDMGSKZQDEDGA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000020089 Atacta Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020847 Body for Life Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010092265 CCWGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101000896148 Enterobacteria phage T4 Baseplate central spike complex protein gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101800001466 Envelope glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 1
- 101000597227 Escherichia phage Mu Probable terminase, small subunit gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101000912555 Escherichia phage lambda Tail fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- 101710170470 Glycoprotein 42 Proteins 0.000 description 1
- 241001481828 Glyptocephalus cynoglossus Species 0.000 description 1
- 101000764556 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 206010019759 Hepatitis chronic persistent Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N Leu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 1
- DINQYZRMXGWWTG-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DINQYZRMXGWWTG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- JAIZPWVHPQRYOU-ZJDVBMNYSA-N Val-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JAIZPWVHPQRYOU-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000020403 chronic hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940000425 combination drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010025826 prolyl-leucyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Oblasť vynálezu
Vynález sa týka použitia kombinovaného prípravku na výrobu liečiva na liečenie chronických vírusových chorôb pečene.
Doterajší stav techniky
Aspoň päť od seba odlišných vírusov, najmä vírusy hepatitídy A, B, C, D a E, vyvoláva akútny zápal pečene. Hepatitída A a E, ktorá sa prenáša tráviacou sústavou, neprechádza do chronickej infekcie, zatiaľ čo hepatitída typu B, C (predtým nazývaná parenterálna hepatitída, odlišná od typu A a B) a D môže pokračovať do chronického zápalového štádia, v dôsledku ktorého môže dôjsť k cirhóze pečene alebo môže vzniknúť primárny karcinóm z buniek pečene.
Existuje pomerne málo údajov, týkajúcich sa hepatitídy typu C a D, spôsobu ich diagnózy, ich liečenia a tiež príslušného vírusu. Vírus hepatitídy D je RNA-vírus, o ktorom je známe, že je neúplný. Z tohto dôvodu je nutné, aby na rozvoj ochorenia u chorých bol prítomný ešte pomocný vírus a k ochoreniu preto dochádza len u jednotlivcoch, infikovaných HBV. V poslednom čase bol objavený vírus hepatitídy C a bol vyvinutý test s použitím protilátky (anti-HCV), ktorý uľahčuje diagnózu infekcie vírusom chronickej hepatitídy C. Z uvedených dôvodov vzniká zvyšujúca sa potreba liečenia uvedených ochorení.
To isté platí pre chronickú hepatitídu B, ktorá je oveľa dokonalejšie preštudovaným ochorením, najmä pokiaľ ide o diagnózu imunologickými metódami, o vírus, ktorý je príčinou tohto ochorenia, ako aj o životný cyklus tohto vírusu a jeho reťazec DNA. Chorý sa označuje ako chronický nosič vírusu hepatitídy B v prípade, že je možné DNA vírus preukázať v jeho organizme dlhšie než 10 týždňov, antigén HBe (HBeAg) počas viac než 12 týždňov alebo v prípade, že v organizme je možné preukázať povrchový antigén vírusu hepatitídy V (HBsAg) dlhšie ako 6 mesiacov.
Chronickou hepatitídou typu B trpí približne 300 miliónov ľudí, pričom väčšina z týchto ľudí žije na ďalekom východe.
V prípade týchto ľudí dochádza k hlavnému riziku infekcie v priebehu pôrodu alebo bezprostredne po pôrode vzhľadom na to, že matka s chronickou infekciou prenáša vírus na svojho novorodenca. 90 % deti, infikovaných týmto spôsobom, bude trpieť v neskoršom živote chronickou infekciou. V západných štátoch dochádza k infekcii obvykle neskoršie v priebehu života, počas detstva alebo i v dospelosti, prevažne dochádza k prenosu parenterálne alebo pri sexuálnom styku. V týchto prípadoch je infekcia hepatitídou B po pôrode vzácnejšia a len 5 až 10 % infikovaných sa stáva chronickými nosičmi. Prenesený vírus sám však nie je zodpovedný za určité reakcie infikovaných ľudí a nie je celkom zrejmé, prečo u niektorých ľudí dochádza k eliminácii vírusu a u niektorých k udržaniu vírusu v organizme po celý život. Najpravdepodobnejšie závisí od stavu imunologického aparátu budúci telesný stav infikovaných ľudí.
Virión HB (častica Dane) je tvorený rôznymi štruktúrnymi bielkovinami, a to bielkovinami jadra a povrchovými bielkovinami (S). Povrchové bielkoviny sú produktom translácie otvoreného čítacieho rámca, ktorý zahŕňa kódové reťazce troch oblastí typu S, z ktorých každá začína kodónom ATC, ktorý je schopný začať transláciu in vivo. Uvedené tri oblasti sa označujú preSl, preS2 a S v poradí od 5'-zakončenia k 3'-zakončeniu molekuly. Existuje šesť bielkovinových produktov, odvodených od tohto ORF: glykozylovaná a neglykozylovaná forma hlavnej bielkoviny. gp27 a p24, k jej translácii dochádza len z oblasti S, obsahujúcej 226 zvyškov aminokyselín, stredná bielkovina, obsahujúca 281 zvyškov aminokyselín a obsahujúca jeden alebo dva postranné polysacharidové reťazce gp33 a gp36, pre ktoré je kódom oblasť preS2 a S a konečne glykozylovaná (gp42) a neglykozylovaná (p39) forma bielkoviny s dlhým reťazcom, obsahujúca 39 až 400 zvyškov aminokyselín v závislosti na serotype vírusu, táto bielkovina vzniká tra isláciou preSl, preS2 a S. Bielkovinami jadra sú HBeAg a HBeAg, pričom druhá z týchto bielkovín vzniká spracovaním prvej uvedenej bielkoviny.
Častica Dane, ktorá je infekčným viriónom, obsahuje tak bielkovinu jadra, ako aj povrchové bielkoviny, kým vlákna sú tvorené zmesou šiestich povrchových antigénov. Peptidy S sú samé osebe kombinované v časticiach s veľkosťou 28 nm, ktoré sú úplne neinfekčné.
Chorí, ktorí sú infikovaní vírusom HB a prešli niekoľkými štádiami hepatitídy, sú teda označovaní ako chorí, trpiaci chronickou infekciou HBV. Bezprostredne po infekcii nastáva infekčné štádium, ktoré je charakterizované prítomnosťou antigénu HBeAg v krvnom sére. Pokračujúca HBs-antigenémia cez inhibíciu replikácie HBV znamená že sa reťazce DNA vírusu integrovali do bunkového genómi chorého. Tieto integrované reťazce vírusu však nespôsobujú syntézu úplného vírusu hostiteľskou bunkou. Pečeňové bunky, v ktorých je integrovaný reťazec HBV, môžu produkovať len antigén HBsAg, ktorý je možné preukázať v krvnom sére chorých a ktorý je teda indikátorom chronickej hepatitídy typu B. Je pravdepodobné, že transformované pečeňové bunky nie sú rozrušované cytotoxickými T-bunkami, no profilerujú a v dôsledku toho sa vyvíja buď chronická pretrvávajúca hepatitída CPH, alebo chronická aktívna hepatitída C AH, z ktorej sa môže ďalej vyvinúť cir lóža pečene alebo tiež primárny hcpatocelulámy karcinóin, obidve tieto ochorenia môžu viesť k predčasnému úmr .iu chorého.
V poslednom čase bolo dokázané, že chorí, ktorí trpia cht onickou infekciou HBV, majú takisto defekt v endogénnej produkcii interferónu, ako bolo opísané v publikácii Abb a ďalšej, J. Med. Virol., 1985, 16, 171 - 176. Z tohto dôvodu boli robené pokusy liečiť chorých, trpiacich chronickou hepatitídou B, po preukázaní prítomnosti HBeAg a HBV-DNA v krvnom sére podávaním interferónu alfa (IFNalfa). Pri pokusoch na veľkom množstve chorých bolo dokázané, že pri podávaní interferónu alfa došlo k štatisticky významne zvýšenej eliminácii vírusu hepatitídy B v poroinaní s kontrolnými príkladmi. No chorí, infikovaní v priebehu pôrodu alebo tesne po narodení, na toto liečenie odpovedali v oveľa nižšej miere. Tento fenomén nanešťastie znamená, že uvedeným spôsobom nie je možné liečiť pri iližne 75 % nosičov tohto ochorenia.
V súčasnosti zostáva presný mechanizmus pôsobenia interferónu alfa na chronickú hepatitis B nejasný. Protivírusoi ý účinok tejto látky by mohol infikované bunky chrániť pred infekciou alebo by mohlo dochádzať k zníženiu transkripcie, translácie a replikácie vírusu v infikovaných bunkách. Okrem toho má interferón tiež imunomodulačné účinky, najmä dochádza pri jeho aplikácii k aktivácii T-bmiek, makrofágov a NK-buniek a k indukcii expresie bielkovín MHC skupiny I.
Ďalší pristúp k liečeniu chronickej hepatitídy B je založer ý na myšlienke dosiahnuť inhibíciu replikácie vírusu a tým napomôcť imunologickému systému hostiteľa dosiahnuť elimináciu vírusu, ku ktorého replikách nemôže dôjsť. S týmto cieľom boli skúmané protivírusové látky, napríklad
SK 280551 Β6 adenínarabinozid a adenínarabinozidmonofosfát ako možné účinné látky na liečenie jednotlivcov s chronickou infekciou HBV. No menej než polovica chorých odpovedala na túto liečbu buď tak, že prechodne došlo k premene HBeAg+ na anti-HBe+ v krvnom sére. Ďalším negatívnym hľadiskom pri použití týchto protivírusových látok je skutočnosť, že uvedené zlúčeniny potláčajú imunologický systém chorého.
U chronických nosičov týchto vírusov boli skúmané ešte ďalšie účinné látky, napríklad interferón beta, acykloquanozín (acyklovir), interleucín 2, steroidy, napríklad prednisolon, a kombinácie týchto látok. Pri použití žiadnej z uvedených látok však nebolo možné dosiahnuť priaznivejšie výsledky než pri liečení interferónom alfa. Len kombinovanou liečbou, pri ktorej sa na začiatku liečenia podávajú steroidy a potom sa podáva ešte interferón alfa, je možné u niektorých chorých zvýšiť počet zlepšených prípadov.
Z literatúry je už známe, že šimpanzy, trpiace chronickou infekciou HBV, nie je možné vyliečiť podávaním HBsAg, viazanými na tetanový toxoid, ani podávaním protilátok anti-HBS. Okrem toho boli robené pokusy imunizovať chorých, trpiacich chronickou infekciou HBV, podávaním peptidov S. Pri tomto spôsobe liečenia však nedošlo u liečených osôb ani k tvorbe protilátok anti-HBS.
Okrem toho podľa definície uvedenej na ochorenie je hlavnou vlastnosťou chronických nosičov vírusu hepatitídy B skutočnosť, že v ich krvnom sére je možné preukázať antigén HBsAg. Nebolo teda vôbec možné predpokladať, že by pomocou kombinácie, obsahujúcej epitop vírusového peptidu S aktivujúceho T-bunky, s použitím podľa vynálezu, bolo možné dosiahnuť imunizáciu a pri dostatočne dlhom čase podávania i úplného vyliečenia chronických nosičov hepatitídy B.
Vynález si kladie za úlohu navrhnúť účinnú kombináciu na liečenie chronickej vírusovej hepatitídy, pri použití ktorého by mohol byť dosiahnutý dobrý účinok, najmä dlhodobej inhibicie replikácie vírusu HBV, straty DNA-polyerázy tohto vírusu a súčasne by malo byť dosiahnuté tiež vymiznutie antigénov HBeAg a IIBsAg v krvnom sére chorých, trpiacich týmto ochorením.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvorí použite kombinovaného prípravku na výrobu liečiva na liečenie chronických vírusových chorôb pečene pozostávajúceho z
a) aspoň jedného polypeptidového reťazca, ktorý obsahuje jeden alebo viac antigénnych epitopov aktivujúcich T-bunky a
b) nosiča, schopného umožniť účinok reťazca/reťazcov epitopu a), pričom polypeptidový reťazec/reťazce a) je viazaný na nosič b) kovalentnou alebo hydrofóbnou väzbou.
Podľa vynálezu môže byť polypeptidovým reťazcom a) polypeptid alebo kombinácia dvoch alebo väčšieho počtu polypeptidov vírusu hepatitídy B, a to akéhokoľvek podtypu tohto vírusu, zvlášť adw, ayw, adr a ady. Tieto peptidy, odvodené od vírusu hepatitídy B, môžu byť napríklad peptidy preSl, preS2 alebo S, alebo tiež antigén jadra HBV.
Ako uvedené polypeptidové reťazce a) je možné okrem toho použiť akýkoľvek z uvedených polypeptidov, alebo kombináciu dvoch alebo väčšieho počtu polypeptidov, ktoré boli modifikované nasledujúcimi spôsobmi:
i) je možné vypustiť niektoré časti reťazca, pričom musí byť zachovaný epitop, ktorý obsahuje aspoň šesť po sebe nasledujúcich zvyškov aminokyselín, ii) jednu alebo väčší počet aminokyselín je v reťazci možné nahradiť alebo iii) je možné pridať ďalšie aminokyseliny alebo reťazce aminokyselín na N-terminálnom alebo na C-terminálnom zakončení alebo tiež uprostred polypeptidového reťazca/reťazcov a).
Je samozrejmé, že vo všetkých uvedených prípadoch je nevyhnutné zachovanie biologických účinností polypeptidového reťazca.
Vo výhodnom uskutočnení sa na tento účel použijú myristylované polypeptidové reťazce a).
Aby bolo možné dosiahnuť príslušnú farmakologickú účinnosť, je potrebné, aby v kombinácii podľa vynálezu bol polypeptidový reťazec alebo reťazce a) použité na nosiči b). Tento nosič je tvorený zvláštnym materiálom, napríklad môže byť tvorený časticami hydrofóbneho polyméru, časticami anorganického nosiča alebo časticami polysacharidu. Výhodne je však nosič b) tvorený ďalším polypeptidovým reťazcom, ktorý vytvára častice, pričom priemer týchto častíc je aspoň 10 nm.
Vo výhodnom uskutočnení obsahujú častice, tvorené polypeptidom, ktorý je použitý ako nosič b), podstatnú časť úplného reťazca aminokyselín polypeptidu, ktorý môže byť zvolený z peptidu S vírusu HBV, antigénu jadra HBV, antigénu jadra HAV, povrchového antigénu HAV, povrchového antigénu HIV a antigénu jadra HIV, a môže ísť tiež o povrchový antigén vírusu detskej obmy. Výhodným materiálom na častice nosiča b) je najmä peptid S vírusu HBV a/alebo peptid jeho jadra.
Pri použití ako nosiče b) môžu byť uvedené polypeptidy modifikované tak, ako je opísané pri polypeptidovom reťazci a). Vo výhodnom uskutočnení je polypeptidový reťazec nosiča b) myristylovaný.
V prípade, že nosičom b) je polypeptidový reťazec, môžu byť reťazce a) a b) viazané jedným alebo väčším počtom nasledujúcich spôsobov: môže ísť o väzbu cez hydrofóbnu skupinu (sprostredkovanú kyselinou myristovou), o tvorbu disulfidových mostíkov alebo môžu byť obidva reťazce spojené pomocou peptidovej väzby za vzniku zloženého peptidu. V tomto poslednom prípade je možné medzi polypeptidový reťazec a) a polypeptidový reťazec nosiča b) vložiť ešte ďalší reťazec, ktoiý je k obidvom polypeptidom viazaný peptidovými väzbami.
Každý z polypeptidov a) a b) môže byť vytvorený expresiou rekombinantnej molekuly DNA. Väčšinou sú tieto dva polypeptidy vytvárané expresiou z tej istej rekombinantnej molekuly DNA, na ktorej sú sekvencie kódované za sebou. Polypeptidy sú obvykle vytvorené expresiou zo samostatného otvoreného čítacieho rámca a sú prípadne oddelené ďalším polypeptidovým reťazcom kódovaným tiež v samostatnom otvorenom čítacom rámci.
Expresia molekuly DNA môže prebiehať v hostiteľskej bunke. Môže ísť o hostiteľskú bunku cicavca, o kvasinkovú bunku alebo o bakteriálnu bunku. Vo výhodnom uskutočnení sa na účely vynálezu používajú bunky, ktoré samé neprodukujú žiadnu bielkovinu ľudského séra alebo žiadnu bielkovinu séra primátov s výnimkou polypeptidov, ktoré zodpovedajú zložkám uvedeného prostriedku.
Pod pojmom peptid S vírusu HBV sa rozumie peptid, pre ktorý je kódovým reťazcom celá oblasť S genómu vírusu HBV, Pod pojmom pre-S2 peptid HBV sa rozumie v priebehu prihlášky peptid, pre ktorý je kódovým reťazcom celá oblasť pre-S2 a S genómu HBV. Pod pojmom pre-Sl peptid HBV sa v priebehu prihlášky rozumie polypeptid, pre ktorý je kódovým reťazcom celá oblasť pre-Sl, pre-S2 a S genómu HBV. Pod pojmom epitop sa v priebehu prihlášky rozumie reťazec aspoň šiestich po sebe nasledujú
SK 280551 Β6 cich zvyškov aminokyselín, pre ktoré je kódom uvedená oblasť genómu, to znamená, že napríklad pre-S2 epitop HBV znamená reťazec, obsahujúci aspoň šesť zvyškov aminokyselín, pre ktoré je kódom určitá oblasť pre-S2 genómu HBV. Pod pojmom epitop T-bunky sa v priebehu prihlášky rozumie epitop, schopný interakcie s receptormi na povrchu T-buniek za súčasného podporovania alebo iného ovplyvňovania imunologickej odpovede.
Pod pojmom antigenita sa v priebehu prihlášky rozumie schopnosť vyvolať imunologickú odpoveď, to znamená napríklad pôsobiť ako antigén, ďalej schopnosť vyvolať tvorbu protilátok, to znamená opäť pôsobiť ako antigén, a/alebo schopnosť interakcie s receptorom na povrchu bunky na zvýšenie imunologickej odpovede alebo na vyvolanie produkcie protilátok.
Pod pojmom HBV sa rozumie akýkoľvek podtyp vírusu, najmä adw, ayw, adr a ayr, tak ako boli opísané v literatúre, napríklad P. Valenzuela, Náture zv. 280, str. 815, 1979, Gerlich, EP-A-85 111 361 a Neurath, EP-A-85 102 250. Príklady peptidových reťazcov, tvoriacich polypeptidové reťazce a), schopné sprostredkovať antigenitu jedného alebo väčšieho počtu epitopov, budú ďalej uvedené v zozname reťazcov, ide o reťazce ID č. 17 a ž 20 a 22.
Ako výhodné realizovanie vynálezu je možné označiť nasledujúce kombinácie:
- častice S-antigénu HB so špecifickými epitopmi (determinantami) z oblastí pre-Sl, pre-S2 a/alebo môže ísť o peptidy jadra,
- častice antigénu jadra HB s obsahom špecifických epitopov (determinant) z oblasti peptidu pre-Sl, pre-S2, S a/alebo antigénu jadra,
- častice antigénu vírusu hepatitídy A so špecifickými epitopmi (determinantami) vírusu hepatitídy B, a to oblasti S, pre-Sl, pre-S2 a/alebo peptidu jadra.
Rekombinantné molekuly DNA, ktoré sú výhodné na použitie vynálezu, sú charakterizované prítomnosťou reťazcov, ktoré sú kódovými reťazcami pre polypeptidové reťazce a), sprostredkujúce antigenitu pre jeden alebo väčší počet epitopov T-buniek a tiež pre polypeptidové reťazce nosiča b), ktoré prednostne po svojej sekrécii vytvárajú častice s priemerom aspoň 10 nm, v oboch prípadoch pod riadením vhodného promótora. Príkladom reťazcov, ktoré sú kódovými reťazcami pre polypeptidy a), je možné uviesť ktorýkoľvek z reťazcov, ktoré sú ďalej uvedené v zozname reťazcov pod číslami ID 1 až 24. Príklady reťazcov DNA, ktoré sú kódovými reťazcami pre polypeptidové reťazce nosiča b), môžu byť ktorékoľvek z ďalej uvedených reťazcov ID 25 až 27.
Ktorýkoľvek z reťazcov ID-1 až 24 je možné kombinovať s ktorýmkoľvek reťazcom ID-25 až 27 v zozname reťazcov, a to v poradí a-b i b-a.
Vo zvlášť výhodnom realizovaní vynálezu ide o kombináciu epitopu reťazca ID-28, ktorý’ zodpovedá aminokyselinám 9 až 28 reťazca SI HBV a reťazca ID 26 a/alebo 27 ako reťazca nosiča, tvoriaceho častice.
Reťazce vírusu hepatitídy, použité na konštrukciu rekombinantnej DNA, je možné vytvoriť alebo izolovať akýmkoľvek spôsobom včítane izolácie a naviazania reštrikčných fragmentov chemickej syntézy oligonukleotidov pri použití syntetizačného prístroja (Cyclon, Bio-Search) a syntézy pomocou metódy PCR podľa publikácie T. J. White, N. Arnleim, H. E. Erlich, 1989: The Polymerase Chain reaction, Technical Focus 5 (6).
Výhodné molekuly rekombinantnej DNA boli vytvorené väzbou syntetických oligonukleidov na fragment 5'XBaI-BglII-3’, ID-27, z oblasti S genómu HBV, reťazec je odvodený od fragmentu HBV BglII-BglII včítane celej oblasti pre-Sl-pre-S2-S- alebo celej oblasti S. Oligonukleotidy, použité pri tvorbe týchto konštrukcií, sú súhrnne uvedené v nasledujúcej tabuľke I.
Tabuľka I
| fu nkcia | definícia | reťazec ID č. |
| jadro (adw) | aax 59-87 | 6 |
| jadro (adw) | aa 2-28 | 7 |
| jadro (adw) | aa-10-28 | 8 |
| jadro (adw) | aa 29-58 | 9 |
| jadro (adw) | aa 1-87 | 10 |
| jadro (adw) | aa-10-87 | 11 |
| jadro (adw) | aa 70-110 | 12 |
| jadro (adw) | aa 80-125 | 13 |
| jadro (adw) | aa 88-120 | 15 |
| S (ayw) | aa9-28 | 17 |
| S (ayw) | aa 83-103 | 18 |
| S· (ayw) | aa 20-40 | 19 |
| S (ayw) | aa 59-94 | 20 |
| S (adw) | aa 94-114 | 21 |
| S (adw) | aa 70-105 | 22 |
| S: (ayw) | aa 2-21 | 23 |
| SI (ayw) | aa 14-33 | 24 |
* au = aminokyseliny
Ďalšie výhodné molekuly DNA boli vytvorené väzbou reťazca jadra, pripraveného metódou PCR (kódové reťazce pre epitopy T-buniek), na reťazce jadra HBV, ID č. 25, použité ako polypeptidový reťazec nosiča b). Použité oligonukleotidy na tieto konštrukcie sú uvedené v tabuľke II-1.
| Tabuľka II-l | ||
| funkcia | definícia | IDč. |
| jadro | úplný reťazec, bp 1901-2500 | 1 |
| jadro | C-terminálne vypustenie, | |
| bp 1901-2450 | 2 | |
| jadro | C-terminálne vypustenie a vloženie | |
| stop kodónu, bp 1901-2405 | 3 | |
| jadro/reťazec | 10 aminokyselín reťazca pred | |
| pred jadrom | jadrom, C-terminálne vypustenie, | |
| bp 1871-2405 | 4 | |
| jadro/reťazec | 10 aminokyselín reťazca pred | |
| pred jadrom | jadrom, C-terminálne vypustenie, uloženie stop-kodónu. | |
| bp 1871-2405 | 5 | |
| jadro | aa (-10-120) | 16 |
| jadro/reťazec | 10 aminokyselín reťazca pred | |
| pred jadrom | jadrom, úplné jadro a | |
| bp 1871-2500 | 35 |
V nasledujúcej tabuľke II-2 je uvedených niekoľko príkladov, v ktorých bol izolovaný kódový reťazec DNA pre epitop T-buniek pri použití reštrikčných fragmentov z genómu vírusu HBV, tieto fragmenty potom boli naviazané na reťazec DNA, ktorý je kódovým reťazcom pre polypeptidový reťazec nosiča b) v uvedenom význame.
Tabuľka II-2
| funkcia | definícia | ID č. |
| jadro/reťazec | úplný reťazec, bp 1403-31 | XX |
| pred jadrom S2 ay/ad « S2 (K) ay/ad | S2-S, 7 kodónov vypustených, koccn ATG pre začiatok je nahradený kodonom ATA | 14 |
Tabuľka III
Možné zloženie častíc, obsahujúcich epitopy T-buniek na zacielenie nosiča v prostriedku proti chronickej hepatitíde •ptcpT-bunM iartewý rabkŕnj taton* kcratoá (romátar^ SVN PCW gtn notii pén iwilniWt
MT12AJ2
MT12ÄJ2 jadro baz
Vtuce crM Jadran jadnXMw) napr.bp 1901-2500
J*wo(idwj ** Reťazce boli zverejnené v publikáciách Galibert F. a ďalší, 1979, Náture, 281, 646-650 a Ono Y. a ďalší, 1983, Nucl. Acid. Res, 11(6), 1747-1757.
V nasledujúcej tabuľke II-3 sú uvedené niektoré špecifické rekombinantné molekuly DNA. Konštrukcia týchto molekúl bude podrobnejšie opísaná v príkladovej časti prihlášky.
Tabuľka II-3
MT12/U2
1901-2« 0β ηκΜΟΡ
MT-jadraMT 12X12
MT 12JU2 bp14XM1
| konečná | epitop | nosič, tvo- | selekčný |
| konštrukcia | T-buniek | riaci Častice | gén |
| MT-jadro(-10-120 | jadro(aa-10- | S adw/ayw alebo | neo |
| + SAg + neo | -120) | S/Xba1l/Bg1ll | |
| MT-S1(aa 9-28) | S1(aa 9-28)ay | S adw/ayw alebo | egpt x |
| -S* egpt | S/Xba1l/Bg1ll | ||
| MR-jadro-neo | jadro/reťazec pred jadrom bp 1403-31 | jadro adw | neo |
| MT-jadro(1-87) | jadro(aa 1-87) | S adw/ayw alebo | neo |
| + HBsAg - nec | S/Xbal/Bg1ll |
api«ri-2*O5
MT 12AT2
MT12AJ2
MT Ι2ΛΛ
MTI2/U2 >1*01-2*0.5 iwo/«gpt
JMrc (Äa2MB>
ΜΤΙ2Λ/2
CtlýS •Mayw SMbMBglli ctlýS Mayw sata^ni x egpt = E.coli xantínquanínfosforibosyltransferáza.
Výhodné rekombinantné molekuly DNA obsahujú okrem kódových oblastí pre polypeptidové reťazce a) a b) ešte ďalší kódový reťazec na označenie, uľahčujúce neskoršiu selekciu produktu. Okrem toho obsahujú ešte všetky ďalšie zvyčajné prvky, nevyhnutné na expresiu, ako sú reťazec promótora, kodón na začiatok a polyadenylačný signál.
Príkladom vhodných promótorov môžu byť metalotioneín (MT), promótory U2 a H2K v prípade, že sa ako hostiteľské bunky použijú bunky cicavcov. V prípade, že majú byť použité kvasinkové bunky alebo bakteriálne bunky, použijú sa príslušné promótor}' pre tieto typy buniek, napríklad promótor GCN4 a promótor GAL 1/10 alebo prokaryotické promótory trp a tac.
Aby bolo možné produkovať kombináciu polypeptidových reťazcov a) a b) podľa vynálezu, uloží sa rekombinantná molekula DNA do hostiteľských buniek pri využití transfekcie (v prípade buniek cicavcov), transformácie (v prípade kvasinkových a bakteriálnych buniek) alebo inými spôsobmi. Ako hostiteľská bunka môže byť použitý akýkoľvek organizmus, v ktorom môže dôjsť k transkripcii a translácii rekombinantných molekúl DNA, môže ísť napríklad o bunky cicavcov, bakteriálne bunky alebo bunky kvasiniek.
Vhodnými bunkami cicavcov sú napríklad bunky VERO (bunková línia opičích obličiek), bunky 373-, C127 a L (bunková línia myších fibroblastov) a bunky CHO (vaječníkové bunky čínskeho škrečka), ktoré reagujú buď pozitívne, alebo negatívne na dehydrofolátreduktázu.
Ďalej je možné, že uvedený reťazec DNA, ktorý je kódom pre polypeptidové reťazce a) a definovaný druhý reťazec DNA, ktorý je kódom pre polypeptidový reťazec b), sú uložené v rôznych rekombinantných molekulách DNA, v tomto prípade je nutné vykonať súčasnú transfekciu hostiteľských buniek s použitím oboch typov rekombinantných molekúl DNA.
MR-J*ďo (-10-120) • SAJ‘0*0
MT 12AJ2
WT1BU2
MT 12Λ12
MT 12X12
MR-S1 MT 12X12 (MB-2I>
S»egrt
MT 12ΛΙ2
MT12U2
MT12/U2
ΜΤ12Λ»
MT 12X12
MT 12/112
MT12/U2
MT 12X12
MT12XT2
ΜΤ12ΛΛ jadra (AA-1M7) (ÍzíO-HO) ja*o (AAM-12S)
Jadro *AA2-d7) (AA-10-120)
RM*0pt
S14M
S1-(M
43-103W
S1(AA2(M0
S1(AA
5S-M»)
9HAA
ΘΙ-(ΑΛ
SHM β·28Κ>»
82-íAA
2-21K«y)
52-;aa c·** S adaťapa S/XMlSglII
MOMgpt &xteV8ein ealpS wMpot arMrtyw SMMimglI
Vysvetlivky k tabuľke:
1: vysvetlenie je uvedené v príklade 3
2: akýkoľvek z uvedených promótorov je možné použiť 3: čistenie je podrobnejšie uvedené v príkladovej časti.
V tabuľke III je uvedený súhrnný prehľad ako kombinovať vhodné reťazce DNA. Je nutné uviesť, že akékoľvek zložky, ktoré sú v tabuľke uvedené, je možné kombinovať na získanie reťazca DNA, ktorý je možné použiť na transfekciu hostiteľskej bunky, ktorá potom bude produkovať kombináciu polypeptidov a) a b), vhodnú na liečenie chronickej vírusovej hepatitídy.
Reťazce DNA, ktoré sú kódovými reťazcami pre reťazce epitopov T-buniek, boli pripravené synteticky (SYN) s použitím automatického prístroja Biosearch Cyclon synthesiser, pomocou PCR (PCR) alebo fragmentárnou vírusového genómu pomocou reštrikčných enzýmov (GENE).
Na liečenie chorých, trpiacich chronickou vírusovou hepatitídou, je možné spracovať kombináciu polypeptidových reťazcov a) a b) do akéhokoľvek typu ťarmaceutického prostriedku, ktorý’ okrem toho bude obsahovať vhodné riedidlo alebo farmaceutický nosič, napríklad roztok pufra.
Takto pripravený farmaceutický prostriedok je možné podávať akýmkoľvek spôsobom, napríklad parenterálne, vnútrožilovo, vnútrosvalovo alebo perorálne, napríklad s použitím tyťoidných bakteriálnych buniek na zapuzdrenie účinného materiálu.
Farmaceutický prostriedok má obsahovať uvedenú kombináciu reťazcov a) a b) v dostatočnej koncentrácii na vyvolanie požadovaného účinku po podaní.
Praktické realizovanie vynálezu bude ďalej podrobnejšie opísané v súvislosti s priloženými výkresmi
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. I je znázornená konštrukcia DNA, ktorá je kódovým reťazcom pre promótor, reťazec nosiča, tvoriaca častice a selekčný gén, tak ako je opísaná v príklade 3/4.
Na obr. II je znázornená konštrukcia DNA génu, obsahujúca promótor, epitop s úplným HB-S-Ag a gén pre selekciu, tak ako je opísaná v príklade 3/18.
Na obr. III je znázornená konštrukcia DNA, ktorá je tvorená promótorom, epitopom T-buniek so zvyškom, tvoriacim častice a gén pre selekciu, táto konštrukcia jc opísaná v príklade 3/21.
Na obr. IV sú uvedené hodnoty AST pre šimpanza 1 v priebehu liečenia prostriedkom Hepa-Care, liečenie je opísané v príklade 10/1.
Na obr. V sú uvedené hodnoty antigénu u šimpanza 1 v priebehu liečenia prostriedkom Hepa-Care, tak ako je opísané v príklade 10/1.
Na obr. V sú uvedené hodnoty pečeňových enzýmov ALT a GGT u šimpanza, ktorému bol v určitých intervaloch trikrát podaný prostriedok Hepa-Care podľa príkladu 10/2.
Na obr. VII sú uvedené hodnoty pečeňových enzýmov ALT, AST a GGT a množstvo antigénu u šimpanza 2 v priebehu liečenia prostriedkom Hepa-Care spôsobom, ktorý je opísaný v príklade 10/3.
Na obr. VIII sú uvedené hodnoty pečeňových enzýmov, stanovené u neliečeného kontrolného šimpanza, tak ako je uvedené v príklade 10/3.
Na obr. IX a X sú uvedené hodnoty množstva antigénu a titer protilátok u chorého 1 v priebehu jeho liečenia prostriedkom Hepa-Care, tak ako je opísané v príklade 11.
Na obr. XI a XII je súhrne uvedené množstvo antigénu a titer protilátok u chorého 2 v priebehu liečenia prostriedkom Hepa-Care spôsobom podľa príkladu 11.
Na obr. XIII a XIV sú uvedené hodnoty množstva antigénu a titer protilátok u chorého 3 v priebehu liečenia prostriedkom Hepa-Care, tak ako je opísané v príklade 11.
Praktické realizovanie vynálezu bude podrobnejšie opísané v nasledujúcich príkladoch, ktoré však nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
1. Frakcionované zrážanie polyetylénglykolom (PEG)
Supematant kultúry, produkujúci bielkovinu HBV, sa odoberie a rozdelí na podiely po 2400 ml. Ku každému podielu sa pridá 144 g PEG 6000 (Serva) a po rozpustení sa zmes mieša 20 minút pri teplote miestnosti a potom ešte 6 hodín pri teplote 4 °C. Vzniknutá zrazenina sa oddelí odstredenim vo fľašiach s objemom 500 ml s použitím rotora GS 3 9000/ot./min., t.j. 15 000 g počas 30 minút pi teplote 10 °C. Potom sa podiely supernatantu oddelia a pridá sa znovu 144 g PEG 6000 rovnakým spôsobom ako je uvedené Roztok sa mieša 3 hodiny pri teplote 4 °C. Vytvorená zrazenina z tohto roztoku sa oddelí rovnako, ako je uvedené až na to, že odstredenie trvá 60 minút.
2. Chromatografia na géli
Materiál, získaný po vyzrážaní pomocou PEG, sa znova rozpustí v 20 ml PBS a roztok sa chromatografiije na A-5m (BioRad). Bol použitý stĺpec s rozmermi 25 x 1000 mm a 400 ml prostriedku. Pri typickej frakcionácii došlo pri použití PEG k vyzrážaniu 1000 mikrogramov bielkoviny HBV v ibjeme 10 až 15 ml, elúcia bola vykonávaná PBS rýchlosťou 6 kvapiek za minútu, t.j. 18 ml za hodinu. Boli odobraté frakcie s objemom 3 ml. K elúcii bielkoviny HBV dochádzala v prvom vrchole. Odobraté frakcie boli podrobc lé gradientu CsCl.
3. Sedimentácia v gradiente CsCl
Približne 30 frakcií, tvoriacich prvý vrchol pri vykonávaní chromatografie na stĺpci l-5m a obsahujúcich čiastočne čistenú bielkovinu HBV, boli odobraté a spojené, objem spojených frakcii bol približne 100 ml. Tento roztok bol upravený na hustotu 1,30 g/ml pridaním CsCl a potom bol prenesený do polyalomérnej skúmavky, ktorú je možné použ ť v rotore SW 27/28 (Beckman). Gradient bol vytvorený tal, že boli najprv uložené 4 ml roztoku CsCl s hustotou 1,35 g/ml, na túto vrstvu bola uložená vrstva 4 ml roztoku s hustotou 1,25 g/ml a táto bola ešte prevrstvená vrstvou 4 ml roztoku s hustotou 1,20 g/ml. Potom bolo pri použití tohto gradientu vykonané odstreďovanie materiálu rýchlosťou 28 000 ot./min. celkom 50 hodín pri teplote 10 °C. Potom bol gradient podrobený frakcionácii a bola oddelená čistená bielkovina HBV, nachádzajúca sa vo vrstve s hustotou 1,20 g/rril. Potom bol roztok zbavený soli dialýzou vo vakoch proti vode, dialýza bola trikrát opakovaná.
Príklad 2
Kv antitatívne stanovenie bielkoviny HBV
1. Rádioimunologický spôsob
Pri rádioimunologickej skúške, realizovanej v niekoľkých vrstvách, AUSTRIA 11-125 (Abbot) sa častice, vybavené povlakom morčacej protilátky proti povrchovému antigénu vírusu hepatitídy B (Anti-HBs), inkubujú sérom, plazmou alebo čistenou bielkovinou s použitím zodpovedajúcich kontrolných vzoriek. Akýkoľvek prítomný antigén HBsAg sa viaže na protilátku na pevnej ťáze. Po odsatí nenaiazaného materiálu a premytí častíc sa s komplexom, viazaným na častice, nechá reagovať ľudský 125I-Anti-HBs. Po om sa častice opäť premyjú, aby došlo k odstráneniu nenaviazaného značeného 125I-Anti-HBs.
)-Anti-HBs HBsAg )-.\ntí-HBs. HBsAg l25I-Anti-HBs j-Anti-HBs . HBsAg . 125I-Anti-Hbs
Rádioaktivita, ktorá zostáva viazaná na častice, sa stano 'í pomocou scintilačného gamma-počítača.
2. Skúška ELISA
Pri použití platne na mikrostanovenie, Enzygnost (Behring) sa pri stanovení HBsAg vyhĺbenia poťahujú anti-HBs. Potom sa pridá sérum, plazma alebo čistená bielkovina a tiež kontroly a platňa sa inkubuje. Po premytí sa zo zvyšnými antigénnymi determinantmi nechá reagovať protilátka proti HBsAg, značená peroxidázou. Nenaviazaná protilátka s enzýmom sa odstráni premytím a stanoví sa účinnosť enzýmu, viazaného na pevnú fázu. Enzymaticky katalyzovaná reakcia peroxidu vodíka a chromogénu sa zastaví pridaním zriedenej kyseliny sírovej. Intenzita zafarbenia je úmerná koncentrácii HBsAg vo vzorke a je možné ju stanoviť fotometrickým porovnaním intenzity zafarbenia neznámej vzorky s intenzitou zafarbenia negatívnej a pozitívnej kontrolnej vzorky séra.
Príklad 3
Príprava konštrukcií génov, ktoré obsahujú promótor, požadované reťazce a gén, uľahčujúci selekciu
1. Izolácia MT-promótora
Plazmid pBPV-342-12 (ATCC 37224) sa rozštiepi pôsobením reštrikčných endonukleáz BglII a BamHI. Týmto spôsobom vznikli tri molekuly DNA. Požadovaný fragment obsahuje metalotioneínový promótor a reťazec plazmidu pBR322 s veľkosťou 4,5 kb a je možné ho ľahko odlíšiť od ostatných fragmentov s veľkosťou 2,0 kb a 7,6 kb.
Reakcia sa vykonáva v celkovom objeme 200 mikrolitrov reakčného pufra pri konečnej koncentrácii DNA 0,5 Tg/Tl včítane 100 jednotiek každého uvedeného reštrikčného enzýmu. Úplnosť rozštiepenia bola kontrolovaná po inkubácii 3 hodiny pri teplote 37 °C elektroforézou na 0,8% agarosovom géli. Potom bola reakcia zastavená pridaním 4 mikrolitrov 0, 5 M EDTA.
Fragment s veľkosťou 4,5 kb bol od ostatných fragmentov oddelený preparatívnou elektroforézou na 1,2% agarosovom géli. Elúcia DNA z agarosového gélu bola vykonávaná na Whatmanovom filtračnom papieri DE-81, DNA bola oddelená pomocou pufra s vysokým obsahom solí. Potom bola DNA čistená extrakciou zmesi fenolu a chloroformu s nasledujúcim dvojitým zrážaním s použitím etanolu.
2. Väzba fragmentu s 1,8 kb, ktorý je kódom pre antigén jadra HBV
Fragment Bam-HI-BamHI s veľkosťou 1,8 kb, obsahujúci kódovú oblasť jadra HBV, bol izolovaný z DNA s obsahom HBV. Tento fragment bol potom naviazaný na fragment s veľkosťou 4,5 kb, obsahujúci MT-promótor a zvyšok pBR, ako je opísané v odseku 1.
mikrolitre fragmentu s veľkosťou 1,8 kb sa zmiešajú s 3 mikrolitrami fragmentu s veľkosťou 4,5 kb, väzba sa vykonáva v celkovom objeme 10 mikrolitrov príslušného pufra, ktorý obsahuje dve jednotky T4-DNA-ligázy a 2 mM ATP cez noc pri teplote 14 °C.
K väzbovej zmesi sa pridá 150 mikrolitrov suspenzie bakteriálnych buniek na príjem DNA. Po včlenení DNA do bakteriálnych buniek sa bunky nanesú na platne LB-agaru s obsahom 50 mikrolitrov/ml ampicilínu, použije sa 50 až 300 mikrolitrov bunkovej suspenzie na jednu platňu. Potom sa agarové platne inkubujú cez noc pri teplote 37 °C a vzniknuté jednotlivé izolované kolónie bakteriálnych buniek sa skúšajú na prítomnosť plazmidu, obsahujúceho požadované fragmenty.
3. Sledovanie bakteriálnych kolónií, obsahujúcich požadovaný plazmid
Jednotlivé kolónie sa ostrým nástrojom oddelia od agaru a prenesú do skúmavky s objemom 5 ml, obsahujúcej živné prostredie LB s ampicilínom. Skúmavky sa inkubujú cez noc pri teplote 30 °C za rýchleho pretrepávania. Potom sa z každej suspenzie bakteriálnych buniek pripravia plazmidy. Získané od seba odlišné vzorky DNA sa skúšajú štiepením reštrikčnou endonukleázou BglII. Očakáva sa vznik dvoch molekúl, a to fragmentu s veľkosťou 400 bp a fragmentu s veľkosťou 5,9 kb. Rozštiepený materiál sa analyzuje elektroforézou na agarosovom géli, DNA plazmidu sa izoluje z bakteriálnych buniek.
4. Uloženie selekčného označenia-génu na odolnosť proti neomycínu
Plazmid, získaný v predchádzajúcom stupni sa linearizuje rozštiepením reštrikčným enzýmom EcoRI. Reakcia sa vykonáva v celkovom objeme 50 mikrolitrov pri konečnej koncentrácii DNA plazmidu lTg/Tl. Pridá sa 50 jednotiek enzýmu EcoRI a štiepenie sa vykonáva inkubáciou 3 hodiny pri teplote 37 °C, priebeh štiepenia sa sleduje elektroforézou na agarosovom géli. Reakcia sa zastaví pridaním 1 mikrolitra 0,5 M EDTA a DNA sa vyzráža octanom sodným v konečnej koncentrácii 0,3 M a pridaním troch až štyroch objemov etanolu pri teplote -80 °C v priebehu 30 minút. Vyzrážaná DNA sa rozpustí v 50 mikrolitroch destilovanej vody.
mikrolitre linearizovaného plazmidu sa zmiešajú s 3 mikrolitrami fragmentu DNA, obsahujúceho metalotioneínový promótor a selekčný gén na odolnosť proti neomycínu, izolovaný z plazmidu pMT-neo-E (ATCC/Exogene) rozštiepením endonukleázou EcoRI ako fragment s veľkosťou 3,9 kb a vzniknutá zmes sa naviaže. Potom sa jednotlivé bakteriálne kolónie sledujú na prítomnosť požadovaného plazmidu.
5. Izolácia fragmentu, obsahujúceho reťazec promótora U2
Plazmid pUC-8-42 (Exogene) sa rozštiepi pôsobením reštrikčných endonukleáz EcoRI a Apal. Získajú sa 2 molekuly DNA. Požadovaný fragment obsahuje promótor UA s veľkosťou 340 bp a je možné ho ľahko odlíšiť od zvyšného fragmentu, ktorý obsahuje 3160 bp. Štiepenie sa vykonáva v celkovom objeme 200 mikrolitrov reakčného pufra pri konečnej koncentrácii DNA 0,5 Tg/Jl včítane 100 jednotiek každého reštrikčného enzýmu. Úplnosť štiepenia sa po inkubácii 3 hodiny pri teplote 37 °C kontroluje elektroforézou na 0,7 % agarosovom géli. Reakcia sa potom zastaví pridaním 4 mikrolitrov 0,5 M EDTA. Fragment s veľkosťou 340 bp sa od DNA plazmidu oddelí preparatívnou elektroforézou na 1,2 % agarosovom géli. DNA sa z agarosového gélu vymýva na Whatmanovom filtračnom papieri DE-81, DNA sa z tohto materiálu vymyje pufrom s vysokým obsahom solí. Potom sa DNA čistí extrakciou zmesi fenolu a chloroformu a dvojitým zrážaním etanolom.
6. Uloženie fragmentu s obsahom reťazca promótora do plazmidu s obsahom spojovníka s väčším počtom miest pôsobenia reštrikčných enzýmov.
Plazmid pSP165 (Promega Biotec), obsahujúci reťazec spojovníka s obsahom nasledujúcich miest pôsobenia reštrikčných endonukleáz: EcoRI, Sací, Smal, Aval, BanHI, BglII, Sali, PstI, HindlII sa linearizuje pôsobením reštrikčného enzýmu EcoRI. Reakcia sa vykonáva v celkovom objeme 50 mikrolitrov s použitím konečnej koncentrácie DNA plazmidu 1 Tg/Tl. Potom sa pridá 50 jednotiek enzýmu EcoRI a zmes sa inkubuje 3 hodiny pri teplote 37 °C,
SK 280551 Β6 štiepenie sa potom kontroluje elektroforézou na agarosovom géli. Reakcia sa zastaví pridaním 1 mikrolitra 0,5 M EDTA a DNA sa vyzráža pri konečnej koncentrácii 0,3 M octanu sodného a 3 a 4 objemov etanolu, zrážanie sa vykonáva 30 minút pri teplote -80 °C. Vyzrážaná DNA sa rozpustí v 50 mikrolitroch destilovanej vody.
mikrolitre DNA plazmidu sa zmiešajú s 10 mikrolitrami fragmentu DNA, obsahujúceho reťazec promótora U2, a obidva fragmenty sa naviažu v celkovom objeme 25 mikrolitrov pufra na uskutočnenie väzby, obsahujúceho dve jednotky T4-DNA-ligázy a 2-mM ATP, väzba prebieha cez noc pri teplote 14 °C. Potom sa DNA čistí extrakciou zmesi fenolu a chloroformu, potom sa dvakrát vyzráža etanolom a rozpustí v 10 mikrolitroch destilovanej vody. Výsledné väzbové zakončenia po odštiepení EcoRI a Apal sa prevedú na zarovnané konce a vykoná sa ďalšia väzba. Postup sa vykonáva tak, že sa väzbové zakončenia prevedú sa zarovnané zakončenia reakciou s nukleázou z bobov nasledujúcim spôsobom: k 25 mikrolitrom DNA s koncentráciou lTg/Tl sa v reakčnom pufri pridá 20 jednotiek enzýmu v konečnej koncentrácii glycerolu 1 % a v konečnom reakčnom objeme 35 mikrolitrov. Zmes sa inkubuje 30 minút pri teplote 30 °C a potom sa DNA čistí extrakciou zmesi fenolu a chloroformu s nasledujúcim dvojitým vyzrážaním etanolom. Potom sa DNA znovu rozpustí v 5 mikrolitroch destilovanej vody. Výsledné zarovnané konce sa naviažu v 15 mikrolitroch reakčného objemu, použije sa lOx väčšie množstvo P4-DNA-ligázy a 2 mM ATP, väzba prebieha cez noc pri teplote 14 °C.
Potom sa zmes, v ktorej prebiehala väzba, pridá k 150 mikrolitrom suspenzie príslušných bakteriálnych buniek na príjem DNA. Po uložení DNA do bakteriálnych buniek sa bunky nanesú na platne LB-agaru, obsahujúceho 50 mikrogramov/ml ampicilínu, použije sa objem 50 až 300 mikrolitrov bunkovej suspenzie na jednu platňu. Potom sa agarové platne inkubujú cez noc pri teplote 37 °C. Jednotlivé izolované bakteriálne kolónie sa sledujú na prítomnosť plazmidu, obsahujúceho požadovaný fragment promótora U2. Výsledný plazmid sa z bakteriálnych buniek izoluje a robí sa jeho charakteristika analýzou s použitím reštrikčných enzýmov.
7. Väzba syntetického oligo-DNA-nukleotidu 89 (reťazec ID č. 30) na fragment MT-promótora s veľkosťou 4,5 kb
Fragment s veľkosťou 4,5 kb opísaný v stupni 1, obsahujúci MT-promótor a zvyšok pBR, sa navzájom viaže na syntetický oligonukleid 89 (reťazec ID č. 30). Väzná zmes sa potom pridá k 150 mikrolitrom suspenzie príslušných bakteriálnych buniek, aby došlo k príjmu DNA týmito bunkami. Potom sa bunková suspenzia nanesie na platne a po inkubácii sa jednotlivé izolované bakteriálne kolónie sledujú na prítomnosť požadovaného plazmidu. Prítomnosť tohto plazmidu je možné dokázať rozštiepením pôsobením reštrikčných endonukleáz EcoRI a Xbal. Očakáva sa vznik dvoch molekúl, jednej s veľkosťou 2,0 kb a druhej s veľkosťou 2,6 kb.
8. Väzba syntetického oligonukleotidu 101 (reťazec ID č. 32) na plazmid, opísaný v stupni 7
Plazmid, opísaný v predchádzajúcom stupni, sa rozštiepi pôsobením enzýmov BglII a BamHI a oddelí sa fragment, obsahujúci 13 nukleidov a opísaný v stupni 1. Výsledný fragment, ktorý obsahuje prvý oligonukleid 89 (reťazec ID Č. 30), sa naviaže na oligonukleid 101 (reťazec ID č. 32), fragment BglII-BamHI. Po príjme DNA bakteriálnymi bunkami a inkubáciou sa jednotlivé bunky sledujú na prítomnosť požadovaného plazmidu. Prítomnosť tohto no vého plazmidu je možné dokázať štiepením pôsobením endonukleáz EcoRI a Xbal alebo EcoRI a BglII.
9. Väzba syntetického DNA-oligonukleotidu 99 (reťazec ID č. 31) na fragment s veľkosťou 4,4 kb, opísaný v stupni 1
Fragment s veľkosťou 4,5 kb po štiepení enzýmami BglII-BamlII sa naviaže na DNA-oligonukleotid 99 (reťazec ID č. 31). Po uložení do bakteriálnych buniek a inkubácii sa analyzujú jednotlivé bakteriálne kolónie, ktoré obsahujú rôzne molekuly DNA. Požadovaný plazmid je možné dokázať rozštiepením pôsobením reštrikčného enzýmu EcoRI, pri ktorom vznikajú dva fragmenty s veľkosťou 1,9 kb a 2,7 kb a tiež pozitívnou linearizáciou za použitia enzýmu BglII alebo BamHI.
Nový plazmid sa potom rozštiepi pôsobením enzýmu PstI a BamHI. Očakáva sa vznik dvoch molekúl, jednej s fragmentom s veľkosťou 2,6 kb s obsahom zvyšku pBR, ΜΓ-promótora a oligonukleotidu, druhou molekulou je zv/šok pBR s veľkosťou 2,9 kb. Fragment s veľkosťou 2,6 kb sa izoluje.
Väzba fragmentu plazmidu, opísaného v stupni 9, s ve kosťou 2,6 kb na fragment, izolovaný z plazmidu zo str pňa 8
Plazmid, opísaný v stupni 8 a obsahujúci DNA-oligonukleotidy 89 a 101 (reťazce ID č. 30 a 32), sa rozštiepia pôsobením reštrikčných enzýmov PstI a BglII. Očakáva sa vznik dvoch fragmentov. Prvý fragment s veľkosťou 2,5 kb obsahuje zvyšok pBR a ΜΤ-promótor a fragment s veľkosťou 2,2 kb obsahuje zvyšok pBR a obidva uvedené oligonukleotidy.
Fragment s veľkosťou 2,2 kb sa oddelí a naviaže na fragment s veľkosťou 2,6 kb, obsahujúci zvyšok pBR, MT-promótor a oligonukleotid 99 (reťazec ID č.31), opísaný v stupni 8.
Po analýze jednotlivých bakteriálnych kolónií na prítomnosť požadovaného plazmidu je možné plazmid charakterizovať štiepením pomocou reštrikčných endonukleáz BglII-Xbal. Očakáva sa vznik dvoch fragmentov, jedného s eeľkosťou 270 bp s obsahom oligo-DNA-nukleotidov a druhého s veľkosťou 4,5 kb, ktorý obsahuje MT-promótor a pBR.
Väzba fragmentov s veľkosťou 2,3 kb po štiepení enzýmom Bgl II-Bg 1II
Z DNA, obsahujúcej HBV, sa izoluje fragment s veľkosťou 2,3 kb po štiepení enzýmom BglII-BglII, obsahujúci oblasti HBV pre-Sl, pre-S2 a S ako kódové oblasti. Fragment s veľkosťou 2,3 kb sa potom naviaže na fragment s eeľkosťou 4,5 kb, získaný podľa stupňa 1 a obsahujúci metalotioneínový promótor.
mikrolitre fragmentu s veľkosťou 2,3 kb sa zmiešajú s 3 mikrolitrami fragmentu s veľkosťou 4,5 kb a väzba prebieha v celkovom objeme 10 mikrolitrov pufra na uskutočnenie väzby s obsahom 2 jednotiek T4-DNA-ligázy a 2 mM ATP cez noc pri teplote 14 °C.
Potom sa zmes po ukončenej väzbe pridá k 150 mikrolitrom suspenzie príslušných bakteriálnych buniek na príjem DNA. Bakteriálne bunky sa potom nanesú na platne LB-agaru s obsahom 50 mikrogramov/ml ampicilínu, použije sa 50 až 300 mikrolitrov bunkovej suspenzie na jednu platňu. Potom sa agarosové platne inkubujú cez noc pri teplote 37 °C. Jednotlivé izolované bakteriálne kolónie sa potom sledujú na prítomnosť plazmidu, obsahujúceho požadovaný fragment.
12. Premena časti reťazca génu HBV epitopmi jadra HBV
Plazmid, získaný v stupni 11, sa rozštiepi pôsobením endonukleáz BglII a Xbal. Očakáva sa vznik dvoch molekúl, a to fragmentu s 550 bp a fragmentu s veľkosťou 6,25 kb, ktorý sa izoluje elektroforézou na agarosovom géli.
Potom sa fragment s veľkosťou 6,25 kb naviaže na fragment s veľkosťou 270 bp z plazmidu, opísaného v stupni 10, po rozštiepení enzýmami BglII a Xbal a po izolácii fragmentu uvedeným spôsobom. Fragment s veľkosťou 270 bp je kódovým reťazcom pre epitop jadra génu HBV.
Zmes po uskutočnenej väzbe sa pridá k 150 mikrolitrom suspenzie príslušných bakteriálnych buniek na príjem DNA. Po inkubácii sa jednotlivé izolované bakteriálne kolónie sledujú na prítomnosť požadovaného plazmidu. Prítomnosť nového plazmidu je možné dokázať jeho rozštiepením pomocou enzýmu BamHI. Očakáva sa vznik 3 molekúl s veľkosťou 950 bp, 450 bp a 5150 bp.
13. Príprava nosného plazmidu
Plazmid zo stupňa 11 sa rozštiepi pôsobením enzýmov EcoRI a Xbal. Očakáva sa vznik dvoch molekúl s veľkosťou 2450 bp a 4350 bp, tieto fragmenty sa izolujú elektroforézou na géli.
Fragment s veľkosťou 43 500 bp sa naviaže na oligoDNA-nukleid 39 (reťazec ID č. 29), ide o kódový reťazec, ktorý je úplným reťazcom pre gén HBV-S od kodónu ATG až do miesta pôsobenia enzýmu Xbal, v reťazci bol kodón ATG nahradený kodónom ATA.
14. Epitop jadra proti smeru expresie úplného génu HBV-S
Nosný plazmid, získaný v predchádzajúcom stupni, sa rozštiepi pôsobením enzýmov PstI a Xbal. Očakáva sa vznik dvoch molekúl, zvyšku plazmidu s veľkosťou 600 bp a fragmentu s veľkosťou 3850 bp, ktorý sa izoluje a naviaže na fragment 2800 bp (2700 bp), izolovaný po rozštiepení plazmidu zo stupňa 10 pôsobením enzýmov Pstl-Xbal.
Po zavedení plazmidu do bakteriálnych buniek, inkubáciou a pestovaním na agare je možné požadovaný plazmid charakterizovať štiepením reštrikčnými endonukleázami EcoRI a Xbal alebo EcoRI, BglII a BamHI.
15. Uloženie označenia, uľahčujúceho selekciu
Plazmid zo stupňa 14 sa linearizuje pôsobením enzýmu EcoRI. Reakcia sa vykonáva v celkovom objeme 50 mikrolitrov pri konečnej koncentrácii DNA plazmidu lTg/Tl. Pridá sa 50 jednotiek enzýmu EcoRI a po vykonaní štiepnej reakcie inkubáciou 3 hodiny pri teplote 37 °C sa materiál analyzuje elektroforézou na agarosovom géli.
Reakcia sa zastaví pridaním 1 mikrolitra 0,5 M EDTA, a potom sa DNA vyzráža octanom sodným do konečnej koncentrácie 0,3 M a 3 až 4 objemy etanolu 30 minút pri teplote -80 °C. Vyzrážaná DNA sa rozpustí v 50 míkrolitroch destilovanej vody.
mikrolitre linearizovaného plazmidu sa zmiešajú s 3 mikrolitrami fragmentu DNA, obsahujúceho metalotioneinový promótor a selekčný gén na odolnosť proti neomycínu, opísaný v stupni 4, a nechá sa prebehnúť väzba. Jednotlivé bakteriálne kolónie s obsahom získaného materiálu sa analyzujú na prítomnosť požadovaného plazmidu, ktorý’ sa potom izoluje, čisti a charakterizuje.
Každá uvedená konštrukcia génu môže byť vytvorená tiež s použitím U2-promótora tak, že sa fragment DNA, obsahujúci MT-promótor po rozštiepení enzýmami EcoRI a BglII, nahradí fragmentom DNA, obsahujúcim U2-promótor po rozštiepení tými istými enzýmami.
16. Izolácia selekčného génu pre xantínguanínfosforibosyltransferázu (egpt) z E. coli.
Fragment, obsahujúci selekčný gén egpt, sa izoluje po rozštiepení plazmidu pMSG pôsobením BamHI a BglII a získaný fragment s veľkosťou 1,8 kb sa naviaže na fragment s 4,5 kb, opísaný v stupni 1 (BglII-BamHI), ktorý obsahuje MT-promótor.
Materiál sa použije na uloženie buniek, vzniknuté kolónie sa analyzujú na prítomnosť plazmidu, ktorý sa izoluje, čistí a nakoniec sa miesto pôsobenia enzýmu BamHI prevedie na miesto pôsobenia enzýmu EcoRI.
17. Izolácia požadovaných reťazcov DNA pomocou PCR
Fragment DNA s veľkosťou 400 bp sa izoluje elektroforézou na géli. Vzniká s použitím PCR podľa príkladu 5 a špecifických oligonukleidov 131 a 132 (reťazca ID č. 33 a 34) ako primérov.
Fragment DNA sa rozštiepi pôsobením endonukleáz BamHI a Xbal a potom sa čistí elektroforézou na géli. Izolovaný PCR-fragment sa naviaže na fragment s veľkosťou 6,25 kb, izolovaný z plazmidu, opísaného v stupni 13, po rozštiepení enzýmami BglII a Xbal. Po príjme DNA a transformácii bakteriálnych buniek sa analyzujú jednotlivé bakteriálne kolónie na prítomnosť požadovaného plazmidu.
18. Uloženie označení na selekciu
Plazmid, opísaný v stupni 17, sa ešte upraví pridaním selekčného génu v stupni 15.
19. Izolácia promótora H2K
Promótor H2K sa izoluje tak, že sa plazmid pSP65H2 (Exogene) rozštiepi pôsobením endonukleáz EcoRI a BglII a fragment s veľkosťou 2 kb sa izoluje.
Vo všetkých uvedených konštrukciách je možné všetky promótory vzájomne zameniť vo forme fragmentov po pôsobení enzýmov EcoRI/BglII.
20. Premena časti reťazca génu HBV
Plazmid zo stupňa 11 sa rozštiepi pôsobením endonukleáz BglII a Xbal. Očakáva sa získanie 2 molekúl, z ktorých jednou je fragment s veľkosťou 6250 kb, ktorý sa izoluje po elektroforéze na agarosovom géli.
Fragment s veľkosťou 6250 kb sa naviaže na oligo-DNA-nukleid 23 (reťazec ID č. 28). Väzná zmes sa pridá k 150 mikrolitrom suspenzie príslušných bakteriálnych buniek, aby došlo k príjmu DNA. Potom sa jednotlivé bakteriálne kolónie analyzujú na prítomnosť požadovaného plazmidu. Prítomnosť nového plazmidu je možné dokázať rozštiepením endonukleázami EcoRI a BglII, pri ktorom majú vzniknúť dve molekuly, jedna s veľkosťou 1,9 kb a druhá s veľkosťou 4450 kb.
21. Uloženie selekčného označenia egpt
Plazmid, opísaný v stupni 20, sa linearizuje pôsobením enzýmu EcoRI. Reakcia sa vykonáva v konečnom objeme 100 mikrolitrov pri konečnej koncentrácii DNA plazmidu 0,6 Tg/Tl. Pridá sa 60 jednotiek enzýmu EcoRI a zmes sa inkubuje tri hodiny pri teplote 37 °C, ukončené štiepenie sa dokáže elektroforézou na agarosovom géli. Reakcia sa zastaví pridaním 2 mikrolitrov 0,5 M EDTA a DNA sa vyzráža octanom sodným v konečnej koncentrácii 0,3 M a 4 objemami etanolu pri teplote -80 °C, reakcia trvá 1 hodinu. Potom sa vyzrážaná DNA rozpustí v 50 mikrolitroch destilovanej vody.
mikrolitre linearizovaného plazmidu sa zmiešajú s 3 mikrolitrami fragmentu DNA s veľkosťou 3,7 kb, ktorý obsahuje metalotioneínový promótor a selekčný gén egpt, o
SK 280551 Β6 písaný v stupni 16, po rozštiepení enzýmom EcoRI a zmes sa naviaže. Po uložení vzniknutého materiálu do bakteriálnych buniek sa jednotlivé kolónie analyzujú na prítomnosť požadovaného plazmidu. Každý z génov, uvedených v tabuľke III, je možné pripraviť podobným spôsobom ako v opísaných stupňoch 1 až 21 príkladu 3.
Príklad 4
Transfekcia buniek cicavcov
Aby bolo možné dosiahnuť sekréciu väčšieho množstva peptidov HBV, je nutné dosiahnuť transfekciu buniek cicavcov konštrukciami DNA. Transfekcia bola vykonaná v dvoch stupňoch, to znamená, že bola na každú konštrukciu použitá samostatná transfekcia alebo v jednom stupni, v ktorom bola prevedená transfekcia obidvoma konštrukciami súčasne. Súčasnú transfekciu bolo možné uskutočniť buď s použitím selekčného značenia na oboch konštrukciách, alebo dokázaním sekrécie produktov expresie oboch konštrukcií imunologickými skúškami.
Je tiež možné postupovať tak, že sa spojí do jedinej konštrukcie reťazec, ktorý je kódom pre reťazec peptidu HBV podľa vynálezu, a ďalší reťazec, ktorý je kódom pre úplnú bielkovinu oblasti S alebo jadra, alebo HAV.
Príklad 5
Reťazová reakcia s použitím polymerázy (PCR)
Pri PCR-reakcii je možné dosiahnuť amplifikáciu špecifických nukleotidových reťazcov DNA alebo zvolenú oblasť reťazca známeho genómu in vitro viac než miliónkrát, ako bolo napísané v publikáciách Thomas J. White, Norman Amleim, Henry A. Erlich, 1989, The polymerase chain reaction. Technical Focus, zv. 5, č. 6, S. Kwok a R. Higuchi 1989, Avoiding false positives witch PCR. Náture, zv. 339, str. 237-238.
DNA, izolovaná z buniek alebo DNA plazmidu, sa spracováva tak, aby bolo možné oddeliť jej komplementárne reťazce.
Tieto reťazce sa potom spoja s prebytkom dvoch DNA-oligonukleidov s dĺžkou vždy 20 až 25 párov báz, ktoré boli chemicky syntetizované tak, aby zodpovedali reťazcom X nukleidov, kde X je obvykle 50 až 2000 párov báz.
Oba nukleotidy sú použité ako špecifické priméry na syntézu DNA in vitro, katalyzovanou DNA-polymerázou, pri ktorej dochádza k vzniku kópii DNA medzi obidvoma reťazcami, zodpovedajúcimi použitým dvom oligonukleotidom. V prípade, že oba oligonukleotidy, použité ako primérym obsahujú príslušné reťazce, je možné vytvoriť nové miesta štiepenia na oboch zakončeniach 5' a 3'.
Po mnohonásobnom opakovaní reakčných cyklov je možné získať veľké množstvo fragmentov DNA s požadovanou dĺžkou, tento fragment je potom možné čistiť clcktroforézou na géli a preukázať jeho vlastnosti štiepením pôsobením reštrikčných enzýmov a elektroforézou na agarosovom géli. Amplifikovaný, čistený fragment DNA je potom možné použiť na väzbu na ďalšie fragmenty alebo plazmidy.
PCR-fragmenty DNA sa amplifikujú so zarovnaným zakončením. Aby bolo možné získať zakončenia, vhodné na nasledujúcu väzbu, je nutné fragment rozštiepiť požadovanou endonukleázou a potom znovu čistiť.
PCR-reakciu jc možné uskutočniť v 20 až 30 cykloch. Každý z týchto cyklov sa delí na tri stupne, ktoré sa vykonávajú počas rôznych časov pri odlišných reakčných teplotách, ktoré sú riadené automatickým zariadením, PCR-thermo-cycler. Prvým stupňom je denaturácia matrice DNA (1 minúta pri 95 °C), druhým stupňom hybridizácia tejto DNA a primérov (1 minúta pri 55 °C), tretím stupňom je polymerizácia (2 minúty pri 72 °C).
Konečný objem pre jednu skúšku jc 30 mikrolitrov v nasledujúcich konečných koncentráciách: PCR-pufer lx, zmes nukleidov s obsahom 200 mikroM každého zo štyroch nukleidov, 200 ng každého z dvoch primérov v 30 m krolitroch a 0,5 jednotky Tag-polymerázy v 30 mikrolitroch bidestilovanej vody.
Príklad 6
Pestovanie buniek po transfekcii a sekrécia bielkoviny
Bunky po transfekcii (C 127 alebo CHO, ATCC) sa naočkujú na bežné rastové prostredie DMEM s 10 % fetálnehc teľacieho séra, glukózou a glutamínom v Petriho miskách v množstve 1 až 2 x 106 buniek na misku s priemerom 11 cm 1. deň. Nasledujúci deň sa prostredie odstráni 4 hodí ry pred pridaním zrazeniny DNA k bunkám a bunky sa dvakrát premyjú 1 x PBS. Potom sa pridá 8 ml prostredia DMEM bez fetálneho teľacieho séra (FCS) a po 4 hodinách sa k bunkám pridá vyzrážaná DNA, pripravená ďalej uvedeným spôsobom. Po ďalších 4 hodinách sa prostredie znovu odstráni a pridajú sa 3 ml prostriedku Glycerol-Mix (50 m 2 x TBS pufra, 30 ml glycerolu a 120 ml destilovanej vedy). Zmes sa inkubuje 3 minúty pri teplote 37 °C, potom sa prostredie okamžite odstráni a bunky sa premyjú 1 x PBS. Potom sa bunky pestujú cez noc v 8 ml prostredia DMEM s 10 FCS.
Po 48 hodinách sa bunky od platne oddelia pôsobením rortoku trypsinu a EDTA (0,025 % trypsínu + 1 mM EDTA). Potom sa bunky premyjú 1 x PBS na odstránenie trj psinu a EDTA, uvedú sa do suspenzie v prostredí DMEM s 10 % FDC a rozdelia na platne s 24 vyhĺbeninami tak, že sa bunky z jednej misky rozdelia do 4 týchto platní.
V prípade, že bunky dobre rastú, pridá sa selekčné prostredie (0,5 až 1 mg/ml neomycínu alebo 250 Tg/ml xantinu, 15 Tg/ml hypoxantínu alebo 25 Tg/ml adenínu, 10 TFml tymidinu, 2 Tg/ml aminopterínu, 25 Tg/ml kyseliny mykofenolovej v prípade eco-gpt). Prostredie sa mení každý týždeň. Po dvoch týždňoch je možné pozorovať rast prvých kolónii buniek.
K 10 mikrogramom DNA plazmidu a 20 mikrogramom DNA ako nosiča (DNA zo spermy lososa alebo teľacieho týmusu) sa pridá pufer TE (10 mM tris-HCl a 1 mM EDTA, pH 7,05) do konečného objemu 440 mikrolitrov a pridá sa 60 mikrolitrov 2M chloridu vápenatého. Potom sa pr dá ešte rovnaké množstvo 2 x TBS (Hepes 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,05) a zmes sa dobre premieša. Tento roztok sa inkubuje 30 minút pri teplote 37 °C a potom sa priamo pridá k bunkám, určeným na tranfekciu.
Príklad 7
Príprava pomocného prostriedku z čistených častíc
K požadovanej koncentrácii antigénu v suspenzii v sterilnom fyziologickom roztoku sa pridá Thimerosol v objemovom pomere 1 : 10 000, ďalej 1/10 objemu filtrácie steril zovaného 0,2 M roztoku KA1(SO4)2 x 12H2O. Potom sa upraví pH na 5,0 pridaním IN sterilného roztoku hydroxidu sodného a suspenzia sa mieša 3 hodiny pri teplote miestnosti. Antigén, vyzrážaný hlinitou zlúčeninou, sa oddelí odstredením 10 minút pri 2000 ot./min., uvedie sa znovu do suspenzie v IN roztoku chloridu sodného s obsahom 1 : : 10 000 Thimerosolu a potom sa za sterilných podmienok deh na jednotlivé podiely.
Príklad 8
Čistenie antigénu jadra vírusu vírusu hepatitídy B
Supernatant buniek, vylučujúcich antigén jadra HB, sa oddelí a koncentruje ultrafdtráciou. Koncentrát sa vyčerí odstredením 15 minút pri 20 000 ot./min. a teplote 4 °C s použitím rotora SW28 (Beckman).
Tvorba častíc sa skúša odstredením s použitím gradientu 0 až 45 % sacharózy a takisto rotora 24 hodín pri 28 000 ot./min. a teplote 4 °C. Gradient sa podrobí frakcionácii a frakcie sa analyzujú skúškou ELISA.
Príklad 9
V nasledujúcich tabuľkách sú uvedené výsledky skúšky ELISA s imunogénnymi časticami podľa vynálezu nasledujúcim spôsobom.
V nasledujúcej tabuľke IV sú uvedené údaje pre čistené častice antigénu HBs, získané s použitím akejkoľvek konštrukcie reťazca HBV podľa vynálezu včítane epitopov preS1 a oblasti S s použitím anti-pre-Sl monoklonálnej protilátky MA 18/7 a anti-HBs-monoklonálnej protilátky GO22.
V nasledujúcej tabuľke IV sú uvedené frakcie, ktoré boli získané s použitím gradientu CsCl.
Tabuľka IV-1
| gradient CsCl frakcie č. | skúška ELISA (E®492) monoklonálne protilátka 18/7 |
| 13 | 0,092 |
| 14 | 0,210 |
| 15 | 0,388 |
| 16 | 1,662 |
| 17 | 2,604 |
| 18 | 0,648 |
| 19 | 0.031 |
| Tabuľka IV-2 | |
| gradient CsCl frakcie č. | skúška ELISA (E=492) monoklonálna protilátka GO22 |
| 13 | 0,133 |
| 14 | 0,425 |
| 15 | 0.822 |
| 16 | 1,970 |
| 17 | 2,954 |
| 18 | 0,967 |
| 19 | 0,076 |
| V tabuľke V sú uvedené výsledky skúšky ELISA s čis- | |
| tenými časticami antigénu jadra HB z akejkoľvej konštrukcie reťazca jadra HB podľa vynálezu s polyklonálnymi | |
| protilátkami proti jadru HB GO22. | a monoklonálnou protilátkou |
| Tabuľka V-1 | |
| sacharózový gradient | skúška ELISA (E=492) |
| frakcie ó. | polyklonálne protilátky |
| 6 | 0,25 |
| 7 | 0,922 |
| 8 | 1,423 |
| 9 | 1.5 |
| 10 | 1,5 |
| 11 | 1,28 |
| 12 | 0,465 |
Tabuľka V-2 sacharózový gradient frakcie č.
skúška ELISA (E»492) monoklonálna protilátka GO22 proti HB-A-Ag
Príklad 10
Skúšky s podávaním prostriedku Hepa-Care šimpanzom
Hepa-Care sú častice s povrchovým antigénom vírusu hepatitídy B (SI a S2) v špecifickom spracovaní v pomere 50 : 50, tento prostriedok je možné použiť na liečenie chronických vírusov hepatitídy.
Pokus 1
Šimpanzovi 1, ktorý bol nosičom vírusu hepatitídy B, bol vnútrosvalovo podaný prostriedok Hepa-Care v časovom období 0,4 a 8 týždňov, vždy v dávke 18 mikrogramov v jednej injekcii.
Potom boli sledované pečeňové enzýmy, výsledok je znázornený na obr. IV, a množstvo antigénu hepatitídy B v sére, ako je znázornené na obr. V.
Pokus 2
Šimpanz 1 bol po ošetrení, uskutočnenom podľa pokusu 1, ešte liečený ďalšími injekciami, ktoré boli podávané v týždni 30, 34 a 38. Výsledky tohto liečenia sú uvedené na obr. VI.
Pokus 3
Šimpanzovi 2 bol podávaný prostriedok Hepa-Care, no prostriedok bol podaný vnútrožilovo vždy v dávke 2 mg. Výsledky sú znázornené na obr. VII.
Na kontrolnom šimpanzovi 3 boli taktiež sledované pečeňové enzýmy, výsledok je znázornený na obr. VIII.
Príklad 11
Liečenie prostriedkom Hepa-Care (zloženie prostriedku je opísané v príklade 10)
Pacient 1 (muž, 65 rokov, chorobou trpí 2 roky): parametre hepatitídy B: HBsAg poz.
anti-HBs neg. HBeAg neg. anti-HBe poz. anti-HBc neg.
Chorému bol vnútrosvalovo podávaný prostriedok Hepa-Care v mesiaci 0, 1, 6 a 7. Výsledky merania množstva antigénu a protilátky sú uvedené na obr. IX a X.
Pacient 2 (žena, 48 rokov, choroba trvá 12 rokov): parametre hepatitídy B: HBsAg poz.
HBeAg neg. anti-HBs neg. anti-HBe poz. anti-HBc poz.
Chorému bol vnútrosvalovo podávaný prostriedok Hepa-Care v mesiaci 0, 1 a 6. Výsledky merania množstva antigénu a protilátky sú uvedené na obr. XI a XII.
SK 280551 Β6
Pacient 3 (žena, 41 rokov, choroba trvá 5 rokov): parametre hepatitídy B: HBsAg poz.
HBeAg neg. anti-HBs neg. anti-HBe poz.
Vnútrosvalovo bol podávaný Hepa-Care v mesiaci 0, 1, a 5. Hodnoty antigénu a protilátky sú uvedené na obr. XIII a XIV.
Zoznam reťazcov
| reťazec ID č: | 1 | |||||
| typ reťazca: | nukleotid | |||||
| dĺžka reťazca: | 558 bp | |||||
| reťazec: | jednoduchý | |||||
| topológia: | lineárna | |||||
| typ molekuly: | DNA genómu | |||||
| pôvodný zdroj: | jadro HBV | |||||
| pokusný zdroj: | PCR-amplifikácia | |||||
| ATG GAC ATT | GAC | CCT | TAT AAA GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT GTG GAG | TTA | CTC | TCG TTT TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC TTT CCT | TCC | GTA | CGA GAT CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC TCA GCT | CTG | TAT | CGA GAA GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT GAG CAT | TGC | TCA | CCT CAC CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG CAA GCC | ATT | CTC | TGC TGG GGG | GAA | TTG | ATG |
| ACT CTA GCT | ACC | TGG | GTG GGT AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT CCA GCA | TCC | AGA | GAT CTA GTA | GTC | AAT | TAT |
| GTT AAT ACT | AAC | ATG | GGT TTA AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA TTG TGG | TTT | CAT | ATA TCT TGC | CTT | ACT | TTT |
| GGA AGA GAG | ACT | GTA | CTT GAA TAT | TTG | GTC | TCT |
| TTC GGA GTG | TGG | ATT | CGC ACT CCT | CCA | GCC | TAT |
| AGA CCA CCA | AAT | GCC | CCT ATG TTA | TCA | ACA | CTT |
| CCG GAA ACT | ACT | GTT | GTT AGA CGA | CGG | GAC | CGA |
| GGC AGG TCC | CCT | AGA | AGA AGA ACT | CCC | TCG | CCT |
| CGC AGA CGT | AGA | TCT | CAA TCG CCG | CGT | CGC | AGA |
| AGA TCT CAA | TCT | CGG | GAA TCT CAA | TGT | TAG | |
| reťazec ID č: | 2 | |||||
| typ reťazca: | nukleotid | |||||
| dĺžka reťazca: | 504 bp | |||||
| reťazec: | jednoduchý | |||||
| topológia: | lineárna | |||||
| typ molekuly : | DNA genómu | |||||
| pôvodný zdroj: | jadro HBV | |||||
| pokusný zdroj: | PCR-amplifikácia | |||||
| ATG GAC ATT | GAC | CCT | TAT AAA GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT GTG GAG | TTA | CTC | TCG TTT TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC TTT CCT | TCC | GTA | CGA GAT CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC TCA GCT | CTG | TAT | CGA GAA GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT GAG CAT | TGC | TCA | CCT CAC CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG CAA GCC | ATT | CTC | TGC TGG GGG | GAA | TTG | ATG |
| ACT CTA GCT | ACC | TGG | GTG GGT AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT CCA GCA | TCC | AGA | GAT CTA GTA | GTC | AAT | TAT |
| GTT AAT ACT | AAC | ATG | GGT TTA AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA TTG TGG | TTT | CAT | ATA TCT TGC | CTT | ACT | TTT |
| GGA AGA GAG | ACT | GTA | CTT GAA TAT | TTG | GTC | TCT |
| TTC GGA GTG | TGG | ATT | CGC ACT CCT | CCA | GCC | TAT |
| AGA CCA CCA | AAT | GCC | CCT ATG TTA | TCA | ACA | CTT |
| CCG GAA ACT | ACT | GTT | GTT AGA CGA | CGG | GAC | CGA |
| GGC AGG TCC | CCT | AGA | AGA AGA ACT | CCC | TCG | CCT |
| CGC AGA CGT | ||||||
| reťazec ID č: | 3 | |||||
| typ reťazca: | nukleotid | |||||
| dĺžka reťazca: | 504 bp | |||||
| reťazec: | jednoduchý | |||||
| topológia: | lineárna |
| typ molekuly: | DNA genómu | ||||
| pôvodný zdroj: | jadro HBV | ||||
| pokusný zdroj | PCR-amplifikácia | ||||
| ATG GAC ATT | GAC | CCT | TAT | AAA GAA TTT GGA | GCT |
| ACT GTG GAG | TTA | CTC | TCG | TTT TTG CCT TCT | GAC |
| TTC TTT CCT | TCC | GTA | CGA | GAT CTC CTA GAC | ACC |
| GCC TCA GCT | CTG | TAT | CGA | GAA GCC TTA GAG | TCT |
| CCT GAG CAT | TGC | TCA | CCT | GAC CAT ACT GCA | CTC |
| AGG CAA GCC | ATT | CTC | TGC | TGG GGG GAA TTG | ATG |
| ACT CTA GCT | ACC | TGG | GTG | GGT AAT AAT TTG | CAA |
| GAT CCA GCA | TCC | AGA | GAT | CTA GTA GTC AAT | TAT |
| GIT AAT ACT | AAC | ATG | GGT | TTA AAG ATC AGG | CAA |
| CIA TTG TGG | TTT | CAT | ATA | TCT TGC CTT ACT | TTT |
| GGA AGA GAG | ACT | GTA | CTT | GAA TAT TTG GTC | TCT |
| TI C GGA GTG | TGG | ATT | CGC | ACT CCT CCA GCC | TAT |
| AGA CCA CCA | AAT | GCC | CCT | ATG TTA TCA ACA | CTT |
| CCG GAA ACT | ACT | GTT | GTT | AGA CGA CGG GAC | CGA |
| GGC AGG TCC | CCT | AGA | AGA | AGA ACT CCC TCG | CCT |
| CGC AGA CGT | |||||
| reťazec ID č: | 4 | ||||
| typ reťazca: | nukleotid | ||||
| dĺžka reťazca: | 543 bp | ||||
| reťazec: | jednoduchý | ||||
| topológia: | lineárna | ||||
| typ molekuly: | DNA genómu | ||||
| pôvodný zdroj: | jadro HBV | ||||
| pokusný zdroj: | PCR-amplifikácia | ||||
| TCC AAC | CTG | TGC | CTT | GGG TGG CTT TGG | GGC |
| AIG GAC ATT | GAC | CCT | TAT | AAA GAA TTT GGA | GCT |
| ACT GTG GAG | TTA | CTC | TCG | TTT TTG CCT TCT | GAC |
| TTS TTT CCT | TCC | GTA | CGA | . GAT CTC CTA GAC | ACC |
| GCC TCA GCT | CTG | TAT | CGA | GAA GCC TTA GAG | TCT |
| CCT GAG CAT | TGC | TCA | CCT | CAC CAT ACT GCA | CTC |
| AGG CAA GCC | ATT | CTC | TGC | TGG GGG GAA TTG | ATG |
| ACT CTA GCT | ACC | TGG | GTG | GGT AAT AAT TTG | CAA |
| GAT CCA GCA | TCC | AGA | GAT | CTA GTA GTC AAT | TAT |
| GTT AAT ACT | AAC | ATG | GGT | ' TTA AAG ATC AGG | CAA |
| CTA TTG TGG | TTT | CAT | ATA | TCT TGC CTT ACT | TTT |
| GGA AGA GAG | ACT | GTA | CTT | GAA TAT TTG GTC | TCT |
| TTC GGA GTG | TGG | ATT | CGC | ; ACT CCT CCA GCC | TAT |
| AGA CCA CCA | AAT | GCC | CCT | ATG TTA TCA ACA | CTT |
| CCG GAA ACT | ACT | GTT | GTT | AGA CGA CGG GAC | CGA |
| GCC AGG TCC | CCT | AGA | AGA | . AGA ACT CCC TCG | CCT |
| CGC AGA CGT | |||||
| reťazec ID č; | 5 | ||||
| typ reťazca: | nukleotid | ||||
| dĺžka reťazca: | 534 bp | ||||
| reťazec: | jednoduchý | ||||
| topológia: | lineárna | ||||
| typ molekuly: | DNA genómu | ||||
| pôvodný zdroj: | jadro HBV | ||||
| pokusný zdroj: | PCR-amplifikácia | ||||
| TCC | AAC | CTG | TGC | CTT GGG TGG CTT TGG GGC | |
| ATG GAC | ATT | GAC | CCT | TAT AAA GAA TTT GGA GCT | |
| ACT GTG | GAG | TTA | CTC | TCG TTT TTG CCT TCT GAC | |
| TTC TTT | CCT | TCC | GTA | CGA GAT CTC CTA GAC ACC | |
| GCC TCA | GCT | CTG | TAT | CGA GAA GCC TTA GAG TCT | |
| CCT GAG | CAT | TGC | TCA | CCT CAC CAT ACT GCA CTC | |
| AGG CAA | GCC | ATT | CTC | TGC TGG GGG GAA TTG ATG | |
| ACT CTA | GCT | ACC | TGG | GTG GGT AAT AAT TTG CAA | |
| GAT CCA | GCA | TCC | AGA | GAT CTA GTA GTC AAT TAT | |
| GTT AAT | ACT | AAC | ATG | GGT TTA AAG ATC AGG CAA | |
| CTA TTG | TGG | TTT | CAT | ATA TCT TGC CTT ACT TTT | |
| GGA AGA | GAG | ACT | GTA | CTT GAA TAT TTG GTC TCT | |
| TTC GGA | GTG | TGG | ATT | CGC ACT CCT CCA GCC TAT | |
| AGA CCA | CCA | AAT | GCC | CCT ATG TTA TCA ACA CTT | |
| CCG GAA | ACT | ACT | GTT | GTT AGA CGA CGG GAC CGA | |
| GGC AGG | TCC | CCT | AGA | AGA AGA ACT CCC TCG CCT | |
| CGC AGA | CGT |
reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
ATG CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGC AAT AAT TTG GAA GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTC TTT CCT TCC GTC AGG reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
TCC AAC TTG TGC CTT
GAC ATT GAC CCT TAT
GTG GAG TTA CTC TCG
TTT CCT TCC GTC AGG reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj :
GAT CTC CTA GAC ACC
GAA GCC TTA GAG TCT
CAC CAT ACT GCA CTC reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
ATG GAC ATT GACCCT
ACT GTG GAG TTACTC
TTC TTT CCT TCCGTC
GCC TCA GCT CTGTAT
CCT GAG CTA TGCTCA
AGG CAA GGT ATCCTC
ACT CTA GCT ACC TGG
GAT CCA GCA TCT AGG reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec:
nukleotid bp jednoduchý lineárna
DNA genómu jadro HBV chemická syntéza nukleotid bp jednoduchý lineárna
DNA genómu jadro HBV chemická syntéza nukleotid
114 bp jednoduchý lineárna
DNA genómu jadro HBV chemická syntéza
GGG TGG CTT TGG GGC ATG AAA DAA TTT GGA GCT ACT TTT TTG CCT TCT GAC TTC nukleotid bp jednoduchý lineárna
DNA genómu jadro HBV chemická syntéza
GCC TCA GCT CTG TAT CGA
CCT GAG CTA TGC TCA CCT AGG CAA GGT nukleotid
261 bp jednoduchý lineárna
DNA genómu jadro HBV chemická syntéza
TAT AAA GAA TTT GGA GCT TCG Τπ TTG CCT TCT GAC AGG GAT CTC CTA GAC ACC CGA GAA GCC TTA GAG TCT CCT CAC CAT ACT GCA CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG GTG GGC AAT AAT TTG CAA GAC CTT GTA GTA AAT nukleotid 291 bp jednoduchý topológia:
typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj :
TCC AAC CTG TGC ATG GAC ATT GAC CCT
ACT GTG GAG TTA CTC
TTC TTT CCT TCC GTC
GCC TCA GCT CTG TAT
CCT GAG CTA TGC TCA lineárna
DNA genómu jadro HBV chemická syntéza
| CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC |
| TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| AGG | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
| CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GGT ATC | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TGG | ATG | |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGC | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCT | AGG | GAC | CTT | GTA | GTA | AAT |
reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
ACC TGG GTG GGT
TCC AGA GAT CTA AAC ATG GGT TTA TTT CAT ATA TCT reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
| GCA | TCC | AGA |
| ACT | AAC | ATG |
| TGG | TTT | CAT |
| GAG | ACT | GTA |
| GTG | TGG |
GAT GGT ATA CTT
CTA
TTA
TCT
GAA
GTA AAG TGC TAT reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj pokusný zdroj:
AAT GTA AAG TGC nukleotid
123 bp jednoduchý lineárna
DNA genómu jadro HBV chemická syntéza AAT TTG CAA GAT CCA
GTC AAT TAT GTT AAT
ATC AGG CAA CTA TTG
CTT ACT TTT nukleotid 138 bp jednoduchý lineárna DNA genómu jadro HBV chemická syntéza GTC AAT TAT GTT ATC AGG CAA CTA CTT ACT TTT GGA TTG GTC TCT TTC nukleotid
294 bp jednoduchý lineárna
DNA genómu
HBV S2 ayw/adw DNA HBV
| ATG | CAG | TGG | AAT | TCC | AGA | ACC | TTC | CAC | CAA | ACT CTG |
| CAA | GAT | CCC | AGA | GTG | AGA | GGC | CTG | TAT | TTC | CCT GCT |
| GGT | GGC | TCC | AGT | TCA | GGA | ACA | GTA | AAC | CCT | GTT CTG |
| ACT | ACT | GCC | TCT | CCC | TTA | TCG | TCA | ATC | TTC | TCG AGG |
| ATA | GAG | AAC | ATC | ACA | TCA | GGA | TTC | CTA | GGA | CCC CTT |
| CTC | GTG | TTA | CAG | GCG | GGG | TTT | TTC | TTG | TTG | ACA AGA |
| ATC | CTC | ACA | ATA | CCG | CAG | AGT | CTA | GAC | TCG | TGG TGG |
| ACT | TCT | CTC | AAT | TTT | CTA | GGG | GGA | ACT | ACC | GTG TGT |
| CTT | GGC | CAA | AAT | TCG | CAG | TCC | TCA | ACC | TCC | AAT CAC |
| TCA | CCA | ACC | TCT | TGT | CCT | CCA | ACT | TGT | CCT | GGT TAT |
| CGC | TGG | ATG | TGT | CTG | CGG | CGT | TTT | ATC | ATC | TTC CTC |
| TTC | ATC | CTG | CTG | CTA | TGC | CTC | ATC | TTC | TTG | TTG GTT |
| CTT | CTG | GAC | TAT | CAA | GGT | ATG | TTG | CCC | GTT | TGT CCT |
| CTA | ATT | CCA | GGA | TCC | TCA | ACA | ACC | AGC | ACG | GGA CCA |
| TGC | CGG | ACC | TGC | ATG | ACT | ACT | GCT | CAA | GGA | ACC TCT |
| ATG | TAT | CCC | TCC | TGT | TGC | TGT | ACC | AAA | CCT | TCG GAC |
| GGA | AAT | TGC | ACC | TGT | ATT | CCC | ATC | CCA | TCA | TCC TGG |
| GCT | TTC | GGA | AAA | TTC | CTA | TGG | GAG | TGG | GCC | TCA GCC |
| CGT | TTC | TCC | TGG | CTC | AGT | TTA | CTA | GTG | CCA | TTT GTT |
| CAG | TGG | TTC | GTA | GGG | CTT | TCC | CCC | ACT | GTT | TGG CTT |
| TCA | GTT | ATA | TGG | ATG | ATG | TGG | TAT | TGG | GGG | CCA AGT |
| CTG | TAC | AGC | ATC | TTG | AGT | CCC | TTT | TTA | CCG | CTG TTA |
| CCA | ATT | TTC | TTT | TGT | CTT | TGG | GTA | TAC | ATT |
| reťazec ID č: | 15 | dĺžka reťazca: | 63 bp |
| typ reťazca: | nukleotid | reťazec: | jednoduchý |
| dĺžka reťazca: | 99 bp | topológia: | lineárna |
| reťazec: | jednoduchý | typ molekuly: | DNA genómu |
| topológia: | lineárna | pôvodný zdroj: | HBV Sl ay |
| typ molekuly: | DNA genómu | pokusný zdroj: | chemická syntéza |
| pôvodný zdroj: | jadro HBV | GAT CCA GCC | TTC AGA GCA AAC ACC GCA AAT CCA GAT |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza | TGG GAC TTC | AAT CCC AAC AAG GAC ACC |
| TAT GTT AAT ACT AAC | ATG GGT TTA AAG ATC AGG | ||
| CAA CTA TTG TGG ΤΤΤ | CAT ATA TCT TGC CTT ACT | Asp Pro Ala | Prie Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp |
| TTT GGA AGA GAG ACT | GTA CTT GAA TAT TTG GTC | Tr> Asp Phe | Asn Pro Asn Lys Asp Thr |
| reťazec ID č: | 16 | reťazec ID č: | 20 |
| typ reťazca: | nukleotid | typ reťazca: | nukleotid a zodpovedajúca biel- |
| dĺžka reťazca: | 390 bp | kovina | |
| reťazec: | jednoduchý | dĺžka reťazca: | 108 bp |
| topológia: | lineárna | reťazec: | jednoduchý |
| typ molekuly: | DNA genómu | topológia: | lineárna |
| pôvodný zdroj: | jadro HBV | typ molekuly: | DNA genómu |
| pokusný zdroj: | PCR-amplifikácia | pôvodný zdroj: | HBV Sl ay |
| TCC AAC | CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC | pokusný zdroj : | chemická syntéza |
| ATG GAC ATT | GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT | ||
| CCG CAC GGA | GGC CTT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT | ||
| ACT GTG GAG | TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC | CAG GGC ATA | CTA CAA ACT TTG CCA GCA AAT CCG CCT |
| TTC TTT CCT | TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC | CCT GCC TCC | ACC AAT CGC CAG TCA GGA AGG CAG CCT |
| GCC TCA GCT | CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT | ||
| CCT GAG CAT | TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC | Pro His Gly | Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gin Ala |
| AGG CAA GCC | ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG | Gh Gly lle | Leu Glu Thr Leu Pro Ala Asn Pro Pro |
| ACT CTA GCT | ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA | Pro Ala Ser | Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro |
| GAT CCA GCA | TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT | ||
| GTT AAT ACT | AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA | reťazec ID č: | 21 |
| CTA TTG TGG | TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT | typ reťazca: | nukleotid |
| GGA AGA GAG | ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC | dĺžka reťazca: | 63 bp |
| reťazec: | jednoduchý | ||
| reťazec ID č: | 17 | topológia: | lineárna |
| typ reťazca: | nukleotid a zodpovedajúca biel- | typ molekuly: | DNA genómu |
| kovina | pôvodný zdroj: | HBV Sl ad | |
| dĺžka reťazca: | 60 bp | pokusný zdroj: | chemická syntéza |
| reťazec: | jednoduchý | CCT GCC TCC | ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT |
| topológia: | lineárna | AC T CCC ATC | TCT CCA CCT CTA AGA GAC-X |
| typ molekuly: | DNA genómu | ||
| pôvodný zdroj: | HBV Sl ay | reťazec ID č: | 22 |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza | typ reťazca: | nukleotid a zodpovedajúca biel- |
| AAT CCT CGT | GGA TTC TTT CCC GAT CAC CAG TTG GAT | kovina | |
| CCA GCC TTC | AGA GCA AAC ACC GCA | dĺžka reťazca: | 108 bp |
| reťazec: | jednoduchý | ||
| Asn Pro Leu | Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp | topológia: | lineárna |
| Pro Ala Phe | Arg Ala Asn Thr Ala | typ molekuly: | DNA genómu |
| pôvodný zdroj: | HBV Sl ad | ||
| reťazec ID C: | 18 | pokusný zdroj: | chemická syntéza |
| typ reťazca: | nukleotid a zodpovedajúca biel- | CCA CAC GGC | GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT |
| kovina | CAG GGC ATA | TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT CCT | |
| dĺžka reťazca: | 63 bp | CC T GCC TCC | ACC AAT CGC CAG TCA GGA AGG CAG CCT |
| reťazec: | jednoduchý | ||
| topológia: | lineárna | Pr:i His Gly | Gly lle Leu Gly Trp Ser Pro Gin Ala |
| typ molekuly: | DNA genómu | Gin Gly lle | Leu Thr Thr Val Ser Thr lle Pro Pro |
| pôvodný zdroj: | HBVS1 ay | Pr> Ala Ser | Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza | ||
| CCT GCC TCC | ACC AAT CGC CAG TCA GGA AGG CAG CCT | reťazec ID č: | 23 |
| ACC CCG CTG | TCT CCA CCT TTG AGA AAC | typ reťazca: | nukleotid |
| dĺžka reťazca: | 60 bp | ||
| Pro Ala Ser | Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro | reťazec: | jednoduchý |
| Thr Pro lle | Ser Pro Pro Leu Arg Asn | topológia: | lineárna |
| typ molekuly: | DNA genómu | ||
| reťazec ID č: | 19 | pôvodný zdroj: | HBV Sl ay |
| typ reťazca: | nukleotid a zodpovedajúca biel- | pokusný zdroj: | chemická syntéza |
| kovina |
CAG TGG AAT TCC AGA ACC TTC CAC CAA ACT CTG CAA GAT CCC AGA GTG AGA GGC CTG TAT-X
| reťazec ID č: | 24 |
| typ reťazca: | nukleotid |
| dĺžka reťazca: | 60 bp |
| reťazec: | jednoduchý |
| topológia: | lineárna |
| typ molekuly: | DNA genómu |
| pôvodný zdroj: | HBV S2 ay |
| pokusný zdroj . | chemická syntéza |
| GAT CCC AGA GTG AGA | GGC CTG TAT TTC CCT GCT |
| GGT GGC TCC AGT TCA | GGA ACA GTA AAC-X |
| reťazec ID č: | 25 |
| typ reťazca: | nukleotid |
| dĺžka reťazca: | 558 bp |
| reťazec: | jednoduchý |
| topológia: | lineárna |
| typ molekuly: | DNA genómu |
| pôvodný zdroj: | jadro HBV adw |
| pokusný zdroj: | PCR-amplifikácia |
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
| GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
| GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
| TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
| AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
| CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
| GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
| CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
| AGA | TCT | CAA | TCT | CGG | GAA | TCT | CAA | TGT | TAG |
reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj: CTA GAC TCG TGG TGG ACT GGA TCT CCC GTG TGT CTT CCA ACC TCC AAT CAC TCA ATT TGT CCT GGT TAT CGC TTT ATC ATA TTC CTC TTC ATC TTC TTA TTG GTT CTT TTG CCC GTT TGT CCT CTA ACC AGT ACG GGA CCA TGC GCT CAA GGC AAC TCT ATG ACA AAA CCT ACG GAT GGA ATC CCA TCG TCC TGG GCT
GAG TGG GCC TCA GTC CGT CTA GTG CCA TTT GTT CAG CCC ACT GTT TGG CTT TCA TAT TGG GGG CCA AGT CTG TTT ATA CCG CTG TTA CCA GTA TAC ATT reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
678 bp jednoduchý lineárna
DNA genómu
HBV S adw/ayw
DNA HBV
ATA GAC AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTT CTC GTG TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC
ACA ATA CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC
| AAT TTT | CTA | GGG | GGA | ACT |
| TCG CAG | TCC | TCA | ACC | TCC |
| CCT CCA | ACT | TGT | CCT | GGT |
| CGT TTT | ATC | ATC | TTC | CTC |
| ATC TTC | TTG | TTG | GTT | CTT |
| CCC GTT | TGT | CCT | CTA | ATT |
| ACG GGA | CCA | TGC | CGG | ACC |
| ACC TCT | ATG | TAT | CCC | TCC |
| GAC GGA | AAT | TGC | ACC | TGT |
| GCT TTC | GGA | AAA | TTC | CTA |
| TTC TCC | TGG | CTC | AGT | TTA |
| TTC GTA | GGG | CTT | TCC | CCC |
| TGG ATG | ATG | TGG | TAT | TGG |
| TTG AGT | CCC | TTT | TTA | CCG |
| CTT TGG | GTA | TAC | ATT |
ACC GTG TGT CTT GGC CAA AAT AAT CAC TCA CCA ACC TCT TGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG
TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC CTG GAC TAT CAA GGT ATG TTG CCA GGA TCC TCA ACA ACC AGC TGC ATG ACT ACT GCT CAA GGA TGT TGC TGT ACC AAA CCT TCG ATT CCC ATC CCA TCA TCC TGG TGG GAG TGG GCC TCA GCC CGT
CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG ACT GTT TGG CTT TCA GTT ATA GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGT nukleotid 585 bp jednoduchý lineárna DNA genómu HBV S adw/ayw DNA HBV
TCT CTC AAT TTT CTA GGG GGC CAA AAT TCG CAG TCC CCA ACC TCC TGT CCT CCA TGG ATG TGT CTG CGG CGT ATC CTG CTG CTA TGC CTC CTG GAT TAT CAA GGT ATG ATT CCA GGA TCA ACA ACA AAA ACC TGC ACG ACT CCT TTT CCC TCA TGT TGC TGT AAT TGC ACC TGT ATT CCC TTC GCA AAA TAC CTA TGG TTC TCT TGG CTC AGT TTA TGG TTC GTA GGG CTT TCC GCT ATA TGG ATG ATG TGG TAC AGC ATC GTC AGT CCC ATT TTC TTT TGT CTC TGG nukleotid
106 bp jednoduchý lineárna
DNA genómu HBV Sl chemická syntéza
5'-GAT-CTT-TAA-CAT-GGA-GAA-CAA-TCC-TCT-G
GG-ATT-CTT-TCC-CGA-TCA-CAA-GTT-GGA-TCC-A
GC-CTT-CAG-AGC-AAA-CAC-CGC-AAA-TCC-AGA-T
TG-GGA-CTT-CAA-TCC-CAG-(T)-3' reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
115 bp jednoduchý lineárna DNA genómu HBV S chemická syntéza
5'-AAT-TCT-AGA-CTC-GAG-TCT-GAA-CAT-AGA-G
AA-CAT-CAC-ATC-AGG-ATT-CCT-AGG-ACC-CCT-T
CT-CGT-GTT-ACA-GGC-GGG-GTT-TTT-CTT-GTT-G
AC-AAG-AAT-CCT-CAC-AAT-ACC-GCA-GAG-(C)-3' reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec: topológia: typ molekuly: pôvodný zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
108 bp jednoduchý lineárna
DNA genómu jadro HBV chemická syntéza
5'-GAT-CTT-TTA-AAG-GGA-TCC-TCT-GCT-GGG-G GG-AAT-GGA-TGA-CTCTAGCTACCTGGGTGG-G CA-ATA-ATT-TGG-AAG-ATC-CAG-CAT-CTA-GGG-A CC-TTG-TAG-TAA-ATC-TAGAC-(A)-3' reťazec ID č: typ reťazca: dĺžka reťazca: reťazec:
nukleotid 106bp jednoduchý
SK 280551 Bó
| topológia: | lineárna |
| typ molekuly: | DNA genómu |
| pôvodný zdroj: | jadro HBV |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza |
5'-GAT-CTC-CGG-SAA-TTC-CTG-GGG-CAT-C3GA-C AT-TGA-CCC-TTA-TAA-AGA-ATT-TGG-AGC-TAC-T GT-GGA-GTT-ACT-CTC-GTT-TTT-GCC-TTG-TGAC TT-CTTTCC-TTC-CGT-CAG-(G)-3'
| reťazec ID č: | 32 |
| typ reťazca: | nukleotid |
| dĺžka reťazca: | 89 bp |
| reťazec: | jednoduchý |
| topológia: | lineárna |
| typ molekuly: | DNA genómu |
| pôvodný zdroj: | jadro HBV |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza |
5'-GAT-CTC-CTA-GAC-ACC-GCC-TCA-GCT-CTG-T AT-CGA-GAA-GCC-TTA-GAG-rCT-CCT-GAG-CAT-T GC-TCA-CCT-CAC-CAT-ACT-GCA-CTC-AGG-CAA-G -<G)-3'
| reťazec ID č: | 33 |
| typ reťazca: | nukleotid |
| dĺžka reťazca: | 25 bp |
| reťazec: | jednoduchý |
| topológia: | lineárna |
| typ molekuly: | DNA genómu |
| pôvodný zdroj: | jadro HBV |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza |
5'-TTG-GAT-CCT-CCA-ACC-TGT-GCC-TTG-(G)-3'
| reťazec ID č: | 34 | |||||
| typ reťazca: | nukleotid | |||||
| dĺžka reťazca: | 25 bp | |||||
| reťazec: | jednoduchý | |||||
| topológia: | lineárna | |||||
| typ molekuly: | DNA genómu | |||||
| pôvodný zdroj: | jadro HBV | |||||
| pokusný zdroj | chemická syntéza | |||||
| 6'-CCT-CTA-GAA-CCA-AAT-ATT-CAA-GTA-(C)-3· | ||||||
| reťazec ID č: | 35 | |||||
| typ reťazca: | nukleotid | |||||
| dĺžka reťazca: | 588 bp | |||||
| reťazec: | jednoduchý | |||||
| topológia: | lineárna | |||||
| typ molekuly: | DNA genómu | |||||
| pôvodný zdroj: | jadro HBV | |||||
| pokusný zdroj | PCR-amplifikácia | |||||
| TCC AAC | CTG | TGC | CTT | GGG TGG CTT | TGG | GGC |
| ATG GAC ATT | GAC | CCT | TAT | AAA GAA TTT | GGA | GCT |
| ACT GTG GAG | TTA | CTC | TCG | 1 TTT TTG CCT | TCT | GAC |
| TTC TTT CCT | TCC | GTA | CGA | . GAT CTC CTA | GAC | ACC |
| GCC TCA GCT | CTG | TAT | CGA | . GAA GCC TTA | GAG | TCT |
| CCT GAG CAT | TGC | TCA | CCT | CAC CAT ACT | GCA | CTC |
| AGG CAA GCC | ATT | CTC | TGC | TGG GGG GAA | TTG | ATG |
| ACT CTA GCT | ACC | TGG | GTG | i GGT AAT AAT | TTG | CAA |
| GAT CCA GCA | TCC | AGA | GAT | CTA GTA GTC | AAT | TAT |
| GTT AAT ACT | AAC | ATG | GG1 | ‘ TTA AAG ATC | AGG | CAA |
| CTA TTG TGG | TTT | CAT | ATA | TCT TGC CTT | ACT | TTT |
| GGA AGA GAG | ACT | GTA | CTT | GAA TAT TTG | GTC | TCT |
| TTC GGA GTG | TGG | ATT | CGC | : ACT CCT CCA | GCC | TAT |
| AGA CCA CCA | AAT | GCC | CCT | ATG TTA TCA | ACA | CTT |
| CCG GAA ACT | ACT | GTT | GTT | AGA CGA CGG | GAC | CGA |
| GGC AGG TCC | CCT | AGA | AGA | , AGA ACT CCC | TCG | CCT |
| GGC AGA CGT | AGA | TCT | CAA | TCG CCG CGT | CGC | AGA |
| AGA TCT CAA | TCT | CGG | GAA | . TCT CAA TGT | TAG |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použitie kombinovaného prípravku pozostávajúceho za) aspoň jedného polypeptidového reťazca, ktorý obsahuje jeden alebo viac antigénnych epitopov aktivujúcich T-bunky ab) nosiča, schopného umožniť účinok reťazca/reťazcov epitopu a), pričom polypeptidový reťazec/reťazce a) je viazaný na nosič b) kovalentnou alebo hydrofóbnou väzbou, nr výrobu liečiva na liečenie chronickej vírusovej hepatitídy
- 2. Použitie podľa nároku 1, kde polypeptidovým reťazcom/reťazcami a) je polypeptid vírusu hepatitídy B.
- 3. Použitie podľa nároku 2, kde polypeptidovým reťazcom/reťazcami a) je reťazec aminokyselín jedného alebo väčšieho počtu členov vybraných zo skupiny, zahŕňajúcej peptidy pre-Sl, pre-S2, S vírusu hepatitídy B a antigény jadra vírusu hepatitídy B.
- 4. Použitie podľa nároku 1, kde je polypeptidovým reťazcom/reťazcami a) polypeptid vírusu hepatitídy B modifikovaný nasledujúcimi spôsobmi:i) je možné vypustiť niektoré časti reťazca, pričom musí byť zachovaný epitop, ktorý obsahuje aspoň šesť po sebe nasledujúcich zvyškov aminokyselín, ii) jednu alebo väčší počet aminokyselín je v reťazci možné nahradiť alebo iii) je možné pridať ďalšie aminokyseliny alebo reťazce aminokyselin na N-terminálnom alebo na C-terminálnom zakončení alebo tiež uprostred polypeptidového reťazca reťazcov a).
- 5. Použitie podľa nároku 4, kde polypeptidovým reťazcorn/reťazcami a) je reťazec aminokyselín jedného alebo väčšieho počtu členov vybraných zo skupiny, zahŕňajúcej peotidy pre-Sl, pre-S2, S vírusu hepatitídy B a antigény jadra vírusu hepatitídy B, ktorý je modifikovaný ako je definované v nároku 4.
- 6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, pričom polypeptidový reťazec/reťazce a) je myrisiylovaný.
- 7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, pričom polypeptidový reťazec/reťazce a) je vytváraný expresiou rekombinatnej molekuly DNA.
- 8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde nosičom b) je polysacharid, hydrofóbny polymér alebo anorganická molekula v časticovej forme.
- 9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde nosičom b) je ďalší polypeptidový reťazec.
- 10. Použitie podľa nároku 9, kde polypeptidový reťazec nosiča b) po svojej sekrécii vytvára častice, ktoré majú priemer aspoň 10 nm.
- 11. Použitie podľa nároku 9 alebo 10, kde polypeptidovým reťazcom nosiča b) je podstatná časť alebo úplný reťazec aminokyselín polypeptidu vybraného zo skupiny S-peptidu vírusu hepatitídy B (HBV), peptidu jadra HBV, antigénu jadra vírusu hepatitídy B (HAV) alebo antigénu jadra HIV a povrchových antigénov vírusu detskej obmy, vírusov HAV alebo HIV.
- 12. Použitie podľa nároku 9 alebo 10, kde polypeptidovýin reťazcom nosiča b) je podstatná časť alebo úplný reťazec aminokyselín polypeptidu vybraného zo skupiny S-peptidu HBV, peptidu jadra HBV, antigénu jadra HAV alebo antigénu jadra HIV a povrchových antigénov vírusu detskej obmy, vírusov HAV alebo HIV, pričom je modifikovaný niektorým z nasledujúcich spôsobov:i) vypustenie niektorých častí, pričom schopnosť vytvárať častice musí byť zachovaná,SK 280551 Β6 ii) náhradou jednej alebo niekoľkých aminokyselín inými aminokyselinami alebo iii) pridaním ďalších reťazcov aminokyselín na N-terminálne zakončenie, C-terminálne zakončenie alebo uprostred polypeptidového reťazca b).
- 13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 12, kde polypeptidový reťazec nosiča b) je myristylovaný.
- 14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 13, pričom polypeptidový reťazec/reťazce b) je vytváraný expresiou rekombinatnej molekuly DNA.
- 15. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 14, kde sú polypeptidové reťazce a) a b) spolu spojené disulfidovými mostíkmi.
- 16. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 15, kde sú polypeptidové reťazce a) a b) spolu spojené hydrofóbnym spojením, sprostredkovaným kyselinou myristovou.
- 17. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 16, kde sú polypeptidové reťazce a) a b) spolu spojené peptidovou väzbou, pričom je prípadne medzi polypeptidový reťazec/reťazce a) a polypeptidový reťazec nosiča b) uložený ďalší reťazec, ktorý je k polypeptidovým reťazcom a) a b) viazaný peptidovými väzbami.
- 18. Použitie podľa nároku 17, kde sú polypeptidový reťazec/reťazce a) a polypeptidový reťazec b) vytvorené expresiou z tej istej rekombinantnej molekuly DNA, na ktorej sú kódované za sebou.
- 19. Použitie podľa nároku 18, kde polypeptidový reťazec/reťazce a) a polypeptidový reťazec b) sú vytvorené expresiou zo samostatného otvoreného čítacieho rámca molekuly DNA a môžu byť oddelené ďalším polypeptidovým reťazcom kódovaným tiež v samostatnom otvorenom čítacom rámci.
- 20. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde kombinovaný prípravok je vo forme vnútrožilovej alebo vnútrosvalovej injekcie.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90124775A EP0491077A1 (en) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| PCT/EP1991/002460 WO1992011368A1 (en) | 1990-12-19 | 1991-12-19 | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK63693A3 SK63693A3 (en) | 1993-10-06 |
| SK280551B6 true SK280551B6 (sk) | 2000-03-13 |
Family
ID=8204863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK636-93A SK280551B6 (sk) | 1990-12-19 | 1991-12-19 | Použitie kombinovaného prípravku na výrobu liečiva |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6020167A (sk) |
| EP (2) | EP0491077A1 (sk) |
| JP (2) | JP3857305B2 (sk) |
| KR (1) | KR0156587B1 (sk) |
| AT (1) | ATE170220T1 (sk) |
| AU (1) | AU657935B2 (sk) |
| CA (1) | CA2098021C (sk) |
| CZ (1) | CZ290233B6 (sk) |
| DE (1) | DE69130071T3 (sk) |
| DK (1) | DK0563093T4 (sk) |
| ES (1) | ES2121000T5 (sk) |
| HK (1) | HK1002901A1 (sk) |
| HU (1) | HU216301B (sk) |
| SK (1) | SK280551B6 (sk) |
| WO (1) | WO1992011368A1 (sk) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988010300A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| DE4107612A1 (de) * | 1991-03-09 | 1992-09-10 | Behringwerke Ag | Rekombinante proteine mit der immunreaktivitaet des hepatitis b virus e antigens (hbeag), verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in immunoassays und impfstoffen |
| US6689363B1 (en) | 1992-01-29 | 2004-02-10 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions |
| US7611713B2 (en) | 1993-03-05 | 2009-11-03 | Pharmexa Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions |
| US6509149B2 (en) * | 1995-06-06 | 2003-01-21 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
| BR9709993A (pt) * | 1996-06-25 | 1999-08-10 | Stichting Inst Dierhouderij | Vacina preparação de vacina composição processo para produção de uma preparação imugênica e preparação imugênica |
| US7091324B2 (en) | 1998-11-05 | 2006-08-15 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational epitopes |
| CN1268345C (zh) * | 2000-03-29 | 2006-08-09 | 乔治敦大学 | 治疗丁型肝炎病毒感染的核苷化合物 |
| IL142802A (en) * | 2000-04-27 | 2015-01-29 | Enzo Therapeutics Inc | Use of one or more HBV antigens for the preparation of oral pharmaceutical preparations for the treatment of a person with active HBV infection or hepatocellular carcinoma |
| US6787526B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-09-07 | Idenix Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides |
| US7022830B2 (en) * | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
| KR20030074787A (ko) * | 2001-02-05 | 2003-09-19 | 스트레스젠 바이오테크놀러지스 코포레이션 | Ｂ형 간염 바이러스 치료 |
| US7351413B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-04-01 | Lorantis, Limited | Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis |
| US8420353B2 (en) * | 2002-03-22 | 2013-04-16 | Aprogen, Inc. | Humanized antibody and process for preparing same |
| DE10339927A1 (de) * | 2003-08-29 | 2005-03-24 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen |
| GB0326416D0 (en) | 2003-11-12 | 2003-12-17 | Karolinska Innovations Ab | Methods and means relating to hepatitis B infection |
| WO2005050214A2 (en) * | 2003-11-12 | 2005-06-02 | Hbv Theranostica Ab | Methods and means relating to hepatitis b infection |
| US9603921B2 (en) * | 2004-10-27 | 2017-03-28 | Janssen Vaccines Ag | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus |
| US8071561B2 (en) * | 2007-08-16 | 2011-12-06 | Chrontech Pharma Ab | Immunogen platform |
| WO2009092396A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Universitätsklinikum Heidelberg | Hydrophobic modified pres-derived peptides of hepatitis b virus (hbv) and their use as hbv and hdv entry inhibitors |
| CN101485672B (zh) * | 2008-12-05 | 2010-08-25 | 广东粤龙药业有限公司 | 异丙景糖酐在制备治疗人HBeAg阳性慢性乙型肝炎药物中的应用 |
| US10076570B2 (en) | 2009-08-07 | 2018-09-18 | Transgene S.A. | Composition for treating HBV infection |
| EP2461826A2 (en) | 2009-08-07 | 2012-06-13 | Transgene SA | Composition for treating hbv infection |
Family Cites Families (85)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US34705A (en) * | 1862-03-18 | Improvement in tompions for fire-arms | ||
| US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
| FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
| IN151589B (sk) * | 1978-12-22 | 1983-05-28 | Biogen Nv | |
| EP0182442B2 (en) * | 1978-12-22 | 1996-04-03 | Biogen, Inc. | Recombinant DNA molecules and their method of production |
| US4935235A (en) * | 1979-05-24 | 1990-06-19 | The Regents Of The University Of California | Non-passageable viruses |
| IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
| US5196194A (en) * | 1979-05-24 | 1993-03-23 | The Regents Of The University Of California | Vaccines containing Hepatitis B S-protein |
| USRE34705E (en) | 1979-08-30 | 1994-08-23 | Institut Pasteur | Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby |
| US4415491A (en) * | 1980-01-14 | 1983-11-15 | The Regents Of The University Of California | Synthetic vaccine peptide epitomes of hepatitis B surface antigen |
| EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
| FI83662C (fi) * | 1980-07-17 | 1991-08-12 | Scripps Clinic Res | Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning. |
| GR76274B (sk) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
| AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
| US4741901A (en) * | 1981-12-03 | 1988-05-03 | Genentech, Inc. | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
| JPS58194897A (ja) * | 1982-05-07 | 1983-11-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ，その製造方法およびそれで形質転換させた宿主 |
| JPS5936698A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 |
| US4977092A (en) * | 1985-06-26 | 1990-12-11 | Amgen | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
| US5198348A (en) * | 1982-08-30 | 1993-03-30 | Amgen Inc. | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
| JPS5974985A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-04-27 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| CA1341116C (en) * | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
| US4696898A (en) * | 1984-01-16 | 1987-09-29 | Integrated Genetics, Inc. | Vector encoding hepatitis B surface antigen |
| FR2559159B1 (fr) * | 1984-02-02 | 1986-09-12 | Inst Nat Sante Rech Med | Vecteurs viraux de clonage et d'expression d'une proteine dans une cellule eucaryote, comportant au moins une partie du genome d'un retro-virus; cellules eucaryotes transfectees; procede utilisant de telles cellules et proteines obtenues |
| FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
| US5158769A (en) * | 1984-03-07 | 1992-10-27 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
| US5324513A (en) * | 1984-03-07 | 1994-06-28 | Institut Pasteur | Composition useful for the fabrication of vaccines |
| US5204096A (en) * | 1984-03-07 | 1993-04-20 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
| US4861588A (en) * | 1985-02-05 | 1989-08-29 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
| US4847080A (en) * | 1984-03-07 | 1989-07-11 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers |
| US4777240A (en) * | 1984-03-08 | 1988-10-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
| US4942125A (en) * | 1984-09-07 | 1990-07-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
| US4599230A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
| US4599231A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
| AU579148B2 (en) * | 1984-03-09 | 1988-11-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants |
| US5098704A (en) * | 1984-06-18 | 1992-03-24 | Chiron Corporation | Hepatitis surface antigen particle vaccine |
| EP0171908A3 (en) * | 1984-07-11 | 1987-07-15 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Hepatitis b virus surface antigen and production thereof |
| GB8421282D0 (en) * | 1984-08-22 | 1984-09-26 | Connaught Lab | Multispecific antigenic proteins |
| US4722940A (en) * | 1984-08-23 | 1988-02-02 | Georgia Tech Research Corporation | Aminoalkyl phenyl selenides for the treatment of hypertension and nervous system dysfunctions |
| US4722840A (en) * | 1984-09-12 | 1988-02-02 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
| EP0175261B1 (en) * | 1984-09-12 | 1991-12-11 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
| US4639371A (en) * | 1984-10-02 | 1987-01-27 | New York Blood Center, Inc. | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom |
| EP0180012A1 (de) * | 1984-10-27 | 1986-05-07 | Wolfram H. Prof. Dr. Gerlich | Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus |
| US4683136A (en) * | 1985-03-06 | 1987-07-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Proteinaceous antigens with conformation-independent and conformation-dependent determinants |
| CA1324094C (en) * | 1985-04-03 | 1993-11-09 | Dino Dina | Hepatitis a virus vaccines |
| FI861417A0 (fi) * | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
| US5837249A (en) * | 1985-04-19 | 1998-11-17 | The Wistar Institute | Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus |
| US4639271A (en) * | 1985-04-24 | 1987-01-27 | Moore Business Forms, Inc. | Chromogenic mixtures |
| FR2581394B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1988-08-05 | Grp Genie Genetique | Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| JPH084507B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1996-01-24 | 武田薬品工業株式会社 | 新規ｄｎａおよびポリペプチド |
| US4959323A (en) * | 1985-11-04 | 1990-09-25 | Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Production and use of pre S polypeptides of hepatitis B virus |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| US4742158A (en) * | 1986-04-25 | 1988-05-03 | Merck & Co., Inc. | Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding |
| IE59389B1 (en) * | 1986-05-23 | 1994-12-23 | Merck & Co Inc | Method for producing hepatitis b virus core antigen (HBcAg) in yeast |
| CA1310602C (en) * | 1986-06-03 | 1992-11-24 | Hajime Horii | Yeast promoter and process for preparing heterologous protein |
| JPH01500515A (ja) * | 1986-06-20 | 1989-02-23 | スクリップス クリニック アンド リサーチ ファウンデーション | Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原のプレｓ領域のｔ及びｂ細胞エピトープ |
| US5068185A (en) * | 1986-07-10 | 1991-11-26 | Merck & Co., Inc. | Trains of yeast for the expression of heterologous genes |
| IL79740A0 (en) * | 1986-08-17 | 1986-11-30 | Yeda Res & Dev | Hepatitis vaccine |
| US4882145A (en) * | 1986-12-09 | 1989-11-21 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
| US5143726A (en) * | 1986-12-09 | 1992-09-01 | The Scripps Research Institute | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
| US4818527A (en) * | 1986-12-09 | 1989-04-04 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
| ZA88488B (en) * | 1987-01-30 | 1988-10-26 | Smith Kline Rit | Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them |
| EP1088830A3 (en) * | 1987-06-22 | 2004-04-07 | Medeva Holdings B.V. | Hepatitis b surface antigen particles |
| WO1988010300A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
| US4883865A (en) * | 1987-09-30 | 1989-11-28 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+s antigen |
| US4963483A (en) * | 1987-10-13 | 1990-10-16 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| US5011915A (en) * | 1987-10-26 | 1991-04-30 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| US5039522A (en) * | 1988-01-29 | 1991-08-13 | New York Blood Center, Inc. | Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen |
| NZ229260A (en) * | 1988-06-03 | 1994-02-25 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and |
| US5242812A (en) * | 1989-02-07 | 1993-09-07 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification of hepatitis B vaccine |
| US5462863A (en) * | 1989-02-09 | 1995-10-31 | Development Center For Biotechnology | Isolation of Hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
| GB8903313D0 (en) * | 1989-02-14 | 1989-04-05 | Wellcome Found | Conjugates |
| DK0414374T3 (da) * | 1989-07-25 | 1998-03-09 | Smithkline Beecham Biolog | Hidtil ukendte antigener og fremgangsmåder til fremstilling deraf |
| EP0421626A1 (en) * | 1989-09-19 | 1991-04-10 | Merck & Co. Inc. | Vaccine for aids and hepatitis B |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| US5102989A (en) * | 1991-03-15 | 1992-04-07 | Merck & Co., Inc. | Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells |
| IL101653A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles |
| CA2067003A1 (en) * | 1991-04-29 | 1992-10-30 | Peter J. Kniskern | Hbsag escape mutant vaccine |
| US5840303A (en) * | 1991-08-26 | 1998-11-24 | The Scripps Research Foundation | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
| JP2501186Y2 (ja) * | 1992-03-31 | 1996-06-12 | 株式会社栗本鐵工所 | ハンマ―ミル |
| CN1063343C (zh) * | 1993-04-27 | 2001-03-21 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
| CN1094311A (zh) * | 1993-04-27 | 1994-11-02 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
| CN1059927C (zh) * | 1994-03-10 | 2000-12-27 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 羧端带有前表面抗原1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因及其编码蛋白 |
| US5792163A (en) * | 1996-01-03 | 1998-08-11 | Hitzig; Gary | Linear punch |
-
1990
- 1990-12-19 EP EP90124775A patent/EP0491077A1/en not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-12-19 DK DK92900527T patent/DK0563093T4/da active
- 1991-12-19 ES ES92900527T patent/ES2121000T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 DE DE69130071T patent/DE69130071T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 CZ CZ19931186A patent/CZ290233B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 WO PCT/EP1991/002460 patent/WO1992011368A1/en active IP Right Grant
- 1991-12-19 SK SK636-93A patent/SK280551B6/sk unknown
- 1991-12-19 AU AU90817/91A patent/AU657935B2/en not_active Ceased
- 1991-12-19 JP JP50100592A patent/JP3857305B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 HU HU9301794A patent/HU216301B/hu unknown
- 1991-12-19 CA CA002098021A patent/CA2098021C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 US US08/075,520 patent/US6020167A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 AT AT92900527T patent/ATE170220T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 EP EP92900527A patent/EP0563093B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-06-18 KR KR1019930701862A patent/KR0156587B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-10 HK HK98101997A patent/HK1002901A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-06-07 JP JP2000175584A patent/JP2001019643A/ja active Pending
-
2003
- 2003-03-21 US US10/394,896 patent/US20030235591A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK63693A3 (en) | 1993-10-06 |
| DE69130071T2 (de) | 1999-01-07 |
| DE69130071D1 (de) | 1998-10-01 |
| WO1992011368A1 (en) | 1992-07-09 |
| AU657935B2 (en) | 1995-03-30 |
| CA2098021C (en) | 2000-04-25 |
| HUT66437A (en) | 1994-11-28 |
| US20030235591A1 (en) | 2003-12-25 |
| KR0156587B1 (en) | 1998-10-15 |
| DK0563093T4 (da) | 2008-01-21 |
| CZ118693A3 (en) | 1994-02-16 |
| DK0563093T3 (da) | 1999-02-08 |
| EP0563093B2 (en) | 2007-10-03 |
| HU9301794D0 (en) | 1993-10-28 |
| EP0491077A1 (en) | 1992-06-24 |
| CA2098021A1 (en) | 1992-06-20 |
| JP2001019643A (ja) | 2001-01-23 |
| US6020167A (en) | 2000-02-01 |
| HU216301B (hu) | 1999-06-28 |
| HK1002901A1 (en) | 1998-09-25 |
| EP0563093A1 (en) | 1993-10-06 |
| JPH06507303A (ja) | 1994-08-25 |
| AU9081791A (en) | 1992-07-22 |
| JP3857305B2 (ja) | 2006-12-13 |
| EP0563093B1 (en) | 1998-08-26 |
| DE69130071T3 (de) | 2008-02-21 |
| ATE170220T1 (de) | 1998-09-15 |
| CZ290233B6 (cs) | 2002-06-12 |
| ES2121000T5 (es) | 2008-04-16 |
| ES2121000T3 (es) | 1998-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK280551B6 (sk) | Použitie kombinovaného prípravku na výrobu liečiva | |
| CN101970464B (zh) | 乙型肝炎病毒(HBV)的疏水性修饰的preS衍生肽及它们作为HBV和HDV进入抑制剂的使用 | |
| KR100208129B1 (ko) | B형 간염 백신 | |
| JP2758184B2 (ja) | 肝炎ｂ表面抗原ワクチン | |
| US5039522A (en) | Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen | |
| EP0546787A2 (en) | Expression of specific immunogens using viral antigens | |
| IE69265B1 (en) | Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins | |
| Pride et al. | Evaluation of B and T-cell responses in chimpanzees immunized with Hepagene®, a hepatitis B vaccine containing pre-S1, pre-S2 and S gene products | |
| CA2128896A1 (en) | Hepatitis therapeutics | |
| CA2067003A1 (en) | Hbsag escape mutant vaccine | |
| Delpeyroux et al. | Structural factors modulate the activity of antigenic poliovirus sequences expressed on hybrid hepatitis B surface antigen particles | |
| KR970007153B1 (ko) | B형 간염 표면 항원 백신 | |
| KR960004264B1 (ko) | B형 간염 표면항원, 이의 생성 진핵 세포 및 백신의 제조방법, 검정방법 및 진단용 키트 | |
| Neurath et al. | Vaccination with synthetic hepatitis B virus peptides | |
| Michel et al. | Synthesis in CHO cells of hepatitis B surface antigen containing the pre-S2 region expression product |