DE3856496T2 - Hepatitis-B-Oberflächenantigen enthaltendes Peptid - Google Patents
Hepatitis-B-Oberflächenantigen enthaltendes PeptidInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft Hepatitis-B-Oberflächenantigen ("HBs-Antigen" oder "HBsAg")-Polypeptide, welche durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, DNA-Sequenzen, welche diese Polypeptide codieren, und Zelllinien zur Expression derselben.
- Fortschritte bei Impfstoftherstellungsverfahren ermöglichten es, dem HBs-Antigen entsprechende Polypeptide in Bakterien, Hefe und Säugerzellen zu synthetisieren. Die Transkription eukaryontischer Gene in Bakterien und Hefe beeinflußt jedoch die Wirksamkeit dieser Polypeptide als Antigene infolge mehrerer Nachteile, welche die Glykosylierung und Sekretion der Polypeptide und die Zusammensetzung des daraus gebildeten Partikels betreffen, ungünstig.
- Zum Beispiel sind im Fall des Hepatitis-B-Virus die in vivo hergestellten Polypeptid-Antigene stark glykosyliert (Gerlich, J. Virol. 52(2) (1984), 396). In Prokaryonten ist die Glykosylierung kein essentieller Prozeß, so daß durch gentechnisch veränderte Bakterien hergestellte Polypeptide entweder nicht glykosyliert oder unvollständig glykosyliert sind. In jedem Fall rufen Polypeptide, welche dem HBsAg entsprechen, bei der Expression in Bakterien keine Antikörper hervor, welche das HBsAg für einen wirksamen Impfstoff hinreichend erkennen. Obwohl Hefe als ein eukaryontischer Wirt eine vollständigere Glykosylierung vorzusehen kann, weisen in Hefe exprimierte Polypeptide, welche dem HBsAg entsprechen, die gleiche Unzulänglichkeit auf wie im Fall der Expression in Bakterien (Murray et al., Nature 282 (1979), 575; Valenzuela et al., Nature 298 (1982), 347; Miyanohara et al., PNAS 80 (1983), 1).
- Als ein weiteres Beispiel wird das eukaryontische Strukturgen des HBsAg in Bakterien in den meisten Fällen nicht effizient transkribiert. Außerdem kann die Struktur und Funktion des eukaryontischen HBsAg-Genprodukts von den weiteren posttranslationalen Prozessen der Ausbildung von Disulfidbrücken abhängen, die von dem Bakterienwirt nicht ausgeführt werden können.
- Weiterhin wird das exprimierte Polypeptid von den bakteriellen Wirtszellen selten sezerniert. Sie müssen lysiert werden, um das exprimierte Polypeptid zu gewinnen. Während des Reinigungsverfahrens können Komponenten der Bakterienwand das Polypeptid verunreinigen und schwere allergische Reaktionen hervorrufen oder zu einem anaphylaktischen Schock bei Patienten führen.
- Schließlich sind eukaryontische Promotoren üblicherweise nicht in Bakterien wirksam und müssen durch einen bakteriellen Promotor ersetzt werden, was eine Modifikation des exprimierten Polypeptids zur Folge haben kann (Offensperger et al., PNAS 82 (1985), 7540; Valenzuela et al., ICN-UCLA Symp., Mol. Cell. Biol. 18 (1980), 57).
- Die natürlichen Formen des Hepatitis-B-Virus ("HBV") und des HBV-Proteins kommen in drei verschiedenen Formen vor:
- - dem HBV-Virion (Dane-Partikel), von dem man annimmt, daß es sich um das infektiöse Material handelt,
- - den Filamenten, und
- - den 20 nm- oder 22 nm-Partikeln (nachstehend "20 nm-Partikel"), welche nur aus einer Proteinhülle bestehen.
- Die für einen wirksamen Impfstoffe besonders interessante Form ist das 20 nm- Partikel, da 1) die codierenden Sequenzen vollständig bekannt sind; 2) es völlig uninfektiös ist; und 3) es eine gewisse Immunogenität in einem menschlichen Organismus hervorruft.
- Die drei bekannten Komponenten der HBV-Partikel unterscheiden sich in ihrer relativen Größe in der Proteinzusammensetzung. Es gibt drei Monomere, welche als das Hauptprotein mit 226 Aminosäuren, das mittlere Protein mit 281 Aminosäuren und das große Protein mit 389 oder 400 Aminosäuren, abhängig von dem Subtyp ayw bzw. adw, bezeichnet werden. Das große Protein wird von der vollständigen Sequenz der prä-S&sub1;-, prä-S&sub2;- und S-Bereiche codiert, während das mittlere Protein nur von den prä-S&sub2;- und S- Bereichen und das Hauptprotein schließlich nur vom S-Bereich abgeleitet ist (Tiollais et al., Nature 317 (1985), 489; Dubois et al., PNAS 77 (1980), 4549; McAlzer et al., Nature 307 (1984), 178).
- Das infektiöse Virion des HBV (Dane-Partikel) enthält im Vergleich zu dem 20 nm-Partikel eine 40-80mal größere Menge der hochmolekularen Monomere - die prä- S&sub1;- und prä-S&sub2;-Peptide. Es ist nun bekannt, daß diese prä-S-Polypeptide mit einigen biologischen und klinischen Folgeerscheinungen in Zusammenhang stehen können. Der Polyalbuminrezeptor auf den prä-S-Polypeptiden kann polymerisierte Albumine von Menschen und Schimpansen, welche für das HBV empfänglich sind, binden (Thung et al., Liver 3 (1983), 290; Machida et al., Gastroenterology 86 (1984), 910). Dieser enge Wirtsbereich und der bekannte Rezeptor für menschliches Polyserumalbumin auf menschlichen Hepatocyten erklärt den Hepatotrophismus des HBV: Dane-Partikel sind in der Lage, mit Hepatocyten über menschliches Polyserumalbumin, welches von Hepatocyten aus dem Blutkreislauf aufgenommen wird, Kontakt aufzunehmen. Unter Zugrundelegung dieser Hinweise sollten die prä-S-Peptide für einen wirksamen Impfstoff gegen HBV nützlich sein, da zu erwarten ist, daß dessen Antikörper die signifikanten Stellen auf den Dane- Partikeln, die für das Eindringen in die Hepatocyten erforderlich sind, blockiert (Tiollais et al., Nature 317 (1985), 489; Millich et al., Science 228 (1985), 1195).
- Daten aus der Literatur würden auch einen besseren Schutz vor dem infektiösen Dane-Partikel nahe legen, falls das prä-S&sub1;-Epitop in einem viel höheren Anteil als auf den Hüllpartikeln vorhanden ist.
- Der aus natürlichen Quellen (z.B. Spenderblut) erhaltene Impfstoff, welcher einen begrenzten immunogenen Schutz hervorruft, enthält (praktisch) keines der prä-S- Proteine; dies hat zwei Gründe. Erstens ist das Reinigungsverfahren auf die nicht infektiösen 20 nm-Partikel ausgerichtet. Diese enthalten höchstens 1% prä-S&sub1;-Peptid, verglichen mit 15-20% in dem Dane-Partikel (Gerlich, J. Vir. 52(2) (1984), 396; Tiollais et al., Nature 317 (1985), 489; Gerlich, Virology 123 (1982), 436). Zweitens werden die 20 nm-Partikel aus Seren von Anti-HBe-positiven Trägern isoliert (Hevac B, HepaVac B) oder werden durch Proteasen während des Reinigungsverfahrens gespalten. Es wurde gezeigt, daß dieser proteolytische Verdau die prä-S-Polypeptide spaltet, wobei nur die S-Monomere zurückbleiben. Als Ergebnis enthalten diese Impfstoffe keine oder sehr wenig prä-S-Polypeptide.
- Daher besteht eine Nachfrage nach einen Impfstoff in Form von HBs-Antigen- Partikeln, welche aufgrund der Zusammensetzung der Partikel, die einer Glykosylierung in der Zeile unterworfen sind eine hohe Immunogenität besitzen und welche kontinuierlich aus der Partikel-produzierenden Zelle sezerniert werden.
- EP-A-72 318 beschreibt die Expression von HBsAg in Hefezellen, welche mit einem Vektor, umfassend ein Hefe-Replikon, einen Hefe-Promotor und eine das S-Peptid codierende DNA-Sequenz, transformiert wurden.
- Laub et al., J. Virol., Bd. 48 Nr. 1 (1983), S. 271-280, offenbaren die Konstruktion eines Vektors ausgehend von dem Simian-Virus 40, in welches das HBsAg, einschließlich der aus 163 Codons bestehenden Vorläufersequenz, eingeführt wurde. Laub et al. berichten, daß CV-1-Zellen, die mit dem Vektor transformiert wurden, eine bessere Expression erbringen, wenn der Vektor nur die codierende Sequenz für das S-Protein enthält, verglichen dem obigen Vektor, der zusätzlich auch die aus 163 Codons bestehende Vorläufersequenz umfaßt.
- Auch beschreibt die Japanische Patentanmeldung Nr. J5-8194-897-A von Takeda Chemical Ind. die Expression der vollständigen prä-S- und S-Peptide. Es wird auch auf die Expression des adw-Subtyps Bezug genommen.
- Feitilson et al., Virology, Bd. 130 (1983), S. 75-90, haben die partielle Expression von Polypeptiden innerhalb der prä-S-codierenden Sequenz, einschließlich Spezies mit 24.000, 28.000, 32.000, 43.000 und 50.000 Dalton, beschrieben.
- Weiterhin beschreibt DE-OS-34 39 400 die Expression einer immunogenen Polypeptidsequenz des Hepatitis-B-Virus.
- Diese Sequenz stellt eine Teilsequenz des prä-S&sub1;-Polypeptids dar, umfaßt 108 oder 119 Codons und beginnt mit dem ersten Startcodon von HBsAg und endet 281 Codons vor dem Stopcodon.
- EP-A-154 902 offenbart einen Hepatitis-B-Impfstoff, welcher ein Peptid mit einer Aminosäurekette aus mindestens sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren innerhalb des die prä-S-Kette codierenden Bereichs der Hülle des Hepatitis-B-Virus enthält.
- Auch haben Kent et al. in Pept. Chem., Bd. 22 (1984), S. 16770, beschrieben, daß ein chemisch synthetisiertes Peptid, umfassend die N-terminalen 26 Aminosäuren des prä-S&sub2;-Bereichs, als ein Antigen dienen kann und daher als ein synthetischer Impfstoff geeignet sein kann.
- Keine der oben besprochenen Referenzen zieht die Möglichkeit in Betracht, daß durch die Veränderung der Zusammensetzung der Monomere, welche die 20 nm-Partikel ausmachen, und die daraus resultierende Annäherung an die natürliche Zusammensetzung des Dane-Partikels die Antigenität des Partikels verbessert werden kann.
- Wie vorstehend erwähnt, ist die Immunogenität der Peptidmonomere des Virushüllproteins im Vergleich zu zusammengelagerten Proteinpartikeln sehr unzureichend. Das Ziel dieser Erfindung ist die Entwicklung von Proteinpartikeln, die einen Gehalt an prä-S-Polypeptid-Epitopen aufweisen, welcher mit der natürlichen Zusammensetzung der Oberflächenstruktur des infektiösen Dane-Partikels vergleichbar ist.
- Ein weiteres Ziel ist die Verwendung zusätzlicher prä-S-Peptide, enthaltend wichtige protektive Epitope, bei der Entwicklung einer besseren Immunantwort, eines längeren Schutzes und einer geringeren Rate von nichtansprechenden Personen, verglichen mit allen anderen Produkten, welche entweder bereits vertrieben werden oder sich in der Entwicklung befinden.
- Ein anderes Ziel ist die Expression des HBsAg in Säugerzellen. Dies erfordert, daß bekannte Schwierigkeiten kompensiert werden, wobei die Expression des erwünschten Peptids in einer Säugerzellen resultieren kann in:
- - unterschiedlichen regulatorischen Mechanismen für die drei Translations/Transkriptionsprodukte,
- - eine Promotor-Promotor-Inhibierung,
- - eine unterschiedliche Stärke der Startcodons, und
- - daß nicht alle Peptide exprimiert werden.
- Der Begriff "HBV-S-Peptid", so wie hier verwendet, bezieht sich auf das Peptid, welches von dem gesamten S-Bereich des HBV-Genoms codiert wird. Der Begriff "HBV- prä-S&sub2;-Peptid", so wie hier verwendet, bezieht sich auf das Peptid, welches von dem gesamten prä-S&sub2;- und S-Bereich des HBV-Genoms codiert wird. Der Begriff "HBV-prä- S&sub1;-Peptid", so wie hier verwendet, bezieht sich auf das Polypeptid, welches von dem gesamten prä-S&sub1;-, prä-S&sub2;- und S-Bereich des HBV-Genoms codiert wird. Der Begriff "Epitop", so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Sequenz aus mindestens sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren, welche von der bezeichneten Genomregion codiert wird (z.B. bezieht sich ein "HBV-prä-S&sub2;-Epitop" auf eine Sequenz aus mindestens sechs Aminosäuren, welche von dem prä-S&sub2;-Bereich des HBV-Genoms codiert wird). So wie hier verwendet, ist mit "Antigenität" die Fähigkeit gemeint, eine Immunantwort auszulösen (z.B. als ein Impfstoff oder Antigen wirksam zu sein), die Produktion von Antikörpern auszulösen (z.B. als ein Antigen wirksam zu sein), und/oder mit einem Zelloberflächenrezeptor in Wechselwirkung zu treten, um eine Immunantwort oder die Produktion von Antikörpern zu verstärken (z.B. die Reaktion mit einem T-Zell-Oberflächenrezeptor, um eine Immunantwort zu verstärken).
- Der Begriff "HBV" bezieht sich auf irgendeinen Subtyp des Virus, besonders adw, ayw, adr und ayr, welche in der Literatur beschrieben sind (Valenzuela P., Nature, Bd. 280 (1979), S. 815; Gerlich, EP-A-85 111 361; Neurath, EP-A-85 102 250). Beispiele von Peptidsequenzen hiervon, von denen die erfindungsgemäßen Epitope abgeleitet werden können, sind in den Fig. XVI bis XX gezeigt.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein rekombinantes DNA-Molekül bereit, umfassend eine Expressionskontrollsequenz, welche mit einer ersten und einer zweiten DNA- Sequenz funktionell verbunden ist, die im Leseraster verknüpft sind, wobei die DNA- Sequenzen jeweils einen getrennten Bereich eines einzelnen Peptids codieren, das von dem rekombinanten DNA-Molekül exprimiert wird, und wobei die erste DNA-Sequenz der Expressionskontrollsequenz näher ist als die zweite DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß:
- (a) die erste DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz eines Teils des HBV-prä-S&sub1;-codierenden Bereichs umfaßt, worin ein 5'-terminaler Bereich des prä-S&sub1;-codierenden Bereichs, enthaltend das ATG-Startcodon des prä-S&sub1;-Bereichs, durch einen 5'-terminalen, codierenden Bereich des HBV-S-Bereichs, enthaltend das ATG-Startcodon des S-Bereichs, ersetzt wurde, und wobei die erste DNA-Sequenz ein HBV-prä-S&sub1;- Epitop codiert; und
- (b) die zweite DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz des HBV-S-codierenden Bereichs umfaßt, worin das ATG-Startcodon fehlt, und ein Peptid codiert, das bei der Sekretion die Bildung von Partikeln steuert, die eine Immunantwort gegen das prä- S&sub1;-Epitop auslösen.
- Mit den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekülen transfizierte Wirtszellen werden ebenfalls offenbart. So wie hier verwendet, bezieht sich "transfiziert" oder "Transfektion" auf das Hinzufügen einer exogenen DNA zu einer Wirtszelle, ob durch Transfektion, Transformation oder ein anderes Mittel. Wirtszellen schließen jeden einzelligen Organismus, welcher fähig ist, rekombinante DNA-Moleküle zu transkribieren und zu translatieren, einschließlich, ohne Begrenzung, Säugerzellen, Bakterien und Hefe, ein. Erfindungsgemäße Wirtszellen können auch mit einem zweiten rekombinanten DNA- Molekül, codierend ein Peptid, welches die Aminosäuresequenz des HBV-S-Peptids einschließt, cotransfiziert werden.
- Die Erfindung schließt Peptide ein, welche von den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekülen codiert werden.
- Immunogene Partikel werden ebenfalls offenbart, welche eine Vielzahl von ersten Peptidmonomeren umfassen, die von einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekül codiert werden. Es werden auch immunogene Partikel offenbart, welche weiterhin eine Vielzahl von zweiten Peptidmonomeren umfassen und wobei die ersten und zweiten Peptidmonomeren über interaktive Kräfte zwischen den Monomeren miteinander verbunden sind. Jedes der zweiten Peptidmonomeren umfaßt die Aminosäuresequenz des HBV-S-Peptids.
- Es werden auch immunogene Partikel offenbart, welche im wesentlichen mehr als 1%, vorzugsweise mehr als 5%, des prä-S&sub1;-Epitops enthalten. So wie hier verwendet, enthält ein Partikel "1%" eines bestimmten Epitops, wenn die Peptidmonomeren mit dem bestimmten Epitop 1% des gesamten Proteins in dem Partikel ausmachen. Immunogene Partikel, welche im wesentlichen mehr als 10%, vorzugsweise mehr als 15%, des prä-S&sub2;- Epitops enthalten, werden ebenfalls offenbart.
- Pharmazeutische Zubereitungen und zur Herstellung von Antikörpern verwendbare Zubereitungen, umfassend die oben beschriebenen immunogenen Partikel in einer ausreichenden Konzentration, um eine Immunantwort nach Verabreichung der Zubereitung auslösen, und einen geeigneten Träger, werden ebenfalls offenbart. Geeignete Träger sind dem Fachmann bekannt und können einfache Pufferlösungen einschließen.
- Andere zur Herstellung von Antikörpern verwendbare Zubereitungen werden offenbart, umfassend die oben beschriebenen immunogenen Partikel in einer ausreichenden Konzentration, um eine Immunantwort nach Verabreichung der Zubereitung auslösen, und einen geeigneten Träger. Geeignete Träger sind dem Fachmann bekannt und können einfache Pufferlösungen einschließen.
- Ein Verfahren zur Herstellung einer transfizierten Wirtszelle wird offenbart, umfassend die Bereitstellung einer Wirtszelle, die für die Aufnahme von DNA kompetent gemacht wurde; Aussetzen der Wirtszelle einer ersten DNA-Zubereitung, umfassend ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül; Ermöglichen der DNA-Aufnahme aus der ersten DNA-Zubereitung durch die Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen; und Selektion auf eine Wirtszelle, die das rekombinante DNA-Molekül aufgenommen hat. Das Verfahren kann weiterhin das Aussetzen der Wirtszelle einer zweiten DNA-Zubereitung, umfassend ein DNA-Molekül, das ein Peptid codiert, welches die Aminosäuresequenz des HBV-S-Peptids einschließt, und das Ermöglichen der DNA-Aufnahme aus der zweiten DNA-Zubereitung durch die Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen umfassen. Das Aussetzen und die Aufnahme der zweiten DNA-Zubereitung kann vor oder nach dem Aussetzen und der Aufnahme der ersten DNA-Zubereitung durchgeführt werden. Alternativ kann die erste DNA-Zubereitung auch ein DNA-Molekül einschließen, welches ein Peptid codiert, das die Aminosäuresequenz des HBV-S-Peptids einschließt.
- Ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids wird ebenfalls offenbart, welches die Züchtung einer Wirtszelle, transfiziert mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekül, unter Bedingungen, welche die Expression und Sekretion eines Proteins durch die Wirtszelle zulassen, und die Gewinnung des als Ergebnis der Expression des rekombinanten DNA-Moleküls hergestellten Peptids umfaßt.
- Ein Verfahren zur Herstellung von immunogenen Partikeln wird offenbart, umfassend die Herstellung eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküls, Transfektion einer Wirtszelle mit dem rekombinanten DNA-Molekül, Züchtung der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression und Sekretion eines Proteins durch die Wirtszelle zulassen, und Ermöglichen unter geeigneten Bedingungen der Aggregation von Peptidmonomeren, welche als Ergebnis der Expression exogener DNA-Sequenzen hergestellt wurden, innerhalb der Wirtszelle. Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung von immunogenen Partikeln offenbart, welches weiterhin die Transfektion (Cotransfektion) der Wirtszelle mit einem DNA-Molekül, codierend ein Peptid, welches die Aminosäuresequenz des HBV-S-Peptids einschließt, umfaßt. Die Cotransfektion kann vor, nach oder gleichzeitig mit der Transfektion des oben beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküls erfolgen. Die Anwesenheit von Peptiden, welche von dem cotransfizierten DNA-Molekül codiert werden, ist notwendig, um mehr als Spurenmengen der von der Wirtszelle sezernierten Partikel zu erhalten.
- Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung und einer zur Herstellung von Antikörpern verwendbaren Zubereitung werden offenbart, umfassend die Herstellung eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküls, Transfektion einer Wirtszelle mit dem rekombinanten DNA-Molekül, Züchtung der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression und Sekretion eines Proteins durch die Wirtszelle zulassen, Ermöglichen unter geeigneten Bedingungen der Aggregation von Peptiden, welche als Ergebnis der Expression von DNA-Sequenzen hergestellt wurden, innerhalb der Wirtszelle, um immunogene Partikel zu bilden, und Kombinieren der immunogenen Partikel mit einem geeigneten Träger, so daß die immunogenen Partikel in einer ausreichenden Konzentration vorliegen, um die Produktion von Antikörpern nach Verabreichung einer Zubereitung an ein Individuum auszulösen. Die in diesen Verfahren verwendeten Wirtszellen können auch, wie bereits beschrieben, cotransfiziert sein.
- Die Fig. I, III, IV, VI und VIII zeigen erfindungsgemäße Genkonstrukte.
- Die Fig. II, V, VII und X zeigen Genkonstrukte, welche außerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen und welche prä-S&sub2;-enthaltende Peptide codieren.
- Die schraffierten Bereiche in den Fig. I bis VIII und X geben Bereiche an, welche in den Konstrukten nicht vorhanden sind.
- Fig. IX zeigt eine BglII-BglII-Sequenz, welche prä-S&sub1;, prä-S&sub2; und S codiert. Die Fig. XI und XII zeigen die durch eine Cäsiumchloridsedimentation von immunogenen Partikeln gemäß Beispiel 10 erhaltenen Ergebnisse.
- Fig. XIII zeigt ein in Tabelle XI aufgeführtes Konstrukt gemäß dem Stand der Technik.
- Fig. XIV zeigt die Charakterisierung von Partikeln mit prä-S 1- und prä-S&sub2;- Epitopen.
- Fig. XV zeigt die Oligosequenz von Fig. X-2.
- Die Fig. XVI bis XX zeigen Beispiele von Peptidsequenzen, von welchen die erfindungsgemäß verwendeten Epitope abgeleitet werden können.
- Bevorzugte erfindungsgemäße DNA-Konstrukte sind durch das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus dhfr (Dihydrofolatreduktase), MT-neo (eine Neomycin-Resistenzsequenz verbunden mit einem Metallothionein- Promotor) und MT-ecogpt (eine Resistenzsequenz verbunden mit einem Metallothionein- Promotor), gekennzeichnet. Die Expressionsrate kann weiterhin durch die Addition eines dhfr-Gens als ein Amplifikationsgen an die Konstrukte erhöht werden.
- HBV-Nucleotidsequenzen, welche in bestimmten erfindungsgemäßen Konstrukten verwendet werden, können durch beliebige Mittel, einschließlich der Isolierung und Ligierung von Restriktionsfragmenten und synthetischer Oligonucleotide, erzeugt oder isoliert werden. Die hier genauer beschriebenen Konstrukte wurden durch die Ligierung synthetischer Oligonucleotide mit einem 5'-XbaI-BglII-3'-Fragment aus dem in Fig. IX gezeigten S-Bereich des HBV-Genoms (nachstehend das "XbaI-BglII-Fragment"), das von einem BglII-BglII-HBV-Fragment, welches den gesamten prä-S&sub1;-prä-S&sub2;-S-Bereich einschließt (das "BglII-BglII-Fragment"), abgeleitet ist, gebildet. Der prä-S&sub1;-prä-S&sub2;-S- Bereich des HBV-Genoms ist in Fig. IX gezeigt. Die bei der Herstellung solcher Konstrukte verwendeten Oligonucleotide sind in Tabelle I zusammengefaßt. Tabelle I Oligonucleotiddoppelstränge für die Vektorkonstruktion Tabelle I (Fortsetzung)
- Die Oligonucleotide in Tabelle I wurden mit dem XbaI-BglII-Fragment kombiniert, um Konstrukte mit erwünschten Merkmalen herzustellen. In bestimmten Konstrukten wurden Adapter-Oligonucleotidsequenzen (Tabelle II) verwendet, um richtig zusammenpassende klebrige Enden an den Oligonucleotiden und den anderen Konstruktkomponenten zu erzeugen. Tabelle II Oligonucleotiddoppelstränge (Adapterseauenzen)
- Andere Adaptersequenzen können verwendet werden, um erwünschte Oligonucleotide aus Tabelle I mit dem XbaI-BglII-Fragment, anderen Restriktionsfragmenten, Oligonucleotiden und anderen Konstruktkomponenten zu kombinieren. Die erforderlichen Sequenzen von solchen anderen Adaptersequenzen sind für den Fachmann unter Berücksichtigung von Tabellen der Restriktionsstellen (z.B. diejenigen, welche man auf den Seiten 121-128 von Methods in Enzymology, Band 152, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Hrsg. Berger und Kimmel (Academic Press, 1987), hier unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen, findet) und der Sequenzen der verschiedenen zu kombinierenden Nucleotide ohne weiteres ersichtlich. Adaptersequenzen können auch verwendet werden, um zusätzliche Restriktionsstellen in erfindungsgemäße Konstrukte einzuführen. Es sollte angemerkt werden, daß Adaptersequenzen so ausgewählt oder konstruiert werden müssen, daß das richtige Leseraster in der HBV-Sequenz beibehalten wird.
- Bevorzugte Genkonstrukte, welche zur Transfektion von Wirtszellen verwendet wurden, wurden erfindungsgemäß durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt. Bevorzugte Ausführungsformen der Konstrukte mit einer erhöhten Expressionsrate sind in den Fig. I-VIII gezeigt und nachstehend schematisch dargestellt:
- pU2-Strukturgen
- pU2-Strukturgen-dhfr
- pU2-Strukturgen-dhfr-MT-neo
- pU2-Strukturgen-dhfr-MT-egpt
- pMT-Strukturgen-dhfr
- pMT-Strukturgen-dhfr-MT-neo
- pMT-Strukturgen-dhfr-MT-egpt
- pH2K-Strukturgen-dhfr
- pH2K-Strukturgen-MT-neo
- pH2K-Strukturger-MT-egpt
- pH2K-Strukturgen-dhfr-MT-neo
- pH2K-Strukturgen-dhfr-MT-egpt
- Jedes der in den Fig. I-VIII dargestellten Konstrukte enthält zusätzlich zu einer HBV-Sequenz einen Neomycin-Selektionsmarker mit dem MT-Promotor, einen Ampicillin-Selektionsmarker, ein dhfr-Selektions/Amplifikationsgen und einen Promotor für die HBV-Sequenz. Der Promotor für die HBV-Sequenz ist vorzugsweise der U2- Promotor, der MT-Promotor oder der H2K-Promotor. Die Isolierung von Fragmenten, enthaltend die verschiedenen Promotoren, die Selektionsmarker und das Amplifikationsgen, wird nachstehend beschrieben. Die HBV-Sequenzen in den Konstrukten der Fig. I- VIII sind durch einen rechteckigen Balken in jeder Figur schematisch dargestellt, welcher die Oligonucleotide und/oder Adaptersequenzen aus den Tabellen I und 11 angibt, die mit dem XbaI-BglII-Fragment kombiniert wurden. Schraffierte Bereiche innerhalb des Balkens geben allgemeine Bereiche des gesamten prä-S&sub1;-prä-S&sub2;-S-Bereichs an, welche in dem spezifischen Konstrukt nicht vorkommen. Oligonucleotide aus Tabelle I, welche verwendet werden können, um jeden HBV-Sequenztyp zu konstruieren, sind in den Figuren angegeben.
- Fig. X veranschaulicht zwei weitere Konstrukte zur Expression von Peptiden, welche die Sequenz des prä-S&sub2;-Bereichs unter Kontrolle des MT-Promotors einschließen.
- Es wurden auch Konstrukte hergestellt, welche das gesamte BglII-BglII-Fragment aus dem HBV-Genom unter Kontrolle des U2-Promotors einschließen. Diese Konstrukte ergaben Peptide, welche eine Deletion in dem S-Bereich einschließen, wie durch eine Western-Blot-Analyse gezeigt wurde.
- Die oben erwähnten Promotoren werden besonders bevorzugt, wenn ihre Verwendung mit einem Modulationsverfahren unter Verwendung des dhfr-Gens und Methotrexat, um die Expression zu verstärken, kombiniert wird. Dies wird erreicht, wenn zusätzlich zu dem Selektionsmarker das dhfr-Minigen auch in die Plasmidsequenz eingeführt wird. Es ist wesentlich, daß sich das dhfr-Gen zusammen mit dem zu exprimierenden Strukturgen auf dem gleichen Plasmid befindet. Eine Erhöhung der Expressionsrate des Strukturgens kann dann durch Zugabe von Methotrexat in einer Konzentration im Mikromolbereich erzielt werden. Auf diese Weise wird eine vielfache Erhöhung der Expressionsrate erzielt.
- Geeignete Zellen sind z.B. VERO-Zellen (Affen-Nierenzelllinie), 3T3-Zellen (murine Fibroblastenlinie), C127-Zellen (murine Fibroblastenlinie), L-Zellen und CHO- Zellen (Zellen des Chinesischen Hamster, welche für Dehydrofolatreduktase entweder positiv oder negativ sind).
- Als Stoppsignal wird die Verwendung eines Stoppsignals aus einer eukaryontischen Zelle bevorzugt. Vorzugsweise wird das Stoppsignal der Casein-DNA-Sequenz verwendet. So wie in den folgenden Beispielen verwendet, bezieht sich "HBV-Protein" allgemein auf ein erfindungsgemäß hergestelltes Protein, welches den HBsAg-Sequenzen entspricht.
- Der Überstand von HBV-Protein-produzierenden Kulturen wurde gesammelt und in Portionen von 2.400 ml aufgeteilt. Zu jeder Portion wurden 144 g PEG-6000 (Serva) zugegeben und durch 20-minütiges Rühren bei Raumtemperatur gelöst, und das Ganze wurde weitere 6 Stunden bei 4ºC gerührt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation in 500 ml-Flaschen in einem GS-3-Rotor bei 9.000 UpM (15.000 · g) 30 Minuten bei 10ºC abgetrennt. Der Überstand wurde gesammelt, und 144 g PEG-6000 wurden zugegeben und gelöst, wie vorstehend beschrieben. Die Lösung wurde bei 4ºC 3 Stunden gerührt. Das Präzipitat aus dieser Lösung wurde gewonnen, wie vorstehend beschrieben, außer daß die Zentrifugation 60 Minuten fortgesetzt wurde.
- Das nach der PEG-Fällung erhaltene Material wurde wieder in 20 ml PBS gelöst und einer Gelchromatographie auf A-5m (BioRad) unterworfen. Die Säulenabmessungen waren 25 · 1.000 mm und 480 ml Bettvolumen. Bei einem typischen Fraktionierungslauf wurden 1.000 ug PEG-gefälltes HBV-Protein in 10 bis 15 ml aufgegeben und mit PBS in einer Geschwindigkeit von 6 Tropfen/min (18 ml/h) eluiert, und 3 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Das HBV-Protein eluierte mit dem ersten Peak. Die gesammelten Fraktionen wurden einem CsCl-Gradienten unterworfen.
- Etwa 30 Fraktionen, welche den ersten Peak bei der Säulenchromatographie auf A-5m abdecken und vorgereinigtes HBV-Protein enthalten, wurden gesammelt, wobei etwa 100 ml erhalten wurden. Diese Lösung wurde mit CsCl auf eine Dichte von 1,30 g/cm³ eingestellt und anschließend in ein in einen SW-27/28-Rotor (Beckman) passendes Nitrocelluloseröhrchen transferiert. Ein Gradient wurde durch Unterlegen von 4 ml einer CsCl-Lösung von 1,35 g/cm³ und durch Überschichten von 4 ml von 1,25 g/cm³, gefolgt von 4 ml mit einer Dichte von 1,20 g/cm³ vorgegeben. Diesen Gradient ließ man bei 28.000 UpM 50 Stunden bei 10ºC laufen. Danach wurde der Gradient fraktioniert, und das gereinigte HBV-Protein, welches in der Schicht mit einer Dichte von 1,20 g/cm³ obenauf schwamm, wurde gesammelt. Die Lösung wurde durch drei Dialysezyklen in Beuteln gegen Wasser entsalzt.
- Bei dem AUSRIA II-125-"Sandwich"-Radioimmuntest (im Handel erhältlich von Abbot) wurden Kügelchen, beschichtet mit dem Meerschweinchen-Antikörper gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (Anti-HBs), mit Serum oder Plasma oder gereinigtem Protein und geeigneten Kontrollen inkubiert. Jedes vorhandene HBsAg wurde an den Festphasen-Antikörper gebunden. Nach Absaugen des nicht gebundenen Materials und Waschen der Kügelchen ließ man menschliches ¹²&sup5;I-Anti-HBs mit dem Antikörper-Antigen-Komplex auf den Kügelchen reagieren. Die Kügelchen wurden dann gewaschen, um nicht gebundenes ¹²&sup5;I-Anti-HBs zu entfernen.
- )-Anti-HBs HBsAg
- )-Anti-HBs . HBsAg 125I-Anti-HHs
- )-Anti-HBs . HBsAg . 125-Anti-HBs
- Die auf den Kügelchen zurückbleibende Radioaktivität wurde in einem Gamma- Szintillationszähler gezählt.
- Bei dem Enzygnost-HBsAg-Mikro-"Sandwich"-Test (im Handel erhältlich von Behring) wurden Vertiefungen mit Anti-HBs beschichtet. Serumplasma oder gereinigtes Protein und geeignete Kontrollen wurden zu den Vertiefungen zugegeben und inkubiert.
- Nach dem Waschen wurden Peroxidase-markierte Antikörper gegen HBsAg mit den verbleibenden antigenen Determinanten umgesetzt. Die nicht gebundenen, Enzym-gebundenen Antikörper werden durch Waschen entfernt, und die Enzymaktivität auf der festen Phase wird bestimmt. Die enzymatisch katalysierte Umsetzung von Wasserstoffperoxid und dem Chromogen wurde durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure gestoppt. Die Farbintensität war zu der HBsAg-Konzentration der Probe proportional und wurde durch den photometrischen Vergleich der Farbintensität der unbekannten Proben mit den Farbintensitäten der beigefügten negativen und positiven Kontrollseren erhalten.
- Das Plasmid pBPV-342-12 (im Handel erhältlich von ATCC) wurde mit den Endonucleasen BglII und BamHI gespalten. Drei DNA-Moleküle wurden erzeugt. Das Fragment von Interesse enthält den Methallothionein-Promotor und eine pBR322-Sequenz, umfassend 4,5 kb, und kann von den anderen Fragmenten (2,0 kb und 7,6 kb) leicht identifiziert werden.
- Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 200 ul Reaktionspuffer bei einer Endkonzentration von 0,5 ug/pl DNA, einschließlich 100 Einheiten jedes Restriktionsenzyms, durchgeführt. Die Beendigung der Spaltung wurde nach 3-stündiger Inkubation bei 37ºC durch Agarosegelelektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel überprüft. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 pl 0,5 M EDTA gestoppt.
- Das 4,5 kb-Fragment wurde durch eine präparative Elektrophorese auf einem 1,2%igen Agarosegel von den anderen Fragmenten getrennt. Die DNA wurde aus dem Agarosegel auf DE-81-Whatman-Filterpapier eluiert, aus dem die DNA in einem Puffer mit hoher Salzkonzentration entfernt wurde. Die DNA wurde durch eine Phenol/ Chloroform-Extraktion und zwei Ethanolfällungen gereinigt.
- Ein 2,3 kb großes BglII-BglII-Fragment, enthaltend die HBV-prä-S&sub1;-, -prä-S&sub2;- und -S-codierenden Bereiche, wurde aus HBV-enthaltender DNA isoliert. Das 2,3 kb- Fragment wurde mit dem 4,5 kb-Fragment (erhalten wie in 1 beschrieben), enthaltend den Methallothionein-Promotor, ligiert.
- 2 ul des 2,3 kb-Fragments wurden mit 3 ul des 4,5 kb-Fragments gemischt und in einem Gesamtvolumen von 10 ul Ligierungspuffer, enthaltend 2 Einheiten T4-DNA- Ligase und 2 mM ATP, bei 14ºC über Nacht ligiert.
- Das Ligierungsgemisch wurde zur DNA-Aufnahme zu 150 ul einer Suspension kompetenter Bakterienzellen zugegeben. Nach der DNA-Aufnahme wurden die Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, in Volumina von 50 bis 300 uI Zellsuspension pro Platte ausgestrichen. Die Agarplatten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden auf das Vorhandensein eines Plasmids, enthaltend die erwünschten Fragmente, durchmustert.
- Einzelne Kolonien wurde mit einem Zahnstocher entnommen und in ein LB- Ampicillin-Medium enthaltendes Röhrchen (5 ml) transferiert. Die Röhrchen wurde über Nacht bei 37ºC unter schnellem Schütteln inkubiert. Eine Mini-Plasmidpräparation jeder vermehrten Bakteriensuspension wurde durchgeführt. Die verschiedenen erhaltenen DNAs wurden durch die Spaltung mit der Restriktionsendonuclease EcoRI bestätigt. Zwei Moleküle wurden erwartet, ein 2,2 kb-Fragment und ein 4,6 kb-Fragment. Die Spaltung wurde mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Plasmid-DNA wurde aus den Bakterienzellen isoliert.
- Das vorstehend aus (3) erhaltene Plasmid wurde mit den Endonucleasen BglII und XbaI gespalten. Zwei Moleküle wurden erwartet, ein 550 bp-Fragment und ein 6,250 kb-Fragment, das nach einer Agarosegelelektrophorese isoliert wurde. Das 6,250 kb-Fragment wurde mit dem Oligonucleotid Nr. 55 aus Tabelle I ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zur DNA-Aufnahme zu 150 ul einer Suspension kompetenter Bakterienzellen zugegeben. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden auf das Vorhandensein des erwünschten Plasmids durchmustert. Das neue Plasmid wurde durch die Spaltung mit den Endonucleasen EcoRI und BglII überprüft. Zwei Moleküle wurden erwartet, ein 1,9 kb-Fragment und ein 4,450 kb-Fragment.
- Das vorstehend aus (4) erhaltene Plasmid wurde durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. Die Umsetzung wurde in einem Gesamtvolumen von 50 ul und bei einer Endkonzentration von 1 ug/u1 Plasmid-DNA durchgeführt. 50 Einheiten EcoRI wurden zugegeben, und die Spaltung wurden nach 3-stündiger Inkubation bei 37ºC mittels Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 1 ul 0,5 M EDTA gestoppt, und die DNA wurde mit Natriumactetat in einer Endkonzentration von 0,3 M und 3-4 Volumina Ethanol bei -80ºC 30 Minuten gefällt. Die gefällte DNA wurde in 50 ul destilliertem Wasser gelöst.
- 2 ul des linearisierten Plasmids wurden mit 3 ul des DNA-Fragments, enthaltend den Methallothionein-Promotor und das Neomycin-Selektionsgen (isoliert aus dem Plasmid pMT-neo-E (erhältlich von ATCC) durch Spaltung mit der Endonuclease EcoRI als ein 4 kb-Fragment) gemischt und ligiert. Einzelne Bakterienkolonien wurden auf das Vorhandensein des erwünschten Plasmids durchmustert.
- Das Plasmid pdhfr3.2 (erhältlich von ATCC) wurde mit der Restriktionsendonuclease HindIII gespalten. Zwei Moleküle wurden erzeugt, ein 3.000 bp-Fragment, enthaltend die dhfr-Gensequenz, und ein 3.400 bp-Fragment. Das 3.000 bp-Fragment wurde isoliert und in das vorstehend aus (5) erhaltene Plasmid, welches vorher durch Spaltung mit Hindill geöffnet worden war, ligiert. Das so erhaltene Plasmid ist in Fig. I-2 dargestellt.
- Das Plasmid pUC-8-42 (erhältlich von Exogene) wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und ApaI gespalten. Zwei DNA-Moleküle wurden erzeugt. Das Fragment von Interesse enthält den U2-Promotor, umfassend 340 bp, und kann unter den anderen Fragment (3.160 bp) leicht identifiziert werden. Die Spaltung wurde in einem Gesamtvolumen von 200 ul Reaktionspuffer bei einer Endkonzentration von 0,5 ug/pd DNA, einschließlich 100 Einheiten jedes Restriktionsenzyms, durchgeführt. Die Beendigung der Spaltung wurde nach 3-stündiger Inkubation bei 37ºC mittels Agarosegelelektrophorese in einem 0,7%igen Agarosegel überprüft. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 4 ul 0,5 M EDTA gestoppt. Das 340 bp-Fragment wurde von der Plasmid-DNA durch eine präparative Elektrophorese in einem 1,2%igen Agarosegel getrennt. Die DNA wurde aus dem Agarosegel auf DE-81-Whatman-Filterpapier eluiert, aus dem die DNA in einem Puffer mit hoher Salzkonzentration entfernt wurde. Die DNA wurde durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion und zwei Ethanolfällungen gereinigt.
- Das Plasmid pSP165 (im Handel erhältlich von Promega Biotec), enthaltend eine Polylinkersequenz (enthaltend die folgenden Restriktionsstellen: EcoRI, SacI, SmaI, AvaI, BamHI, BglII, SalI, PstI und HindIII), wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. Die Umsetzung wurde in einem Gesamtvolumen von 50 ul und bei einer Endkonzentration von 1 ug/ul Plasmid-DNA durchgeführt. 50 Einheiten EcoRI wurde zugegeben, und die Spaltung wurde nach 3-stündiger Inkubation durch eine Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 1 ul 0,5 M EDTA gestoppt, und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat und 3- 4 Volumina Ethanol bei -80ºC 30 Minuten gefällt. Die gefällte DNA wurde in 50 ul destilliertem Wasser gelöst.
- 2 ul der Plasmid-DNA wurden mit 10 ul der Fragment-DNA, enthaltend die U2- Promotorsequenz, gemischt und in einem Gesamtvolumen von 25 pl Ligierunspuffer, enthaltend 2 Einheiten T4-DNA-Ligase und 2 mM ATP, bei 14ºC über Nacht ligiert. Danach wurde die DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktionen, gefolgt von zwei Ethanolfällungen gereinigt und in 10 ul destilliertem Wasser gelöst. Die resultierenden klebrigen EcoRI- und ApaI-Enden mußten in glatte Enden überführt und ligiert werden. Die glatten Enden wurden durch eine Entfernungsreaktion mit der Mungbohnen-Nuclease wie folgt umgewandelt: 25 ul DNA (Konzentration 1 ug/ul)-Reaktionspuffer, 20 Einheiten Enzym und eine Endkonzentration von 1% Glycerin wurden zu dem Reaktionsvolumen von 35 ul zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 30ºC wurde die DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktionen, gefolgt von zwei Ethanolfällungen gereinigt. Die DNA wurde wieder in 5 ul destilliertem Wasser gelöst. Die erhaltenen glatten Enden wurden in einem Reaktionsvolumen von 15 ul, enthaltend 10x mehr T4-Ligase als vorstehend verwendet und 2 mM ATP, bei 14ºC über Nacht ligiert.
- Das Ligierungsgemisch wurde zur DNA-Aufnahme zu 150 ul einer Suspension kompetenter Bakterienzellen zugegeben. Nach der DNA-Aufnahme wurden die Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, in Volumina von 50 bis 300 ul Zellsuspension pro Platte ausgestrichen. Die Agarplatten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden auf das Vorhandensein eines Plasmids, enthaltend das erwünschte U2-Promotorfragment, durchmustert.
- Einzelne Kolonien wurde mit einem Zahnstocher entnommen und in ein LB- Ampicillin-Medium enthaltendes Röhrchen (5 ml) transferiert. Die Röhrchen wurde über Nacht bei 37ºC unter schnellem Schütteln inkubiert. Eine Mini-Plasmidpräparation jeder vermehrten Bakteriensuspension wurde durchgeführt. Das so erhaltene andere Plasmid wurde durch Spaltung mit den beiden Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII überprüft. Zwei Moleküle werden nachgewiesen, ein 400 bp-Fragment, enthaltend die U2- Promotorsequenz, und das Plasmid von 2.700 bp. Die Spaltung wurde mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde aus den Bakterienzellen isoliert.
- Das Plasmid pBPV-342-12 (im Handel erhältlich von ATCC) wurde mit den Endonucleasen EcoRI und BamHI gespalten. Zwei Moleküle wurden isoliert, ein 4.000 bp-Fragment, enthaltend den MT-Promotor zusammen mit dem Neomycin-Selektionsgen, und das Plasmid von 10.000 bp.
- Das vorstehend aus (3) erhaltene Plasmid wurde mit EcoRI linearisiert und mit dem 4.000 bp-Fragment, enthaltend den MT-Promotor zusammen mit dem Neomycin- Selektionsgen, ligiert. Die erhaltenen klebrigen Enden wurden ebenfalls in glatte Enden überführt und miteinander ligiert, wie vorstehend beschrieben.
- Nach der Transformation von Bakterien, Kolonieselektion und Mini-Plasmidpräparation wurden die so erhaltenen Plasmide durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Hindill analysiert. Zwei DNA-Moleküle wurden isoliert, ein 400 bp- Fragment und ein 6.700 bp-Fragment.
- Das vorstehend aus (4) erhaltene Plasmid wurde mit BglII linearisiert. Das 2,3 kb große BglII-BglII-Fragment wurde mit dem linearisierten Plasmid ligiert. Bakterienkolonien wurden analysiert, um das erhaltene Plasmid zu identifizieren. Die Plasmid- DNA wurde mit EcoRI gespalten, und zwei resultierende Fragmente wurden erhalten, ein 700 bp-Fragment (enthaltend den Promotor und einen Teil der HBV-Sequenz) und ein 8.700 bp-Fragment (enthaltend den Rest der HBV-Sequenz, MT-neo und das Plasmid).
- Das vorstehend aus (S) erhaltene Plasmid wurde mit den Endonucleasen BglII und MstII gespalten. Zwei Moleküle wurden erzeugt, ein 300 bp-Fragment, enthaltend einen Teil der prä-S-Sequenz, und ein zweites (9.100 bp), welches eluiert wurde, wie oben beschrieben. Dieses 9.100 bp-Fragment wurde mit einem anderen 216 bp großen BglII- MstII-Fragment (eine Sequenz, welche eine veränderte prä-S&sub1;-Gensequenz codiert) ligiert.
- Das erwünschte Plasmid wurde mit EcoRI gespalten, und zwei resultierende Fragmente, ein 616 bp-Fragment und ein 8.700 bp-Fragment, wurden isoliert.
- Der H2K-Promotor wurde als ein EcoRI/BglII-Fragment (2 kb) aus psp65H2 (erhältlich von Exogene) isoliert.
- Das den Methallothionein-Promotor und das egpt-Selektionsgen enthaltende Fragment wurde durch Spaltung des Plasmids pMSG (erhältlich von Pharmacia) mit dem Restriktionsenzym EcoRI als ein 3,6 kb-Fragment isoliert.
- Alle anderen Plasmidkonstruktionen wurden in ähnlicher Weise durch Kombination von Fragmenten, enthaltend die notwendigen Komponenten, und Verwendung der erwünschten Oligonucleotide und Adaptersequenzen (falls notwendig) hergestellt.
- Um die Sekretion bedeutender Mengen der von den erfindungsgemäßen Konstrukten codierten HBV-Peptide zu erreichen, müssen Säugerzellen mit sowohl dem erfindungsgemäßen Konstrukt als auch mit einem Konstrukt, welches das gesamte S-Protein exprimiert, transfiziert werden. Die Cotransfektion wurde in zwei Schritten (d.h. eine getrennte Transfektion für jedes Konstrukt) oder in einem einzigen Schritt (d.h. eine Transfektion unter Verwendung einer Präparation beider Konstrukte) durchgeführt. Die Cotransfektion wurde entweder durch die Verwendung verschiedener Selektionsmarker auf den zwei Konstrukten oder durch den Nachweis der Sekretion von Expressionsprodukten beider Konstrukte durch einen Immuntest bestätigt.
- Alternativ könnte eine Sequenz, welche die erfindungsgemäße HBV-Peptidsequenz codiert, und eine andere Sequenz, welche das gesamte S-Protein codiert, in einem einzigen Konstrukt kombiniert werden.
- Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung anwendbaren allgemeinen Verfahren findet man in (1) Methods of Enzymology, Band 152, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Hrsg. Berger und Kimmel (Acadernic Press, 1987); und (2) Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), welche beide hier unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind. Spezifische angewendete Techniken werden nachstehend beschrieben.
- Die verwendeten Restriktionsendonucleasen waren: BglII, BamHI, HindIII, EcoRI, XbaI, MstII, XhoI und PflMI, welche im Handel von GibcoBRL mit ihren jeweiligen Restriktionspuffern (10x) erhältlich sind.
- Sofern nicht anders angegeben, wurden die Restriktionsspaltungen durchgeführt und die Fragmente isoliert, wie nachstehend beschrieben. Die Reaktionen enthielten typischerweise 1-5 ug DNA.
- - Destilliertes Wasser wurde zu der DNA in einem Eppendorf-Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 8 ul zugegeben.
- - 1 ul des geeigneten 10x Spaltpuffers wurde zugegeben.
- - 1 ul (enthaltend 5-10 E) Restriktionsenzym wurde zugegeben und vorsichtig eingemischt.
- - Das Reaktionsröhrchen wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.
- - Die Spaltung wurde durch Zugabe von 0,5 M EDTA (pH 8,0) bis zu einer Endkonzentration von 10 mM gestoppt.
- - Falls die DNA direkt auf einem Gel analysiert wurde, wurde 1 ul des Gelbeladungsfarbstoffs III (Maniatis) zugegeben, eingemischt und die Probe wurde in die Slots eines 0,8%igen Agarosegels aufgegeben.
- Das Agarosegel enthält normalerweise 0,8% Agarose-1x Laufpuffer (TBE, Maniatis). Falls ein Fragment (etwa 100-1.000 bp) aus einem Agarosegel isoliert wurde, wurde der Agarosegehalt auf 1, 2 bis 1,4% erhöht.
- Von einer dichten Übernachtkultur wurde 1 ml der Bakterienzellsuspension zu 100 ml frischem Wachstumsmedium (L-Brühe) zugegeben. Die Zellen wurden bei 37ºC bis zu einer Dichte von OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,7 vermehrt, welche innerhalb von 2 Stunden unter intensiven Schütteln in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben erreicht wurde. Das Wachstum wurde durch 10-minütiges Abkühlen der Kultur auf Eis gestoppt. Von dieser Kultur wurden 3 ml entnommen, um die exponentiell wachsenden Bakterienzellen mittels Zentrifugation bei 3.000 UpM für 5 Minuten zu gewinnen. Die Zellen wurden in 1,5 ml 50 mM CaCl&sub2; in 10 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert und weitere 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden wieder durch Zentrifugation bei 3.000 UpM für 5 Minuten gewonnen und in 200 ul 50 mM CaCl&sub2; in 10 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert und direkt verwendet.
- Die einzuschleusende DNA wurde in 70 ul 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA suspendiert und zur DNA-Aufnahme zu den 200 ul der Bakterienzellsuspension zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert, und danach wurde 1 ml L-Brühe zugegeben. Die Mischung wurde 2 Minuten bei 42ºC und 40 Minuten bei 37ºC inkubiert.
- Nach der Inkubation wurden die Zellen auf Agarplatten, enthaltend 50 ug Ampicillin/ml Agar, in Volumina von 50-300 ul Zellsuspension pro Platte ausgestrichen. Die Agarplatten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum bildeten sich einzelne isolierte Bakterienkolonien.
- 1 Liter der plasmidtragenden Zellen wurde bis zu 0,5 OD&sub6;&sub0;&sub0; in L-Brühe gezüchtet und 20 Stunden mit 200 ug/ml Chloramphenicol vermehrt. Die Kultur wurde dann bei 4.000 UpM 20 Minuten in einem JA-10-Rotor bei 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wurde in 18 ml kalter 25%iger Saccharose, 50 mM Tris, pH 8,0 resuspendiert, in einen 250 ml- Erlenmeyerkolben überführt und auf Eis aufbewahrt. 6 ml Lysozym (5 mg/ml) in 250 mM Tris, pH 8,0, wurden zugegeben, und man ließ die Mischung 10-15 Minuten stehen. 6 ml 250 mM EDTA, pH 8,0, wurden zugegeben, vorsichtig eingemischt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. 30 ml Detergens (0,01% Triton X-100; 60 mM EDTA, pH 8,0; 50 mM Tris, pH 8,0) wurden zugegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Mischung bei 25.000 UpM 90 Minuten in einem SW28-Rotor bei 4ºC zentrifugiert.
- Pronase wurde zu dem Überstand bis zu 250 ug/ml zugegeben und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Lösung wurde mit Phenol und einmal mit einem - Volumen Phenol, äquilibriert mit 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde entfernt. Natriumacetat wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 300 mM zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 3 Volumina kaltem 100%igen Ethanol und gründlichem Mischen. Die Mischung wurde bei -20ºC über Nacht gelagert.
- Die Mischung wurde aufgetaut und zentrifugiert. Das Pellet wurde in 6 ml 10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0, resuspendiert. 9,4 g CsCl und 0,65 ml Ethidiumbromid (6 mg/ml) wurden zugegeben, und das Volumen wurde mit sterilem, zweifach destilliertem Wasser auf 10 ml eingestellt. Die 10 ml-Aliquots wurden in wärmeversiegelbare Beckman-Gradientenröhrchen eingebracht und bei 50.000 UpM 48 Stunden in einem Ti70.1-Beckman-Rotor zentrifugiert.
- Plasmidbanden wurden mittels UV-Licht sichtbar gemacht und mit einer Spritze und einer 18 Gauge-Nadel durch Hineinstechen in die Seite des Röhrchens entfernt. Das Ethidiumbromid wurde aus den Plasmidfraktionen durch 3 aufeinanderfolgende Extraktionen mit gleichen Volumina von Isobutanol entfernt. Die Fraktionen wurden dann (1) gegen eine 2 Liter-Portion von 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 7,5, 5 mM NaCl für 2 Stunden oder mehr bei 4ºC dialysiert; und (2) einmal mit 1/3 Volumen Phenol, äquilibriert wie vorstehend, phenolextrahiert. Natriumacetat wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 300 mM zugegeben, gefolgt von der Zugabe von zwei Volumina 100% Ethanol. Das Präzipitat bildete sich bei -20ºC über Nacht oder bei -70ºC für 30 Minuten.
- 1 ml einer Bakterienübernachtkultur wurde in ein Eppendorf-Röhrchen eingebracht und 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt. 100 ul 50 mM Glucose, 25 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0) wurden zu dem Pellet zugegeben, mit Hilfe eines Vortexgeräts gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 200 ul 0,2 N NaOH, 1% SDS wurden zugegeben, mit Hilfe eines Vortexgeräts gemischt und 5 Minuten auf Eis inkubiert. 150 ul 3 M Natriumacetat (pH 4,8) wurden zugegeben, mit Hilfe eines Vortexgeräts gemischt und 5 Minuten auf Eis inkubiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 13.000 UpM wurde der Überstand in ein frisches Eppendorf-Röhrchen umgefüllt. 3 Volumina 100% Ethanol wurden supplementiert, gut gemischt und 30 Minuten bei -80ºC inkubiert, dann 10 Minuten bei 13.000 UpM zentrifugiert. Das Ethanol wurde entfernt, das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, gefriergetrocknet und in 20 ul destilliertem Wasser gelöst. 5 ul dieser Plasmid-DNA-Lösung wurden direkt für eine Restriktionsanalyse verwendet.
- Die Nicktranslation wurde gemäß Rigby et al., J. Mol. Biol., Bd. 113 (1977), S. 237-215, hier unter Bezugnahme eingeschlossen, durchgeführt. Das Reaktionsgemisch zur ³²P-Markierung der DNA enthielt 0,5 ug eines HBV-Fragments in einem Gesamtvolumen von 30 ul mit 50 mM Tris, pH 7,8, 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dTTP, 50 uCl ³²P-dCTP, 10 Einheiten DNA-Polymerase I, 3 ul einer 2 · 10&supmin;&sup5;-fachen Verdünnung von 1 mg/ml DNase I und wird 90 Minuten bei 15ºC inkubiert, wobei 3 · 10&sup6; bis 12 · 10&sup6; CpM insgesamt, d.h. 1 · 10&sup7; bis 5 · 10&sup7; CpM/ug DNA erhalten wurden.
- Zur Charakterisierung der Organisation der erfindungsgemäßen Vektoren innerhalb des Wirtszellengenoms wurde die chromosomale DNA aus Zellinien, welche erfindungsgemäße Partikel produzieren, isoliert und mit dem/den geeigneten Restriktionsenzym(en) gespalten und durch das Verfahren von Southern (J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), S.503-517), hier unter Bezugnahme eingeschlossen, unter Verwendung einer ³²P-markierten DNA-Sonde analysiert. Nach der Spaltung der chromosomalen DNA (20 ug) mit dem Restriktionsenzym BglII wurden die resultierenden Fragmente durch eine Elektrophorese in einem 0,7%igen Agarosegel getrennt. Danach wurde die DNA durch das Aussetzen von UV-Licht von 366 nm für 10 Minuten und durch Inkubation in einer Lösung von 0,5 M NaOH und 1 M NaCl für 45 Minuten denaturiert. Die Gele wurden durch Inkubation in 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,5, für 60 Minuten neutralisiert. Die DNA wurde auf einen Nitrocellulosefilter übertragen, indem man 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat (20x SSC) für 20 Stunden in das Gel durch Bedecken der Oberseite des Nitrocellulosefilters mit einem Stapel trockener Papierhandtücher einziehen ließ. Der Nitrocellulosefilter wurde 2 Stunden in einem Vakuumofen bei 80ºC inkubiert. Eine radioaktive DNA-Sonde aus dem BglII-Fragment des pHBV (2,3 kb) wurde durch Nicktranslation hergestellt.
- Für die Hybridisierung mit der DNA-Sonde wurde der Nitrocellulosefilter in einem Plastikbeutel, enthaltend 10 ml Vorhybridisierungsgemisch: 50% Formamid, 5x SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 5x Denhardt-Lösung und 250 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA, versiegelt. Der Filter wurde in dieser Mischung 4 Stunden bei 45ºC inkubiert, danach wurde das Vorhybridisierungsgemisch durch das Hybridisierungsgemisch: 50% Formamid, 5x SSC, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 1x Denhardt- Lösung, 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 5 · 10&sup5; CpMIml ³²P-Sonde, ersetzt. Der Filter wurde nach 18-stündiger Inkubation in dem Hybridisierungsgemisch bei 45ºC dreimal, jeweils 5 Minuten, in 0,1x SSC, 0,1% SDS bei 50ºC gewaschen. Der Filter wurde bei 60ºC 10 Minuten getrocknet und zwei Röntgenfilmen (XAR-5, Kodak) zwischen zwei Verstärkerschirmen ausgesetzt und bei -80ºC inkubiert. Der erste Röntgenfilm wird nach 3-tägiger Exposition entwickelt; der zweite Film wird nach 7-tägiger Exposition entwickelt.
- Die Empfängerzellen (C127- oder CHO-Zellen, erhältlich von ATCC) wurden in normales Wachstumsmedium (DMEM + 10% fötales Kälberserum, Glykose und Glutamin) in Petrischalen (1-2 · 10&sup6; Zellen pro Schale, 10 cm) am Tag 1 überimpft. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt (4 Stunden bevor das DNA-Präzipitat zu den Zellen zugegeben wurde), und die Zellen wurden zweimal mit 1x PBS gewaschen. Dann wurden 8 ml DMEM ohne FCS zugegeben. 4 Stunden später wurde das DNA- Präzipitat (hergestellt wie nachstehend beschrieben) zu den Zellen zugegeben. Nach 4 Stunden wurde das Medium wieder entfernt und 3 ml Glycerin-Mix (50 ml 2x TBS- Puffer, 30 ml Glycerin, 120 ml destilliertes Wasser) wurden zugegeben. Der Glycerin-Mix wurde nach einer Inkubation bei 37ºC für 3 Minuten sofort entfernt, und die Zellen wurden mit 1x PBS gewaschen. Die Zellen wurden über Nacht in 8 ml DMEM mit 10% FCS gezüchtet.
- Nach 48 Stunden wurden die Zellen aus der Schale durch das Behandeln mit einer Trypsin-EDTA-Lösung (0,025% Trypsin + 1 mM EDTA) gewonnen. Danach wurden die Zellen mit 1x PBS gewaschen, um das Trypsin-EDTA zu entfernen, in DEM mit 10% FCS suspendiert und auf Costar-Platten mit 24 Vertiefungen verteilt (die Zellen einer Schale auf vier Platten mit 24 Vertiefungen). Nach der ausreichenden Vermehrung der Zellen wurde Selektionsmedium (Konzentration: 0,5-1 mg/ml Neomycin oder Xanthin; 250 ug/ml Hypoxanthin; 15 ug/ml Thymidin (oder 25 ug/ml Adenin); 10 ug/ml Aminopterin; 2 ug/ml Mycophenolsäure; und zum Beispiel 25 ug/ml eco-gpt) zugegeben. Das Medium wurde jede Woche gewechselt. Die ersten wachsenden Zellkolonien wurden nach 2 Wochen beobachtet.
- Zu 10 ug Plasmid-DNA und 20 ug Träger-DNA (Lachssperma-DNA, Kalbsthymus-DNA) wurde TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,05) bis zu einem Endvolumen von 440 ul zugegeben und mit 60 ul 2 M CaCl&sub2; zusammengemischt. Dann wurde die gleiche Menge 2x TBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,05) zugegeben und gut eingemischt. Die Fällungslösung wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und direkt zu den Zellen, die transfiziert werden sollen, zugegeben.
- Die ausgewählten Zellen wurden zur weiteren Züchtung in normalem Wachstumsmedium behandelt, wie in Abschnitt 8 beschrieben ist.
- Zu der erwünschten Konzentration der in steriler Salzlösung suspendierten Antigenpartikel wurden ein 1 : 10.000-Volumen Thimerosol und ein 1/10-Volumen filtersterilisiertes 0,2 M AlK(SO&sub4;)&sub2;. 12H&sub2;O zugegeben. Der pH wurde mit steriler 1 N NaOH auf 5,0 eingestellt, und die Suspension wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Das alaungefällte Antigen wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 2.000 UpM gewonnen, in steriler normaler Salzlösung, enthaltend 1 : 10.000-Thimerosol, resuspendiert und unter sterilen Bedingungen aliquotiert.
- Die Tabellen III-X geben einige der Ergebnisse einer ELISA-Analyse von immunogenen Partikeln an, wie nachstehend beschrieben.
- Tabelle III: zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigen-Partikels, hergestellt von einem erfindungsgemäßen HBV-Sequenzkonstrukt, umfassend den prä-S&sub1;- Bereich mit einer vollständigen Deletion von prä-S&sub2; und Deletionen stromaufwärts des prä-S&sub2;-ATG's und des S-Bereichs mit einer Deletion des S-ATG's und stromabwärts des S-ATG's bis zur XbaI-Stelle (z.B. das Konstrukt von Fig. I-1), mit dem monoclonalen Anti-prä-S&sub1;-Antikörper MA 18/7. Die Fraktionen 9- 15 (Fig. XI) wurden nach der CsCl-Sedimentation vereinigt.
- Tabelle IV: zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigen-Partikels, hergestellt von einem erfindungsgemäßen HBV-Sequenzkonstrukt, umfassend den prä-S&sub1;- Bereich mit einer vollständigen Deletion von prä-S&sub2; und Deletionen stromaufwärts des prä-S&sub2;-ATG's und des S-Bereichs mit einer Deletion des S-ATG's und stromabwärts des S-ATG's bis zur XbaI-Stelle (z.B. das Konstrukt von Fig. I-1), mit dem monoclonalen Anti-prä-S&sub2;-Antikörper MQ 19/10. Die Fraktionen 9-15 (Fig. XI) wurden nach der CsCl-Sedimentation vereinigt.
- Tabelle V: zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigen-Partikels, hergestellt von einem HBV-Sequenzkonstrukt, umfassend den prä-S&sub2;-Bereich ohne den prä-S&sub1;- Bereich und Deletionen stromaufwärts des S-ATG's und stromabwärts des S- ATG's bis zur XbaI-Stelle und den S-Bereich mit einer Deletion des S-ATG's (z.B. das Konstrukt von Fig. II-1), mit dem monoclonalen Anti-prä-S&sub1;-Antikörper MA 18/7. Die Fraktionen 9-15 (Fig. XII) wurden nach der CsCl- Sedimentation vereinigt.
- Tabelle VI: zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigen-Partikels, hergestellt von einem HBV-Sequenzkonstrukt, umfassend den prä-S&sub2;-Bereich ohne den prä-S&sub1;- Bereich und Deletionen stromaufwärts des S-ATG's und stromabwärts des S- ATG's bis zur XbaI-Stelle und den S-Bereich mit einer Deletion des S-ATG's (z.B. das Konstrukt von Fig. II-1), mit dem monoclonalen Anti-prä-S&sub2;-Antikörper MQ 19/10. Die Fraktionen 9-15 (Fig. XII) wurden nach der CsCl- Sedimentation vereinigt.
- CsCl-Gradient ELISA-Messung
- Monoclonaler Antikörer MA 18/7
- Fraktion Nr. 9-15 (vereinigt) E&sub4;&sub9;&sub2; = 0,839
- CsCl-Gradient ELISA-Messung
- Monoclonaler Antikörer MQ 19/10
- Fraktion Nr. 9-15 (vereinigt) E&sub4;&sub9;&sub2; = 0,000
- CsCl-Gradient ELISA-Messung
- Monoclonaler Antikörer MA 18/7
- Fraktion Nr. 9-15 (vereinigt) E&sub4;&sub9;&sub2; = 0,000
- CsCl-Gradient ELISA-Messung
- Monoclonaler Antikörer MQ 19/10
- Fraktion Nr. 9-15 (vereinigt) E&sub4;&sub9;&sub2; = 1,028
- Tabelle VII: zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigen-Partikels, hergestellt von einem erfindungsgemäßen HBV-Sequenzkonstrukt, umfassend den prä-S&sub1;- Bereich mit einer Deletion des gesamten prä-S&sub2; und Deletionen stromaufwärts des prä-S&sub2;-ATG's und den S-Bereich mit einer Deletion des S-ATG's (z.B. das Konstrukt von Fig. VI-2), mit dem monoclonalen Anti-prä-S&sub1;-Antikörper MA 18/7. Die Fraktionen 9-15 (Fig. XI) wurden nach der CsCl-Sedimentation vereinigt.
- Tabelle VIII: zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigen-Partikels, hergestellt von einem erfindungsgemäßen HBV-Sequenzkonstrukt, umfassend den prä-S&sub1;- Bereich mit Deletionen stromaufwärts des prä-S&sub2;-ATG's mit einer Deletion des S-ATG's, mit dem monoclonalen Anti-prä-S&sub2;-Antikörper MQ 19/10. Die Fraktionen 9-15 (Fig. XI) wurden nach der CsCl-Sedimentation vereinigt.
- Tabelle IX: zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigen-Partikels, hergestellt von einem HBV-Sequenzkonstrukt, umfassend den prä-S&sub2;-Bereich ohne den prä-S&sub1;- Bereich und Deletionen stromaufwärts des S-ATG's und den S-Bereich mit einer Deletion des S-ATG's (z.B. das Konstrukt von Fig. VII-2), mit dem monoclonalen Anti-prä-S&sub1;-Antikörper MA 18/7. Die Fraktionen 9-15 (Fig. XI) wurden nach der CsCl-Sedimentation vereinigt.
- Tabelle X: zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigen-Partikels, hergestellt von einem HBV-Sequenzkonstrukt, umfassend den prä-S&sub2;-Bereich mit Deletionen stromaufwärts des S-ATG's mit einer Deletion des S-ATG's (z.B. das Konstrukt von Fig. VII-4), mit dem monoclonalen Anti-prä-S&sub2;-Antikörper MQ 19/10. Die Fraktionen 9-15 (Fig. XII) wurden nach der CsCl-Sedimentation vereinigt.
- CsCl-Gradient ELISA-Messung
- Monoclonaler Antikörper MA 18/7
- Fraktion Nr. 9-15 (vereinigt) E&sub4;&sub9;&sub2; = 1,273
- CsCl-Gradient ELISA-Messung
- Monoclonaler Antikörper MQ 19/10
- Fraktion Nr. 9-15 (vereinigt) E&sub4;&sub9;&sub2; = 0,000
- CsCl-Gradient ELISA-Messung
- Monoclonaler Antikörper MA 18/7
- Fraktion Nr. 9-15 (vereinigt) E&sub4;&sub9;&sub2; = 0,000
- CsCl-Gradient ELISA-Messung
- Monoclonaler Antikörper MQ 19/10
- Fraktion Nr. 9-15 (vereinigt) E&sub4;&sub9;&sub2; = 0,985
- Tabelle XI: zeigt die ELISA-Daten gereinigter HBs-Antigen-Partikel, hergestellt von einem Konstrukt, umfassend den gesamten prä-S&sub1;-prä-S&sub2;-S-Bereich unter Kontrolle der LTR-Region des Rous-Sarkom-Virus nach Stimulierung mit stimulierenden Substanzen (z.B. PMA) und der zusätzlichen Cotransfektion mit S (Fig. XIII).
- CsCl-Gradient ELISA-Messung
- Monoclonaler Antikörper MA 18/7
- Fraktion Nr. 9-15 (vereinigt) E&sub4;&sub9;&sub2; = 0,125
- Fig. XIV: zeigt die Charakterisierung der Partikel, welche von Genkonstrukten gemäß Tabelle III (Fig. I-1) und Tabelle V (Fig. II-1), cotransfiziert in C127 nach Reinigung in dem CsCl-Gradienten, gewonnen wurden. Die gesammelte Fraktion wies ein kleineres Volumen auf.
- Tabelle XII: zeigt die Serotypisierung von Partikeln gemäß Fig. I-1 mit der S-Sequenz, durchgeführt im Pettenkofer-Institut.
- Ergebnisse:
- adw/ayw: positiv
- Aus dem Vorstehenden wird für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Modifikationen bei den vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren durchgeführt werden können, ohne vom Geist und vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Demgemäß kann die Erfindung andere spezifische Formen umfassen, ohne von dem Geist oder wesentlichen Charakteristika hiervon abzuweichen. Die vorliegenden Ausführungsformen werden daher in jeder Hinsicht als veranschaulichend und nicht als begrenzend angesehen, wobei der Schutzumfang der Erfindung durch die beigefügten Patentansprüche anstatt durch die vorstehende Beschreibung angegeben wird, und es ist daher beabsichtigt, daß alle Veränderungen, welche in den Bedeutungs- und Gleichwertigkeitsbereich der Patentansprüche fallen, darin eingeschlossen sind.
Claims (21)
1. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Expressionskontrollsequenz, welche
mit einer ersten und einer zweiten DNA-Sequenz funktionell verbunden ist, die im
Leseraster verknüpft sind, wobei die DNA-Sequenzen jeweils einen getrennten
Bereich eines einzelnen Peptids codieren, das von dem rekombinanten DNA-
Molekül exprimiert wird, und wobei die erste DNA-Sequenz der
Expressionskontrollsequenz näher ist als die zweite DNA-Sequenz, dadurch
gekennzeichnet, daß:
(c) die erste DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz eines Teils des
HBV-prä-S&sub1;-codierenden Bereichs umfaßt, worin ein 5'-terminaler Bereich des prä-S&sub1;-codierenden
Bereichs, enthaltend das ATG-Startcodon des prä-S&sub1;-Bereichs, durch einen 5'-
terminalen, codierenden Bereich des HBV-S-Bereichs, enthaltend das ATG-
Startcodon des S-Bereichs, ersetzt wurde, und wobei die erste DNA-Sequenz ein
HBV-prä-S&sub1;-Epitop codiert; und
(d) die zweite DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz des HBV-S-codierenden Bereichs
umfaßt, worin das ATG-Startcodon fehlt, und ein Peptid codiert, das bei der
Sekretion die Bildung von Partikeln steuert, die eine Immunantwort gegen das prä-
S&sub1;-Epitop auslösen.
2. DNA-Molekül, wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die Nucleotidsequenz des 5'-
terminalen, codierenden Bereichs des HBV-S-Bereichs ATGGAGAAC ist.
3. DNA-Molekül, wie in Anspruch 2 beansprucht, worin die Nucleotidsequenz des 5'-
terminalen, codierenden Bereichs des HBV-S-Bereichs AACATGGAGAAC ist.
4. DNA-Molekül, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei die
erste DNA-Sequenz die Nucleotidsequenz eines Teils des HBV-prä-S&sub1;-codierenden
Bereichs umfaßt, worin der 3'-Terminus des prä-S&sub1;-codierenden Bereichs deletiert
wurde.
S. DNA-Molekül, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, das ein
HBV-prä-S&sub1;-Epitop des ayw-Serotyps codiert.
6. DNA-Molekül, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, enthaltend
mindestens eine Nucleotidsequenz aus Tabelle I.
7. DNA-Molekül, wie in Anspruch 6 beansprucht, worin die erste DNA-Sequenz die
Sequenz von Oligo Nr. 55 aus Tabelle I umfaßt.
8. DNA-Molekül, wie in Anspruch 6 beansprucht, woein die erste DNA-Sequenz die
Sequenz von Oligo Nr. 23 aus Tabelle I umfaßt.
9. DNA-Molekül, wie in Anspruch 7 oder Anspruch 8 beansprucht, worin die zweite
DNA-Sequenz die S-codierende Sequenz des XbaI-BglII-Fragments des in Fig. IX
gezeigten HBV-S-Gens umfaßt.
10. DNA-Molekül, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das DNA-Molekül durch
Fig. I-1, I-2, IV-1, IV-2, IV-3, VI-1, VI-2 oder VI-3 beschrieben wird.
11. Wirtszelle, transfiziert mit einem rekombinanten DNA-Molekül, wie in irgendeinem
der Ansprüche 1 bis 10 beansprucht.
12. Wirtszelle, cotransfiziert mit einem ersten rekombinanten DNA-Molekül und einem
zweiten rekombinanten DNA-Molekül, wobei das erste rekombinante DNA-
Molekül ein rekombinantes DNA-Molekül ist, wie in irgendeinem der Ansprüche 1
bis 10 beansprucht, und wobei das zweite rekombinante DNA-Molekül ein Peptid
codiert, das die Aminosäuresequenz des HBV-S-Peptids einschließt.
13. Wirtszelle, wie in Anspruch 11 oder 12 beansprucht, die eukaryontischen Ursprungs
ist.
14. Wirtszelle, wie in Anspruch 13 beansprucht, die eine Hefezelle ist.
15. Wirtszelle, wie in Anspruch 13 beansprucht, die von einem Säuger stammt.
16. Wirtszelle, wie in Anspruch 15 beansprucht, die aus einer VERO-Zelle, einer 3T3-
Zelle, einer C127-Zelle, einer L-Zelle, einer CHO-Zelle, die für
Dehydrofolatreduktase positiv ist, und einer CHO-Zelle, die für
Dehydrofolatreduktase negativ ist, gewählt ist.
17. Peptid, codiert durch ein rekombinantes DNA-Molekül, wie in irgendeinem der
Ansprüche 1 bis 10 beansprucht.
18. Peptid, wie in Anspruch 17 beansprucht, zur Verwendung in einem Verfahren zur
Impfung gegen HBV.
19. Verfahren zur Herstellung einer transfizierten Wirtszelle, wobei das Verfahren
umfaßt:
Bereitstellung einer Wirtszelle, die für die Aufnahme von DNA kompetent
gemacht wurde;
Aussetzen der Wirtszelle einer ersten DNA-Zubereitung, umfassend ein
rekombinantes DNA-Molekül nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10;
Ermöglichen der DNA-Aufnahme aus der ersten DNA-Zubereitung durch die
Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen; und
Selektion auf eine Wirtszelle, die das rekombinante DNA-Molekül
aufgenommen hat.
20. Verfahren, wie in Anspruch 19 beansprucht, weiterhin umfassend das Aussetzen der
Wirtszelle einer zweiten DNA-Zubereitung, umfassend ein DNA-Molekül, das ein
Peptid codiert, welches die Aminosäuresequenz des HBV-S-Peptids einschließt, und
das Ermöglichen der DNA-Aufnahme aus der zweiten DNA-Zubereitung durch die
Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen.
21. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, wobei das Verfahren die Züchtung einer
Wirtszelle, transfiziert mit einem rekombinanten DNA-Molekül, wie in irgendeinem
der Ansprüche 1 bis 10 beansprucht, unter Bedingungen, welche die Expression und
Sekretion eines Proteins durch die Zelle zulassen, und die Gewinnung des als
Ergebnis der Expression des rekombinanten DNA-Moleküls produzierten Peptids
umfaßt.
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Free format text: PRODUCT NAME: HEPACARE-TRIPEL ANTIGEN HEPATITIS B VAKZINE (REKOMBINANT); REGISTRATION NO/DATE: EU/1/00/136/001, EU/1/00/136/002; 20000804 Spc suppl protection certif: 102 99 017 Filing date: 20020423 |
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8364 | No opposition during term of opposition | ||
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