DE3789399T2 - Herstellung von Vakkzinen gegen Hepatitis B-Virus. - Google Patents

Herstellung von Vakkzinen gegen Hepatitis B-Virus.

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Hepatitis B-Virus (HBV) ist die Infektionsursache, die für eine Reihe von verschiedenen Leberkrankheiten beim Menschen verantwortlich ist. Viele Individuen, die mit HBV infiziert sind, leiden an einer akuten Phase der Krankheit, auf die eine Erholung folgt. Jedoch kann eine Reihe von Individuen die Infektion nicht mehr ausheilen, wodurch sie zu chronischen Trägern der Infektion werden. Die HBV-Infektion ist in vielen Teilen der Welt endemisch, mit einer starken Verbreitung der Infektion, die nach der Geburt von chronisch infizierten Müttern auf ihre Neugeborenen übergeht. Die Anzahl der chronischen Träger weltweit wurde auf über dreihundert Millionen geschätzt. Aus diesem Pool von Trägern sterben jährlich Hunderttausende an den Langzeitfolgen der chronischen Hepatitis B (Zirrhose oder hepatozelluläres Karzinom).
  • Das HB-Virion besteht aus zwei Gruppen von Strukturproteinen, den Kernproteinen und den Hüll- oder Oberflächen("S")-Proteinen. Abgesehen von der Tatsache, daß es die Hauptoberflächenproteine des Virions sind, d. h. Dane-Teilchen, sind die "S"-Proteine die alleinigen Bestandteile des Australia Antigens oder 22 nm-Teilchen. Die "S"-Proteine sind die Translationsprodukte eines großen offenen Leserahmens (ORF), der für die Aminosäuren 389-400, je nach Serotyp, kodiert [LO, S.J: et al., 1986, Biochem. Biophys. Res. Comm. 135, Seiten 383 ff.]. Dieser ORF wird in drei Domänen aufgeteilt, von denen jede mit einem ATG-Codon beginnt, das in der Lage ist, als Startstelle der Translation in vivo zu fungieren. Diese Domänen werden gemäß ihrer entsprechenden 5'-, 3'-Anordnung in dem Gen als preS-1 (Aminosäuren 108-119), preS-2 (55 Aminosäuren) und S (226 Aminosäuren) bezeichnet [Heermann, K.H: et al., 1984, J. Virol., 52, Seiten 396-402].
  • Die sechs Proteinprodukte, die diesem ORF entstammen, weisen die folgenden Zusammensetzungen auf:
  • 1) gp42 (42 000 Dalton-Glykoprotein) = preS-1/preS-/S (bedeutet preS-1 folgt unmittelbar vor pres-2, folgt unmittelbar vor 5).
  • 2) p39 (p = Protein) = preS-1/preS-2
  • 3) gp36 = preS-2/5 (zwei Glykosylierungsstellen)
  • 4) gp33 = preS-2/5 (eine Glykosylierungsstelle)
  • 5) gp27 = S (eine Glykosylierungsstelle)
  • 6) p24 = 5.
  • Alle sechs Proteine sind zu einem etwa äquimolaren Ausmaß in dem HBV-Dane-Teilchen vorhanden. In dem 22 nm-Teilchen sind die vier kleineren Proteine in etwa äquimolarem Ausmaß vorhanden, während gp42 und p39 meistens in einem oder einigen wenigen Molekülen pro Teilchen vorhanden sind.
  • Die 22 nm-Teilchen oder die HB-Oberflächenantigenteilchen (HBsAg) wurden aus dem Plasma chronischer Träger gereinigt. Diese chronischen Träger werden als HBs&spplus; bezeichnet, da ihr Plasma-Teilchen in Bezug auf auf die HB-Oberflächenantigenteilchen positiv ist. Wenn diese Träger eine bestimmte ausreichende Immunreaktion erreicht haben, können sie die Infektion ausheilen und werden zu HBs&supmin;. Diese Individuen werden aufgrund ihrer Bildung von Antikörpern gegen HBs als anti-HBs&spplus; bezeichnet. Auf diese Weise steht HBs&spplus; mit der Genesung von der Krankheit in Verbindung. Darum wurde erwartet, daß die Stimulation oder Bildung von anti-HBs&spplus; durch einen HB-Impfstoff einen Schutz gegenüber einer HBV-Infektion verleiht.
  • Diese Hypothese wurde bereits experimentell nachgeprüft. Abgesehen vom Menschen, sind Schimpansen die einzige Spezies, die gegenüber einer HBV-Infektion vollkommen anfällig ist, wie es sich in quantifizierbaren Markern, wie HBs&spplus;, einem erhöhten Niveau an Leberenzymen im Serum etc., widerspiegelt. Schimpansen wurden mit drei Dosen aus gereinigten HBsAg- Teilchen geimpft und anschließend mit einer hohen Dosis infektiösem HBV provoziert. Während die mit Placebo geimpften Tiere an den Anzeichen einer akuten HBV-Infektion litten, waren die mit HBsAg geimpften Tiere gegenüber jeglichen Anzeichen einer Infektion vollständig geschützt. Darum genügten in diesem experimentellen System HBsAg-Teilchen, die aus gp27 und gp24 bestanden (nur die S-Domäne), um eine Schutzimmunität auszulösen. Beflügelt von diesen Beobachtungen haben mehrere Hersteller HB-Impfstoffe, die aus HBsAg- Teilchen bestehen, hergestellt.
  • Jüngste Daten haben nahegelegt, daß die preS-1- und preS-2- Domäne bei der Immunität gegenüber HBV-Infektionen eine wichtige Rolle spielen [Neurath et al., Nature, 315, Seiten 154-6 (1985)]. Beide Antikörper gegen preS-1 (ausgelöst durch Immunisierung mit einem Peptid, bestehend aus den Aminosäureresten 1-26 von preS-2), sowie Antikörper gegen preS-2 (ausgelöst durch Immunisierung mit einem Peptid, bestehend aus den Aminosäureresten 1-26 von preS-2) sind in der Lage, die Bindung von HBV an menschliche Hepatomzellen in vitro zu blockieren; anti-HBs (Seren von Patienten, die mit HBsAg ohne preS-1 oder preS-2 geimpft worden sind) ist nicht in der Lage, diese Blockierung auszulösen. Wenn dieses in vitro- Ereignis eine in vivo-Infektion simuliert, so können die preS-Domänen (d. h. preS-1 und preS-2 in toto als verknüpfte Einheit) die HBV-Bindungsstelle für seinen Leberzellen- Rezeptor darstellen, und anti-preS- kann die Bindung von HBV und die Auslösung einer Infektion blockieren. Ferner wurde gefunden, daß der anti-preS-Titer während der Genesungsphase von einer akuten HBV-Infektion ansteigt, was beweist, daß diese zwei Antikörper bei der Genesung eine Rolle spielen. Schließlich wurde gezeigt, daß die Impfung von Schimpansen mit einem preS-Poly-petid aus 108 Aminosäuren (die Reste 27- 19 von preS-1, an die unmittelbar die Reste 1-16 von preS-2 anschließen) ein gewisses Maß an Schutz gegen eine Provokation mit HBV vermitteln konnte. Zusammengefaßt legen diese experimentellen Beobachtungen nahe, daß die preS- Domänen ein wirksamer Zusatz zu den derzeitigen HB-Impfstoffen sind.
  • Um die verfügbare Versorgung mit HB-Impfstoffen auszudehnen, haben sich die Hersteller der DNA-Rekombinationstechnik zugewandt, um die Expression von "S"-Proteinen durchzuführen. Unter den mikrobiellen Systemen wurden Echerichia coli und Saccharomyces cerevisiae am häufigsten zur Expression vieler Rekombinationsproteine verwendet. Zahlreiche Versuche zur Expression immunologisch aktiver HbSAg-Teilchen in E. coli waren nicht erfolgreich [Fujisuwa et al., (1985) Gene, 40, Seiten 23-29; Offensperger et al., (1985), P.N.A.S. USA, Seiten 7540-4]. S. cerevisiae zeigte jedoch eine große Vielseitigkeit in ihrer Fähigkeit, immunologisch aktive HBsAg-Teilchen zu exprimieren [Valenzuela et al., Biotechnology 3 : 317-320, April 1985). Diese Teilchen erwiesen sich bei einer Formulierung in einen Impfstoff als fähig, Schimpansen vollständig gegen eine Provokation mit lebendem HBV zu schützen. Außerdem war ein aus Hefe stammender HBsAg bei klinischen Versuchen am Menschen genauso immunologisch wirksam wie ein aus Plasma stammender HBsAg. Darum hat sich die Verwendung von S. cerevisiae als Wirtspezies zur Steuerung der Synthese von rekombinantem HBsAg fest etabliert. Im Lichte dessen wäre es wünschenswert, die gesamte preS-Domäne, die mit der S-Domäne in einem immunogenen Teilchen verknüpft ist, zu exprimieren.
  • In einer Reihe von mikrobiellen rekombinanten Expressionssystemen wurde gezeigt, daß die Synthese von vielen verschiedenen Polypeptiden für die Wirtszelle von Nachteil ist. Als Folge existiert ein selektiver Druck gegen die Expression solcher Polypeptide, so daß die einzigen Zellen, die sich bei einer Anreicherung einer solchen rekombinanten Kultur akkumulieren, diejenigen sind, die das fremde Polypeptid nicht mehr exprimieren oder so wenig Fremdpeptid exprimieren, daß die Kultur als Quelle für das Polypeptid nicht mehr ökonomisch ist. In einigen Fällen ist die nachteilige Wirkung so stark, daß, wenn die Expression durch einen starken konstitutiven Promotor angetrieben wird, die sich neu transformierten Zellen nicht mehr fortpflanzen und auf Selektionsplatten Kolonien bilden können. Diese nachteiligen Wirkungen können behoben werden, indem ein induzierbarer Promotor zur Steuerung der Synthese solcher Polypeptide verwendet wird. Eine Reihe induzierbarer Gene kommen in S. cerevisiae vor. Drei gut charakterisierte induzierbare Systeme sind die Galactose (GAL)-Gebrauchsgene, das Alkoholdehydrogenase 2(ADH2)-Gen und das Gen des α-Paarungsfaktors.
  • S. cerevisiae besitzt drei Gene, welche für die Enzyme kodieren, die für die Verwendung von Galactose als Kohlenstoffquelle für das Wachstum verantwortlich sind. Die Gene GAL1, GAL7 bzw. GAL10 kodieren jeweils für Galactokinase, α-D-Galactose-1-phosphaturidyltransferase und Uridindiphosphorgalactose-4-epimerase. In Abwesenheit von Galactose wird eine sehr geringe Expression dieser Enzyme nachgewiesen. Wenn die Zellen auf Glucose gezogen werden und anschließend Galactose zu der Kultur hinzugegeben wird, werden diese drei Enzyme gleichwertig, auf dem Niveau der RNA-Transkription, in 10 000facher Konzentration induziert. Die GAL1- und GAL10-Gene wurden molekular kloniert und sequenziert. Die Regulator- und Promotorsequenzen für die 5'-Stellen der entsprechenden kodierenden Regionen wurden neben den kodierenden Regionen des lacZ-Gens angeordnet. Diese Experimente haben diejenigen Promotor- und Regulatorseqenzen definiert, die für die Induktion von Galactose notwendig und ausreichend sind.
  • S. cerevisiae besitzt ferner drei Gene, die jeweils für ein Isoenzym von ADH kodieren. Eines dieser Enzyme, ADHII, ist für die Fähigkeit von S. cerevisiae verantwortlich, Ethanol als Kohlenstoffquelle während des oxidativen Wachstums zu verwenden. Die Expression des ADHII-Gens, das für das ADHII-Isoenzym kodiert, unterliegt der Katabolitrepression durch Glucose, so daß während des fermentativen Wachstums in Gegenwart von Glucosekonzentrationen von 0,1% (Gew./Vol.) praktisch keine Transkription des ADHII-Gens auftritt. Während dieses Glucoseverbrauchs und in Gegenwart nichtreprimierender Kohlenstoffquellen wird die Transkription des ADHII-Gens in 100-1000facher Konzentration induziert. Dieses Gen wurde molekular kloniert und sequenziert, und diejenigen Regulator- und Promotorsequenzen, die zur Derepression der Transkription notwendig und ausreichend sind, wurden definiert.
  • Der α-Paarungsfaktor ist ein Sexualpheromon von S. cerevisiae, das zur Paarung zwischen MATα- und MATa-Zellen erforderlich ist. Dieses Tridecapeptid wird als Prepropheromon exprimiert, das in das rauhe endoplasmatische Reticulum eingeschleust, Glykosyliert und proteolytisch bis zu einer endgültigen reifen Form, die von den Zellen sezerniert wird, weiterverarbeitet wird. Dieser biochemische Weg wurde als Expressionsstrategie für fremde Polypeptide ausgenutzt. Das Gen des α-Paarungsfaktors wurde molekular kloniert, und sein Promotor mit der Preproleadersequenz wurde verwendet, um eine Reihe von Polypeptiden zu exprimieren und sezernieren. Wie aufgrund ihrer Durchquerung des rauhen endoplasmatischem Reticulums und des Golgiapparates erwartet, können Fremdproteine sowohl N- als auch O-verknüpfte Glykosylierungsvorgänge durchlaufen. Der α-Paarungsfaktor- Promotor ist nur in -phänotypischen Zellen aktiv. Bei S. cerevisiae existieren 4 genetische Loci, bekannt als SIR, die Proteine synthetisieren, die zur Repression von weiteren, normalerweise stummen Kopien der und -Information erforderlich sind. Temperaturempfindliche (ts) Läsionen, die dieses Repressionsereignis stören, kommen in dem Genprodukt von wenigstens einem dieser Loci vor. In dieser Mutante unterbricht das Wachstum bei 35ºC die Repression, was zu Zellen des Phänotyps führt, in denen der α-Paarungspromotor inaktiv ist. Bei einer Temperaturverschiebung auf 23 ºC wandeln sich die Zellen in den Phänotyp um, so daß der Promotor aktiv wird. Die Verwendung von Stämmen mit einer ts SIR-Läsion wurde für die kontrollierte Expression mehrerer fremder Polypeptide gezeigt.
  • Das gesamte Hepatitis B-Virus-pres-Antigen-Gen, das in einem angrenzenden Leserahmen mit dem Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen verknüpft ist, wurde in Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Das exprimierte Protein aggregiert in Teilchenform, die die Hauptantigenstellen aufweist, für die beide Domänen kodieren, wodurch die Nützlichkeit von Hefe als Wirt für die Expression der preS-Domäne unterstrichen wird. Dieses Protein ist in diagnostischen in vitro-Systemen und als Impfstoff zur Behandlung und Prävention von Krankheiten und/oder Infektionen, die durch das Hepatitis B-Virus hervorgerufen werden, nützlich.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Fig. 1A, 1B und 1C sind schematische Diagramme, die die Konstruktion der Plasmide pYGAP/PSSA, pYGAP/PSSC, pYGAL/PSSA, pYGAL/PSSC, pYAGAP/PSSΔ, pYADH2/PSSC und pUC13/PSSC erläutern.
  • Die Fig. 2 und 3 sind schematische Diagramme, die die Konstruktion des Vektors pJC197 mit dem darauf befindlichen α-Paarungsfaktor erläutern.
  • Die Fig. 4A und 4B sind schematische Diagramme, die die Konstruktion des Plasmids pYαMF/PSΔS erläutern.
    • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft einen Impfstoff gegen die Hepatitis B- Krankheit, umfassend ein Polypeptid und ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptid die preS-1-Domäne, auf der die Aminosäuren 2-15 fehlen, die preS-2-Domäne und die S-Domäne aufweist.
  • Dane-Teilchen werden als Quelle für HBV-Nucleinsäure zur Isolierung des preS-1-, preS-2-, S-ORF verwendet. Die endogene Polymerasereaktion wird eingesetzt, um kovalent geschlossene ringförmige doppelsträngige DNA des HBV-Genoms aus der Nick-Gap-Form herzustellen, die ursprünglich in dem HB-Virion vorhanden sind. Die reparierte DNA wird isoliert und vollständig mit EcoRI verdaut. Der E. coli-Klonierungsvektor pBR322 wird ebenfalls mit EcoRI verdaut, mit der HBV-DNA ligasiert und verwendet, um E. coli zu transformieren. Die rekombinanten Plasmide werden selektiert, wobei diese das HBV-Genom in einer ringförmig permutierten Form enthalten, bei der die EcoRI-Schnittstelle die komplette preS-1, preS-2, S-Kodierungsregion in eine 5'-Domäne von 4 Kilobasenpaaren (kbp) und eine 3'-Domäne von 0,8 kbp teilt. Diese beiden Regionen werden für den gelegentlichen Zusammenbau des gesamten Gens subkloniert. Für die 3'-Domäne wird puC19 mit EcoRI und BamHI verdaut, anschließend mit einem synthetischen Oligonucleotid ligasiert, das aus den endständigen 5 Nucleotiden der kodierenden Region, dem Stoppcodon, einer HindIII-Schnittstelle und einem BamHI-Ende besteht. Der 3'-Teil des preS-1/preS-2/S-Gens, der aus einem EcoRI-AccI-Fragment von 0,8 kbp besteht, wird in diesen Vektor kloniert. Der 5'-Teil, der aus einem BamHI-EcoRI- Fragment von 0,3 kbp besteht, wird in pUC18 auf eine von zwei Arten subkloniert, die davon abhängen, ob (1) der vollständige ORF exprimiert werden soll, oder (2) die putative hydrophobe Signalsequenz (Aminosäuren 2-15) elimiert werden soll. Für die erste Strategie wird pUC18 mit HindIII und EcoRI verdaut und mit einem synthetischen 72 bp-Oligonucleotid ligasiert, das den vollständigen ORF von der BamHI- Schnittstelle stromaufwärts über die distale ATG-Sequenz und eine nicht translatierte 10 bp-Leadersequenz zu einem HindIII-kompatiblen Ende wieder-herstellt. Für die zweite Strategie wird ein Oligonucleotid von 30 bp, das eine identische Funktion ausführt, jedoch die kodierende Region für die u-Aminosäuren 2-15 eliminiert, ligasiert. Das BamHI- EcoRI-Fragment von 0,3 kbp der 5'-Domäne wird anschließend in einen dieser Oligonucleotid-verknüpften Klonierungsvektoren ligasiert. Die 5'-pUC18- und 3'-pUC19-Klone werden durch Wachstum in E. coli amplifiziert. Die kodierenden Regionen Fragmente abgespalten. Diese 51- und 3'-Fragmente werden ligasiert, mit HindIII verdaut, und der vollständige ORF mit HindIII-Enden wird in pUC13 kloniert, der zuvor mit HindIII verdaut worden ist. Der vollständige ORF wird als HindIII- Fragment über präparative Agarose-Gelelektrophorese zur Klonierung in das GAPDH-, ADH2- oder GAL10-Promotorexpressionssystem gereinigt.
  • Das PBR322-Plasmid, das die GAPDH-Expressionkassette enthält, besitzt eine außergewöhnliche HindIII-Schnittstelle zwischen dem GAPDH-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator, in den der vollständige, oben beschriebene ORF aus pUC13 in der geeigneten Orientierung inseriert wird. Diese Expressionskassette von 3,0 kbp wird anschließend durch SphI-Verdau entfernt und in den Shuttle-Vektor pC1/1 ligasiert, um das kleine SphI-Fragment zu ersetzen. Die auf diese Weise konstruierten Vektoren werden zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes 2150-2-3 (Valenzuela et al., Biotechnology 3 : 317-320, April 1985) verwendet; jedoch ergibt eine Ausplattierung des Transformationsgemisches auf selektiven Platten keine stabile Kolonienbildung. Die vermutete Toxizität des exprimierten Produkts wird durch die Entfernung des größten Teils der preS-1-PreS-2/S-kodierenden Region, durch die Bildung einer Leserahmenverschiebung durch Verdau mit BamHI und durch Religasierung des Plasmids bestätigt; die auf diese Weise hergestellte DNA transformiert Hefezellen wirksam.
  • Der YEp52 E coli/S. cerevisiae-Shuttlevektor lenkt die Expression von Fremdgenen, die in einer außergewöhnlichen HindIII-Schnittstelle hinter dem Galactose-induzierbaren GAL10-Promotor inseriert sind. Der oben beschriebene preS-1/preS-2/S-ORF (mit HindIII-Enden) wird in die HindIII- Schnittstelle des Vektors ligasiert. Dieses rekombinante Plasmid wird in den S. cerevisiae-Stamm BY-19 (auch als DC04 bekannt, Broach et al. Cell 21 : 501-508, 1980) eingeschleust. Die transformierten Klone werden selektiert. Die Zellen werden in einem selektiven synthetischen Medium gezogen, das Glycerin-Milchsäure enthält. Anschließend wird Galactose zu der Kultur hinzugegeben, um die Expression auszulösen. Es werden Lysate hergestellt, in einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und ein Western Blot auf Nitrocellulose durchgeführt. Es wird ein p39-Produkt gefunden, das aufgrund seines Vorkommens nur in den induzierten Transformanten und seiner Reaktivität gegenüber konvaleszenten menschlichen HB-Seren spezifisch gegenüber preS-1/preS-2/S ist. Außerdem sind Lysate der Transformanten, jedoch nicht diejenigen der Wildtyp-S. cerevisiae, im Radioimmuntest HBsAg-positiv, und sie sind preS-positiv aufgrund der Bindung an polymersiertes menschliches Albumin, eine Bindung, die sich gegenüber der preS-Region als spezifisch erwies. Eine Immun-Affinitätssäule mit Ziegenantikörpern, die die Teilchenform von HBsAg erkennen, wurde zur Reinigung von preS-1/preS-2/S aus transformierter S. cerevisiae verwendet. Das eluierte Produkt ist im Radioimmuntest HBsAg-positiv, gemäß Bindung an polymerisiertes menschliches Albumin preS-positiv und unter dem Elektronenmikroskop teilchenförmig. Diese Daten zeigen, daß das gesamte preS-1/preS-2/5-Protein in S. cerevisiae als p39-Protein exprimiert ist, das in Teilchenform vorliegt. Eine solche Teilchenform, die sowohl HBs- als auch preS-Antigene enthält, ist als HB-Impfstoff und diagnostisches Mittel wirksam.
  • Der) E. coli-Klonierungsvektor pADH2Δ67(-1) enthält Sequenzen, die in der Lage sind, bei S. cerevisiae die Expression von Fremdgenen auszulösen, die an einer außergewöhnlichen HindIII-Schnittstelle hinter dem (Glucose-reprimierbaren) ADH2-Promotor inseriert sind. pADH2Δ67(1-) wird mit BamHI und EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen, und das 4,9 kbp-Fragment, das den ADH2-Promotor und -Terminator enthält, über präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. pUC7 wird mit PstI verdaut, mit T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und mit dem 4,9 kbp-Fragment ligasiert. Das resultierende Plasmid wird mit SalI verdaut, und das 4,9 kbp-Fragment wird über präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. pUCI8 wird mit HindIII verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen und mit sich selbst ligasiert. Das resultierende Plasmid wird mit SalI und mit dem 4,9 kbp-SalI-Fragment ligasiert. Der oben beschriebene 1,2 kbp-preSe-1/preS-2/S-ORF (mit HindIII-Enden) wird in die HindIII-Schnittstelle dieses Vektors ligasiert. Das resultierende Plasmid wird mit SalI verdaut, und das 6,1 kbp-Fragment wird in die SalI-Schnittstelle des Shuttle-Vektors pC1/1 ligasiert. Das Plasmid pC1/1 ist ein Derivat von pJDB219, bei dem die Region, die dem bakteriellen Plasmid pMB9 in pJDB219 entspricht, durch pBR322 ersetzt wurde. Dieses rekombinante Plasmid wird in S. cerevisiae eingeschleust, und die transformierten Klone werden selektiert. Die Zellen werden in einem synthetischen selektiven Medium, das 0,3% (Gew./Vol.) Glucose enthält, gezogen. 48 Stunden später, nach der Glucoseverarmung, werden Lysate hergestellt, durch SDS-PAGE aufgetrennt und ein Western Blot auf Nitrocellulose durchgeführt. Es wird ein p39-Produkt gefunden, das aufgrund seines Vorkommens nur in den Transformanten und aufgrund seiner Reaktivität gegenüber konvaleszenten menschlichen HB-Seren spezifisch für preS-1/preS-2/S ist. Außerdem sind die Lysate von Transformanten, jedoch nicht die der Wildtyps. cerevisiae im Radioimmuntest HBsAg-positiv, und sie sind aufgrund der Bindung an polymerisiertes menschliches Albumin pres-positiv. Eine Immun-Affinitätssäule mit Ziegen-Antikörpern, die die Teilchenform von HBsAg erkennen, wurde zur Reinigung von preS-1/preS-2/S aus transformierter S. cerevisiae verwendet. Das eluierte Produkt ist im Radioimmuntest HBsAgpositiv, aufgrund der Bindung an polymerisiertes menschliches Albumin gegenüber preS positiv und ist unter dem Elektronenmikroskop teilchenförmig.
  • Das Gen MFα1 des α-Paarungsfaktors wurde in einen Plasmidvektor aus S. oerevisiae-Genom-DNA kloniert. Das resultierende Plasmid pKH2 wird mit EcoRI verdaut und das 1,7 kbp-Fragment, das das Gen des α-Paarungsfaktors trägt, wird über präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt.
  • 1,7 kbp-Fragment, das das Gen des α-Paarungsfaktors trägt, wird über präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Das Plasmid pRJ148 (ein modifiziertes pBR322 ohne die HindIII-Schittstelle) wird mit EcoRI verdaut und mit dem 1,7 kbp-Fragment ligasiert, um das Plasmid pRJ159 zu erhalten. Diese DNA wird mit HindIII verdaut und mit sich selbst ligasiert, um das Plasmid pRJ167 zu erzeugen, das nun die außergewöhnliche HindIII-Schnittstelle aufweist. Das Plasmid pRJ167 wird mit HindIII verdaut und durch Insertion eines synthetischen Oligonucleotid-Adaptors modifiziert, um ein neues Plasmid (pRJ174) zu gewinnen, das eine außergewöhnliche HindIII-Schnittstelle enthält, die bei allen drei Leserahmen zwischen der 3'-Seite des Promotors und Preproleaders und der 5'-Seite des Terminationssignals der Translation liegt. Die HindIII-Schnittstelle wird zu einer BamHI-Schnittstelle umgewandelt, indem mit HindIII verdaut wird, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I glatte Enden hergestellt werden, indem BamHI-Linker zugegeben werden und eine Selbstligasierung erfolgt, um das Plasmid pJC193 zu erzeugen. Dieses Plasmid wird mit EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen, durch Zugabe von BclI-Linkern modifiziert, mit BclI verdaut, und das 1,5 kbp-Fragment, das das Gen des α-Paarungsfaktors trägt, über präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Dieses resultierende BclI-Fragment wird mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm behandelt und anschließend in die außergewöhnliche BamHI-Schnittstelle von pC1/1 inseriert, wobei die ursprüngliche BamHI-Schnittstelle während des Verfahrens (Plasmid pJC194) zerstört wird. Diese DNA wird mit BamHI verdaut und mit sich selbst ligasiert, um überschüssige BamHI-Linker zu entfernen, was zu dem neuen α-Paarungsfaktor-Expressions-plasmid pJC197 führt. Der preS- 1/preS-2/S-ORF in pUC13, der oben beschrieben ist, wird mit HinfI und AvaI verdaut. Der 0,5 kbp-ORF wird über präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. pUCI8 wird mit SalI und BamHI verdaut, anschließend mit zwei synthetischen Oligonucleotiden ligasiert. Das 5'-Oligonucleotid besteht aus einem SalI-Ende, einer HindIII-Schnittstelle, Nucleotiden, die für eine KEX2-Spaltstelle kodieren, Nucleotiden, die für die Aminosäuren 2 und 3 von preS-1 kodieren und einem HinfI- Ende. Das 3'-Nucleotid enthält eine AvaI-Schnittstelle, Nucleotide, die für die letzten 8 Aminosäuren von preS-2 kodieren, das Stoppcodon, eine HindIII-Schnittstelle und ein BamHI-Ende. Der 0,5 kbp-ORF wird in diesen Oligonucleotidverküpften puC18-Vektor kloniert. Der resultierende Vektor wird mit HindIII verdaut und mit dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I mit glatten Enden versehen. Der resultierende modifizierte 0,5 kbp-preS-1/preS-2-ORF wird über präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in pJC197 kloniert, der mit BamHI verdaut und mit dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I mit glatten Enden versehen wurde, was dazu führte, daß der preS-ORF mit der Preproleadersequenz des α-Paarungsfaktors zweckorientiert verbunden ist.
  • Der Promotor des α-Paarungsfaktors ist nur in Zellen aktiv, die phänotypisch sind. Es existieren 4 Loci bei S. cerevisiae, die als SIR bekannt sind und die Proteine synthetisieren, die zur Repression weiterer, normalerweise stummer Kopien der und -Information erforderlich sind. Zellen des Stamms JRYl88 (MATα, sir3-8, leu2-3, leu2-112, trpl, ura3-52, his4) enthalten eine ts-Läsion in dem Genprodukt SIR3. Als Ergebnis sind JRY188-Zellen, die bei 35ºC gezogen werden, phänotypisch und der Promotor des α-Paarungsfaktors ist nicht aktiv. Andererseits sind Zellen, die bei 23ºC gezogen wurden, phänotypisch - und somit in der Lage, eine Expression, die von dem Promotor des α-Paarungsfaktors gesteuert wird, auszulösen. Das rekombinante preS-1/preS-2- haltige α-Paarungsfaktor-Plasmid wird zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes JRY188 verwendet (Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 4642-4646, 1984). Transformierte Klone werden selektiert. Zellen werden bei 35ºC in einem selektiven synthetischen (leu&supmin;)-Medium gezogen, anschließend werden die Zellen bei A&sup6;&sup0;&sup0;= 0,5 in demselben Medium bei 23ºC gezogen. Es werden Lysate hergestellt, durch SDS-PAGE aufgetrennt und ein Western Blot auf Nitrocellulose durchgeführt. Ein p21-Produkt wird aufgrund seines Vorkommens nur in Transformanten und aufgrund seiner Reaktivität mit konvalsezenten menschlichen HB-Seren als spezifisch für preS- 1/preS-2 betrachtet.
  • Das Unvermögen des Vektors, der die preS-1/preS-2/S-Region von dem konstitutiven GAPDH-Promotor aus steuert, S. cerevisiae stabil zu transformieren, unterstreicht die negative physiologische Wirkung einer konstitutiven Expression von preS auf hohem Niveau bei S. cerevisiae. Das Plasmid pHBS56-GAP347/33, das die S-Polypeptidexpression von dem genannten Promotor aus steuert, transformiert S. cerevisiae wirksam. Solche, auf diese Weise transformierten S. cerevisiae-Zellen wachsen wirksam im großtechnischen Produktionsmaßstab. Diese Beobachtung unterstreicht die Nützlichkeit eines Shuttlevektors, der einen induzierbaren dereprimierbaren oder weniger aktiven konstitutiven Promotor verwendet, um die Expression von preS- haltigen Polypeptiden in S. cerevisiae zu steuern. Insbesondere unterstreicht dies die Nützlichkeit des Expressionsvektors, der den GAL10-Promotor verwendet, um die Expression von preS-1/preS-2/S in S. cerevisiae zu steuern. Fachleuten ist klar, daß der regulierbare GAL10-Promotor oder die GAl1-, GAL2-, GAL7- oder MEL-Promotoren, die auf nichtunterscheidbare Weise funktionieren, das Wachstum einer rekombinanten S. cerevisiae-Kultur ermöglichen, damit sie auf ein großtechnisches Volumen vergrößert werden kann, bevor mit der Synthese des rekombinanten Proteins begonnen wird, so daß die negativen Wirkungen auf die Wirtszelle so klein wie möglich gehalten werden. Ferner ist Fachleuten klar, daß ein Expressionsvektor, der einen anderen regulierbaren Promotor enthält, einschließlich ADH2 und des α-Paarungsfaktors, jedoch nicht darauf beschränkt, die durch andere Substrate physiologisch induzierbar oder dereprimierbar sind, zur Steuerung der Expression von preS-haltigen Polypeptiden verwendet werden kann. Außerdem ist Fachleuten klar, daß ein konstitutiver Promotor, der weniger wirksam ist als GAPDH, einschließlich CYC1, jedoch nicht darauf begrenzt, die Expression von preS-haltigen Polypeptiden bis zu einem geringeren Prozentsatz an Zellprotein vorantreibt, so daß die negativen physiologischen Wirkungen einer Überexpression vermieden werden. Fachleuten ist klar, daß ein geeignetes Testsystem, z. B. Western Blot oder ein Radioimmuntest, verwendet werden sollte, um die Expression pres-haltiger Polypeptide in diesem System zu testen, so daß die Erntezeit der Kultur zum Erhalt einer maximalen Ausbeute optimiert werden kann.
  • Die Gattung Saccharomyces besteht aus einer Vielzahl von Spezies. Am häufigsten wird Saccharomyces cerevisiae oder Bäckerhefe als Wirt für die rekombinante DNA-vermittelte Expression einer Vielzahl von Fremd-Polypeptiden verwendet. Jedoch sind die Unterscheidungen zwischen den weiteren Spezies der Gattung Saccharomyces nicht immer gut definiert. Viele dieser Spezies sind in der Lage, sich mit S. cerevisiae zu kreuzen und besitzen wahrscheinlich regulierbare Promotoren, die analog oder identisch zu den Promotoren bei S. cerevisiae sind, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf GAL10, ADH2 und/oder die Promotoren des α-Paarungs-faktors. Darum ist es Fachleuten klar, daß sich zur Ex-pression von pres-haltigen Polypeptiden die Auswahl eines Wirtstammes auf weitere Spezies der Gattung Saccharomyces erstreckt, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf carlsbergensis, uvarum, rouxii, montanus, kluyveri, elonqisporus, norbensis, oviformis und diastaticus.
  • Bei mehreren Hefegattungen, wie Hansenula, Candida, Torulopsis und Pichia, wurde gezeigt, daß sie ähnliche Stoffwechselwege zur Verwendung von Methanol als einziger Kohlenstoffquelle für das Wachstum aufweisen. Das Gen für die Alkoholoxidase, ein Enzym, das an diesem Stoffwechselweg teilnimmt, wurde aus Pichia Dastoris isoliert. Der Promotor für die P. pastoris-Alkoholoxidase wurde isoliert und erwies sich für eine Induktion der Expression durch Methanol als empfindlich. Ein solcher induzierbarer Promotor ist zur Expression von Polypeptiden geeignet, die in Hefe negativ selektiert sind. Insbesondere hat sich dieser Promotor zur induzierbaren Expression der S-Domäne in Teilchenform in P.
  • pastoris auf einem Plasmid als aktiv erwiesen. Diese Beobachtung unterstreicht die Fähigkeit weiterer Hefegattungen, als Wirte für die rekombinante DNA-vermittelte Expression von S-Polypetiden in immunologisch aktiver Form zu fungieren. Darum ist Fachleuten klar, daß sich die Auswahl eines Wirtsstammes zur Expression preS-haltiger Polypeptide auf Spezies weiterer Hefegattungen aus den Familien Saccharomycetaceae und Cryptococcaceae, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis, Kluyveromyces und Saccharomycopsis, erstreckt.
  • In den letzten Jahren ist über bemerkenswerte Erfolge bei der Expression rekombinanter Proteine in Zellen von Prokaryoten, die höher stehen als Hefe, insbesondere in Säugerzellinien und in Insektenzellen, die mit den Expressionsvektoren des Baculovirus transfiziert worden sind, berichtet worden. Es wurde eine erfolgreiche Expression als immunogenes Teilchen sowohl der S-Domäne der se als auch der preS-2-Domäne, die mit der S-Domäne verknüpft ist, erreicht. Darum ist Fachleuten klar, daß sich das Konzept der Expression der vollständigen preS-1/preS-2/S-Domänen in Hefe als immunogenes Teilchen leicht auf die Expression dieser verknüpften Domänen in Zellen höherer Eukaryoten, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Säugerzellinien, wie Vero, GH3, LTK&supmin; und CHO, erstreckt.
  • Die folgenden Beispiel erläutern die Erfindung, ohne jedoch selbige darauf zu beschränken. Die Beschreibung eines jeden, in den folgenden Beispielen erwähnten Zitats ist hiermit als Referenz angegeben.
    • BEISPIEL 1 Klonierung des preS-1/preS-2/S-Gens
  • Dane-Teilchen (Subtyp ayw) wurden aus dem Plasma infizierter Individuen durch bewährte Techniken gereinigt [Landers et al., J. Virology 23 : 368 (1977)]. Die HBV-Genom-DNA ist in einer Nick-Gap-Form des Virions vorhanden [Hruska et al., J. Virology 21 : 666 (1977)]. Um diese DNA für die molekulare Klonierung herzustellen, wurde die Reaktion mit endogener Polymerase durchgeführt, um kovalente geschlossene ringförmige doppelsträngige DNA herzustellen [Landers et al., J. Virology 23 : 368 (1977)]. Die DNA wurde durch Inkubation in Puffer, der Natriumdodecylsulfat und Proteinase K enthielt, von Proteinen befreit, und anschließend mit Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert und durch Ethanolfällung konzentriert. Diese gereinigte DNA wurde vollständig mit EcoRI verdaut. Der E. coli-Klonierungsvektor pBR322 wurde ebenfalls mit EcoRI verdaut, mit der verdauten HBV-DNA ligasiert und zur Transformation von E. coli verwendet. Es wurden rekombinante Plasmide isoliert, die das HBV-Genom in einer ringförmig permutierten Orientierung um die außergewöhnliche EcoRI-Schnittstelle (pHBV/AYW-1, Fig. 1A), die die vollständige pres-1/preS-2/S-kodierende Region in eine 5'-Domäne von 0,4 kbp und eine 3'-Domäne von 0,8 kbp teilt, enthalten [Galibert et al., Nature 281 : 646 (1979)]. Diese zwei Domänen wurden für einen gelegentlichen Wiederzusammenbau des gesamten Gens subkloniert. pUC19 wurde mit EcoRI und BamHI verdaut, anschließend mit einem synthetischen Oligonucleotid ligasiert, das aus den letzten fünf Nucleotiden der kodierende Region, dem Stoppcodon, einer HindIII-Schnittstelle und einem BamHI-Ende besteht. Die Struktur dieses Oligonucleotids lautet
  • Der 3'-Teil des preS-1/preS-2/S-Gens, der aus einem 0,8 kpb- EcoRI-Acc1-Fragment besteht, wurde in diesen Vektor (pUC19/ DSD, Fig. 1A und 1B) kloniert.
  • Der 5'-Teil wurde in pUC18 auf eine von zwei Arten subkloniert, je nachdem, ob der vollständige ORF exprimiert oder die putative hydrophobe Signalsequenz (Aminosäure 2-15) eliminiert werden sollte. Für die erste Strategie wurde pUC18 mit HindIII und EcoRI verdaut und mit einem synthetischen 72 bp-Oligonucleotid ligasiert, das den vollständigen ORF stromabwärts von der BamHI-Schnittstelle zu dem distalen ATG über eine nichttranslatierte Leadersequenz von 10 bp zu einem HindIII-kompatiblen Ende wiederherstellt. Die Struktur dieses Oligonucleotid lautet
  • (* die natürliche Sequenz enthält statt T C; die obige Veränderung zerstört die HinfI-Schnittstelle ohne Veränderung der kodierten Aminosäure). Für die zweite Strategie wurde ein 30 bp-Oligonucleotid ligasiert, das eine identische Funktion wie das 72 bp-Oligonucleotid ausführte, jedoch die kodierende Region für die Aminosäuren 2-15 nicht aufwies. Die Struktur dieses Oligonucleotids lautet
  • Das 0,4 kbp-BamHI-EcoRI-Fragment der 5'-Domäne wurde anschließend in einen dieser beiden Oligonucleotidverknüpften Klonierungsvektoren (pUC18/USDΔ, pUC19/USDC; Fig. 1A und 1B) ligasiert. Die 5'-pUC18- und 3'-pUC19- Klone wurden durch Wachstum in E. coli amplifiziert, und die kodierenden Regionen wurden aus den isolierten Plasmiden als HindIII-EcoRI-Fragmente abgespalten. Diese Fragmente wurden ligasiert, mit HindIII verdaut, der vollständige ORF mit den HindIII-Enden wurde in pUC13 kloniert, der mit HindIII (pUC13/PSSΔ, pUC13/PSSC: Fig. 1B und 1C) verdaut worden war. Der vollständige ORF aus diesem Vektor wurde über präparative Agarose-Gelelektrophorese zur Klonierung in den GAPDH- oder GAL10-Promotor (YEp52) oder in die ADH2-Promotorexpressionssysteme, wie in den Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben, gereinigt.
    • BEISPIEL 2 Verwendung des GADPH-Promotors zur Steuerung der Expression von -reS-1/-reS-/S in S. cerevisiae
  • Das pBR322-Plasmid, das die GADPH-Expressionskassette enthält [Holland und Holland, J. Biol. Chem. 255 : 2596 (1980)] weist eine außergewöhnliche HindIII-Schnittstelle für eine Klonierung auf, in die der 1,1 kbp preS-1/preS-2/S-ORF mit den HindIII-Enden (in Beispiel 1 beschrieben) kloniert wurde (pEGAP/pSSΔ, pEGAP/ PSSC, Fig. 1C). Die Expressionskassetten (die die HBV-Gene enthalten) wurden von dem pBR322-Plasmid durch SphI-Verdau und über präparative Agarose-Gelelektrophorese entfernt. Die Expressionskassetten wurden anschließend in den Shuttlevektor pC1/1 kloniert [Beggs, Nature 275 : 104 (1978); Rosenberg et al., Nature 312 : 77 (1984)], der zuvor mit SphI verdaut worden war (pYGAP/PSSΔ, PAGAP(PSSC; Fig. 1C). Das pC1/1-Plasmid, das die Expressionskassetten enthält, wurde zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes 2150-2-3 verwendet; es konnten jedoch wenige stabile Klone aus den selektiven Platten nach der Ausplattierung des Transformationsgemisches gewonnen werden. Die vermutete Toxizität des preS-1-haltigen Produkts für S. cerevisiae wurde durch Entfernung der preS-1/preS-2/S- kodierenden Region und Erzeugung einer Leserahmenverschiebung durch BamHI-Verdau und Religasierung des Plasmids bestätigt; die auf diese Weise hergestellte DNA transformierte Hefe wirksam.
    • BEISPIEL 3 Verwendung des GAL10-Promotors zur Steuerung der Expression von preS-1/preS-2/S in S. cerevisiae
  • Der YEp52 E. coli/S. cerevisiae-Shuttlevektor treibt die Expression von Fremdgenen an, die in einer außergewöhnlichen HindIII-Schnittstelle hinter dem Galactose-induzierbaren GAL10-Promotor inseriert wurden, [Broach et al., In Experimental Manipulation of Gene Expression, S. 83, Academic Press (1983)]. Ferner enthält dieser Vektor partielle Sequenzen aus dem 2 um Hefeplasmid (ori und eine umgekehrte Wiederholungssequenz) zur Fortpflanzung in S. cerevisiae, bzw. LEU2 zur Selektion in S. cerevisiae, die ori- und bla- Sequenzen zur Amplifikation und Selektion in E. coli. Der 1,1 kbp-preS-1/preS-2/S-ORF mit den HindIII-Enden (in Beispiel 1 beschrieben) wurde in die außergewöhnliche HindIII-Schnittstelle (pAGAL/PSSΔ, pYGAL/PSSC; Fig. 1C) kloniert, und das resultierende Plasmid wurde zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes BY-19 verwendet, den wir aus dem Labor von Dr. J.R. Broach von der Universität Princeton erhielten. Rekombinante Klone wurden isoliert und auf Expression des preS-1/preS-2/S-Polypeptids untersucht. Die Klone wurden in einem synthetischen selektiven (leu&supmin;) -Glycerin-Milchsäuremedium [0,67% (Gew. /Vol.) Hefe als Stickstoffgrundlage ohne Aminosäuren, 0,004% Adenin, 0,004% Uracil, 1% Succinat, 0,005% Tyrosin, 0,002% Arginin, 0,006% Isoleucin, 0,004% Lysin, 0,001% Methionin, 0,006% Phenylalanin, 0,006% Threonin, 0,004% Tryptophan, 0,001% Histidin, 0,6% Natriumhydroxid, 2% (Vol./Vol.) Milchsäure, 3% (Vol./Vol.) Glycerin)] gezogen. Die Produktion des Genprodukts wurde durch Zugabe von Galactose zu 2% (Gew./Vol.) ausgelöst, nachdem die Hefe bis zu A&sup6;&sup0;&sup0;= 0,3 gewachsen war. Die Expression des gewünschten Antigens wurde durch den Nachweis von HBsAg durch Ausria®(Abbott)- Reaktivität, Bindungsaktivität gegenüber polymerisiertem menschlichen Albumin [Machida et al., Gastroenterology 86: 910 (1984)] und durch Vorliegen von p39 in Western Blots, die unter Verwendung von konvaleszentem Humanserum und radioaktiv markiertem Staphylococcus aureus-Protein A entwickelt worden waren, verifiziert. Diese rekombinanten Klone dienten als Ausgangskulturen zur großtechnischen Fermentation und Isolierung, die in Beispiel 6 beschrieben sind.
    • BEISPIEL 4 Verwendung des ADH2-Promotors zur Steuerung der Expression von preS-1/preS-2/S in S. cerevisiae
  • Der pADH2Δ67 (-1) E.coli-Klonierungsvektor enthält Sequenzen, die in der Lage sind, in S. cerevisiae die Expression von Fremdgenen anzutreiben, die an einer außergewöhnlichen HindIII-Schnittstelle hinter dem ADH2 dereprimierbaren Promotor inseriert worden sind [Russell et al., J. Biol. Chem. 258 : 2674 (1983); E.T. Young, zur Veröffentlichung eingereicht]. Die außergewöhnliche HindIII-Schnittstelle ist zwischen Nucleotid -1 der nichttranslatierten 5'-Flankierungssequenz und dem Terminator der Transkription des ADH2-Gens angeordnet. pADH2Δ67(-1) wurde mit BamHI und EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Fragment der Polymerase I mit glatten Enden versehen, und das 4,9 kbp-Fragment, das den ADH2- Promotor enthält, wurde über präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. pUC7 wurde mit PstI verdaut, mit T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und mit dem 4,9 kbp-ADH2-Fragment ligasiert. Das resultierende Plasmid wurde mit SalI verdaut und das 4,9 kbp-Fragment über Agarose- Gelelektrophorese gereinigt. pUC18 wurde mit HindIII verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen und mit sich selbst ligasiert. Das resultierende Plasmid wurde mit SalI verdaut und mit dem 4,9 kbp-SalI-Fragment ligasiert, wodurch der Vektor pUC18A HindIII-ADH2 erzeugt wurde (Fig. 1). Die beiden verschiedenen 1,1 kbp-preS-1/preS-2/S-ORFs mit den HindIII- Enden (in Beispiel I beschrieben) wurden in die HindIII- Schnittstelle dieses Vektors ligasiert. Das resultierende Plasmid (pEADH2/PSSΔ, pEADH2/PSSC, Fig. 1C) wurde mit SAlI verdaut, und das 6,1 kbp-Fragment wurde in die SAlI-Schnittstelle von pC1/1 ligasiert, wodurch die Plasmide pYADH2/PSSΔ, pYADH2/PSSC (Fig. 1C) erzeugt wurden. Diese rekombinanten Plasmide wurden zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes 2150-2-3 verwendet, der aus dem Labor von Dr. L. Hartwell von der Universität von Washington erhalten worden war. Die rekombinanten Klone wurden isoliert und auf Expression des preS-1/preS-2/S-Polypeptids getestet. Die Klone wurden in synthetischem selektivem (leu-)-Medium gezogen, das 0,3% (Gew./Vol.) Glucose enthielt. Die Zellen wurden 48 Stunden lang bei 30ºC bis zu A&sup6;&sup0;&sup0; = 1,5 gezogen, währenddessen die Glucoseverarmung den ADH2-Promotor dereprimiert hatte. Alternativ wurden die Klone in synthetischem selektivem (leu&supmin;)-Medium gezogen, das 2% Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 30ºC bis zu A&sup6;&sup0;&sup0; von entweder 0,1 oder 1,0 wachsen gelassen, wonach größere Kolben oder Fermenter, die ein Komplexmedium mit 1,6% Glucose als Kohlenstoffquelle enthielten, angeimpft wurden (Impfmenge = 10% Vol./Vol.). Die Zellen wurden weitere 45 Stunden lang, wie oben beschrieben, bis zu A&sup6;&sup0;&sup0; = 12,0-14,0 gezogen, währenddessen die Glucoseverarmung den ADH2-Promotor dereprimiert hatte. Die Expression des gewünschten Antigens wurden durch den Nachweis von HBsAg durch Ausria®(Abbott)-Reaktivität gegenüber polymerisiertem Humanalbumin und durch den Nachweis von p39 in Western Blots, die unter Verwendung von konvalseszentem Humanserum und radioaktiv markiertem Staphylococcus aureus-Protein A entwickelt worden waren, verifiziert. Ein ausgewählter rekombinanter Klon diente als Ausgangskultur zur großtechnischen Fermentation und Isolierung, die in Beispiel 7 beschrieben ist.
    • BEISPIEL 5 Verwendung des α-Paarungsfaktor-Promotors und des Preproleaders zur Steuerung der Expression von preS-1/preS-2 in S. cerevisiae
  • Das α-Paarungsfaktor-Gen MFα1 wurde in einen Plasmidvektor aus S. cerevisiae-Genom-DNA kloniert [Kurjan et al., Cell 30: 933 (1982); Singh et al., Nucleic Acids Res. 11 : 4049 (1983)]. Das resultierende Plasmid pKH2 wurde mit EcoRI verdaut, und das 1,7 kbp-Fragment, das das Gen des α-Paarungsfaktors trägt, wurde über präparative Agarose- Gelelektrophorese gereinigt. Das Plasmid pRJ148 (ein modifiziertes pBR322, ohne die HindIII-Schnittstelle) wurde mit EcoRI verdaut und mit dem 1,7 kbp-Fragment ligasiert, um das Plasmid pRJ159 zu gewinnen. Diese DNA wurde mit HindIII verdaut und mit sich selbst ligasiert, um das Plasmid pRJ167 zu ergeben, das nun eine außergewöhnliche HindIII-Schnittstelle aufwies. Plasmid pRJ167 wurde mit HindIII verdaut und durch die Insertion eines synthetischen Oligonucleotid- Adaptors modifiziert, um ein neues Plasmid (pRJ178) zu gewinnen, das eine außergewöhnliche HindIII-Schnittstelle enthielt, die in allen drei Leserahmen zwischen der 3'-Seite des Promotors und Preproleaders und der 5'-Seite des Terminationssignals für die Translation liegt (Fig. 2). Die HindIII-Schnittstelle wurde in eine BamHI-Schnittstelle umgewandelt, indem mit HindIII verdaut wurde, mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I glatte Enden erzeugt wurden, BamHI-Linker zugegeben wurden und eine Ligasierung mit sich selbst unter Bildung des Plasmids pJC193 erfolgte. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen, durch Zugabe von BclI-Linkern modifiziert, mit BclI verdaut und das 1,5 kbp- Fragment, das das Gen des α-Paarungsfaktors trägt, über präparative Gelelektrophorese isoliert. Dieses resultierende BclI-Fragment wurde mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm behandelt und in die außergewöhnliche BamHI-Schnittstelle von pC1/1 inseriert, wodurch die ursprüngliche BarnHI-Schnittstelle zerstört wurde (Plasmid pJC194). Diese DNA wurde mit BamHI verdaut und mit sich selbst ligiert, um überschüssige BamHI-Linker zu entfernen, wodurch sich das neue Expressionsplasmid pUC197 des α-Paarungsfaktors ergab (Fig. 3). Das pUC13/PSSC-Plasmid (in Beispiel 1 beschrieben) wurde mit HinfI und AvaI verdaut, und der 0,45 kbp-ORF wurde über präparative Agarose-Gelelektrophorese (Fig. 4A) gereinigt. pUC18 wurde mit SalI und BamHI verdaut, anschließend mit zwei synthetischen Nucleotiden ligasiert. Das 5'-Oligonucleotid besteht aus einem SalI-Ende, einer HindIII-Schnittstelle, Nucleotiden, die für eine KEX2-Spaltstelle kodieren, Nucleotide, die für die Aminosäuren 2 und 3 von preS-1 kodieren und einem HinfI-Ende. Die Struktur dieses Oligonucleotids lautet:
  • Das 3'-Oligonucleotid enthält eine AvaI-Schnittstelle, Nucleotide, die die letzten 8 Aminosäuren von preS-2 kodieren, das Stoppcodon, eine HindIII-Schnittstelle und ein BamHI-Ende. Die Struktur dieses Oligonucleotids lautet
  • Der 0,4 kbp-ORF wurde in diesen Oligonucleotid-verknüpften pUC18-Vektor kloniert (Fig. 4A und 4B). Der resultierende Vektor (pUC18/PSAS) wurde mit HindIII verdaut und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen, wodurch sich eine Expressionskassette ergab, die den preS-1/preS-2-ORF enthielt, der mit dem Preproleader des α-Faktors zweckorientiert verknüpft war. Diese Kassette wurde über präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in pJC197 kloniert, der mit BamHI verdaut worden war und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen worden war (pYαMF/PSΔS; Fig. 4B), was zu dem preS-1/ preS-2-ORF führte, der mit dem α-Faktor-Preproleader zweckorientiert verknüpft war.
  • Der Promotor des α-Paarungsfaktors ist nur in Zellen aktiv, die phänotypisch - sind [Brake et al., Mol. Cell Biol. 3: 1440 (1983)]. Es existieren 4 Loci bei S. cerevisiae, die als SIR bekannt sind, welche Proteine synthetisieren, die für die Reprimierung weiterer, normalerweise stummer Kopien der - und -Information erforderlich sind [Rine et al., Genetics 93 : 877 (1979)]. Die Zellen des Stammes JRY188 (MATα, sir-8, leu2-112, trp1, ura3-52, his4) enthalten eine temperaturempfindliche Läsion in dem SIR3-Genprodukt. Als Ergebnis sind Zellen, die bei 35ºC gezogen wurden, phänotypsich , und der α-Paarungsfaktor-Promotor ist nicht aktiv; andererseits sind Zellen, die bei 23ºC gezogen wurden, phänotypisch - und somit in der Lage, eine Expression auszulösen, die durch den Promotor des α-Paarungsfaktors gesteuert wird [Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 4642 (1984)]. Das rekombinante preS-1/preS-2-haltige Plasmid des α-Paarungsfaktors wurde zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes JRY188 verwendet, der aus dem Labor von Dr. Jasper Rine von der Universität von Kalifornien in Berkeley erhalten worden war. Die transformierten Klone wurden selektiert. Die Zellen wurden in synthetischem selektivem (leu&supmin;)-Medium bei 37ºC gezogen. Anschließend wurden die Zellen bei A&sup6;&sup0;&sup0;= 0,5 in demselben Medium bei 23ºC gezogen. Lysate wurden hergestellt, durch SDS-PAGE aufgetrennt und ein Western Blot auf Nitrocellulose durchgeführt. Ein p21-Produkt wurde aufgrund seines Vorkommens nur in dem Transformanten und seiner Reaktivität mit menschlichen HB-Seren von Genesenden als spezifisch für preS- 1/preS-2 betrachtet.
    • BEISPIEL 6 Reinigung von preS-1/preS-2/S in Teilchenform mittels Immun- Affinitätschromatographie
  • Rekombinante S. cerevisiae-Zellen, die, wie in Beispiel 3 beschrieben, konstruiert worden waren (vollständige preS- Sequenz einschließlich der Aminosäuren 2-15), wurden in einem 16 l-Fermenter von New Brunswick Scientific gezogen, der mit 9,0 l synthetischem selektivem Glycerin-Milchsäuremedium beschickt worden war, das, wie in Beispiel 3 beschrieben, zusammengesetzt war. Die Fermentationsbedingungen waren Rühren bei 250 Upm, 2,5 l Luft/min bei 30ºC. Nach dem Wachstum bis A&sup6;&sup0;&sup0;= 0,25 wurde die Synthese des Produkts durch Zugabe von Galactose [2% Gew./Vol.)] ausgelöst, und die Fermentation wurde noch 33 Stunden lang bis zu einer endgültigen optischen Dichte von A&sup6;&sup6;&sup0;= 2,40 fortgesetzt. Die Hefezellen wurden durch Mikrofiltration über eine DC-10-Einheit von Amicon geerntet, in 30 ml Puffer A [0,1 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,2, 0,5 M NaCl] suspendiert und in einer Stansted-Druckzelle in sieben Durchgängen bei 75-85 Pfund pro squ.in. aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellsuspension (31 g Naßzellen-Gewicht) wurde mit 120 Puffer A verdünnt, Triton X-100® wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (Gew./Vol.) hinzugegeben. Die Suspension wurde durch 20minütige Zentrifugation bei 10000· g bei 4ºC geklärt. Der geklärte Überstand wurde abdekantiert und mit Sepharose 4B, an die Antikörper gegen HBsAg gekuppelt waren [McAleer et al., Nature 307 : 178 (1984)], 19 Stunden lang bei 4ºC inkubiert, um das Antigen auf dem Harz zu adsorbieren. Nach der Inkubation wurde die Aufschlämmung für alle anschließenden Schritte auf Raumtemperatur erwärmt und unter Vakuum 15 Minuten lang entgast. Die entgaste Aufschlämmung wurde in eine 2,5·40 cm Säule gegossen. Nach dem vollständigen Packen der Säule wurde ungebundenes Protein aus Puffer A herausgespült. Das Antigen wurde mit 3 M KSCN in Puffer A eluiert. Die antigenhaltigen Fraktionen wurden gegen 0,007 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,2, 0,15 M NaCI bei 4 ºC dialysiert und unter Bildung des dialysierten Affinitätspools, der 1,08 mg Protein in 20 ml enthielt, vereinigt. 16 ml des dialysierten Affinitätspools wurden auf 40 mcg/ml mit 5,6 ml 0,006 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,2, 0,15 M NaCl verdünnt. Das Produkt wurde durch Filtration über eine Millex-GV-Membran von 0,22 um sterilisiert. Die Identität des Produkts in dem dialysierten Affinitätspool wurde durch den Nachweis von HBsAg durch Ausria®-Reaktivität und Bindungsaktivität gegenüber polymerisiertem Humanalbumin bestätigt.
    • BEISPIEL 7 Reinigung von preS-1/preS-2/S in Teilchenform mittels Immun- Affinitätschromatographie
  • Rekombinante S. cerevisiae-Zellen, die, wie in Beispiel 4 beschrieben, konstruiert worden waren (vollständige preS-Sequenz einschließlich der Aminosäuren 2-15), wurden in einem 16 l-Fermenter von New Brunswick Scientific gezogen, der mit 9,0 l Komplexmedium, hergestellt wie beschrieben (YPD in Methods in Yeast Genetics S. 61, Cold Spring Harbor, NY), außer daß HySoy (Amber) durch Pepton ersetzt war, beschickt worden war. Die Fermentationsbedingungen waren Rühren bei 500 Upm, 5,0 l Luft/min bei 30ºC, 44 Stunden lang von A&sup6;&sup0;&sup0;- 0,65 bis A&sup6;&sup0;&sup0;= 9,50. Die Hefezellen wurden geerntet und lysiert. Das preS-1/preS-2/S-Produkt wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, gereinigt. Die Identität des Produkts wurde durch den Nachweis von HBsAg durch Ausria®-Reaktivität, Bindungsaktivität gegenüber polymerisiertem Humanalbumin und Gegenwart von p39 in Western Blots, die unter Verwendung von Humanserum von Konvaleszenten und radioaktiv markiertem Staphylococcus aureus-Protein A entwickelt worden waren, bestätigt.

Claims (1)

  1. Impfstoff gegen die Krankheit Hepatitis B, enthaltend ein Polypeptid und ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptid die prä-S1-Domäne, der die Aminosäuren 2-15 fehlen, die prä-S2-Domäne und die S-Domäne aufweist.
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