JPH06507303A

JPH06507303A - 慢性ウイルス性肝臓病に対する治療薬として用いる組成物

Info

Publication number: JPH06507303A
Application number: JP4501005A
Authority: JP
Inventors: トーマ，ハンス　アー．
Original assignee: メデバ　ホールディングス　ベスローテン　ベノートスハップ
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-19
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2021-12-13
Also published as: SK63693A3; DE69130071T2; DE69130071D1; WO1992011368A1; AU657935B2; CA2098021C; HUT66437A; US20030235591A1; KR0156587B1; DK0563093T4; CZ118693A3; DK0563093T3; EP0563093B2; HU9301794D0; EP0491077A1; SK280551B6; CA2098021A1; JP2001019643A; US6020167A; HU216301B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】慢性ウィルス性肝臓病に対する治療薬として用いる組成物本発明は、慢性ウィルス性肝臓病に対する治療薬を提供するための組換えＤＮＡ技術により調製されるポリペプチド配列と担体とを含んで成る組成物に関する。本発明は、前記ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列および前記ＤＮＡ配列の発現のためのトランスフェクトされた細胞に関する。

少なくとも５種のウィルス、即ちＡ、Ｂ、　Ｃ，ＤおよびＥ型肝炎ウィルスが急性肝炎の臨床的局面を開始させることができる。腸内的に感染するＡ型肝炎とＢ型肝炎は必ず直るが、一方Ｂ型、Ｃ型（以前は非経口性非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれた）およびＢ型肝炎は炎症の慢性段階に進行することがあり、これが次いで肝硬変や一次性肝細胞癌を引き起こし得る。

Ｃ型とＢ型肝炎、それらの診断および治療方法並びに各ウィルスに関して入手できるデータは比較的少ない。Ｄ型肝炎ウィルスは、不完全であることが知られているＲＮＡウィルスである。従って、それは患者中で発達するためにヘルパーウィルスを必要とし、ＨＢＶに感染した個体においてのみ見つかる。ごく最近になってようやくＣ型肝炎ウィルスが検出され、慢性Ｃ型肝炎感染の診断を容易にする抗体試験（抗ＨＣＶ）が開発された。しかしながら、この病気を直す治療法に対する緊急な要望がますます高まっている。

免疫学的方法による認識、原因となるウィルス並びにウィルスの生活環およびＤＮＡ配列に関してより詳しく研究された病気である慢性Ｂ型肝炎にも同じことが当てはまる。ウィルスＤＮＡが１０週間よりも長く存続している場合、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が６か月より長く存続している場合、患者はＢ型肝炎ウィルスの慢性保有者であると言われる。

はぼ３００００万の人が慢性Ｂ型肝炎にかかっていると思われ、その大部分が極東に住む人々である。それらの人が感染する主な危険性は、慢性的に感染した母親がウィルスを新生児に伝達するため、出産中または出産直後であると思われる。こうして感染した子供の９０％は、その後の人生の間に同じように慢性感染状態になるだろう。

西欧諸国では、より頻繁には人生の後期、幼児期または成人になってさえも、主に非経口的または性的伝染によって、感染が起こる。

誕生後のＢ型感染の場合には、感染者の５〜ｌＯ％のみが慢性保有者になる。しかしながら、転移されたウィルスは、感染者がウィルスを排除するのかまたはそれを体内に終生保持するのかのいずれかを示す明確な反応を招かない。従って、それは将来の身体状態を決定する免疫学的状態の問題であると思われる。

ＨＢウィルス粒子（ゾーン粒子）は、異なる構造タンパク質であるコアタンパク質と表面（Ｓ）タンパク質とから構成される。後者は、３つのＳ型領域のコード配列（その各々は生体内で翻訳を開始することができるＡＴＧ）リブレットで始まる）を包含する転写解読枠の翻訳産物である。それらの領域は、該分子の５′ から３′末端の順序でブレＳｌ、ブレＳ２およびＳと呼ばれる。このＯＲＦから６つのタンパク質産物：Ｓ領域のみから翻訳される主要タンパク質のグリコジル化形と非グリコジル化形（ｇｐ２７とｐ２４　）　（２２６アミノ酸）、１本または２本の多糖側鎖を有しブレＳ２とＳ領域によりコードされる中央タンパク質（２８１アミノ酸）、そして最後に、ブレＳｌ、ブレＳ２およびＳの翻訳により形成される大型タンパク質のグリコジル化形（ｇｐ２４）と非グリコジル化形（ｐ３９）　（ウィルスの抗原型に依存して３８９〜４００アミノ酸）が誘導される。コアタンパク質はＨＢｃＡｇとＨＢｅＡｇであり、後者のタンパク質はおそら＜　ＨＢｃＡｇのプロセシング産物であろう。

感染性ウィルス粒子であるゾーン粒子は、コアタンパク質と表面タンパク質の両方を含んで成り、一方フィラメントは６種の表面抗原の混合物から成る。Ｓペプチドは単独で凝集すると、完全に非感染性であるいわゆる２０　ｎｍ粒子を形成する。

ＨＢウィルスにより感染された患者は、慢性的ＨＢＶ感染状態であると見なされる前に幾つかの肝炎病期を通過する。感染直後は、血清中のＨＢｅＡｇの存在により特徴づけられる感染期がくるだろう。

ＨＢＶ複製の抑制にもかかわらず連続したＨＢｓ抗原血は、患者の細胞性ゲノム中に組み込まれたウィルスＤＮＡ配列の存在を指摘する。組み込まれたウィルス配列では、宿主細胞が完全なウィルスを合成することはできない。しかしながら、組み込まれたＨＢＶ配列を有する肝細胞はＨＢｓＡｇのみを生産することができ、これが患者の血清中に検出可能であり、慢性Ｂ型肝炎の指標である。おそらく、形質転換された肝細胞は細胞毒性Ｔ細胞により溶解されず、増殖して慢性持続性肝炎（ＣＰＨ）か慢性活動性肝炎（ＣＡＭ）のいずれかを誘発し、これが次いて肝硬変または一次性肝細胞癌に進行して患者の早熟化を引き起こし得る。

最近、慢性的にＨＢＶ感染している患者が内因性インターフェロン生産に欠損を示すことが確立された（　Ａｂｂら、、　１９８５：　Ｊ、　Ｍｅｄ。

Ｖｉｒｏｌ、１６．１７１−１７６　）　、　ニーれは、血清中（７）　ＨＢｅＡｇとＨＢＶ−ＤＮＡ　（７）存在により指摘されるような慢性Ｂ型肝炎を有する患者をインターフェロンα（ｒＦＮα）で治療することの理論的根拠であった。多数の患者の管理試行は、インターフェロンαの投与が対照と比較すると有意に増加されたＢ型肝炎ウィルス排除をもたらすことを示した。

しかしながら、誕生時またはその近辺に感染した患者は、この治療に応答してセロコンバージョンしないと思われる。この現象は、不運にも保有者の７５％を［ＦＮα療法できなくする。

現在も慢性Ｂ型肝炎に対するインターフェロンαの正確な作用形態は不明瞭なままである。それの抗ウィルス活性が感染細胞を感染から保護するかまたはＨＢＶ感染細胞におけるウィルスの転写、翻訳および複製を減少させるのかもしれない。インターフェロンは更に、Ｔ細胞、マクロファージおよびＮＫ細胞を活性化させそしてＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を誘導することにより免疫調節機能を有する。

慢性ＢＷ肝炎を治療する別のアプローチは、ウィルスの複製を抑制し、それによって宿主免疫系をウィルスを排除できるようにするのに十分な防御を付与する考えである。これは、慢性的にＨＢＶに感染した個体の治療に向けて抗ウィルス薬、例えばアデニンアラビノシドおよびアデニンアラビノシドモノリン酸を試験することに至る。しかしながら、患者の半数未満が、持続的または一時的セロコンバーション（ＨＢｅＡｇ”から抗ＨＢｅ“に）のいずれかにより、この治療法に応答した。それらの抗ウィルス薬の更に不利な面は免疫抑制性質である。

慢性保有者の治療用に試験されている他の薬剤としては、インターフェロンβ、アシクログアノシン（アシクロビル）、インターロイキン２、ステロイド、例えばプレドニソロン、およびそれらの組合せが挙げられる。しかし、それらのいずれもインターフェロンαでの治療よりも優れた結果を提供することができなかった。ステロイドの初期投与の後のＩＦＮαの投与を含む組合せ療法のみが、特定の患者において応答速度を増加させることができる。

従来技術から、慢性的にＨＢＶに感染したチンパンジーはＨＢｓＡｇ（破傷風毒素に結合させたもの）での治療でも抗ＨＢｓでの治療でも直すことができないことが知られている。更に、慢性的にＨＢＶ感染した患者をＳペプチドの投与により免疫処置することが試みられている。この処置はそれらの人において抗ＨＢｓ抗体形成さえも引き起こさなかった。

その上、定義によれば、Ｂ型肝炎ウィルスの慢性保有者は、血清中にＨＢｓＡｇが検出可能であることにより特徴づけられる。従って、本発明に係るウィルスＳペプチドのＴ細胞活性化エピトープを含んで成る組合せがＢ型肝炎ウィルスの慢性保有者において免疫化と最終的治癒を誘導できることは全く予想外であった。

上述した技術の現状を考慮すれば、本発明の目的は、完全な応答（即ち、ＨＢＶ複製の持続的阻害、ＨＢＶ　ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼの喪失、および患者の血清中のＨＢｅＡｇとＨＢｓＡｇの減少そして最終的にはそれらの消失）をもたらすウィルス性慢性肝臓病の治療のための有効な治療薬を提供することである。

本発明によれば、この目的は、ａ）　１または複数のエピトープの抗原性を媒介する少なくとも１つのポリペプチド配列とｂ）エピトープ配列ａ）を提示することのできる担体との組合せであって、ここで前記ポリペプチド配列ａ）は吸着、任意の化学結合または副原子価により担体ｂ）に結合することができる組合せにより達成される。

本発明は更に、慢性ウィルス性肝炎の治療用医薬の製造へのこの組合せの利用に向けられる。

本発明は更に、ａ）　１または複数のエピトープの抗原性を媒介する少なくとも１つのポリペプチド配列とｂ）エピトープ配列ａ）を提示することのできる担体との組合せであって、ここで前記ポリペプチド配列ａ）は吸着、任意の化学結合または副原子価により担体ｂ）に結合することができる前記組合せを患者に投与することによる、慢性ウィルス性肝炎の治療方法にも向けられる。

■または複数の異なるポリペプチドであることができるポリペプチド配列ａ）が直接的または間接的方法でＴ細胞活性化エピトープの抗原性を媒介することが重要である。本発明によれば、ポリペプチド配列ａ）は、任意のサブタイプ、特にａｄｗ、　ａｙｗ、　ａｄｒおよびａｄｙのＢ型肝炎ウィルスの１つのポリペプチドであるかまたは２つ以上のポリペプチドの組み合わせであることができる。

Ｂ型肝炎ウィルスに由来するそれらのペプチドは、ＨＢＶペプチドプレｓ１、ブレＳ２もしくはＳまたはＨＢＶコア抗原であることができる。

ポリペプチド配列ａ）として更に有用なものは、少なくとも６つの連続アミノ酸残基を含んで成る少なくとも１つのエピトープが保存されなければならないようなアミノ酸欠失により、またはポリペプチド配列ａ）のＮ末端に、Ｃ末端にもしくは配列中への挿入として更なるアミノ酸を付加することにより変更されている、上述のポリペプチドのいずれかまたは２以上のポリペプチドの組合せである。

しかしながら、これらの各場合、生物学的活性が保持されていることが不可欠である。

好ましくは、ポリペプチド配列ａ）はミリスチル化される。

適当な薬理活性を示すためには、本発明の組合せにおいてポリペプチド配列ａ）が担体ｂ）上に提示されることが必要である。この担体は、例えば疎水性ポリマー粒子、無機粒子または多糖粒子から成ることができる特定の物質から成る。好ましくは、担体ｂ）は、分泌時に粒子を形成する第二のポリペプチド配列であり、前記粒子は好ましくは少なくとも１０　ｎｍの直径を育する。

粒子を形成するポリペプチド配列ｂ）は、ＨＢＶ　Ｓペブチ、ド、ＨＢＶコア抗原、ＨＡＶコア抗原、ＨＡＶ表面抗原、ＨＩＶ表面抗原およびＨＩＶコア抗原並びにポリオウィルスの表面抗原から成る群から選ぶことができるポリペプチドの実質的部分または完全なアミノ酸配列であることが好ましい。粒子形成担体ｂ）として好ましいのは、ＨＢＶのＳペプチドおよび／またはコアペプチドである。

担体配列ｂ）として使用する時、上述のポリペプチドは、任意のアミノ酸削除、ｌもしくは複数のアミノ酸の置換、Ｎ末端かＣ末端のいずれかにおけるｌもしくは複数のアミノ酸の付加、またはポリペプチド配列ｂ）中への１もしくは複数のアミノ酸の挿入により変更することができるが、ただし、粒子形成能が保持されることを前提とする。好ましくは、ポリペプチド配列ｂ）はミリスチル化される。

担体ｂ）がポリペプチド配列であるならば、再配列ａ）とｂ）を次の相互作用：疎水的固定（ミリスチン酸により媒介される）、ジスルフィド結合形成、のうちの１つまたは複数によって結合することができ、または再配列をペプチド結合により連結して融合ペプチドを形成せしめることができる。後者の場合、所望によりポリペプチド配列ａ）とポリペプチド配列ｂ）との間にスペーサー配列を挿入することができ、このスペーサー配列はペプチド結合によって両ポリペプチドに結合される。

本発明は更に、慢性ウィルス性肝臓病の治療用医薬の製造に有用である、成る組合せをコードする組換えＤＮＡ分子を提供する。この組換えＤＮＡ分子は、少なくとも１つの第一のＤＮＡ配列、所望により第二、第三および／または第四のＤＮＡ配列を含んで成り、ここでｉ）前記少な（とも１つの第一のＤＮＡ配列は、上記で定義した少なくとも１つのポリペプチド配列ａ）をコードし、ｉｉ）前記第二のＤＮＡ配列は、粒子形成ペプチドの上記定義に従ったポリペプチド配列ｂ）をコードし、ｉｉ）前記第三のＤＮＡ配列はスペーサー配列をコードし、そしてｉｖ）前記第四のＤＮＡ配列は選択マーカーをコードし、そして前記ＤＮＡ配列は発現に不可欠なりＮＡ要素により調節され、所望により共通の読み枠を有する。

多くのアミノ酸が複数のトリプレットによって指定されるという事実を鑑みれば、上記で定義したペプチド配列ａ）およびｂ）をコードする、本発明に包含される幾つかのＤＮＡ配列が存在する。

この他に、本発明は、ヌクレオチドの３０％までが置換され得るという事実により上記で定義した組換えＤＮＡ分子とは異なる組換えＤＮＡ分子も更に包含する。

本出願の更なる目的は、上記組合せをコードする組換えＤＮＡ分子によりトランスフェクトされた宿主細胞を提供することであり、該宿主細胞は慢性的ＨＢＶ感染患者の治療に有用である。この宿主細胞は哺乳動物、酵母または細菌細胞であることができる。本発明の目的上、この宿主細胞が上記組合せ中に含まれるポリペプチド以外のいずれの霊長類血清タンパク質やヒト血清タンパク質も生産しないことが好ましい。

本明細書中で使用する用語ｒＨＢＶ　Ｓペプチド」は、ＨＢＶゲノムの全領域によりコードされるペプチドを言う。本明細書中で使用する用語ｒＨＢＶ　ブレＳ２ペプチド」は、ＨＢＶゲノムの完全なブレＳ２とＳ領域によりコードされるペプチドを言う。本明細書中で使用する用語ｒＨＢＶ　ブレＳｌペプチド」は、ＨＢＶゲノムの完全なブレＳｌ、ブレＳ２およびＳ領域によりコードされるポリペプチドを言う。本明細書中で使用する用語「エピトープ」は、指定のゲノム領域によりコードされる少なくとも６つの連続アミノ酸の配列を言う（例えば、ｒＨＢＶブレＳ２エピトープ」とはＨ，ＢＶゲノムのブレＳ２領域によりコードされる少なくとも６つの連続アミノ酸の配列を言う）。本明細書中で使用する用語「Ｔ細胞エピトープ」は、Ｔ細胞の表面上のレセプターと相互作用して免疫応答を増強するかあるいは免疫応答をもたらすエピトープを言う。本明細書中で使用する「抗原性」は、免疫応答を惹起せしめる能力（例えば抗原として作用する）、抗体産生を引き起こす能力（例えば抗原として作用する）および／または表面細胞レセプターと相互作用して免疫応答もしくは抗体産生を増強するような能力を意味する。

用語ｒＨＢＶ」は、文献（Ｐ、　Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｎａｔｕｒｅ第２８０巻、８１５頁（１９７９）　；　Ｇｅｒｌｉｃｈ、　ＥＰ−Ａ−８５１１１３６１；　Ｎｅｕｒａｔｈ、　ＢＰ−Ａ−８５１０２２５０〕中に記載されたウィルスの任意のサブタイプ、特にａｄｗ、　ａｙｗ。

ａｄｒおよびａｙｒを意味する。ｌまたは複数のエピトープの抗原性を媒介するポリペプチド配列ａ）を構成するそのペプチド配列の例を、配列表（配列番号１７〜２０．２２）に示す。

本発明の好ましい態様は、次の組合せであるニー　ＨＢ　Ｓ抗原粒子とブレＳｌペプチド、ブレＳ２ペプチドおよび／またはコアペプチドの特異的エピトープ（決定基）との組合せ； −ＨＢココア原粒子とブレＳｌペプチド、ブレＳ２ペプチド、Ｓペプチドおよび／またはコア抗原の特異的エピトープ（決定基）との組合せ； −Ａ型肝炎抗原粒子とＢ型肝炎Ｓペプチド、ブレＳｌペプチド、ブレＳ２ペプチドおよび／またはコアペプチドの特異的エピトープ（決定基）との組合せ。

本発明にとって好ましい組換えＤＮＡ分子は、ｌまたは複数のＴ細胞エピトープの抗原性を媒介するポリペプチド配列ａ）をコードする配列、および分泌時に１０　ｎｍ以上の直径を存する粒子を形成するポリペプチドｂ）をコードする配列（再配列とも適当なプロモーターの調節下にある）の存在により特徴づけられる。ａ）をコードする配列の例としては、配列表の配列番号１〜２４のもとに記載した配列を挙げることができる。ポリペプチド配列ｂ）をコードするＤＮＡ配列の例は、配列表の配列番号２５〜２７の配列のいずれかにより表される。

２４種の配列（配列番号１〜２４）のいずれかを配列表中の配列番号２５〜２７のもとに開示される配列と組み合わせることができ、この場合ａ−ｂとｂ−ａの両方の順序が包含される。

特に好ましい本発明の態様は、粒子形成物としての配列番号２６および／または２７の配列と組み合わせた配列番号２８のエピトープ（ＨＢＶの８１配列のアミノ酸９〜２８に相当する）の組合せを含んで成る。

本発明の組換えＤＮＡ構成物において使用する肝炎ウィルス配列は、制限断片の単離と連結、合成装置（Ｃｙｃｌ＋）１．３ｉｏ−３ｅａｒｃｈ）を使ったオリゴヌクレオチドの化学合成、およびＰＣＲ法による合成（Ｔ、Ｊ、　Ｗｈｉｔｅ、　Ｎ、　Ａｒｎｌｅｊｍ、　Ｈ，Ｅｉ、　Ｅｒ１ｉｃｈ、　１９８９．　Ｔｈｅ　ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｆｏｃｕｓ　５（６））を包含する任意の手段により作製または単離することができる。

好ましい組換えＤＮＡ分子は、合成オリゴヌクレオチドをＨＢＶゲノムのＳ領域からの５’　ＸｂａＩ　−ＢｇｌＩＩ　３’断片（配列番号２７）（これは完全なブレＳｔ−ブレ３２−３領域を含むＢｇｌ　ＩＦ　−Ｂｇｌ　ＩＩＨＢＶ断片から誘導される）に、または完全なＳ領域に連結せしめることにより作製した。

そのような構成物の作製に用いるオリゴヌクレオチドを丁の表１に要約する。

表■ 他の好ましいＤＮＡ分子は、ＰＣＲ法により調製されそしてＴ細胞エピトープをコードするコア配列を、ポリペプチド配列ｂ）として機能するＨＢＶのコア配列（配列番号２５）に連結せしめることにより作製した。それらの構成物の作製に用いるオリゴヌクレオチドを表Ｉｆ−１に与える。

表ｌｌ−２は、ＨＢＶゲノムの制限切断によりＴ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列を単離し、そして上記に定義したポリペプチド配列ｂ）をコードする配列に連結せしめた幾つかの例を示す。

本本　配列１まＧａ１ｉｂｅｒｔ、　Ｆ、ら（１９７９：　Ｎａｔｕｒｅ　２８１．６４６−６６０）およびＯｎｏ、　Ｙ、ら（１９８３：　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１（６）、　１７４７−１７５７）により発表されている。

表ｌｌ−３に特定の組換えＤＮＡ分子を列挙する。それらの作製方法は実施例の中でより詳細に記載する。

表ＩＦ−３ ’　ｅｇｐｔ＝大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子は、ポリペプチドａ）およびｂ）をコートする領域に加えて、選択マーカーをコードする追加のＤＮＡ配列を含んで成る。更に、それらは発現に不可欠な全ての有用な要素、例えばプロモーター配列、開始コドンおよびポリアデニル化配列を含んで成る。

適当なプロモーターの例は、宿主細胞として哺乳動物細胞を使った場合、メタロチオネイン（ＭＴ）　、Ｕ２およびＨ２にプロモーターである。酵母または細菌細胞を使う予定ならば、それぞれ適当な酵母および細菌プロモーター、例えばＧＣＮ４およびＧＡＬ　ｌ／１０プロモーター、または原核性ｔｒｐおよびｔａｃプロモーターをそれぞれ使うことができる。

本発明に係るポリペプチドａ）とポリペプチドｂ）の組合せを生産するためには、組換えＤＮＡ分子をトランスフェクションにより（哺乳動物細胞の場合）、形質転換により（酵母および細菌細胞の場合）または他の手段により、宿主細胞中に挿入する。組換えＤＮＡ分子を転写および翻訳することのできる任意の生物の細胞、例えば哺乳動物、細菌および酵母細胞を宿主として使用することができる。

本発明に係る適当な哺乳動物細胞は、例えば、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓細胞系）、３Ｔ３　、Ｃｌ２７およびＬ細胞（マウス繊維芽細胞系）、並びにＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞であり、それらはデヒドロ葉酸レダクターゼが陽性または陰性のいずれかである。

本発明の特定態様によれば、それぞれポリペプチド配列ａ）とポリペプチド配列ｂ）をコードする上記に定義した第一のＤＮＡ配列と上記に定義した第二のＤＮＡ配列が、異なる組換えＤＮＡ分子中に存在することも更に可能であり、その場合、それらの組換えＤＮＡ分子の両者により宿主細胞が同時トランスフェクトされる。

表■は、本発明のＤＮＡ構成物を与えるための適当なりＮＡ配列の組合せ方法についての大要を示す。この表に示されるいずれの構成物も、組み合わせて、宿主細胞中にトランスフェクトされると取り込まれて慢性ウィルス性肝炎の治療用医薬としての組合せ〔ポリペプチドａ）とｂ）を含んで成る〕を生産することのできるＤＮＡ配列を提供することができることに注意すべきである。Ｔ細胞エピトープ配列をコードするＤＮＡ配列は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｃｙｃｌｏｎ合成装置を用いて合成的に（ＳＹＮ）　、Ｐ　ＣＲ法により（ＰＣＲ）　、またはウィルスゲノムの制限酵素切断により（ＧＥＮＥ）、調製した。

慢性ウィルス性肝炎を有する患者の治療のために、ポリペプチド配列ａ）と担体ｂ）の組合せを、任意の種類の医薬組成物中に製剤することができる。該医薬組成物は、適当な希釈剤または医薬担体材料、例えば緩衝液を更に含んで成る。

投与は、任意の方法、即ち非経口（例えば静脈内または筋肉内）または経口（例えば活性物質を被包する細菌細胞を使うことによって）により行うことができる。

医薬組成物は、投与によって応答を惹起せしめるのに十分な濃度において上記の組合せを含んで成る。

図面の簡単な説明図Ｉは、プロモーター、粒子形成物配列および選択遺伝子をコードするＤＮＡ構成物を示す（実施例３／４に記載）。

図■は、プロモーター、完全なＨＢ−Ｓ−Ａｇを有するエピトープおよび選択遺伝子をコードするＤＮＡ遺伝子構成物を示す（実施例３／１８に記載）。

図■は、プロモーター、粒子形成物残基を有するエピトープおよび選択遺伝子をコードするＤＮＡ構成物を示す（実施例３／２１に記載）。

図■は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中のチンパンジーｌのＡＳＴ値を示す（実施例１０／ｌに記載）。

図■は、）Ｉｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中のチンパンジーｌの抗原値を示す（実施例１Ｏ／！に記載）。

図■は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅで３回追加免疫処置したチンパンジーｌの肝酵素ＡＴＬとＧＧＴ値を示す（実施例１Ｏ／２に記載）。

図■は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中のチンパンジー２の肝酵素ＡＬＴ、　ＡＳＴおよびＧＧＴ値並びに抗原値を示す（実施例１Ｏ／３に記載）。

図■は、未処置の対照チンパンジーについて測定された肝酵素を示す（実施例１０／３に記載）。

図■およびＸは、それぞれＨｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中の患者ｌの抗原価および抗体価を示す（実施例＋１に記載）。

図ＸＩおよびＸ■は、それぞれＨｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中の患者２の抗原価および抗体価を示す（実施例１１に記載）。

図Ｘ■およびＸＩＶは、それぞれＨｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中の患者３の抗原価および抗体価を示す（実施例１１に記載）。

本発明を次の実施例により更に詳細に説明する。

実施例１１、　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた分別沈澱ＨＢＶタンパク質を生産する培養物の上溝を収集し、２．４００一部分に分けた。各部分に１４４　ｇのＰＥＧ　６０００　（Ｓｅｒｖａ）を添加し、室温で２０分間攪拌しながら溶解させ、更に４°Ｃで６時間攪拌した。５００　ｍｉ容器中でＧＳ　３０−ター中で１０°Ｃにて９．０００　ｒｐｍ　（１５，０００Ｘｇ）で３０分間遠心することにより沈澱を分離した。上溝を収集し、１４４　ｇのＰＥＧ６０００を添加し、上記と同様に溶解させた。その溶液を４℃で３時間攪拌した。遠心を６０分間続けたこと以外は上記と同様にしてこの溶液から沈澱を回収した。

Ｚ　ゲルクロマトグラフィーＰＥＧ沈澱後に得られた物質を２０−のＰＢＳに再溶解し、Ａ−５ｍ　（ＢｉｏＲａｄ）上でのゲルクロマトグラフィーにかけた。カラム寸法は２５Ｘ　１０００ｍおよび４８０　ＷＬｌのベッド容積であった。典型的な分画操作では、ＰＥＧ沈澱したＨＢＶタンパク質１．０００μｇをｌθ〜１５ｒｄにおいて負荷し、そして６滴／分（１８ｒｄ／時）の速度でＰＢＳを使って溶出せしめた。

３ｍ上の画分を収集した。ＨＢＶタンパク質は最初のピークに溶出した。収集した画分をＣｓＣ１勾配にかけた。

３、ＣｓＣ１勾配中での沈降Ａ−５ｍ上でのカラムクロマトグラフィーでの最初のピークを包含し且つ予備精製されたＨＢＶタンパク質を含む約３０画分を約１００艷に集めた。この溶液をＣｓＣ１で１．３０　ｇ／ｃｃの密度に調整し、次いで５Ｗ２７／２８０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ）に合ったポリアロマ−試験管に移した。

１．３５　ｇ／ｃｃのＣｓＣ１溶液４ｒＲ１を下層しそしてその上に１．２５　ｇ／ｃｃの密度の溶液４ｄを、次いて１．２０　ｇ／ｃｃの密度の溶液４−を重層することにより、勾配を設定した。この勾配を１０℃にて２８．００Ｏｒｐｍにおいて５０時間実施し続けた。その後、勾配を分別し、１．２０　ｇ／ｃｃ密度の層中に浮いている精製ＨＢＶタンパク質を収集した。透析袋中での水に対する３回の透析により、この溶液を脱塩した。

実施例２ＨＢＶタンパク質の定量１、　ラジオイムノアッセイによる定量ＡＵＳＲ［Ａ　Ｉｆ−１２５ｒサンドイッチＪラジオイムノアッセイ（Ａｂｂｏｔから市販されている）において、Ｂ壓肝炎表面抗原に対するモルモット抗体（抗ＨＢｓ）がコーティングされたビーズを、血清、血漿または精製タンパク質および適当な対照と共にインキュベートした。

存在し得るＨＢｓＡｇを固相抗体に結合させた。未結合物質を吸引しそしてビーズを洗浄した後、ヒト　１２６１−抗ＨＢｓをビーズ上の抗体−抗原複合体と反応せしめた。次いでビーズを洗浄して未結合の＋２Ｊ−抗ＨＢｓを除去した。

）−抗ＨＢｓ　）ｌＢｓＡｇ）−抗ＨＢｓ−ＨＢｓＡｇ　”’Ｉ−抗ＨＢｓ）−抗ＨＢｓ　・ＨＢｓＡｇ　− ”’Ｉ−抗ＨＢｓビーズ上に残っている放射能をガンマシンチレーションカウンター中でカウントした。

２、ＥＬＩＳＡによる定量Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ　ＨＢｓＡｇ微量ｒサノドイッチ」アッセイ（Ｂｅｈｒｉｎｇから市販されている）において、ウェルを抗ＨＢｓでコーティングした。

血清、血漿または精製タンパク質と適当な対照をウェルに添加し、インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ＨＢＳＡｇ抗体を残余の抗原決定基と反応せしめた。未結合の酵素接合抗体を洗浄により取り除き、そして固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素と色素原との酵素触媒反応を希硫酸の添加により停止させた。色の強度は試料のＨＢｓＡｇ濃度に比例し、ＨＢｓＡｇ濃度は、未知試料の色の強度と付随の正および負の対照血清の色の強度との分光学的比較により得られた。

実施例３プロモーター、所望の抗原配列および選択遺伝子を含む本発明の遺伝子構成物の調製。

１、ＭＴプロモーターの単離プラスミドｐＢＰＶ−３４２−１２（ＡＴＣＣ３７２２４）をエンドヌクレアーゼＢｇｌＩ［とＢａｍＨＩて消化した。３つのＤＮＡ分子が生成した。着目の断片は、４．５ｋｂを存しメタロチオネインプロモーターとｐＢＲ３２２配列を含み、他の断片（２，Ｏｋｂおよび７．６ｋｂ）がら容易に識別可能である。

反応緩衝液２００μｌの総容量で各制限酵素１００単位を含む０．５μｇ／μｆ　ＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。消化の完結は、３７°Ｃで３時間のインキュベーション後に０．８％アガロースゲル上でのアガロースゲル電気泳動により確認した。反応は４μｌの０．５ＭＥＤＴＡの添加により停止させた。

調製用１．２％アガロースゲル電気泳動により４．５ｋｂ断片を他の断片から分離した。ＤＮＡをアガロースゲルからＤＥ−８１Ｗｈａｔｍａｎ濾紙上に溶出せしめ、その濾紙から高塩緩衝液中でＤＮＡを取り出した。

フェノール−クロロホルム抽出と２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。

２、ＨＢＶコア抗原をコードする１、８ｋｂ断片の連結ＨＢＶ含有ＤＮＡからＨＢＶ−７アコード領域を含む１．８ｋｂのＢａｍＨ［−ＢａｍＨ［断片を単離した。この断片を、ＭＴプロモーターとｐＢＲ残基を含む４．５ｋｂ断片（ｌに記載）と−緒に連結せしめた。

２μβの１．８ｋｂ断片を３μｌの４．５ｋｂ断片と混合し、２単位のＤＮＡリガーゼと２ｍＭのＡＴＰを含む総容量１０μｌの連結緩衝液中で１４°Ｃにて一晩連結せしめた。

この連結混合物をＤＮＡ取り込みのためコンピテント細菌細胞懸濁液１５０μ！に添加した。ＤＮＡ取り込み後、５０μｌ／−のアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液５０〜３００μβの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレートを３７°Ｃで一晩インキユベートした。１つの単離した細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。

３、　所望のプラスミドを含む細菌コロニーのスクリーニング単一コロニーを爪楊枝で取り、ＬＢ−アンピシリン培地の入った試験管（５イ）に移した。この試験管を迅速振盪環境下で３７°Ｃにて一晩インキュベートした。各増殖細菌懸濁液のミニプラスミド調製物を作製した。種々の生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ■ての消化により確かめた。２つの分子、４００　ｂｐ断片と５．９ｋｂ断片か期待された。消化物をアガロースゲル電気泳動により分析した。

細菌細胞からプラスミドＤＮＡを単離した。

４、　ネオマイシン選択マーカーの挿入上記の３から得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ［での消化により直鎖状にした。５０μｌの総容量およびｌμｇ／ μｌプラスミドＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。５０単位のＥｃｏＲ［を添加し、３７°Ｃて３時間インキュベーションした後でアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。１μ！の０．５Ｍ　ＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、そして最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウムと３〜４容のエタノールを用いて一８０°Ｃにて３０分間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを５０μｌの蒸留水に溶かした。

直鎖状プラスミド２μｌを、メタロチオネインプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むＤＮＡ断片〔プラスミドｐＭＴ−ｎｅｏ−Ｅ（ＡＴＣＣ／Ｅｘｏｇｅｎｅから入手可能）からエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩでの消化により３．９ｋｂ断片として単離したもの〕３μβと混合し、−緒に連結せしめた。単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。

５、Ｕ２プロモーター配列を含む断片の単離プラスミドｐＵＣ−８−４２（Ｅｘｏｇｅｎｅから入手可能）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＡｐａ［て消化した。２つのＤＮＡ分子が生成した。

着目の断片は、３４０　ｂｐを有するＵ２プロモーターを含み、他方の断片（３１６０ｂｐ）から容易に検出可能である。

反応緩衝液２００μｌの総容量で各制限酵素１００単位を含む０．５μｇ／μｌのＤＮＡ最終濃度において反応を実施した。消化の完結は、３７℃で３時間のインキュベーション後に０．７％アガロースゲル中でのアガロースゲル電気泳動により確認した。４μｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡの添加により反応を停止させた。調製用１．２％アガロースゲル電気泳動により３４０　ｂｐ断片をプラスミドＤＮＡから分離した。ＤＮＡをアガロースゲルからＤＨ−８１Ｗｈａｔｍａｎ濾紙上に溶出せしめ、その濾紙から高塩緩衝液中でＤＮＡを取り出した。フェノール／クロロホルム抽出と２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。

６、　ポリリンカープラスミド中へのプロモーター配列含有断片の挿入ポリリンカー配列（次の制限部位を含む：ＥｃｏＲ１，５ａｃｋ、　Ｓｍａ［。

Ａｖａ［、ＢａｍＨ［、ＢｇｌＩ［、５ａｌｔ、　Ｐｓｔｌ、　ＨｉｎｄＩ［）を含むプラスミドｐｓＰ１６５　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃから入手可能）を制限酵素ＥｃｏＲ［により直鎖状にした。５０μｌの総容量においてｌμｇ／μｌプラスミドＤＮＡの最終濃度で反応を実施した。５０単位のＥｃｏＲ［を添加し、そして３７°Ｃにて３時間のインキュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。１μｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウムと３〜４容のエタノールを用いて一８０℃にて３０分間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを５０μｌの蒸留水に溶かした。

プラスミドＤＮＡ　２μｌをＵ２プロモーター配列を含むＤＮＡ断片１０μｌと混合し、２単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼと２ｍＭのＡＴＰを含有する総容量２５ μｌの連結緩衝液中で１４°Ｃにて一晩連結せしめた。その後、フェノール／クロロホルム抽出に次いで２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製し、そして１０μ！の蒸留水に溶解させた。生成したＥｃｏＲ［とＡｐａｌ粘着末端を平滑末端に変換して連結させなければならなかった。次のようにしてマングビーンヌクレアーゼとの反応により粘着末端を平滑末端に変換した：反応緩衝液中のＤＮＡ（ｌμｇ／μｌ濃度）２５μｌに２０単位の酵素を添加し、１％グリセロールの最終濃度と３５μｌの最終反応容量を与えた。３０℃にて３０分間のインキュベーション後、フェノール−クロロホルム抽出に続く２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。このＤＮＡを再度５μｌの蒸留水に溶かした。生じた平滑末端を、上記で使用したものより１０倍高いＴ４リカーゼと２　ｄのＡＴＰを含む１５μｌの反応液中で１４°Ｃにて一晩一緒に連結せしめた。

この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため１５０μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。ＤＮＡ取り込み後、５０μｌ／−のアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液５０〜３００μｌの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレートを３７°Ｃで一晩インキユベートした。単一の単離した細菌コロニーを、所望のＵ２プロモーター断片を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。得られたプラスミドを細菌細胞から単離し、制限酵素分析により特徴づけた。

７、　合成オリゴＤＮＡヌクレオチド８９（配列番号：３０）とＭＴプロモーター断片（４，５ｋｂ）との連結ＭＴプロモーターとｐＢＲ残基を含む４．５ｋｂ断片（ｌに記載）を合成オリゴヌクレオチド８９（配列番号＝３０）と−緒に連結せしめた。この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため１５０μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単一の単離した細菌コロニーを、所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲ［とＸｂａ　［での消化により確かめた。１つは２、Ｏｋｂで１つは２．６ｋｂの２つの分子が期待された。

８、合成オリゴヌクレオチド１０１　（配列番号＝３２）とプラスミド（７に記載）との連結プラスミド（７に記載）をＢｇｌＩ［とＢａｍＨ［で消化し、１３ヌクレオチドの断片を取り出した（ｌに記載）。第一のオリゴヌクレオチド８９（配列番号＝３０）を含む生成断片を、Ｂｇｌ　Ｉｆ　−Ｂａｍ旧断片であるオリゴヌクレオチド１０１　（配列番号：３２）と連結せしめた。ＤＮＡ取り込み後、単細胞を所望のプラスミドについてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｂａｌまたはＥｃｏＲＩ　とＢｇｌｌＩでの消化により確かめた。

９、合成りＮＡオリゴヌクレオチド９９（配列番号：３１）と４．５ｋｂ断片（ｌに記載）との連結４．５ｋｂ断片（Ｂｇｌ　Ｉｆ　−Ｂａｍ）１１）をＤＮＡオリゴヌクレオチド９９（配列番号：３１）と連結せしめた。様々なりＮＡを含む単一細菌コロニーのスクリーニング後、所望のプラスミドをＥｃｏＲＩでの消化（１，９ｋｂと２．７ｋｂの２断片を生じる）とＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨでの陽性の線状化により特徴づけた。

次いでこの新規プラスミドをＰｓｔｌとＢａｍＨ［で消化した。ｐＢＲ残基、ＭＴプロモーターおよびオリゴヌクレオチドを含む２．６ｋｂ断片と、２、ＯｋｂのｐＢＲ残基の２つの分子が期待された。２．６ｋｂ断片を単離した。

１０．９に記載のプラスミドの２．６ｋｂ断片とプラスミド（８に記載）から単離した断片との連結ＤＮＡオリゴヌクレオチド８９と１０１　（それぞれ配列番号３０と３２）を含むプラスミド（８に記載）をＰｓｔ［とＢｇｌＩＩで消化した。２断片が期待された。１つはｐＢＲ残基とＭＴプロモーターを含む２．５ｋｂ断片で、もう１つはｐＢＲ残基と両方のオリゴを含む２．２ｋｂ断片であった。

この２．２ｋｂ断片を、８に記載のｐＢＲ残基、ＭＴプロモーターおよびオリゴ９９（配列番号＝３１）を含む２．６ｋｂ断片と連結せしめた。

所望のプラスミドについてスクリーニングした後、それをＢｇＩｎ−Ｘｂａ　［を使った制限エンドヌクレアーゼ消化により特徴づけた。オリゴＤＮＡヌクレオチドの２７０　ｂｐ断片およびＭＴプロモーターとｐＢＲの４．５ｋｂ断片の２断片が期待された。

１１、２．３　ｋｂ　ＨＢＶ　ＢｇｌＩ［−ＢｇｌＩ［断片の連結ＨＢＶ含有ＤＮＡから、ＨＢＶ　ブレ＄１、ブレＳ２およびＳ）−ド領域を含む２．３ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　Ｉ［断片を単離した。この２．３ｋｂ断片を、メタロチオネインプロモーターを含む４．５ｋｂ断片（１に記載した通りに得た）と連結せしめた。

２μｌの２．３ｋｂ断片を３μｌの４．５ｋｂ断片と混合し、そして２単位のＴ４−１）ＮＡリガーゼと２ｍＭのＡＴＰを含む総容量１０μｍの連結緩衝液中で１４°Ｃにて一晩連結せしめた。

この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため１５０μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。ＤＮＡ取り込み後、５０μｌ／ｒｔｄ！のアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液５０〜３００μｌの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレートを３７℃で一晩インキユベートした。単離した単一の細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。

１２．８ＢＶコアエピトープによるＨＢＶ遺伝子配列の一部分の変換上記の１１から得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼＢｇｌＩ［とＸｂａ　Ｉで消化した。１つが５５０　ｂＰ断片で１つが６．２５ｋｂ断片である２つの分子が期待され、アガロースゲル電気泳動後に６．２５ｋｂ断片を単離した。

６．２５ｋｂ断片を、ＨＢＶコア遺伝子のエピトープ部分をコードするｌＯに記載のプラスミドの２７０　ｂｐ断片（上記と同様なりｇｌＩ［とＸｂａ　［での消化および断片の単離後）と連結せしめた。

この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため１５０μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単離した単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラスミドをＢａｍＨＩでの消化により確かめた。９５０　ｂｐ、　４５０　ｂｐおよび５．１５０ｂｐ断片の３分子が期待された。

１３、「ビヒクル」プラスミドの調製プラスミド（１１に記載）をＥｃｏＲＩ　とＸｂａ　［で消化した。２．４５０　ｂｐ断片と４．３５０　ｂｐ断片の２分子が期待され、ゲル電気泳動後４，３５０　ｂｐ断片を単離した。

、：）４．３５０　ｂｐ断片を、ＡＴＧカラｘｂａ１部位までのＨＢｖ−８遺伝子の全ＤＮＡ配列をコードし、ＡＴＧがＡＴＡに変更されているＤＮＡオリゴヌクレオチド３９（配列番号：２９）と連結せしめた。

１４、完全なＨＢＶ−８遺伝子の上流のコアエピトープ次いでこの「ビヒクル」プラスミドをＰｓｔｌとＸｂａｌで消化すると、６００　ｂｐプラスミド残基と３．８５０　ｂｐ断片の２分子が期待され、後者の断片を単離し、１０に記載のプラスミドの消化後に単離された２、　８００ｂｐ　（２，７００ｂｐ）のＰｓｔｌ−Ｘｂａｌ断片と連結せしめた。

所望のプラスミドについてスクリーニングした後、それをＥｃｏＲＩとＸｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲｒ　とＢｇｌＩ［とＢａｍＨＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化により特徴づけた。

＋５．選択マーカーの挿入前記プラスミド（１４に記載）をＥｃｏＲｒにより直鎖状にした。５０μ！の総容量およびｌμｇ／μｌのプラスミドＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。５０単位のＥｃｏＲ［を添加し、３７℃で３時間インキュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。

１μｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、そして最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウムと３〜４容のエタノールを用いて一８０°Ｃにて３０分間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを５０μｌの蒸留水に溶かした。

直鎖状プラスミド２μｌを、メタロチオネインプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むＤＮＡ断片（４に記載）３μ！と混合し、−緒に連結せしめた。単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングし、プラスミドを単離しそして特徴づけた。

上述した各遺伝子構成物は、ＥｃｏＲｌ　とＢｇｌＩＩでの消化後、ＭＴプロモーター含有ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ　とＢｇｌ　ＩＩによる消化後に単離されたＵ２プロモーター含有ＤＤＮＡ用によって置き換えることにより、Ｕ２プロモーターを使って作製することもできる。

１６、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｅｇｐｔ）選択遺伝子の単離プラスミドｐＭＳＧをＢａｍ）Ｉ　Ｉ　とＢｇｌＩ［で消化した後、ｅｇｐｔ選択遺伝子を含む断片（１，８ｋｂ）を単離し、そしてＭＴプロモーターを含む４．５ｋｂ断片（ＢｇｌＩ［−ＢａｍＨＩ、１に記載）と連結せしめた。

所望のプラスミドについてスクリーニングした後、プラスミドを単離し、精製し、そしてＢａｍ旧部位からＥｃｏＲ１部位への変換により完成させた。

１７、ＰＣＲ法による所望のＤＮＡ配列の単離１つのＤＮＡ断片（４００ｂｐ）をゲル電気泳動後に単離した。その断片は、プライマーとして特定のオリゴヌクレオチド１３１と１３２（配列番号：３３と３４）を使ってＰＣＲ法（実施例５に記載）により作製された。

このＤＮＡ断片をエンドヌクレアーゼＢａｍ旧とＸｂａ　Ｅで消化し、次いでゲル電気泳動により精製した。単離したＰＣＲ断片を、プラスミド（１３に記載）からＢｇｌＩ［とＸｂａ　［での消化後に単離された６、２５ｋｂ断片と連結せしめた。ＤＮＡの取り込みと細菌の形質転換後、単一の細菌コロニーを所望のプラスミドについてスクリーニングした。

１８、選択マーカーの挿入プラスミド（１７に記載）に選択遺伝子（１５に記載）を付加することによりプラスミドを完成させた。

１９、　８２にプロモーターの単離ｐＳＰ６５Ｈ２（Ｅｘｏｇｅｎｅから入手可能）からＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　ＩＩ断片（２ｋｂ）として８２にプロモーターを単離した。

上述の全ての構成物において、どのプロモーターもＥｃｏＲ［／ＢｇｌＩＩ断片として交換することができる。

２０．８ＢＶ遺伝遺伝列配一部の変換上記のＩＩから得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼＢｇｌｌＩとＸｂａ　Ｉで消化した。２分子が期待され、その１つが６．２５０　ｋｂ断片であり、その断片をアガロースゲル電気泳動後に単離した。

６．２５０　ｋｂ断片をオリゴＤＮＡヌクレオチド２３（配列番号：２８）と連結せしめた。この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため１５０ｕｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単一の単離した細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌクレアーゼεｃｏＲＩとＢｇｌＩＩでの消化により確かめた。１つが１．９ｋｂで１つが４．４５０　ｋｂの２分子が期待された。

２１、　ｅｇｐｔ選択マーカーの挿入前記プラスミド（２０に記載）をＥｃｏＲ［により直鎖状にした。１００μｌの総容量および０．６μｇ／μｌプラスミドＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。６０単位のＥｃｏＲＩを添加し、３７°Ｃで３時間インキュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。

２μβの０．５Ｍ　ＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、そして最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウムと４容のエタノールを用いて一８０℃にて１時間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを５０μｌの蒸留水に溶かした。

直鎖状プラスミド２μｌを、メタロチオネインプロモーターとｅｇｐｔ選択遺伝子を含むＤＮＡ断片（３，７ｋｂ）　（１６に記載＞３ｕｌと混合し、−緒に連結せしめた。単一のコロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。上記と同じ方法で表■に記載の各遺伝子構成物を調製することかできる。

実施例４本発明の構成物を用いた哺乳動物細胞のトランスフェクション本発明の構成物によりコードされるＨＢＶペプチドの相当量の分泌を獲得するためには、本発明のＤＮＡ構成物を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトせしめなければならない。二段階で（即ち、各構成物について別々のトランスフェクション）または一段階で（即ち、画構成物の調製物を使った１回のトランスフェクション）同時トランスフェクションを実施した。２つの構成物上での異なる選択マーカーの使用により、またはイムノアッセイによる画構成物の発現産物の分泌の検出により、同時トランスフェクションを確かめた。

あるいは、本発明のＨＢＶペプチド配列をコードする配列と、完全なＳまたはコアまたはＨＡＶタンパク質をコードする別の配列とを、単一構成物中に組み合わせることができる。

実施例５ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ポリメラーゼ連鎖反応は、既知ゲノム配列の選択した領域の特定のＤＮＡヌクレオチド配列を試験管内で百万倍以上に増幅することが可能である（Ｔｈｏｍａｓ　Ｊ、　Ｗｈｉｔｅ、　Ｎｏｒｍａｎ　Ａｒｎｌｅｉｍ、　Ｈｅｎｒｙ　Ａ。

Ｅｒ１ｉｃｈ　１９８９：　Ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｆｏｃｕｓ。

第５巻、第６号；Ｓ、ＫｗｏｋおよびＲ，Ｈｊｇｕｃｈｉ　１９８９：　Ａｖｏｉｄｉｎｇｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ　ｗｉｔｈ　ＰＣＲ，Ｎａｔｕｒｅ、第３３９巻、　２３７−２３８頁）。

細胞から単離したＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを処理してそれの相補的鎖を分離する。次いでそれらの鎖を、Ｘヌクレオチド（ここでＸは通常５０〜２．０００塩基対である）により隔てられた配列とマツチするように化学的に合成された過剰の２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド（各々長さ２０〜２５塩基対）とアニールせしめる。

この２つのオリゴヌクレオチドは、２つのオリゴヌクレオチドと一致する配列の間でＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼにより触媒される試験管内ＤＮＡ合成のための特異的プライマーとして働く。

２つのプライマーオリゴヌクレオチドが正しい配列を含むならば、５′と３′に新たな消化部位を造成することが可能である。

複数回の反応サイクル後、所望の長さの多量のＤＮＡ断片が得られ、それをゲル電気泳動により精製し、そして制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動により特徴づけた。増幅された精製ＤＮＡ断片を他の断片、即ちプラスミドと連結せしめるために使った。

ＰＣＲ−ＤＮＡ断片は平滑末端で増幅された。粘着末端を与えるために（連結操作のため）、該断片を所望のエンドヌクレアーゼで消化し、再度精製しなければならない。

ＰＣＲ反応は２０〜３０サイクル間回転するだろう。ｌサイクルは、異なる反応時間と異なる反応温度（ＰＣＲ熱循環器により制御される）により３段階に分けられる。第一段階は鋳型ＤＮＡの「変性」（１分／９５°Ｃ）であり、第二段階は鋳型ＤＮＡとプライマーの［ハイブリダイゼーションＪ　（１分１５５°Ｃ）であり、第三段階は「重合」（２分／７２°Ｃ）である。

１回のアッセイ用の最終容量は例えば３０μｌであり、これは次の最終濃度を含む：　ＰＣＲ緩衝液（ＩＸ）、４種のヌクレオチド各２００μＭを有するヌクレオチド混合物、２つのプライマー各々を３０１ｔｉあたり２００　ｎｇ、　ａｑｕａ　ｂｉｄｅｓｔ　３０μｌあたり０．５単位のＴａｑポリメラーゼ。

実施例６タンパク質を分泌するトランスフェクト細胞の培養受容細胞（ＡＴＣＣから入手可能なＣｌ２７またはＣＨＯ細胞）を、第１日にベトリ皿中の標準増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清、グルコースおよびグルタミン）中に接種した（１ −２　ＸＩＯ＠細胞／皿、φ１０ａｎ）。

翌日、培地を除去しくＤＮＡ沈澱を細胞上に添加する４時間前）、細胞をＩＸＰＢＳで２回洗浄した。次いでＦＣ３を含まないＤＭＥＭ　Ｓ−を添加し、４時間後にＤＮＡ沈澱（下記の如く調製したもの）を細胞に添加した。再び４時間後、培地を除去し、３−のグリセロール混合物（２ＸＴＢＳ緩衝液５０　ｙＪ、グリセロール３０　ｒｎｌ、蒸留水１２０ｒｎｌ”）を添加した。３７°Ｃて３分間のインキュベーション後にグリセロール混合物を即座に除去し、そして細胞をＩＸＰＢＳで洗浄した。ｌＯ％ＦＣ８を含むＤＭＥＭ　８−中で細胞を一晩培養した。

４８時間後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０，０２５％トリプシン＋１ｍＭＥＤＴＡ）で処理することにより細胞を皿から回収した。その後、トリプシン−ＥＤＴＡを除去するために細胞をＩＸＰＢＳで洗浄し、ｌＯ％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に懸濁し、そして２４コスタ−ウェルプレートに分配した（１つの皿からの細胞を４枚の２４ウエルプレートに）。

細胞が十分に増殖した時、選択培地を添加した〔例えば、濃度０．５〜１■／− のネオマイシンまたは、キサンチン（２５０μｓ／ｒｄ）、ヒボキサンチン（１５μｇ／ｍｌ）もしくはアデニン（２５μｇ／１ｎｉ）　、チミジン（１０μｇ／ｍ／）　、アミノプテリン（２μｇ／ｙｎｌ）、ミコフェノール酸（２５μｇ／ｒｄ）　）。最初の増殖中の細胞コロニーは２週間後に認められた。

１０μｇのプラスミドＤＮＡと２０μｇの担体ＤＮＡ　（サケ***ＤＮＡ１子ウシ胸腺ＤＮＡ）に、Ｔε緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ７，０５）を４４０μｌの最終容量になるように添加し、そして６０μｌの２Ｍ　ＣａＣ１ｚと混合した。次いで等量の２　ｘＴＢＳ　（Ｈｅｐｅｓ　５０ｍＭ、　ＮａＣｌ２８０ｍＭ、　ＮａＪＰ０４１．５ｍＭ、　ｐＨ７，０５）を添加し、よく混合した。沈澱溶液を３７°Ｃで３０分間インキュベートし、そしてトランスフェクトせしめる予定の細胞に直接添加した。

実施例７精製粒子のアジュバントの調製無菌の食塩溶液中に懸濁した所望の濃度の抗原に、１　：　１０，０００容のチメロプール、ｌ／１０容の濾過滅菌法０．２Ｍ　ＫＡＩ（ＳＯ−）！・１２　Ｈ２Ｏを添加した。無菌のＩＮ　ＮａＯＨでｐＨを５．０に調整し、そして懸濁液を室温て３時間攪拌した。ミョウバン沈澱した抗原を２．００Ｏｒｐｍで１０分間の遠心により回収し、ｉ　：　ｔｏ、ｏｏｏチメロゾールを含む無菌の標準食塩溶液中に再懸濁し、そして無菌条件下でアリコートに分けた。

ＨＢココア原分泌細胞の細胞上清を収集し、限外濾過により濃縮した。この濃縮物をＢｅｃｋｍａｎ　５Ｗ２８０−ター中で４℃にて２０．００Ｏｒｐｍで１５分間の遠心により清澄化した。

Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ２８０一ター中４°Ｃにて２８．００Ｏｒｐｍで２４時間のショ糖密度勾配遠心（０〜４５％ショ糖）により粒子形成を試験した。勾配を分画し、１両分ずつをＥＬ［ＳＡにより分析した。

実施例９下表は、本発明の免疫原性粒子の後述のＥＬ［ＳＡ分析の幾つかの結果を与える。

表■は、抗ブレＳ１モノクローナル抗体ＭＡ　１８／７と抗ＨＢｓモノクローナル抗体Ｇ０２２を用いた、プレＳ１エピトープとＳ領域を含む本発明のＨＢＶ配列構成物から生産された精製ＨＢｓ抗原粒子のＥＬＩＳＡ表■は、ＣｓＣ１密度勾配後に収集した画分（２１）を示す。

表ＩＶ−２表Ｖは、ＨＢココア対するポリクローナル抗体とＨＢ−Ｓ−Ａｇに対するモノクローナル抗体Ｇ０２２を用いた、本発明の任意のＨＢココア列構成物から生産された精製ＨＢココア原粒子のＥＬ［ＳＡデータを示す。

実施例１０チンパンジーにおけるＨｅｐａ−Ｃａｒｅの投与実験Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅは、特定の配合比（５０：　５０）においてＢ型肝炎表面抗原（ＳｌおよびＳ）を提示する粒子であり、肝炎ウィルスの慢性保存者の治療に使われる。

実験ｌＢ型肝炎保存チンパンジー１を、第０．　４および８週に注射１回あたり１８μ ｇの用量においてＨｅｐａ−Ｃａｒｅで処置（筋肉内）した。

肝酵素（図■）並びにＢ型肝炎抗原レベル（図Ｖ）をモニタリングした。

実験２上記処置後のチンパンジー１を第３０．３４および３８週に追加免疫処置した。

その結果を図■に示す。

実験３チンパンジー２をＨｅｐａ−Ｃａｒｅで処置した。ただし、チンパンジー１とは異なり、静脈内に与えた。用量は２■であった。結果を図■に示す。

対照チンパンジー３からも肝酵素をモニタリングし、その結果を図■に示す。

実施例１１Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅての処置：（定義については実施例ＩＯを参照のこと）患者１　（男性、年齢６５才、病歴２年）：Ｂ型肝炎パラメーター：　ＨＢｓＡｇ　陽性抗ＨＢｓ　陰性ＨＢｅＡｇ　陰性抗ＨＢｅ　陽性抗ＨＢｃ　陰性を、第０．　１．　６および７か月にＨｅｐａ−Ｃａｒｅで処置（ｉ、ｍ、）　Ｌ、た。

抗原および抗体測定の結果を図■とＸに与える。

患者２（女性、年齢４８才、病歴１２年）：Ｂ壓肝炎パラメーター：　ＨＢｓＡｇ　陽性ＨＢｅＡｇ　陰性抗ＨＢｓ　陰性抗ＨＢｅ　陽性抗ＨＢｃ　陽性を、第０．　Ｉおよび６か月にＨｅｐａ−Ｃａｒｅで処置（ｉ、ｍ、）　Ｌ、た。抗原および抗体測定の結果を図ＸＩとＸ■に与える。

患者３（女性、年齢４１才、病歴５年）：Ｂ型肝炎パラメーター：　ＨＢｓＡｇ　陽性ＨＢｅＡｇ　陰性抗ＨＢｓ　陰性抗ＨＢｅ　陽性を、第０．　Ｉ、２および５か月にＨｅｐａ−Ｃａｒｅで処置（ｉ、ｍ、）　シた。

ＨＢｓ抗原および抗ＨＢｓ抗体の測定値を図Ｘ■とＸＩＶに示す。

配エーノＬ−−人配列番号＝１配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　５５８　ｂｐ鎖の数ニー末鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア直接の起源：　ＰＣＲ増幅 λτＧＧ入ＣＡＴＴ　ＧＡＣＣＣＴ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＧＣＴＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＣＴＣＴＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＧＡＣＴＴＣＴＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＣＧＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＴＡ　ＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＡ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　７．％Ｔ　ＣＧＡ　Ｇ減　ＧＣＣＴＴＡ　ＧＡＧ　ＴＣＴＣＣＴ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＴＧＣＴＣＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣＣＡＴ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＣＴＣＡＧＧ　鏝　ＧＣＣＡＴＴ　ＣＴＣＴＧＣＴＣＧ　ＧＧＧ　Ｇ八　ＴＴＧ　ＡＴＧλＣＴ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＡＣＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　減Ｔ　λｘ’ｒ　ＴＴＧ　Ｃ）−１ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＣＡＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＧＴＡ　ＧＴＣλλτ　ＴλＴＧＴＴ　減Ｔ　ＡＣＴ　ＡＡＣＡＴＧ　ＧＧＴ　ＴＴＡ　、ＩＡＧ　ＡＴＣＡＧＧ　Ｃ菖ＣＴλ　丁ＴＧ　ＴＧＧ　ＴＴＴ　ＣＡＴ　ＡＴＡ　ＴＣＴ　ＴＧＣＣＴＴ　ＡＣＴ　ＴＴＴＧＧλ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＧＴＣτＣＴττＣＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＣＧＣＡＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣＴＡＴＡＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　入ＡＴ　ＧＣＣＣＣＴ　ＡＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＣＴＴＣＣＧ　Ｇ触　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＧＡＣＣにＡＧＧＣＡＧＧ　ＴＣＣＣＣＴ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＣＴ　ＣＣＣＴＣＧ　ＣＣＴＣＧＣＡＧＡ　ＣＧＴ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＧ　ＣＣＧ　ＣＧＴ　ＣＧＣＡＧＡＡＡＡ　ＴＣＴ　ＣＬＩ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＧＴ　ＴＡＧ配列番号＝２配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　５０４　ｂｐ鎖の数ニー末鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア直接の起源：ＰＣＲ増幅ＡＴＧ　ＧＡＣλττ　ＣλＣＣＣＴ　τλτ　ＡＡＡ　Ｏλ入　丁τＴ　ＧＣＡ　ＧＣＴＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＣＴＣＴＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＧＡＣＴＴＣＴＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＣＧＴＡ　ＣＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＴＡ　ＱＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＡ　ＧＣＴ　Ｃ″：Ｇ　ＴＡＴ　ＣＧＡ　ＧＡＡ　ＧＣＣＴＴＡ　ＧＡＧ　ＴＣＴＣＣＴ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＴＣＣＴＣＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣＣＡＴ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣＡＧＧ　Ｃ）Ａ　ＧＣＣＡＴＴ　ＣＴＣＴＣＣＴＣＧ　ＧＧＧ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＡＴＧλＣＴ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＡＣＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ττＧＣＡＡＧＡＴ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＣＡＧＡ　（ａλＴＣτλ　ＧＴＡ　ＧＴＣＡＡＴ　ＴＡＴＧττ　ＡＡＴ　ＡＣＴ　ＡＡＣＡＴＧ　ＧＧｒ　ＴＴＡ　ＡＡＧ　ＡＴＣＡＧＧ　ＣＡＡＣＴＡ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　τττ　ＣλＴＡτλ　ＴＣＴ　ＴＧＣＣＴＴ　ＡＣＴ　τττＧＧλ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＣＧＣＡＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣＴＡＴＡＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　）２Ｔ　ＧＣＣＣＣＴ　ＡＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＣＴＴＣＣＧ　Ｇ触　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＧＡＣＣＧＡＧＧＣＡＧＧ　ＴＣＣＣＣＴ　ＡＣＡ　λハλＧＡ　ＡＣＴ　ＣＣＣＴＣＧ　ＣＣＴＣＧＣＡＣＡ　ＣＧＴ配列番号：３配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　５０４　ｂ［）鎖の数ニー末鎖トポロジー　直鎖状配列の種類・ゲノムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア直接の起源：　ＰＣＲ増幅ＡＴＧ　（ａ入ＣλτＴＱλＣＣＣＴ　τλτ　λ入入　ＧＡＡ　ＴＴＴ　Ｇ（、λ　ＧＣＴＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　丁τＡ　ＣＴＣＴＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　こＣＴ　ＴＣＴ　ＧＡＣＴＴＣＴＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＣＧＩＡ　００人　Ｇλ ＴＣτＣＣＴＡ　ＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＡ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＴＡＴ　ＣＣＡ　Ｃ入λ　ＧＣＣττＡＧλＧ　ＴＣＴＣＣＴ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＴＣＣＴＣＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣＣＡＴ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣＡＧＧ　ＣＡＡ　ＧＣＣＡＴＴ　ＣＴＣＴＧＣＴＧＧ　ＧＧＧ　ＣＡＡ　ＴＴＧ　ＡＴＧＡＣＴ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＡＣＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＴＴＧ　Ｏ人入ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＣＡＣＡ　ＣＡＴ　ＣＴＡ　ＧＩＡ　ＧＴＣλ入丁　ＴＡＴＧＴＴ　λ入丁　ＡＣＴ　入入ＣＡＴＧ　ＧＧＴ　ＴＴＡ　ＡＡＣ入τＣＡＧＧ　ＣＡＡＣＴＡ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＴＴＴ　ＣＡＴ　ＡＴＡ　ＴＣＴ　ＴＧＣＣＴＴ　ＡＣＴ　ＴＴＴＧＧＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＧＴＣＴＣＴＴτＣＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　入ττ 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Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ配列番号：１９配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質配列の長さ：６３ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶ　Ｓｌ　ａｙ直接の起源：化学合成ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣＴｒＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＡＣＣＧＣＡ　ＡＡＴ　ＣＣＡ　ＧＡＴＴＧＧ　ＧＡＣＴｒＣＡＡＴ　ＣＣＣＡＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＡＣＣＡｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ丁ｒｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　丁ｈｒ配列番号：２０配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質配列の長さ：　１０８　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶ　Ｓｌ　ａｙ直接の起源：化学合成ＣＣＧ　ＣＡＣＧＧＡ　ＧＧＣＣ“ｎ′′ローＧ　ＧＧＧ　ＴＧＧ　ＡＧＣＣＣＴ　ＣＡＧ　ＧＣＴＣＡＧ　ＧＧＣＡ丁Ａ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＴｒＧ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　ＣＣＧ　ＣＣＴＣＣＴ　ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴ　ＣＧＣＣＡＧ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴＰｒｏ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＡｌａＧｌｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

配列番号：２１配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　６３　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー二直鑓状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶ　Ｓｌ　ａｄ直接の起源：化学合成ＣＣＴ　ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣ下ＡＣＴ　ＣＣＣＡＴＣＴＣＴ　ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＡＧＡ　ＧＡＣ−Ｘ配列番号＝２２配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質配列の長さ：　１０８　ｔａｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶ　Ｓｌ　ａｄ直接の起源：化学合成ＣＣＡ　ＣＡＣＧＧＣＧＧＴ　Ａ’口°”ローＧ　ＧＧＧ　ＴＧＧ　ＡＧＣＣＣＴ　ＣＡＧ　ＧＣＴＣＡＧ　ＧＧＣＡＴＡ　ｎＧ　ＡＣＣＡＣＡ　ＧＴＧ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＴｒ　ＣＣＴ　ＣＣＴＣＣＴ　ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴＰｒｏ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＡｌａＧｌｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｐｒ。

配列番号＝２３配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　６０　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶ　Ｓ２　ａｙ直接の起源：化学合成ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣＡＧＡ　ＡＣＣＴｒＣＣＡＣＣＡＡ　ＡＣＴ　ＣＴＧＣＡＡ　ＧＡＴ　ＣＣＣＡＧＡ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＧＧＣＣＴＧ　ＴＡＴ　−Ｘ配列番号：２４配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：６０ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶ　Ｓ２　ａｙ直接の起源：化学合成ＧＡＴ　ＣＣＣＡＧＡ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＧＧＣＣＴＧ　ＴＡＴ　ＴＴＣＣＣＴ　ＧＣＴＧＧＴ　ＧＧＣＴＣＣＡＧＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＡＡＣ−Ｘ配列番号：２５配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　ｓｓｓ　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー二直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア　ａｄｗ直接の起源：　ＰＣＲ増幅ＡＴＣＧＡＣＡＴＴ　ＧＡＣＣＣＴ　ＴＡＴ　λＡＡＧλλ　ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＧＣＴＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＣＴＣＴＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＧＡＣττＯＴＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＣＣＴＡ　ＣＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＴＡ　ＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＡ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＴＡＴ　ＣＧＡ　ＧＭ　ＧＣＣＴＴＡ　ＧＡＧ　ＴＣＴＣＣＴ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＴＧＣＴＣＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣＣＡＴ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣＡＧＧ　ＣＡＡ　ＧＣＣＡＴＴ　ＣＴＣＴＧＣＴＧＧ　ＧＧＧ　（ａＡ　ＴＴＧ　ＡＴＧＡＣＴ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　入ＣＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　ＭＴ　ＡＡＴ　ＴＴＧ　Ｃλ入ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＣＡＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＧＴＡ　ＧＴＣ品τ　τλＴＧＴＴ　ＡＡＴ　ＡＣＴ　ＭＣＡＴＧ　ＧＧＴ　ＴＴＡ　ＡＡＧ　ＡＴＣＡＧＣＣＡＡＣＴλ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＴＴＴ　ＣＡＴ　ＡＴＡ　ＴＣＴ　ＴＧＣＣＴＴ　ＡＣＴ　ＴＴＴＧＧＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＣＧＣＡＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣＴＡＴＡＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　欣Ｔ　ＧＣＣＣＣＴ　ＡＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＣＴＴＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　入ＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＧＡＣＣＣＡＧＧＣＡＧＧ　ＴＣＣＣＣＴ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＣＴ　ＣＣＣＴＣＧ　ＣＣＴＣＧＣＡＧＡ　ＣＧＴ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＣＣＣＧ　ＣＧＴ　ＣＧＣＡＧ入ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＣＭ　ＴＧＴ　τ λＧ配列番号：２６配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　６７８　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：　ＨＢＶ　Ｓ　ａｄｗ／ａｙｗ直接（７）起源：ＨＢＶ　ＤＮＡＺλ　コＧ　ＡＡＣＡＴＣＡＣＡ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ττＣＣτＡ　α’Ａ　ＣＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＧＴＧ　ττλ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　τττ　ＴＴＣ丁τＧ　ＴＴＧ　ＡＣＡ　ＡＱＡ　ＡＴＣＣＴＣλＯ入　入τλ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＴＡ　ＣＡＣＴＣＧ　ＴＧＧ　ＴＧＧ　ＪＬＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＡＡＴ　ＴＴＴ　ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＡＣＣＧＴＧ　ＴＧＴ　ＣＴＴ　ＧＧＣＣＡＡ　ＡＡＴＴＣＧ　ＣＡＧ　ＴＣＣＴＣＡ　ＡＣＣＴＣＣＡＡＴ　ＣＡＣＴＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＣＴＣＴ　ＴＧＴＣＣＴ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　τλτ　ＣＧＣＴＧＧ　ＡＴＣＴＧＴ　ＣＴＧ　ＣＧＧＣＧＴ　τττ　ＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＴＧＣＣＴＣλＴＣＴＴＣττＧＴ″ｒＧ　ＧＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＧＡＣＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ττＧＣＣＣＧＴＴ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＴＣＣＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＣＡＧＣＡＣＧ　ＧＧＡ　ＣＣＡ　ＴＧＣＣＧＧ　ＡＣＣＴＧＣＡＴＧ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＧＡλＣＣτ０τ　ＡＴＧ　ＴＡτ　ＣＣＣＴＣＣＴＧＴ　ＴＧＣＴＧＴ　ＡＣＣＡＡＡ　ＣＣＴ　丁ＣＧＧＡＣＧＧＡ　ＡＡＴ　ＴＧＣＡＣＣＴＧＴ　ＡＴＴ　ＣＣＣＡＴＣＣＣＡ　ＴＣＡ　ＴＣＣＴＧＧＧＣＴ　ＴＴＣＧＧＡ　Ａｊ−Ａ　ＴＴＣＣＴＡ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＴＣＧ　ＧＣＣＴＣＡ　ＧＣＣＣＧττＴＣＴＣＣＴＧＧ　ＣＴＣ入Ｇτ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　τ丁ＴＧττ　ＧＡＧ　ＴＧＧＴＴＣＣＴＡ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＴＣＣＣＣＣＡＣＴ　ＧＴＴ　ＴＧＧ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　Ａτλ丁ＧＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＴＧＧ　ＴＡＴ　ＴＧＧ　ＧＧＧ　ＣＣＡ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　τ入ＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧ　ＡＧＴ　ＣＣＣＴＴＴ　ＴＴＡ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＴＴＣＴＴＴ　ＴＧＴＣＴＴ　ＴＧＧ　ＧＴＡ　ＴλＣλ丁Ｔ配列番号：２７配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　５８５　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶ　Ｓ　ａｄｗ／ａｙｗ直接の起源：ＨＢＶ　ＤＮＡｃτ入　ＧＡＣＴＣＧ　ＴＧＧ　ＴＧＧ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＡＡＴ　ＴＴＴ　ＣＴＡ　ＧＧＧＧＧＡ　ＴＣＴ　ＣＣＣＧＴＧ　ＴＧ’ｌ”　ＣＴＴ　ＧＧＣＣＡＡ　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＣＡＧ　ＴＣＣＣＣＡ　ＡＣＣＴＣＣＡＡＴ　ＣＭ：　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＣＴＣＣＴＧＴ　ＣＣＴ　ＣαＡττ　丁ＧＴ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＴＡＴ　ＣＧＣＴＧＧ　ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＣＧＧ　ＣＧτ τττ　ＡＴＣＡＴＡ　ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＡ　ττＧＧττ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　Ｑλτ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＡＴＧ丁τＧ　ＣＣＣＧＴＴ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　 λττ　ＣＣＡ　ＣＧＡ　ＴＣＡ　λＣＡ　λＱλλ（（ＡＣＴ　ＡＣＣＧＧＡ　ＣＣＡ　ＴＣＣＡＡＡ　入ＣＣＴＧＣＡＣＧ　ＡＣＴ　ＣＣＴＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＧＣ入λＣＴＣＴ　ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＣＣＣＴＣＡ　ＴＧＴ　ＴＧＣＴＧＴＡＣＡ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＡＣＧ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＴＧＣＡＣＣＴＧＴ　ＡＴＴ　ＣＣＣＡＴＣＣユ　ＴＣＧ　ＴＣＣＴＧＧ　ＧＣＴ　ＴＴＣＧＣＡ　ＡＡＡ　ＴλＣＣτλ　τＧＧＧＸＧ　ＴＧＧ　ＧＣＣＴＣＡ　ＧＴＣＣＧＴ　ＴＴＣＴＣＴ　ＴＧＧ　ＣＴＣＡＣＴ　ＴＴＡＣＴＡ　ＧＴＧ　ＣＧ　ＴＴＴ　ＧＴＴ　αＧ　ＴＧＧ　ττＣＧτλ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＴＣＣＣＣＣＡＣＴ　ＧＴＴ　ＴＣＧ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＡＴＡ　ＴＧＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＴＧＧτλτ　ＴＣＧ　ＧＧＣ；　ＣＣＡ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　ＴＡＣＡＧＣＡＴＣＧＴＧ　ＡＧＴ　ＣＣＣＴＴＴ　ＡＴＡ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＴＴＣＴＴＴ　ＴＧＴ　ＣＴＣＴＧＧＧτ入　ＴＡＣ人τＴ配列番号：２８配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　１０６　ｂｌ）鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶ　Ｓｌ直接の起源：化学合成配列番号：２９配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　１１５　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶ　Ｓ直接の起源：化学合成ＡＣ−ＡＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＴ−口＾Ｃ−ＡＡＴ−Ａ（ローＧＣＡ−ＧＡＧ−（Ｃ１−３”配列番号＝３０配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　１０８　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア直接の起源：化学合成５−５ＡＴ−ＣＴｒ−＋　ＴＡ−ＡＡＧ−ＧＧＡ−ＴＣＣ−ＴＣＴ−１１ｉｃＴ −ＧＧＧ−ＧＧＧ−ＡＡＴ−５ＧＡ−ＴＧＡ−ＣＴローＴＡＧ−ＣＴＡ−ＣＣＴ −ＧＧＧ−ＴＧＧ−ＧＣＡ−ＡＴＡ−ＡＴＴ−ＴＧＧ−ＡＡＧ−ＡＴＣ−ＣＡＧ −ＣＡＴ−ＣＴＡ−（ｉＧＧ−ＡＣＣ−＋　ＴＧ−ＴＡＧ−ＴＡＡ−ＡＴローＴＡＧ−ＡＣ−（Ａｌ−３’配列番号＝３１配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　１０６　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア直接の起源：化学合成 ’５’−５ＡＴ−ＣＴローＣ％−ＧＡＡ−ＴｒＣ−ＣＴＧ−ＧＧＧ−ＣＡＴ−ＧＧＡ−ＣＡＴ−ＴＧＡ−ＣＣＣ−ＴＴＡ−ＴＡＡ−Ａ１３Ａ−ＡＴＴ−ＴＧＧ− ＡＧＣ−ＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＧＡ−Ｃ５＋　＋　−ＡＣＴ−ＣＴＣ−ＧＴＴ−ＴＴＴ−ＧＣＣ−ＴＴＣ−τ１５Ａ−ＣＴＴ−ＣＴＴ−ＴＣローＴＴＣ−ＣＧＴ− ＣＡＧ−ＣＧ＋−コ。

配列番号：３２配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　８９　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー・直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア直接の起源：化学合成５−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＴＡ−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＧＣＣ−ＴＣＡ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＴＡＴ−ＣＧＡ−ＧＡＡ−ｒ３ＣＣ−ＴＴＡ−ＧＡＧ−７０丁−ＣＣＴ−ＧＡＧ−ＣＡＴ−ＴｅＣ−ＴＣＡ−ＣＣＴ−ＣＡＣ−ＣＡＴ−ＡＣＴ−ＧＣＡ−ＣＴＣ−ＡＧＧ−ＣＡＡ−Ｇ−ＣＧ）−３′ 配列番号＝３３配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：２５ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー二直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア直接の起源：化学合成５’−ＴＴＧ−ＧＡＴ−ＣＣＴ−ＣＣＡ−ＡＣロー工ＧＴ−ＧＣＣ−ＴＴＧ−（Ｇ）−３’配列番号＝３４配列の型：ヌクレオチド配列の長さ：　２５　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア直接の起源：化学合成５’−ＣＣＴ−ＣＴＡ−ＧＡＡ−口Ｃ＾−ＡＡＴ−ＡＴＴ−ＣＡＭ−ＧＴＡ−（Ｃ）−ゴ′配列番号：３５配列の型・ヌクレオチド配列の長さ：　５８８　ｂｐ鎖の数ニー重鎖トポロジー二直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：ＨＢＶコア直接の起源：ＰＣＲ増幅ＴＣＣＡＡＣＣＴＧ　ＴＧＣＣＴＴ　ＧＧＧ　ＴＧＧ　ＣＴＴ　ＴＣＧ　ＧＧＣＣＣＧ　ＱＡＣＡＴＴ　ＧＡＣＣＣＴ　τＡτ　λ入ＡＧＡλ　丁Ｔτ　ＣＣＡ　ＣＣＴＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ττλ　ＣＴＣＴＣＧ　τττ　ττＧ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　（、入ＣＴＴＣτττ　ＣＣＴ　ＴＣＣＧτλ　ＣＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＴＡ　ＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＡ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　丁ＡＴ　ＣＧＡ　ＧＡＡ　ＧＣＣＴＴＡ　ＧＡＧ　ＴＣＴＣＣＴ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＴＧＣＴＣＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣＣＡＴ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣＡＧＧ　ＣＡＡ　ＧＣＣλ ττ　ＣＴＣＴＧＣＴＧＧ　ＧＧＧ　ＣＡＡ　ττＧ　λ丁Ｇ入ＣＴ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　λＣＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　入λτ　λＡτ　ττＧＣＡＡＧλτ 　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＣＡＧＡ　ＧλＴＣτＡＧτλ　ＣＴＣλ入ＴＴλτＧ ττ　λ入Ｔ　ＡＣＴ　ＡＡＣλτＧ　ＣＧＴ　ＴＴＡ　ＡＡＧ　λτＣＡＧＧ　Ｃ入入Ｃτλ　ττＧ　ＴＧＧ　τ丁Ｔ　ＣＡＴ　ＡＴＡ　ＴＣＴ　ＴＧＣＣＴＴ　ＡＣＴ　τττＧＧＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　Ｇτλ　ＣＴＴ　ＣＡＡ　τλＴ　ττＧＧτＣＴＣττＴＣＣＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＣＧＣＡＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣτ入子ＡＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　）−１Ｔ　ＧＣＣＣＣＴ　ｋＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＣＴＴＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＣＣＡ　ＣＧＧ　ＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＧＧ　ＴＣＣＣＣＴ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＣＴ　ＣＣＣＴＣＧ　ＣＣＴＣＧＣＡＧＡ　ＣＧＴ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＧ　ＣＣＧ　ＣＧＴ　ＣＧＣＡＧＡＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＧＴ　τＡＧＦｉｇ、　ＩＶ　肝酵素の測定Ｆｉｇ、　Ｖｌｌ　チンパンジー実験３の結果Ｆｉｇ、ＩＸ　抗原の測定患者＃１Ｆｉｇ、　Ｘ　抗体の測定患者＃１Ｆｉｇ、　ＸＩ　抗原の測定患者＃２Ｆｉｇ、　Ｘｌｌ　抗体の測定患者＃２補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年６月ｔｒ日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）１または複数のエピトープの抗原性を媒介する少なくとも１つのポリペプチド配列とｂ）エピトープ配列ａ）を提示することができる担体であって、前記ポリペプチド配列ａ）を吸着、任意の化学結合または副原子価により担体ｂ）に結合せしめることができる担体との組合せ。
２．ポリペプチド配列ａ）が直接的または間接的方法でＴ細胞活性化エピトープの抗原性を媒介することを特徴とする、請求項１に記載の組合せ。
３．前記ポリペプチド配列ａ）がＢ型肝炎ウイルスのポリペプチドであることを特徴とする、請求項１または２に記載の組合せ。
４．ポリペプチド配列ａ）がＨＢウイルスペプチドのプレＳ１、プレＳ２、Ｓおよびコア抗原から成る群から選ばれた１または複数のメンバーのアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組合せ。
５．ポリペプチド配列ａ）が、ｉ）少なくとも６個の連続アミノ酸残基を含んで成るエピトープが保存される任意の欠失を有することにより、ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸の置換を有することにより、またはｉｉｉ）ポリペプチド配列ａ）のＮ末端に、Ｃ末端にもしくは配列中への挿入物として追加のアミノ酸を有することにより、変更され得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ。
６．ポリペプチド配列ａ）がミリスチル化されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組合せ。
７．担体ｂ）が多糖、疎水性ポリマーまたは粒子形態を有する無機分子であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組合せ。
８．担体ｂ）が第二のポリペプチド配列であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組合せ。
９．ポリペプチド配列ｂ）が分泌時に少なくとも１０ｎｍの直径を有する粒子を形成することを特徴とする、請求項８に記載の組合せ。
１０．ポリペプチド配列ｂ）が、ＨＢＶＳペプチド、ＨＢＶコア抗原、ＨＡＶコア抗原およびＨＩＶコア抗原並びにポリオウイルスＨＡＶまたはＨＩＶの表面抗原から成る群から選ばれたポリペプチドの実質的部分または完全なアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項８または９に記載の組合せ。
１１．ポリペプチド配列ｂ）が、ｉ）粒子形成能が保存される任意の欠失を有することにより、ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸の置換を有することにより、またはｉｉｉ）ポリペプチド配列ｂ）のＮ末端、Ｃ末端もしくは配列中への挿入として追加のアミノ酸を有することにより、変更され得ることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組合せ。
１２．ポリペプチド配列ｂ）がミリスチル化されることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組合せ。
１３．ポリペプチド配列ａ）とｂ）がジスルフィド結合により結合される、請求項１〜６または８〜１２のいずれか一項に記載の組合せ。
１４．ポリペプチド配列ａ）とｂ）が「疎水的固定」（ミリスチン酸により媒介される）により結合される、請求項１〜６または８〜１３のいずれか一項に記載の組合せ。
１５．ポリペプチド配列ａ）とｂ）がペプチド結合により結合され、ここで、所望によりポリペプチド配列ａ）とポリペプチド配列ｂ）との間にスペーサー配列が挿入され、前記スペーサー配列はペプチド結合を介してポリペプチド配列ａ）とｂ）に結合されることを特徴とする、請求項１〜６および８〜１４のいずれか一項に記載の組合せ。
１６．慢性ウイルス性肝炎の治療用医薬の製造のための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組合せの用途。
１７．請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組合せをコードする組換えＤＮＡ分子であって、少なくとも１つの第一のＤＮＡ配列、所望により第二、第三および／または第四のＤＮＡ配列を含んで成り、ここでｉ）前記少なくとも１つの第一のＤＮＡ配列は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列ａ）をコードし、ｉｉ）前記第二のＤＮＡ配列は、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド配列ｂ）をコードし、ｉｉｉ）前記第三のＤＮＡ配列は請求項１５に記載のスペーサー配列をコードし、そしてｉｖ）前記第四のＤＮＡ配列は選択マーカーをコードし、そして前記ＤＮＡ配列は発現に不可欠なＤＮＡ要素により調節され、所望により共通の読み枠を有することを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
１８．第一のＤＮＡ配列中３０％までのヌクレオチドが置換され得ることを特徴とする、請求項１７に記載の組換えＤＮＡ分子。
１９．請求項１７または１８のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡによりトランスフェクトされた宿主細胞。
２０．前記宿主細胞が哺乳動物、酵母および細菌細胞から成る群がら選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載の宿主細胞。
２１．慢性ウイルス性肝炎の治療方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組合せを患者に投与することを特徴とする方法。
２２．前記投与が静脈内または筋肉内注射により行われる、請求項２１に記載の方法。