JP3857305B2 - 慢性ウイルス性肝臓病に対する治療薬として用いる組成物 - Google Patents
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Description
少なくとも5種のウイルス、即ちA,B,C,DおよびE型肝炎ウイルスが急性肝炎の臨床的局面を開始させることができる。腸内的に感染するA型肝炎とE型肝炎は患者の死をもたらすのとは異り、B型、C型(以前は非経口性非A非B型肝炎と呼ばれた)およびD型肝炎は炎症の慢性段階に進行することがあり、これが次いで肝硬変や一次性肝細胞癌を引き起こし得る。
C型とD型肝炎、それらの診断および治療方法並びに各ウイルスに関して入手できるデータは比較的少ない。D型肝炎ウイルスは、不完全であることが知られているRNAウイルスである。従って、それは患者中で発達するためにヘルパーウイルスを必要とし、HBVに感染した個体においてのみ見つかる。ごく最近になってようやくC型肝炎ウイルスが検出され、慢性C型肝炎感染の診断を容易にする抗体試験(抗HCV)が開始された。しかしながら、この病気を直す治療法に対する緊急な要望がますます高まっている。
免疫学的方法による認識、原因となるウイルス並びにウイルスの生活環およびDNA配列に関してより詳しく研究された病気である慢性B型肝炎にも同じことが当てはまる。ウイルスDNAが10週間よりも長く存続している場合、またはB型肝炎表面抗原(HBsAg)が6か月より長く存続している場合、患者はB型肝炎ウイルスの慢性保有者であると言われる。
ほぼ30000万の人が慢性B型肝炎にかかっていると思われ、その大部分が極東に住む人々である。それらの人が感染する主な危険性は、慢性的に感染した母親がウイルスを新生児に伝達するため、出産中または出産直後であると思われる。こうして感染した子供の90%は、その後の人生の間に同じように慢性感染状態になるだろう。西欧諸国では、より頻繁には人生の後期、幼児期または成人になってさえも、主に非経口的または性的伝染によって、感染が起こる。誕生後のB型感染の場合には、感染者の5〜10%のみが慢性保有者になる。しかしながら、転移されたウイルスは、感染者がウイルスを排除するのかまたはそれを体内に終生保持するのかのいずれかを示す明確な反応を招かない。従って、それは将来の身体状態を決定する免疫学的状態の問題であると思われる。
HBウイルス粒子(デーン粒子)は、異なる構造タンパク質であるコアタンパク質と表面(S)タンパク質とから構成される。後者は、3つのS型領域のコード配列(その各々は生体内で翻訳を開始することができるATGトリプレットで始まる)を包含する転写解読枠の翻訳産物である。それらの領域は、該分子の5′から3′末端の順序でプレS1、プレS2およびSと呼ばれる。このORFから6つのタンパク質産物:S領域のみから翻訳される主要タンパク質のグリコシル化形と非グリコシル化形(gp27とp24)(226アミノ酸)(以下、HBV Sペプチドと称する)、1本または2本の多糖類鎖(それぞれgp33及びgp36)を有しプレS2とS領域によりコードされる中央タンパク質(281アミノ酸)(以下、HBV 2Sペプチドと称する)、そして最後に、プレS1、プレS2およびSの翻訳により形成される大型タンパク質のグリコシル化形(gp24)と非グリコシル化形(p39)(ウイルスの抗原型に依存して389〜400アミノ酸)(以下、HBV S1ペプチドと称する)が誘導される。コアタンパク質はHBcAgとHBeAgであり、後者のタンパク質はおそらくHBcAgのプロセシング産物であろう。コアタンパク質はプレ−コアペプチドを有することができる。
感染性ウイルス粒子であるデーン粒子は、コアタンパク質と表面タンパク質の両方を含んで成り、一方フィラメントは6種の表面抗原の混合物から成る。HBV S,S1及びS2ペプチド(本明細書に定義する)は単独で凝集すると、完全に非感染性であるいわゆる20nm粒子を形成する。
HBウイルスにより感染された患者は、慢性的HBV感染状態であると見なされる前に幾つかの肝炎病期を通過する。感染直後は、血清中のHBeAgの存在により特徴づけられる感染期がくるだろう。HBV複製の抑制にもかかわらず連続したHBs抗原血は、患者の細胞性ゲノム中に組み込まれたウイルスDNA配列の存在を指摘する。組み込まれたウイルス配列では、宿主細胞が完全なウイルスを合成することはできない。しかしながら、組み込まれたHBV配列を有する肝細胞はHBsAgのみを生産することができ、これが患者の血清中に検出可能であり、慢性B型肝炎の指標である。おそらく、形質転換された肝細胞は細胞毒性T細胞により溶解されず、増殖して慢性持続性肝炎(CPH)か慢性活動性肝炎(CAH)のいずれかを誘発し、これが次いで肝硬変または一次性肝細胞癌に進行して患者の早熟死を引き起こし得る。
最近、慢性的にHBV感染している患者が内因性インターフェロン生産に欠損を示すことが確立された(Abbら., 1985:J. Med. Virol. 16, 171-176)。これは、血清中のHBeAgとHBV-DNAの存在により指摘されるような慢性B型肝炎を有する患者をインターフェロンα(IFN α)で治療することの理論的根拠であった。多数の患者の管理試行は、インターフェロンαの投与が対照と比較すると有意に増加されたB型肝炎ウイルス排除をもたらすことを示した。しかしながら、誕生時またはその近辺に感染した患者は、この治療に応答してセロコンバーションしないと思われる。この現象は、不運にも保有者の75%をIFNα療法できなくする。
現在も慢性B型肝炎に対するインターフェロンαの正確な作用形態は不明瞭なままである。それの抗ウイルス活性が感染細胞を感染から保護するかまたはHBV感染細胞におけるウイルスの転写、翻訳および複製を減少させるのかもしれない。インターフェロンは更に、T細胞、マクロファージおよびNK細胞を活性化させそしてMHCクラスIタンパク質の発現を誘導することにより免疫調節機能を有する。
慢性B型肝炎を治療する別のアプローチは、ウイルスの複製を抑制し、それによって宿主免疫系をウイルスを排除できるようにするのに十分な防御を付与する考えである。これは、慢性的にHBVに感染した個体の治療に向けて抗ウイルス薬、例えばアデニンアラビノシドおよびアデニンアラビノシドモノリン酸を試験することに至る。しかしながら、患者の半数未満が、持続的または一時的セロコンバーション(HBeAg+から抗HBe+に)のいずれかにより、この治療法に応答した。それらの抗ウイルス薬の更に不利な面は免疫抑制性質である。
慢性保有者の治療用に試験されている他の薬剤としては、インターフェロンβ、アシクログアノシン(アシクロビル)、インターロイキン2、ステロイド、例えばプレドニソロン、およびそれらの組合せが挙げられる。しかし、それらのいずれもインターフェロンαでの治療よりも優れた結果を提供することができなかった。ステロイドの初期投与の後のIFNαの投与を含む組合せ療法のみが、特定の患者において応答速度を増加させることができる。
従来技術から、慢性的にHBVに感染したチンパンジーはHBsAg(破傷風毒素に結合させたもの)での治療でも抗HBsでの治療でも直すことができないことが知られている。更に、慢性的にHBV感染した患者をHBV S2及びS1ペプチド(本明細書に定義する)の投与により免疫処置することが試みられている。この処置はそれらの人において抗HBs抗体形成さえも引き起こさなかった。
その上、定義によれば、B型肝炎ウイルスの慢性保有者は、血清中にHBsAgが検出可能であることにより特徴づけられる。従って、本発明に係るMBVゲノムのプレS1−プレS2−S領域によりコードされるT細胞活性化エピトープを含んで成る組合せがB型肝炎ウイルスの慢性保有者において免疫化と最終的治癒を誘導できることは全く予想外であった。
上述した技術の現状を考慮すれば、本発明の目的は、完全な応答(即ち、HBV複製の持続的阻害、HBV DNAとDNAポリメラーゼの喪失、および患者の血清中のHBeAgとHBsAgの減少そして最終的にはそれらの消失)をもたらすウイルス性慢性肝臓病の治療のための有効な治療薬を提供することである。
本発明によれば、この目的は、
a)1または複数のT−細胞活性化エピトープを有する少なくとも1つのポリペプチド配列と、
b)エピトープ配列a)を提示することができる担体との組合せであって、ここで前記ポリペプチド配列a)は共有結合又は疎水結合により担体b)に結合することができる
組合せにより達成される。
本発明は、慢性ウイルス性肝炎の治療用医薬組成物に向けられ、この組成物は、上記a)及びb)の組合せを含んで成る。
すなわち、本発明の医薬組成物は、a)1又は複数のt−細胞活性化エピトープを有する少なくとも1つのポリペプチド配列と、b)該エピトープ配列を提示することができる担体の組合せであって、該ペプチド配列a)は共有結合又は疎水結合により担体b)に結合しているものを患者に投与することにより慢性ウイルス性肝炎の治療を行うための医薬組成物に向けられる。
1または複数の異なるポリペプチドであることができるポリペプチド配列a)が直接的または間接的方法でT細胞活性化エピトープの抗原性を媒介することが重要である。本発明によれば、ポリペプチド配列a)は、任意のサブタイプ、特にadw,ayw,adrおよびadyのB型肝炎ウイルスの1つのポリペプチドであるかまたは2つ以上のポリペプチドの組み合わせであることができる。B型肝炎ウイルスに由来するそれらのペプチドは、HBVペプチドプレS1、プレS2もしくはS(本明細書に定義する)、またはHBVコア抗原であることができる。
ポリペプチド配列a)として有用なものはさらに、(i)少なくとも6個の連続するアミノ酸残基を含んで成るエピトープが保存される任意の除去により、(ii)1又は少数のアミノ酸の置換を有することにより、又は(iii)そのN−末端に、そのC−末端に、又は前記ポリペプチド配列への挿入として追加のアミノ酸配列を有することにより、変更されている前記のポリペプチド又は2以上の該ポリペプチドの組合せのいずれかである。しかしながら、これらの場合のそれぞれにおいて、生物学的活性が維持されていることが必須である。
疎水性結合又は付着を助けるため、ポリペプチド配列a)はミリスチル化されているのが好ましい。
適当な薬理活性を示すためには、本発明の組合せにおいてポリペプチド配列a)が担体b)上に提示されることが必要である。この担体は、例えば疎水性ポリマー粒子、無機粒子または多糖粒子から成ることができる特定の物質から成る。好ましくは、担体b)は、分泌時に粒子を形成する第二のポリペプチド配列であり、前記粒子は好ましくは少なくとも10nmの直径を有する。
粒子を形成するポリペプチド配列b)は、HBV Sペプチド(本明細書に定義する)、HBVコア抗原、HAVコア抗原、HAV表面抗原、HIV表面抗原およびHIVコア抗原並びにポリオウイルスの表面抗原から成る群から選ぶことができるポリペプチドの実質的部分または完全なアミノ酸配列であることが好ましい。粒子形成担体b)として好ましいのは、HBVのSペプチドおよび/またはコアペプチドである。
担体b)として使用するとき、上述のポリペプチドは、(i)任意の除去を有することにより、(ii)1又は少数のアミノ酸の置換を有することにより、又は(iii)そのN−末端に、そのC−末端に、又は該ペプチド配列b)への挿入として、変更されていてもよい。但し、粒子形成能が維持されていることを前提とする。疎水結合の形成を助けるため、ポリペプチド配列b)はミリスチル化される。
担体b)がポリペプチド配列であるならば、両配列a)とb)を次の相互作用:疎水的固定(ミリスチン酸により媒介される)、ジスルフィド結合形成、のうちの1つまたは複数によって結合することができ、または両配列をペプチド結合により連結して融合ペプチドを形成せしめることができる。後者の場合、所望によりポリペプチド配列a)とポリペプチド配列b)との間にスペーサー配列を挿入することができ、このスペーサー配列はペプチド結合によって両ポリペプチドに結合される。
本発明は更に、慢性ウイルス性肝臓病の治療用医薬の製造に有用である、或る組合せをコードする組換えDNA分子を提供する。この組換えDNA分子は、少なくとも1つの第一のDNA配列、所望により第二、第三および/または第四のDNA配列を含んで成り、ここで
i)前記少なくとも1つの第一のDNA配列は、上記で定義した少なくとも1つのポリペプチド配列a)をコードし、
ii)前記第二のDNA配列は、粒子形成ペプチドの上記定義に従ったポリペプチド配列b)をコードし、
iii)前記第三のDNA配列はスペーサー配列をコードし、そして
iv)前記第四のDNA配列は選択マーカーをコードし、
そして前記DNA配列は発現に不可欠なDNA要素により調節され、所望により共通の読み枠を有する。
多くのアミノ酸が複数のトリプレットによって指定されるという事実を鑑みれば、上記で定義したペプチド配列a)およびb)をコードする、本発明に包含される幾つかのDNA配列が存在する。
この他に、本発明は、ヌクレオチドの30%までが置換され得るという事実により上記で定義した組換えDNA分子とは異なる組換えDNA分子も更に包含する。
本出願の更なる目的は、上記組合せをコードする組換えDNA分子によりトランスフェクトされた宿主細胞を提供することであり、該宿主細胞は慢性的HBV感染患者の治療に有用である。この宿主細胞は哺乳動物、酵母または細菌細胞であることができる。本発明の目的上、この宿主細胞が上記組合せ中に含まれるポリペプチド以外のいずれの霊長類血清タンパク質やヒト血清タンパク質も生産しないことが好ましい。
本明細書中で使用する用語「HBV Sペプチド」は、HBVゲノムの全S領域(すなわちプレ−S1及びプレ−S2領域を除く)によりコードされるペプチドを言う。本明細書中で使用する用語「HBV プレS2ペプチド」は、HBVゲノムの完全なプレS2とS領域によりコードされるペプチドを言う。本明細書中で使用する用語「HBV プレS1ペプチド」は、HBVゲノムの完全なプレS1、プレS2およびS領域によりコードされるポリペプチドを言う。本明細書中で使用する用語「エピトープ」は、指定のゲノム領域によりコードされる少なくとも6つの連続アミノ酸の配列を言う(例えば、「HBVプレS2エピトープ」とはHBVゲノムのプレS2領域によりコードされる少なくとも6つの連続アミノ酸の配列を言う)。本明細書中で使用する用語「T細胞エピトープ」は、T細胞の表面上のレセプターと相互作用して免疫応答を増強するかあるいは免疫応答をもたらすエピトープを言う。本明細書中で使用する「抗原性」は、免疫応答を惹起せしめる能力(例えば抗原として作用する)、抗体産生を引き起こす能力(例えば抗原として作用する)および/または表面細胞レセプターと相互作用して免疫応答もしくは抗体産生を増強するような能力を意味する。
用語「HBV」は、文献〔P. Valenzuela, Nature第280巻, 815頁(1979);Gerlich, EP-A-85 111 361;Neurath, EP-A-85 102 250〕中に記載されたウイルスの任意のサブタイプ、特にadw,ayw,adrおよびayrを意味する。1または複数のエピトープの抗原性を媒介するポリペプチド配列a)を構成するそのペプチド配列の例を、配列表(配列番号17〜20,22)に示す。
本発明の好ましい態様は、次の組合せである:
−HBVゲノムのプレ−S1、及び/又はプレ−S2領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ(決定基)を有するHBV S−抗原粒子;
−HBVゲノムのプレ−S1、プレ−S2、及び/又はS領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ(決定基)を有するHBVコア−抗原粒子;
−HBVゲノムのS、プレ−S1及び/又はプレ−S2領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ(決定基)を有する肝炎A−抗原粒子。
本発明にとって好ましい組換えDNA分子は、1または複数のT細胞エピトープの抗原性を媒介するポリペプチド配列a)をコードする配列、および分泌時に10nm以上の直径を有する粒子を形成するポリペプチドb)をコードする配列(両配列とも適当なプロモーターの調節下にある)の存在により特徴づけられる。a)をコードする配列の例としては、配列表の配列番号1〜24又は28〜34のもとに記載した配列を挙げることができる。ポリペプチド配列b)をコードするDNA配列の例は、配列表の配列番号25〜27又は35の配列のいずれかにより表される。
24種の配列(配列番号1〜24)のいずれかを配列表中の配列番号25〜27のもとに開示される配列と組み合わせることができ、この場合a−bとb−aの両方の順序が包含される。
特に好ましい本発明の態様は、粒子形成物としての配列番号26および/または27の配列と組み合わせた配列番号28のエピトープ(HBVのS1配列のアミノ酸9〜28を含む配列に相当する)の組合せを含んで成る。
本発明の組換えDNA構成物において使用する肝炎ウイルス配列は、制限断片の単離と連結、合成装置(Cyclon, Bio-Search)を使ったオリゴヌクレオチドの化学合成、およびPCR法による合成〔T.J. White, N. Arnleim, H.E. Erlich, 1989, The Polymerase Chain Reaction, Technical Focus 5(6)〕を包含する任意の手段により作製または単離することができる。
好ましい組換えDNA分子は、合成オリゴヌクレオチドをHBVゲノムのS領域からの5′XbaI−BglII3′断片(配列番号27)(これは完全なプレS1−プレS2−S領域を含むBglII−BglIIHBV断片から誘導される)に、または完全なS領域に連結せしめることにより作製した。そのような構成物の作製に用いるオリゴヌクレオチドを下の表Iに要約する。
他の好ましいDNA分子は、PCR法により調製されそしてT細胞エピトープをコードするコア配列を、ポリペプチド配列b)として機能するHBVのコア配列(配列番号25)に連結せしめることにより作製した。それらの構成物の作製に用いるオリゴヌクレオチドを表II−1に与える。
表II−2は、HBVゲノムの制限切断によりT細胞エピトープをコードするDNA配列を単離し、そして上記に定義したポリペプチド配列b)をコードする配列に連結せしめた幾つかの例を示す。
表II−3に特定の組換えDNA分子を列挙する。それらの作製方法は実施例の中でより詳細に記載する。
本発明の好ましい組換えDNA分子は、ポリペプチドa)およびb)をコードする領域に加えて、選択マーカーをコードする追加のDNA配列を含んで成る。更に、それらは発現に不可欠な全ての有用な要素、例えばプロモーター配列、開始コドンおよびポリアデニル化配列を含んで成る。
適当なプロモーターの例は、宿主細胞として哺乳動物細胞を使った場合、メタロチオネイン(MT)、U2およびH2Kプロモーターである。酵母または細菌細胞を使う予定ならば、それぞれ適当な酵母および細菌プロモーター、例えばGCN4およびGAL 1/10プロモーター、または原核性trpおよびtacプロモーターをそれぞれ使うことができる。
本発明に係るポリペプチドa)とポリペプチドb)の組合せを生産するためには、組換えDNA分子をトランスフェクションにより(哺乳動物細胞の場合)、形質転換により(酵母および細菌細胞の場合)または他の手段により、宿主細胞中に挿入する。組換えDNA分子を転写および翻訳することのできる任意の生物の細胞、例えば哺乳動物、細菌および酵母細胞を宿主として使用することができる。
本発明に係る適当な哺乳動物細胞は、例えば、VERO細胞(サル腎臓細胞系)、3T3、C127およびL細胞(マウス繊維芽細胞系)、並びにCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞であり、それらはデヒドロ葉酸レダクターゼが陽性または陰性のいずれかである。
本発明の特定態様によれば、それぞれポリペプチド配列a)とポリペプチド配列b)をコードする上記に定義した第一のDNA配列と上記に定義した第二のDNA配列が、異なる組換えDNA分子中に存在することも更に可能であり、その場合、それらの組換えDNA分子の両者により宿主細胞が同時トランスフェクトされる。
表IIIは、本発明のDNA構成物を与えるための適当なDNA配列の組合せ方法についての大要を示す。この表に示されるいずれの構成物も、組み合わせて、宿主細胞中にトランスフェクトされると取り込まれて慢性ウイルス性肝炎の治療用医薬としての組合せ〔ポリペプチドa)とb)を含んで成る〕を生産することのできるDNA配列を提供することができることに注意すべきである。T細胞エピトープ配列をコードするDNA配列は、Biosearch Cyclon合成装置を用いて合成的に(SYN)、PCR法により(PCR)、またはウイルスゲノムの制限酵素切断により(GENE)、調製した。
慢性ウイルス性肝炎を有する患者の治療のために、ポリペプチド配列a)と担体b)の組合せを、任意の種類の医薬組成物中に製剤することができる。該医薬組成物は、適当な希釈剤または医薬担体材料、例えば緩衝液を更に含んで成る。
投与は、任意の方法、即ち非経口(例えば静脈内または筋肉内)または経口(例えば活性物質を被包する細菌細胞を使うことによって)により行うことができる。
医薬組成物は、投与によって応答を惹起せしめるのに十分な濃度において上記の組合せを含んで成る。
【図面の簡単な説明】
図Iは、プロモーター、粒子形成物配列および選択遺伝子をコードするDNA構成物を示す(実施例3/4に記載)。
図IIは、プロモーター、完全なHB-S-Agを有するエピトープおよび選択遺伝子をコードするDNA遺伝子構成物を示す(実施例3/18に記載)。
図IIIは、プロモーター、粒子形成物残基を有するエピトープおよび選択遺伝子をコードするDNA構成物を示す(実施例3/21に記載)。
図IVは、Hepa-Care処置中のチンパンジー1のAST値を示す(実施例10/1に記載)。
図Vは、Hepa−Care処置中のチンパンジー1の抗原値を示す(実施例10/1に記載)。
図VIは、Hepa-Careで3回追加免疫処置したチンパンジー1の肝酵素ATLとGGT値を示す(実施例10/2に記載)。
図VIIは、Hepa-Care処置中のチンパンジー2の肝酵素ALT,ASTおよびGGT値並びに抗原値を示す(実施例10/3に記載)。
図VIIIは、未処置の対照チンパンジーについて測定された肝酵素を示す(実施例10/3に記載)。
図IXおよびXは、それぞれHepa-Care処置中の患者1の抗原価および抗体価を示す(実施例11に記載)。
図XIおよびXIIは、それぞれHepa-Care処置中の患者2の抗原価および抗体価を示す(実施例11に記載)。
図XIIIおよびXIVは、それぞれHepa-Care処置中の患者3の抗原価および抗体価を示す(実施例11に記載)。
本発明を次の実施例により更に詳細に説明する。
実施例1
1. ポリエチレングリコール(PEG)を用いた分別沈澱
HBVタンパク質を生産する培養物の上清を収集し、2,400ml部分に分けた。各部分に144gのPEG 6000(Serva)を添加し、室温で20分間攪拌しながら溶解させ、更に4℃で6時間攪拌した。500ml容器中でGS 3ローター中で10℃にて9,000rpm(15,000×g)で30分間遠心することにより沈澱を分離した。上清を収集し、144gのPEG6000を添加し、上記と同様に溶解させた。その溶液を4℃で3時間攪拌した。遠心を60分間続けたこと以外は上記と同様にしてこの溶液から沈澱を回収した。
2. ゲルクロマトグラフィー
PEG沈澱後に得られた物質を20mlのPBSに再溶解し、A-5m(BioRad)上でのゲルクロマトグラフィーにかけた。カラム寸法は25×1000mmおよび480mlのベッド容積であった。典型的な分画操作では、PEG沈澱したHBVタンパク質1,000μgを10〜15mlにおいて負荷し、そして6滴/分(18ml/時)の速度でPBSを使って溶出せしめた。3mlの画分を収集した。HBVタンパク質は最初のピークに溶出した。収集した画分をCsCl勾配にかけた。
3. CsCl勾配中での沈降
A-5m上でのカラムクロマトグラフィーでの最初のピークを包含し且つ予備精製されたHBVタンパク質を含む約30画分を約100mlに集めた。この溶液をCsClで1.30g/ccの密度に調整し、次いでSW 27/28ローター(Beckman)に合ったポリアロマー試験管に移した。1.35g/ccのCsCl溶液4mlを下層しそしてその上に1.25g/ccの密度の溶液4mlを、次いで1.20g/ccの密度の溶液4mlを重層することにより、勾配を設定した。この勾配を10℃にて28,000rpmにおいて50時間実施し続けた。その後、勾配を分別し、1.20g/cc密度の層中に浮いている精製HBVタンパク質を収集した。透析袋中での水に対する3回の透析により、この溶液を脱塩した。
実施例2
HBVタンパク質の定量
1. ラジオイムノアッセイによる定量
AUSRIA II-125「サンドイッチ」ラジオイムノアッセイ(Abbotから市販されている)において、B型肝炎表面抗原に対するモルモット抗体(抗HBs)がコーティングされたビーズを、血清、血漿または精製タンパク質および適当な対照と共にインキュベートした。存在し得るHBsAgを固相抗体に結合させた。未結合物質を吸引しそしてビーズを洗浄した後、ヒト125I−抗HBsをビーズ上の抗体−抗原複合体と反応せしめた。次いでビーズを洗浄して未結合の125I−抗HBsを除去した。
)−抗HBs HBsAg
)−抗HBs・HBsAg 125I−抗HBs
)−抗HBs・HBsAg・125I−抗HBs
ビーズ上に残っている放射能をガンマシンチレーションカウンター中でカウントした。
2. ELISAによる定量
Enzygnost HBsAg微量「サンドイッチ」アッセイ(Behringから市販されている)において、ウエルを抗HBsでコーティングした。血清、血漿または精製タンパク質と適当な対照をウエルに添加し、インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識HBSAg抗体を残余の抗原決定基と反応せしめた。未結合の酵素接合抗体を洗浄により取り除き、そして固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素と色素原との酵素触媒反応を希硫酸の添加により停止させた。色の強度は試料のHBsAg濃度に比例し、HBsAg濃度は、未知試料の色の強度と付随の正および負の対照血清の色の強度との分光学的比較により得られた。
実施例3
プロモーター、所望の抗原配列および選択遺伝子を含む本発明の遺伝子構成物の調製。
1. MTプロモーターの単離
プラスミドpBPV-342-12(ATCC 37224)をエンドヌクレアーゼBglIIとBamHIで消化した。3つのDNA分子が生成した。着目の断片は、4.5kbを有しメタロチオネインプロモーターとpBR322配列を含み、他の断片(2.0kbおよび7.6kb)から容易に識別可能である。
反応緩衝液200μlの総容量で各制限酵素100単位を含む0.5μg/μl DNAの最終濃度において反応を実施した。消化の完結は、37℃で3時間のインキュベーション後に0.8%アガロースゲル上でのアガロースゲル電気泳動により確認した。反応は4μlの0.5M EDTAの添加により停止させた。
調製用1.2%アガロースゲル電気泳動により4.5kb断片を他の断片から分離した。DNAをアガロースゲルからDE-81 Whatman濾紙上に溶出せしめ、その濾紙から高塩緩衝液中でDNAを取り出した。フェノール−クロロホルム抽出と2回のエタノール沈澱によりDNAを精製した。
2. HBVコア抗原をコードする1.8kb断片の連結
HBV含有DNAからHBVコアコード領域を含む1.8kbのBamHI-BamHI断片を単離した。この断片を、MTプロモーターとpBR残基を含む4.5kb断片(1に記載)と一緒に連結せしめた。
2μlの1.8kb断片を3μlの4.5kb断片と混合し、2単位のDNAリガーゼと2mMのATPを含む総容量10μlの連結緩衝液中で14℃にて一晩連結せしめた。
この連結混合物をDNA取り込みのためコンピテント細菌細胞懸濁液150μlに添加した。DNA取り込み後、50μl/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液50〜300μlの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレートを37℃で一晩インキュベートした。1つの単離した細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。
3. 所望のプラスミドを含む細菌コロニーのスクリーニング
単一コロニーを爪楊枝で取り、LB−アンピシリン培地の入った試験管(5ml)に移した。この試験管を迅速振盪環境下で37℃にて一晩インキュベートした。各増殖細菌懸濁液のミニプラスミド調製物を作製した。種々の生成したDNAを制限エンドヌクレアーゼBglIIでの消化により確かめた。2つの分子、400bp断片と5.9kb断片が期待された。消化物をアガロースゲル電気泳動により分析した。細菌細胞からプラスミドDNAを単離した。
4. ネオマイシン選択マーカーの挿入
上記の3から得られたプラスミドを制限酵素EcoRIでの消化により直鎖状にした。50μlの総容量および1μg/μlプラスミドDNAの最終濃度において反応を実施した。50単位のEcoRIを添加し、37℃で3時間インキュベーションした後でアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。1μlの0.5M EDTAの添加により反応を停止させ、そして最終濃度0.3Mの酢酸ナトリウムと3〜4容のエタノールを用いて−80℃にて30分間DNAを沈澱させた。沈澱したDNAを50μlの蒸留水に溶かした。
直鎖状プラスミド2μlを、メタロチオネインプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むDNA断片〔プラスミドpMT-neo-E(ATCC/Exogeneから入手可能)からエンドヌクレアーゼEcoRIでの消化により3.9kb断片として単離したもの〕3μlと混合し、一緒に連結せしめた。単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。
5. U2プロモーター配列を含む断片の単離
プラスミドpUC-8-42(Exogeneから入手可能)を制限エンドヌクレアーゼEcoRIとApaIで消化した。2つのDNA分子が生成した。着目の断片は、340bpを有するU2プロモーターを含み、他方の断片(3160bp)から容易に検出可能である。
反応緩衝液200μlの総容量で各制限酵素100単位を含む0.5μg/μlでDNA最終濃度において反応を実施した。消化の完結は、37℃で3時間のインキュベーション後に0.7%アガロースゲル中でのアガロースゲル電気泳動により確認した。4μlの0.5M EDTAの添加により反応を停止させた。調製用1.2%アガロースゲル電気泳動により340bp断片をプラスミドDNAから分離した。DNAをアガロースゲルからED-81 Whatman濾紙上に溶出せしめ、その濾紙から高塩緩衝液中でDNAを取り出した。フェノール/クロロホルム抽出と2回のエタノール沈澱によりDNAを精製した。
6. ポリリンカープラスミド中へのプロモーター配列含有断片の挿入
ポリリンカー配列(次の制限部位を含む:EcoRI, SacI, SmaI, AvaI, BamHI, BglII, SalI, PstI, HindIII)を含むプラスミドpSP165(Promega Biotecから入手可能)を制限酵素EcoRIにより直鎖状にした。50μlの総容量において1μg/μlプラスミドDNAの最終濃度で反応を実施した。50単位のEcoRIを添加し、そして37℃にて3時間のインキュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。1μlの0.5M EDTAの添加により反応を停止させ、最終濃度0.3Mの酢酸ナトリウムと3〜4容のエタノールを用いて−80℃にて30分間DNAを沈澱させた。沈澱したDNAを50μlの蒸留水に溶かした。
プラスミドDNA 2μlをU2プロモーター配列を含むDNA断片10μlと混合し、2単位のT4-DNAリガーゼと2mMのATPを含有する総容量25μlの連結緩衝液中で14℃にて一晩連結せしめた。その後、フェノール/クロロホルム抽出に次いで2回のエタノール沈澱によりDNAを精製し、そして10μlの蒸留水に溶解させた。生成したEcoRIとApaI粘着末端を平滑末端に変換して連結させなければならなかった。次のようにしてマングビーンヌクレアーゼとの反応により粘着末端を平滑末端に変換した:反応緩衝液中のDNA(1μg/μl濃度)25μlに20単位の酵素を添加し、1%グリセロールの最終濃度と35μlの最終反応容量を与えた。30℃にて30分間のインキュベーション後、フェノール−クロロホルム抽出に続く2回のエタノール沈澱によりDNAを精製した。このDNAを再度5μlの蒸留水に溶かした。生じた平滑末端を、上記で使用したものより10倍高いT4リカーゼと2mMのATPを含む15μlの反応液中で14℃にて一晩一緒に連結せしめた。
この連結混合物をDNA取り込みのため150μlのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。DNA取り込み後、50μl/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液50〜300μlの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレートを37℃で一晩インキュベートした。単一の単離した細菌コロニーを、所望のU2プロモーター断片を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。得られたプラスミドを細菌細胞から単離し、制限酵素分析により特徴づけた。
7. 合成オリゴDNAヌクレオチド89(配列番号:30)とMTプロモーター断片(4.5kb)との連結
MTプロモーターとpBR残基を含む4.5kb断片(1に記載)を合成オリゴヌクレオチド89(配列番号:30)と一緒に連結せしめた。この連結混合物をDNA取り込みのため150μlのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単一の単離した細菌コロニーを、所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌクレアーゼEcoRIとXbaIでの消化により確かめた。1つは2.0kbで1つは2.6kbの2つの分子が期待された。
8. 合成オリゴヌクレオチド101(配列番号:32)とプラスミド(7に記載)との連結
プラスミド(7に記載)をBglIIとBamHIで消化し、13ヌクレオチドの断片を取り出した(1に記載)。第一のオリゴヌクレオチド89(配列番号:30)を含む生成断片を、BglII−BamHI断片であるオリゴヌクレオチド101(配列番号:32)と連結せしめた。DNA取り込み後、単細胞を所望のプラスミドについてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌクレアーゼEcoRIとXbaI、またはEcoRIとBglIIでの消化により確かめた。
9. 合成DNAオリゴヌクレオチド99(配列番号:31)と4.5kb断片(1に記載)との連結
4.5kb断片(BglII−BamHI)をDNAオリゴヌクレオチド99(配列番号:31)と連結せしめた。様々なDNAを含む単一細胞コロニーのスクリーニング後、所望のプラスミドをEcoRIでの消化(1.9kbと2.7kbの2断片を生じる)とBglIIまたはBamHIでの陽性の線状化により特徴づけた。
次いでこの新規プラスミドをPstIとBamHIで消化した。pBR残基、MTプロモーターおよびオリゴヌクレオチドを含む2.6kb断片と、2.0kbのpBR残基の2つの分子が期待された。2.6kb断片を単離した。
10. 9に記載のプラスミドの2.6kb断片とプラスミド(8に記載)から単離した断片との連結
DNAオリゴヌクレオチド89と101(それぞれ配列番号30と32)を含むプラスミド(8に記載)をPstIとBglIIで消化した。2断片が期待された。1つはpBR残基とMTプロモーターを含む2.5kb断片で、もう1つはpBR残基と両方のオリゴを含む2.2kb断片であった。
この2.2kb断片を、8に記載のpBR残基、MTプロモーターおよびオリゴ99(配列番号:31)を含む2.6kb断片と連結せしめた。
所望のプラスミドについてスクリーニングした後、それをBglII-XbaIを使った制限エンドヌクレアーゼ消化により特徴づけた。オリゴDNAヌクレオチドの270bp断片およびMTプロモーターとpBRの4.5kb断片の2断片が期待された。
11. 2.3kb HBV BglII-BglII断片の連結
HBV含有DNAから、HBV プレS1、プレS2およびSコード領域を含む2.3kbのBglII-BglII断片を単離した。この2.3kb断片を、メタロチオネインプロモーターを含む4.5kb断片(1に記載した通りに得た)と連結せしめた。
2μlの2.3kb断片を3μlの4.5kb断片と混合し、そして2単位のT4-DNAリガーゼと2mMのATPを含む総容量10μlの連結緩衝液中で14℃にて一晩連結せしめた。
この連結混合物をDNA取り込みのため150μlのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。DNA取り込み後、50μl/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液50〜300μlの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレートを37℃で一晩インキュベートした。単離した単一の細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。
12. HBVコアエピトープによるHBV遺伝子配列の一部分の変換
上記の11から得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼBglIIとXbaIで消化した。1つが550bp断片で1つが6.25kb断片である2つの分子が期待され、アガロースゲル電気泳動後に6.25kb断片を単離した。
6.25kb断片を、HBVコア遺伝子のエピトープ部分をコードする10に記載のプラスミドの270bp断片(上記と同様なBglIIとXbaIでの消化および断片の単離後)と連結せしめた。
この連結混合物をDNA取り込みのため150μlのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単離した単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラスミドをBamHIでの消化により確かめた。950bp,450bpおよび5,150bp断片の3分子が期待された。
13. 「ビヒクル」プラスミドの調製
プラスミド(11に記載)をEcoRIとXbaIで消化した。2,450bp断片と4,350bp断片の2分子が期待され、ゲル電気泳動4,350bp断片を単離した。
この4,350bp断片を、ATGからXbaI部位までのHBV−S遺伝子の全DNA配列をコードし、ATGがATAに変更されているDNAオリゴヌクレオチド39(配列番号:29)と連結せしめた。
14. 完全なHBV−S遺伝子の上流のコアエピトープ
次いでこの「ビヒクル」プラスミドをPstIとXbaIで消化すると、600bpプラスミド残基と3,850bp断片の2分子が期待され、後者の断片を単離し、10に記載のプラスミドの消化後に単離された2,800bp(2,700bp)のPstI-XbaI断片と連結せしめた。
所望のプラスミドについてスクリーニングした後、それをEcoRIとXbaI、EcoRIとBglIIとBamHIを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化により特徴づけた。
15. 選択マーカーの挿入
前記プラスミド(14に記載)をEcoRIにより直鎖状にした。50μlの総容量および1μg/μlのプラスミドDNAの最終濃度において反応を実施した。50単位のEcoRIを添加し、37℃で3時間インキュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。
1μlの0.5M EDTAの添加により反応を停止させ、そして最終濃度0.3Mの酢酸ナトリウムと3〜4容のエタノールを用いて−80℃にて30分間DNAを沈澱させた。沈澱したDNAを50μlの蒸留水に溶かした。
直鎖状プラスミド2μlを、メタロチオネインプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むDNA断片(4に記載)3μlと混合し、一緒に連結せしめた。単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングし、プラスミドを単離しそして特徴づけた。
上述した各遺伝子構成物は、EcoRIとBglIIでの消化後、MTプロモーター含有DNA断片を、EcoRIとBglIIによる消化後に単離されたU2プロモーター含有DNA断片によって置き換えることにより、U2プロモーターを使って作製することもできる。
16. 大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(egpt)選択遺伝子の単離
プラスミドpMSGをBamHIとBglIIで消化した後、egpt選択遺伝子を含む断片(1.8kb)を単離し、そしてMTプロモーターを含む4.5kb断片(BglII-BamHI、1に記載)と連結せしめた。
所望のプラスミドについてスクリーニングした後、プラスミドを単離し、精製し、そしてBamHI部位からEcoRI部位への変換により完成させた。
17. PCR法による所望のDNA配列の単離
1つのDNA断片(400bp)をゲル電気泳動後に単離した。その断片は、プライマーとして特定のオリゴヌクレオチド131と132(配列番号:33と34)を使ってPCR法(実施例5に記載)により作製された。
このDNA断片をエンドヌクレアーゼBamHIとXbaIで消化し、次いでゲル電気泳動により精製した。単離したPCR断片を、プラスミド(13に記載)からBglIIとXbaIでの消化後に単離された6.25kb断片と連結せしめた。DNAの取り込みと細菌の形質転換後、単一の細菌コロニーを所望のプラスミドについてスクリーニングした。
18. 選択マーカーの挿入
プラスミド(17に記載)に選択遺伝子(15に記載)を付加することによりプラスミドを完成させた。
19. H2Kプロモーターの単離
pSP65H2(Exogeneから入手可能)からEcoRI-BglII断片(2kb)としてH2Kプロモーターを単離した。
上述の全ての構成物において、どのプロモーターもEcoRI/BglII断片として交換することができる。
20. HBV遺伝子配列の一部の変換
上記の11から得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼBglIIとXbaIで消化した。2分子が期待され、その1つが6.250kb断片であり、その断片をアガロースゲル電気泳動後に単離した。
6.250kb断片をオリゴDNAヌクレオチド23(配列番号:28)と連結せしめた。この連結混合物をDNA取り込みのため150μlのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単一の単離した細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌクレアーゼEcoRIとBglIIでの消化により確かめた。1つが1.9kbで1つが4,450kbの2分子が期待された。
21. egpt選択マーカーの挿入
前記プラスミド(20に記載)をEcoRIにより直鎖状にした。100μlの総容量および0.6μg/μlプラスミドDNAの最終濃度において反応を実施した。60単位のEcoRIを添加し、37℃で3時間インキュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。2μlの0.5M EDTAの添加により反応を停止させ、そして最終濃度0.3Mの酢酸ナトリウムと4容のエタノールを用いて−80℃にて1時間DNAを沈澱させた。沈澱したDNAを50μlの蒸留水に溶かした。
直鎖状プラスミド2μlを、メタロチオネインプロモーターとegpt選択遺伝子を含むDNA断片(3.7kb)(16に記載)3μlと混合し、一緒に連結せしめた。単一のコロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。上記と同じ方法で表IIIに記載の各遺伝子構成物を調製することができる。
実施例4
本発明の構成物を用いた哺乳動物細胞のトランスフェクション
本発明の構成物によりコードされるHBVペプチドの相当量の分泌を獲得するためには、本発明のDNA構成物を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトせしめなければならない。二段階で(即ち、各構成物について別々のトランスフェクション)または一段階で(即ち、両構成物の調製物を使った1回のトランスフェクション)同時トランスフェクションを実施した。2つの構成物上での異なる選択マーカーの使用により、またはイムノアッセイによる両構成物の発現産物の分泌の検出により、同時トランスフェクションを確かめた。
あるいは、本発明のHBVペプチド配列をコードする配列と、完全なSまたはコアまたはHAVタンパク質をコードする別の配列とを、単一構成物中に組み合わせることができる。
実施例5
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
ポリメラーゼ連鎖反応は、既知ゲノム配列の選択した領域の特定のDNAヌクレオチド配列を試験管内で百万倍以上に増幅することが可能である(Thomas J. White, Norman Arnleim, Henry A. Erlich 1989: The polymerase chain reaction. Technical Focus, 第5巻,第6号;S. KwokおよびR. Higuchi 1989: Avoiding false positives with PCR. Nature, 第339巻,237-238頁)。
細胞から単離したDNAまたはプラスミドDNAを処理してそれの相補的鎖を分離する。次いでそれらの鎖を、Xヌクレオチド(ここでXは通常50〜2,000塩基対である)により隔てられた配列とマッチするように化学的に合成された過剰の2つのDNAオリゴヌクレオチド(各々長さ20〜25塩基対)とアニールせしめる。
この2つのオリゴヌクレオチドは、2つのオリゴヌクレオチドと一致する配列の間でDNAを複製するDNAポリメラーゼにより触媒される試験管内DNA合成のための特異的プライマーとして働く。2つのプライマーオリゴヌクレオチドが正しい配列を含むならば、5′と3′に新たな消化部位を造成することが可能である。
複数回の反応サイクル後、所望の長さの多量のDNA断片が得られ、それをゲル電気泳動により精製し、そして制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動により特徴づけた。増幅された精製DNA断片を他の断片、即ちプラスミドと連結せしめるために使った。
PCR−DNA断片は平滑末端で増幅された。粘着末端を与えるために(連結操作のため)、該断片を所望のエンドヌクレアーゼで消化し、再度精製しなければならない。
PCR反応は20〜30サイクル間回転するだろう。1サイクルは、異なる反応時間と異なる反応温度(PCR熱循環器により制御される)により3段階に分けられる。第一段階は鋳型DNAの「変性」(1分/95℃)であり、第二段階は鋳型DNAとプライマーの「ハイブリダイゼーション」(1分/55℃)であり、第三段階は「重合」(2分/72℃)である。
1回のアッセイ用の最終容量は例えば30μlであり、これは次の最終濃度を含む:PCR緩衝液(1×)、4種のヌクレオチド各200μMを有するヌクレオチド混合物、2つのプライマー各々を30μlあたり200ng、aqua bidest 30μlあたり0.5単位のTaqポリメラーゼ。
実施例6
タンパク質を分泌するトランスフェクト細胞の培養
受容細胞(ATCCから入手可能なC127またはCHO細胞)を、第1日にペトリ皿中の標準増殖培地(DMEM+10%ウシ胎児血清、グルコースおよびグルタミン)中に接種した(1-2×106細胞/皿、φ10cm)。翌日、培地を除去し(DNA沈澱を細胞上に添加する4時間前)、細胞を1×PBSで2回洗浄した。次いでFCSを含まないDMEM8mlを添加し、4時間後にDNA沈澱(下記の如く調製したもの)を細胞に添加した。再び4時間後、培地を除去し、3mlのグリセロール混合物(2×TBS緩衝液50ml、グリセロール30ml、蒸留水120ml)を添加した。37℃で3分間のインキュベーション後にグリセロール混合物を即座に除去し、そして細胞を1×PBSで洗浄した。10%FCSを含むDMEM8ml中で細胞を一晩培養した。
48時間後、トリプシン−EDTA溶液(0.025%トリプシン+1mM EDTA)で処理することにより細胞を皿から回収した。その後、トリプシン−EDTAを除去するために細胞を1×PBSで洗浄し、10%FCSを含むDMEM中に懸濁し、そして24コスターウエルプレートに分配した(1つの皿からの細胞を4枚の24ウエルプレートに)。
細胞が十分に増殖した時、選択培地を添加した〔例えば、濃度0.5〜1mg/mlのネオマイシンまたは、キサンチン(250μg/ml)、ヒポキサンチン(15μg/ml)もしくはアデニン(25μg/ml)、チミジン(10μg/ml)、アミノプテリン(2μg/ml)、ミコフェノール酸(25μg/ml)〕。最初の増殖中の細胞コロニーは2週間後に認められた。
10μgのプラスミドDNAと20μgの担体DNA(サケ***DNA、子ウシ胸腺DNA)に、TE緩衝液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 7.05)を440μlの最終容量になるように添加し、そして60μlの2M CaCl2と混合した。次いで等量の2×TBS(Hepes 50mM, NaCl 280mM, Na2HPO4 1.5mM, pH 7.05)を添加し、よく混合した。沈澱溶液を37℃で30分間インキュベートし、そしてトランスフェクトせしめる予定の細胞に直接添加した。
実施例7
精製粒子のアジュバントの調製
無菌の食塩溶液中に懸濁した所望の濃度の抗原に、1:10,000容のチメロゾール、1/10容の濾過滅菌済0.2M KAl(SO4)2・12 H2Oを添加した。無菌の1N NaOHでpHを5.0に調整し、そして懸濁液を室温で3時間攪拌した。ミョウバン沈澱した抗原を2,000rpmで10分間の遠心により回収し、1:10,000チメロゾールを含む無菌の標準食塩溶液中に再懸濁し、そして無菌条件下でアリコートに分けた。
実施例8
B型肝炎コア抗原の精製
HBコア抗原分泌細胞の細胞上清を収集し、限外濾過により濃縮した。この濃縮物をBeckman SW28ローター中で4℃にて20,000rpmで15分間の遠心により清澄化した。
Beckman SW28ローター中4℃にて28,000rpmで24時間のショ糖密度勾配遠心(0〜45%ショ糖)により粒子形成を試験した。勾配を分画し、1画分ずつをELISAにより分析した。
実施例9
下表は、本発明の免疫原性粒子の後述のELISA分析の幾つかの結果を与える。
表IVは、抗プレS1モノクローナル抗体MA 18/7と抗HBsモノクローナル抗体G022を用いた、プレS1エピトープとS領域を含む本発明のHBV配列構成物から生産された精製HBs抗原粒子のELISAデータを示す。
表IVは、CsCl密度勾配後に収集した画分(21)を示す。
表Vは、HBコアに対するポリクローナル抗体とHB-S-Agに対するモノクローナル抗体G022を用いた、本発明の任意のHBコア配列構成物から生産された精製HBコア抗原粒子のELISAデータを示す。
実施例10
チンパンジーにおけるHepa-Careの投与実験
Hepa-Careは、特定の配合比(50:50)においてB型肝炎表面抗原(S1およびS)を提示する粒子であり、肝炎ウイルスの慢性保有者の治療に使われる。
実験1
B型肝炎保有チンパンジー1を、第0,4および8週に注射1回あたり18μgの用量においてHepa-Careで処置(筋肉内)した。
肝酵素(図IV)並びにB型肝炎抗原レベル(図V)をモニタリングした。
実験2
上記処置後のチンパンジー1を第30,34および38週に追加免疫処置した。その結果を図VIに示す。
実験3
チンパンジー2をHepa-Careで処置した。ただし、チンパンジー1とは異なり、静脈内に与えた。用量は2mgであった。結果を図VIIに示す。
対照チンパンジー3からも肝酵素をモニタリングし、その結果を図VIIIに示す。
実施例11
Hepa-Careでの処置:
(定義については実施例10を参照のこと)
患者1(男性、年齢65才、病歴2年):
を、第0,1,6および7か月にHepa-Careで処置(i.m.)した。抗原および抗体測定の結果を図IXとXに与える。
患者2(女性、年齢48才、病歴12年):
を、第0,1および6か月にHepa-Careで処置(i.m.)した。抗原および抗体測定の結果を図XIとXIIに与える。
患者3(女性、年齢41才、病歴5年):
を、第0,1,2および5か月にHepa-Careで処置(i.m.)した。HBs抗原および抗HBs抗体の測定値を図XIIIとXIVに示す。
配列表
配列番号:1
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:558bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:PCR増幅
配列番号:2
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:504bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:PCR増幅
配列番号:3
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:504bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:PCR増幅
配列番号:4
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:534bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:PCR増幅
配列番号:5
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:534bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:PCR増幅
配列番号:6
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:87bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:7
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:81bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:8
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:114bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:9
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:90bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:10
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:261bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:11
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:291bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:12
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:123bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:13
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:138bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:14
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:294bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S2 ayw/adw
直接の起源:HBV DNA
配列番号:15
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:99bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:16
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:390bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:PCR増幅
配列番号:17
配列の型:ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ:60bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S1 ay
直接の起源:化学合成
配列番号:18
配列の型:ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ:63bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S1 ay
直接の起源:化学合成
配列番号:19
配列の型:ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ:63bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S1 ay
直接の起源:化学合成
配列番号:20
配列の型:ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ:108bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S1 ay
直接の起源:化学合成
配列番号:21
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:63bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S1 ad
直接の起源:化学合成
配列番号:22
配列の型:ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ:108bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S1 ad
直接の起源:化学合成
配列番号:23
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:60bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S2 ay
直接の起源:化学合成
配列番号:24
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:60bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S2 ay
直接の起源:化学合成
配列番号:25
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:558bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア adw
直接の起源:PCR増幅
配列番号:26
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:678bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S adw/ayw
直接の起源:HBV DNA
配列番号:27
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:585bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S adw/ayw
直接の起源:HBV DNA
配列番号:28
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:106bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S1
直接の起源:化学合成
配列番号:29
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:115bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBV S
直接の起源:化学合成
配列番号:30
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:108bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:31
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:106bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:32
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:89bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:33
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:25bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:34
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:25bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:化学合成
配列番号:35
配列の型:ヌクレオチド
配列の長さ:588bp
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ゲノムDNA
起源:HBVコア
直接の起源:PCR増幅
Claims (3)
- 慢性ウイルス性B型肝炎治療用医薬組成物であって、この医薬組成物は、
(a)抗原性T細胞活性化エピトープを含む、B型肝炎ウイルスのプレ−S1ポリペプチド配列と、
(b)前記エピトープを提示することができる担体としての、B型肝炎ウイルスのS抗原配列と、
を有するポリペプチドを含んでなり、
上記ポリペプチド中で、前記プレ−S1ポリペプチド配列(a)と前記S抗原配列(b)とはペプチド結合により連結されており、それらのモル比は50:50である、
ことを特徴とする医薬組成物。 - 前記ポリペプチドが組換えDNA分子の発現により生産される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記配列(b)が、分泌時に少なくとも10nmの直径を有する粒子を形成する、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
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