JP2001019643A - 慢性ウイルス性肝臓病に対する治療薬として用いる組成物 - Google Patents

慢性ウイルス性肝臓病に対する治療薬として用いる組成物

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JP2001019643A JP2000175584A JP2000175584A JP2001019643A JP 2001019643 A JP2001019643 A JP 2001019643A JP 2000175584 A JP2000175584 A JP 2000175584A JP 2000175584 A JP2000175584 A JP 2000175584A JP 2001019643 A JP2001019643 A JP 2001019643A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 慢性ウイルス性肝炎の新規な治療薬の提供。 【解決手段】 肝炎ウイルスにより惹起される慢性肝炎
治療用医薬組成物であって、ａ）前記肝炎ウイルスの１
または複数の抗原性Ｔ細胞活性化エピトープを有する少
なくとも１つのポリペプチド配列と、ｂ）エピトープ配
列ａ）を提示することができる担体、との組合せを含ん
で成り、前記ポリペプチド配列ａ）が共有結合または疎
水結合により担体ｂ）に結合されることを特徴とする医
薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、慢性ウイルス性肝臓病に対する
治療薬を提供するためのポリペプチド配列と担体とを含
んで成る組成物に関する。本発明は、前記ポリペプチド
配列をコードするＤＮＡ配列および前記ＤＮＡ配列の発
現のためのトランスフェクトされた細胞に関する。少な
くとも５種のウイルス、即ちＡ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥ型
肝炎ウイルスが急性肝炎の臨床的局面を開始させること
ができる。腸内的に感染するＡ型肝炎とＥ型肝炎は患者
の死をもたらすのとは異り、Ｂ型、Ｃ型（以前は非経口
性非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれた）およびＤ型肝炎は炎症の
慢性段階に進行することがあり、これが次いで肝硬変や
一次性肝細胞癌を引き起こし得る。
【０００２】Ｃ型とＤ型肝炎、それらの診断および治療
方法並びに各ウイルスに関して入手できるデータは比較
的少ない。Ｄ型肝炎ウイルスは、不完全であることが知
られているＲＮＡウイルスである。従って、それは患者
中で発達するためにヘルパーウイルスを必要とし、ＨＢ
Ｖに感染した個体においてのみ見つかる。ごく最近にな
ってようやくＣ型肝炎ウイルスが検出され、慢性Ｃ型肝
炎感染の診断を容易にする抗体試験（抗ＨＣＶ）が開発
された。しかしながら、この病気を直す治療法に対する
緊急な要望がますます高まっている。
【０００３】免疫学的方法による認識、原因となるウイ
ルス並びにウイルスの生活環およびＤＮＡ配列に関して
より詳しく研究された病気である慢性Ｂ型肝炎にも同じ
ことが当てはまる。ウイルスＤＮＡが１０週間よりも長
く存続している場合、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ
Ａｇ）が６か月より長く存続している場合、患者はＢ型
肝炎ウイルスの慢性保有者であると言われる。
【０００４】ほぼ３００００万の人が慢性Ｂ型肝炎にか
かっていると思われ、その大部分が極東に住む人々であ
る。それらの人が感染する主な危険性は、慢性的に感染
した母親がウイルスを新生児に伝達するため、出産中ま
たは出産直後であると思われる。こうして感染した子供
の９０％は、その後の人生の間に同じように慢性感染状
態になるだろう。西欧諸国では、より頻繁には人生の後
期、幼児期または成人になってさえも、主に非経口的ま
たは性的伝染によって、感染が起こる。誕生後のＢ型感
染の場合には、感染者の５〜１０％のみが慢性保有者に
なる。しかしながら、転移されたウイルスは、感染者が
ウイルスを排除するのかまたはそれを体内に終生保持す
るのかのいずれかを示す明確な反応を招かない。従っ
て、それは将来の身体状態を決定する免疫学的状態の問
題であると思われる。
【０００５】ＨＢウイルス粒子（デーン粒子）は、異な
る構造タンパク質であるコアタンパク質と表面（Ｓ）タ
ンパク質とから構成される。後者は、３つのＳ型領域の
コード配列（その各々は生体内で翻訳を開始することが
できるＡＴＧトリプレットで始まる）を包含する転写解
読枠の翻訳産物である。それらの領域は、該分子の５′
から３′末端の順序でプレＳ１、プレＳ２およびＳと呼
ばれる。このＯＲＦから６つのタンパク質産物：Ｓ領域
のみから翻訳される主要タンパク質のグリコシル化形と
非グリコシル化形（ｇｐ２７とｐ２４）（２２６アミノ
酸）（以下、ＨＢＶ Ｓペプチドと称する）、１本また
は２本の多糖類鎖（それぞれｇｐ３３及びｇｐ３６）を
有しプレＳ２とＳ領域によりコードされる中央タンパク
質（２８１アミノ酸）（以下、ＨＢＶ ２Ｓペプチドと
称する）、そして最後に、プレＳ１、プレＳ２およびＳ
の翻訳により形成される大型タンパク質のグリコシル化
形（ｇｐ２４）と非グリコシル化形（ｐ３９）（ウイル
スの抗原型に依存して３８９〜４００アミノ酸）（以
下、ＨＢＶ Ｓ１ペプチドと称する）が誘導される。コ
アタンパク質はＨＢｃＡｇとＨＢｅＡｇであり、後者の
タンパク質はおそらくＨＢｃＡｇのプロセシング産物で
あろう。コアタンパク質はプレ−コアペプチドを有する
ことができる。
【０００６】感染性ウイルス粒子であるデーン粒子は、
コアタンパク質と表面タンパク質の両方を含んで成り、
一方フィラメントは６種の表面抗原の混合物から成る。
ＨＢＶ Ｓ，Ｓ１及びＳ２ペプチド（本明細書に定義す
る）は単独で凝集すると、完全に非感染性であるいわゆ
る２０nm粒子を形成する。
【０００７】ＨＢウイルスにより感染された患者は、慢
性的ＨＢＶ感染状態であると見なされる前に幾つかの肝
炎病期を通過する。感染直後は、血清中のＨＢｅＡｇの
存在により特徴づけられる感染期がくるだろう。ＨＢＶ
複製の抑制にもかかわらず連続したＨＢｓ抗原血は、患
者の細胞性ゲノム中に組み込まれたウイルスＤＮＡ配列
の存在を指摘する。組み込まれたウイルス配列では、宿
主細胞が完全なウイルスを合成することはできない。し
かしながら、組み込まれたＨＢＶ配列を有する肝細胞は
ＨＢｓＡｇのみを生産することができ、これが患者の血
清中に検出可能であり、慢性Ｂ型肝炎の指標である。お
そらく、形質転換された肝細胞は細胞毒性Ｔ細胞により
溶解されず、増殖して慢性持続性肝炎（ＣＰＨ）か慢性
活動性肝炎（ＣＡＨ）のいずれかを誘発し、これが次い
で肝硬変または一次性肝細胞癌に進行して患者の早熟死
を引き起こし得る。
【０００８】最近、慢性的にＨＢＶ感染している患者が
内因性インターフェロン生産に欠損を示すことが確立さ
れた（Abb ら., 1985: J.Med.Virol. 16, 171-176 ）。
これは、血清中のＨＢｅＡｇとＨＢＶ−ＤＮＡの存在に
より指摘されるような慢性Ｂ型肝炎を有する患者をイン
ターフェロンα（ＩＦＮα）で治療することの理論的根
拠であった。多数の患者の管理試行は、インターフェロ
ンαの投与が対照と比較すると有意に増加されたＢ型肝
炎ウイルス排除をもたらすことを示した。しかしなが
ら、誕生時またはその近辺に感染した患者は、この治療
に応答してセロコンバーションしないと思われる。この
現象は、不運にも保有者の７５％をＩＦＮα療法できな
くする。
【０００９】現在も慢性Ｂ型肝炎に対するインターフェ
ロンαの正確な作用形態は不明瞭なままである。それの
抗ウイルス活性が感染細胞を感染から保護するかまたは
ＨＢＶ感染細胞におけるウイルスの転写、翻訳および複
製を減少させるのかもしれない。インターフェロンは更
に、Ｔ細胞、マクロファージおよびＮＫ細胞を活性化さ
せそしてＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を誘導するこ
とにより免疫調節機能を有する。
【００１０】慢性Ｂ型肝炎を治療する別のアプローチ
は、ウイルスの複製を抑制し、それによって宿主免疫系
をウイルスを排除できるようにするのに十分な防御を付
与する考えである。これは、慢性的にＨＢＶに感染した
個体の治療に向けて抗ウイルス薬、例えばアデニンアラ
ビノシドおよびアデニンアラビノシドモノリン酸を試験
することに至る。しかしながら、患者の半数未満が、持
続的または一時的セロコンバーション（ＨＢｅＡｇ+ か
ら抗ＨＢｅ+ に）のいずれかにより、この治療法に応答
した。それらの抗ウイルス薬の更に不利な面は免疫抑制
性質である。
【００１１】慢性保有者の治療用に試験されている他の
薬剤としては、インターフェロンβ、アシクログアノシ
ン（アシクロビル）、インターロイキン２、ステロイ
ド、例えばプレドニソロン、およびそれらの組合せが挙
げられる。しかし、それらのいずれもインターフェロン
αでの治療よりも優れた結果を提供することができなか
った。ステロイドの初期投与の後のＩＦＮαの投与を含
む組合せ療法のみが、特定の患者において応答速度を増
加させることができる。
【００１２】従来技術から、慢性的にＨＢＶに感染した
チンパンジーはＨＢｓＡｇ（破傷風毒素に結合させたも
の）での治療でも抗ＨＢｓでの治療でも直すことができ
ないことが知られている。更に、慢性的にＨＢＶ感染し
た患者をＨＢＶ Ｓ２及びＳ１ペプチド（本明細書に定
義する）の投与により免疫処置することが試みられてい
る。この処置はそれらの人において抗ＨＢｓ抗体形成さ
えも引き起こさなかった。
【００１３】その上、定義によれば、Ｂ型肝炎ウイルス
の慢性保有者は、血清中にＨＢｓＡｇが検出可能である
ことにより特徴づけられる。従って、本発明に係るＭＢ
ＶゲノムのプレＳ１−プレＳ２−Ｓ領域によりコードさ
れるＴ細胞活性化エピトープを含んで成る組合せがＢ型
肝炎ウイルスの慢性保有者において免疫化と最終的治癒
を誘導できることは全く予想外であった。上述した技術
の現状を考慮すれば、本発明の目的は、完全な応答（即
ち、ＨＢＶ複製の持続的阻害、ＨＢＶ ＤＮＡとＤＮＡ
ポリメラーゼの喪失、および患者の血清中のＨＢｅＡｇ
とＨＢｓＡｇの減少そして最終的にはそれらの消失）を
もたらすウイルス性慢性肝臓病の治療のための有効な治
療薬を提供することである。
【００１４】本発明によれば、この目的は、 ａ）１または複数のＴ−細胞活性化エピトープを有する
少なくとも１つのポリペプチド配列と、 ｂ）エピトープ配列ａ）を提示することができる担体と
の組合せであって、ここで前記ポリペプチド配列ａ）は
共有結合又は疎水結合により担体ｂ）に結合することが
できる組合せにより達成される。
【００１５】本発明は、慢性ウイルス性肝炎の治療用医
薬組成物に向けられ、この組成物は、上記ａ）及びｂ）
の組合せを含んで成る。すなわち、本発明の医薬組成物
は、ａ）１又は複数のＴ−細胞活性化エピトープを有す
る少なくとも１つのポリペプチド配列と、ｂ）該エピト
ープ配列を提示することができる担体の組合せであっ
て、該ペプチド配列ａ）は共有結合又は疎水結合により
担体ｂ）に結合しているものを患者に投与することによ
り慢性ウイルス性肝炎の治療を行うための医薬組成物に
向けられる。
【００１６】１または複数の異なるポリペプチドである
ことができるポリペプチド配列ａ）が直接的または間接
的方法でＴ細胞活性化エピトープの抗原性を媒介するこ
とが重要である。本発明によれば、ポリペプチド配列
ａ）は、任意のサブタイプ、特にａｄｗ，ａｙｗ，ａｄ
ｒおよびａｄｙのＢ型肝炎ウイルスの１つのポリペプチ
ドであるかまたは２つ以上のポリペプチドの組み合わせ
であることができる。Ｂ型肝炎ウイルスに由来するそれ
らのペプチドは、ＨＢＶペプチドプレＳ１、プレＳ２も
しくはＳ（本明細書に定義する）またはＨＢＶコア抗原
であることができる。
【００１７】ポリペプチド配列ａ）として有用なものは
さらに、（ｉ）少なくとも６個の連続するアミノ酸残基
を含んで成るエピトープが保存される任意の除去によ
り、（ii）１又は少数のアミノ酸の置換を有することに
より、又は（iii)そのＮ−末端に、そのＣ−末端に、又
は前記ポリペプチド配列への挿入として追加のアミノ酸
配列を有することにより、変更されている前記のポリペ
プチド又は２以上の該ポリペプチドの組合せのいずれか
である。しかしながら、これらの場合のそれぞれにおい
て、生物学的活性が維持されていることが必須である。
疎水性結合又は付着を助けるため、ポリペプチド配列
ａ）はミリスチル化されているのが好ましい。
【００１８】適当な薬理活性を示すためには、本発明の
組合せにおいてポリペプチド配列ａ）が担体ｂ）上に提
示されることが必要である。この担体は、例えば疎水性
ポリマー粒子、無機粒子または多糖粒子から成ることが
できる特定の物質から成る。好ましくは、担体ｂ）は、
分泌時に粒子を形成する第二のポリペプチド配列であ
り、前記粒子は好ましくは少なくとも１０nmの直径を有
する。粒子を形成するポリペプチド配列ｂ）は、ＨＢＶ
Ｓペプチド（本明細書に定義する）、ＨＢＶコア抗
原、ＨＡＶコア抗原、ＨＡＶ表面抗原、ＨＩＶ表面抗原
およびＨＩＶコア抗原並びにポリオウイルスの表面抗原
から成る群から選ぶことができるポリペプチドの実質的
部分または完全なアミノ酸配列であることが好ましい。
粒子形成担体ｂ）として好ましいのは、ＨＢＶのＳペプ
チドおよび／またはコアペプチドである。
【００１９】担体ｂ）として使用するとき、上述のポリ
ペプチドは、（ｉ）任意の除去を有することにより、
（ii）１又は少数のアミノ酸の置換を有することによ
り、又は（iii)そのＮ−末端に、そのＣ−末端に、又は
該ペプチド配列ｂ）への挿入として、変更されていても
よい。但し、粒子形成能が維持されていることを前提と
する。疎水結合の形成を助けるため、ポリペプチド配列
ｂ）はミリスチル化される。
【００２０】担体ｂ）がポリペプチド配列であるなら
ば、両配列ａ）とｂ）を次の相互作用：疎水的固定（ミ
リスチン酸により媒介される）、ジスルフィド結合形
成、のうちの１つまたは複数によって結合することがで
き、または両配列をペプチド結合により連結して融合ペ
プチドを形成せしめることができる。後者の場合、所望
によりポリペプチド配列ａ）とポリペプチド配列ｂ）と
の間にスペーサー配列を挿入することができ、このスペ
ーサー配列はペプチド結合によって両ポリペプチドに結
合される。
【００２１】本発明は更に、慢性ウイルス性肝臓病の治
療用医薬の製造に有用である、或る組合せをコードする
組換えＤＮＡ分子を提供する。この組換えＤＮＡ分子
は、少なくとも１つの第一のＤＮＡ配列、所望により第
二、第三および／または第四のＤＮＡ配列を含んで成
り、ここで ｉ）前記少なくとも１つの第一のＤＮＡ配列は、上記で
定義した少なくとも１つのポリペプチド配列ａ）をコー
ドし、 ii）前記第二のＤＮＡ配列は、粒子形成ペプチドの上記
定義に従ったポリペプチド配列ｂ）をコードし、 iii ）前記第三のＤＮＡ配列はスペーサー配列をコード
し、そして iv）前記第四のＤＮＡ配列は選択マーカーをコードし、
そして前記ＤＮＡ配列は発現に不可欠なＤＮＡ要素によ
り調節され、所望により共通の読み枠を有する。
【００２２】多くのアミノ酸が複数のトリプレットによ
って指定されるという事実を鑑みれば、上記で定義した
ペプチド配列ａ）およびｂ）をコードする、本発明に包
含される幾つかのＤＮＡ配列が存在する。この他に、本
発明は、ヌクレオチドの３０％までが置換され得るとい
う事実により上記で定義した組換えＤＮＡ分子とは異な
る組換えＤＮＡ分子も更に包含する。
【００２３】本出願の更なる目的は、上記組合せをコー
ドする組換えＤＮＡ分子によりトランスフェクトされた
宿主細胞を提供することであり、該宿主細胞は慢性的Ｈ
ＢＶ感染患者の治療に有用である。この宿主細胞は哺乳
動物、酵母または細菌細胞であることができる。本発明
の目的上、この宿主細胞が上記組合せ中に含まれるポリ
ペプチド以外のいずれの霊長類血清タンパク質やヒト血
清タンパク質も生産しないことが好ましい。
【００２４】本明細書中で使用する用語「ＨＢＶ Ｓペ
プチド」は、ＨＢＶゲノムの全Ｓ領域（すなわちプレ−
Ｓ１及びプレ−Ｓ２領域を除く）によりコードされるペ
プチドを言う。本明細書中で使用する用語「ＨＢＶプレ
Ｓ２ペプチド」は、ＨＢＶゲノムの完全なプレＳ２とＳ
領域によりコードされるペプチドを言う。本明細書中で
使用する用語「ＨＢＶプレＳ１ペプチド」は、ＨＢＶゲ
ノムの完全なプレＳ１、プレＳ２およびＳ領域によりコ
ードされるポリペプチドを言う。本明細書中で使用する
用語「エピトープ」は、指定のゲノム領域によりコード
される少なくとも６つの連続アミノ酸の配列を言う（例
えば、「ＨＢＶプレＳ２エピトープ」とはＨＢＶゲノム
のプレＳ２領域によりコードされる少なくとも６つの連
続アミノ酸の配列を言う）。
【００２５】本明細書中で使用する用語「Ｔ細胞エピト
ープ」は、Ｔ細胞の表面上のレセプターと相互作用して
免疫応答を増強するかあるいは免疫応答をもたらすエピ
トープを言う。本明細書中で使用する「抗原性」は、免
疫応答を惹起せしめる能力（例えば抗原として作用す
る）、抗体産生を引き起こす能力（例えば抗原として作
用する）および／または表面細胞レセプターと相互作用
して免疫応答もしくは抗体産生を増強するような能力を
意味する。
【００２６】用語「ＨＢＶ」は、文献〔P.Valenzuela,
Nature 第280 巻、815 頁（1979);Gerlich, EP-A-85 1
11 361; Neurath, EP-A-85 102 250 〕中に記載された
ウイルスの任意のサブタイプ、特にａｄｗ，ａｙｗ，ａ
ｄｒおよびａｙｒを意味する。１または複数のエピトー
プの抗原性を媒介するポリペプチド配列ａ）を構成する
そのペプチド配列の例を、配列表（配列番号１７〜２
０，２２）に示す。
【００２７】本発明の好ましい態様は、次の組合せであ
る： −ＨＢＶゲノムのプレ−Ｓ１、及び／又はプレ−Ｓ２領
域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ（決
定基）を有するＨＢＶ Ｓ−抗原粒子； −ＨＢＶゲノムのプレ−Ｓ１、プレ−Ｓ２、及び／又は
Ｓ領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ
（決定基）を有するＨＢＶコア−抗原粒子； −ＨＢＶゲノムのＳ、プレ−Ｓ１及び／又はプレ−Ｓ２
領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ
（決定基）を有する肝炎Ａ−抗原粒子。
【００２８】本発明にとって好ましい組換えＤＮＡ分子
は、１または複数のＴ細胞エピトープの抗原性を媒介す
るポリペプチド配列ａ）をコードする配列、および分泌
時に１０nm以上の直径を有する粒子を形成するポリペプ
チドｂ）をコードする配列（両配列とも適当なプロモー
ターの調節下にある）の存在により特徴づけられる。
ａ）をコードする配列の例としては、配列表の配列番号
１〜２４又は２８〜３４のもとに記載した配列を挙げる
ことができる。ポリペプチド配列ｂ）をコードするＤＮ
Ａ配列の例は、配列表の配列番号２５〜２７又は３５の
配列のいずれかにより表される。
【００２９】２４種の配列（配列番号１〜２４）のいず
れかを配列表中の配列番号２５〜２７のもとに開示され
る配列と組み合わせることができ、この場合ａ−ｂとｂ
−ａの両方の順序が包含される。特に好ましい本発明の
態様は、粒子形成物としての配列番号２６および／また
は２７の配列と組み合わせた配列番号２８のエピトープ
（ＨＢＶのＳ１配列のアミノ酸９〜２８を含む配列に相
当する）の組合せを含んで成る。
【００３０】本発明の組換えＤＮＡ構成物において使用
する肝炎ウイルス配列は、制限断片の単離と連結、合成
装置（Cyclon, Bio-Search）を使ったオリゴヌクレオチ
ドの化学合成、およびＰＣＲ法による合成〔T.J.White,
N.Arnleim, H.E.Erlich, 1989, The Polymerase Chain
Reaction, Technical Focus 5 (6)〕を包含する任意の
手段により作製または単離することができる。
【００３１】好ましい組換えＤＮＡ分子は、合成オリゴ
ヌクレオチドをＨＢＶゲノムのＳ領域からの５′Ｘｂａ
Ｉ−ＢｇｌII ３′断片（配列番号２７）（これは完全
なプレＳ１−プレＳ２−Ｓ領域を含むＢｇｌII−Ｂｇｌ
II ＨＢＶ断片から誘導される）に、または完全なＳ領
域に連結せしめることにより作製した。そのような構成
物の作製に用いるオリゴヌクレオチドを下の表１に要約
する。
【００３２】
【表１】
【００３３】他の好ましいＤＮＡ分子は、ＰＣＲ法によ
り調製されそしてＴ細胞エピトープをコードするコア配
列を、ポリペプチド配列ｂ）として機能するＨＢＶのコ
ア配列（配列番号２５）に連結せしめることにより作製
した。それらの構成物の作製に用いるオリゴヌクレオチ
ドを表II−１に与える。
【００３４】
【表２】
【００３５】表II−２は、ＨＢＶゲノムの制限切断によ
りＴ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列を単離し、
そして上記に定義したポリペプチド配列ｂ）をコードす
る配列に連結せしめた幾つかの例を示す。
【表３】
【００３６】表II−３に特定の組換えＤＮＡ分子を列挙
する。それらの作製方法は実施例の中でより詳細に記載
する。
【表４】
【００３７】本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子は、ポ
リペプチドａ）およびｂ）をコードする領域に加えて、
選択マーカーをコードする追加のＤＮＡ配列を含んで成
る。更に、それらは発現に不可欠な全ての有用な要素、
例えばプロモーター配列、開始コドンおよびポリアデニ
ル化配列を含んで成る。適当なプロモーターの例は、宿
主細胞として哺乳動物細胞を使った場合、メタロチオネ
イン（ＭＴ）、Ｕ２およびＨ２Ｋプロモーターである。
酵母または細菌細胞を使う予定ならば、それぞれ適当な
酵母および細菌プロモーター、例えばＧＣＮ４およびＧ
ＡＬ １／１０プロモーター、または原核性ｔｒｐおよ
びｔａｃプロモーターをそれぞれ使うことができる。
【００３８】本発明に係るポリペプチドａ）とポリペプ
チドｂ）の組合せを生産するためには、組換えＤＮＡ分
子をトランスフェクションにより（哺乳動物細胞の場
合）、形質転換により（酵母および細菌細胞の場合）ま
たは他の手段により、宿主細胞中に挿入する。組換えＤ
ＮＡ分子を転写および翻訳することのできる任意の生物
の細胞、例えば哺乳動物、細菌および酵母細胞を宿主と
して使用することができる。
【００３９】本発明に係る適当な哺乳動物細胞は、例え
ば、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓細胞系）、３Ｔ３，Ｃ１２
７およびＬ細胞（マウス繊維芽細胞系）、並びにＣＨＯ
（チャイニーズハムスター卵巣）細胞であり、それらは
デヒドロ葉酸レダクターゼが陽性または陰性のいずれか
である。本発明の特定態様によれば、それぞれポリペプ
チド配列ａ）とポリペプチド配列ｂ）をコードする上記
に定義した第一のＤＮＡ配列と上記に定義した第二のＤ
ＮＡ配列が、異なる組換えＤＮＡ分子中に存在すること
も更に可能であり、その場合、それらの組換えＤＮＡ分
子の両者により宿主細胞が同時トランスフェクトされ
る。
【００４０】
【表５】
【００４１】
【表６】
【００４２】表III は、本発明のＤＮＡ構成物を与える
ための適当なＤＮＡ配列の組合せ方法についての大要を
示す。この表に示されるいずれの構成物も、組み合わせ
て、宿主細胞中にトランスフェクトされると取り込まれ
て慢性ウイルス性肝炎の治療用医薬としての組合せ〔ポ
リペプチドａ）とｂ）を含んで成る〕を生産することの
できるＤＮＡ配列を提供することができることに注意す
べきである。Ｔ細胞エピトープ配列をコードするＤＮＡ
配列は、Biosearch Cyclon合成装置を用いて合成的に
（ＳＹＮ）、ＰＣＲ法により（ＰＣＲ）、またはウイル
スゲノムの制限酵素切断により（ＧＥＮＥ）、調製し
た。
【００４３】慢性ウイルス性肝炎を有する患者の治療の
ために、ポリペプチド配列ａ）と担体ｂ）の組合せを、
任意の種類の医薬組成物中に製剤することができる。該
医薬組成物は、適当な希釈剤または医薬担体材料、例え
ば緩衝液を更に含んで成る。投与は、任意の方法、即ち
非経口（例えば静脈内または筋肉内）または経口（例え
ば活性物質を被包する細菌細胞を使うことによって）に
より行うことができる。医薬組成物は、投与によって応
答を惹起せしめるのに十分な濃度において上記の組合せ
を含んで成る。本発明を次の実施例により更に詳細に説
明する。
【００４４】実施例１ １．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた分別沈
澱 ＨＢＶタンパク質を生産する培養物の上清を収集し、
２，４００ml部分に分けた。各部分に１４４ｇのＰＥＧ
６０００（Serva ）を添加し、室温で２０分間攪拌し
ながら溶解させ、更に４℃で６時間攪拌した。５００ml
容器中でＧＳ ３ローター中で１０℃にて９，０００rp
m （１５，０００×ｇ）で３０分間遠心することにより
沈澱を分離した。上清を収集し、１４４ｇのＰＥＧ ６
０００を添加し、上記と同様に溶解させた。その溶液を
４℃で３時間攪拌した。遠心を６０分間続けたこと以外
は上記と同様にしてこの溶液から沈澱を回収した。
【００４５】２．ゲルクロマトグラフィー ＰＥＧ沈澱後に得られた物質を２０mlのＰＢＳに再溶解
し、Ａ−５ｍ（BioRad）上でのゲルクロマトグラフィー
にかけた。カラム寸法は２５×１０００mmおよび４８０
mlのベッド容積であった。典型的な分画操作では、ＰＥ
Ｇ沈澱したＨＢＶタンパク質１，０００μｇを１０〜１
５mlにおいて負荷し、そして６滴／分（１８ml／時）の
速度でＰＢＳを使って溶出せしめた。３mlの画分を収集
した。ＨＢＶタンパク質は最初のピークに溶出した。収
集した画分をＣｓＣｌ勾配にかけた。
【００４６】３．ＣｓＣｌ勾配中での沈降 Ａ−５ｍ上でのカラムクロマトグラフィーでの最初のピ
ークを包含し且つ予備精製されたＨＢＶタンパク質を含
む約３０画分を約１００mlに集めた。この溶液をＣｓＣ
ｌで１．３０ｇ／ccの密度に調整し、次いでＳＷ ２７
／２８ローター（Beckman ）に合ったポリアロマー試験
管に移した。１．３５ｇ／ccのＣｓＣｌ溶液４mlを下層
しそしてその上に１．２５ｇ／ccの密度の溶液４mlを、
次いで１．２０ｇ／ccの密度の溶液４mlを重層すること
により、勾配を設定した。この勾配を１０℃にて２８，
０００rpm において５０時間実施し続けた。その後、勾
配を分別し、１．２０ｇ／cc密度の層中に浮いている精
製ＨＢＶタンパク質を収集した。透析袋中での水に対す
る３回の透析により、この溶液を脱塩した。
【００４７】実施例２ ＨＢＶタンパク質の定量 １．ラジオイムノアッセイによる定量 ＡＵＳＲＩＡ II−１２５「サンドイッチ」ラジオイム
ノアッセイ（Abbot から市販されている）において、Ｂ
型肝炎表面抗原に対するモルモット抗体（抗ＨＢｓ）が
コーティングされたビーズを、血清、血漿または精製タ
ンパク質および適当な対照と共にインキュベートした。
存在し得るＨＢｓＡｇを固相抗体に結合させた。未結合
物質を吸引しそしてビーズを洗浄した後、ヒト 125Ｉ−
抗ＨＢｓをビーズ上の抗体−抗原複合体と反応せしめ
た。次いでビーズを洗浄して未結合の 125Ｉ−抗ＨＢｓ
を除去した。
【００４８】 ）−抗ＨＢｓ ＨＢｓＡｇ ）−抗ＨＢｓ・ＨＢｓＡｇ 125Ｉ−抗ＨＢｓ ）−抗ＨＢｓ・ＨＢｓＡｇ・ 125Ｉ−抗ＨＢｓ ビーズ上に残っている放射能をガンマシンチレーション
カウンター中でカウントした。
【００４９】２．ＥＬＩＳＡによる定量 Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ ＨＢｓＡｇ微量「サンドイッチ」
アッセイ（Behring から市販されている）において、ウ
エルを抗ＨＢｓでコーティングした。血清、血漿または
精製タンパク質と適当な対照をウエルに添加し、インキ
ュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ＨＢＳＡ
ｇ抗体を残余の抗原決定基と反応せしめた。未結合の酵
素接合抗体を洗浄により取り除き、そして固相上の酵素
活性を測定した。過酸化水素と色素原との酵素触媒反応
を希硫酸の添加により停止させた。色の強度は試料のＨ
ＢｓＡｇ濃度に比例し、ＨＢｓＡｇ濃度は、未知試料の
色の強度と付随の正および負の対照血清の色の強度との
分光学的比較により得られた。
【００５０】実施例３ プロモーター、所望の抗原配列および選択遺伝子を含む
本発明の遺伝子構成物の調製 １．ＭＴプロモーターの単離 プラスミドｐＢＰＶ−３４２−１２（ＡＴＣＣ ３７２
２４）をエンドヌクレアーゼＢｇｌIIとＢａｍＨＩで消
化した。３つのＤＮＡ分子が生成した。着目の断片は、
４．５kbを有しメタロチオネインプロモーターとｐＢＲ
３２２配列を含み、他の断片（２．０kbおよび７．６k
b）から容易に識別可能である。
【００５１】反応緩衝液２００μｌの総容量で各制限酵
素１００単位を含む０．５μｇ／μｌ ＤＮＡの最終濃
度において反応を実施した。消化の完結は、３７℃で３
時間のインキュベーション後に０．８％アガロースゲル
上でのアガロースゲル電気泳動により確認した。反応は
４μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加により停止させた。
調製用１．２％アガロースゲル電気泳動により４．５kb
断片を他の断片から分離した。ＤＮＡをアガロースゲル
からＤＥ−８１ Ｗｈａｔｍａｎ濾紙上に溶出せしめ、
その濾紙から高塩緩衝液中でＤＮＡを取り出した。フェ
ノール−クロロホルム抽出と２回のエタノール沈澱によ
りＤＮＡを精製した。
【００５２】２．ＨＢＶコア抗原をコードする１．８kb
断片の連結 ＨＢＶ含有ＤＮＡからＨＢＶコアコード領域を含む１．
８kbのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離した。この断
片を、ＭＴプロモーターとｐＢＲ残基を含む４．５kb断
片（１に記載）と一緒に連結せしめた。２μｌの１．８
kb断片を３μｌの４．５kb断片と混合し、２単位のＤＮ
Ａリガーゼと２mMのＡＴＰを含む総容量１０μｌの連結
緩衝液中で１４℃にて一晩連結せしめた。
【００５３】この連結混合物をＤＮＡ取り込みのためコ
ンピテント細菌細胞懸濁液１５０μｌに添加した。ＤＮ
Ａ取り込み後、５０μｌ／mlのアンピシリンを含むＬＢ
寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液５０〜３
００μｌの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレー
トを３７℃で一晩インキュベートした。１つの単離した
細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在に
ついてスクリーニングした。
【００５４】３．所望のプラスミドを含む細菌コロニー
のスクリーニング 単一コロニーを爪楊枝で取り、ＬＢ−アンピシリン培地
の入った試験管（５ml）に移した。この試験管を迅速振
盪環境下で３７℃にて一晩インキュベートした。各増殖
細菌懸濁液のミニプラスミド調製物を作製した。種々の
生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｇｌIIでの
消化により確かめた。２つの分子、４００bp断片と５．
９kb断片が期待された。消化物をアガロースゲル電気泳
動により分析した。細菌細胞からプラスミドＤＮＡを単
離した。
【００５５】４．ネオマイシン選択マーカーの挿入 上記の３から得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ
での消化により直鎖状にした。５０μｌの総容量および
１μｇ／μｌプラスミドＤＮＡの最終濃度において反応
を実施した。５０単位のＥｃｏＲＩを添加し、３７℃で
３時間インキュベーションした後でアガロースゲル電気
泳動により消化を確かめた。１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａの添加により反応を停止させ、そして最終濃度０．３
Ｍの酢酸ナトリウムと３〜４容のエタノールを用いて−
８０℃にて３０分間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮ
Ａを５０μｌの蒸留水に溶かした。
【００５６】直鎖状プラスミド２μｌを、メタロチオネ
インプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片〔プラスミドｐＭＴ−ｎｅｏ−Ｅ（ATCC／Exogen
e から入手可能）からエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで
の消化により３．９kb断片として単離したもの〕３μｌ
と混合し、一緒に連結せしめた。単一の細菌コロニーを
所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。
【００５７】５．Ｕ２プロモーター配列を含む断片の単
離 プラスミドｐＵＣ−８−４２（Exogene から入手可能）
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＡｐａＩで消化
した。２つのＤＮＡ分子が生成した。着目の断片は、３
４０bpを有するＵ２プロモーターを含み、他方の断片
（３１６０bp）から容易に検出可能である。
【００５８】反応緩衝液２００μｌの総容量で各制限酵
素１００単位を含む０．５μｇ／μｌのＤＮＡ最終濃度
において反応を実施した。消化の完結は、３７℃で３時
間のインキュベーション後に０．７％アガロースゲル中
でのアガロースゲル電気泳動により確認した。４μｌの
０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加により反応を停止させた。調
製用１．２％アガロースゲル電気泳動により３４０bp断
片をプラスミドＤＮＡから分離した。ＤＮＡをアガロー
スゲルからＤＥ−８１ Ｗｈａｔｍａｎ濾紙上に溶出せ
しめ、その濾紙から高塩緩衝液中でＤＮＡを取り出し
た。フェノール／クロロホルム抽出と２回のエタノール
沈澱によりＤＮＡを精製した。
【００５９】６．ポリリンカープラスミド中へのプロモ
ーター配列含有断片の挿入 ポリリンカー配列（次の制限部位を含む：ＥｃｏＲＩ，
ＳａｃＩ，ＳｍａＩ，ＡｖａＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｇｌI
I，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ，ＨｉｎｄIII ）を含むプラス
ミドｐＳＰ１６５（Promega Biotec から入手可能）を
制限酵素ＥｃｏＲＩにより直鎖状にした。５０μｌの総
容量において１μｇ／μｌプラスミドＤＮＡの最終濃度
で反応を実施した。５０単位のＥｃｏＲＩを添加し、そ
して３７℃にて３時間のインキュベーション後にアガロ
ースゲル電気泳動により消化を確かめた。１μｌの０．
５Ｍ ＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、最終濃度
０．３Ｍの酢酸ナトリウムと３〜４容のエタノールを用
いて−８０℃にて３０分間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱し
たＤＮＡを５０μｌの蒸留水に溶かした。
【００６０】プラスミドＤＮＡ ２μｌをＵ２プロモー
ター配列を含むＤＮＡ断片１０μｌと混合し、２単位の
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと２mMのＡＴＰを含有する総容量
２５μｌの連結緩衝液中で１４℃にて一晩連結せしめ
た。その後、フェノール／クロロホルム抽出に次いで２
回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製し、そして１０
μｌの蒸留水に溶解させた。生成したＥｃｏＲＩとＡｐ
ａＩ粘着末端を平滑末端に変換して連結させなければな
らなかった。
【００６１】次のようにしてマングビーンヌクレアーゼ
との反応により粘着末端を平滑末端に変換した：反応緩
衝液中のＤＮＡ（１μｇ／μｌ濃度）２５μｌに２０単
位の酵素を添加し、１％グリセロールの最終濃度と３５
μｌの最終反応容量を与えた。３０℃にて３０分間のイ
ンキュベーション後、フェノール−クロロホルム抽出に
続く２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。こ
のＤＮＡを再度５μｌの蒸留水に溶かした。生じた平滑
末端を、上記で使用したものより１０倍高いＴ４リガー
ゼと２mMのＡＴＰを含む１５μｌの反応液中で１４℃に
て一晩一緒に連結せしめた。
【００６２】この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため１
５０μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。Ｄ
ＮＡ取り込み後、５０μｌ／mlのアンピシリンを含むＬ
Ｂ寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液５０〜
３００μｌの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレ
ートを３７℃で一晩インキュベートした。単一の単離し
た細菌コロニーを、所望のＵ２プロモーター断片を含む
プラスミドの存在についてスクリーニングした。得られ
たプラスミドを細菌細胞から単離し、制限酵素分析によ
り特徴づけた。
【００６３】７．合成オリゴＤＮＡヌクレオチド８９
（配列番号：３０）とＭＴプロモーター断片（４．５k
b）との連結 ＭＴプロモーターとｐＢＲ残基を含む４．５kb断片（１
に記載）を合成オリゴヌクレオチド８９（配列番号：３
０）と一緒に連結せしめた。この連結混合物をＤＮＡ取
り込みのため１５０μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液
に添加した。単一の単離した細菌コロニーを、所望のプ
ラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラ
スミドをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｂａＩでの
消化により確かめた。１つは２．０kbで１つは２．６kb
の２つの分子が期待された。
【００６４】８．合成オリゴヌクレオチド１０１（配列
番号：３２）とプラスミド（７に記載）との連結 プラスミド（７に記載）をＢｇｌIIとＢａｍＨＩで消化
し、１３ヌクレオチドの断片を取り出した（１に記
載）。第一のオリゴヌクレオチド８９（配列番号：３
０）を含む生成断片を、ＢｇｌII−ＢａｍＨＩ断片であ
るオリゴヌクレオチド１０１（配列番号：３２）と連結
せしめた。ＤＮＡ取り込み後、単細胞を所望のプラスミ
ドについてスクリーニングした。新規プラスミドをエン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｂａＩ、またはＥｃｏＲ
ＩとＢｇｌIIでの消化により確かめた。
【００６５】９．合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド９９
（配列番号：３１）と４．５kb断片（１に記載）との連
結 ４．５kb断片（ＢｇｌII−ＢａｍＨＩ）をＤＮＡオリゴ
ヌクレオチド９９（配列番号：３１）と連結せしめた。
様々なＤＮＡを含む単一細菌コロニーのスクリーニング
後、所望のプラスミドをＥｃｏＲＩでの消化（１．９kb
と２．７kbの２断片を生じる）とＢｇｌIIまたはＢａｍ
ＨＩでの陽性の線状化により特徴づけた。次いでこの新
規プラスミドをＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化した。ｐＢ
Ｒ残基、ＭＴプロモーターおよびオリゴヌクレオチドを
含む２．６kb断片と、２．０kbのｐＢＲ残基の２つの分
子が期待された。２．６kb断片を単離した。
【００６６】１０．９に記載のプラスミドの２．６kb断
片とプラスミド（８に記載）から単離した断片との連結 ＤＮＡオリゴヌクレオチド８９と１０１（それぞれ配列
番号３０と３２）を含むプラスミド（８に記載）をＰｓ
ｔＩとＢｇｌIIで消化した。２断片が期待された。１つ
はｐＢＲ残基とＭＴプロモーターを含む２．５kb断片
で、もう１つはｐＢＲ残基と両方のオリゴを含む２．２
kb断片であった。
【００６７】この２．２kb断片を、８に記載のｐＢＲ残
基、ＭＴプロモーターおよびオリゴ９９（配列番号：３
１）を含む２．６kb断片と連結せしめた。所望のプラス
ミドについてスクリーニングした後、それをＢｇｌII−
ＸｂａＩを使った制限エンドヌクレアーゼ消化により特
徴づけた。オリゴＤＮＡヌクレオチドの２７０bp断片お
よびＭＴプロモーターとｐＢＲの４．５kb断片の２断片
が期待された。
【００６８】１１．２．３kb ＨＢＶ ＢｇｌII−Ｂｇ
ｌII断片の連結 ＨＢＶ含有ＤＮＡから、ＨＢＶプレＳ１、プレＳ２およ
びＳコード領域を含む２．３kbのＢｇｌII−ＢｇｌII断
片を単離した。この２．３kb断片を、メタロチオネイン
プロモーターを含む４．５kb断片（１に記載した通りに
得た）と連結せしめた。２μｌの２．３kb断片を３μｌ
の４．５kb断片と混合し、そして２単位のＴ４−ＤＮＡ
リガーゼと２mMのＡＴＰを含む総容量１０μｌの連結緩
衝液中で１４℃にて一晩連結せしめた。
【００６９】この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため１
５０μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。Ｄ
ＮＡ取り込み後、５０μｌ／mlのアンピシリンを含むＬ
Ｂ寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液５０〜
３００μｌの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレ
ートを３７℃で一晩インキュベートした。単離した単一
の細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在
についてスクリーニングした。
【００７０】１２．ＨＢＶコアエピトープによるＨＢＶ
遺伝子配列の一部分の変換 上記の１１から得られたプラスミドをエンドヌクレアー
ゼＢｇｌIIとＸｂａＩで消化した。１つが５５０bp断片
で１つが６．２５kb断片である２つの分子が期待され、
アガロースゲル電気泳動後に６．２５kb断片を単離し
た。６．２５kb断片を、ＨＢＶコア遺伝子のエピトープ
部分をコードする１０に記載のプラスミドの２７０bp断
片（上記と同様なＢｇｌIIとＸｂａＩでの消化および断
片の単離後）と連結せしめた。この連結混合物をＤＮＡ
取り込みのため１５０μｌのコンピテント細菌細胞懸濁
液に添加した。単離した単一の細菌コロニーを所望のプ
ラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラ
スミドをＢａｍＨＩでの消化により確かめた。９５０b
p，４５０bpおよび５，１５０bp断片の３分子が期待さ
れた。
【００７１】１３．「ビヒクル」プラスミドの調製 プラスミド（１１に記載）をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消
化した。２，４５０bp断片と４，３５０bp断片の２分子
が期待され、ゲル電気泳動後４，３５０bp断片を単離し
た。この４，３５０bp断片を、ＡＴＧからＸｂａＩ部位
までのＨＢＶ−Ｓ遺伝子の全ＤＮＡ配列をコードし、Ａ
ＴＧがＡＴＡに変更されているＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド３９（配列番号：２９）と連結せしめた。
【００７２】１４．完全なＨＢＶ−Ｓ遺伝子の上流のコ
アエピトープ 次いでこの「ビヒクル」プラスミドをＰｓｔＩとＸｂａ
Ｉで消化すると、６００bpプラスミド残基と３，８５０
bp断片の２分子が期待され、後者の断片を単離し、１０
に記載のプラスミドの消化後に単離された２，８００bp
（２，７００bp）のＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片と連結せし
めた。所望のプラスミドについてスクリーニングした
後、それをＥｃｏＲＩとＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩとＢｇｌ
IIとＢａｍＨＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に
より特徴づけた。
【００７３】１５．選択マーカーの挿入 前記プラスミド（１４に記載）をＥｃｏＲＩにより直鎖
状にした。５０μｌの総容量および１μｇ／μｌのプラ
スミドＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。５０
単位のＥｃｏＲＩを添加し、３７℃で３時間インキュベ
ーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確か
めた。１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加により反応を
停止させ、そして最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウムと
３〜４容のエタノールを用いて−８０℃にて３０分間Ｄ
ＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを５０μｌの蒸留水
に溶かした。直鎖状プラスミド２μｌを、メタロチオネ
インプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片（４に記載）３μｌと混合し、一緒に連結せしめ
た。単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在につ
いてスクリーニングし、プラスミドを単離しそして特徴
づけた。
【００７４】上述した各遺伝子構成物は、ＥｃｏＲＩと
ＢｇｌIIでの消化後、ＭＴプロモーター含有ＤＮＡ断片
を、ＥｃｏＲＩとＢｇｌIIによる消化後に単離されたＵ
２プロモーター含有ＤＮＡ断片によって置き換えること
により、Ｕ２プロモーターを使って作製することもでき
る。
【００７５】１６．大腸菌キサンチングアニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（ｅｇｐｔ）選択遺伝子の単
離 プラスミドｐＭＳＧをＢａｍＨＩとＢｇｌIIで消化した
後、ｅｇｐｔ選択遺伝子を含む断片（１．８kb）を単離
し、そしてＭＴプロモーターを含む４．５kb断片（Ｂｇ
ｌII−ＢａｍＨＩ、１に記載）と連結せしめた。所望の
プラスミドについてスクリーニングした後、プラスミド
を単離し、精製し、そしてＢａｍＨＩ部位からＥｃｏＲ
Ｉ部位への変換により完成させた。
【００７６】１７．ＰＣＲ法による所望のＤＮＡ配列の
単離 １つのＤＮＡ断片（４００bp）をゲル電気泳動後に単離
した。その断片は、プライマーとして特定のオリゴヌク
レオチド１３１と１３２（配列番号：３３と３４）を使
ってＰＣＲ法（実施例５に記載）により作製された。こ
のＤＮＡ断片をエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＸｂａ
Ｉで消化し、次いでゲル電気泳動により精製した。単離
したＰＣＲ断片を、プラスミド（１３に記載）からＢｇ
ｌIIとＸｂａＩでの消化後に単離された６．２５kb断片
と連結せしめた。ＤＮＡの取り込みと細菌の形質転換
後、単一の細菌コロニーを所望のプラスミドについてス
クリーニングした。
【００７７】１８．選択マーカーの挿入 プラスミド（１７に記載）に選択遺伝子（１５に記載）
を付加することによりプラスミドを完成させた。 １９．Ｈ２Ｋプロモーターの単離 ｐＳＰ６５Ｈ２（Exogene から入手可能）からＥｃｏＲ
Ｉ−ＢｇｌII断片（２kb）としてＨ２Ｋプロモーターを
単離した。上述の全ての構成物において、どのプロモー
ターもＥｃｏＲＩ／ＢｇｌII断片として交換することが
できる。
【００７８】２０．ＨＢＶ遺伝子配列の一部の変換 上記の１１から得られたプラスミドをエンドヌクレアー
ゼＢｇｌIIとＸｂａＩで消化した。２分子が期待され、
その１つが６．２５０kb断片であり、その断片をアガロ
ースゲル電気泳動後に単離した。６．２５０kb断片をオ
リゴＤＮＡヌクレオチド２３（配列番号：２８）と連結
せしめた。この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため１５
０μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単一
の単離した細菌コロニーを所望のプラスミドの存在につ
いてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌク
レアーゼＥｃｏＲＩとＢｇｌIIでの消化により確かめ
た。１つが１．９kbで１つが４．４５０kbの２分子が期
待された。
【００７９】２１．ｅｇｐｔ選択マーカーの挿入 前記プラスミド（２０に記載）をＥｃｏＲＩにより直鎖
状にした。１００μｌの総容量および０．６μｇ／μｌ
プラスミドＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。
６０単位のＥｃｏＲＩを添加し、３７℃で３時間インキ
ュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を
確かめた。２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加により反
応を停止させ、そして最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウ
ムと４容のエタノールを用いて−８０℃にて１時間ＤＮ
Ａを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを５０μｌの蒸留水に
溶かした。
【００８０】直鎖状プラスミド２μｌを、メタロチオネ
インプロモーターとｅｇｐｔｇ選択遺伝子を含むＤＮＡ
断片（３．７kb）（１６に記載）３μｌと混合し、一緒
に連結せしめた。単一のコロニーを所望のプラスミドの
存在についてスクリーニングした。上記と同じ方法で表
III に記載の各遺伝子構成物を調製することができる。
【００８１】実施例４ 本発明の構成物を用いた哺乳動物細胞のトランスフェク
ション 本発明の構成物によりコードされるＨＢＶペプチドの相
当量の分泌を獲得するためには、本発明のＤＮＡ構成物
を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトせしめなけれ
ばならない。二段階で（即ち、各構成物について別々の
トランスフェクション）または一段階で（即ち、両構成
物の調製物を使った１回のトランスフェクション）同時
トランスフェクションを実施した。２つの構成物上での
異なる選択マーカーの使用により、またはイムノアッセ
イによる両構成物の発現産物の分泌の検出により、同時
トランスフェクションを確かめた。
【００８２】あるいは、本発明のＨＢＶペプチド配列を
コードする配列と、完全なＳまたはコアまたはＨＡＶタ
ンパク質をコードする別の配列とを、単一構成物中に組
み合わせることができる。
【００８３】実施例５ ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） ポリメラーゼ連鎖反応は、既知ゲノム配列の選択した領
域の特定のＤＮＡヌクレオチド配列を試験管内で百万倍
以上に増幅することが可能である（Thomas J.White, No
rman Arnleim, Henry A.Erlich 1989: The polymerase
chain reaction. Technical Focus 、第５巻、第６号；
S.KwokおよびR.Higuchi 1989: Avoidingfalse positive
s with PCR. Nature 、第339 巻、237-238 頁）。
【００８４】細胞から単離したＤＮＡまたはプラスミド
ＤＮＡを処理してそれの相補的鎖を分離する。次いでそ
れらの鎖を、Ｘヌクレオチド（ここでＸは通常５０〜
２，０００塩基対である）により隔てられた配列とマッ
チするように化学的に合成された過剰の２つのＤＮＡオ
リゴヌクレオチド（各々長さ２０〜２５塩基対）とアニ
ールせしめる。
【００８５】この２つのオリゴヌクレオチドは、２つの
オリゴヌクレオチドと一致する配列の間でＤＮＡを複製
するＤＮＡポリメラーゼにより触媒される試験管内ＤＮ
Ａ合成のための特異的プライマーとして働く。２つのプ
ライマーオリゴヌクレオチドが正しい配列を含むなら
ば、５′と３′に新たな消化部位を造成することが可能
である。
【００８６】複数回の反応サイクル後、所望の長さの多
量のＤＮＡ断片が得られ、それをゲル電気泳動により精
製し、そして制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動に
より特徴づけた。増幅された精製ＤＮＡ断片を他の断
片、即ちプラスミドと連結せしめるために使った。ＰＣ
Ｒ−ＤＮＡ断片は平滑末端で増幅された。粘着末端を与
えるために（連結操作のため）、該断片を所望のエンド
ヌクレアーゼで消化し、再度精製しなければならない。
【００８７】ＰＣＲ反応は２０〜３０サイクル間回転す
るだろう。１サイクルは、異なる反応時間と異なる反応
温度（ＰＣＲ熱循環器により制御される）により３段階
に分けられる。第一段階は鋳型ＤＮＡの「変性」（１分
／９５℃）であり、第二段階は鋳型ＤＮＡとプライマー
の「ハイブリダイゼーション」（１分／５５℃）であ
り、第三段階は「重合」（２分／７２℃）である。１回
のアッセイ用の最終容量は例えば３０μｌであり、これ
は次の最終濃度を含む：ＰＣＲ緩衝液（１×）、４種の
ヌクレオチド各２００μＭを有するヌクレオチド混合
物、２つのプライマー各々を３０μｌあたり２００ng、
ａｑｕａ ｂｉｄｅｓｔ ３０μｌあたり０．５単位の
Ｔａｑポリメラーゼ。
【００８８】実施例６ タンパク質を分泌するトランスフェクト細胞の培養 受容細胞（ATCCから入手可能なＣ１２７またはＣＨＯ細
胞）を、第１日にペトリ皿中の標準増殖培地（ＤＭＥＭ
＋１０％ウシ胎児血清、グルコースおよびグルタミン）
中に接種した（１−２×１０6 細胞／皿、φ１０cm）。
翌日、培地を除去し（ＤＮＡ沈澱を細胞上に添加する４
時間前）、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した。次いでＦ
ＣＳを含まないＤＭＥＭ ８mlを添加し、４時間後にＤ
ＮＡ沈澱（下記の如く調製したもの）を細胞に添加し
た。
【００８９】再び４時間後、培地を除去し、３mlのグリ
セロール混合物（２×ＴＢＳ緩衝液５０ml、グリセロー
ル３０ml、蒸留水１２０ml）を添加した。３７℃で３分
間のインキュベーション後にグリセロール混合物を即座
に除去し、そして細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。１０％
ＦＣＳを含むＤＭＥＭ ８ml中で細胞を一晩培養し
た。
【００９０】４８時間後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液
（０．０２５％トリプシン＋１mM ＥＤＴＡ）で処理す
ることにより細胞を皿から回収した。その後、トリプシ
ン−ＥＤＴＡを除去するために細胞を１×ＰＢＳで洗浄
し、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に懸濁し、そして
２４コスターウエルプレートに分配した（１つの皿から
の細胞を４枚の２４ウエルプレートに）。
【００９１】細胞が十分に増殖した時、選択培地を添加
した〔例えば、濃度０．５〜１mg／mlのネオマイシンま
たは、キサンチン（２５０μｇ／ml）、ヒポキサンチン
（１５μｇ／ml）もしくはアデニン（２５μｇ／ml）、
チミジン（１０μｇ／ml）、アミノプテリン（２μｇ／
ml）、ミコフェノール酸（２５μｇ／ml）〕。最初の増
殖中の細胞コロニーは２週間後に認められた。
【００９２】１０μｇのプラスミドＤＮＡと２０μｇの
担体ＤＮＡ（サケ***ＤＮＡ、子ウシ胸腺ＤＮＡ）に、
ＴＥ緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴ
Ａ、pH７．０５）を４４０μｌの最終容量になるように
添加し、そして６０μｌの２Ｍ ＣａＣｌ2 と混合し
た。次いで等量の２×ＴＢＳ（Ｈｅｐｅｓ ５０mM、Ｎ
ａＣｌ ２８０mM、Ｎａ2 ＨＰＯ4 １．５mM、pH７．０
５）を添加し、よく混合した。沈澱溶液を３７℃で３０
分間インキュベートし、そしてトランスフェクトせしめ
る予定の細胞に直接添加した。
【００９３】実施例７ 精製粒子のアジュバントの調製 無菌の食塩溶液中に懸濁した所望の濃度の抗原に、１：
１０，０００容のチメロゾール、１／１０容の濾過滅菌
済０．２Ｍ ＫＡｌ（ＳＯ4)2 ・１２Ｈ2 Ｏを添加し
た。無菌の１Ｎ ＮａＯＨでpHを５．０に調整し、そし
て懸濁液を室温で３時間攪拌した。ミョウバン沈澱した
抗原を２，０００rpm で１０分間の遠心により回収し、
１：１０，０００チメロゾールを含む無菌の標準食塩溶
液中に再懸濁し、そして無菌条件下でアリコートに分け
た。
【００９４】実施例８ Ｂ型肝炎コア抗原の精製 ＨＢコア抗原分泌細胞の細胞上清を収集し、限外濾過に
より濃縮した。この濃縮物をＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８
ローター中で４℃にて２０，０００rpm で１５分間の遠
心により清澄化した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ロータ
ー中４℃にて２８，０００rpm で２４時間のショ糖密度
勾配遠心（０〜４５％ショ糖）により粒子形成を試験し
た。勾配を分画し、１画分ずつをＥＬＩＳＡにより分析
した。
【００９５】実施例９ 下表は、本発明の免疫原性粒子の後述のＥＬＩＳＡ分析
の幾つかの結果を与える。表IVは、抗プレＳ１モノクロ
ーナル抗体ＭＡ １８／７と抗ＨＢｓモノクローナル抗
体Ｇ０２２を用いた、プレＳ１エピトープとＳ領域を含
む本発明のＨＢＶ配列構成物から生産された精製ＨＢｓ
抗原粒子のＥＬＩＳＡデータを示す。表IVは、ＣｓＣｌ
密度勾配後に収集した画分（２１）を示す。
【００９６】
【表７】
【００９７】
【表８】
【００９８】表Ｖは、ＨＢコアに対するポリクローナル
抗体とＨＢ−Ｓ−Ａｇに対するモノクローナル抗体Ｇ０
２２を用いた、本発明の任意のＨＢコア配列構成物から
生産された精製ＨＢコア抗原粒子のＥＬＩＳＡデータを
示す。
【００９９】
【表９】
【０１００】
【表１０】
【０１０１】実施例１０ チンパンジーにおけるＨｅｐａ−Ｃａｒｅの投与実験 Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅは、特定の配合比（５０：５０）に
おいてＢ型肝炎表面抗原（Ｓ１およびＳ）を提示する粒
子であり、肝炎ウイルスの慢性保有者の治療に使われ
る。
【０１０２】実験１ Ｂ型肝炎保有チンパンジー１を、第０，４および８週に
注射１回あたり１８μｇの用量においてＨｅｐａ−Ｃａ
ｒｅで処置（筋肉内）した。肝酵素（図IV）並びにＢ型
肝炎抗原レベル（図Ｖ）をモニタリングした。実験２ 上記処置後のチンパンジー１を第３０，３４および３８
週に追加免疫処置した。その結果を図VIに示す。実験３ チンパンジー２をＨｅｐａ−Ｃａｒｅで処置した。ただ
し、チンパンジー１とは異なり、静脈内に与えた。用量
は２mgであった。結果を図VII に示す。対照チンパンジ
ー３からも肝酵素をモニタリングし、その結果を図VIII
に示す。
【０１０３】実施例１１ Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅでの処置： （定義については実施例１０を参照のこと）患者１ （男性、年齢６５才、病歴２年）： を、第０，１，６および７か月にＨｅｐａ−Ｃａｒｅで
処置（i.m.）した。抗原および抗体測定の結果を図IXと
Ｘに与える。
【０１０４】患者２ （女性、年齢４８才、病歴１２年）： を、第０，１および６か月にＨｅｐａ−Ｃａｒｅで処置
（i.m.）した。抗原および抗体測定の結果を図XIとXII
に与える。
【０１０５】患者３ （女性、年齢４１才、病歴５年）： を、第０，１，２および５か月にＨｅｐａ−Ｃａｒｅで
処置（i.m.）した。ＨＢｓ抗原および抗ＨＢｓ抗体の測
定値を図XIIIとXIV に示す。
【０１０６】
【表１１】
【０１０７】
【表１２】
【０１０８】
【表１３】
【０１０９】
【表１４】
【０１１０】
【表１５】
【０１１１】
【表１６】
【０１１２】
【表１７】
【０１１３】
【表１８】
【０１１４】
【表１９】
【０１１５】
【表２０】
【０１１６】
【表２１】
【０１１７】
【表２２】
【０１１８】
【表２３】
【０１１９】
【表２４】
【０１２０】
【表２５】
【０１２１】
【表２６】
【０１２２】
【表２７】
【０１２３】
【表２８】
【０１２４】
【表２９】
【０１２５】
【表３０】
【０１２６】
【表３１】
【０１２７】
【表３２】
【０１２８】
【表３３】
【０１２９】
【表３４】
【０１３０】
【表３５】
【０１３１】
【表３６】
【０１３２】
【表３７】
【０１３３】
【表３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プロモーター、粒子形成物配列および
選択遺伝子をコードするＤＮＡ構成物を示す（実施例３
／４に記載）。
【図２】図２は、プロモーター、完全なＨＢ−Ｓ−Ａｇ
を有するエピトープおよび選択遺伝子をコードするＤＮ
Ａ遺伝子構成物を示す（実施例３／１８に記載）。
【図３】図３は、プロモーター、粒子形成物残基を有す
るエピトープおよび選択遺伝子をコードするＤＮＡ構成
物を示す（実施例３／２１に記載）。
【図４】図４は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中のチンパン
ジー１のＡＳＴ値を示す（実施例１０／１に記載）。
【図５】図５は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中のチンパン
ジー１の抗原値を示す（実施例１０／１に記載）。
【図６】図６は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅで３回追加免疫処
置したチンパンジー１の肝酵素ＡＴＬとＧＧＴ値を示す
（実施例１０／２に記載）。
【図７】図７は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中のチンパン
ジー２の肝酵素ＡＬＴ，ＡＳＴおよびＧＧＴ値並びに抗
原値を示す（実施例１０／３に記載）。
【図８】図８は、未処置の対照チンパンジーについて測
定された肝酵素を示す（実施例１０／３に記載）。
【図９】図９は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中の患者１の
抗原価を示す（実施例１１に記載）。
【図１０】図１０は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中の患者
１の抗体価を示す（実施例１１に記載）。
【図１１】図１１は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中の患者
２の抗原価を示す（実施例１１に記載）。
【図１２】図１２は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中の患者
２の抗体価を示す（実施例１１に記載）。
【図１３】図１３は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中の患者
３の抗原価を示す（実施例１１に記載）。
【図１４】図１４は、Ｈｅｐａ−Ｃａｒｅ処置中の患者
３の抗体価を示す（実施例１１に記載）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16 31/12 31/12 // Ｃ０７Ｋ 14/02 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/02 ＺＮＡ 14/155 14/155 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 肝炎ウイルスにより惹起される慢性肝炎
    治療用医薬組成物であって、 ａ）前記肝炎ウイルスの１または複数の抗原性Ｔ細胞活
    性化エピトープを有する少なくとも１つのポリペプチド
    配列と ｂ）エピトープ配列ａ）を提示することができる担体と
    の組合せを含んで成り、前記ポリペプチド配列ａ）が共
    有結合または疎水結合により担体ｂ）に結合されること
    を特徴とする医薬組成物。
  2. 【請求項２】 前記ポリペプチド配列ａ）がＢ型肝炎ウ
    イルスのポリペプチドである、請求項１に記載の医薬組
    成物。
  3. 【請求項３】 前記ポリペプチド配列ａ）がHBウイルス
    のプレＳ１、プレＳ２およびＳペプチド並びにHBコア抗
    原から成る群から選ばれた１または複数のメンバーの変
    更されているか又は変更されていないアミノ酸配列であ
    る、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】 前記ポリペプチド配列ａ）が、 ｉ）少なくとも６個の連続アミノ酸残基を含んで成るエ
    ピトープが保存される任意の欠失を有することにより、 ii）１個もしくは数個のアミノ酸の置換を有することに
    より、または iii)ポリペプチド配列ａ）のＮ末端に、Ｃ末端に、もし
    くは配列中への挿入物として、追加のアミノ酸を有する
    ことにより、変更された生来のポリペプチド配列である
    ことができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医
    薬組成物。
  5. 【請求項５】 前記ポリペプチド配列ａ）がミリスチル
    化される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組
    成物。
  6. 【請求項６】 前記ポリペプチド配列ａ）が組換えDNA
    分子の発現により生産される、請求項１〜５のいずれか
    一項に記載の医薬組成物。
  7. 【請求項７】 前記担体ｂ）が多糖、疎水性ポリマーま
    たは粒子形態を有する無機分子である、請求項１〜６の
    いずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 【請求項８】 前記担体ｂ）が第二のポリペプチド配列
    である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成
    物。
  9. 【請求項９】 前記ポリペプチド配列ｂ）が分泌時に少
    なくとも10nmの直径を有する粒子を形成する、請求項８
    に記載の医薬組成物。
  10. 【請求項１０】 前記ポリペプチド配列ｂ）が、HBV Ｓ
    ペプチド、HBV コア抗原、HAV コア抗原及びHIV コア抗
    原並びにポリオウイルス、HAV またはHIV の表面抗原か
    ら成る群から選ばれたポリペプチド配列の実質的部分ま
    たは完全な変更されているか又は変更されていないアミ
    ノ酸配列である、請求項８または９に記載の医薬組成
    物。
  11. 【請求項１１】 前記ポリペプチド配列ｂ）が、 ｉ）粒子形成能が保存される任意の欠失を有することに
    より、 ii）１個もしくは数個のアミノ酸の置換を有することに
    より、または iii)ポリペプチド配列ｂ）のＮ末端、Ｃ末端、もしくは
    配列中への挿入物として追加のアミノ酸を有することに
    より、変更され得る、請求項８〜10のいずれか一項に記
    載の医薬組成物。
  12. 【請求項１２】 前記ポリペプチド配列ｂ）がミリスチ
    ル化される、請求項８〜11のいずれか一項に記載の医薬
    組成物。
  13. 【請求項１３】 前記ポリペプチド配列ｂ）が組換えDN
    A 分子の発現により生産される、請求項８〜12のいずれ
    か一項に記載の医薬組成物。
  14. 【請求項１４】 前記ポリペプチド配列ａ）とｂ）がジ
    スルフィド結合により結合される、請求項１〜６または
    ８〜13のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 前記ポリペプチド配列ａ）とｂ）が
    「疎水的固定」（ミリスチン酸により媒介される）によ
    り結合される、請求項１〜６または８〜14のいずれか一
    項に記載の医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 前記ポリペプチド配列ａ）とｂ）がペ
    プチド結合により結合され、ここで、所望によりポリペ
    プチド配列ａ）とポリペプチド配列ｂ）との間にスペー
    サー配列が挿入され、前記スペーサー配列はペプチド結
    合を介してポリペプチド配列ａ）とｂ）に結合される、
    請求項１〜６または８〜15のいずれか一項に記載の医薬
    組成物。
  17. 【請求項１７】 前記ポリペプチド配列ａ）と前記ポリ
    ペプチド配列ｂ）が同一の組換えDNA 分子上で縦列にお
    いてコードされる、請求項16に記載の医薬組成物。
  18. 【請求項１８】 前記ポリペプチド配列ａ）と前記ポリ
    ペプチド配列ｂ）が前記DNA 分子上の単一の転写解読枠
    から発現され、そしてその単一の転写解読枠において同
    じくコードされるスペーサーポリペプチド配列により隔
    てられることがある、請求項17に記載の医薬組成物。
  19. 【請求項１９】 前記組成物が静脈内または筋肉内注射
    による投与のためのものである、請求項１〜18に記載の
    医薬組成物。
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