JP2001019643A - 慢性ウイルス性肝臓病に対する治療薬として用いる組成物 - Google Patents
慢性ウイルス性肝臓病に対する治療薬として用いる組成物Info
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Abstract
治療用医薬組成物であって、a)前記肝炎ウイルスの1
または複数の抗原性T細胞活性化エピトープを有する少
なくとも1つのポリペプチド配列と、b)エピトープ配
列a)を提示することができる担体、との組合せを含ん
で成り、前記ポリペプチド配列a)が共有結合または疎
水結合により担体b)に結合されることを特徴とする医
薬組成物。
Description
治療薬を提供するためのポリペプチド配列と担体とを含
んで成る組成物に関する。本発明は、前記ポリペプチド
配列をコードするDNA配列および前記DNA配列の発
現のためのトランスフェクトされた細胞に関する。少な
くとも5種のウイルス、即ちA,B,C,DおよびE型
肝炎ウイルスが急性肝炎の臨床的局面を開始させること
ができる。腸内的に感染するA型肝炎とE型肝炎は患者
の死をもたらすのとは異り、B型、C型(以前は非経口
性非A非B型肝炎と呼ばれた)およびD型肝炎は炎症の
慢性段階に進行することがあり、これが次いで肝硬変や
一次性肝細胞癌を引き起こし得る。
方法並びに各ウイルスに関して入手できるデータは比較
的少ない。D型肝炎ウイルスは、不完全であることが知
られているRNAウイルスである。従って、それは患者
中で発達するためにヘルパーウイルスを必要とし、HB
Vに感染した個体においてのみ見つかる。ごく最近にな
ってようやくC型肝炎ウイルスが検出され、慢性C型肝
炎感染の診断を容易にする抗体試験(抗HCV)が開発
された。しかしながら、この病気を直す治療法に対する
緊急な要望がますます高まっている。
ルス並びにウイルスの生活環およびDNA配列に関して
より詳しく研究された病気である慢性B型肝炎にも同じ
ことが当てはまる。ウイルスDNAが10週間よりも長
く存続している場合、またはB型肝炎表面抗原(HBs
Ag)が6か月より長く存続している場合、患者はB型
肝炎ウイルスの慢性保有者であると言われる。
かっていると思われ、その大部分が極東に住む人々であ
る。それらの人が感染する主な危険性は、慢性的に感染
した母親がウイルスを新生児に伝達するため、出産中ま
たは出産直後であると思われる。こうして感染した子供
の90%は、その後の人生の間に同じように慢性感染状
態になるだろう。西欧諸国では、より頻繁には人生の後
期、幼児期または成人になってさえも、主に非経口的ま
たは性的伝染によって、感染が起こる。誕生後のB型感
染の場合には、感染者の5〜10%のみが慢性保有者に
なる。しかしながら、転移されたウイルスは、感染者が
ウイルスを排除するのかまたはそれを体内に終生保持す
るのかのいずれかを示す明確な反応を招かない。従っ
て、それは将来の身体状態を決定する免疫学的状態の問
題であると思われる。
る構造タンパク質であるコアタンパク質と表面(S)タ
ンパク質とから構成される。後者は、3つのS型領域の
コード配列(その各々は生体内で翻訳を開始することが
できるATGトリプレットで始まる)を包含する転写解
読枠の翻訳産物である。それらの領域は、該分子の5′
から3′末端の順序でプレS1、プレS2およびSと呼
ばれる。このORFから6つのタンパク質産物:S領域
のみから翻訳される主要タンパク質のグリコシル化形と
非グリコシル化形(gp27とp24)(226アミノ
酸)(以下、HBV Sペプチドと称する)、1本また
は2本の多糖類鎖(それぞれgp33及びgp36)を
有しプレS2とS領域によりコードされる中央タンパク
質(281アミノ酸)(以下、HBV 2Sペプチドと
称する)、そして最後に、プレS1、プレS2およびS
の翻訳により形成される大型タンパク質のグリコシル化
形(gp24)と非グリコシル化形(p39)(ウイル
スの抗原型に依存して389〜400アミノ酸)(以
下、HBV S1ペプチドと称する)が誘導される。コ
アタンパク質はHBcAgとHBeAgであり、後者の
タンパク質はおそらくHBcAgのプロセシング産物で
あろう。コアタンパク質はプレ−コアペプチドを有する
ことができる。
コアタンパク質と表面タンパク質の両方を含んで成り、
一方フィラメントは6種の表面抗原の混合物から成る。
HBV S,S1及びS2ペプチド(本明細書に定義す
る)は単独で凝集すると、完全に非感染性であるいわゆ
る20nm粒子を形成する。
性的HBV感染状態であると見なされる前に幾つかの肝
炎病期を通過する。感染直後は、血清中のHBeAgの
存在により特徴づけられる感染期がくるだろう。HBV
複製の抑制にもかかわらず連続したHBs抗原血は、患
者の細胞性ゲノム中に組み込まれたウイルスDNA配列
の存在を指摘する。組み込まれたウイルス配列では、宿
主細胞が完全なウイルスを合成することはできない。し
かしながら、組み込まれたHBV配列を有する肝細胞は
HBsAgのみを生産することができ、これが患者の血
清中に検出可能であり、慢性B型肝炎の指標である。お
そらく、形質転換された肝細胞は細胞毒性T細胞により
溶解されず、増殖して慢性持続性肝炎(CPH)か慢性
活動性肝炎(CAH)のいずれかを誘発し、これが次い
で肝硬変または一次性肝細胞癌に進行して患者の早熟死
を引き起こし得る。
内因性インターフェロン生産に欠損を示すことが確立さ
れた(Abb ら., 1985: J.Med.Virol. 16, 171-176 )。
これは、血清中のHBeAgとHBV−DNAの存在に
より指摘されるような慢性B型肝炎を有する患者をイン
ターフェロンα(IFNα)で治療することの理論的根
拠であった。多数の患者の管理試行は、インターフェロ
ンαの投与が対照と比較すると有意に増加されたB型肝
炎ウイルス排除をもたらすことを示した。しかしなが
ら、誕生時またはその近辺に感染した患者は、この治療
に応答してセロコンバーションしないと思われる。この
現象は、不運にも保有者の75%をIFNα療法できな
くする。
ロンαの正確な作用形態は不明瞭なままである。それの
抗ウイルス活性が感染細胞を感染から保護するかまたは
HBV感染細胞におけるウイルスの転写、翻訳および複
製を減少させるのかもしれない。インターフェロンは更
に、T細胞、マクロファージおよびNK細胞を活性化さ
せそしてMHCクラスIタンパク質の発現を誘導するこ
とにより免疫調節機能を有する。
は、ウイルスの複製を抑制し、それによって宿主免疫系
をウイルスを排除できるようにするのに十分な防御を付
与する考えである。これは、慢性的にHBVに感染した
個体の治療に向けて抗ウイルス薬、例えばアデニンアラ
ビノシドおよびアデニンアラビノシドモノリン酸を試験
することに至る。しかしながら、患者の半数未満が、持
続的または一時的セロコンバーション(HBeAg+ か
ら抗HBe+ に)のいずれかにより、この治療法に応答
した。それらの抗ウイルス薬の更に不利な面は免疫抑制
性質である。
薬剤としては、インターフェロンβ、アシクログアノシ
ン(アシクロビル)、インターロイキン2、ステロイ
ド、例えばプレドニソロン、およびそれらの組合せが挙
げられる。しかし、それらのいずれもインターフェロン
αでの治療よりも優れた結果を提供することができなか
った。ステロイドの初期投与の後のIFNαの投与を含
む組合せ療法のみが、特定の患者において応答速度を増
加させることができる。
チンパンジーはHBsAg(破傷風毒素に結合させたも
の)での治療でも抗HBsでの治療でも直すことができ
ないことが知られている。更に、慢性的にHBV感染し
た患者をHBV S2及びS1ペプチド(本明細書に定
義する)の投与により免疫処置することが試みられてい
る。この処置はそれらの人において抗HBs抗体形成さ
えも引き起こさなかった。
の慢性保有者は、血清中にHBsAgが検出可能である
ことにより特徴づけられる。従って、本発明に係るMB
VゲノムのプレS1−プレS2−S領域によりコードさ
れるT細胞活性化エピトープを含んで成る組合せがB型
肝炎ウイルスの慢性保有者において免疫化と最終的治癒
を誘導できることは全く予想外であった。上述した技術
の現状を考慮すれば、本発明の目的は、完全な応答(即
ち、HBV複製の持続的阻害、HBV DNAとDNA
ポリメラーゼの喪失、および患者の血清中のHBeAg
とHBsAgの減少そして最終的にはそれらの消失)を
もたらすウイルス性慢性肝臓病の治療のための有効な治
療薬を提供することである。
少なくとも1つのポリペプチド配列と、 b)エピトープ配列a)を提示することができる担体と
の組合せであって、ここで前記ポリペプチド配列a)は
共有結合又は疎水結合により担体b)に結合することが
できる組合せにより達成される。
薬組成物に向けられ、この組成物は、上記a)及びb)
の組合せを含んで成る。すなわち、本発明の医薬組成物
は、a)1又は複数のT−細胞活性化エピトープを有す
る少なくとも1つのポリペプチド配列と、b)該エピト
ープ配列を提示することができる担体の組合せであっ
て、該ペプチド配列a)は共有結合又は疎水結合により
担体b)に結合しているものを患者に投与することによ
り慢性ウイルス性肝炎の治療を行うための医薬組成物に
向けられる。
ことができるポリペプチド配列a)が直接的または間接
的方法でT細胞活性化エピトープの抗原性を媒介するこ
とが重要である。本発明によれば、ポリペプチド配列
a)は、任意のサブタイプ、特にadw,ayw,ad
rおよびadyのB型肝炎ウイルスの1つのポリペプチ
ドであるかまたは2つ以上のポリペプチドの組み合わせ
であることができる。B型肝炎ウイルスに由来するそれ
らのペプチドは、HBVペプチドプレS1、プレS2も
しくはS(本明細書に定義する)またはHBVコア抗原
であることができる。
さらに、(i)少なくとも6個の連続するアミノ酸残基
を含んで成るエピトープが保存される任意の除去によ
り、(ii)1又は少数のアミノ酸の置換を有することに
より、又は(iii)そのN−末端に、そのC−末端に、又
は前記ポリペプチド配列への挿入として追加のアミノ酸
配列を有することにより、変更されている前記のポリペ
プチド又は2以上の該ポリペプチドの組合せのいずれか
である。しかしながら、これらの場合のそれぞれにおい
て、生物学的活性が維持されていることが必須である。
疎水性結合又は付着を助けるため、ポリペプチド配列
a)はミリスチル化されているのが好ましい。
組合せにおいてポリペプチド配列a)が担体b)上に提
示されることが必要である。この担体は、例えば疎水性
ポリマー粒子、無機粒子または多糖粒子から成ることが
できる特定の物質から成る。好ましくは、担体b)は、
分泌時に粒子を形成する第二のポリペプチド配列であ
り、前記粒子は好ましくは少なくとも10nmの直径を有
する。粒子を形成するポリペプチド配列b)は、HBV
Sペプチド(本明細書に定義する)、HBVコア抗
原、HAVコア抗原、HAV表面抗原、HIV表面抗原
およびHIVコア抗原並びにポリオウイルスの表面抗原
から成る群から選ぶことができるポリペプチドの実質的
部分または完全なアミノ酸配列であることが好ましい。
粒子形成担体b)として好ましいのは、HBVのSペプ
チドおよび/またはコアペプチドである。
ペプチドは、(i)任意の除去を有することにより、
(ii)1又は少数のアミノ酸の置換を有することによ
り、又は(iii)そのN−末端に、そのC−末端に、又は
該ペプチド配列b)への挿入として、変更されていても
よい。但し、粒子形成能が維持されていることを前提と
する。疎水結合の形成を助けるため、ポリペプチド配列
b)はミリスチル化される。
ば、両配列a)とb)を次の相互作用:疎水的固定(ミ
リスチン酸により媒介される)、ジスルフィド結合形
成、のうちの1つまたは複数によって結合することがで
き、または両配列をペプチド結合により連結して融合ペ
プチドを形成せしめることができる。後者の場合、所望
によりポリペプチド配列a)とポリペプチド配列b)と
の間にスペーサー配列を挿入することができ、このスペ
ーサー配列はペプチド結合によって両ポリペプチドに結
合される。
療用医薬の製造に有用である、或る組合せをコードする
組換えDNA分子を提供する。この組換えDNA分子
は、少なくとも1つの第一のDNA配列、所望により第
二、第三および/または第四のDNA配列を含んで成
り、ここで i)前記少なくとも1つの第一のDNA配列は、上記で
定義した少なくとも1つのポリペプチド配列a)をコー
ドし、 ii)前記第二のDNA配列は、粒子形成ペプチドの上記
定義に従ったポリペプチド配列b)をコードし、 iii )前記第三のDNA配列はスペーサー配列をコード
し、そして iv)前記第四のDNA配列は選択マーカーをコードし、
そして前記DNA配列は発現に不可欠なDNA要素によ
り調節され、所望により共通の読み枠を有する。
って指定されるという事実を鑑みれば、上記で定義した
ペプチド配列a)およびb)をコードする、本発明に包
含される幾つかのDNA配列が存在する。この他に、本
発明は、ヌクレオチドの30%までが置換され得るとい
う事実により上記で定義した組換えDNA分子とは異な
る組換えDNA分子も更に包含する。
ドする組換えDNA分子によりトランスフェクトされた
宿主細胞を提供することであり、該宿主細胞は慢性的H
BV感染患者の治療に有用である。この宿主細胞は哺乳
動物、酵母または細菌細胞であることができる。本発明
の目的上、この宿主細胞が上記組合せ中に含まれるポリ
ペプチド以外のいずれの霊長類血清タンパク質やヒト血
清タンパク質も生産しないことが好ましい。
プチド」は、HBVゲノムの全S領域(すなわちプレ−
S1及びプレ−S2領域を除く)によりコードされるペ
プチドを言う。本明細書中で使用する用語「HBVプレ
S2ペプチド」は、HBVゲノムの完全なプレS2とS
領域によりコードされるペプチドを言う。本明細書中で
使用する用語「HBVプレS1ペプチド」は、HBVゲ
ノムの完全なプレS1、プレS2およびS領域によりコ
ードされるポリペプチドを言う。本明細書中で使用する
用語「エピトープ」は、指定のゲノム領域によりコード
される少なくとも6つの連続アミノ酸の配列を言う(例
えば、「HBVプレS2エピトープ」とはHBVゲノム
のプレS2領域によりコードされる少なくとも6つの連
続アミノ酸の配列を言う)。
ープ」は、T細胞の表面上のレセプターと相互作用して
免疫応答を増強するかあるいは免疫応答をもたらすエピ
トープを言う。本明細書中で使用する「抗原性」は、免
疫応答を惹起せしめる能力(例えば抗原として作用す
る)、抗体産生を引き起こす能力(例えば抗原として作
用する)および/または表面細胞レセプターと相互作用
して免疫応答もしくは抗体産生を増強するような能力を
意味する。
Nature 第280 巻、815 頁(1979);Gerlich, EP-A-85 1
11 361; Neurath, EP-A-85 102 250 〕中に記載された
ウイルスの任意のサブタイプ、特にadw,ayw,a
drおよびayrを意味する。1または複数のエピトー
プの抗原性を媒介するポリペプチド配列a)を構成する
そのペプチド配列の例を、配列表(配列番号17〜2
0,22)に示す。
る: −HBVゲノムのプレ−S1、及び/又はプレ−S2領
域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ(決
定基)を有するHBV S−抗原粒子; −HBVゲノムのプレ−S1、プレ−S2、及び/又は
S領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ
(決定基)を有するHBVコア−抗原粒子; −HBVゲノムのS、プレ−S1及び/又はプレ−S2
領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ
(決定基)を有する肝炎A−抗原粒子。
は、1または複数のT細胞エピトープの抗原性を媒介す
るポリペプチド配列a)をコードする配列、および分泌
時に10nm以上の直径を有する粒子を形成するポリペプ
チドb)をコードする配列(両配列とも適当なプロモー
ターの調節下にある)の存在により特徴づけられる。
a)をコードする配列の例としては、配列表の配列番号
1〜24又は28〜34のもとに記載した配列を挙げる
ことができる。ポリペプチド配列b)をコードするDN
A配列の例は、配列表の配列番号25〜27又は35の
配列のいずれかにより表される。
れかを配列表中の配列番号25〜27のもとに開示され
る配列と組み合わせることができ、この場合a−bとb
−aの両方の順序が包含される。特に好ましい本発明の
態様は、粒子形成物としての配列番号26および/また
は27の配列と組み合わせた配列番号28のエピトープ
(HBVのS1配列のアミノ酸9〜28を含む配列に相
当する)の組合せを含んで成る。
する肝炎ウイルス配列は、制限断片の単離と連結、合成
装置(Cyclon, Bio-Search)を使ったオリゴヌクレオチ
ドの化学合成、およびPCR法による合成〔T.J.White,
N.Arnleim, H.E.Erlich, 1989, The Polymerase Chain
Reaction, Technical Focus 5 (6)〕を包含する任意の
手段により作製または単離することができる。
ヌクレオチドをHBVゲノムのS領域からの5′Xba
I−BglII 3′断片(配列番号27)(これは完全
なプレS1−プレS2−S領域を含むBglII−Bgl
II HBV断片から誘導される)に、または完全なS領
域に連結せしめることにより作製した。そのような構成
物の作製に用いるオリゴヌクレオチドを下の表1に要約
する。
り調製されそしてT細胞エピトープをコードするコア配
列を、ポリペプチド配列b)として機能するHBVのコ
ア配列(配列番号25)に連結せしめることにより作製
した。それらの構成物の作製に用いるオリゴヌクレオチ
ドを表II−1に与える。
りT細胞エピトープをコードするDNA配列を単離し、
そして上記に定義したポリペプチド配列b)をコードす
る配列に連結せしめた幾つかの例を示す。
する。それらの作製方法は実施例の中でより詳細に記載
する。
リペプチドa)およびb)をコードする領域に加えて、
選択マーカーをコードする追加のDNA配列を含んで成
る。更に、それらは発現に不可欠な全ての有用な要素、
例えばプロモーター配列、開始コドンおよびポリアデニ
ル化配列を含んで成る。適当なプロモーターの例は、宿
主細胞として哺乳動物細胞を使った場合、メタロチオネ
イン(MT)、U2およびH2Kプロモーターである。
酵母または細菌細胞を使う予定ならば、それぞれ適当な
酵母および細菌プロモーター、例えばGCN4およびG
AL 1/10プロモーター、または原核性trpおよ
びtacプロモーターをそれぞれ使うことができる。
チドb)の組合せを生産するためには、組換えDNA分
子をトランスフェクションにより(哺乳動物細胞の場
合)、形質転換により(酵母および細菌細胞の場合)ま
たは他の手段により、宿主細胞中に挿入する。組換えD
NA分子を転写および翻訳することのできる任意の生物
の細胞、例えば哺乳動物、細菌および酵母細胞を宿主と
して使用することができる。
ば、VERO細胞(サル腎臓細胞系)、3T3,C12
7およびL細胞(マウス繊維芽細胞系)、並びにCHO
(チャイニーズハムスター卵巣)細胞であり、それらは
デヒドロ葉酸レダクターゼが陽性または陰性のいずれか
である。本発明の特定態様によれば、それぞれポリペプ
チド配列a)とポリペプチド配列b)をコードする上記
に定義した第一のDNA配列と上記に定義した第二のD
NA配列が、異なる組換えDNA分子中に存在すること
も更に可能であり、その場合、それらの組換えDNA分
子の両者により宿主細胞が同時トランスフェクトされ
る。
ための適当なDNA配列の組合せ方法についての大要を
示す。この表に示されるいずれの構成物も、組み合わせ
て、宿主細胞中にトランスフェクトされると取り込まれ
て慢性ウイルス性肝炎の治療用医薬としての組合せ〔ポ
リペプチドa)とb)を含んで成る〕を生産することの
できるDNA配列を提供することができることに注意す
べきである。T細胞エピトープ配列をコードするDNA
配列は、Biosearch Cyclon合成装置を用いて合成的に
(SYN)、PCR法により(PCR)、またはウイル
スゲノムの制限酵素切断により(GENE)、調製し
た。
ために、ポリペプチド配列a)と担体b)の組合せを、
任意の種類の医薬組成物中に製剤することができる。該
医薬組成物は、適当な希釈剤または医薬担体材料、例え
ば緩衝液を更に含んで成る。投与は、任意の方法、即ち
非経口(例えば静脈内または筋肉内)または経口(例え
ば活性物質を被包する細菌細胞を使うことによって)に
より行うことができる。医薬組成物は、投与によって応
答を惹起せしめるのに十分な濃度において上記の組合せ
を含んで成る。本発明を次の実施例により更に詳細に説
明する。
澱 HBVタンパク質を生産する培養物の上清を収集し、
2,400ml部分に分けた。各部分に144gのPEG
6000(Serva )を添加し、室温で20分間攪拌し
ながら溶解させ、更に4℃で6時間攪拌した。500ml
容器中でGS 3ローター中で10℃にて9,000rp
m (15,000×g)で30分間遠心することにより
沈澱を分離した。上清を収集し、144gのPEG 6
000を添加し、上記と同様に溶解させた。その溶液を
4℃で3時間攪拌した。遠心を60分間続けたこと以外
は上記と同様にしてこの溶液から沈澱を回収した。
し、A−5m(BioRad)上でのゲルクロマトグラフィー
にかけた。カラム寸法は25×1000mmおよび480
mlのベッド容積であった。典型的な分画操作では、PE
G沈澱したHBVタンパク質1,000μgを10〜1
5mlにおいて負荷し、そして6滴/分(18ml/時)の
速度でPBSを使って溶出せしめた。3mlの画分を収集
した。HBVタンパク質は最初のピークに溶出した。収
集した画分をCsCl勾配にかけた。
ークを包含し且つ予備精製されたHBVタンパク質を含
む約30画分を約100mlに集めた。この溶液をCsC
lで1.30g/ccの密度に調整し、次いでSW 27
/28ローター(Beckman )に合ったポリアロマー試験
管に移した。1.35g/ccのCsCl溶液4mlを下層
しそしてその上に1.25g/ccの密度の溶液4mlを、
次いで1.20g/ccの密度の溶液4mlを重層すること
により、勾配を設定した。この勾配を10℃にて28,
000rpm において50時間実施し続けた。その後、勾
配を分別し、1.20g/cc密度の層中に浮いている精
製HBVタンパク質を収集した。透析袋中での水に対す
る3回の透析により、この溶液を脱塩した。
ノアッセイ(Abbot から市販されている)において、B
型肝炎表面抗原に対するモルモット抗体(抗HBs)が
コーティングされたビーズを、血清、血漿または精製タ
ンパク質および適当な対照と共にインキュベートした。
存在し得るHBsAgを固相抗体に結合させた。未結合
物質を吸引しそしてビーズを洗浄した後、ヒト 125I−
抗HBsをビーズ上の抗体−抗原複合体と反応せしめ
た。次いでビーズを洗浄して未結合の 125I−抗HBs
を除去した。
カウンター中でカウントした。
アッセイ(Behring から市販されている)において、ウ
エルを抗HBsでコーティングした。血清、血漿または
精製タンパク質と適当な対照をウエルに添加し、インキ
ュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識HBSA
g抗体を残余の抗原決定基と反応せしめた。未結合の酵
素接合抗体を洗浄により取り除き、そして固相上の酵素
活性を測定した。過酸化水素と色素原との酵素触媒反応
を希硫酸の添加により停止させた。色の強度は試料のH
BsAg濃度に比例し、HBsAg濃度は、未知試料の
色の強度と付随の正および負の対照血清の色の強度との
分光学的比較により得られた。
本発明の遺伝子構成物の調製 1.MTプロモーターの単離 プラスミドpBPV−342−12(ATCC 372
24)をエンドヌクレアーゼBglIIとBamHIで消
化した。3つのDNA分子が生成した。着目の断片は、
4.5kbを有しメタロチオネインプロモーターとpBR
322配列を含み、他の断片(2.0kbおよび7.6k
b)から容易に識別可能である。
素100単位を含む0.5μg/μl DNAの最終濃
度において反応を実施した。消化の完結は、37℃で3
時間のインキュベーション後に0.8%アガロースゲル
上でのアガロースゲル電気泳動により確認した。反応は
4μlの0.5M EDTAの添加により停止させた。
調製用1.2%アガロースゲル電気泳動により4.5kb
断片を他の断片から分離した。DNAをアガロースゲル
からDE−81 Whatman濾紙上に溶出せしめ、
その濾紙から高塩緩衝液中でDNAを取り出した。フェ
ノール−クロロホルム抽出と2回のエタノール沈澱によ
りDNAを精製した。
断片の連結 HBV含有DNAからHBVコアコード領域を含む1.
8kbのBamHI−BamHI断片を単離した。この断
片を、MTプロモーターとpBR残基を含む4.5kb断
片(1に記載)と一緒に連結せしめた。2μlの1.8
kb断片を3μlの4.5kb断片と混合し、2単位のDN
Aリガーゼと2mMのATPを含む総容量10μlの連結
緩衝液中で14℃にて一晩連結せしめた。
ンピテント細菌細胞懸濁液150μlに添加した。DN
A取り込み後、50μl/mlのアンピシリンを含むLB
寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液50〜3
00μlの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレー
トを37℃で一晩インキュベートした。1つの単離した
細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在に
ついてスクリーニングした。
のスクリーニング 単一コロニーを爪楊枝で取り、LB−アンピシリン培地
の入った試験管(5ml)に移した。この試験管を迅速振
盪環境下で37℃にて一晩インキュベートした。各増殖
細菌懸濁液のミニプラスミド調製物を作製した。種々の
生成したDNAを制限エンドヌクレアーゼBglIIでの
消化により確かめた。2つの分子、400bp断片と5.
9kb断片が期待された。消化物をアガロースゲル電気泳
動により分析した。細菌細胞からプラスミドDNAを単
離した。
での消化により直鎖状にした。50μlの総容量および
1μg/μlプラスミドDNAの最終濃度において反応
を実施した。50単位のEcoRIを添加し、37℃で
3時間インキュベーションした後でアガロースゲル電気
泳動により消化を確かめた。1μlの0.5M EDT
Aの添加により反応を停止させ、そして最終濃度0.3
Mの酢酸ナトリウムと3〜4容のエタノールを用いて−
80℃にて30分間DNAを沈澱させた。沈澱したDN
Aを50μlの蒸留水に溶かした。
インプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むDN
A断片〔プラスミドpMT−neo−E(ATCC/Exogen
e から入手可能)からエンドヌクレアーゼEcoRIで
の消化により3.9kb断片として単離したもの〕3μl
と混合し、一緒に連結せしめた。単一の細菌コロニーを
所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。
離 プラスミドpUC−8−42(Exogene から入手可能)
を制限エンドヌクレアーゼEcoRIとApaIで消化
した。2つのDNA分子が生成した。着目の断片は、3
40bpを有するU2プロモーターを含み、他方の断片
(3160bp)から容易に検出可能である。
素100単位を含む0.5μg/μlのDNA最終濃度
において反応を実施した。消化の完結は、37℃で3時
間のインキュベーション後に0.7%アガロースゲル中
でのアガロースゲル電気泳動により確認した。4μlの
0.5M EDTAの添加により反応を停止させた。調
製用1.2%アガロースゲル電気泳動により340bp断
片をプラスミドDNAから分離した。DNAをアガロー
スゲルからDE−81 Whatman濾紙上に溶出せ
しめ、その濾紙から高塩緩衝液中でDNAを取り出し
た。フェノール/クロロホルム抽出と2回のエタノール
沈澱によりDNAを精製した。
ーター配列含有断片の挿入 ポリリンカー配列(次の制限部位を含む:EcoRI,
SacI,SmaI,AvaI,BamHI,BglI
I,SalI,PstI,HindIII )を含むプラス
ミドpSP165(Promega Biotec から入手可能)を
制限酵素EcoRIにより直鎖状にした。50μlの総
容量において1μg/μlプラスミドDNAの最終濃度
で反応を実施した。50単位のEcoRIを添加し、そ
して37℃にて3時間のインキュベーション後にアガロ
ースゲル電気泳動により消化を確かめた。1μlの0.
5M EDTAの添加により反応を停止させ、最終濃度
0.3Mの酢酸ナトリウムと3〜4容のエタノールを用
いて−80℃にて30分間DNAを沈澱させた。沈澱し
たDNAを50μlの蒸留水に溶かした。
ター配列を含むDNA断片10μlと混合し、2単位の
T4−DNAリガーゼと2mMのATPを含有する総容量
25μlの連結緩衝液中で14℃にて一晩連結せしめ
た。その後、フェノール/クロロホルム抽出に次いで2
回のエタノール沈澱によりDNAを精製し、そして10
μlの蒸留水に溶解させた。生成したEcoRIとAp
aI粘着末端を平滑末端に変換して連結させなければな
らなかった。
との反応により粘着末端を平滑末端に変換した:反応緩
衝液中のDNA(1μg/μl濃度)25μlに20単
位の酵素を添加し、1%グリセロールの最終濃度と35
μlの最終反応容量を与えた。30℃にて30分間のイ
ンキュベーション後、フェノール−クロロホルム抽出に
続く2回のエタノール沈澱によりDNAを精製した。こ
のDNAを再度5μlの蒸留水に溶かした。生じた平滑
末端を、上記で使用したものより10倍高いT4リガー
ゼと2mMのATPを含む15μlの反応液中で14℃に
て一晩一緒に連結せしめた。
50μlのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。D
NA取り込み後、50μl/mlのアンピシリンを含むL
B寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液50〜
300μlの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレ
ートを37℃で一晩インキュベートした。単一の単離し
た細菌コロニーを、所望のU2プロモーター断片を含む
プラスミドの存在についてスクリーニングした。得られ
たプラスミドを細菌細胞から単離し、制限酵素分析によ
り特徴づけた。
(配列番号:30)とMTプロモーター断片(4.5k
b)との連結 MTプロモーターとpBR残基を含む4.5kb断片(1
に記載)を合成オリゴヌクレオチド89(配列番号:3
0)と一緒に連結せしめた。この連結混合物をDNA取
り込みのため150μlのコンピテント細菌細胞懸濁液
に添加した。単一の単離した細菌コロニーを、所望のプ
ラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラ
スミドをエンドヌクレアーゼEcoRIとXbaIでの
消化により確かめた。1つは2.0kbで1つは2.6kb
の2つの分子が期待された。
番号:32)とプラスミド(7に記載)との連結 プラスミド(7に記載)をBglIIとBamHIで消化
し、13ヌクレオチドの断片を取り出した(1に記
載)。第一のオリゴヌクレオチド89(配列番号:3
0)を含む生成断片を、BglII−BamHI断片であ
るオリゴヌクレオチド101(配列番号:32)と連結
せしめた。DNA取り込み後、単細胞を所望のプラスミ
ドについてスクリーニングした。新規プラスミドをエン
ドヌクレアーゼEcoRIとXbaI、またはEcoR
IとBglIIでの消化により確かめた。
(配列番号:31)と4.5kb断片(1に記載)との連
結 4.5kb断片(BglII−BamHI)をDNAオリゴ
ヌクレオチド99(配列番号:31)と連結せしめた。
様々なDNAを含む単一細菌コロニーのスクリーニング
後、所望のプラスミドをEcoRIでの消化(1.9kb
と2.7kbの2断片を生じる)とBglIIまたはBam
HIでの陽性の線状化により特徴づけた。次いでこの新
規プラスミドをPstIとBamHIで消化した。pB
R残基、MTプロモーターおよびオリゴヌクレオチドを
含む2.6kb断片と、2.0kbのpBR残基の2つの分
子が期待された。2.6kb断片を単離した。
片とプラスミド(8に記載)から単離した断片との連結 DNAオリゴヌクレオチド89と101(それぞれ配列
番号30と32)を含むプラスミド(8に記載)をPs
tIとBglIIで消化した。2断片が期待された。1つ
はpBR残基とMTプロモーターを含む2.5kb断片
で、もう1つはpBR残基と両方のオリゴを含む2.2
kb断片であった。
基、MTプロモーターおよびオリゴ99(配列番号:3
1)を含む2.6kb断片と連結せしめた。所望のプラス
ミドについてスクリーニングした後、それをBglII−
XbaIを使った制限エンドヌクレアーゼ消化により特
徴づけた。オリゴDNAヌクレオチドの270bp断片お
よびMTプロモーターとpBRの4.5kb断片の2断片
が期待された。
lII断片の連結 HBV含有DNAから、HBVプレS1、プレS2およ
びSコード領域を含む2.3kbのBglII−BglII断
片を単離した。この2.3kb断片を、メタロチオネイン
プロモーターを含む4.5kb断片(1に記載した通りに
得た)と連結せしめた。2μlの2.3kb断片を3μl
の4.5kb断片と混合し、そして2単位のT4−DNA
リガーゼと2mMのATPを含む総容量10μlの連結緩
衝液中で14℃にて一晩連結せしめた。
50μlのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。D
NA取り込み後、50μl/mlのアンピシリンを含むL
B寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液50〜
300μlの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレ
ートを37℃で一晩インキュベートした。単離した単一
の細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在
についてスクリーニングした。
遺伝子配列の一部分の変換 上記の11から得られたプラスミドをエンドヌクレアー
ゼBglIIとXbaIで消化した。1つが550bp断片
で1つが6.25kb断片である2つの分子が期待され、
アガロースゲル電気泳動後に6.25kb断片を単離し
た。6.25kb断片を、HBVコア遺伝子のエピトープ
部分をコードする10に記載のプラスミドの270bp断
片(上記と同様なBglIIとXbaIでの消化および断
片の単離後)と連結せしめた。この連結混合物をDNA
取り込みのため150μlのコンピテント細菌細胞懸濁
液に添加した。単離した単一の細菌コロニーを所望のプ
ラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラ
スミドをBamHIでの消化により確かめた。950b
p,450bpおよび5,150bp断片の3分子が期待さ
れた。
化した。2,450bp断片と4,350bp断片の2分子
が期待され、ゲル電気泳動後4,350bp断片を単離し
た。この4,350bp断片を、ATGからXbaI部位
までのHBV−S遺伝子の全DNA配列をコードし、A
TGがATAに変更されているDNAオリゴヌクレオチ
ド39(配列番号:29)と連結せしめた。
アエピトープ 次いでこの「ビヒクル」プラスミドをPstIとXba
Iで消化すると、600bpプラスミド残基と3,850
bp断片の2分子が期待され、後者の断片を単離し、10
に記載のプラスミドの消化後に単離された2,800bp
(2,700bp)のPstI−XbaI断片と連結せし
めた。所望のプラスミドについてスクリーニングした
後、それをEcoRIとXbaI、EcoRIとBgl
IIとBamHIを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に
より特徴づけた。
状にした。50μlの総容量および1μg/μlのプラ
スミドDNAの最終濃度において反応を実施した。50
単位のEcoRIを添加し、37℃で3時間インキュベ
ーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確か
めた。1μlの0.5M EDTAの添加により反応を
停止させ、そして最終濃度0.3Mの酢酸ナトリウムと
3〜4容のエタノールを用いて−80℃にて30分間D
NAを沈澱させた。沈澱したDNAを50μlの蒸留水
に溶かした。直鎖状プラスミド2μlを、メタロチオネ
インプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むDN
A断片(4に記載)3μlと混合し、一緒に連結せしめ
た。単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在につ
いてスクリーニングし、プラスミドを単離しそして特徴
づけた。
BglIIでの消化後、MTプロモーター含有DNA断片
を、EcoRIとBglIIによる消化後に単離されたU
2プロモーター含有DNA断片によって置き換えること
により、U2プロモーターを使って作製することもでき
る。
ボシルトランスフェラーゼ(egpt)選択遺伝子の単
離 プラスミドpMSGをBamHIとBglIIで消化した
後、egpt選択遺伝子を含む断片(1.8kb)を単離
し、そしてMTプロモーターを含む4.5kb断片(Bg
lII−BamHI、1に記載)と連結せしめた。所望の
プラスミドについてスクリーニングした後、プラスミド
を単離し、精製し、そしてBamHI部位からEcoR
I部位への変換により完成させた。
単離 1つのDNA断片(400bp)をゲル電気泳動後に単離
した。その断片は、プライマーとして特定のオリゴヌク
レオチド131と132(配列番号:33と34)を使
ってPCR法(実施例5に記載)により作製された。こ
のDNA断片をエンドヌクレアーゼBamHIとXba
Iで消化し、次いでゲル電気泳動により精製した。単離
したPCR断片を、プラスミド(13に記載)からBg
lIIとXbaIでの消化後に単離された6.25kb断片
と連結せしめた。DNAの取り込みと細菌の形質転換
後、単一の細菌コロニーを所望のプラスミドについてス
クリーニングした。
を付加することによりプラスミドを完成させた。 19.H2Kプロモーターの単離 pSP65H2(Exogene から入手可能)からEcoR
I−BglII断片(2kb)としてH2Kプロモーターを
単離した。上述の全ての構成物において、どのプロモー
ターもEcoRI/BglII断片として交換することが
できる。
ゼBglIIとXbaIで消化した。2分子が期待され、
その1つが6.250kb断片であり、その断片をアガロ
ースゲル電気泳動後に単離した。6.250kb断片をオ
リゴDNAヌクレオチド23(配列番号:28)と連結
せしめた。この連結混合物をDNA取り込みのため15
0μlのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単一
の単離した細菌コロニーを所望のプラスミドの存在につ
いてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌク
レアーゼEcoRIとBglIIでの消化により確かめ
た。1つが1.9kbで1つが4.450kbの2分子が期
待された。
状にした。100μlの総容量および0.6μg/μl
プラスミドDNAの最終濃度において反応を実施した。
60単位のEcoRIを添加し、37℃で3時間インキ
ュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を
確かめた。2μlの0.5M EDTAの添加により反
応を停止させ、そして最終濃度0.3Mの酢酸ナトリウ
ムと4容のエタノールを用いて−80℃にて1時間DN
Aを沈澱させた。沈澱したDNAを50μlの蒸留水に
溶かした。
インプロモーターとegptg選択遺伝子を含むDNA
断片(3.7kb)(16に記載)3μlと混合し、一緒
に連結せしめた。単一のコロニーを所望のプラスミドの
存在についてスクリーニングした。上記と同じ方法で表
III に記載の各遺伝子構成物を調製することができる。
ション 本発明の構成物によりコードされるHBVペプチドの相
当量の分泌を獲得するためには、本発明のDNA構成物
を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトせしめなけれ
ばならない。二段階で(即ち、各構成物について別々の
トランスフェクション)または一段階で(即ち、両構成
物の調製物を使った1回のトランスフェクション)同時
トランスフェクションを実施した。2つの構成物上での
異なる選択マーカーの使用により、またはイムノアッセ
イによる両構成物の発現産物の分泌の検出により、同時
トランスフェクションを確かめた。
コードする配列と、完全なSまたはコアまたはHAVタ
ンパク質をコードする別の配列とを、単一構成物中に組
み合わせることができる。
域の特定のDNAヌクレオチド配列を試験管内で百万倍
以上に増幅することが可能である(Thomas J.White, No
rman Arnleim, Henry A.Erlich 1989: The polymerase
chain reaction. Technical Focus 、第5巻、第6号;
S.KwokおよびR.Higuchi 1989: Avoidingfalse positive
s with PCR. Nature 、第339 巻、237-238 頁)。
DNAを処理してそれの相補的鎖を分離する。次いでそ
れらの鎖を、Xヌクレオチド(ここでXは通常50〜
2,000塩基対である)により隔てられた配列とマッ
チするように化学的に合成された過剰の2つのDNAオ
リゴヌクレオチド(各々長さ20〜25塩基対)とアニ
ールせしめる。
オリゴヌクレオチドと一致する配列の間でDNAを複製
するDNAポリメラーゼにより触媒される試験管内DN
A合成のための特異的プライマーとして働く。2つのプ
ライマーオリゴヌクレオチドが正しい配列を含むなら
ば、5′と3′に新たな消化部位を造成することが可能
である。
量のDNA断片が得られ、それをゲル電気泳動により精
製し、そして制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動に
より特徴づけた。増幅された精製DNA断片を他の断
片、即ちプラスミドと連結せしめるために使った。PC
R−DNA断片は平滑末端で増幅された。粘着末端を与
えるために(連結操作のため)、該断片を所望のエンド
ヌクレアーゼで消化し、再度精製しなければならない。
るだろう。1サイクルは、異なる反応時間と異なる反応
温度(PCR熱循環器により制御される)により3段階
に分けられる。第一段階は鋳型DNAの「変性」(1分
/95℃)であり、第二段階は鋳型DNAとプライマー
の「ハイブリダイゼーション」(1分/55℃)であ
り、第三段階は「重合」(2分/72℃)である。1回
のアッセイ用の最終容量は例えば30μlであり、これ
は次の最終濃度を含む:PCR緩衝液(1×)、4種の
ヌクレオチド各200μMを有するヌクレオチド混合
物、2つのプライマー各々を30μlあたり200ng、
aqua bidest 30μlあたり0.5単位の
Taqポリメラーゼ。
胞)を、第1日にペトリ皿中の標準増殖培地(DMEM
+10%ウシ胎児血清、グルコースおよびグルタミン)
中に接種した(1−2×106 細胞/皿、φ10cm)。
翌日、培地を除去し(DNA沈澱を細胞上に添加する4
時間前)、細胞を1×PBSで2回洗浄した。次いでF
CSを含まないDMEM 8mlを添加し、4時間後にD
NA沈澱(下記の如く調製したもの)を細胞に添加し
た。
セロール混合物(2×TBS緩衝液50ml、グリセロー
ル30ml、蒸留水120ml)を添加した。37℃で3分
間のインキュベーション後にグリセロール混合物を即座
に除去し、そして細胞を1×PBSで洗浄した。10%
FCSを含むDMEM 8ml中で細胞を一晩培養し
た。
(0.025%トリプシン+1mM EDTA)で処理す
ることにより細胞を皿から回収した。その後、トリプシ
ン−EDTAを除去するために細胞を1×PBSで洗浄
し、10% FCSを含むDMEM中に懸濁し、そして
24コスターウエルプレートに分配した(1つの皿から
の細胞を4枚の24ウエルプレートに)。
した〔例えば、濃度0.5〜1mg/mlのネオマイシンま
たは、キサンチン(250μg/ml)、ヒポキサンチン
(15μg/ml)もしくはアデニン(25μg/ml)、
チミジン(10μg/ml)、アミノプテリン(2μg/
ml)、ミコフェノール酸(25μg/ml)〕。最初の増
殖中の細胞コロニーは2週間後に認められた。
担体DNA(サケ***DNA、子ウシ胸腺DNA)に、
TE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDT
A、pH7.05)を440μlの最終容量になるように
添加し、そして60μlの2M CaCl2 と混合し
た。次いで等量の2×TBS(Hepes 50mM、N
aCl 280mM、Na2 HPO4 1.5mM、pH7.0
5)を添加し、よく混合した。沈澱溶液を37℃で30
分間インキュベートし、そしてトランスフェクトせしめ
る予定の細胞に直接添加した。
10,000容のチメロゾール、1/10容の濾過滅菌
済0.2M KAl(SO4)2 ・12H2 Oを添加し
た。無菌の1N NaOHでpHを5.0に調整し、そし
て懸濁液を室温で3時間攪拌した。ミョウバン沈澱した
抗原を2,000rpm で10分間の遠心により回収し、
1:10,000チメロゾールを含む無菌の標準食塩溶
液中に再懸濁し、そして無菌条件下でアリコートに分け
た。
より濃縮した。この濃縮物をBeckman SW28
ローター中で4℃にて20,000rpm で15分間の遠
心により清澄化した。Beckman SW28ロータ
ー中4℃にて28,000rpm で24時間のショ糖密度
勾配遠心(0〜45%ショ糖)により粒子形成を試験し
た。勾配を分画し、1画分ずつをELISAにより分析
した。
の幾つかの結果を与える。表IVは、抗プレS1モノクロ
ーナル抗体MA 18/7と抗HBsモノクローナル抗
体G022を用いた、プレS1エピトープとS領域を含
む本発明のHBV配列構成物から生産された精製HBs
抗原粒子のELISAデータを示す。表IVは、CsCl
密度勾配後に収集した画分(21)を示す。
抗体とHB−S−Agに対するモノクローナル抗体G0
22を用いた、本発明の任意のHBコア配列構成物から
生産された精製HBコア抗原粒子のELISAデータを
示す。
おいてB型肝炎表面抗原(S1およびS)を提示する粒
子であり、肝炎ウイルスの慢性保有者の治療に使われ
る。
注射1回あたり18μgの用量においてHepa−Ca
reで処置(筋肉内)した。肝酵素(図IV)並びにB型
肝炎抗原レベル(図V)をモニタリングした。実験2 上記処置後のチンパンジー1を第30,34および38
週に追加免疫処置した。その結果を図VIに示す。実験3 チンパンジー2をHepa−Careで処置した。ただ
し、チンパンジー1とは異なり、静脈内に与えた。用量
は2mgであった。結果を図VII に示す。対照チンパンジ
ー3からも肝酵素をモニタリングし、その結果を図VIII
に示す。
処置(i.m.)した。抗原および抗体測定の結果を図IXと
Xに与える。
(i.m.)した。抗原および抗体測定の結果を図XIとXII
に与える。
処置(i.m.)した。HBs抗原および抗HBs抗体の測
定値を図XIIIとXIV に示す。
選択遺伝子をコードするDNA構成物を示す(実施例3
/4に記載)。
を有するエピトープおよび選択遺伝子をコードするDN
A遺伝子構成物を示す(実施例3/18に記載)。
るエピトープおよび選択遺伝子をコードするDNA構成
物を示す(実施例3/21に記載)。
ジー1のAST値を示す(実施例10/1に記載)。
ジー1の抗原値を示す(実施例10/1に記載)。
置したチンパンジー1の肝酵素ATLとGGT値を示す
(実施例10/2に記載)。
ジー2の肝酵素ALT,ASTおよびGGT値並びに抗
原値を示す(実施例10/3に記載)。
定された肝酵素を示す(実施例10/3に記載)。
抗原価を示す(実施例11に記載)。
1の抗体価を示す(実施例11に記載)。
2の抗原価を示す(実施例11に記載)。
2の抗体価を示す(実施例11に記載)。
3の抗原価を示す(実施例11に記載)。
3の抗体価を示す(実施例11に記載)。
Claims (19)
- 【請求項1】 肝炎ウイルスにより惹起される慢性肝炎
治療用医薬組成物であって、 a)前記肝炎ウイルスの1または複数の抗原性T細胞活
性化エピトープを有する少なくとも1つのポリペプチド
配列と b)エピトープ配列a)を提示することができる担体と
の組合せを含んで成り、前記ポリペプチド配列a)が共
有結合または疎水結合により担体b)に結合されること
を特徴とする医薬組成物。 - 【請求項2】 前記ポリペプチド配列a)がB型肝炎ウ
イルスのポリペプチドである、請求項1に記載の医薬組
成物。 - 【請求項3】 前記ポリペプチド配列a)がHBウイルス
のプレS1、プレS2およびSペプチド並びにHBコア抗
原から成る群から選ばれた1または複数のメンバーの変
更されているか又は変更されていないアミノ酸配列であ
る、請求項2に記載の医薬組成物。 - 【請求項4】 前記ポリペプチド配列a)が、 i)少なくとも6個の連続アミノ酸残基を含んで成るエ
ピトープが保存される任意の欠失を有することにより、 ii)1個もしくは数個のアミノ酸の置換を有することに
より、または iii)ポリペプチド配列a)のN末端に、C末端に、もし
くは配列中への挿入物として、追加のアミノ酸を有する
ことにより、変更された生来のポリペプチド配列である
ことができる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医
薬組成物。 - 【請求項5】 前記ポリペプチド配列a)がミリスチル
化される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬組
成物。 - 【請求項6】 前記ポリペプチド配列a)が組換えDNA
分子の発現により生産される、請求項1〜5のいずれか
一項に記載の医薬組成物。 - 【請求項7】 前記担体b)が多糖、疎水性ポリマーま
たは粒子形態を有する無機分子である、請求項1〜6の
いずれか一項に記載の医薬組成物。 - 【請求項8】 前記担体b)が第二のポリペプチド配列
である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の医薬組成
物。 - 【請求項9】 前記ポリペプチド配列b)が分泌時に少
なくとも10nmの直径を有する粒子を形成する、請求項8
に記載の医薬組成物。 - 【請求項10】 前記ポリペプチド配列b)が、HBV S
ペプチド、HBV コア抗原、HAV コア抗原及びHIV コア抗
原並びにポリオウイルス、HAV またはHIV の表面抗原か
ら成る群から選ばれたポリペプチド配列の実質的部分ま
たは完全な変更されているか又は変更されていないアミ
ノ酸配列である、請求項8または9に記載の医薬組成
物。 - 【請求項11】 前記ポリペプチド配列b)が、 i)粒子形成能が保存される任意の欠失を有することに
より、 ii)1個もしくは数個のアミノ酸の置換を有することに
より、または iii)ポリペプチド配列b)のN末端、C末端、もしくは
配列中への挿入物として追加のアミノ酸を有することに
より、変更され得る、請求項8〜10のいずれか一項に記
載の医薬組成物。 - 【請求項12】 前記ポリペプチド配列b)がミリスチ
ル化される、請求項8〜11のいずれか一項に記載の医薬
組成物。 - 【請求項13】 前記ポリペプチド配列b)が組換えDN
A 分子の発現により生産される、請求項8〜12のいずれ
か一項に記載の医薬組成物。 - 【請求項14】 前記ポリペプチド配列a)とb)がジ
スルフィド結合により結合される、請求項1〜6または
8〜13のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 【請求項15】 前記ポリペプチド配列a)とb)が
「疎水的固定」(ミリスチン酸により媒介される)によ
り結合される、請求項1〜6または8〜14のいずれか一
項に記載の医薬組成物。 - 【請求項16】 前記ポリペプチド配列a)とb)がペ
プチド結合により結合され、ここで、所望によりポリペ
プチド配列a)とポリペプチド配列b)との間にスペー
サー配列が挿入され、前記スペーサー配列はペプチド結
合を介してポリペプチド配列a)とb)に結合される、
請求項1〜6または8〜15のいずれか一項に記載の医薬
組成物。 - 【請求項17】 前記ポリペプチド配列a)と前記ポリ
ペプチド配列b)が同一の組換えDNA 分子上で縦列にお
いてコードされる、請求項16に記載の医薬組成物。 - 【請求項18】 前記ポリペプチド配列a)と前記ポリ
ペプチド配列b)が前記DNA 分子上の単一の転写解読枠
から発現され、そしてその単一の転写解読枠において同
じくコードされるスペーサーポリペプチド配列により隔
てられることがある、請求項17に記載の医薬組成物。 - 【請求項19】 前記組成物が静脈内または筋肉内注射
による投与のためのものである、請求項1〜18に記載の
医薬組成物。
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