DE4416144A1

DE4416144A1 - Immunoassay für Analyte in Proben unter Verwendung von Alkylierungsmittel

Info

Publication number: DE4416144A1
Application number: DE4416144A
Authority: DE
Inventors: Jon E Peterson; Jeffrey W Staeffens
Original assignee: Pasteur Sanofi Diagnostics SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 1993-05-19
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 1994-11-24
Also published as: JP3335760B2; GB2278195B; JPH06347460A; ES2066739A1; FR2705463B1; ITTO940399A1; ES2066739B1; FR2705463A1; ITTO940399A0; CN1104773A; GB2278195A; GB9410054D0; CN1082663C; US5484706A; IT1274006B; CA2123069C; CA2123069A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen verbesserten Immunoassay zum Nach weis der Anwesenheit oder einer Menge eines Analyts in einer Probe eines Pa tienten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Al kylierungsmitteln bei einem neutralen oder alkalischen pH in einem verbesser ten Immunoassayverfahren zum Nachweisen von Analyten in einer Probe, die endogene Antikörper enthält.

Im Verlauf der vergangenen zwei Jahrzehnte sind Immunoassays oder Immun zytochemische Nachweisverfahren entwickelt worden, die dazu geeignet sind, die Anwesenheit eines bestimmten Analyts in einer Patientenprobe zu bestim men. Bei einem typischen Immunoassay wird ein Assayreagens mit einer Ver bindung markiert, die ein nachweisbares Signal erzeugen kann, und dieses Rea gens wird mit einer Patientenprobe kombiniert, von der angenommen wird, daß sie einen speziellen Analyt enthält. Das markierte Assayreagens bindet an den Analyt in einer Menge, die in Beziehung zu der Menge des Analyts in der Probe steht.

Von endogenen Anti-Analyt-Antikörpern und Immunkomplexen aus Antikör pern und Analyt, die in den Serumproben zirkulieren, ist gezeigt worden, daß sie Immunoassays zum Analytnachweis beeinträchtigen. US-PS 4 703 001 be schreibt ein Vorbehandlungsverfahren zum Auflösen von Immunkomplexen und Denaturieren der Anti-Analyte bei Immunoassays für säurestabile Analyte in einer Serumprobe, umfassend das Inkontaktbringen der Serumprobe mit ei nem pH-abhängigen Chaotrop bei einem sauren pH. Ähnlich beschreiben P. Nis hanian et al. in J. Infect. Dis. 162 : 21-28 (1990) ein Probenvorbehandlungsver fahren mit Hilfe einer Säurehydrolyse, das verwendet wurde, um Analyt-Anti- HIV-Antikörper-Immunkomplexe aufzulösen und Anti-HIV-Antikörper zu dena turieren. Um vollständige Denaturierung der Anti-HIV-Antikörper zu erreichen, wurde das Testserum jedoch bei 37°C während 60 Minuten mit einer 0,5 N HCl- Lösung behandelt.

Während die Säurehydrolyse, wie oben beschrieben und für Protein- oder Pep tidantigene durchgeführt, genaue Ergebnisse liefern kann, ist es immer wün schenswert, diese Ergebnisse schneller und mit verbesserter Empfindlichkeit zu erzielen. Weiterhin sind solche rigorosen Säurehydrolysen mit einigen Analy ten nicht möglich. Zum Beispiel würden die 2-Keto-3-desoxyoctulosonsäure (KDO)-Zucker von Lipopolysaccharid (LPS)-Antigenen aus bestimmten Mikro organismen durch eine solche Behandlung hydrolysiert, wobei somit deren an tigene Eigenschaften zerstört würden. Deshalb wäre es wünschenswert, ein Im munoassayverfahren zu haben, bei dem endogene Antikörper, die in einer Pa tientenprobe vorhanden sind, irreversibel denaturiert werden können bei einem pH von größer als 7,0 und vorzugsweise bei einem alkalischen pH ohne daß die Antigenizität des Analyts beeinflußt werden würde.

Der vorliegenden Erfindung lag daher das technische Problem zugrunde, ein verbessertes Immunoassayverfahren bereitzustellen, bei dem die in der zu ana lysierenden Probe enthaltenen Antikörper den Analytnachweis nicht oder in ge ringerem Umfang beeinträchtigen, als dies in herkömmlichen Verfahren der Fall ist.

Dieses Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verfahren gemäß An spruch 1, 13 und 14 sowie durch den Kit nach Anspruch 9. Bevorzugte Ausfüh rungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Leistungsfähigkeit von Immunoassays für die Analyse von Analyten in einer Patientenprobe kann beträchtlich verbessert werden durch die Vorbehandlung der Probe, um endogene Antikörper so zu modifizieren, damit die Beeinträchti gung des Analytnachweises durch die Antikörper verringert oder verhindert wird. Wie oben ausgeführt, können solche Antikörper und Immunkomplexe die analytspezifischen Bindungsschritte in vielen Immunoassays beeinträchtigen. Der erfindungsgemäße Vorbehandlungsschritt der Probe verwendet Alkylie rungsmittel, die bei einem pH von größer als 7,0 und vorzugsweise bei einem al kalischen pH von größer als 8,0 aktiv sind. Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Alkylierungsmittel sind aktiv bei einem neutralen oder alkalischen pH, und sie beeinflussen die Antigenizität des Analyts nicht. Wünschenswerter weise reagieren die Alkylierungsmittel mit Lysin, Arginin oder primären Amino gruppen der Antikörper, um die Gruppen auf den Antikörpern so zu modifizie ren, damit diese den Analytnachweis nicht beeinträchtigen, und sie umfassen Glutaraldehyd, o-Methylisoharnstoff, Formaldehyd, Butandion, Cyclohexan dion und S-Acetyl-thioglykolsäure-N-hydroxysuccinimid.

Vor der Durchführung des Immunoassays wird das Alkylierungsmittel inakti viert, so daß es die Reagenzien des Immunoassays nicht beeinflußt. Die Mittel zum Inaktivieren des Alkylierungsmittels variieren abhängig von dem verwen deten Alkylierungsmittel. Eine Art von Alkylierungsmittel, das in der vorliegen den Erfindung verwendet werden kann, ist bei einem alkalischen pH aktiv und bei einem neutralen pH inaktiv. Diese Art von Alkylierungsmittel ist besonders nützlich zum Nachweis von Analyten, die in der Probe in einer Form vorliegen, die verlangt, daß die Probe mit einer alkalischen Detergenzlösung vorbehandelt wird, um den Analyt zu extrahieren.

Bei einer Ausführungsform wird die Probe mit dem Alkylierungsmittel vorbe handelt folgend einer alkalischen Detergenzextraktion, die vor einem Immuno assay für LPS aus Chlamydia oder ähnlichen Antigenen durchgeführt wird. Das Alkylierungsmittel sollte vor der Neutralisierung der Probenlösung zugesetzt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Alkylierungsmittel das nur bei einem alkalischen pH aktiv ist, nach der alkalischen Extraktion zu gesetzt und mit der Probenlösung für eine ausreichende Zeit inkubiert, so daß die endogenen Antikörper modifiziert werden können, damit diese den Analytnachweis während des Immunoassays nicht beeinträchtigen können. Das Alky lierungsmittel muß so ausgewählt werden, daß es mit den anderen Reagenzien, die zum Extrahieren des Analyts verwendet werden, kompatibel ist. Auf die In kubation folgend wird das Alkylierungsmittel durch Neutralisieren der Proben lösung inaktiviert, und der Immunoassay wird durchgeführt.

Bei einer Ausführungsform ist der zu bestimmende Analyt säureempfindlich. Für die Zwecke dieser Erfindung bedeutet "säureempfindlich" ein Analyt, der seine antigene Aktivität verliert, wenn er in eine Lösung mit einem pH von weni ger als 3,0 inkubiert wird. Für diese Anwendungszwecke umfassen die säu reempfindlichen Analyte LPS-Antigene mit einem KDO-Anteil aus Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Salmonella typhimurium, Neisseria gonorrhoe ae und Escherichia coli.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Immunoassay für LPS-Antigen durchgeführt, und nach dem Antigen-Extraktionsschritt wird das mit Dithiothreitol (DTT) kombinierte Alkylierungsmittel zugesetzt. DTT ist ein mukolytisches Mittel wie auch ein chemisches Modifizierungsmittel, das an Cy stein bindet. Die Verwendung von DTT in Kombination mit einem Alkylierungs mittel verstärkt die Signalstabilität im Laufe der Zeit und verstärkt die Empfind lichkeit des Assays.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft einen Kit für einen Immunoassay zum Verwenden beim Nachweis eines Analyts in einer Patienten probe, die endogene Antikörper enthält, die den Analytnachweis beeinträchti gen, wobei der Kit Immunoassayreagenzien zum Durchführen eines Immunoas says mit der Probe, um den Analyt nachzuweisen, ein Alkylierungsmittel, das Gruppen auf den Antikörpern bei einem pH von nicht weniger als 7,0 alkylieren kann, umfaßt, damit die endogenen Antikörper den Analytnachweis nicht be einträchtigen. Der Kit umfaßt weiterhin ein Inaktivierungsmittel, das das Alky lierungsmittel derart Inaktivieren kann, daß es die Antikörper nicht länger mo difiziert. Bei einer Ausführungsform, in der das Alkylierungsmittel nur bei ei nem alkalischen pH aktiv ist, stellt das Inaktivierungsmittel ein neutralisieren des Mittel dar.

Fig. 1 stellt ein Diagramm dar, das die Wirkungen des erfindungsgemäßen Vor behandlungsverfahrens auf den Analytnachweis unmittelbar nach der Extrak tion zeigt.

Fig. 2 stellt ein Diagramm dar, das die Beeinträchtigung des Analytnachweises zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Extraktion zeigt, wobei das erfindungs gemäße Vorbehandlungsverfahren nicht angewendet wurde.

Fig. 3 stellt ein Diagramm dar, das die Wirkungen des erfindungsgemäßen Vor behandlungsverfahrens auf den Analytnachweis zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Extraktion zeigt.

Fig. 4 zeigt Streifen von Westernblots, die den Einfluß der in der Erfindung ver wendeten Alkylierungsmittel auf die Fähigkeit von Anti-Chlamydia-Antikör pern in Patientenproben an Analyt zu binden zeigen.

Die erfindungsgemäßen Reagenzien und Verfahren können bei Patientenproben angewendet werden, die auf herkömmliche Weise aus dem Auge, der hinteren Nasenöffnung dem Gebärmutterhals, der Vagina, der Harnröhre, dem Mast darm, dem Rachen, dem Blut, dem Serum, dem Plasma, dem Harn oder ähnli chem erhalten wurden. Die Reagenzien und das Vorbehandlungsverfahren kön nen in jedem Immunoassay verwendet werden, bei dem die Anwesenheit von endogenen Antikörpern den Analytnachweis beeinträchtigt aber sie sind be sonders nützlich bei Analyten, die bei einem niedrigen pH nicht stabil sind.

Bei vielen verschiedenen Immunoassays kann eine verbesserte Leistungsfähig keit unter Verwendung des erfindungsgemäßen Vorbehandlungsverfahrens er reicht werden. Beispiele hierfür sind Radioimmunoassays, Immunoassays, die ELISA-Verfahren verwenden, und Immunoassays, die eine Vielzahl von Markie rungen, einschließlich Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-Markierungen verwenden. Ein solcher Immunoassay umfaßt die Schritte des Inkontaktbrin gens der extrahierten, neutralisierten Probelösung mit einem monoclonalen An tikörper gegen den Analyt, der auf einer Festphase, wie einer Mikrotiterplatte, Kügelchen, Partikel, Röhrchen oder ähnlichen immobilisiert ist, Inkubieren, Zusetzen eines markierten polyclonalen Antikörpers, der an die Festphase in ei ner Menge bindet, die zu der Menge des Analyts in der Probe in Beziehung steht, Inkubieren und Nachweisen der Markierung.

Die Menge und Konzentration an Alkylierungsmittel, die bei einem speziellen Immunoassay nützlich ist, wird variieren abhängig von der Probenart, d. h. Se rum oder urogenitaler Abstrich, der Konzentration der anderen Immunoassay- Reagenzien, der Analytart und der Temperatur, bei der die Vorbehandlung durchgeführt wird.

Bei bestimmten Immunoassays zum Nachweis der Anwesenheit von Mikroorga nismen ist der nachzuweisende Analyt ein säureempfindliches Lipopolysaccha rid (LPS), wie das Antigen aus Chlamydia. Typischerweise wird bei Assays für solche Chlamydia-Antigene und ähnliche Antigene die Patientenprobe mit einer Detergenzlösung vorbehandelt, die Alkali- oder Erdalkalimetallionen enthält. Während des Extraktionsschritts werden die endogenen Anti-Analyt-Antikör per teilweise denaturiert oder gestört. Im Verlaufe der Zeit jedoch, wenn die Pro benlösung einmal neutralisiert ist, renaturieren die endogenen Antikörper, und sie blockieren die Erkennung des Analyts, indem sie die Bindung des Antikör perreagenzes an den Analyt während des Immunoassays beeinträchtigen.

Ohne durch die folgende Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die Alkylierungsmittel mit Gruppen auf den Antikörpern reagieren, die teilweise de naturiert oder gestört worden sind, um somit die Renaturierung der Antikörper während des Immunoassays zu verhindern.

Eine Art an Alkylierungsmittel, die besonders in einem Immunoassay für LPS geeignet ist, ist ein Mittel, das nur bei alkalischem pH, z. B. bei pH größer als 8,0, aktiv und bei einem neutralen oder sauren pH inaktiv ist. Alkylierungsmit tel dieser Art umfassen beispielsweise Glutaraldehyd, Formaldehyd, o-Methyl isoharnstoff, Butandion und Cyclohexandion. Solche Reagenzien sind insbe sondere bevorzugt, weil typische Immunoassays bei einem neutralen pH durch geführt werden, so daß sie die Ausführung des Assays nicht beeinträchtigen.

Eine andere Art an Alkylierungsmittel ist gemäß der Erfindung aktiv bei einem neutralen pH (pH 7,0 bis pH 8,0) und kann durch den Zusatz eines zweiten Rea genzes mit Amingruppen, wie einem tertiären Amin, wie Tris, oder einem primä ren Amin, wie Glycin, inaktiviert werden. Alkylierungsmittel dieser Art umfas sen beispielsweise S-Acetyl-thioglykolsäure-N-hydroxysuccinimid.

Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 - Chlamydia-Immunoassay

Ein Kallestad-Pathfinder®-Chlamydia-Mikroplatten-Kit wurde bei der Durch führung des Vorbehandlungsverfahrens und des Immunoassays verwendet. Der Kallestad-Pathfinder®-Chlamydia-Mikroplatten-Kit umfaßte:

- Eine Probenbehandlungslösung A (STS A), die enthält 0,1 N NaOH, 5 mM EDTA, 50 mg/ml Alizarin Gelb (2-Hydroxy-5-[(4-nitrophenyl)-azo]-benzoesäu re, eine Farbe, die bei einem neutralen pH unter 10,2 gelb und bei einem pH von 12 rot ist, und 0,05% 3-[(3-Cholamidopropyl)-diamethylammoni-o]-1-propan sulfonat (CHAPS).
- Eine Probenbehandlungslösung B (STS B), die enthält 1,0 N HCl, 2 M Tris- Base, 3% H₂O₂.

Das Extraktionsverfahren, das vor dem unten beschriebenen Immunoassay durchgeführt wurde, umfaßte die Schritte Zusetzen von 1,0 ml STS A zu 0,1 ml der Probe und Inkubieren für 10 Minuten und Vortexen für 30 Sekunden. Um die Wirksamkeit der Alkylierungsmittel gemäß der Erfindung zu ermitteln, wur den 0, 1 ml an Alkylierungsmittel oder Puffer zugesetzt, in einem Vortex für 10 Sekunden gemischt und dann für 10 Minuten inkubiert. Vor der Durchführung des Immunoassays wurden 0,1 ml STS B zugesetzt, und dann wurde die Proben lösung für 10 Sekunden mit einem Vortex gemischt.

Nach der Extraktion wurde ein Immunoassay mit Hilfe des Kallestad-Path finder®-Mikroplatten-Kits, wie oben beschrieben, durchgeführt.

Ein 100 µl Aliquot an extrahierter Probe wurde jedem Loch der Pathfinder®-Mi krotiterplatte zugesetzt, in dem ein monoclonaler Antikörper gegen Chlamydia- Antikörper gebunden ist. Die Platte wurde für 30 Minuten bei 26°C in einem STAT-FAX-Schüttelinkubator (Awareness Technologies) inkubiert. 50 µl poly clonales Kaninchen-Anti-Chlamydia-Antikörperreagens wurden jedem Loch zugesetzt, und die Platte wurde für 30 Minuten bei 26°C in einem STAT-FAX 2200 inkubiert.

Dann wurden 50 µl Meerrettichperoxidase, konjugiert an Ziege-Anti-Kanin chen-Serum, jedem Loch zugesetzt, und dann wurde die Platte für 30 Minuten bei 26°C in einem STAT-FAX 2200 inkubiert.

Die Löcher der Platten wurden dann 5-mal auf dem LP-35-Microplate-Washer (Diagnostics Pasteur, Frankreich) gewaschen, und jedem Loch wurden 100 µl o- Phenylendiamin in Puffer zugesetzt, und die Platte wurde für 30 Minuten in der Dunkelheit inkubiert. 100 µl einer Stopplösung enthaltend 4N H₂SO₄ wurden zugesetzt, und die Mikrotiterplatten wurden mit einem LP-400-Mikrotiterplat ten-Lesegerät (Diagnostic Pasteur, Frankreich) bei einer OD 492/620 gemes sen.

Beispiel 2 - Säureempfindlicher Analyt

Wie oben ausgeführt, ist das Vorbehandlungsverfahren besonders bevorzugt bei säureempfindlichen Analyten, wie einem Lipopolysaccharid. Es wurde auf gezeigt daß die Antigenizität von LPS beeinflußt wurde, wenn die Probe mit ei ner Säure und nicht mit einer Base behandelt wurde.
Säurebehandlung: 1 ml Chlamydia-Antigen in STSA : STS B (10 : 1) wurde mit 30 µl 4M H₃PO₄ (pH 2,3) behandelt, und die Reaktion wurde für 90 Minuten zugelassen und dann mit 70 µl 2N NaOH (pH 8,1) neutralisiert.
Basenbehandlung: 1 ml Chlamydia-Antigen in STSA : STS B (10 : 1) wurde mit 70 µl 2N NaOH (pH 12,5) behandelt, und dann wurde die Reak tion für 90 Minuten zugelassen, bevor die Neutralisierung mit 30 µl 4M H₃PO₄ (pH 2,3) erfolgte.

Die Ergebnisse der Säure- und Basenbehandlung sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Beispiel 3 - Alkylierungsmittel

Die Wirksamkeit der verschiedenen Alkylierungsmittel zur Modifizierung der endogenen Antikörper und der Verstärkung des EIA-Signals wurde mit seropo sitivem Plasma (menschliches Anti-Chlamydia-Plasma) und Anti-Chlamydia- Pferdemodellen gezeigt. Humanes seropositives Anti-Chlamydia-Plasma oder immunoaffinitätsgereinigte Anti-Chlamydia-Pferdeantikörper wurden mit Chlamydia trachomatis-Elementarkörperchen (Serumvariante L2, mit üblicher Endkonzentration von 1,5 × 10⁶ EB/ml) gemischt und wie in Beispiel 1 be schrieben extrahiert.

Die Wirksamkeit eines jeden Alkylierungsmittels wurde durch Vergleich der nur mit Puffer behandelten Probe ermittelt. Wie in Tabelle 2 gezeigt, ist nach dem In aktivieren der Alkylierungsmittel durch Zusatz eines Neutralisierungsmittels in STS B eine sofortige Verstärkung des Analytnachweises zum Zeitpunkt Null mit dem Alkylierungsmittel Glutaraldehyd und Cyclohexandion im Vergleich zu der Behandlung mit nur Puffer ersichtlich.

Tabelle 2

Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß die alkalische Extraktion allei ne ohne Alkylierungsmittel den Anti-Chlamydia-Antikörper stört, wobei er so weniger den Analytnachweis beeinträchtigt. Im Verlaufe der Zeit renaturiert der alkalisch gestörte Antikörper in der nur pufferhaltigen Probe und neutralisiert das EIA-Signal wirkungsvoll, indem er den Antigeneinfang oder Nachweis in der Pathfinder-Form beeinträchtigt.

Bei 0 Stunden nach der Extraktion (Tabelle 2) besitzt die pufferbehandelte Probe eine OD von 20% und 22% unterhalb der OD von Proben, die in Anwesenheit von 1% Glutaraldehyd mit bzw. ohne DTT extrahiert wurden. Bei 120 Stunden nach der Extraktion fiel der Wert der nur in Anwesenheit von Puffer extrahierten Pro ben um 37%, im Vergleich zu den Extraktionen mit 1% Glutaraldehyd und 50 mM Cyclohexandion, die nur leicht abnahmen. Kombinieren von 25 mM DTT mit dem Glutaraldehyd und Cyclohexandion führte zu einer leichten Zunahme des Signals zum Zeitpunkt Null.

Beispiel 4 - Glutaraldehyd

Chlamydia-Elementarkörperchenpräparationen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an Anti-Chlamydia-Pferdeantikörpern gemischt, nach der Ex traktion mit Detergenz mit dem 1% Glutaraldehyd/25 mM DTT oder Puffer vor behandelt und dem oben beschriebenen EIA-Verfahren unterzogen. Die mit dem alkylierenden/vernetzenden Glutaraldehyd vorbehandelten Proben zeigen eine deutliche Zunahme des Signals, wie in Fig. 1 gezeigt, im Verhältnis zu pufferbe handelten Proben zum Zeitpunkt Null (nach der Extraktion), bei sämtlichen Konzentrationen an Anti-Chlamydia-Pferdeantikörper, außer bei 0,2 µg/ml, die sich der Grenze der neutralisierenden Aktivität näherte. Humanes Anti-Chla mydia-Antiserum (P1) zeigte eine annähernd äquivalente neutralisierende Wir kung wie die 1,6 µg/ml Anti-Chlamydia-Pferdeantikörper in der Abwesenheit von Glutaraldehyd.

Der Einfluß von Anti-Chlamydia-Pferde- oder Humanantiserum auf die EIA- Signalerzeugung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Extraktion er mittelt. In der Abwesenheit von Glutaraldehyd war die Empfindlichkeit des As says 0 Stunden nach der Extraktion viel größer als 24 oder 48 Stunden nach der Extraktion, wie sich aus der in Fig. 2 gezeigten Abnahme der OD zeigt. In Anwe senheit von Glutaraldehyd/DTT, wie in Fig. 3 gezeigt waren die Unterschiede im Verlaufe der Zeit nicht so stark, und der Gesamtnachweis an Chlamydia-Anti gen wurde durch die Anti-Chlamydia-Pferdeantikörper nicht blockiert.

Die Anwesenheit von humanen Anti-Chlamydia-Antikörpern (Hu X C) in urogenitalen Klinikproben und der Einfluß der Vorbehandlung der Probe mit Gluta raldehyd/DTT wurde weiterhin aufgezeigt mit Hilfe der Westernblot-Immunoas sayverfahren. Klinische Proben wurden vorbehandelt, wie oben beschrieben, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Glutaraldehyd/DTT und auf den Verlust des EIA-Signals hin untersucht, was ein Hinweis auf die Anwesenheit von Hu X C darstellt. Es wurde gefunden, daß die Proben mit dem stärksten Verlust an EIA-Signal immunoreaktive HU X Chlamydia (MOMP, Hauptprotein der äußeren Membran) besaßen, wie in Fig. 4 gezeigt. In den korrespondierenden Proben, die Glutaraldehyd enthalten, wurden keine humanen immunoreaktiven Anti- MOMP-Antikörper (Hu X MOMP) nachgewiesen.

Beispiel 5 - Vorbehandlung mit Alkylierungsmitteln bei einem alkalischen pH

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse beim Analytnachweis, wenn verschiedene Kon zentrationen an verschiedenen Alkylierungsmitteln verwendet wurden. 0,1 ml Chlamydia-Antigen wurde seropositivem Plasma zugesetzt und mit STS A ge mischt, für 10 Sekunden mit einem Vortex gemischt und dann für 10 Minuten inkubiert. 0,1 ml Alkylierungsmittel oder Puffer wurden dann zugesetzt und die Lösung dann während 10 Sekunden und 10 Minuten inkubiert. Vor dem Durch führen des Immunoassays wurden 0,1 ml STS B zugesetzt und die Lösung wurde für 10 Sekunden mit einem Vortex gemischt. Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, wa ren die niedrigen Konzentrationen an Alkylierungsmittel 48 Stunden nach der Extraktion nicht so wirkungsvoll zum Eliminieren der Beeinträchtigung durch endogene Antikörper, aber sie waren wirksamer als nur Puffer bei 0 Stunden und 24 Stunden nach der Extraktion.

Tabelle 3

Zusätzlich zu der Vorbehandlung bei einem alkalischen pH mit Glutaraldehyd wurden 50 mM o-Methylisoharnstoff (OMIU) und 50 mM Cyclohexandion (CHD) der Probenlösung zugesetzt folgend auf die Extraktion in STS A, und ein Immu noassay wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Beide Reagenzien führten zu verbesserten Immunoassayergebnissen im Verlaufe der Zeit, und die Leistungsfähigkeit des Immunoassays wurde weiterhin gesteigert, wenn die Al kylierungsmittel mit DTT kombiniert wurden.

Die Ergebnisse dieser Experimente über einen Zeitraum von 5 Tagen nach der Extraktion sind in der Tabelle 4 unten gezeigt.

Tabelle 4

Beispiel 6 - Vorbehandlung mit Alkylierungsmitteln bei einem neutralen pH

Obwohl Alkylierungsmittel, die bei einem alkalischen pH aktiv sind, in einem Immunoassay für LPS bevorzugt sind, können auch Alkylierungsmittel verwen det werden, die bei einem neutralen pH aktiv sind. Es wurden 2 ml EBs (1 : 16, 3,12 × 10⁶) und 40 µl Anti-Chlamydia-Pferdeantikörper (100 µg/ml, Endkon zentration 2 µg/ml) gemischt, und es wurden 0,1 ml Aliquots der EB-Antikör permischung als eine Probe verwendet. Die Aliquots wurden 8 Gefäßen zuge setzt und mit 1 ml STS A extrahiert, mit einem Vortex gemischt und für 10 Minu ten bei Raumtemperatur inkubiert. 100 ml HCl/Phosphatpuffer wurden zuge setzt, wobei dessen pH vorher so eingestellt war, daß bei dem Kombinieren mit der Probe-STS A-Lösung der pH 8,0 betragen würde. 50 mM S-Acetyl-thioglykol säure-N-hydroxysuccinimid (SATA) wurden zugesetzt, und die Lösung wurde für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 0,1 ml 1M Tris (pH 8), das ein tertiäres Amin ist, wurde dann zugesetzt, um das Alkylierungsmittel zu inakti vieren.

Die Proben wurden analysiert mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Chlamy dia-Immunoassayverfahrens. Puffer alleine führte nur zu einer OD bei 472/620 von 0,365 ± 0,2 l. Die Behandlung der Probe mit SATA bei neutralem pH führte zu verbesserten Immunoassay-Ergebnissen von 2,26 ± 0,75, was nahe zu der OD der EB-Probe in der Abwesenheit der Anti-Chlamydia-Pferdeantikörper war.

Claims

1. Immunoassay zum Nachweisen eines Analyts in einer Probe eines Patien ten, die Antikörper enthält, die den Analytnachweis beeinträchtigen, wobei der Analyt antigen ist, umfassend die folgenden Schritte:

a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Alkylierungsmittel, das Gruppen auf den Anti-Analyt-Antikörpern bei einem pH von nicht weniger als 7,0 alkylie ren kann, um die Antikörper zu modifizieren, damit diese den Analytnachweis nicht beeinträchtigen können, wobei das Alkylierungsmittel ein Mittel ist, das die Antigenizität das Analyts nicht beeinflußt
b) Inaktivieren des Alkylierungsmittels und dann
c) Durchführen eines Immunoassays mit der Probe, um den Analyt in der Anwesenheit der modifizierten Antikörper nachzuweisen.

2. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ana lyt säureempfindlich ist.

3. Immunoassay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ana lyt ein Lipopolysaccharid-Antigen ist.

4. Immunoassay nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Li popolysaccharid-Antigen aus Mikroorganismen stammt, ausgewählt aus Chla mydia trachomatis, Chlamydia psittaci Salmonella typhimurium, Neisseria go norrhoeae und Escherichia coli.

5. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Al kylierungsmittel Glutaraldehyd, Formaldehyd, o-Methylisoharnstoff, Cyclohe xandion, Butandion und/oder S-Acetyl-thioglykolsäure-N-hydroxysuccinimid ist.

6. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Al kylierungsmittel auch Gruppen auf den Antikörpern vernetzen kann.

7. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Al kylierungsmittel bei einem alkalischen pH aktiviert und bei einem neutralen pH inaktiviert wird, und wobei der Inaktivierungsschritt das Neutralisieren des pH der Probe umfaßt.

8. Immunoassay nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er wei terhin die Schritte des Inkontaktbringens der Probe mit einem geeigneten Ex traktionsdetergenz bei einem alkalischen pH, um das Lipopolysaccharid vor oder gleichzeitig mit dem Inkontaktbringen der Probe mit dem Alkylierungsmit tel freizusetzen umfaßt.

9. Kit für einen Immunoassay zum Nachweisen eines Analyts in einer Probe eines Patienten, die endogene Antikörper enthält, die den Nachweis des Analyts beeinträchtigen, wobei der Kit Immunoassayreagenzien zum Durchführen eines Immunoassays mit der Probe zum Nachweisen des Analyts, ein Alkylierungsmit tel, das Gruppen auf den Antikörpern bei einem pH von nicht weniger als 7,0 al kylieren kann, um die endogenen Antikörper so zu modifizieren, daß deren Bin dung an den Analyt verhindert wird, und ein Inaktivierungsmittel zum Inakti vieren des Alkylierungsmittels umfaßt, wobei die Immunoassayreagenzien ihre Funktion in der Anwesenheit des Inaktivierungsmittels und des inaktivierten Alkylierungsmittels ausführen können.

10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkylierungs mittel Glutaraldehyd, Formaldehyd, o-Methylisoharnstoff, Glyceraldehyd und/ oder S-Acetyl-thioglykolsäure-N-hydroxysuccinimid ist.

11. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkylierungs mittel bei einem alkalischen pH aktiviert und bei einem neutralen pH inaktiviert wird und das Inaktivierungsmittel ein Neutralisierungsmittel ist.

12. Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin ein Detergenz und ein Erdalkalimetallreagens zum Extrahieren des Analyts aus der Probe umfaßt, und worin der Analyt ein Lipopolysaccharid-Antigen ist.

13. Immunoassay zum Nachweisen eines säureempfindlichen Analyts in ei ner Probe eines Patienten, die Antikörper enthält, die den Analytnachweis be einträchtigen, wobei der Analyt antigen ist, umfassend die folgenden Schritte:

a) nachdem die Probe mit einer alkalischen Extraktion behandelt worden ist, um den Analyt freizusetzen, Inkontaktbringen der Probe mit einem Alkylie rungsmittel, das Gruppen auf den Anti-Analyt-Antikörpern bei einem pH von nicht weniger als 7,0 alkylieren kann, um die Antikörper zu modifizieren, damit diese den Analytnachweis nicht mehr beeinträchtigen können, wobei das Alky lierungsmittel ein Mittel ist, das die Antigenizität des Analyts nicht beeinflußt;
b) Inaktivieren des Alkylierungsmittels und dann
c) Durchführen eines Immunoassays mit der Probe, um den Analyt in der Anwesenheit der modifizierten Antikörper nachzuweisen.

14. Immunoassay zum Nachweisen eines Lipopolysaccharid-Antigens in ei ner Probe eines Patienten, die Antikörper enthält, die den Analytnachweis be einträchtigen, wobei der Analyt antigen ist, umfassend die folgenden Schritte:

a) nach alkalischer Detergenzextraktion der Probe, um das Lipopolysaccha rid-Antigen freizusetzen, Inkontaktbringen der Probe mit einem Alkylierungs mittel, das Gruppen auf den Anti-Analyt-Antikörpern bei einem pH von nicht weniger als 7,0 alkylieren kann, um die Antikörper zu modifizieren, damit diese den Analytnachweis nicht mehr beeinträchtigen können, wobei das Alkylie rungsmittel ein Mittel ist, das die Antigenizität des Lipopolysaccharid-Antigens nicht beeinflußt
b) Inaktivieren des Alkylierungsmittels und dann
c) Durchführen eines Immunoassays mit der Probe, um das Lipopolysac charid-Antigen in der Anwesenheit der modifizierten Antikörper nachzuweisen.