DE4219714C2

DE4219714C2 - B¶1¶¶2¶-Enzymimmunoassay und Probenvorbehandlung

Info

Publication number: DE4219714C2
Application number: DE4219714A
Authority: DE
Inventors: Michael I Watkins; Clifford R Bartlett; Liang Edward Tung-Wu; John M Pocekay; Mark A Staples
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1991-06-27
Filing date: 1992-06-16
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2012-06-17
Also published as: FR2678387B1; JPH05232110A; GB2257249B; IT1254411B; AU648484B2; ITRM920491A1; AU1856092A; CA2071173C; ITRM920491A0; FR2678387A1; DE4219714A1; CA2071173A1; GB2257249A; JPH07104348B2; GB9213503D0; US5187107A

Description

Die Erfindung betrifft Enzymimmunoassays, insbesondere Assays für Vitamin B₁₂ und die Vorbehandlung von Proben.

Vitamin B₁₂ ist eine Organo-Cobalt-Verbindung mit einem Moleku largewicht von 1355,42. Vitamin B₁₂ kann vom menschlichen Körper nicht synthetisiert werden, sondern es muß durch die Nahrung aufgenommen werden, um den erforderlichen Bedarf zu decken. Es gibt verschiedene endogene Transportproteine im Körper, die die Absorption von Vitamin B₁₂ aus der Nahrung ermöglichen. Zu die sen Transportproteinen gehören die Haptocorrine im Speichel, die Vitamin B₁₂ binden, wenn es während der Verdauung freige setzt wird. Ein anderes Transportprotein ist der sogenannte Intrinsicfaktor, der im Intestinaltrakt vorkommt und Vitamin B₁₂ über die intestinale Mucosa in den Blutkreislauf transportiert.

Weitere Transportproteine sind die Trancobalamine im Blutkreis lauf die Vitamin B₁₂ binden und es an die Körpergewebe, die es benötigen, abgeben. Im Blutkreislauf liegt Vitamin B₁₂ als Hy droxy-, Methyl- oder Adenosylcobalamin vor. Diese Derivate wer den dadurch gebildet, daß die axiale Cyanogruppe des Vitamin B₁₂ durch die entsprechende funktionelle Gruppe ersetzt wird. Die Begriffe "B₁₂" und "Vitamin B₁₂" sind im folgenden in der Weise zu verstehen, daß sie alle natürlichen und synthetischen Deri vate umfassen.

Da ein Teil von B₁₂ im Serum an Transcobalamin-Bindungsproteine gebunden vorliegt, muß in allen Tests, durch die B₁₂ gemessen werden soll, zuerst die Probe vorbehandelt werden, um B₁₂ aus diesen Proteinen freizusetzen. Ein weiteres störendes Protein ist der Anti-Intrinsicfaktor-Antikörper. Dieser Antikörper liegt beispielsweise in Proben von Patienten vor, die an be stimmten Stadien der perniziösen Anämie leiden. Wenn der Anti körper vorliegt, muß dieser ebenfalls während der Vorbehandlung denaturiert werden, da ein derartiger Antikörper mit kompetiti ven Assays interferiert, die den Intrinsicfaktor als B₁₂-Bin dungsprotein verwenden.

Eine ausführliche Diskussion dieser Probleme ist in den Veröffentlichungen Vitamin B₁₂ B. Zagalak und W. Friedrich, Herausgeber (Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1979); B₁₂ Volume 1: Chemistry und B₁₂ Volume 2: Biochemistry and Medicine, D. Dolphin, Herausgeber (John Wiley & Sons, New York, 1982) enthalten.

Bis zum heutigen Zeitpunkt sind die meistverwendeten Assays für Vitamin B₁₂ die Radioimmunoassays (RIA). Die meisten dieser Ver fahren verwenden den an eine feste Phase gebundenen Intrinsic faktor und mit ⁵⁷Co radioaktiv markiertes B₁₂, welches mit dem B₁₂ in der Probe konkurriert. Die Probe wird entweder durch ein "Koch"-Verfahren oder ein "Nicht-Koch"-Verfahren vorbehandelt. Das Kochverfahren umfaßt das Kochen der Probe in Gegenwart ei ner Thiolverbindung bei pH 9,3, um die B₁₂-bindenden Proteine und die Anti-Intrinsicfaktor-Antikörper zu denaturieren. Die Vorbehandlungslösung enthält weiterhin Kaliumcyanid, um alle Formen von B₁₂ in Cyanocobalamin umzuwandeln. Beim Nicht-Koch verfahren werden Natriumhydroxid und eine Thiolverbindung zu gegeben, um die endogenen Bindungsproteine und die Anti-Intrin sicfaktor-Antikörper zu denaturieren. Kaliumcyanid wird, wie im Kochverfahren, ebenfalls zugegeben. Nach der Vorbehandlung wird ein Neutralisationsmittel zugegeben, um den pH auf 9,3 abzusen ken. Dieses System wurde im einzelnen von Allen untersucht (vergleiche die US-Patentschriften 41 88 189, 43 51 822 und 44 51 571); Allen weist darauf hin, daß es notwendig ist, in einem Radio-Verdünnungs-Assay den gereinigten Intrinsicfaktor zu ver wenden und zusätzlich zur Zugabe von Alkali und Thiol bei der Nicht-Koch-Probenvorbehandlung zusätzlich Cobinamid zuzugeben.

Obwohl Enzymimmunoassays bereits seit den frühen 70iger Jahren bekannt sind (vgl. hierzu beispielsweise Engvall, E., und Perl mann, P., Immunochem. 8: 871 (1971)), wurde die Sensitivität dieses Verfahrens erst vor kurzem in ausreichender Weise ver bessert, um zu ermöglichen, daß Vitamin B₁₂ in klinisch signifi kanten Levels (d. h. pg/ml) meßbar ist. Diese Verbesserung wurde zuerst von Bachas, L. G., Tsalta, C. D., und Meyerhoff, M. E., in Biotechniques 4: 42-55 (1986) veröffentlicht. In dieser Ver öffentlichung wird ein B₁₂-Enzymimmunoassay beschrieben, der einen an Kügelchen gebundenen Intrinsicfaktor verwendet, wobei B₁₂-Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase als Probe verwendet wird.

Seit dieser Veröffentlichung von Bachas et al. sind mehrere Abstracts erschienen, die B₁₂-Immunoassays betreffen. Eine die ser Veröffentlichungen von Wang, C.-C., Charlton, R. R. "An En zymometric Assay for Vitamin B₁₂ Using Magnetic Particles as So lid Support", Clin. Chem. 33: 963 (1987), beschreibt einen As say, der B₁₂, gebunden an Chromdioxid, Intrinsicfaktor-β-Galac tosidase und o-Nitrophenyl-β-D-galactosid als Substrat verwen det. Im Mai 1989 wurden von Dworschack et al. beim CLAS-Meeting in Los Angeles ein Poster präsentiert, auf dem ein Assay be schrieben wurde, der die CEDIA-Technologie mit Intrinsicfaktor als B₁₂-Bindungsprotein und B₁₂-Enzymdonor (Enzymdonor ist ein genetisch hergestelltes Fragment von β-Galactosidase, verwendet in CEDIA-Assays) als markiertem Analyt verwendet. Dworschack, R. T., Rosman, D. B., Shindelman, J. E., Lingenfelter, D. S., und Khanna, P. L., "CEDIA B₁₂: A Homogeneous Enzyme-Based Ligand Binding Assay for Serum Vitamin B₁₂", 15th National Meeting of the Clinical Ligand Assay Society (Los Angeles; May 1989). Wei terhin stellten Klukas et al. 1989 einen Chemilumineszenz-B₁₂- Immunoassay vor, der einen an magnetische Teilchen gebundenen Intrinsicfaktor und einen B₁₂-Acridiniumester-Tracer verwendet. Klukas, C., Williams, M., Berg, M., Kozel, P., und Hudson, T., "A Chemiluminescence Receptor Assay for Vitamin B₁₂," Clin. Chem. 35: 1194 (1989). Im Juli 1990 präsentierte Kuemmerle eine andere Version eines nicht-Isotopen-B₁₂-EIA bei einem AACC-Mee ting in San Francisco. Der Assay verwendet einen an eine poly mere mikrospherikale Festphase gebundenen Intrinsicfaktor und ein an ein B₁₂-Derivat gekoppeltes Reporterenzym. Kuemmerle, S. C., Boltinghouse, G. L., Delby, S. M., Lane, T. L., Simondsen, R. P., "IMx Assay for Vitamin B₁₂", Clin. Chem. 36: 969 (1990).

In diesem Zusammenhang ist weiterhin eine internationale Paten tanmeldung (PCT-Anmeldung) von Oh, C. S. et al. (Beckman Instru ments, Inc.) WO 89/12826, veröffentlicht am 28. Dezember 1989, interessant sowie eine veröffentlichte europäische Patentanmel dung von Hoyle et al., EP 0 378 197 A2, veröffentlicht am 1. Oktober 1990; beide Veröffentlichungen betreffen B₁₂-Nicht-Iso topen-Assays. Die Veröffentlichung von Oh beschreibt einen B₁₂- EIA, der einen biotinylierten Intrinsicfaktor, Avidin-Meerret tichperoxidase und B₁₂, gebunden an eine Festphase, verwendet. Die Veröffentlichung von Hoyle beschreibt einen B₁₂-EIA unter Verwendung von Streptavidin, gebunden an eine Festphase, bioti nyliertem monoklonalem Anti-B₁₂ und B₁₂-Meerrettichperoxidase.

Aus der EP 0 361 817 A2 sind nukleophile polysubstituierte Aryl-acridinium-ester bekannt, die insbesondere für Assays für die Bestimmung von Vitamin B₁₂ verwendet werden können. Verwiesen sei insbesondere auf Seite 10, Zeilen 2-25 dieser Patentschrift.

Aus der DE 29 02 400 C2 ist ein spezifischer Doppelrezeptor- Bindetest für einen Probenliganden bekannt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß das Bindungsreagenz durch einen bestimmten Komplex gebildet wird, der einen bindenden Ligand und einen Rezeptor für den Probenliganden enthält. Der Rezeptor kann dabei insbesondere ein bindendes Protein sein und der Probenligand insbesondere Vitamin B₁₂. Zu verweisen ist insbesondere auf die Ansprüche 1, 8, 10, 25 und 26 sowie auf Spalte 13, Zeilen 23 bis 29 und Spalte 14, Zeilen 56 bis 61 dieser Druckschrift.

In der US 4 950 612 werden Serum-Proben für die Vitamin-B₁₂- Analyse beschrieben, die unter Verwendung einer Kombination von Peroxy-Säure und Dithiothreitol vorbehandelt werden können. Zu verweisen ist inbesondere auf die Ansprüche 1 bis 7 dieser Druckschrift.

Von Self, C. H., EP 00 27 036 B1 wurde im Oktober 1988 ein Am plifikationsverfahren beschrieben, in welchem das Signal des Markierungsenzyms (alkalische Phosphatase) um das etwa Hundert fache verstärkt wird.

Von Suter, M., Butler, J. E., und Peterman, J. H., in "The Immu nochemistry of Sandwich ELISAs-III. The Stoichiometry and Effi cacy of the Protein-Avidin-Biotin Capture (PABD) System", Mole cular Immunol. 26: 221-230 (1989) wurde ein Festphasensystem für ELISA Assays beschrieben, in welchem Streptavidin an ein bioti nylisiertes Protein gebunden vorliegt, welches dann wieder an eine Mikrotiterplatte adsorbiert wird.

Die oben beschriebenen Verfahren aus dem Stand der Technik wei sen verschiedene Schwierigkeiten und Nachteile auf. Beispiels weise verwendet das "Nicht-Koch"-Vorbehandlungsverfahren von Allen Behandlungsreagenzien, die in der Lage sind, die ver schiedenen Enzyme und Bindungsproteine, die im Assay verwendet werden, zu denaturieren oder in anderer Weise nachteilig zu modifizieren. Hierdurch wird die Genauigkeit und Reproduzier barkeit des Assays verringert. Das von Self beschriebene Ampli fikationsverfahren wurde für B₁₂-Assays nicht angewendet, da es die Verwendung eines Enzym-markierten B₁₂ erfordert, welches eine wesentlich geringere Bindungsaffinität an die Proteine zeigt als unmarkiertes B₁₂. Dies hat die Entwicklung von kompe titiven Bindungsassays, insbesondere für B₁₂, beeinflußt. Eine weitere Schwierigkeit liegt in der Tatsache, daß die Fähigkeit des Intrinsicfaktors, B₁₂ zu binden, eine Konformationsänderung des Intrinsicfaktors einschließt und die Fähigkeit des Intrin sicfaktors, eine derartige Veränderung zu vollziehen, hängt von den verwendeten Arbeitsbedingungen ab. Zur Erreichung einer maximalen Bindungsaktivität muß der Intrinsicfaktor in Lösung vorliegen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die oben be schriebenen und weitere nicht im einzelnen genannten Nachtei le bei der Vorbehandlung einer Testprobe für einen Enzymimmu noassay nach dem "Nicht-Koch"-Verfahren zu vermeiden.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen im Anspruch 1 gelöst. Erfindungsgemäß verbleiben die de naturierenden Mittel im Nicht-Kochverfahren bei der Vitamin B₁₂- Vorbehandlung nach dem Gebrauch in der Probenmischung und werden mit einem Behandlungsmittel kombiniert, welches die denaturierenden Mittel deaktiviert, ohne selbst auf belie bige Proteine oder Enzyme, die anschließend zur Durchführung des Assays zugegeben werden, eine denaturierende Wirkung auszu üben. Der Assay kann deshalb durchgeführt werden, ohne irgend welche Behandlungsmittel aus der Reaktionsmischung zu entfer nen. Da die denaturierenden Mittel eine anorganische Base und ein Thiol umfassen, weist das Behandlungsmittel ein Puffermit tel in Säureform auf, um den pH der Base zu erniedrigen, und ein Mittel, um die Sulfhydrylgruppen des Thiols in eine inakti ve Form, beispielsweise Disulfide oder Alkylthiogruppen, umzu wandeln. Das Sulfhydrylgruppen-Umwandlungsmittel kann deshalb entweder ein Oxidationsmittel oder ein Alkylierungsmittel sein.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren für den Assay selbst bereitzustellen, welches die Verwendung von Enzym-markiertem B₁₂ ermöglicht, ohne daß ein Nachteil durch die verringerte Proteinbindungsaffinität aufgrund der Gegenwart des Enzyms oder der Verwendung von derivatisiertem B₁₂ entsteht. Weiterhin soll das Verfahren die Verwendung von Intrinsicfaktor als Bindungselement ermöglichen, wenn die Reaktion zwischen B₁₂ und dem Intrinsicfaktor vollständig in der Flüssigphase stattfindet.

Diese Aufgaben werden durch ein Ver fahren mit den Merkmalen im Anspruch 8 gelöst.

Erfindungsgemäß werden folgende Schritte ausgeführt:

1) Die Testprobe wird, wenn das in der Probe enthaltene B₁₂ von allen endogenen Bindungsproteinen befreit ist, mit einem Überschuß an biotinyliertem Intrinsicfaktor umgesetzt, um einen Komplex zu bilden. Diese Reaktion erfolgt vollständig in Lösung in der Flüssigphase.
2) Anschließend wird Enzym-markiertes Vitamin B₁₂ zugege ben, und die Lösung wird mit Festphasen-Streptavidin inkubiert. Als Ergebnis dieser Inkubation wird sowohl der in Schritt (1) gebildete Komplex als auch nicht umgesetzter biotinylierter Intrinsicfaktor auf der Festphase durch eine Streptavidin-Biotin-Interaktion immobilisiert, und der immobilisierte biotinylierte Intrinsicfaktor, der keinen Komplex mit B₁₂ aus der Testprobe gebildet hatte, bindet an Enzym-markiertes B₁₂.

Auf dieser Verfahrensstufe umfaßt die immobilisierte Spezies auf der Festphase das B₁₂ aus der Probe und einen Teil des En zym-markiertem B₁₂, während ein Teil des Enzym-markierten B₁₂ in der Lösung verbleibt. Es ist wichtig, daß eine ausreichend gro ße Menge an biotinyliertem Intrinsicfaktor verwendet wird, so daß das meiste, wenn nicht alles B₁₂ aus der Probe im Schritt (1) verbraucht wird, und daß das Enzym-markierte B₁₂ in Schritt (2) den verbleibenden biotinylierten Intrinsicfaktor ver braucht, während von dem B₁₂ aus der Probe im wesentlichen nichts verdrängt wird.

3) Die Fest- und Flüssigphasen werden anschließend ge trennt, und anschließend wird die Höhe der Enzymakti vität entweder in der Festphase oder in der Flüs sigphase bestimmt und durch geeignete Kalibrierungs kurven mit der Konzentration an Vitamin B₁₂ in der Testprobe in Beziehung gesetzt.

Weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden im fol genden beschrieben.

Die anliegende Zeichnung ist eine graphische Darstellung einer Dosis-Antwort-Kurve für Vitamin B₁₂, wie sie für den erfindungs gemäßen Assay typisch ist.

Als Puffermittel in der Behandlungsmischung nach der Denaturie rung der Testprobe kann jeder Puffer verwendet werden, der in saurer Form angewandt werden kann, um den pH auf eine für den Test verträgliche Höhe zu verringern, und der dann den pH bei oder nahe bei diesem Level während der nachfolgenden Testreak tionen aufrechterhält. Ein Beispiel für derartige Puffer sind Phosphatpuffer, Boratpuffer, Acetatpuffer, Succinatpuffer und Tris(hydroxymethyl)-aminomethan. Erfindungsgemäß werden als Phosphatpuffer insbesondere Mononatriumphosphat und Monokalium phosphat bevorzugt. Die Puffer werden ausgewählt und, wenn nö tig, eingestellt, um die behandelte Testprobe auf einen pH ein zustellen, der innerhalb eines Bereiches von etwa 6,5 - etwa 8,0, bevorzugt etwa 7,0 - etwa 7,4, liegt. Die Mengen und die Verfahren, um den pH-Wert einzustellen, sind dem Fachmann be kannt.

Als oxidierende Mittel zur Deaktivierung der Sulfhydrylgruppe des Thiols werden erfindungsgemäß solche Mittel verwendet, die ein oxidierendes Potential aufweisen und eine Reaktionsge schwindigkeit, die ausreichend groß ist, um eine Oxidation der Sulfhydrylgruppen zu erreichen, die aber gleichzeitig nicht in der Lage sind, eine wesentliche Denaturierung der Proteine und Enzyme zu bewirken, die in den nachfolgenden Schritten im Test verfahren zugegeben werden. Beispiele für derartige oxidierende Mittel sind Iodatsalze, Nitritsalze, Bromatsalze, Dithionat salze und Ellman's Reagenz. Erfindungsgemäß werden Iodatsalze, insbesondere Natrium- und Kaliumiodat, bevorzugt.

Als Alkylierungsmittel zur Deaktivierung der Sulfhydrylgruppe des Thiols können solche Mittel eingesetzt werden, die in der Lage sind, die Sulfhydrylgruppen zu Alkylthiogruppen unter den in der Testprobe nach der Denaturierungs-Vorbehandlung herr schenden Bedingungen umzuwandeln. Beispiele für derartige Mit tel sind Iodessigsäure, Methylmaleimid, 2-Brommethylamin und N- Iodsuccinimid.

Die optimalen Konzentrationen des Puffers und des oxidierenden oder alkylierenden Mittels zur Verwendung in einem beliebigen Behandlungsverfahren in Übereinstimmung mit dieser Erfindung sind vom Fachmann ohne weiteres durch Routineexperimente be stimmbar.

Die Vorbehandlungsmaterialien für das Nicht-Kochverfahren der Proteindenaturierung, deren Anwendung der Anwendung der Kombi nation von Puffer und Sulfhydryl-deaktivierenden Mittel voran geht, können aus den bekannten Verfahren ausgewählt werden, insbesondere aus den oben angeführten Patent- und Offenlegungs schriften von Allen (auf deren Offenbarungsgehalt hiermit voll inhaltlich Bezug genommen wird). Typische Vorbehandlungslösun gen enthalten eine anorganische Base wie Natrium- oder Kalium hydroxid und ein Thiol wie z. B. Dithiothreitol, β-Mercaptoet hanol, Thioglycolat, Thioglycerin oder 3-Mercaptopropionsäure. Im allgemeinen werden Natriumhydroxid und Dithiothreitol ver wendet. Typische Vorbehandlungslösungen enthalten weiterhin Kaliumcyanid, um alle Formen von Cobalamin zu Cyanocobalamin umzuwandeln, als auch Cobinamid, ein B₁₂-Analog, in Form von Dicyanocobinamid, welches dazu dient, alle R-Bindungsproteine, die in der Probe vorliegen, zu sättigen, um zu verhindern, daß sie in diesem Schritt und in den nachfolgenden Schritten rena turieren. Die anorganische Base und das Thiol werden im allge meinen als Einzellösungen aufbewahrt, wobei die eine Lösung die Base plus Kaliumcyanid und Dicyanocobinamid und die andere Lö sung das Thiol und Natriumchlorid enthalten.

Obwohl die Vorbehandlungs-, Neutralisations- und Deaktivie rungsverfahren in dieser Patentanmeldung insbesondere im Zusam menhang mit Vitamin B₁₂-Assays beschrieben werden, sind sie auch in ähnlicher Weise auf Assays in einem weiten Bereich von Spe zies anwendbar, die in der Lage sind, endogene Proteine zu bin den, wenn sie in einer biologischen Probe vorliegen. In dieser Hinsicht ist die Spezies, welche durch den Assay nachgewiesen werden soll, erfindungsgemäß unkritisch.

Wenn die vorliegende Erfindung bei Assays für Vitamin B₁₂ ange wandt wird, können diese Assays bei beliebigen biologischen Flüssigproben angewandt werden, von denen angenommen wird, daß sie Vitamin B₁₂ enthalten und bei denen der Vitamin B₁₂-Gehalt bestimmt werden soll. Derartige Assays werden typischerweise an menschlichem Plasma oder Serum angewandt.

Für das Enzym-markierte Vitamin B₁₂ ist eine große Vielzahl an Enzymen einsetzbar, einschließlich solcher Enzyme, die als Mar kierung in einem Nachweisverfahren dienen können. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunoassays sind viele derartige Enzyme und Substrate zu ihrem Nachweis bekannt. Ein bevorzugtes Enzym ist die alkalische Phosphatase, und ein bevorzugtes Nachweisverfah ren ist das Enzymamplifikationsverfahren von Self, auf welches oben hingewiesen wurde, und auf welches hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Ein typisches Verfahren, welches die Verwendung der alkalischen Phosphatase einschließt, verwendet β-Nicotinamid-adenin-dinu cleotid-phosphat, die reduzierte Form (β-NADPH), als Substrat. Die alkalische Phosphatase schneidet die Phosphatgruppe, um β- Nicotinamid-adenin-dinucleotid zu bilden, die reduzierte Form (β-NADH). Hierauf folgt die Zugabe eines Farbentwicklungsrea genzes, welches sich zusammensetzt aus Diaphorase, Iodnitrote trazoliumviolett (INT), Ethanol und Alkoholdehydrogenase. Nur das geschnittene Produkt, β-NADH, gebildet während des Sub strat-Inkubationsschrittes, kann den Amplifikationszyklus ini tiieren. Das β-NADH wird durch Diaphorase zu β-NAD oxidiert mit gleichzeitiger Reduktion von INT zu einem gefärbten Produkt (meßbar bei 490 nm). Um den Zyklus zu vervollständigen, redu ziert die Alkoholdehydrogenase gleichzeitig β-NAD zu β-NADH und oxidiert Ethanol zu Acetaldehyd. Der Zyklus beginnt anschlie ßend erneut, und die Geschwindigkeit, bei der die Farbe gebil det wird, ist abhängig von der ursprünglich vorhandenen Menge an β-NADH.

Wie oben ausgeführt wurde, kann dieses Nachweisverfahren entwe der in der Festphase oder der Flüssigphase durchgeführt werden. Für die Festphasenverfahren wird die Festphase in Kontakt mit den flüssigen Lösungen des Substrats und der anderen Nachweis mittel gebracht, und die Farbwechsel in diesen Lösungen beob achtet und quantifiziert. Für Flüssigphasenverfahren wird die Flüssigphase mit den flüssigen Lösungen des Substrats und der anderen Nachweismittel kombiniert, und die Farbwechsel werden in gleicher Weise beobachtet und quantifiziert.

Die Festphase kann von einer beliebigen Konfiguration sein, die für diese in diesem Assay verwandten Verfahren geeignet ist. Beispiele hierfür sind Kügelchen, Teströhrchen und Mikrotiter platten.

Die Bildung der anderen, in diesem Assay verwendeten Verfahren wird durch herkömmliche, in der Literatur beschriebene Verfah ren erreicht. Um ein mit alkalischer Phosphatase markiertes B₁₂ zu bilden, wird beispielsweise eine saure Hydrolyse der Propionamidgruppen am Corrinring von B₁₂ durchgeführt. Hierauf folgt die Umsetzung von B₁₂-Monocarbonsäure mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbo diimid in einem wasserfreien, aprotischen Lösungsmittelsystem. Dies ergibt die Bildung eines NHS-Esters der B₁₂-Monocarbonsäu re, der anschließend mit den Amingruppen der alkalischen Phos phatase in wäßrigem Medium umgesetzt wird.

Der biotinylierte Intrinsicfaktor wird in ähnlicher Weise durch bekannte Verfahren hergestellt, wobei ein derartiges Verfahren die Verwendung von Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoat als Biotinylierungsmittel umfaßt. Die Konzentration des im As say verwendeten biotinylierten Intrinsicfaktors kann einge stellt werden, um eine Dosisantwortkurve zu ergeben, welche die größte Sensitivität in dem diagnostischen Bereich hat, welcher für den Assay erwartet wird. Eine derartige Einstellung ist für den erfahrenen Fachmann auf dem Gebiet der Immunoassays ohne weiteres möglich und durch Routineexperimente bestimmbar. Der Intrinsicfaktor ist für B₁₂ spezifisch und kreuzreagiert nicht mit Cobinamid oder anderen B₁₂-Analoga.

Die Immobilisierung von Streptavidin auf einer Festphase, wie z. B. einer Mikrotiterplatte, wird im allgemeinen durch Adsorp tion eines biotinylierten Carrierproteins auf eine Mikrotiter platte und anschließende Bindung von Streptavidin an die Bio tin-Protein-Platte erreicht.

Ein Assay-Kit, der alle für den Assay notwendigen Bestandteile einschließt, beinhaltet typischerweise die folgenden Bestand teile:


pg/ml

Bereich
1. Standards
Cyanocobalamin @	Menschliches Serumalbumin	7%
Natriumchlorid	0,9%
Natriumazid	0,1%

2. Enzymkonjugatlösung
B₁₂-alkalische Phosphatase-Konjugat @	Triethanolaminhydrochlorid	10 mM
Natriumazid	0,1%
Natriumchlorid	0,85%
Magnesiumchlorid	1 mM
Zinksulfatheptahydrat	0,1 mM
Menschliches Serumalbumin	1%
Polyethylenglykol 8000	5%
Tween 20	0,05%

3. Bindungsprotein-Konjugatlösung
Biotin-Intrinsicfaktor-Konjugat @	Triethanolaminhydrochlorid	10 mM
Natriumazid	0,1%
Natriumchlorid	0,85%
Magnesiumchlorid	1 mM
Zinksulfatheptahydrat	0,1 mM
Menschliches Serumalbumin	1%
Polyethylenglykol 8000	5%
Tween 20	0,05%

4. Neutralisationsmittel
Kaliumiodat	100 mM
Monobasisches Kaliumphosphatmonohydrat	260 mM

5. Vorbehandlungslösung, Teil A
Natriumhydroxid	1 M
Kaliumcyanid	100 µg/ml
Dicyancobinamid	1 µg/ml

6. Vorbehandlungslösung, Teil B
Dithiothreitol	20 mg/ml
Natriumchlorid	10 mM

7. Waschpuffer, pH 7,4
Triethanolaminhydrochlorid	10 mM
Natriumchlorid	0,88%
Tween	0,05%
Kathon CG	0,06

8. Vorbehandlungs-Mikrotiterplatten
Blindwert-Polystyrol-Mikrotiterplatten

9. Assay-Mikrotiterplatten
Polystyrol-Mikrotiterplatten, beschichtet mit Biotin-Rin derserumalbumin, an welches Streptavidin gebunden ist.

10. Lyophilisiertes Substrat
β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (reduzierte Form)

11. Substratverdünnungsmittel, pH 9,5
Diethanolamin	50 mM
Ethanol	4%
Magnesiumchlorid	1 mM
Natriumazid	0,02%
Tween 20	0,1%

12. Lyophilisierter Verstärker
Alkoholdehydrogenase
Diaphorase

13. Verstärker-Verdünnungsmittel
Monobasisches Natriumphosphatmonohydrat	1 mM
Natriumazid	0,02%
Ethylenglykol	8% (Volumenbasis)
Iodnitrotetrazoliumviolett	2 mM

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Verdeutlichung der Er findung, und es wird darauf hingewiesen, daß die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.

Beispiel 1 Biotinylierung des Intrinsicfaktors

In ein Reaktionsgefäß wurden 200 µl 0,5 mg/ml Intrinsicfaktor, 166 µl deionisiertes Wasser und 50 ml 1M Natriumbicarbonat ge geben. Getrennt hiervon wurde eine Lösung hergestellt durch Auflösen von 5 mg Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoat in 1 ml deionisiertem Wasser. Sofort nach Bildung der letzteren Lösung wurde ein Teil (56 µl) der Biotinlösung zur Intrinsic faktorlösung unter Rühren zugegeben. Die erhaltene Reaktionsmi schung wurde bei 4°C 16 Stunden lang inkubiert.

Nach dieser Zeit wurden 100 µl einer Lösung, enthaltend 1% menschliches Serum Albumin, 10 ml Trishydroxymethylaminomethan, 0,85% Natriumchlorid, 0,1% Natriumazid (10 mM TBS/Azid), bei pH 7,4 zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde sechsmal unter Verwendung eines Zentrikon 30 Mikrokonzentrators und 10 mM TBS/Azid gewaschen. Der Waschpuffer enthielt 10 mM Triethanol amin, 0,88% Natriumchlorid, 0,05% Tween 20 und 0,06% Kathon CG, pH 7,4. Nach dem Waschen wurde das Lösungsvolumen auf einen Milliliter erhöht und das gleiche Volumen an Konjugatverdün nungsmittel wurde zugegeben. Das Konjugatverdünnungsmittel ent hielt 10 mM Triethanolamin, 0,1% Natriumazid, 0,85% Natrium chlorid, 1 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM Zinksulfatheptahydrat, 1% menschliches Serumalbumin, 5% Polyethylenglykol und 0,05% Tween 20, pH 7,4.

Beispiel 2 Kopplung von B₁₂ an alkalische Phosphatase

Bevor B₁₂ an alkalische Phosphatase gekoppelt werden kann, muß es zuerst durch saure Hydrolyse der Propionamidgruppen des Cor rinrings derivatisiert werden. Dies wurde dadurch erreicht, daß zunächst 600 mg B₁₂ zu 12 ml 0,1 M Salzsäure zugegeben wurden. Die Lösung wurde im Dunklen bei Raumtemperatur 72 Stunden ge rührt. Nach dieser Zeit wurde der pH auf 4,0 mit 1 M Natriumhy droxid eingestellt.

Die Reaktionsmischung wurde anschließend auf eine Aluminium oxidsäule gegeben, die dann mit Wasser eluiert wurde. Nicht hydrolysiertes Material passierte diese Säule, während die Mo no-, Di- und Tricarbonsäuren zurückgehalten wurden. Die Mono carbonsäure wurde mit 0,1 M Ammoniumhydroxid herauseluiert. Die Fraktionen, welche die gewünschte Mischung an b, d und e Isomeren der B₁₂ Monocarbonsäure enthielten, wurden vereinigt, konzentriert und auf einen pH von 4,0 angesäuert. Das Produkt wurde anschließend in 90% Phenol extrahiert. Zu den Phenolex trakten wurde Ether hinzugegeben. Die Phenol/Ether-Schicht wur de anschließend mit deionisiertem Wasser extrahiert, wobei das Produkt in der wäßrigen Schicht verblieb. Die kombinierten wäß rigen Extrakte wurden mit Ether gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde am Ende lyophylisiert, um 65 mg einer Mischung der b, d und e Isomere der Monocarbonsäure von B₁₂ zu ergeben.

Anschließend wurde der N-Hydroxysuccinimid-aktive Ester von B₁₂ gebildet und mit alkalischer Phosphatase umgesetzt. Um dies zu erreichen, wurden B₁₂-Monocarbonsäure (20 mg), N-Hydroxysuccinimid (22 mg) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (40 mg) in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (700 µl) gelöst. Die sich ergebende Lösung wurde im Dunklen bei 4°C 16 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde anschließend zentrifugiert und das Pellet verworfen.

Zu 1,27 mg alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm in 5,86 ml 0,1 M Phosphatpuffer, 0,1 M Natriumchlorid, pH 7,4, wurden 140 µl (4,69 mg) des Überstandes der B₁₂ aktiven Ester enthaltenden Lösung gegeben. Die Mischung wurde 16 Stunden lang im Dunklen bei 4°C gerührt. Nach dieser Zeit wurde die Reaktionsmischung gegen 50 mM Tris, 0,1% Natriumazid, 0,1 M Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM Zinkchlorid, pH 7,6, 0,1% Norit A (Holzkohle) dialysiert. Das Konjugat wurde über HPLC unter Ver wendung einer Größenausschlußsäule gereinigt.

Beispiel 3 Herstellung von Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten

Die Herstellung von Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplat ten erfordert biotinyliertes Carrierprotein. In diesem Beispiel war das Carrierprotein Rinderserumalbumin (BSA). Eine Lösung wurde hergestellt durch Auflösen von 100 mg BSA in einer Mi schung von 10 ml 1 M Natriumbicarbonat und 9 ml deionisiertem Wasser. Eine Biotinlösung wurde hergestellt durch Auflösen von 79,5 mg Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoat in 1 ml de ionisiertem Wasser. Sofort nach Bildung der Lösung wurde die Biotinlösung zur BSA-Lösung unter Rühren hinzugegeben. Die re sultierende Lösung wurde 16 Stunden lang bei 4°C stehengelassen und anschließend unter Verwendung eines Centricon 30 Mikrokon zentrators und 10 mM phosphatgepufferter Saline (PBS), 0,1% Natriumazid, pH 7,4, gewaschen.

Die Biotin-BSA-Lösung wurde auf 2,5 µg/ml unter Verwendung von 10 mM PBS, pH 7,4, verdünnt. Die Wells einer Mikrotiterplatte wurden anschließend mit 100 µl/Well dieser Lösung beladen, und die Platte wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Platte mit Waschpuffer gewaschen. Streptavidin wurde in einer Lösung von 1% BSA, 10 mM PBS ge löst, um eine Endkonzentration von 4 µg/ml zu ergeben. Hierauf wurde diese Lösung in die Wells der Mikrotiterplatte mit 100 µl/Well gegeben. Die Platte wurde anschließend über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Platte mit Waschpuffer gewaschen und 5% Sucrose in 10 mM PBS, 100 µl/ Well, pH 7,4, wurden zugegeben. Die Platte wurde anschlie ßend über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Lösung dekantiert und die Platte getrocknet. Die Platte wurde in einem Kunststoffbehälter mit einem Trocknungs mittel bei 4°C aufbewahrt.

Beispiel 4 B₁₂-Assay-Protokoll und -Ergebnisse

In jedes Well einer unbeschichteten Mikrotiterplatte wurden 30 µl eines Standards, einer Kontrolle oder einer Probe gegeben, gefolgt von 60 µl einer 1 : 1 Mischung der Vorbehandlungslösung A und der Vorbehandlungslösung B. Diese Vorbehandlungslösungen waren wie folgt:

Vorbehandlungslösung A:
1 M Natriumhydroxid, 100 µg/ml Kaliumcyanid und 1 µg/ml Dicyanocobinamid

Vorbehandlungslösung B:
20 mg/ml Dithiothreitol und 10 mM Natriumchlorid

Die Platte wurde anschließend kurz geschüttelt, bedeckt und 20 Minuten lang in einen Inkubator bei 37°C gegeben. Anschließend wurde eine Neutralisationslösung (150 µl), bestehend aus 100 mM Kaliumiodat und 260 mM monobasischem Kaliumphosphat, zugegeben, gefolgt von 30 µl Bindungsprotein. Die Platte wurde anschlie ßend wiederum kurz geschüttelt, bedeckt und 30 Minuten lang in einen Inkubator bei 37°C gegeben.

In jedes Well einer mit Streptavidin/Biotin-BSA beschichteten Mikrotiterplatte wurden 35 µl des Enzymkonjugats unter Verwen dung einer Mehrkanalpipette gegeben, gefolgt von 70 µl des vor behandelten Standards, der Kontrolle oder Probe. Die Platte wurde anschließend kurz geschüttelt, bedeckt und 30 Minuten lang in einen Inkubator bei 37°C gegeben. Die Platte wurde an schließend gewaschen und trockengetupft, und die Substratlösung (100 µl/Well) wurde zugegeben. Die Platte wurde wiederum kurz geschüttelt, bedeckt und 30 Minuten lang in einen Inkubator bei 37°C gegeben. Schließlich wurden in jedes Well 100 µl der Ver stärkerlösung gegeben. Die Geschwindigkeit des Wechsels der optischen Dichte bei 490 nm wurde anschließend auf einem Mikro titerplatten-Lesegerät abgelesen.

Die anliegende Figur zeigt eine graphische Darstellung der Do sis-Antwortkurve, die nach diesem Protokoll erhalten wurde. Die vertikale Achse stellt die Geschwindigkeit der Farbentwicklung in milli-optischen Dichteeinheiten pro Minute dar, während auf der horizontalen Achse die B₁₂-Konzentration in Picogramm pro Milliliter angegeben ist.

Die Beschreibung und die Ausführungsbeispiele dienen insbeson dere zur Veranschaulichung der Erfindung. Für den Fachmann ist ohne weiteres erkennbar, daß die Arbeitsbedingungen, Materia lien, Verfahrensschritte und andere Parameter des hier be schriebenen Assays modifiziert oder in anderer Weise veränder bar sind, ohne von der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Testprobe für einen Enzymimmunoassay, wobei das Vorhandensein einer biologi schen Spezies nachgewiesen werden soll und wobei wenig stens ein Teil der biologischen Spezies, falls sie in der Testprobe vorliegt, an endogene Bindungsproteine gebunden ist, die mit dem Enzymimmunoassay interferieren können, umfassend die Verfahrensschritte:

a) Kombinieren der Testprobe mit einer anorganischen Base und einem Thiol, um eine erste Mischung zu bil den;
b) Inkubieren der ersten Mischung, um die in der Test probe vorhandenen endogenen Bindungsproteine durch die anorganische Base und das Thiol zu denaturieren und hierdurch die in der Testprobe vorhandene biolo gischen Spezies von den endogenen Bindungsproteinen freizusetzen, wodurch eine zweite Mischung gebildet wird, und
c) Kombinieren der zweiten Mischung mit
- (i) einem Puffermittel in Säureform und
- (ii) einem Mittel zur Umwandlung von Sulfhydrylgrup pen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1) oxidierenden Mitteln mit einem solchen elektrochemi schen Potential, welches in der Lage ist, die in der ersten Mischung vorliegenden Sulfhydrylverbindungen zu Di sulfiden zu oxidieren und im wesentlichen die Denatu rierung weiterer, nicht bereits denaturierter Protei ne zu verhindern, und 2) alkylierenden Mitteln, um den pH der zweiten Mischung auf einen Wert innerhalb eines Bereiches von etwa 6,5 bis etwa 8,0 zu ernied rigen und noch verbleibende Thiolgruppen zu Disulfid gruppen umzuwandeln.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt (c) die Ab senkung des pH-Wertes auf einen Bereich von etwa 7,0 bis etwa 7,4 umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei des Puffermittel ausge wählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Phosphatpuffer, Boratpuffer, Azetatpuffer, Succinatpuffer und Tris(hydroxymethyl)aminomethan.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das die Sulfhydrylgruppe umwandelnde Mittel ein Oxidationsmittel ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Iodatsalz, einem Ni tritsalz, einem Bromatsalz, Dithionatsalz und Ellman's Reagenz.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die anorganische Base ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Natriumhy droxid und Kaliumhydroxid und das Thiol ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Dithiothreitol, β-Mercapto ethanol, Thioglycolat, Thioglycerol und 3-Mercaptopro pionsäure.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die anorganische Base Natriumhydroxid, das Thiol Dithiothreitol, das Puffermit tel ein Dihydrogenphosphatpuffer und das Sulfhydryl gruppen-umwandelnde Mittel ein Iodatsalz ist.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An sprüche, wobei die biologische Spezies Vitamin B₁₂ ist.

8. Verfahren zur Bestimmung der Menge an Vitamin B₁₂ in einer Vitamin B₁₂ enthaltenden Testprobe innerhalb eines vorbe stimmten Konzentrationsbereiches, umfassend die Verfah rensschritte:

a) Dissoziieren des gesamten Vitamin B₁₂ in der Testlö sung von den hieran gebundenen Proteinen;
b) Kombinieren der Testprobe mit biotinyliertem Intrin sicfaktor in einer ersten Lösung, wobei der biotiny lierte Intrinsicfaktor im Überschuß zum Maximum des vorbestimmten Bereiches vorliegt, und Inkubieren die ser ersten Lösung, um im wesentlichen das gesamte darin enthaltene Vitamin B₁₂ mit dem biotinylierten Intrinsicfaktor zu kombinieren, um einen Komplex zu bilden;
c) Kombinieren der ersten Lösung mit Enzym-markiertem Vitamin B₁₂ in einer zweiten Lösung in Gegenwart von auf einer Festphase immobilisiertem Streptavidin, wobei das Enzym-markierte Vitamin B₁₂ und das Strepta vidin je im Überschuß zum biotinylierten Intrinsic faktor des Schritts (b) vorliegen, und Inkubieren dieser zweiten Lösung und des Streptavidins, um zu bewirken, daß der Komplex und das biotinylierte, In trinsicfaktor-freie Vitamin B₁₂ in der zweiten Lösung an Streptavidin gebunden werden, und Komplexbildung des biotinylierten intrinsicfaktorfreien Vitamin B₁₂ in der zweiten Lösung mit dem Enzym-markierten Vit amin B₁₂;
d) Abtrennen der Festphase von der zweiten Lösung und
e) Bestimmen des Levels der Enzymaktivität entweder der Festphase oder der zweiten Lösung.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Schritte (b) und (c) bei pH-Werten von etwa 7,0 - etwa 8,0 durchgeführt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Enzym des Enzym-mar kierten Vitamin B₁₂ alkalische Phosphatase ist.

11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Schritt (a) umfaßt:

(i) Kombinieren der Testprobe mit einer anorganischen Base und einem Thiol und Inkubieren der resultieren den Mischung, um durch die anorganische Base und das Thiol die Denaturierung der in der Testprobe vorlie genden endogenen Bindungsproteine zu bewirken und hierdurch das gesamte, hieran gebundene Vitamin B₁₂ hiervon freizusetzen; und
(ii) Kombinieren der aus Schritt (i) entstandenen Mischung mit
- 1) einem Puffermittel in Säureform und
- 2) einem Sulfhydrylgruppen-Umwandlungsmittel, aus gewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) oxidie renden Mitteln mit einem elektrochemischen Po tential, welches in der Lage ist, die in der ersten Mischung vorliegenden Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden umzuwandeln und gleichzeitig im wesentlichen die Denaturierung weiterer, noch nicht denaturierter Proteine zu vermeiden, und b) alkylierenden Mitteln, um den pH der zweiten Mischung auf einen Wert innerhalb des Bereiches von etwa 6,5 bis etwa 8,0 abzusenken und die verbliebenen Thiolgruppen zu Disulfidgruppen umzuwandeln