DE68907996T2

DE68907996T2 - Verfahren zur Erhöhung der Spezifizität in kompetitiven Immuntests.

Info

Publication number: DE68907996T2
Application number: DE89106445T
Authority: DE
Inventors: Richard H Decker; John A Weare
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1988-05-11
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2009-04-12
Also published as: DE68907996D1; EP0341439A1; US5681695A; AU613187B2; KR900018679A; ES2059601T3; US6150113A; CA1335706C; EP0341439B1; JP2945025B2; JPH01321365A; AU3464189A; ATE92633T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das Hepatitis B-Kernantigen (HBcAg) ist ein Teilchen aus dem Kern des Hepatitis B- Virion (HBV), das manchmal als Dane-Teilchen bezeichnet wird. HBcAG ist ein wirksames Immunogen, das typischerweise eine starke Immunantwort hervorruft, die nach dem Abklingen der HBV-Infektion jahrelang anhält und im Serum von Patienten mit chronischen HBV-Infektionen gefunden wird.
Die Entdeckung des Antikörpers gegen das Hepatitis B-Kernantigen (Anti-HBc) wird angewendet, um das Voranschreiten von HBV-Infektionen zu kontrollieren. Anti-HBc wird kurz nach dem Auftreten des Hepatitis B-Oberflächenantigens (HBsAg) im Serum gefunden und ist bei einer akuten Hepatitis B noch nach dem Verschwinden von HBsAg und vor dem Auftreten eines detektierbaren Antikörpers gegen HBsAg (Anti- HBs) vorhanden. Darum kann Anti-HBc in Abwesenheit von HBsAg und Anti-HBs für eine kurz zuvor erfolgte Hepatitis B-Infektion und für potentiell infektiöses Blut das einzige Anzeichen im Serum sein.
Vor etwa zehn Jahren zeigte eine groß angelegte Studie der viralen, mit einer Transfusion im Zusammenhang stehenden Infektionen, daß Spender, die Anti-HBc- positiv waren, oft an der Übertragung weiterer infektiöser Mittel auf die Empfänger beteiligt waren, Vyas und Perkins, New England J. Med., 306: 749-750, 1981. Am auffälligsten war die Feststellung, daß etwa 40 % der Empfänger von Spenderblut, die anschließend eine nicht-A-, nicht-B-Hepatitis-Infektion (NANB) entwickelten, mindestens eine Einheit Anti-HBc-positives Blut erhalten hatten. Wahrend die wissenschaftliche Beziehung dieses Zusammenhangs von NANB und Anti-HBc noch nicht aufgeklärt worden ist, glauben viele Wissenschaftler an einen epidemiologischen Zusammenhang und daß Spender, die einer Hepatitis B ausgesetzt waren, zu denen gehören, die auch am wahrscheinlichsten einer NANB ausgesetzt waren. Da bisher ein spezifisches Anzeichen für NANB noch nicht identifiziert worden ist und wegen der deutlichen Häufigkeit von NANB bei Blutempfängern, sind Blutbanken zu einem Ersatztest übergegangen, um die Sicherheit der Blutversorgung in den U.S. zu verbessern. Die Detektion von Anti-HBc wurde als ein solcher Ersatztest gewählt, um die Übertragung von NANB zu verringern.
Immuntests zur Detektion von Anti-HBc sind gut bekannt. Beispiele für solche Tests schließen ein den CORAB -Radioimmuntest und den CORZYME -Enzymimmuntest, die beide von Abbott Laboratories, North Chigaco, Illinois, käuflich erhältlich sind.
Diese Tests sind kompetitive Immuntests, bei denen das Anti-HBc in einer biologischen Probe mit einer konstanten Menge Anti-HBc, das mit einem detektierbaren Marker markiert ist, um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen auf einer mit HBcAg überzogenen festen Phase konkurriert. Der Anteil von gebundenem, markiertem Anti-HBc ist umgekehrt proportional zur Konzentration von Anti-HBc in der biologischen Probe.
Die oben beschriebenen Anti-HBc Tests können durch Ein- oder Zweistufen-Verfahren durchgeführt werden. Bei dem Einstufen-Verfahren werden eine Probe und markiertes Anti-HBc zusammengemischt und konkurrieren um HBcAg, das mit der festen Phase verknüpft ist. Bei dem Zweistufen-Verfahren wird das HBcAg auf der festen Phase zunächst mit der Testprobe und dann in einer zweiten Stufe mit markiertem Anti-HBc umgesetzt. Bei beiden Verfahren wird die Menge von markiertem Anti-HBc gemessen, das an die feste Phase gebunden ist. Eine Abnahme der Menge des markierten Antikörpers ist ein Zeichen für eine Antikörper-positive Probe, die in der Lage ist, die Bindung des markierten Antikörpers zu blockieren.
Falsche positive Ergebnisse stellen bei der Überprüfung von Spenderblut auf Anti-HBc ein Problem dar, da es eine große Anzahl von Proben gibt, die nur Anti-HBc positiv sind, wenn kein anderes Hepatitis-Anzeichen und keine andere Krankengeschichte oder kein anderes Krankheitssymptome vorliegen. Es gibt keinen einfachen Weg, um zu bestätigen, daß diese Proben echte positive Proben sind. Dies ist insbesondere beunruhigend, wenn der Anti-HBc-Test als Ersatztest auf NANB verwendet wird, weil der epidemiologische Zusammenhang zwischen Anzeichen und Krankheit nicht stark ist (85 % der Empfänger von Anti-HBc-positivem Blut entwickeln keine bekannte Infektion). Darum ist es wichtig, zwischen Anti-HBc positiven Proben zu unterscheiden, die sich auf NANB beziehen, und denen, die sich nicht darauf beziehen oder falsche positive Proben sind.
Als wichtiger technischer Hintergrund für die Erfindung können mehrere Dokumente erwähnt werden. Zunächst beschreibt Biological Abstracts, 72 (1981):32079 drei Radioimmuntests zur Detektion des spezifischen Immunglobulin M-Anti-Hepatitis A- Virus: Ein Antikörper-Verfahren in drei Stufen, eine Vorbehandlung mit 2-Mercaptoethanol zur IgM-Spaltung und eine Vorbehandlung mit Staphylokokken-Protein A zur IgG-Absorption. Das dreistufige Antikörper-Verfahren war empfindlicher als die beiden anderen Verfahren, wobei sich in nur einer Serumprobe, die hohe Konzentrationen des monokionalen Rheumatoid-Faktors enthielt, falsche positive Ergebnisse ergaben.
Biological Abstracts, 80 (1985):23240 beschreibt, daß die Rheumatoid-Faktor-artigen Reagentien, die eine potentielle Quelle für falsche positive Reaktionen bei Nicht-A-, Nicht-B-Tests darstellen, mit dem Rheumatoid-Faktor gemeinsame Eigenschaften dahingehend aufwiesen, daß sie von aggregiertem IgG absorbiert wurden und gegenüber 2-Mercaptoethanol instabil waren.
Biological Abstracts, 70 (1980):64854 beschreibt einen Agglutinationstest zur Detektion von C-reaktivem Protein, bei dem falsche positive Reaktionen, die durch den Rheumatoid-Faktor verursacht worden waren, durch eine Vorbehandlung der Testproben mit 2-Mercaptoethanol unterbunden wurden.
Die GB-A-2 052 059 beschreibt einen Agglutinationstest zur Detektion von Polyribophosphat, dem Kapsid-Polysaccharid von Haemophilus Influenzae Typ B, bei dem die nicht-spezifische Agglutination auf 2 % oder weniger verringert wurde durch beispielsweise eine Vorbehandlung der Testprobe mit Reduktionsmitteln, wie 2- Mercaptoethanol oder 1,4-Dithiothreitol.
Clinical Chemistry, 29 (1983) S. 1474-1479 beschreibt die Verwendung von Acridiniumestern als Chemoluminiszenz-Marker für Antikörper bei Immuntests.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Wir haben gefunden eine Verbesserung für Immuntests und Verfahren zur Detektion von Anti-HBc, wie die, die oben beschrieben sind, die die Detektion von Anti-HBc- positiven Reaktionen verhindern, die aufgrund mehrerer Kriterien falsche positive Reaktionen sind. Die Verbesserung umfaßt die Zugabe eines Reduktionsmittels, wie Sulfhydryl-Verbindungen, ein schließlich 2-Mercaptoethanol (2ME), Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE), Cystein oder weiteren Reduktionsmitteln, wie Bisulfitlösungen, insbesondere einer Metabisulfitlösung (MBS) oder einer Natriumbisulfitlösung.
Das Reduktionsmittel kann auf verschiedenen Wegen in den Immuntest eingebracht werden. Die Probe kann mit der Chemikalie vor dem Start des Tests behandelt werden. Bei einem Einstufen-Test können Probe, markiertes Reagens, feste Phase und Reduktionsmittel gleichzeitig oder in einem der Verdünnungsmittel für Probe, markiertes Reagens oder feste Phase zugegeben werden. Wenn jedoch das markierte Reagens eine Komponente enthält, die gegenüber dem Reduktionsmittel empfindlich ist, wie ein Enzym, beispielsweise Meerettichperoxidase, sollte das Reduktionsmittel nicht mit dem Enzym in Kontakt kommen und wird in einer getrennten Stufe in einen Zweistufen-Test eingebracht. Bei einem solchen Zweistufen-Test werden Probe und feste Phase zusammen inkubiert, bevor das markierte Reagens in einer zweiten Stufe zugegeben wird. Das Reduktionsmittel kann entweder in der ersten oder zweiten Stufe zugegeben werden, wird jedoch vorzugsweise vor Zugabe der festen Phase oder gleichzeitig mit der Probe und festen Phase zu der Probe gegeben und ist am wirksamsten, wenn es bei der ersten Inkubation zugegeben wird.
Überraschenderweise schaltet die Zugabe eines Reduktionsmittels zu einem Test auf Anti-HBc falsche positive Proben aus, insbesondere die in der Nähe des Grenzwertes, während sie keine deutliche Wirkung auf die Kontrollwerte oder die echten positiven Proben hat. Dies führt zu einer verringerten Anzahl der Proben, die nur gegenüber Anti-HBc reaktiv sind, d.h. gegenüber keinen anderen HBV-Anzeichen oder einer weiteren Krankheitsgeschichte. Diese verstärkte Spezifität beim Testen auf Anti-HBc verstarkt weiterhin die Spezifität des Blutbank-Ersatztestes auf NANB, was die Anzahl der verworfenen Bluteinheiten verringert und die Spender vor der nachfolgenden klinischen Bewertung zur Bestimmung ihres eigenen Gesundheitszustandes und einer zukünftige Ablehnung als Blutspender bewahrt.
Obwohl die Störreaktivität oder der Faktor, der zu zerstören ist, nicht vollständig verstanden wird, ist es ein Makromolekül mit physikalischen Eigenschaften, die sich von denen des IgG unterscheiden. Die Störaktivität kann verursacht werden durch einen heterogenen Faktor, d.h. durch mehr als ein Molekül oder einen Komplex. Das Molekulargewicht des Störfaktors ist größer als 500 000, es ist extrem instabil in Gegenwart eines Reduktionsmittels, und instabil unterhalb eines pH-Wertes von 4,5. Auf der Grundlage seiner Wechselwirkung mit hydrophoben Gelen wird angenommen, daß dieser Störfaktor hydrophob ist und in 30 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; löslich ist und bei 50 % Sättigung ausfällt. Er wird auf CM- oder DEAE-Cellulose teilweise zurückgehalten. Es wird nicht angenommen, daß der Störfaktor, der durch das Reduktionsmittel ausgeschaltet wird, IgM ist, da es unwahrscheinlich ist, daß eine nennenswerte Anzahl Anti- HBc-positiver Proben mit einer niedrigen IgM-Konzentration vorliegt. Viele Proben, die den Störfaktor enthielten, waren nicht fähig, in einem IgM-Fangtest, wie Corzyme M (erhältlich von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois), zu reagieren. Außerdem gibt es einen biochemischen Beweis dafür, daß der Störfaktor durch MBS oder Cystein anders zerstört wird und in Gegenwart anderer Reduktionsmittel in einem im Vergleich zu IgM unterschiedlichen Ausmaß instabil ist. Beispielsweise würde bei den Konzentrationen an Reduktionsmitteln und unter den bei der Erfindung angewendeten Bedingungen IgM nicht vollständig zerstört werden, wohingegen der Störfaktor vollständig ausgeschaltet wird. Ferner geht die nicht-spezifische Aktivität bei einer Chromatographie über Sepharose 6B verloren, während niedrige Konzentrationen einer IgM-spezifischen Aktivität in den erwarteten Fraktionen entdeckt werden, obwohl der Störfaktor auf Sephacryl S-300 mit IgM coeluiert. Bemerkenswert ist die Inaktivierung des Störfaktors auf Sepharose 6B in Abwesenheit eines Reduktionsmittels. Darum scheint es, daß nicht nur Reduktionsmittel, sondern auch eine Gelfiltration den Abbau eines möglichen Komplexes oder Aggregats verursachen, die für den Störaktivität verantwortlich sind.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1 ist eine graphische Darstellung, die eine Reihenverdünnung einer echten positiven Anti-HBc-Probe zeigt, die mit und ohne Reduktionsmittel auf Anti-HBc getestet worden ist.
Figuren 2 und 3 sind Balkendiagramme, die Anti-HBc-Proben der Gruppe I zeigen, die mit und ohne Reduktionsmittel auf Anti-HBc getestet worden sind.
Figuren 4 und 5 sind Balkendiagramme, die falsche positive Proben der Gruppe II zeigen, die mit und ohne Reduktionsmittel auf Anti-HBc getestet worden sind.
Figur 6 ist eine graphische Darstellung, die einen Reihenverdünnungstest einer echten positiven Anti-HBc-Probe mit und ohne Reduktionsmittel zeigt.
Figuren 7 und 8 sind Balkendiagramme, die falsche positive Proben der Gruppe II zeigen, die mit und ohne Reduktionsmittel auf Anti-HBc getestet worden sind.
Figuren 9 und 10 sind Histogramme von positiven Proben der Gruppe I, die mit und ohne Reduktionsmittel auf Anti-HBc getestet worden sind.
Figur 11 zeigt Anti-HBc-Proben an der Grenze zwischen echt und falsch (Gruppe II), die mit und ohne MBS auf Anti-HBc getestet worden sind.
Figur 12 zeigt Anti-HBc-Proben an der Grenze zwischen echt und falsch (Gruppe II), die mit und ohne Cystein auf Anti-HBc getestet worden sind.
Figur 13 ist ein graphischer Vergleich zweier Tests auf Anti-HBc ohne Reduktionsmittel.
Figur 14 ist ein graphischer Vergleich zweier Tests auf Anti-HBc mit Reduktionsmittel.
Figur 15 stellt ein Absorptionsprofil und Anti-HBc-Aktivität-Elutionsprofil für eine echte positive Anti-HBc-Probe dar.
Figur 16 stellt das Absorptionsprofil und das Elutionsprofil der Anti-HBHc-Aktivität einer Probe an der Grenze zwischen echt und falsch (Gruppe 11) dar.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Zwei Gruppen von Proben wurden verwendet, um die Erfindung zu erläutern. Die erste Gruppe (I) ist eine Gruppe ausgewählter, Anti-HBc positiver Seren, die als echte positive Proben definiert wurden, weil sie weitere Anzeichen für eine Hepatitis B aufwiesen oder von Subjekten mit einer früheren Hepatitis B-Krankengeschichte stammten und weil deren Reaktivität mit Gammaglobulinen zusammenhing. Die zweite Gruppe (II) ist eine Gruppe von Serumproben von Spendern ohne weitere Anzeichen auf Hepatitis B oder eine Hepatitis B-Krankengeschichte und deren Reaktivität nicht klar mit Gammaglobulinen in Zusammenhang gebracht werden konnte. Die meisten Proben der Gruppe II waren bei einem einstufigen Anti-HBc-Test schwache positive Proben, zeigten jedoch im allgemeinen eine stärkere Anti-HBc-artige Reaktivität, wenn sie mit einem zweistufigen Verfahren getestet wurden. Die positiven Proben aus Gruppe I waren im allgemeinen bei beiden Testverfahren stark reaktiv. Nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Seren aus dieser Gruppe wurden verdünnt, so daß das Aktivitätsniveau der positiven Proben aus Gruppe II in der Studie simuliert wurde. Sowohl Gruppe I als auch Gruppe II wurden unter den unten ausführlich beschriebenen Bedingungen mit und ohne Reduktionsmittel getestet.

Beispiel 1

Proben von 0,1 ml aus Gruppe I und Gruppe II wurden zusammen mit einer negativen und einer positiven Kontrolle in die Vertiefungen für eine Duplikat-Reaktion gegeben. 10 ul 0,3 % 2-Mercaptoethanol =(2-ME) in H&sub2;O wurden zu jedem der Duplikate hinzugegeben, während 10 ul H&sub2;O zu dem anderen gegeben wurde. 0,1 ml ¹²&sup5;I-markiertes Anti-HBc wurde zu allen Vertiefungen gegeben, worauf sich die Zugabe einer HBcAg-überzogenen Polystyrolperle von 6 mm (1/4 inch) zu allen Vertiefungen anschloß. Die Tafeln wurden leicht geschüttelt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Perlen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und in Teströhrchen übergeführt, um sie in einem Gamm-Scintillationszähler eine Minute lang zu zählen. Die Positivität oder Negativität wurde jeweils berechnet, ebenso wie das Ausmaß (%) der Hemmung für jede Probe aus der negativen Kontrolle sowohl mit und ohne Reduktionsmittel, gemäß der Formel
cpm neg. Kontrolle - cpm Probe/cpm neg. Kontrolle - cpm pos. Kontrolle x 100
(cpm = Counts pro Minute)
Durch diese Berechnung wird eine Probe, die einen Wert gleich oder größer 50 % ergibt, in dem Test als positiv bewertet. Die Wirkung der Zugabe der Reduktionsmittel zu den Proben wurde anhand mehrerer Kriterien bewertet:
a) Vergleichen der Werte der negativen und positiven Kontrolle mit und ohne Reduktionsmittel;
b) Durchführen eines Vergleichs Seite an Seite des Prozentsatzes der Werte für die Hemmung in jeder Probe aus Gruppe I und Gruppe II mit und ohne Reduktionsmittel;
c) Aufzeichnen der Häufigkeit der Werte für den Prozentsatz der Hemmung für jede Gruppe mit und ohne Reduktionsmittel und Vergleichen der Verteilung der Probenwerte in jeder Gruppe mit und ohne Reduktionsmittel.
Die Ergebnisse in den Figuren 1 bis 3 zeigen, daß die Empfindlichkeit und Detektionsfahigkeit des Tests auf echte positive Proben (Gruppe I) durch die Zugabe von Reduktionsmitteln nicht beeinflußt wurden. Tabelle I zeigt, daß die absoluten Werte für die negativen und positiven Kontrollen ebenfalls nicht merklich durch ein weiteres Reduktionsmittel (MBS) beeinflußt wurden. Andererseits wurden die meisten Proben aus der Klasse von Gruppe II, wie in den Figuren 4 und 5 gezeigt, deutlich dahingehend beeinflußt, daß jede Probe das den größten Teil ihrer Fähigkeit verlor, den markierten Antikörper zu hemmen und sich wie eine negative Probe benahm.

Beispiel 2

0, 1 ml der Proben aus Gruppe I und Gruppe II wurde, wie in Beispiel 1, in doppelter Ausführung in die Reaktionsvertiefungen gegeben, jedoch wurde jeweils 0,1 ml einer Salzlösung hinzugegeben, worauf sich die Zugabe von 10 ul 0,5 % NaHSO&sub3; in H&sub2;O zu einem der Duplikate und von 10 ml H&sub2;O zu dem anderen Duplikat anschloß (0,2 % Na&sub2;S&sub2;O&sub5; in H&sub2;O kann durch 0,5 % NaHSO&sub3; substituiert werden). Eine mit HBcAg überzogene Perle wurde zu jeder Vertiefung gegeben. Die Tafeln wurden leicht geschüttelt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen der Perlen wurden sie mit 0,2 ml Anti-HBc IgG, das mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugieft war, eine Stunde lang bei 40ºC inkubiert. Die Perlen wurden wiederum dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und in saubere Reagensgläser übergeführt. Perlen-gebundenes Antikörper-HRP wurde detektiert, indem zu jeder Perle für 30 Minuten eine Lösung aus o-Phenylendiamin (OPD) in Citrat-Phosphat-Puffer gegeben wurde, der 0,02 % Wasserstoffperoxid enthielt, wobei die Reaktion mit H&sub2;SO&sub4; gestoppt und der Absorptionsgrad bei A492 abgelesen wurde. Eine deutliche Verringerung der Farbintensität war ein Zeichen für die Reaktivität einer echten oder falschen Antikörper-positiven Probe. Die Positivität wurde gemäß der folgenden Formel berechnet:
0,4 x NCV + 0,6 x PCV = Grenzwert
(NCV = neg. Mittelwert der Kontrolle; PCV = pos. Mittelwert der Kontrolle)
Die Proben mit Absorptionswerten gleich oder kleiner als der Grenzwert wurden als positiv betrachtet, und die Proben mit Werten größer als der Grenzwert wurden als negativ betrachtet. Darüberhinaus wurde der Grad (%) der Hemmung aus der negativen Kontrolle für jede Probe sowohl mit und ohne Reduktionsmittel gemäß der Formel aus Beispiel 1 berechnet, jedoch indem die Werte für A492 durch CPM ersetzt wurden. Die Wirkung der Zugabe von Reduktionsmittel zu den Proben wurde ebenfalls gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Kriterien bewertet.
Die Ergebnisse sind in den Figuren 6 bis 10 gezeigt, welche ähnliche Ergebnisse zeigen wie Beispiel 1, nämlich daß die Reduktionsmittel wenig oder keine Wirkung auf die Empfindlichkeit des Tests hatten, Figur 6, und daß die Reduktionsmittel die positiven Proben aus Gruppe II selektiv beeinflussen, jedoch nicht die positiven Proben aus Gruppe I (Figuren 7 bis 10). Es wurde gefunden, daß die berechneten Werte aus der Neutralisation für jede Probe bei dem zweistufigen Enzym-Immuntest größer waren als bei dem einstufigen Radioimmuntest, weil der zweistufige Test um mehrerer Verdünnungen empfindlicher ist als das einstufige Verfahren.

Beispiel 3

Ein Mikroteilchen-Chemoluminiszenz-Immuntest auf Anti-HBc wurde folgendermaßen durchgeführt:

A. Herstellung von HBcAg-beschichteten Mikroteilchen

Ein rekombinantes DNA-Hepatitis B-Kernantigen (rHBcAg) wurde mit carboxylierten Polystyrol-Latex-Mikroteilchen (Seragen Diagnostics, Indianapolis, Indiana, 0,188 um) gekuppelt, indem ein Zweistufen-Verfahren verwendet wurde. Zunächst wurden gereinigte polyklonale Human-Anti-HBc-Latexteilchen in einer Konzentration von 2,7 ug/mg in Gegenwart von normalem Humanserum (1,0 ul/mg) unter Verwendung von 1 Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid (EDAC, 43 ug/mg) in 0,015 M MES-Puffer (2-[N-Morpholino]-ethansulfonsäure), pH 4,8, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gekuppelt. Bangs, "Uniform Latex Particles", Seragen Diagnostics, 1984. Die Teilchen, die einen Antikörper- Grundüberzug aufwiesen, wurden dann dreimal in 0,1 M Tris-Puffer, pH 7,2, gewaschen, der 0,9 % NaCl, 0,03 % EDTA und 0,05 % Tween -20 enthielt, indem zentrifugiert (390 000 m/sec² (40 000 x g) 20 Minuten lang) und in 0,1 M Tris- Puffer, pH 7,2, resuspendiert wurde, der 0,9 % NaCl, 0,03 % EDTA und 0,03 % Rinderserum Albumin enthielt. rHBcAg (0,2 ug/mg) wurde dann auf die mit dem unteren Überzug versehenen Teilchen immunologisch adsorbiert, indem über Nacht bei Raumtemperatur eine langsame Rotation durchgeführt wurde. Die Teilchen wurden dreimal wie zuvor gewaschen und durch eine Nadel mit einem Ventil der Größe 25 dispergiert und in 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,2, aufbewahrt, das 0,15 M NaCl, 0,1 % Rinderserum Albumin, 0,01 % Tween -20 und 0,1 % Natriumazid (Mikroteilchen-Verdünnungsmittel) enthielt. Der Prozentsatz der Feststoffe wurde durch die Lichtstreuung bei 500 nm bestimmt. Die beschichteten Teilchen wurden konzentriert aufbewahrt (typischerweise 5-10 % Feststoffe) und vor jedem Test mit Aufbewahrungspuffer auf eine Arbeitskonzentration (0,036 %) verdünnt. Gemäß einem alternativen Verfahren wurde rHBcAg durch das EDAC-Verfahren direkt mit den Mikroteilchen gekuppelt. Das Anti-HBc- Verfahren, bei dem die untere Beschichtung aufgebracht wird, wird bevorzugt.

B. Herstellung von Acridinium-markiertem Anti-HBc

Gereinigtes Acridinium-markiertes Anti-HBc (human) wurde unter Anwendung eines EDAC-Kupplungsverfahrens mit aktivem Ester hergestellt. Kurz gesagt wurde 1 mg B-Alaninacridinium in 100 ul wasserfreiem DMF aufgelöst und durch eine nacheinanderfolgende Zugabe von 50 ul N-Hydroxylsuccinimid (NHS) (5,75 mg/ml) und 50 ul EDAC (19,2 mg/ml) (molares Verhältnis NHS:EDAC = 1:2) aktiviert. Die Reaktion verlief 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Von Protein A gereinigtes Human-Anti-HBc wurde gegen PBS, 0,5 % CHAPS, pH 6,3, über Nacht bei 2-8 ºC dialysiert (3 x). Aktiviertes Acridinium wurde zu dem dialysierten Antikörper (30:1 molarer Überschuß) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Dialyse gegen denselben Puffer wurde die Präparation zentrifugiert. Der Überstand wurde auf einer Beckman TSK 250 HPLC-Säule chromatographiert, die mit demselben Puffer equilibriert worden war. Die einzelnen Fraktionen (1 ml) wurden durch UV-Spektroskopie bei 369 und 280 nm analysiert, um den Einbau von Acridinium (typischerweise 3:1) zu bestimmen. Das Konjugat wurde in konzentrierten Fraktionen (etwa 100 ug/ml) bei 2-8 ºC aufbewahrt und vor jedem Test mit 0,01 M Natriumphosphat verdünnt, das 14,8 g/l EDTA, 0,1 % Natriumazid, 0,4 % Tween -20, 50 % (V:V) normales Kalbserum und 2 % (V:V) normales Humanserum, pH 6,3, (Konjugat-Verdünnungsmittel) enthielt.

C. Herstellung des stabilen wäßrigen Cystein-Reagens

Cystein oxidiert in Wasser zu Cystin, das relativ unlöslich ist und einen weißen Niederschlag bildet. Die Oxidation wird durch Anwesenheit von Metallionen, insbesondere Kupfer, Eisen, und durch einen neutralen oder leicht alkalischen pH- Wert gefördert. Ein Verfahren zur Herstellung relativ stabiler Cysteinlösungen wird unten beschrieben.
Destilliertes Wasser wurde unter Verwendung eines Water-I-Deionisators von Barnstead bis zu einem Endwiderstand von 18 Megaohm deionisiert. Cystein (Sigma Chemical Co., Free Base), EDTA und DTT wurden bis zu Endkonzentrationen von 200, 10 bzw. 1 mM hinzugegeben. Der pH-Wert der Lösung lag zwischen 4,5 und 5,0 und wurde nicht eingestellt. Aliquote der Lösung wurden in geschlossenen Glasröhrchen bei Raumtemperatur und bei 2-8 ºC aufbewahrt.
Die Stabilität wurde aufgrund des Fehlens eines Cystin-Niederschlags bewertet, der sich in wäßrigen Lösungen ohne Chelatisierungsmittel (EDTA) und Reduktionsmittel (DTT) bildete. Nach zwei Wochen war bei beiden Temperaturen kein Niederschlag sichtbar (Tabelle II). Die Stabilität wurde ferner bewertet durch die Wirksamkeit dieses Reagens, die nicht-spezifische Anti-HBc-Aktivität aus zwei Plasmaproben (S9 und S14) im Laufe der Zeit auszuschalten, die in der Anti-HBc- Aktivität ähnlich waren wie die Proben der Gruppe II, die oben beschrieben sind, wie in Tabelle II gezeigt. Eine zweiwöchige Stabilität war für die praktische Verwendung des Reagens bei dem unten beschriebenen Mikroteilchen-Test ausreichend.

D. Mikroteilchen-Test

Duplikate von 100 ml-Proben einschließlich einer Probe von Empfindlichkeitstafel (1,23 Paul Ehrlich Units/ml, Tafel 7), zwei Proben, S9 und S14, die in der Anti- HBc-Reaktivität ähnlich waren wie die oben beschriebenen Proben der Gruppe II und negative und positive Kontrollen wurden auf eine Mikrotiterplatte aufgegeben. Als nächstes wurde 50 ul Cysteinlösung, die 200 mM Cystein, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt, wie oben beschrieben, in doppelter Ausführung hinzugegeben. Wasser wurde als Kontrolle ebenfalls in doppelter Ausführung hinzugegeben. 50 ul der HBcAg-beschichteten Mikroteilchen (0,036 % Feststoffe) wurden zu allen Vertiefungen gegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang in einem 40 ºC warmen Wasserbad inkubiert.
166 ul von jedem Reaktionsgemisch wurden auf einen Durchflußtrichter mit Glasfaserfilter zum Einfangen von Mikroteilchen (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) übergeführt, der zuvor mit 50 ul 0,1 % Tween -20 benetzt worden war. Jede Fangmembran wurde dann zweimal mit 50 ul 0,1 % Tween -20 gewaschen. 20 ul Acridinium-markiertes Anti-HBc (375 ng/ml) wurden auf die Oberfläche einer jeden Fangmembran gegeben und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang inkubiert. Die Fangmembranen wurden dann zweimal mit 100 ul und einmal mit 50 ul 0,1 % Tween -20 gewaschen. Die Membranen wurden dann auf ein Chemoluminiszenz-Lesegerät übergeführt, wo etwa 100 ul einer Trigger-Lösung an jede Membran abgegeben wurden, die 0,3 % H&sub2;O&sub2; in 0,25 N NaOH enthielt. Die Menge an Licht, die durch das Acridinium-markierte Reagens erzeugt wurde, das an die Mikroteilchen gebunden war, wurde bestimmt. Sie ist umgekehrt proportional zu der Menge an Anti-HBc, die in der Probe vorhanden ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt. Die Testempfindlichkeit, bestimmt durch den Prozentsatz der Hemmung (% I) auf Tafel 7, wurde in Gegenwart des Cystein-Reagens leicht verbessert. In Gegenwart von Cystein kam es bei der negativen Kontrolle zu einem 10-20%igen Signalverlust. Der Typ von Aktivität (Störfaktor), der bei den Proben des Typs von Gruppe II, S9 und S14, gefunden worden war, wurde ausgeschaltet, wenn der Test in Gegenwart von Cystein durchgeführt wurde.

Beispiel 4

Plasmaproben, die mit 52, 71, 166 und 277 bezeichnet wurden, Tafel 7 und positive und negative Kontrollen wurden gemäß dem Mikroteilchen-Testverfahren von Beispiel 3 getestet, außer daß 10 ul frisch hergestelltes 0,75 M Cystein (Sigma, freie Base) anstelle der Cysteinlösung, die EDTA und DTT enthielt, verwendet wurden. Die Proben wurden sowohl mit und ohne Cystein für den Test verwendet.
Wie aus Tabelle IV ersichtlich, ist Probe 277 eine echte negative Probe. Die Proben 71 und 166 sind positive Proben an der Grenze zwischen echt und falsch, die in ihrer Anti-HBc-Aktivität ähnlich sind wie die Proben aus Gruppe II, außer daß diese durch Behandeln mit dem Reduktionsmittel Cystein nicht beeinträchtigt werden, was anzeigt, daß diese tatsächlich Proben an der Grenze oder Unterscheidungsproben sind. Die Proben 52 uns 189 sind Proben an der Grenze, die ebenfalls ähnlich sind wie die Proben aus Gruppe II, jedoch erwiesen sich diese Proben in Gegenwart des Reduktionsmittels als negativ. Jede Probe wurde auch mit und ohne 26,3 ul von einer Empfindlichkeitstafel (Tafel 5) getestet, entsprechend 1,23 PEIU/ml, um die Wirkung zu testen, wenn diese Proben mit einer echten positiven Anti-HBc-Probe mit und ohne Cystein versetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt. Tafel 7 produzierte eine Hemmung von 71,8 % bzw. 80,7 % ohne bzw. mit Cystein. Die negative Kontrolle, die mit einer Menge von Tafel 5 versetzt wurde, die mit der von Tafel 7 äquivalent war, ergab 73,7 % bzw. 80,8 % Hemmung ohne bzw. mit Cystein. Der durchschnittliche Prozentsatz der Hemmung in nicht den versetzten Plasmaproben fiel bei Zugabe von Cystein von 31,8 % auf 21,0 %. Der durchschnittliche Prozentsatz der Hemmung der Plasmaproben, die mit dem Äquivalent von Tafel 7 versetzt worden waren, betrug 67,1 % bzw. 71,5 % ohne bzw. mit Cystein.

Beispiel 5

Die Proben von der Empfindlichkeitstafel, die als positiv auf Anti-HBc bekannt sind (Tafeln 5, 6, 7, 8 und 9), wurden gemäß dem Mikroteilchen-Testverfahren aus Beispiel 3 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Es ergab sich keine Auswirkung auf die Testempfindlichkeit, wenn das Cystein-Reagens verwendet wurde.

Beispiel 6

Die Plasmaproben, die mit 25, 31, 76, 91, 177 und 189 bezeichnet waren, wurden mit einem käuflich erhältlichen Anti-HBc-Kit (Corab , Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) mit und ohne Zugabe von 10 ul eines Reduktionsmittels, 0,5 M Natriummetabisulfit, getestet. Ebenso wie in Beispiel 4 wurden die Proben mit und ohne Zugabe von 26,3 ul einer Anti-HBc-positiven Probe (Tafel 5) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt. Wie aus der Tabelle ersichtlich, ist Probe 25 eine echte negative Probe. Die Proben 31 und 91 sind Unterscheidungsproben, die sich bei Zugabe des Reduktionsmittels als negativ bestätigten. Probe 177 reagiert nicht auf die Behandlung mit MBS, was anzeigte, daß diese Probe eine negative Probe ist, die nicht an der Grenze liegt. Wie aus Tabelle VI ersichtlich, wurden alle Anti-HBc-positiven Proben, einschließlich Tafel 7, und den Proben, die mit Tafel 5 versetzt worden waren, nicht durch die Zugabe von MBS beeinflußt.

Beispiel 7

56 Plasmaproben mit einer Anti-HBc-Reaktivität ähnlich wie in Gruppe II wurden gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren getestet. Bei diesen Proben wurde festgestellt, daß sie bei einem Test mit käuflich erhältlichen Anti-HBc-Tests (Corzyme und Corab , Abbott Laboratories) und dem Mikroteilchen-Testverfahren, das in Beispiel 3 oben beschrieben worden ist, ohne Reduktionsmittel unterschiedliche Ergebnisse aufwiesen. Die Daten sind in Figur 11 graphisch abgebildet.

Beispiel 8

Die in Beispiel 7 beschriebenen Plasmaproben wurden gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Mikroteilchen-Testverfahren getestet. Die Daten sind graphisch in Figur 12 abgebildet. Die Korrelation zwischen den Daten aus Beispiel 7 und diesem Beispiel 8 ohne Metabisulfit bzw. Cystein sind in Figur 13 gezeigt. Die Korrelation zwischen den Daten aus Beispiel 7 und diesem Beispiel 8 mit Metabisulfit bzw. Cystein sind in Figur 14 gezeigt.

Beispiel 9

Die Absorption und Anti-HBc-Aktivität einer Anti-HBc-positiven Probe (Probe 209) sind in Figur 15 abgebildet. Diese Probe zeigte eine Hemmung von 86,3 % bzw. 85,6 % bei einem Test mit dem Corab -Test mit bzw. ohne Metabisulfit. Kurz gesagt wurden 2 ml der recalcifizierten Probe 209 auf eine Sephacryl S-300-Säule (2,5 x 50 cm) aufgegeben, die mit PBS äquilibriert worden war. Fraktionen von 2,5 ml wurden bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/Std. gesammelt. Die Fraktionen wurden unter Anwendung des Mikroteilchen-Tests aus Beispiel 3 getestet, außer daß eine etwa 5fache Zunahme in der Empfindlichkeit erzeugt wurde, indem eine verlängerte Inkubationszeit angewendet und die Menge an Anti-HBc-Konjugat verringert wurde. Wie in Figur 15 gezeigt, wurden ohne Reduktionsmittel zwei Peaks für die Aktivität detektiert. Der erste inhibitorische Peak wurde nicht detektiert, wenn der Test mit Cystein durchgeführt wurde. Der zweite und größere inhibitorische Peak, der mit dem Peak des IgG-Proteins coeluierte, blieb durch die Cystein-Behandlung unbeeinflußt. Die mit Immunglobulin G in Zusammenhang stehende Anti-HBc-Aktivität ist für eine nicht akute Hepatitis B-Infektion spezifisch.

Beispiel 10

3 ml einer positiven Probe an der Grenze zwischen echt und falsch (Probe 9) wurden gemäß dem Verfahren aus Beispiel 9 getestet. Die Probe zeigte eine Hemmung von 56,8 % bzw. 5,2 % bei einem Test mit dem Corab -Test ohne bzw. mit Metabisulfit. Die Absorption und das Elutionsprofil der Anti-HBc-Aktivität von Probe 9 sind in Figur 16 dargestellt. In Abwesenheit von Reduktionsmittel war ein einzelner inhibitorischer Peak in der Nähe des Totvolumens der Säule zu sehen. Dieser Peak wurde nicht detektiert, wenn der Test mit Cystein durchgeführt wurde und war deutlich von dem Peak des IgG-Proteins aufgelöst. Es wird nicht angenommen, daß diese nicht-IgG- Reaktivität ein Ergebnis einer Hepatitis B-Infektion ist und ist darum nicht spezifisch.
Der erfindungsgemäße verbesserte Anti-HBc-Test hat viele Vorteile. Diese schließen ein die Verringerung der Anzahl der reaktiven Anti-HBc-positiven Proben an der Grenze zwischen echt und falsch, einschließlich der Verringerung der Anzahl der Proben, die nur Anti-HBc-positiv sind, wenn kein anderes Hepatitis-Anzeichen oder eine andere Krankheitsgeschichte vorliegen. Durch die Verringerung der Anzahl der Proben an der Grenze oder der falschen positiven Proben bei der Blutspender- Überprüfung wird die Blutversorgung der Nation verbessert und zukünftige Spender werden nicht unnötigerweise ausgeschlossen. TABELLE 1: Wirkung von Natriummetabisulfit (MBS, 0,5 %) auf die Hemmwerte von 10 niedrigen positiven Proben aus Gruppe I (echt Anti-HBc), getestet mit CORAB . Prozent Hemmung mit CORAB Probe kein MBS Durchschnitt, PK (cpm) Durchschnitt, NK(cpm) TABELLE II: Stabilität des Cystein-Reagens bei Raumtemperatur (RT) und bei 2-8 ºC Prozent Hemmung Tag Tafel 7 Probe Kontrolle ohne TABELLE III TESTLÖSUNG WASSER (KONTROLLE) 200 mM CYSTEIN (COUNTS) negative Kontrolle positive Kontrolle Tafel 7 Plasma % CV = PROZENT SCHWANKUNGSKOEFFIZIENT TABELLE IV DETEKTIONSEXPERIMENT KONTROLLE + CYSTEIN * VERSETZT MIT 26,3 uL TAFEL 5 = 7 PEIU/ml (TAFEL 7) TABELLE V KONTROLLE + CYSTEIN durchschnittl. Zählrate negative Kontrolle positive Kontrolle Tafel TABELLE VI DETEKTIONSEXPERIMENT CORAB CORAB + MBS TAFEL *VERSETZT MIT 26,3 ul TAFEL 5 = 1,23 PEIU/ml (TAFEL 7)

Claims

1. Immuntest zur Detektion von Anti-HBc in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reduktionsmittel vor oder während des Immuntests zu der biologischen Probe gegeben wird.

2. Immuntest nach Anspruch 1, umfassend die Stufen:

a) Inkubieren einer festen Phase, die mit MBcAg beschichtet ist, mit einer biologischen Probe, um das genannte HBcAg mit irgendeinem Anti-HBc umzusetzen, das in der genannten biologischen Probe vorhanden sein kann;

b) Inkubieren der genannten festen Phase mit markiertem Anti-HBc, um das genannte HBcAg mit dem genannten markierten Anti-HBc umzusetzen; und

c) Detektieren der Menge des markierten, an das HBcAg auf der festen Phase gebundenen Anti-HBc;

worin ein Reduktionsmiffel entweder vor Stufe (a) oder Stufe (b) zu der Probe gegeben wird.

3. Immuntest nach Anspruch 1, worin das Reduktionsmittel eine Sulfhydryl- Verbindung ist, ausgewählt aus 2-Mercaptoethanol-, Dithiothreitol-, Dithioerythrit-, Cystein- und Bislufitlösungen.

4. Immuntest nach Anspruch 2, bei dem das Reduktionsmittel vor Stufe (a) zugegeben wird und die feste Phase aus HBcAg-beschichteten Latex-Microteilchen besteht, die vor der Stufe (b) in einen Microteilchenfänger/Microteilchendurchflußfilter übergeführt und gewaschen werden.

5. Immuntest nach Anspruch 4, bei dem das Reduktionsmittel eine Sulfhydryl- Verbindung ist, ausgewählt aus 2-Mercaptoethanol-, Dithiothreitol-, Dithioerythrit-, Cystein- und Bisulfitlösungen.

6. Immuntest nach Anspruch 5, bei dem das Reduktionsmittel Cystein ist.

7. Immuntest nach Anspruch 4, bei dem die Markierung Acridin ist.

8. Immuntest nach Anspruch 1, bei dem falsche positive

Untersuchungsergebnisse im wesentlichen eliminiert werden durch Zugabe eines Sulfhydryl-Reduktionsmittels zu der biologischen Probe vor oder während des Tests.