CN1104773A - 使用烷基化剂免疫检测样品中的分析物 - Google Patents

Abstract

提供了改良的免疫检测方法和药盒，包括样品预 处理方法和利用烷基化剂的药盒，该烷基化剂可修饰 样品中的抗体使之不能干扰分析物检测。在进行免 疫检测之前，失活烷基化剂以使其不修饰用于免疫检 测中的抗体试剂。

Description

本发明涉及检测病人样品中分析物的存在或其量的改良的免疫检测法。具体地说，本发明涉及在改良的免疫检测方法中使用中性或碱性pH烷基化剂检测含有内源性抗体之样品中的分析物。

过去二十年里，已发展了用于检测病人样品中是否存在特定分析物的免疫化学检测方法。在一种典型的免疫检测法中，用能够产生可检测信号的化合物标记检测试剂，并使该试剂与预期含有特定分析物的病人样品结合。被标记的检测试剂将以与样品中分析物的量相关的量结合于分析物上。

已发现内源性抗分析物抗体和抗体与循环于血清样品中之分析物形成的免疫复合物可干扰分析物的免疫检测。美国专利4，703，001号描述了在免疫检测血清样品中酸稳定性分析物时解离免疫复合物和变性抗分析物抗体的预处理方法，该方法包括使血清样品在酸性pH下与pH依赖性离液序列高的离子接触。同样，P.Nishanian等人在J.Infect.Dis.162∶21-28（1990）中描述了一种用于解离分析物-抗HIV抗体免疫复合物和变性抗HIV抗体的酸水解血清样品预处理方法。但为了实现抗HIV抗体的完全变性，须用0.5N HCl溶液于37℃将试验血清处理60分钟。

虽然如上所述用酸水解法处理蛋白质或肽抗原可提供准确的结果，但总是期望能更快地获得这些结果并有更高的敏感性。再者，某些分析物不能经受如此强烈的酸水解。例如，来自某些微生物脂多糖（LPS）抗原的2-酮-3-脱氧辛酮糖酸（KDO）糖将因如此处理而被水解，从而破坏了它们的抗原活性。因此，将期望有一种免疫检测方法，其中存在于病人样品中的内源性抗体可在大于7.0的pH且最好在碱性pH下不可逆地变性，但又不影响分析物的抗原性。

预处理样品以修饰内源性抗体，进而减小或防止抗体对分析物检测的干扰，即可明显地改善分析病人样品中分析物之免疫检测法的效能。如上文所提到的，这些抗体和免疫复合物可干扰许多免疫检测法的分析物特异性结合步骤。本发明的样品预处理步骤利用了在大于7.0的pH，最好大于8.0的碱性pH下有活性的烷基化剂。本发明的烷基化剂在中性和碱性pH下有活性并且不影响分析物的抗原性。可望烷基化剂作用于抗体的赖氨酸、精氨酸或伯胺基团以修饰抗体上的这些基团，从而防止抗体干扰分析物检测，所说的烷基化剂包括但不限于戊二醛、邻位甲基异脲、甲醛、丁二酮、环已二酮和S-乙酰-巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺。

在进行免疫检测之前，失活所说的烷基化剂，以使其不影响用于免疫检测的试剂。失活烷基化剂的方法根据所使用的烷基化剂而定。适用于本发明的一种类型的烷基化剂是在碱性pH下有活性而在中性pH下无活性的烷基化剂。这种类型的烷基化剂特别适用于以这样一种形式检测病人样品中存在的分析物，即需用某种碱性去污剂溶液预处理样品以提取分析物。

在一个实施方案中，于免疫检测衣原体LPS，或相似的抗原之前，用碱性去污剂进行提取，然后用烷基化剂预处理样品。应在中和样品溶液之前加入烷基化剂。在一优选的实施方案中，于碱提取后加入只在碱性pH下有活性的烷基化剂，并与样品溶液保温足够长时间，使内源性抗体受到修饰，从而使之在免疫检测期间不能干扰对分析物的检测。必须选择适当的烷基化剂，以使其与用来提取分析物的其他试剂相容。保温后，经中和样品溶液而失活烷基化剂并完成免疫检测。

在一个实施方案中，待检分析物是对酸敏感的。为本发明之目的，“酸敏感的”是指当在pH小于3.0的溶液中保温时分析物失去其抗原活性。为本申请之目的，酸敏感性分析物包括但不只限于源自砂眼衣原体（Chlamydia trachomatis），鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci），鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），淋病奈瑟氏球菌（Neisseria gonorrhoeae）和大肠杆菌（Escherichia coli）的具有KDO部分的的LPS抗原。

在一特别优选的实施方案中，免疫检测LPS抗原并在抗原提取步骤后，合并加入烷基化剂和二硫赤藓糖醇（DTT）。DTT是一种粘液溶解剂及用于结合半胱氨酸的化学修饰剂。结合使用DTT和烷基化剂可提高信号的长时间稳定性并增加检测法的敏感性。

本发明另一实施方案包括用于检测含干扰分析物检测之内源性抗体的病人样品中分析物的免疫检测药盒，该药盒包含对样品进行免疫检测以检测分析物的免疫检测试剂、能够在小于7.0的pH下使抗体上的基团烷基化从而防止内源性抗体干扰分析物检测的烷基化剂。该药盒进一步包含能够失活烷基化剂以使之不再修饰抗体的失活剂。在一个实施方案中，其中烷基化剂只在碱性pH有活性，且失活剂是中和剂。

图1图解显示本发明的预处理方法对提取后分析物检测的影响。

图2图解显示在没有使用本发明预处理方法情况下，提取后各不同时间对分析物检测的干扰。

图3图解显示本发明的预处理方法在提取后不同时间对分析物检测的影响。

图4显示Western印迹条纹，借以证明本发明的烷基化剂对病人样品内抗衣原体抗体结合分析物之能力的影响。

本发明的试剂和方法可适用于检测以常规方法从眼、后鼻孔、子宫颈、***、尿道、直肠、咽喉、血液、血清、血浆、尿等材料中得到的病人样品。试剂和预处理方法可用于存在干扰分析物检测之内源性抗体的免疫检测法，但特别适用于在低pH下不稳定的分析物。

可使用本发明的预处理方法提高许多不同的免疫检测法的效能。如放射免疫检测法、利用ELISA程序的免疫检测法和利用各种标记物如荧光和化学发光标记物的免疫检测法。一种这样的免疫检测法包括使提取的中和的样品溶液与抗固定于固相如微量滴定板孔、球、颗粒、管等上面之分析物的单克隆抗体接触，保温，加入以与分析物量相关的结合于固相上的标记的多克隆抗体，保温并检测标记物等步骤。

用于特定免疫检测法的烷基化剂的量和浓度将依据样品类型即血清或尿生殖道拭子、其他免疫检测试剂的浓度、分析物的类型以及进行预处理的温度等因素而改变。

在检测是否存在微生物的某些免疫检测法中，被检测的分析物是酸敏感性脂多糖（LPS），如衣原体抗原。在检测这些衣原体抗原和相似抗原中，一般用包括碱金属或碱土金属离子的去污剂溶液预处理病人样品。在提取步骤中，部分变性或扰乱内源性抗分析物抗体。但在检测进行中，一旦样品溶液被中和，内源性抗体即复性并在免疫检测中干扰抗体试剂与分析物的结合，而使之不能识别分析物。

虽然我们并不希望在理论上限制自己，但我们相信烷基化剂与已被部分变性或扰乱的抗体上的基团反应，而阻止抗体在免疫检测期间变性。

一种类型的特别是用于免疫检测LPS的烷基化剂是只在碱性如大于8.0的pH条件下有活性的，而在中性或酸性pH条件下是无活性的烷基化剂。这种类型的烷基化剂包括但不只限于戊二醛、甲醛、邻位甲基异脲、丁二酮和环已二酮。因为在中性pH下进行典型的免疫检测时它们不会干扰检测法的效能，所以这些试剂是特别优选的。

本发明的另一种类型的烷基化剂是在中性pH（pH7.0-8.0）有活性的，并且可因加入带有胺基团如Tris等叔胺或甘氨酸等伯胺的第二种试剂而失活。这种类型的烷基化剂包括但不只限于S-乙酰-巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺。

参见下列实施例将会更容易地了解本发明的方法，这些实施例是举例说明而不是限制本发明。

实施例1-衣原体免疫检测法

在完成预处理方法和免疫检测法中，使用Kallestad Pathfinder

衣原体微量滴定板药盒。Kallestad Pathfinder^R衣原体微量滴定板药盒包括：

·样品处理溶液A（STSA），其中包含0.1N NaOH，5mM EDTA，50mg/ml茜素黄（2-羟基-5-[（4-硝基苯基）偶氮]苯甲酸，一种在低于10.2的中性pH下呈黄色并在pH12时呈红色的染料）和0.05% 3[（3-胆酰氨基丙基）-二甲基氨-复]-1-丙烷磺酸盐（CHAPS）。

·样品处理溶液B（STS B），其包含1.0N HCl、2M Tris碱、3%H₂O₂。

在免疫检测之前，按下述步骤完成提取方法，包括向0.1ml样品内加入1.0ml STS A，保温10分钟并涡旋30秒钟。为了确定本发明烷基化剂的效力，加入0.1ml烷基化剂或缓冲液，涡旋10秒钟，然后保温10分钟。在进行免疫检测之前，加入0.1ml STS B并将样品溶液涡旋10秒钟。

提取后，按下述方法使用Kallestad Pathfinder

微量滴定板药盒完成免疫检测法。

将100μl等分的提取的样品加到已结合了抗衣原体抗体之单克隆抗体的Pathfiner^R微量滴定板各小孔内。于26℃使用STATFAX振荡保温器（Awareness Technologies）将平板保温30分钟。向各小孔内加入50μl多克隆兔抗支原体抗体试剂并将平板于26℃在STAT-FAX2200保温器中保温30分钟。

然后向各小孔内加入50μl辣根过氧化物酶结合的羊抗兔抗体并于26℃在STAT-FAX2200保温器中将平板保温30分钟。

然后在LP-35微量滴定板洗涤器（Diagnostics Pasteur，France）上将平板各小孔洗5次，向各孔内加入100μl溶于缓冲液的邻苯二胺并在暗处将平板保温30分钟。加入100μl含4NH₂SO₄的终止溶液并在LP-400微量滴定板读出器（Diagnostic Pasteur，France）上读出于OD492/620处的吸光率。

实施例2-酸敏感性分析物

如上所述，该预处理方法特别适用于酸敏感性分析物如脂多糖。我们已证明，当用酸而不是用碱处理样品时，LPS的抗原性受到影响。

酸处理：用30μl 4MH₃PO₄（pH2.3）处理1ml加在STSA：STS B（10∶1）中的衣原体抗原，使反应进行90分钟，然后用70μl 2NNaOH（pH8.1）中和。

碱处理：用70μl 2N NaOH（pH12.5）处理1ml加在STSA：STSB（10∶1）中的衣原体抗原，使反应进行90分钟，然后用30μl 4M H₃PO₃（pH2.3）中和。

酸和碱处理的结果示于表1中。

实施例3-烷基化剂

用血清阳性血浆（血浆中有人抗衣原体抗体）和马抗衣原体模型证明各种烷基化剂在修饰内源性抗体和增强EIA信号中的效力。将人抗衣原体血清阳性血浆或免疫亲和性纯化的马抗衣原体抗体与衣原体砂眼初级小体（血清变异型L2，终浓度通常为1.5×10⁶EB′s/ml）混合并按实施例1所述方法提取。

与只用缓冲液处理的样品比较，以估测各烷基化剂的效力。如表2所示，当加入中和剂（在STS B中）使烷基化剂失活后，可以看出，与只用缓冲液处理组相比，用烷基化剂戊二醛和环已二酮处理可在0时立即增强分析物检测信号。

表2所示的结果证明，单用碱提取而不用烷基化剂将扰乱抗衣原体抗体，使之不太能够干扰分析物检测。但过一定时间后，在单用缓冲液处理的样品中碱扰乱的抗体复性，并通过干扰抗原俘获或Pathfinder形式的检测而有效地中和了EIA信号。

在提取后0小时（表2），缓冲液处理的样品OD值，比在1%戊二醛存在下，加和不加DTT提取的样品OD值，分别低20%和22%。在提取后120小时，与用1%戊二醛和50mM环已二酮（后者稍降低些）提取相比，只于缓冲液存在下提取的样品信号降低了37%。将25mMDTT与戊二醛和环已二酮合用，可使0时间测得的信号稍有增强。

实施例4-戊二醛

将衣原体初级小体制备物与不同浓度的，在用去污剂提取后用1%戊二醛/25mM DTT或缓冲液预处理的马抗衣原体抗体混合，并按上文所述EIA程序进行检测。如图1中所示，用烷基化剂/交联剂戊二醛预处理的样品显示信号有明显增加;除0.2μg/ml这一浓度外（该浓度达到了中和活性的极限），在所有马抗衣原体抗体浓度下，均较提取后0时间测得的缓冲液处理的样品的信号成比例增加。在不加戊二醛情况下，证明人抗衣原体（PI）抗体几乎等同于1.6μg/ml马抗衣原体抗体的中和效果。

在提取后的几个时间点估测马或人抗衣原体抗体对EIA信号产生的影响。从图2所示的OD值降低情况可以看出，没有戊二醛时，检测法的敏感性在提取后0小时比提取后24或48小时大得多。当存在戊二醛/DTT时，如图3中所示，提取后不同时间差异并不显著，而且衣原体抗原的总体检测没有被马抗衣原体阻断。

进一步用Western印迹免疫检测法证明尿生殖道临床样品中人抗衣原体（HuXC）抗体的存在，和用戊二醛/DTT预处理样品的效果。在有或没有戊二醛/DTT时按上述方法预处理临床样品，并监测EIA信号的丢失作为HuXC存在的指征。如图4中所示，那些显示最大EIA信号丢失的样品具有免疫反应性HuX衣原体（MOMP，主要外膜蛋白质）。在相对的含戊二醛的样品中，则未测到免疫反应性人抗MOMP（HuxMOMP）。

实施例5-在碱性pH下用烷基化剂预处理

表3显示当使用不同浓度的各种烷基化剂时分析物检测的结果。向血清阳性血浆中加入0.1ml衣原体抗原并与STBA混合，涡旋10秒钟，然后保温10分钟。加入0.1ml烷基化剂或缓冲液，将所得溶液保温10秒再保温10分钟。进行免疫检测之前，加入0.1mlSTS B并将样品溶液涡旋10秒钟。从表3中可以看出，降低烷基化剂的浓度在排除内源性抗体干扰中并不如提取后48小时那样有效，但比在提取后0小时和24小时只使用缓冲液更有效。

除了在碱性pH下用戊二醛预处理外，向提取后的样品溶液（在STS A中）内加入50mM环已二酮（CHD）和50mM邻位甲基异脲（OMIU），并按实施例1所述进行免疫检测。两种试剂均在一定时间内改善了免疫检测的结果，并且合用烷基化剂和DTT时进一步提高免疫检测法的效能。

这些在提取后5天内实验的结果显示于下列表4中。

实施例6-在中性pH下用烷基化剂预处理

虽然在对LPS的免疫检测中优选在碱性pH有活性的烷基化剂，但也可使用在中性pH有活性的烷基化剂。我们混合了2mlEB（1∶16，3.12×10⁶）和40μl马抗衣原体（100μg/ml，终浓度2μg/ml）并使用了0.1ml等分的EB-抗体混合物作为样品。将等分样品加到8个试管内并用1ml STS A提取，涡动旋转并在室温下保温10分钟。加入100μlHCl/磷酸盐缓冲液，预调整其pH，以使其与样品-STS A溶液合并后pH为8.0。加入50mMS-乙酰巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺（SATA），并将溶液在室温下保温60分钟。然后加入0.1ml 1M Tris（pH8）（其为一种叔胺）以失活烷基化剂。

使用实施例1中所述的衣原体免疫检测方法检测样品。单加缓冲液所得472/620处OD值只有0.365±0.21。在中性pH下用SATA处理样品，则改善了免疫检测的结果：2.26±0.75，这一结果接近于没有马抗衣原体时的EB样品OD值。

虽然上文已描述了本发明的优选方案，但应明确的是，可在不背离本发明的精神和待批权利要求范围的情况下进行各种改变和改动。

Claims (14)

1、用来检测含有干扰分析物检测之抗体的病人样品内分析物的改良的免疫检测法，所说的分析物是有抗原性的，该方法包括以下步骤：

a)使样品与能够在小于7.0的pH下使抗分析物抗体上的基团烷基化的烷基化剂接触，以修饰抗体使之不能干扰分析物检测，其中烷基化剂是并不影响分析物之抗原性的试剂；

b)失活烷基化剂，并在其后

c)对样品进行免疫检测，以在被修饰的抗体存在下检测分析物。

2、权利要求1的改良的免疫检测法，其中分析物是酸敏感的。

3、权利要求2的改良的免疫检测法，其中分析物是脂多糖抗原。

4、权利要求3的改良的免疫检测法，其中脂多糖抗原是得自一组包括砂眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmomella typhimurium）、淋病奈瑟氏球菌（Neisseria gonorrhoeae）和大肠杆菌（Escherichia coli）的微生物。

5、权利要求1的改良的免疫检测法，其中烷基化剂是戊二醛、甲醛、邻位甲基异脲、环已二酮、丁二酮或S-乙酰巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺。

6、权利要求1的改良的免疫检测法，其中烷基化剂还能够交联抗体上的基团。

7、权利要求1的改良的免疫检测法，其中烷基化剂在碱性pH下被活性并在中性pH下被失活，且其中失活步骤包括中和样品的pH。

8、权利要求3的改良的免疫检测法，进一步包括使样品与适当的提取去污剂在碱性pH下接触的步骤，以在样品与烷基化剂接触之前或同时释放出脂多糖抗原。

9、检测含有干扰分析物检测之内源性抗体的病人样品中分析物的免疫检测药盒，该免疫检测药盒包含对须检测分析物的样品进行免疫检测的免疫检测试剂、能够在pH不小于7.0条件下使抗体上的基团烷基化以修饰内源性抗体使之不能与分析物结合的烷基化剂，以及失活烷基化剂的失活剂，免疫检测试剂可在失活剂和失活的烷基化剂存在下工作。

10、权利要求9的免疫检测药盒，其中烷基化剂是戊二醛、甲醛、邻位甲基异脲、甘油醛或S-乙酰巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺。

11、权利要求9的免疫检测药盒，其中烷基化剂在碱性pH下被活化并在中性pH下被失活，且其中失活剂是中和剂。

12、权利要求11的免疫检测药盒，其进一步包含从样品中提取分析物的去污剂和碱土金属试剂，且其中分析物是脂多糖抗原。

13、检测含有干扰分析物检测之抗体的病人样品内酸敏感性分析物的改良的免疫检测法，其中分析物是有抗原性的，该方法包括下述步骤：

a）经碱提取处理样品以释放分析物后，使样品与能够在pH不小于7.0条件下使抗分析物抗体上的基团烷基化的烷基化剂接触以修饰抗体使之不能干扰分析检测，其中烷基化剂是不影响分析物之抗原性的烷基化剂;

b）失活烷基化剂，然后

c）对样品进行免疫检测，以在被修饰的抗体存在下检测分析物。

14、检测含有干扰分析物检测之抗体的病人样品内脂多糖抗原的改良免疫检测法，其中分析物是有抗原性的，该方法包括下述步骤：

a）用碱性去污剂提取样品以释放出脂多糖抗原后，使样品与能够在不小于7.0的pH下使抗分析物抗体上的基团烷基化的烷基化剂接触，以修饰抗体使之不能干扰分析物检测，其中烷基化剂是不影响脂多糖抗原之抗原性的烷基化剂;

b）失活烷基化剂，然后

c）对样品进行免疫检测，以在被修饰的抗体存在下检测脂多糖抗原。

Images