FR2705463A1 - Essai immunologique amélioré et nécessaire d'essai immunologique par sa mise en Óoeuvre. - Google Patents
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Abstract
La présente invention est relative à un essai immunologique amélioré, destiné à l'analyse d'une substance à analyser dans un échantillon, provenant d'un patient, contenant des anticorps qui perturbent la détection de la substance à analyser, la substance à analyser étant antigénique; caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: a) à mettre en contact l'échantillon avec un agent alkylant capable d'alkyler des groupes présents sur les anticorps anti-substance à analyser, à un pH non inférieur à 7,0, afin de modifier les anticorps et de les rendre incapables de perturber la détection de substances à analyser, l'agent alkylant étant un agent qui ne modifie pas le pouvoir antigénique de la substance à analyser; b) à inactiver l'agent alkylant; et c) à effectuer ensuite un essai immunologique de l'échantillon, afin d'analyser la substance à analyser, en présence de l'anticorps modifié.
Description
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La présente invention est relative à un essai immunologique amélioré pour détecter la présence ou évaluer la quantité d'une substance à analyser dans un échantillon provenant d'un patient. La présente invention est plus particulièrement relative à l'utilisation d'agents alkylants à un pH neutre ou basique, dans un procédé d'essai immunologique amélioré pour détecter des substances à analyser dans
un échantillon contenant des anticorps endogènes.
Au cours des deux dernières décades, on a élaboré des procédés d'essai immunologique, ou d'essai immunocytochimique, qui sont utiles pour déterminer si une substance à analyser particulière est présente dans un échantillon provenant d'un patient. Dans un essai immunologique caractéristique, un réactif d'essai est marqué avec un composé capable de produire un signal détectable, et ce réactif est associé avec un échantillon provenant d'un patient suspecté de contenir une substance à analyser particulière. Le réactif d'essai marqué, se lie à la substance à analyser selon une quantité dépendant de la quantité de la substance à analyser dans l'échantillon.
On a trouvé que des anticorps endogènes anti-
substance à analyser et des complexes immuns d'anticorps et de substance à analyser circulant dans des échantillons de sérum, perturbaient des essais
immunologiques de détection de substance à analyser.
Le brevet US-A-4 703 001, décrit un procédé de pré-
traitement de dissociation de complexes immuns et de dénaturation d'anticorps anti-substance à analyser, pour des essais immunologiques de substances à analyser stables en milieu acide, dans un échantillon de sérum, selon lequel on met en contact l'échantillon de sérum avec un chaotrope dépendant du
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pH, à un pH acide. De manière analogue, P. Nishanian et al. dans J. Infect. Dis., 162:21-28 (1990) décrivent un procédé de pré-traitement d' échantillon de sérum par hydrolyse acide qui a été employé pour dissocier des complexes immuns de substance à
analyser et d'anticorps anti-virus de l'immuno-
déficience humaine (VIH), et dénaturer des anticorps anti-VIH. Afin d'obtenir la dénaturation complète des anticorps anti-VIH, le sérum d'essai a toutefois été traité à 37 C pendant 60 minutes avec une solution d'HCl 0,5 N. Bien que l'hydrolyse acide, telle qu'elle est effectuée pour des antigènes protéiques ou peptidiques ainsi que cela a été décrit ci-dessus, puisse procurer des résultats précis, il est toujours souhaitable d'obtenir ces résultats plus rapidement et avec une sensibilité accrue. En outre, une telle hydrolyse acide rigoureuse, ne serait pas acceptable avec certaines substances à analyser. Les sucres dérivés d'acide 2-céto-3-désoxyoctulosonique (KDO) d'antigènes lipopolysaccharidiques (LPS) provenant de certains micro-organismes, seraient hydrolysés par un tel traitement, en détruisant ainsi leur activité antigénique. Il serait en conséquence souhaitable de disposer d'un procédé d'essai immunologique dans lequel des anticorps endogènes présents dans un échantillon provenant d'un patient, puissent être dénaturés de manière irréversible à un pH supérieur à 7,0, et de manière souhaitable à un pH basique, sans modifier le pouvoir antigénique de la substance à analyser. L'efficacité des essais immunologiques pour l'analyse de substances à analyser dans un échantillon provenant d'un patient, peut être nettement améliorée à l'aide du pré-traitement de
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l'échantillon destiné à modifier des anticorps endogènes afin de réduire ou d'empêcher la perturbation de la détection de la substance à analyser par les anticorps. Ainsi que cela a été mentionné ci-dessus, ces anticorps et ces complexes immuns, peuvent perturber les étapes de liaison spécifique d'une substance à analyser dans de
nombreux essais immunologiques. L'étape de pré-
traitement d'échantillon de la présente invention met en oeuvre des agents alkylants qui sont actifs à un pH supérieur à 7,0 et de préférence à un pH basique supérieur à 8,0. Les agents alkylants de la présente invention sont actifs à un pH neutre ou basique, et ils ne modifient pas le pouvoir antigénique de la substance à analyser. De manière souhaitable, l'agent alkylant agit sur la lysine, l'arginine ou les groupes amine primaires des anticorps de façon à modifier des groupes présents sur les anticorps et les empêcher de gêner la détection d'une substance à analyser, et ils comprennent sans limitation, le glutaraldéhyde, la 0-méthylisourée, le formaldéhyde,
la butanedione, la cyclohexanedione et l'acide S-
acétyl thioglucolique K-hydroxy succinimide.
Avant d'effectuer l'essai immunologique, l'agent alkylant est inactivé de façon à ce qu'il ne modifie pas les réactifs de l'essai immunologique. Les moyens d'inactivation de l'agent alkylant, varient en fonction de l'agent alkylant employé. Un type d'agent alkylant utile selon la présente invention, est actif à un pH basique et inactif à un pH neutre. Ce type d'agent alkylant est particulièrement utile pour détecter des substances à analyser présentes dans un
échantillon sous une forme nécessitant le pré-
traitement de l'échantillon avec une solution alcaline de détergent afin d'extraire la substance à analyser. Selon un mode de réalisation, l'échantillon est pré-traité avec l'agent alkylant, puis on effectue une extraction avec un détergent en milieu basique avant un essai immunologique de LPS de chlamydia ou d'antigènes analogues. L'agent alkylant doit être ajouté avant la neutralisation de la solution échantillon. Selon un mode de réalisation préféré, on ajoute un agent alkylant actif, seulement à un pH basique, après l'extraction en milieu basique, et on l'incube avec la solution échantillon pendant un temps suffisant pour permettre aux anticorps endogènes d'être modifiés, de telle façon que les anticorps soient incapables de perturber la détection de la substance à analyser au cours de l'essai immunologique. L'agent alkylant doit être choisi de telle façon qu'il soit compatible avec les autres réactifs employés pour extraire la substance à analyser. Après l'incubation, l'agent alkylant est inactivé par neutralisation de la solution
échantillon et l'essai immunologique est effectué.
Selon une mode de réalisation, la substance
destinée à être analysée, est sensible aux acides.
Selon la présente invention, "sensible aux acides" qualifie une substance à analyser qui perd son activité antigénique lorsqu'elle est incubée dans une solution ayant un pH inférieur à 3,0. Pour cette application, les substances à analyser sensibles aux acides comprennent, sans limitation, les antigènes LPS comportant un groupe KDO, dérivés de Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Salmonella typhimurium, Neisseria gonorrhoeae et Escherichia coli. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, on effectue un essai immunologique d'un antigène LPS, et après l'étape d'extraction d'antigène, on ajoute l'agent alkylant associé à du dithiothréitol (DTT). Le DTT est un agent mucolytique ainsi qu'un modificateur chimique qui se lie à la cystéine. L'utilisation de DTT en association avec un agent alkylant, accroît la stabilité du signal en
fonction du temps, et la sensibilité de l'essai.
Un autre mode de réalisation de la présente invention comprend un nécessaire d'essai immunologique destiné à être employé pour analyser une substance à analyser dans un échantillon provenant d'un patient, contenant des anticorps endogènes qui gênent la détection de la substance à analyser, le nécessaire comprenant des réactifs d'essai immunologique pour effectuer un essai immunologique sur un échantillon afin d'analyser la substance à analyser, un agent alkylant capable d'alkyler des groupes présents sur les anticorps, à un pH non inférieur à 7,0, afin d'empêcher les anticorps endogènes de gêner la détection de la substance à analyser. Le nécessaire comprend en outre un agent d'inactivation capable d'inactiver l'agent alkylant, de façon à ce qu'il ne modifie plus d'anticorps. Selon un mode de réalisation, dans lequel l'agent alkylant est seulement actif à un pH basique, l'agent d'inactivation est un agent de neutralisation. La présente invention a pour objet un essai immunologique amélioré, destiné à l'analyse d'une substance à analyser dans un échantillon, provenant d'un patient, contenant des anticorps qui perturbent la détection de la substance à analyser, la substance à analyser étant antigénique; caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: a) à mettre en contact l'échantillon avec un agent alkylant capable d'alkyler des groupes présents sur les anticorps anti-substance à analyser, à un pH non inférieur à 7,0, afin de modifier les anticorps et de les rendre incapables de perturber la détection de substances à analyser, l'agent alkylant étant un agent qui ne modifie pas le pouvoir antigénique de la substance à analyser; b) à inactiver l'agent alkylant; et c) à effectuer ensuite un essai immunologique de l'échantillon, afin d'analyser la substance à
analyser, en présence de l'anticorps modifié.
Selon d'autres caractéristiques de l'essai immunologique de la présente invention: - la substance à analyser est sensible aux acides; - la substance à analyser est un antigène lipolysaccharidique; - l'antigène lipopolysaccharidique provient d'un microorganisme choisi parmi Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Salmonella typhimurium, Neisseria qonorrhoeae et Escherichia coli; - l'agent alkylant est le glutaraldéhyde, le formaldéhyde, la O- méthylisourée, la cyclohexanedione, la butanedione ou l'acide S- acétyl thioglycolique-N-hydroxy succinimide; - l'agent alkylant est également capable de réticuler des groupes présents sur les anticorps; - l'agent alkylant est activé à un pH basique, et inactivé à un pH neutre, et en ce que l'étape d'inactivation comprend la neutralisation du pH de l'échantillon; et - il comprend en outre les étapes de mise en contact de l'échantillon avec un détergent d'extraction approprié à un pH basique, afin de libérer l'antigène lipopolysaccharide avant ou pendant la mise en contact de l'échantillon avec
l'agent alkylant.
La présente invention a également pour objet un nécessaire d'essai immunologique pour analyser une substance à analyser dans un échantillon provenant d'un patient contenant des anticorps endogènes qui gênent la détection de la substance à analyser, caractérisé en ce qu'il comprend des réactifs d'essai immunologique pour effectuer un essai immunologique sur l'échantillon afin d'analyser la substance à analyser, un agent alkylant capable de réticuler des groupes présents sur les anticorps à un pH non inférieur à 7,0 afin de modifier les anticorps endogènes et les empêcher de se lier à la substance à analyser, et un agent d'inactivation destiné à inactiver l'agent alkylant, les réactifs d'essai immunologique pouvant être mis en oeuvre en présence de l'agent d'inactivation et de l'agent alkylant inactive. Selon d'autres caractéristiques du nécessaire d'essai immunologique de la présente invention: - l'agent alkylant est le glutaraldéhyde, le formaldéhyde, la o-méthylisourée, le glycéraldéhyde ou l'acide S- acétyl thioglycolique-N-hydroxy succinimide; - l'agent alkylant est activé à un pH basique, et inactivé à un pH neutre, et en ce que 1 'agent d'inactivation est un agent neutralisant; et - un détergent et un réactif dérivé de métal alcalino-terreux, pour extraire la substance à analyser à partir de l'échantillon, et en ce que la substance à analyser est un antigène lipopolysaccharidique. La présente invention a encore pour objet un essai immunologique amélioré destiné à analyser une substance à analyser sensible aux acides dans un échantillon provenant d'un patient contenant des anticorps qui gênent la détection de la substance analysée, la substance à analyser étant antigénique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: a) après avoir traité l'échantillon par extraction basique afin de libérer la substance à analyser, à mettre en contact l'échantillon avec un agent alkylant capable d'alkyler des groupes présents sur les anticorps anti- substances à analyser, à un pH non inférieur à 7,0, afin de modifier les anticorps pour les rendre incapables de gêner la détection de la substance à analyser, l'agent alkylant étant un agent qui ne modifie pas le pouvoir antigénique de la substance à analyser; b) à inactiver l'agent alkylant; et c) à effectuer un essai sur l'échantillon, afin d'analyser la substance à analyser en présence de
l'anticorps modifié.
La présente invention a enfin pour objet un essai immunologique amélioré destiné à analyser un antigène lipopolysaccharidique dans un échantillon provenant d'un patient contenant des anticorps gênant la détection d'une substance à analyser, la substance à analyser étant antigénique; caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: a) après extraction basique avec un détergent de l'échantillon afin de libérer l'antigène lipopolysaccharidique, à mettre en contact l'échantillon avec un agent alkylant capable d'alkyler des groupes présents sur les anticorps anti-substance à analyser, à un pH inférieur à 7,0, afin de modifier les anticorps pour les rendre incapables de gêner la détection de la substance à analyser, l'agent alkylant étant un agent qui ne modifie pas le pouvoir antigénique de l'antigène lipopolysaccharidique; b) à inactiver l'agent alkylant; et c) à effectuer ensuite un essai immunologique
sur l'échantillon, afin d'analyser l'antigène lipo-
polysaccharidique en présence de l'anticorps modifié.
Sur les dessins: la figure 1 est un graphique illustrant l'effet du procédé de pré-traitement de la présente invention sur la détection d'une substance à analyser immédiatement après extraction; la figure 2 est un graphique illustrant la perturbation avec la détection d'une substance à analyser à divers instants après extraction, sans employer le procédé de pré-traitement de la présente invention; la figure 3 est un graphique illustrant les effets du procédé de pré-traitement de la présente invention sur la détection d'une substance à analyser à divers instants après extraction; et la figure 4 illustre des bandes de western blotting mettant en évidence l'effet des agents alkylants de la présente invention sur l'aptitude d'anticorps anti-chlamydia, présents dans des échantillons provenant d'un patient, à se lier à une
substance à analyser.
Les réactifs et les procédés de la présente invention peuvent être employés avec des échantillons provenant d'un patient, obtenus selon des procédés classiques à partir de l'oeil, des fosses nasales à l'arrière du nez, du col, du vagin, de l'urètre, du rectum, de la gorge, du sang, du sérum, du plasma, de
l'urine, etc. Les réactifs et les procédés de pré-
traitement peuvent être mis en oeuvre dans n'importe quel essai immunologique dans lequel la présence d'anticorps endogènes gêne la détection d'une substance à analyser, mais ils sont particulièrement utiles avec des substances à analyser qui ne sont pas
stables à un pH faible.
Bon nombre d'essais immunologiques différents peuvent donner une efficacité accrue en mettant en oeuvre le procédé de pré-traitement de la présente
invention. On peut mentionner les essais radio-
immunologiques, les essais immunologiques qui mettent en oeuvre des procédés ELISA et des essais immunologiques employant divers marqueurs y compris des marqueurs fluorescents et chimioluminescents. Un tel essai immunologique comprend les étapes de mise en contact de la solution échantillon neutralisée et extraite, avec un anticorps monoclonal dirigé contre la substance à analyser, immobilisé sur une phase solide, notamment un puits de plaque de microtitration, une perle, une particule, un tube ou analogue, d'incubation et d'addition d'un anticorps polyclonal marqué qui se lie à la phase solide selon une quantité dépendant de la quantité de substance à analyser présente dans l'échantillon, d'incubation et
de détection du marqueur.
La quantité et la concentration d'agent alkylant utile dans un essai immunologique particulier,
varient en fonction du type d'échantillon, c'est-à-
dire du sérum ou un prélèvement urogénital effectué à l'aide d'un écouvillon, de la concentration des autres réactifs d'essai immunologique, du type de la substance à analyser ainsi que de la température à
laquelle le pré-traitement est effectué.
Dans certains essais immunologiques destinés à détecter la présence de micro-organismes, la substance à analyser destinée à être détectée, est un lipopolysaccharide (LPS) sensible aux acides, tel que l'antigène de chlamydia. De manière caractéristique, dans des essais de tels antigènes de chlamydia et d'antigènes analogues, l'échantillon dérivé de patient, est pré-traité avec une solution de détergent contenant des ions de métal alcalin ou alcalino-terreux. Au cours de l'étape d'extraction, les anticorps endogènes anti-substance à analyser, sont partiellement dénaturés ou perturbés. Toutefois, avec le temps, une fois que la solution échantillon est neutralisée, les anticorps endogènes se renaturent et empêcheront la reconnaissance de la substance à analyser en gênant la liaison de l'anticorps réactif dirigé contre la substance à
analyser au cours de l'essai immunologique.
Bien que l'on ne souhaite pas être lié par ce qui suit, on pense que les agents alkylants réagissent avec des groupes présents sur des anticorps qui ont été partiellement dénaturés ou perturbés, ce qui empêche la renaturation des
anticorps au cours de l'essai immunologique.
Un type d'agent alkylant, particulièrement utile dans un essai immunologique de LPS, est un agent qui est seulement actif à un pH basique, par exemple
supérieur à 8,0, et inactif à un pH neutre ou acide.
Les agents alkylants de ce type comprennent, sans
limitation, le glutaraldéhyde, le formaldéhyde, la o-
méthylisourée, la butanedione et la cyclohexanedione.
Ces agents sont particulièrement préférés dans la mesure o les essais immunologiques caractéristiques sont effectués à un pH neutre, de sorte qu'ils ne
perturberaient pas l'efficacité de l'essai.
Un autre type d'agent alkylant de la présente invention, est actif à un pH neutre (pH: 7,0 - pH: 8,0) et il peut être inactivé par addition d'un deuxième réactif comportant des groupes amine, telles qu'une amine tertiaire comme le Tris ou une amine primaire comme la glycine. Les agents alkylants de ce type comprennent, sans limitation, l'acide S- acétyl
thioglycolique-N-hydroxy succinimide.
Le procédé de la présente invention sera plus facilement compris en se référant aux exemples suivants qui sont mentionnés à titre illustratif et
non limitatif.
Exemple 1 - Essai immunologique de chlamydia On a employé un nécessaire à microplaque pour chlamydia Kallestad PathfinderR, pour effectuer le
procédé de pré-traitement et l'essai immunologique.
Le nécessaire à microplaque pour chlamydia Kallestad PathfinderR comprenait: Une solution de traitement d'échantillon A (STS A) comprenant NaOH, IN d'EDTA 5mM, du jaune
d'alizarine à 50 mg/ml (acide 2-hydroxy-5-[(4-
nitrophényl)azo]benzoïque, un colorant qui est jaune à un pH neutre inférieur à 10,2 et rouge à un pH de
12), et 0,05 % de 3[(3-cholamidopropyl)-
diméthylammonio]-1-propane sulfonate (CHAPS).
Une solution de traitement d'échantillon B (STS B) comprenant NaCl 1,0 N, du tris basique 2M et 3 %
de H202.
Le procédé d'extraction effectué avant l'essai immunologique décrit cidessous, comprenait les étapes d'addition de 1,0 ml de la solution STS A dans 0,1 ml d'échantillon, et une incubation pendant 10 minutes ainsi qu'une agitation à l'aide d'un vortex pendant 30 secondes. Ensuite, afin de déterminer l'efficacité d'agents alkylants de la présente invention, on a ajouté 0,1 ml d'un agent alkylant ou d'un tampon, on a agité à l'aide d'un vortex pendant 10 secondes, puis incubé pendant 10 minutes. Avant d'effectuer l'essai immunologique, on a ajouté 0,1 ml de solution STS B, et la solution échantillon a été
agitée à l'aide d'un vortex pendant 10 secondes.
Après extraction, on a effectué un essai immunologique en employant le nécessaire à
microplaque Kallestad PathfinderR décrit ci-dessous.
On a ajouté une portion aliquote de 100 Al d'échantillon extrait, dans chaque puits de microplaque PathfinderR auquel un anticorps monoclonal dirigé contre un anticorps de chlamydia était lié. La plaque a été incubée pendant 30 minutes à 26 C dans un incubateur à agitation STAT-FAX (Awareness Technologies). On a ajouté dans chaque puits, 50 gl de réactif à base d'anticorps polyclonal de lapin anti-chlamydia, et la plaque a été incubée
pendant 30 minutes à 26 C dans un STAT-FAX 2200.
On a ensuite ajouté dans chaque puits, 50 pl de peroxydase de Raifort conjuguée à un anticorps de chèvre anti-lapin, et la plaque a été incubée pendant
30 minutes à 26 C dans un STAT-FAX 2200.
Les puits des plaques ont ensuite été lavés cinq fois sur le dispositif de lavage de microplaque LP-35 (Diagnostics Pasteur, France), et on a ajouté 100 gl de o-phénylènediamine dans un tampon, dans chaque puits, et la plaque a été incubée pendant 30 minutes dans l'obscurité. On a ajouté 100 pl d'une solution d'arrêt comprenant H2SO4 4N et les microplaques ont été lues sur un lecteur de microplaque LP-400 (Diagnostic Pasteur, France) à une densité optique
(DO) de 492/620.
Exemple 2 - Substance à analyser sensible aux acides Ainsi que cela a été mentionné ci-dessus, le procédé de pré-traitement est particulièrement préféré dans le cas de substances à analyser sensibles aux acides telles qu'un lipopolysaccharide. On a démontré que le pouvoir antigénique d'un LPS était modifié lorsque l'échantillon était traité avec
un acide, mais pas avec une base.
Traitement en milieu acide: on a traité 1 ml d'antigène de chlamydia dans un mélange de solutions STS A et STS B (10:1) avec 30 gl de H3PO4 4M (pH: 2,3) et on a laissé la réaction se dérouler pendant mn, puis on a neutralisé avec 70 gl de NaOH 2N
(pH: 8,1).
Traitement en milieu basique: on a traité 1 ml d'antigène de chlamydia dans un mélange de solutions STS A et STS B (10:1) avec 70 Al de NaOH 2N (pH: 12,5), et on a laissé la réaction se dérouler pendant mn avant d'effectuer une neutralisation avec 30 Ml
de H3PO4 4M (pH: 2,3).
Les résultats des traitements en milieux acide
et basique, sont mentionnés dans le tableau 1.
Tableau 1
Conditions de Mélange Mélange 3,4 x 105 corps 1,72 x 105 corps pré-incubation clinique 1 clinique 2 élémentaires élémentaires
DO 492/620 DO 492/620 DO 492/620 DO 492/620
Pas de traitement 0,135 2,775 0,361 0,254 Traité en milieu acide 0,087 0,401 0,247 0,168 Traité en milieu basique 0,303 1,873 0,431 0,213 Exemple 3: Aqents alkylants L'efficacité des divers agents alkylants pour modifier des anticorps endogènes et accroître le signal d'essai immuno-enzymatique, a été mise en évidence avec des modèles de plasma séropositif (anticorps anti-chlamydia humains dans du plasma) et d'anticorps anti- chlamydia équins. Du plasma séropositif anti-chlamydia humain ou des anticorps anti-chlamydia équins purifies par immuno-affinité, ont été mélangés avec des corps élémentaires de Chlamydia trachomatis (seroivar L2, habituellement 1,5 x 106 corps élémentaires/ml final) et extraits de
la façon décrite dans l'exemple 1.
L'efficacité de chaque agent alkylant a été estimée par comparaison avec un échantillon traité seulement avec un tampon. Ainsi que cela est illustré dans le tableau 2, après que les agents alkylants aient été inactivés par addition d'un agent de neutralisation dans une solution STS B, on observe une amélioration immédiate de la détection de substance à analyser au temps O, avec le glutaraldéhyde et la cyclohexanedione en tant qu'agents alkylants par comparaison à un traitement
juste avec un tampon.
Tableau 2
Traitements 0 heure après 120 heures après Variation, extraction extraction %
DO 492/620 DO 492/620
Tampon 1,479 0,086 0,938 0,048 Chute de 37 % 1 % de glutaraldéhyde 1,821 0,035 1, 743 0,073 Chute de 4 % 1 % de glutaraldéhyde/ 1,895 0,078 1,975 0,129 mM de DTT Accroissement de 4 % mM de cyclohexanedione 1,851 0,031 1,546 0,009 Chute de 17 % mM de cyclohexanedione/ 2,379 0,137 2,488 0,026 mM de DTT Accroissement de 4 % mM de DTT 1,977 0,051 2,241 0,059 Accroissement de 13 % H Les résultats mentionnés dans le tableau 2 démontrent que l'extraction en milieu alcalin seule
sans agent alkylant, perturbe les anticorps anti-
chlamydia en les rendant moins aptes à gêner la détection d'une substance à analyser. Toutefois, au cours du temps, les anticorps perturbés en milieu alcalin, se sont renaturés dans l'échantillon avec seulement un tampon, et ils ont efficacement neutralisé le signal d'essai immuno-enzymatique, en gênant la capture d'antigène ou la détection dans le
dispositif d'essai Pathfinder.
Zéro heure après l'extraction (tableau 2), l'échantillon traité avec un tampon avait une valeur DO respectivement de 20 % et de 22 % en-dessous de celle d'échantillons extraits en présence de 1 % de glutaraldéhyde avec et sans DTT. 120 heures après l'extraction, les échantillons extraits juste en présence de tampon, ont donné lieu à une chute de 37 % par comparaison aux extractions avec 1 % glutaraldéhyde et 50 mM de cyclohexanedione qui ont donné lieu à une légère chute. L'association de DTT mM avec le glutaraldéhyde et la cyclohexanedione, a résulté en un léger accroissement du signal à
partir de l'instant zéro.
Exemple 4 - Glutaraldéhyde On a mélangé des compositions à base de corps élémentaires de chlamydia avec diverses concentrations d'anticorps anti-chlamydia équins, on les a prétraités après extraction avec un détergent en présence de glutaraldéhyde à 1 % et de DTT 25 mM ou d'un tampon, et on a effectué l'opération d'essai immuno- enzymatique décrite ci-dessus. Les échantillons pré-traités avec le glutaraldéhyde alkylant/réticulant ont donné lieu à un accroissement marqué du signal illustré sur la figure 1, proportionnel aux échantillons traités avec un tampon à l'instant zéro (après extraction) à toutes les concentrations en anticorps anti- chlamydia équins à l'exception de 0,2 kg/ml, concentration qui approchait la limite de l'activité de neutralisation. Les anticorps humains anti-chlamydia (PL) ont démontré un effet de neutralisation presque équivalent à 1,6 gg/ml d'anticorps anti-chlamydia
équins en l'absence de glutaraldéhyde.
L'influence d'anticorps anti-chlamydia équins ou
humains sur la production d'un signal d'essai immuno-
enzymatique, a été évaluée à plusieurs instants après extraction. En l'absence de glutaraldéhyde, la sensibilité de l'essai zéro heure après l'extraction, était nettement plus élevée que 24 ou 48 heures après l'extraction, ainsi que cela est révélé par une diminution de la densité optique illustrée sur la figure 2. En présence de glutaraldéhyde et de DTT ainsi que cela est illustré sur la figure 3, les différences n'étaient pas aussi prononcées en fonction du temps, et la détection globale d'antigènede chlamydia, n'était pas empêchée par des anticorps
anti-chlamydia équins.
La présence d'anticorps anti-chlamydia humains (Hu X C) dans des échantillons uro-génitaux cliniques, et l'effet d'un pré- traitement de l'échantillon avec du glutaraldéhyde et du DTT, ont en outre, été mis en évidence selon des procédés d'essai immunologiques par western blotting. On a pré-traité des échantillons cliniques de la façon décrite ci-dessus en présence ou en l'absence de glutaraldéhyde et de DTT, et on a contrôlé une perte de signal d'essai immuno- enzymatique, ce qui indique la présence de Hu X C. On remarquera que les échantillons donnant lieu à la chute de signal d'essai immuno-enzymatique la plus élevée, comportaient des anticorps Hu X Chlamydia immunoréactifs (MOMP, Protéine Majeure de Membrane Externe) ainsi que cela est illustré sur la figure 4. Dans les échantillons correspondants contenant du glutaraldéhyde, on n'a pas détecté d'anticorps
humains anti-MOMP immunoréactifs (Hu X MOMP).
ExemDle 5 - Pré-traitement avec des agents alkylants à un pH basique Le tableau 3 illustre les résultats de détection d'une substance à analyser en employant différentes concentrations de divers agents alkylants. On a ajouté 0,1 ml d'antigène de chlamydia dans du plasma séropositif, et on les a mélangés avec une solution STS A, on a agité dans un vortex pendant 10 secondes, puis on les a incubés pendant 10 minutes. On a ensuite ajouté 0,1 ml d'agent alkylant ou de tampon, la solution a été agitée dans un vortex pendant 10 secondes, puis incubée pendant 10 minutes. Avant d'effectuer l'essai immunologique, on a ajouté 0,1 ml de solution STS B, et la solution échantillon a été agitée dans un vortex pendant 10 secondes. Ainsi qu'on peut le remarquer d'après le tableau 3, les relativement faibles concentrations en agents alkylants, n'étaient pas aussi efficaces 48 heures après extraction pour éliminer la perturbation d'anticorps endogènes, mais elles étaient plus efficaces qu'avec seulement du tampon 0 heure et 24
heures après extraction.
Tableau 3
Traitement 0 heures après 24 heures après 48 heures après extraction, plasma extraction, plasma extraction, plasma séropositif séropositif séropositif 1% de glutaraldéhyde 1,385 0,062 1,598 0,049 1,311 0,076 0,5 % de glutaraldéhyde 1,520 0,080 1,615 0,072 0,425 0,063 1 % de formaldéhyde 1,549 0,230 1,512 0,025 1,321 0,084 0,5 % de formaldéhyde 1,506 0,115 1,254 0,116 0,989 0,217 mM de butanedione 1,439 0,006 1,277 0,086 0,944 0,123 12,5 mM de butanedione 1,351 0,120 1,145 0,113 0, 726 0,173 Tampon 1,238 0,120 0, 825 0,044 0,694 0,036 En plus d'un pré-traitement à un pH basique avec
du glutaraldéhyde, on a ajouté 50 mM de O-
méthylisourée (OMIU) et 50 mM de cyclohexanedione (CHD) dans une solution échantillon après extraction dans une solution STS A, et on a effectué un essai immunologique, ainsi que cela est décrit dans l'exemple 1. Les deux agents ont produit des résultats d'essai immunologique améliorés en fonction du temps, et l'efficacité d'essai immunologique était encore accrue en associant les agents alkylants avec
du DTT.
Les résultats de ces expériences sur une période de cinq jours après extraction, sont mentionnés dans
le tableau 4.
Tableau 4
Temps: 5 jours O jour après 3 jours après 5 jours après extraction extraction extraction Traitements Plasma séropositif Plasma séropositif Plasma séropositif
DO 492/620 DO 492/620 DO 492/620
Tampon 1,479 0,230 0,685 0,040 0,938 0,048 1 % de GA 1,821 0,035 1,109 0,051 1,743 0,073
GA/DTT 1,895 0,078 1,377 0,036 1,975 0,129
mM de OMIU 1,540 0,169 0,694 0,048 0,957 0,043
OMIU/DTT 2,192 0,057 1,773 0,167 2,228 0,194
250 mM de CHD 1,851 0,031 1,205 0,016 1,546 0,009
CHD/DTT 2,379 0,137 1,908 0,056 2,488 0,026
mM de DTT 1,977 0,051 1,702 0,036 2,241 0,059 Exemple 6 Pré-traitement avec des agents alkylants à un pH neutre Bien que l'on préfère les agents alkylants qui sont actifs à un pH basique, dans des essais immunologiques de LPS, on peut également employer des agents alkylants actifs à un pH neutre. On a mélangé 2 ml de corps élémentaires (1:16, 3,12 X 106) et g1 d'anticorps anti-chlamydia équins (100 pg/ml, 2 ml/ml à la fin), et on a employé des portions aliquotes de 0,1 ml du mélange de corps élémentaires et d'anticorps en tant qu'échantillon. On a ajouté des portions aliquotes dans 8 tubes, et on a extrait avec 1 ml de solution STS A, agité dans un vortex et
incubé pendant 10 minutes à la température ambiante.
On a ajouté 100 gl de tampon HCl/phosphate, dont le pH a été préalablement ajusté de façon à ce que,
lorsqu'il est associé avec la solution échantillon-
STS A, le pH soit de 8,0. On a ajouté 50 mM d'acide S-acétyl thioglycolique-N-hydroxysuccinimide (SATA), et la solution a été incubée pendant 60 minutes à la température ambiante. On a ensuite ajouté 0,1 ml de tris 1M (pH 2,8) qui est une amine tertiaire afin
d'inactiver l'agent alkylant.
Les échantillons ont été analysés en mettant en oeuvre le procédé d'essai immunologique de chlamydia décrit dans l'exemple 1. Le tampon seul a résulté en une DO de seulement 0,365 0,21 à 472/620. Le traitement d'un échantillon avec du SATA à un pH neutre, a donné des résultats d'essai immunologique améliorés de 2,26 0,75, ce qui est voisin de la densité optique d'un échantillon de corps élémentaires en l'absence d'anticorps anti-chlamydia équins. Bien que l'on ait décrit un mode de réalisation préféré de la présente invention, on comprendra que diverses modifications, adaptations et variantes peuvent être effectuées sans s'écarter de la définition de l'invention mentionnée dans les
revendications annexées.
Claims (14)
1. Essai immunologique amélioré, destiné à l'analyse d'une substance à analyser dans un échantillon, provenant d'un patient, contenant des anticorps qui perturbent la détection de la substance à analyser, la substance à analyser étant antigénique; caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: a) à mettre en contact l'échantillon avec un agent alkylant capable d'alkyler des groupes présents sur les anticorps anti-substance à analyser, à un pH non inférieur à 7,0, afin de modifier les anticorps et de les rendre incapables de perturber la détection de substances à analyser, l'agent alkylant étant un agent qui ne modifie pas le pouvoir antigénique de la substance à analyser; b) à inactiver l'agent alkylant; et c) à effectuer ensuite un essai immunologique de l'échantillon, afin d'analyser la substance à
analyser, en présence de l'anticorps modifié.
2. Essai immunologique amélioré selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance à
analyser est sensible aux acides.
3. Essai immunologique amélioré selon la revendication 2, caractérisé en ce que la substance à
analyser est un antigène lipopolysaccharidique.
4. Essai immunologique amélioré selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'antigène lipopolysaccharidique provient d'un microorganisme choisi parmi Chlamvdia trachomatis, Chlamydia psittaci. Salmonella typhimurium, Neisseria
gonorrhoeae et Escherichia coli.
5. Essai immunologique amélioré selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent alkylant est le glutaraldéhyde, le formaldéhyde, la O-méthylisourée, la cyclohexanedione, la butanedione ou l'acide S-acétyl thioglycolique-N-hydroxy succinimide.
6. Essai immunologique amélioré selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent alkylant est également capable de réticuler des
groupes présents sur les anticorps.
7. Essai immunologique amélioré selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent alkylant est activé à un pH basique, et inactivé à un pH neutre, et en ce que l'étape d'inactivation
comprend la neutralisation du pH de l'échantillon.
8. Essai immunologique amélioré selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes de mise en contact de l'échantillon avec un détergent d'extraction approprié à un pH basique, afin de libérer l'antigène lipopolysaccharide avant ou pendant la mise en
contact de l'échantillon avec l'agent alkylant.
9. Nécessaire d'essai immunologique pour analyser une substance à analyser dans un échantillon provenant d'un patient contenant des anticorps endogènes qui gênent la détection de la substance à analyser, caractérisé en ce qu'il comprend des réactifs d'essai immunologique pour effectuer un essai immunologique sur l'échantillon afin d'analyser la substance à analyser, un agent alkylant capable de réticuler des groupes présents sur les anticorps à un pH non inférieur à 7,0 afin de modifier les anticorps endogènes et les empêcher de se lier à la substance à analyser, et un agent d'inactivation destiné à inactiver l'agent alkylant, les réactifs d'essai immunologique pouvant être mis en oeuvre en présence de l'agent d'inactivation et de l'agent alkylant inactive.
10. Nécessaire d'essai immunologique selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'agent alkylant est le glutaraldéhyde, le formaldéhyde, la
O-méthylisourée, le glycéraldéhyde ou l'acide S-
acétyl thioglycolique N-hydroxy-succinimide.
11. Nécessaire d'essai immunologique selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'agent alkylant est activé à un pH basique, et inactivé à un pH neutre, et en ce que l'agent d'inactivation est un
agent neutralisant.
12. Nécessaire d'essai immunologique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un détergent et un réactif dérivé de métal alcalino-terreux, pour extraire la substance à analyser à partir de l'échantillon, et en ce que la substance à analyser est un antigène
lipopolysaccharidique.
13. Essai immunologique amélioré destiné à analyser une substance à analyser sensible aux acides dans un échantillon provenant d'un patient contenant des anticorps qui gênent la détection de la substance à analyser, la substance à analyser étant antigénique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: a) après avoir traité l'échantillon par extraction basique afin de libérer la substance à analyser, à mettre en contact l'échantillon avec un agent alkylant capable d'alkyler des groupes présents sur les anticorps anti-substances à analyser, à un pH non inférieur à 7,0, afin de modifier les anticorps pour les rendre incapables de gêner la détection de la substance à analyser, l'agent alkylant étant un
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agent qui ne modifie pas le pouvoir antigénique de la substance à analyser; b) à inactiver l'agent alkylant; et c) à effectuer un essai sur l'échantillon, afin d'analyser la substance à analyser en présence de
l'anticorps modifié.
14. Essai immunologique amélioré destiné à analyser un antigène lipopolysaccharidique dans un échantillon provenant d'un patient contenant des anticorps gênant la détection d'une substance à analyser, la substance à analyser étant antigénique; caractérisé en ce qu'il comprend les étapes
consistant: -
a) après extraction basique avec un détergent de l'échantillon afin de libérer l'antigène lipopolysaccharidique, à mettre en contact l'échantillon avec un agent alkylant capable d'alkyler des groupes présents sur les anticorps anti-substance à analyser, à un pH inférieur à 7,0, afin de modifier les anticorps pour les rendre incapables de gêner la détection de la substance à analyser, l'agent alkylant étant un agent qui ne modifie pas le pouvoir antigénique de l'antigène lipopolysaccharidique; b) à inactiver l'agent alkylant; et c) à effectuer ensuite un essai immunologique
sur l'échantillon, afin d'analyser l'antigène lipo-
polysaccharidique en présence de l'anticorps modifié.
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