DE3854084T2 - Serumvorbehandlung für testverfahren zur bestimmung des vitamins b12. - Google Patents
Serumvorbehandlung für testverfahren zur bestimmung des vitamins b12.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, um Vitamin B&sub1;&sub2; in einer Serumprobe verfügbar zu machen und das Befreien von Vitamin B&sub1;&sub2; aus endogenen serumbindenden bzw. Serumbindungsproteinen zur darauffolgenden Bestimmung der Vitamin B&sub1;&sub2;-Konzentration im Serum.
- Die Konzentration von Vitamin B&sub1;&sub2; in Serum ist das beste Routinemaß für Vitamin B&sub1;&sub2;- Mangel. Jedoch ist der Großteil von Vitamin B&sub1;&sub2; im Blut an Proteine gebunden. Wenn Vitamin B&sub1;&sub2; in den Kreislauf absorbiert wird, bindet es sich an Transcobalamin II, ein Plasma β-Globulin. Im Plasma sind auch zwei andere Transcobalamine (I und III) vorhanden, die sich an Vitamin B&sub1;&sub2; binden. Um die in einer Serumprobe vorhandene Menge an Vitamin B&sub1;&sub2; präzise zu messen, ist es notwendig, die Probe vorzubehandeln, um das Vitamin B&sub1;&sub2; von den verschiedenen Serumsbindungsproteinen loszulösen.
- Bei bestehenden Vitamin B&sub1;&sub2;-Bindungsassays ist eine Vielzahl von Verfahren zur Vorbehandlung einer Serumprobe eingesetzt worden, um Vitamin B&sub1;&sub2; von den Serumbindungsproteinen loszulösen. Zu diesen Verfahren gehören das Erwärmen der Probe (das "Koch"-Verfahren) bei 100ºC für einen ausreichenden Zeitraum, um die endogenen Serumbindungsproteine zu zerstören, und das sogenannte "Nicht-Koch"- Verfahren, bei dem die Probe mit Natriumhydroxid bei pH 12-13 behandelt wird. Kochverfahren unterbrechen den Arbeitsfluß und sind der Automatisierung nicht förderlich, da es notwendig ist, die Probe zuerst zu erwärmen und sie dann vor der Zugabe anderer Reagenzien auf Raumtemperatur abzukühlen. Die Nicht-Kochverfahren denaturieren möglicherweise vorhandene Antikörper gegen den intrinsischen Faktor nicht vollständig. Es ist daher von wesentlichem Interesse, Vitamin B&sub1;&sub2; rasch und effizient von endogenen Serumbindungsproteinen loszulösen sowie andere Faktoren inaktivieren zu können, die das Ergebnis des Assayverfahrens beeinflussen können.
- Was den Stand der Technik betrifft, offenbart die US-A-4,300,907 ein Verfahren zum Loslösen von Vitamin B&sub1;&sub2; von endogenen Serumbindungsproteinen unter Verwendung eines Freisetzungsmittels, das ein organisches Lösungsmittel, ein Reduktionsmittel und Cyanidionen umfaßt. Ein Verfahren zum Denaturieren von Vitamin B&sub1;&sub2;-Bindungsprotein unter Verwendung einer Kombination aus Wärme und einem Denaturierungsmittel wie z.B. Harnstoff wird in der US-A-4,332,786 geoffenbart. Gutcho und Mansbach, Clin.Chem. (1974) 23:1609-1614 offenbaren ein Verfahren zum Zerstören endogener Vitamin B&sub1;&sub2;-Bindemittel und die Freisetzung von gebundenem Vitamin B&sub1;&sub2; durch Erwärmen bei alkalischem pH-Wert in Gegenwart eines Reduktionsmittels.
- Ein Verfahren zur Reduktion von Hintergrundinterferenz, die die Messung der Analytmengen stört, durch Behandlung der Probe mit Persäuren wird in der US-A- 4,668,620 geoffenbart. Ein Nicht-Koch- Vitamin B&sub1;&sub2;-Assay, bei dem B&sub1;&sub2;-Analoge zur Bindung von endogenem Bindungsprotein verwendet werden, gemeinsam mit der Vorbehandlung mit einer starken Base und einer Sulfhydralverbindung, um das B&sub1;&sub2; freizusetzen, wird in der US-A-4,451,571 geoffenbart.
- Gemäß vorliegender Erfindung werden Verfahren zur Vorbehandlung einer Serumprobe zur Freisetzung von Vitamin B&sub1;&sub2; von endogenen Serumbindungsproteinen zur darauffolgenden Bestimmung der Vitamin B&sub1;&sub2;-Konzentration im Serum bereitgestellt, bei denen die Probe mit Peroxysäure inkubiert wird, gefolgt vom Reduzieren der verbleibenden Peroxysäure mit einem Reduktionsmittel. Die Probe wird dann in einem Assay zur Vitamin B&sub1;&sub2;-Bestimmung verwendet, bei dem markiertes Vitamin B&sub1;&sub2; und Vitamin B&sub1;&sub2;-spezifisches Bindungsprotein zum Einsatz kommen.
- Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung wird das Vitamin B&sub1;&sub2; durch Vorbehandlung der Serumprobe mit einer Peroxysäure wie z.B. Peroxymonosulfat oder Peroxytrifluoressigsäure (einschließlich Salzen, insbesondere Alkalimetallsalzen) verfügbar gemacht. Kaliumperoxymonosulfat ist von E.I.duPont de Nemours & Company unter dem Markennamen "Oxone" erhältlich. Peroxytrifluoressigsäure kann aus einer Mischung von Wasserstoffperoxid und Trifluoressigsäure hergestellt werden. Nach der Behandlung der Probe kann jegliche nicht reduzierte Peroxysäure dann unter Verwendung eines Reduktionsmittels zerstört werden, das die darauffolgenden Assayverfahren nicht stört. Reagenzien für das Assaysystem können der vorbehandelten Probe direkt zugefügt werden.
- Die Probe kann jede beliebige Serumprobe sein. Hämolyse der Probe oder Lipämie beeinflußt weder die Vorbehandlung noch das darauffolgende Assay auf Vitamin B&sub1;&sub2;.
- Zur Verwendung gemäß Vorbehandlungsvorschrift wird die Peroxysäure in einem nichtstörenden Puffer wie z.B. Phosphatpuffer mit pH 7,0 oder Zitratpuffer mit pH 8 verdünnt. Die Endkonzentration von Peroxysäure in der Probe ist im allgemeinen größer als etwa 10 mM, zweckmäßig zwischen etwa 25 mM und 100 mM, wobei die Konzentration der zur Inkubationsmischung hinzugefügten Lösung im allgemeinen zumindest 20 mM, vorzugsweise 50-100 mM beträgt. Die Probe wird mit der Peroxysäure im allgemeinen bei Raumtemperatur zumindest 5 Minuten, vorzugsweise zumindest 10 Minuten lang inkubiert, obwohl Inkubationszeiten von 60 Minuten oder darüber die Ergebnisse nicht negativ beeinflussen.
- Wenn die Probe in einem Assaysystem verwendet wird, bei dem ein spezifisches Bindungsprotein verwendet wird, um in der Probe vorhandenes Vitamin B&sub1;&sub2; nachzuweisen, ist es wünschenswert, jegliche verbleibende nicht reduzierte Peroxysäure vor der Zugabe von spezifischem Bindungsprotein zu reduzieren. Wenn beim Assaysystem beispielsweise monoklonaler anti-B&sub1;&sub2;-Antikörper verwendet wird, kann das Reduktionsmittel ein Nicht-Sulfit-Reduktionsmittel wie z.B. Methionin, Natriumphosphit, Natriumarsenit, Dithiothreitol oder β-Mercaptoäthanol sein. Wenn beim eingesetzten Assaysystem ein Vitamin B&sub1;&sub2;-Bindungsprotein wie z.B. intrinsischer Faktor verwendet wird, kann das Reduktionsmittel ein Reduktionsmittel auf Sulfitbasis, wie z.B. Natriumsulfit, Natriummetabisulfit oder Natriumhydrosulfit oder ein Nicht- Sulfit-Reduktionsmittel wie z.B. die oben beschriebenen sein. Die Bindung von Vitamin B&sub1;&sub2; ist in Gegenwart des Reduktionsmittels nicht beeinträchtigt.
- Das Reduktionsmittel wird in einem geeigneten nicht-störenden Puffer wie z.B. Phosphatpuffer mit pH 7,0 hergestellt, der herkömmliche Additive enthält, um das Reduktionsmittel zu stabilisieren. Das Reduktionsmittel kann der oxidierten Probe bei Raumtemperatur zugegeben werden, wobei die Endkonzentration des Reduktionsmittels in der Probe im allgemeinen über 5 mM, vorzugsweise über 10 mM liegt.
- Die Inkubationszeit der oxidierten Probe mit dem Reduktionsmittel ist nicht entscheidend. Wenn die Probe sofort bei einem Vitamin B&sub1;&sub2;-Assay zu verwenden ist, könnte jedes beliebige markierte Vitamin B&sub1;&sub2; oder das Bindungsprotein für kompetitive oder sequentielle Vorschriften mit dem Reduktionsmittel kombiniert werden.
- Die Vorbehandlungsvorschrift kann bei einer Vielfalt von Radioassays oder isotopfreien Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B&sub1;&sub2; in Serum verwendet werden. Diese Verfahren umfassen Assayvorschriften, bei denen ein für Vitamin B&sub1;&sub2; spezifisches Bindungsprotein verwendet wird, wie z.B. monoklonale Antikörper oder intrinsischer Faktor, entweder in Lösung oder an einen festen Träger gebunden. Die Vorbehandlungsvorschrift wird vorzugsweise mit einer Festphasen-Assayvorschrift kombiniert, bei der ein für Vitamin B&sub1;&sub2; spezifisches Bindungsprotein an einen festen Träger gebunden ist. Der feste Träger kann aus Agarosekugeln wie z.B. Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose oder Acrylam idgels wie z.B. AffiGel bestehen. Der feste Träger kann durch jedes beliebige herkömmliche Mittel an das spezifische Bindungsprotein konjugiert werden. Ein alllgemeiner Überblick der Kopplungsverfahren ist beispielsweise Axen et al., "Nature" (1967) 214:1302-1304 zu entnehmen. Diese Vorbehandlung kann auch an homogene Vitamin B&sub1;&sub2;-Assays auf der Basis der Komplementierung von β-Galaktosidasefragmenten gekoppelt sein, bei denen Vitamin B&sub1;&sub2; an eines der Fragmente (Enzymdonor) konjugiert ist und bei denen die Komplementierung durch sich an intrinsischen Faktor bindendes B&sub1;&sub2;- Enzymdonorkonjugat blockiert ist.
- Bei der Durchführung des Assays unter Verwendung der vorbehandelten Probe und des Festphasenbindungsproteins können jegliche zwischen Proben- Vitamin B&sub1;&sub2; und Bindungsprotein gebildeten Komplexe durch eine an Vitamin B&sub1;&sub2; befestigte Markierung ermittelt werden. Tracer-Lösung kann der Probe entweder gleichzeitig mit oder nach der Zugabe des Reduktionsmittels zur Probe zugegeben werden. Das Tracer-Molekül kann auf verschiedene Arten kovalent markiert werden. Die Markierung kann ein Enzym sein, beispielsweise alkal ische Phosphatase, β-D-Galaktosidase oder Fragmente davon, Glukose-6-phosphatdehyd rogenase, Glukoseoxidase, Meerrettichperoxidase, Urease; ein Radionuklid wie z.B. &sup5;&sup7;Co; eine chemilumineszierende oder fluoreszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisocyanat; oder jede beliebige andere Markierung, die ein nachweisbares Signal liefert.
- Die das markierte Vitamin B&sub1;&sub2; enthaltende Probe wird dann mit dem Festphasenbindungsprotein in Kontakt gebracht. Wenn der intrinsische Faktor beispielsweise an Sepharose gebunden ist, kann die Sepharose in Form einer Aufschlämmung vorliegen, vorzugsweise einer 50%igen Aufschlämmung, beispielsweise in 100 mM Phosphatpuffer mit pH 7,5, die Protein wie z.B. BSA oder Gelatine enthält. Die Probenaufschlämmung wird dann im allgemeinen bei Raumtemperatur für einen ausreichenden Zeitraum inkubiert, um Komplexe aus B&sub1;&sub2; und intrinsischem Faktor zu bilden. Wenn der feste Träger Sepharose ist, wird die Inkubationsmischung während der Inkubationszeit vorzugsweise geschaukelt, um das Absetzen der Sepharosekugeln zu verhindern. Die Inkubationszeit beträgt im allgemeinen mindestens 60 Minuten bei Raumtemperatur, aber auch Inkubationszeiten bis zu 16 Stunden beeinflussen die Ergebnisse nicht negativ.
- Nach der Inkubation kann gebundene und ungebundene Probe je nach Beschaffenheit des festen Trägers durch Zentrifugieren, Waschen usw. abgetrennt werden. Der ungebundenes markiertes Vitamin B&sub1;&sub2; enthaltende Überstand wird dekantiert. Entweder der B&sub1;&sub2;-Bindungsprotein-Komplexe enthaltende feste Träger oder der Überstand kann analysiert werden, um die vorhandene Markierungsmenge zu bestimmen. Das Nachweisverfahren hängt sowohl von der verwendeten Markierungsart als auch von der erforderlichen Empfindlichkeit ab. Wenn die Markierung ein Radionuklid ist, kann entweder der feste Träger oder der Überstand gezählt werden, um die vorhandene Radioaktivitätsmenge zu bestimmen. Wenn die Markierung ein Enzym ist, kann das Verschwinden von Substrat oder Auftreten von Reaktionsprodukt nach Substratzugabe spektrophotometrisch gemessen werden. Wenn das Enzym beispielsweise Urease ist, kann ein Indikatorfarbstoff wie z.B. Cresol-Rot verwendet werden, um die Änderung des pH-Werts in der Probe nach der Zugabe von Enzymsubstrat zu überwachen.
- Kontrollen können eingesetzt werden, um die Vitamin B&sub1;&sub2;-Konzentration in einer Probe zu quantifizieren. Üblicherweise werden zumindest eine Hintergrundlösung, die kein Vitamin B&sub1;&sub2; enthält, und zumindest eine Serumbezugslösung, die eine bekannte Menge an Vitamin B&sub1;&sub2; enthält, identisch mit der Probe behandelt, die eine unbekannte Vitamin B&sub1;&sub2;-Konzentration enthält. Die in der Hintergrundlösung feststellbare Markierungsmenge wird von der in der Bezugslösung und der unbekannten Probe feststellbaren Markierungsmenge subtrahiert. Die berichtigten Werte für die Bezugslösung und die unbekannte Probe werden dann in Beziehung gesetzt, um die in der Probe vorhandene Menge an Vitamin B&sub1;&sub2; zu ermitteln.
- Aus Gründen der Zweckmäßigkeit werden die Reagenzien häufig in Sets bereitgestellt, die in getrennten Behältern die Peroxysäure oder das Salz und ein Reduktionsmittel zur Verwendung als Vorbehandlung für Serumproben zur Verwendung bei einem Vitamin B&sub1;&sub2;-Assay umfassen, und als ein Vitamin B&sub1;&sub2;-Assayset, bei dem die/das Peroxysäure oder -salz und das Reduktionsmittel zusammen mit entweder einer markierten Vitamin B&sub1;&sub2;- Lösung, oder Bindungsprotein oder Bezugsproben vorhanden sind, die eine bekannte Menge an Vitamin B&sub1;&sub2; umfassen, gemeinsam mit irgendwelchen zusätzlichen Reagenzien, die für die Durchführung des Assays notwendig sind. Zweckmäßig können die Reagenzien in lyophilisierter Form bereitgestellt werden.
- Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
- 100 ul Peroxymonosulfat in Wasser, 200 mM Natrium- oder Kaliumphosphat mit pH 7,0 oder 200 mM Natriumzitrat mit pH 8,0 wurden zu 100 ul Serum hinzugefügt, das &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; enthielt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. 200 ul 100 mM Natriumsulfit in 500 mM Natrium- oder Kaliumphosphat mit pH 7,0 wurden dann hinzugefügt, um jegliches nichtreduzierte Peroxymonosulfat zu reduzieren. Die Inkubation erfolgte 30 Min. lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. 500 ul mit Humanserumalbumin beschichtete Holzkohle wurden hinzugefügt und die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde dann zentrifugiert, dekantiert, und das Pellet entwässert. Dann wurde die Menge an &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; im Pellet bestimmt. Peroxymonosulfat kann &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; freisetzen und Holzkohle kann zwischen 75 und 80% des freigesetzten B&sub1;&sub2; mit gepuffertem Reagens und zwischen 88 und 92% mit ungepuffertem Reagens ausfällen.Diese Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Ungepuffertes Peroxymonosulfat bewirkt, daß das Serum ausgefällt wird, und die höhere Freisetzung/Ausfällung in ungepuffertem Reagens kann von der Serumproteinausfällung und dem Einschließen von Markierung abhängig sein. ¹ Wenn nicht anders angegeben, betrug die ungefähre Konzentration von &sup5;&sup7;Co-Vitamin B&sub1;&sub2; in den Serumproben in allen Beispielen 0,22 ng/ml (Bereich 0,15 bis 0,25 ng/ml), und die ungefähre Konzentration an endogenem vitamin B&sub1;&sub2; (d.h. unmarkiert) 0,45 ng/ml. Tabelle 1 Freisetzung von Vitamin B&sub1;&sub2; aus Serum durch Peroxymonosulfat und Abtrennung durch HSA-Holzkohle % B&sub1;&sub2; freigesetzt und ausgefällt mM Peroxymonosulfat in Vorbehandlung Peroxymonosulfat in Wasser
- 100 ul Serum, das &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; enthielt, wurden für variable Zeiträume bei Raumtemperatur mit 100 ul 100 mM Peroxymonosulfat in Wasser, 200 mM Phosphat mit pH 7,0 oder 200 mm Natriumzitrat mit pH 8,0 inkubiert. 200 ul 100 mM Natriumsulfit in 500 mM Natrium- oder Kaliumphosphat mit pH 7,0 wurden dann hinzugefügt und die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. 500ul HSA-beschichtete Holzkohle wurden dann zugegeben und die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Probe wurde dann zentrifugiert, dekantiert, entwässert und &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; gezählt. Die maximale Freisetzung/Gewinnung von &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; wurde mit 10 Minuten bei Raumtemperatur erzielt. Dieses Ausmaß wurde bis zu mindestens 50 Minuten beibehalten. Diese Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Zeitverlauf der Freisetzung von Vitamin B&sub1;&sub2; aus Serum durch Peroxymonosulfat (50 mM) %B&sub1;&sub2; freigesetzt und ausgefällt 100 MM Peroxymonosulfat in Zeit (Min.) Wasser
- 200 ul Wasser, das &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; enthielt, wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 200 ul Reduktionsmittel inkubiert. Es wurden zwei Reduktionsmittelkonzentrationen eingesetzt, nämlich 25 mM und 5 mM 500 ul mit Humanserumalbumin beschichtete Holzkohle oder ein monoklonaler anti-B&sub1;&sub2;-Antikörper mit einem sekundären Antikörperausfällungsreagens (Polyäthylenglykol, PEG) wurden zugegeben und die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden dann zentrifugiert, dekantiert, entwässert und gezählt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, hatten weder Sulfit- noch sulfitfreie Reduktionsmittel eine bedeutsame Wirkung auf das Binden von &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; an Holzkohle. Reduktionsmittel auf Sulfitbasis (Natriumsulfit, Natriummetabisulfit und Natriumhydrosulfit) verringerten die Bindung von B&sub1;&sub2; durch Antikörper beträchtlich. Tabelle 3 Vergleich mehrerer Reduktionsmittel: Wirkung auf die Trenntechnik Konzentration % B&sub1;&sub2; freigesetzt und ausgefällt Reduktionsmittel HSA-Holzkohle Methionin Na-Sulfit Na-Metabisulfit Na-Phosphit Na-Arsenit Na-Hydrosulfit Dithiothreitol β-Mercaptoäthanol keines
- 100 ul Wasser und 100 ul Peroxymonosulfat in 200 mM Phosphat mit pH 7,0 wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 200 ul Dithiothreitol, 0-200 mM in 100 mM Phosphatpuffer, 0,01% BSA mit pH 7,5 wurden hinzugefügt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 50 ul &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; und 8 ul 50%ige Aufschlämmung aus Konjugat aus intrinsischem Faktor und Sepharose in 100 mM Phosphatpuffer, 0,01% BSA mit pH 7,5 wurden hinzugefügt und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schaukeln inkubiert. Die Lösungen wurden dann zentrifugiert und 300 ul des Überstands gezählt. Verhältnisse von 1/1 bis ¼ zwischen Peroxymonosulfat und Dithiothreitol für Peroxymonosulfatkonzentrationen von 50 mM oder weniger ermöglichen akzeptable Bindung von B&sub1;&sub2; an intrinsischen Faktor-Sepharose. Wenn das Peroxymonosulfat jedoch nicht wirksam durch Dithiothreitol reduziert ist, nimmt die Fraktion an freigesetztem und ausgefälltem B&sub1;&sub2; ab, was auf die Unfähigkeit von intrinsischem Faktor-Sepharose hinweist, den freigesetzten Tracer zu binden. Diese Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Fraktion von &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; freigesetzt und ausgefällt [DTT] Konzentration (mM) mit vorbehandelter Probe vorbehandelte Probe Peroxymonosulfatkonzentration (mM)
- 100 ul Probe (Wasser, Humanserum oder eine synthetische Matrix), der unmarkiertes Vitamin B&sub1;&sub2; mit variierenden Konzentrationen beigemischt war, wurden mit 100 ul 200 mM Natrium- oder Kaliumphosphat mit pH 7,0 mit oder ohne 50 mM Peroxymonosulfat 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 200 ul 100 mM Natrium- oder Kaliumphosphat, die 0,01% BSA mit pH 7,5 enthielten, mit oder ohne 50 mM Dithiothreitol wurden hinzugefügt und die Mischung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 50 ul &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; und 8 ul 50%ige Aufschlämmung von intrinsischem Faktor-Sepharose wurden hinzugefügt und die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden dann zentrifugiert und 300 ul Überstand gezählt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Die Wirkung von Peroxymonosulfat und Dithiothreitol auf die Freisetzung von B&sub1;&sub2; aus Matrixbindemitteln und neuerliche Bindung durch intrinsischen Faktor-Sepharose: Fraktion von &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; freigesetzt und ausgefällt Peroxymonosulfat Dithiothreitol Probe uMol Serum Synthetische Matrix
- Die Unterschiede zwischen den unbehandelten Proben und jenen, die sowohl Peroxymonosulfat als auch Dithiothreitol enthalten, weisen auf die Fähigkeit von Peroxymonosulfat hin, Vitamin B&sub1;&sub2; von endogenen Bindemitteln freizusetzen, und von intrinsischem Faktor-Sepharose, freies B&sub1;&sub2; im reduzierten System zu binden. Proben, die Peroxymonosulfat und kein Dithiothreitol enthalten, zeigen, daß Peroxymonosulfat die Bindung von B&sub1;&sub2; an intrinsischen Faktor-Sepharose stört. Die Ähnlichkeit zwischen den Peroxymonosulfatproben mit oder ohne Dithiothreitol weist darauf hin, daß das Reduktionsmittel die B&sub1;&sub2;-Bindung an intrinsischen Faktor-Sepharose unter diesen Bedingungen nicht stört.
- 100 ul Probe (Humanserum, das unmarkiertes B&sub1;&sub2; enthält, eine synthetische Matrix, die unmarkiertes B&sub1;&sub2; enthält oder eine Referenzlösung, die unmarkiertes B&sub1;&sub2; enthält) wurden mit 100 ul 50 mM Peroxymonosulfat in 200 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 200 ul 50 mM Dithiothreitol in 100 mM Phosphat, die 0,01% BSA mit pH 7,5 enthielten, wurden hinzugefügt und die Mischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 50 ul &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; und 8 ul 50%ige Aufschlämmung von intrinsischem Faktor-Sepharose wurden dann hinzugefügt und die Mischung 60 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schaukeln inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und 300 ul Überstand gezählt. Wie in Tabelle 6 gezeigt, wird durch die Vorbehandlungsvorschrift serumgebundenes B&sub1;&sub2; freigesetzt und Serumbindungsprotein zerstört, die Bindung von B&sub1;&sub2; durch intrinsischen Faktor- Sepharose aber nicht beeinträchtigt. Die synthetische Matrix und die Referenzlösungen enthalten keine bedeutsamen Mengen an Bindungsproteinen und es ist nur ein geringer Unterschied zwischen vorbehandelten und nicht vorbehandelten Proben zu erkennen. Tabelle 6 Bindung von B&sub1;&sub2; an IF-Sepharose nach der Vorbehandlung von Probe mit Peroxymonosulfat und Dithiothreitol: Frakton von B&sub1;&sub2; freigesetzt und ausgefällt mit (+) und ohne (-) Peroxymonosulfat Konzentration des hinzugefügten unmarkierten Serum Matrix Referenzproben
- 100 ul Probe (Wasser, synthetische Matrix oder Humanserum) wurden mit 100 ul 50 mM Peroxymonosulfat in 200 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 200 ul 50 mM Dithiothreitol in 100 mM Phosphatpuffer, der 0,01% BSA mit pH 7,5 enthielt, wurden hinzugefügt und die Proben bei Raumtemperatur über unterschiedliche Zeiträume inkubiert. 50 ul &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2; und 8 ul 50%ige Aufschlämmung von intrinsischem Faktor-Sepharose wurden unterschiedliche Zeiträume lang hinzugefügt und die Mischung bei Raumtemperatur unter Schaukeln inkubiert. Die Proben wurden dann zentrifugiert, und 300 ul Überstand wurde gezählt. Wie in Tabelle 7 gezeigt, erfolgt die Reduktion von Peroxymonosulfat offensichtlich sofort, was darauf hinweist, daß &sup5;&sup7;Co-B&sub1;&sub2;-Tracer oder der Komplex intrinsischer Faktor- Sepharose mit dem Dithiothreitol jeweils für kompetitive oder sequentielle Vorschriften kombiniert werden könnte. Tabelle 7 Wirkung der Zeit der Inkubation mit Dithiothreitol bei Bindung an IF-Sepharose*: Fraktion von B&sub1;&sub2; freigesetzt und ausgefällt Probe Zeit für DTT-Inkubation (Min.) Wasser Matrix Matrix + Serum *Alle Proben wurden 60 Minuten lang mit IF-Sepharose inkubiert.
- Wie in Tabelle 8 gezeigt, nähert sich die Bindungsreaktion von B&sub1;&sub2; mit intrinsischem Faktor-Sepharose durch 1 Stunde unter den verwendeten Bedingungen dem Abschluß. Tabelle 8 Wirkung der Zeit der Inkubation mit IF-Sepharose auf die B&sub1;&sub2;-Bindung an IF-Separose*: Fraktion von B&sub1;&sub2; freigesetzt und ausgefällt Probe Inkubationszeit mit IF-Seph(Min.) Wasser Matrix Matrix + Serum *Alle Proben wurden mit Dithiothreitol 15 Minuten lang inkubiert.
- Die vorliegenden Verfahren liefern einen raschen und einfachen Weg zur Vorbehandlung einer Serumprobe zur darauffolgenden Bestimmung der Vitamin B&sub1;&sub2;- Konzentration. Die Vorbehandlung kann vor einer Vielzahl von Radioassay- oder isotopenfreien Verfahren zur Messung von Vitamin B&sub1;&sub2; in Serum eingesetzt werden.
Claims (12)
1. Verfahren zur Vorbehandlung einer Serumprobe zur darauffolgenden Bestimmung
der Vitamin B&sub1;&sub2;-Konzentration darin, welches das In-Kontakt-Bringen der Probe mit
einem Oxidationsmittel umfaßt, das im wesentlichen aus einer Peroxysäure oder einem
Salz davon besteht, um Vitamin B&sub1;&sub2; von endogenen serumbindenden bzw.
Serumbindungsproteinen in der genannten Probe freizusetzen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, das nach dem In-Kontakt-Bringen das Hinzugeben einer
ausreichenden Menge an Reduktionsmittel zur oxidierten Serumprobe umfaßt, um
jegliche nicht reduzierte Peroxysäure im wesentlichen zu reduzieren.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das genannte Reduktionsmittel Dithiothreitol ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die genannte
Peroxysäure oder das Salz davon im wesentlichen aus Peroxymonosulfat oder
Peroxytrifluoressigsäure oder ihren Salzen besteht.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches den darauffolgenden
Schritt des Bestimmens der Vitamin B&sub1;&sub2;-Konzentration durch ein Assay umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, das den darauffolgenden Schritt des Bestimmens
der Vitamin B&sub1;&sub2;-Konzentration unter Verwendung eines für Vitamin B&sub1;&sub2; spezifischen
Bindungsproteins umfaßt.
7. Set zur Vorbehandlung einer Serumprobe zur Freisetzung von Vitamin B&sub1;&sub2; aus
endogenen Serumbindungsproteinen in der Probe, wobei das Set in getrennten
Behältern folgendes umfaßt:
(a) ein Oxidationsmittel, das im wesentlichen aus Peroxymonosulfat oder
Peroxytrifluoressigsäure oder ihren Salzen besteht; und
(b) ein Reduktionsmittel.
8. Freisetzungsagensset nach Anspruch 7, worin das genannte Reduktionsmittel
Dithiothreitol ist.
9. Vitamin B&sub1;&sub2;-Assayset, das als Komponenten für das genannte Assay folgendes umfaßt:
(a) ein Oxidationsmittel, das im wesentlichen aus Peroxymonosulfat oder
Peroxytrifluoressigsäure oder ihren Salzen besteht;
(b) Dithiothreitol; und
(c) zumindest eines aus i) einem Vitamin B&sub1;&sub2;-Bindungsprotein, ii) einem markierten
Vitamin B&sub1;&sub2;-Tracer, und iii) zumindest einer Bezugsprobe, die eine bekannte Vitamin
B&sub1;&sub2;-Konzentration enthält.
10. Vitamin B&sub1;&sub2;-Assayset nach Anspruch 9, worin das genannte Bindungsprotein
intrinsischer Faktor ist.
11. Vitamin B&sub1;&sub2;-Assayset nach Anspruch 10, worin der genannte intrinsische Faktor an
einen festen Träger gebunden ist.
12. Vitamin B&sub1;&sub2;-Assayset nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin die genannten
Komponenten lyophilisiert sind.
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