JPH06347460A - アルキル化剤を用いる試料中のアナライトのイムノアッセイ - Google Patents
アルキル化剤を用いる試料中のアナライトのイムノアッセイInfo
- Publication number
- JPH06347460A JPH06347460A JP6103705A JP10370594A JPH06347460A JP H06347460 A JPH06347460 A JP H06347460A JP 6103705 A JP6103705 A JP 6103705A JP 10370594 A JP10370594 A JP 10370594A JP H06347460 A JPH06347460 A JP H06347460A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- analyte
- immunoassay
- sample
- alkylating agent
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 アナライトの検出を妨害する抗体を含有する
試料中のアナライトのイムノアッセイにおける妨害を防
止した、改良されたイムノアッセイおよびそのためのキ
ットを開発する。 【構成】 試料をアルキル化剤で前処理して、試料中の
抗体を、アナライト検出の妨害ができないように修飾す
る。イムノアッセイを実施する前にアルキル化剤を不活
化し、イムノアッセイの妨害を避ける。 【効果】 迅速、高感度で、かつ厳しい加水分解なし
に、アナライトの検出を妨害する抗体含有試料中のアナ
ライトのイムノアッセイが行える。
試料中のアナライトのイムノアッセイにおける妨害を防
止した、改良されたイムノアッセイおよびそのためのキ
ットを開発する。 【構成】 試料をアルキル化剤で前処理して、試料中の
抗体を、アナライト検出の妨害ができないように修飾す
る。イムノアッセイを実施する前にアルキル化剤を不活
化し、イムノアッセイの妨害を避ける。 【効果】 迅速、高感度で、かつ厳しい加水分解なし
に、アナライトの検出を妨害する抗体含有試料中のアナ
ライトのイムノアッセイが行える。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は患者の試料中の、アナラ
イト（analyte）の存在の検出または量の測定用の改良
されたイムノアッセイ（immunoassay）に関する。さら
に詳しくは、本発明は、内因性抗体を含有する試料中の
アナライト検出に、中性またはアルカリｐＨにてアルキ
ル化剤を使用する改良されたイムノアッセイ方法に関す
る。
イト（analyte）の存在の検出または量の測定用の改良
されたイムノアッセイ（immunoassay）に関する。さら
に詳しくは、本発明は、内因性抗体を含有する試料中の
アナライト検出に、中性またはアルカリｐＨにてアルキ
ル化剤を使用する改良されたイムノアッセイ方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】過去２０年以上に亙って、患者の試料中
における個々のアナライトの存在を測定するのに有用な
イムノアッセイまたは免疫細胞化学的検定法が発達して
きた。典型的なイムノアッセイにおいては、検定試薬は
検出可能なシグナルを生じることのできる化合物で標識
され、個々のアナライトを含有すると思われる患者の試
料と合される。標識された検定試薬は、試薬中のアナラ
イトに関連した量でアナライトと結合する。血清試料中
を循環する内因性抗アナライト抗体および抗体とアナラ
イトの免疫複合体がアナライト検出イムノアッセイを妨
害することが判明した。米国特許第４,７０３,００１号
は、酸性ｐＨで血清試料とｐＨ依存性カオトロープ（ch
aotrope）と接触させることからなる、血清試料中の酸
安定性アナライトのイムノアッセイ用の、免疫複合体の
解離および抗アナライト抗体の変性のための前処理法を
開示している。同様に、ピイ・ニサニアンら［P. Nisha
nian et al., J. Infect. Dis., １６２：２１−２８
（１９９０）］は、アナライト−抗ＨＩＶ抗体免疫複合
体を解離させ、抗ＨＩＶ抗体を変性させるために使用す
る酸加水分解血清試料前処理法を開示している。しかし
ながら、抗ＨＩＶ抗体を完全に変性させるには、テスト
血清を０．５Ｎ ＨＣｌ溶液で、３７℃にて６０分処理
する必要がある。
における個々のアナライトの存在を測定するのに有用な
イムノアッセイまたは免疫細胞化学的検定法が発達して
きた。典型的なイムノアッセイにおいては、検定試薬は
検出可能なシグナルを生じることのできる化合物で標識
され、個々のアナライトを含有すると思われる患者の試
料と合される。標識された検定試薬は、試薬中のアナラ
イトに関連した量でアナライトと結合する。血清試料中
を循環する内因性抗アナライト抗体および抗体とアナラ
イトの免疫複合体がアナライト検出イムノアッセイを妨
害することが判明した。米国特許第４,７０３,００１号
は、酸性ｐＨで血清試料とｐＨ依存性カオトロープ（ch
aotrope）と接触させることからなる、血清試料中の酸
安定性アナライトのイムノアッセイ用の、免疫複合体の
解離および抗アナライト抗体の変性のための前処理法を
開示している。同様に、ピイ・ニサニアンら［P. Nisha
nian et al., J. Infect. Dis., １６２：２１−２８
（１９９０）］は、アナライト−抗ＨＩＶ抗体免疫複合
体を解離させ、抗ＨＩＶ抗体を変性させるために使用す
る酸加水分解血清試料前処理法を開示している。しかし
ながら、抗ＨＩＶ抗体を完全に変性させるには、テスト
血清を０．５Ｎ ＨＣｌ溶液で、３７℃にて６０分処理
する必要がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】蛋白質またはペプチド
抗原について行われているごとく、また、上記のごと
く、酸加水分解は正確な結果を与えうるが、常に、かか
る結果をより迅速に、より高感度で得ることが要望され
ている。また、そのような過酷な酸加水分解はある種の
アナライトには許容できない。例えば、ある種の微生物
のリポ多糖類（ＬＰＳ）の２−ケト−３−デオキシオク
ツロソン酸（２-keto-３-deoxyoctulosonicacid：ＫＤ
Ｏ）糖はそのような処理により加水分解され、その抗原
性活性が破壊される。したがって、患者の試料中に存在
する内因性抗体を、アナライトの抗原性に影響を及ぼす
ことなく、７．０より大きいｐＨ、好ましくはアルカリ
性ｐＨにて不可逆的に変性できるイムノアッセイ法を提
供することが要望されている。
抗原について行われているごとく、また、上記のごと
く、酸加水分解は正確な結果を与えうるが、常に、かか
る結果をより迅速に、より高感度で得ることが要望され
ている。また、そのような過酷な酸加水分解はある種の
アナライトには許容できない。例えば、ある種の微生物
のリポ多糖類（ＬＰＳ）の２−ケト−３−デオキシオク
ツロソン酸（２-keto-３-deoxyoctulosonicacid：ＫＤ
Ｏ）糖はそのような処理により加水分解され、その抗原
性活性が破壊される。したがって、患者の試料中に存在
する内因性抗体を、アナライトの抗原性に影響を及ぼす
ことなく、７．０より大きいｐＨ、好ましくはアルカリ
性ｐＨにて不可逆的に変性できるイムノアッセイ法を提
供することが要望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】患者の試料中のアナライ
ト分析用のイムノアッセイは、内因性抗体を修飾して抗
体によるアナライト検出の妨害を減少または防止するた
めの試料前処理により著しく改善できる。上記のごと
く、かかる抗体および免疫複合体は多くのイムノアッセ
イのアナライト特異性結合工程を妨害する。本発明の試
料前処理工程は７．０より大きいｐＨ、好ましくは８．
０より大きいアルカリ性ｐＨにて活性なアルキル化剤を
用いる。本発明のアルキル化剤は中性またはアルカリ性
ｐＨで活性であり、アナライトの抗原性に影響を及ぼさ
ない。望ましくは、該アルキル化剤は、抗体のリジン、
アルギニンまたは一級アミノ基に作用して抗体上の基を
修飾し、アナライト検出妨害を防止する。限定するもの
ではないが、かかるアルキル化剤には、グルタルアルデ
ヒド、ホルムアルデヒド、ｏ−メチルイソウレア、シク
ロヘキサンジオン、ブタンジオンまたはＳ−アセチルチ
オグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが包含さ
れる。
ト分析用のイムノアッセイは、内因性抗体を修飾して抗
体によるアナライト検出の妨害を減少または防止するた
めの試料前処理により著しく改善できる。上記のごと
く、かかる抗体および免疫複合体は多くのイムノアッセ
イのアナライト特異性結合工程を妨害する。本発明の試
料前処理工程は７．０より大きいｐＨ、好ましくは８．
０より大きいアルカリ性ｐＨにて活性なアルキル化剤を
用いる。本発明のアルキル化剤は中性またはアルカリ性
ｐＨで活性であり、アナライトの抗原性に影響を及ぼさ
ない。望ましくは、該アルキル化剤は、抗体のリジン、
アルギニンまたは一級アミノ基に作用して抗体上の基を
修飾し、アナライト検出妨害を防止する。限定するもの
ではないが、かかるアルキル化剤には、グルタルアルデ
ヒド、ホルムアルデヒド、ｏ−メチルイソウレア、シク
ロヘキサンジオン、ブタンジオンまたはＳ−アセチルチ
オグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが包含さ
れる。
【０００５】イムノアッセイを行うに先立ち、該アルキ
ル化剤は不活化され、イムノアッセイの試薬に影響を及
ぼさない。アルキル化剤を不活化する手段は使用するア
ルキル化剤により変わる。本発明で有用なアルキル化剤
の１つのタイプはアルカリ性ｐＨで活性であり、中性ｐ
Ｈで不活性である。このタイプのアルキル化剤は、アル
カリ性洗剤溶液でのアナライト抽出のための試料前処理
の必要な試料中に存在するアナライトの検出に特に有用
である。１つの具体例において、クラミジアＬＰＳまた
は同様な抗原のイムノアッセイに先立ち、アルカリ洗剤
抽出に続いてアルキル化剤で前処理される。該アルキル
化剤は試料溶液の中和前に添加する。好ましい具体例で
は、アルカリ洗剤抽出後、アルカリ性ｐＨでのみ活性な
アルキル化剤を添加し、試料溶液と共に、内因性抗体が
イムノアッセイの間、アナライト検出を妨害できないよ
うに修飾するに十分な時間インキュベートされる。アル
キル化剤はアナライトの抽出に使用する他の試薬と適合
するように選択すべきである。インキュベーションの
後、試料溶液を中和してアルキル化剤を不活化し、イム
ノアッセイを行う。
ル化剤は不活化され、イムノアッセイの試薬に影響を及
ぼさない。アルキル化剤を不活化する手段は使用するア
ルキル化剤により変わる。本発明で有用なアルキル化剤
の１つのタイプはアルカリ性ｐＨで活性であり、中性ｐ
Ｈで不活性である。このタイプのアルキル化剤は、アル
カリ性洗剤溶液でのアナライト抽出のための試料前処理
の必要な試料中に存在するアナライトの検出に特に有用
である。１つの具体例において、クラミジアＬＰＳまた
は同様な抗原のイムノアッセイに先立ち、アルカリ洗剤
抽出に続いてアルキル化剤で前処理される。該アルキル
化剤は試料溶液の中和前に添加する。好ましい具体例で
は、アルカリ洗剤抽出後、アルカリ性ｐＨでのみ活性な
アルキル化剤を添加し、試料溶液と共に、内因性抗体が
イムノアッセイの間、アナライト検出を妨害できないよ
うに修飾するに十分な時間インキュベートされる。アル
キル化剤はアナライトの抽出に使用する他の試薬と適合
するように選択すべきである。インキュベーションの
後、試料溶液を中和してアルキル化剤を不活化し、イム
ノアッセイを行う。
【０００６】１つの具体例において、測定すべきアナラ
イトは酸感受性である。本発明の目的にとって、「酸感
受性」なる語は、ｐＨ３．０以下の溶液中でインキュベ
ートすると、その抗原性を失うアナライトを意味する。
本発明の目的にとって、特に限定するものではないが、
酸感受性アナライトには、クラミジア・トラコマティス
（Chlamydia trachomatis）、クラミジア・プシッタチ
（Chlamydia psittaci）、サルモネラ・チフィムリウム
（Salmonella typhimurium）、ナイセリア・ゴーノロー
エア（Neisseria gonorrhoeae）およびエシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）からの、ＫＤＯ部分を有する
ＬＰＳ抗原が包含される。特に好ましい具体例において
は、ＬＰＳについてのイムノアッセイは、抗原抽出工程
の後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と合したアルキル
化剤を添加して行われる。ＤＴＴは粘液溶解剤であると
共にシステインと結合する化学的修飾剤である。アルキ
ル化剤と組み合わせてＤＴＴを使用することは、長時間
に亙りシグナルの安定性を増強し、検定の感度を増加さ
せる。
イトは酸感受性である。本発明の目的にとって、「酸感
受性」なる語は、ｐＨ３．０以下の溶液中でインキュベ
ートすると、その抗原性を失うアナライトを意味する。
本発明の目的にとって、特に限定するものではないが、
酸感受性アナライトには、クラミジア・トラコマティス
（Chlamydia trachomatis）、クラミジア・プシッタチ
（Chlamydia psittaci）、サルモネラ・チフィムリウム
（Salmonella typhimurium）、ナイセリア・ゴーノロー
エア（Neisseria gonorrhoeae）およびエシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）からの、ＫＤＯ部分を有する
ＬＰＳ抗原が包含される。特に好ましい具体例において
は、ＬＰＳについてのイムノアッセイは、抗原抽出工程
の後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と合したアルキル
化剤を添加して行われる。ＤＴＴは粘液溶解剤であると
共にシステインと結合する化学的修飾剤である。アルキ
ル化剤と組み合わせてＤＴＴを使用することは、長時間
に亙りシグナルの安定性を増強し、検定の感度を増加さ
せる。
【０００７】本発明のもう１つ別の具体例には、アナラ
イト検出を妨害する内因性抗体を含有する患者試料中の
アナライトの検定に使用するイムノアッセイ・キットが
包含される。このキットは、試料のイムノアッセイを行
ってアナライトを検定するためのイムノアッセイ試薬
と、ｐＨ７．０以上において抗体上の基をアルキル化
し、内因性抗体がアナライト検出を妨害するのを防ぐ能
力のあるアルキル化剤とからなる。キットはさらに、ア
ルキル化剤を不活化して、それ以上抗体を修飾しないよ
うにできる不活化剤が含まれる。１つの具体例におい
て、アルキル化剤がアルカリ性ｐＨでのみ活性である場
合、不活化剤は中和剤である。
イト検出を妨害する内因性抗体を含有する患者試料中の
アナライトの検定に使用するイムノアッセイ・キットが
包含される。このキットは、試料のイムノアッセイを行
ってアナライトを検定するためのイムノアッセイ試薬
と、ｐＨ７．０以上において抗体上の基をアルキル化
し、内因性抗体がアナライト検出を妨害するのを防ぐ能
力のあるアルキル化剤とからなる。キットはさらに、ア
ルキル化剤を不活化して、それ以上抗体を修飾しないよ
うにできる不活化剤が含まれる。１つの具体例におい
て、アルキル化剤がアルカリ性ｐＨでのみ活性である場
合、不活化剤は中和剤である。
【０００８】本発明の試薬および方法は、眼、鼻の裏の
鼻孔、勁管、膣、尿道、直腸、咽喉、血液、血清、血
漿、尿などから常法により得られた患者の検体に使用で
きる。本発明の試薬および前処理方法は、内因性抗体の
存在がアナライト検出を妨害するいずれのイムノアッセ
イでも使用できるが、特に、低いｐＨで安定でないアナ
ライトに有用である。本発明の前処理方法を使用する
と、多くの異なったイムノアッセイの実施を促進でき
る。例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ法を採
用するイムノアッセイ、蛍光および化学ルミネッセンス
標識を包含する種々の標識を用いるイムノアッセイ等が
挙げられる。これらの１つのイムノアッセイには、抽出
され、中和された試料溶液を、マイクロプレート・ウエ
ル、ビーズ、粒子、試験管等のごとき固相上に固定化さ
れた当該アナライトに対するモノクローナル抗体と接触
させ、インキュベートし、試料中のアナライトの量に比
例した量で固相と結合する標識したポリクローナル抗体
を添加し、インキュベートし、標識を検出する工程が包
含される。
鼻孔、勁管、膣、尿道、直腸、咽喉、血液、血清、血
漿、尿などから常法により得られた患者の検体に使用で
きる。本発明の試薬および前処理方法は、内因性抗体の
存在がアナライト検出を妨害するいずれのイムノアッセ
イでも使用できるが、特に、低いｐＨで安定でないアナ
ライトに有用である。本発明の前処理方法を使用する
と、多くの異なったイムノアッセイの実施を促進でき
る。例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ法を採
用するイムノアッセイ、蛍光および化学ルミネッセンス
標識を包含する種々の標識を用いるイムノアッセイ等が
挙げられる。これらの１つのイムノアッセイには、抽出
され、中和された試料溶液を、マイクロプレート・ウエ
ル、ビーズ、粒子、試験管等のごとき固相上に固定化さ
れた当該アナライトに対するモノクローナル抗体と接触
させ、インキュベートし、試料中のアナライトの量に比
例した量で固相と結合する標識したポリクローナル抗体
を添加し、インキュベートし、標識を検出する工程が包
含される。
【０００９】個々のイムノアッセイに有用なアルキル化
剤の量および濃度は試料タイプ、すなわち、血清または
泌尿生殖器スワブ（swab）、他のイムノアッセイ試薬の
濃度、アナライトのタイプおよび前処理を行う温度によ
って変わる。微生物の存在を検出するある種のイムノア
ッセイにおいては、検出すべきアナライトは、クラミジ
ア抗原のような、上記のごとき酸感受性ＬＰＳである。
典型的には、そのようなクラミジア抗原および同様な抗
原の検定においては、患者試料をアルカリ金属またはア
ルカリ土類金属イオンを含む洗剤溶液で前処理する。こ
の抽出工程の間、内因性抗アナライト抗体は部分的に変
性または撹乱される。しかしながら、一旦、試料溶液が
中和されると、時間の経過と共に、内因性抗体は再生さ
れ、イムノアッセイの間のアナライトの抗体試薬への結
合を妨害してアナライトの認識を阻止する。以下の作用
機構に束縛されるものではないが、該アルキル化剤は、
部分的に変性または撹乱された抗体上の基と反応してイ
ムノアッセイの間、抗体の再生を防止しているものと考
えられる。
剤の量および濃度は試料タイプ、すなわち、血清または
泌尿生殖器スワブ（swab）、他のイムノアッセイ試薬の
濃度、アナライトのタイプおよび前処理を行う温度によ
って変わる。微生物の存在を検出するある種のイムノア
ッセイにおいては、検出すべきアナライトは、クラミジ
ア抗原のような、上記のごとき酸感受性ＬＰＳである。
典型的には、そのようなクラミジア抗原および同様な抗
原の検定においては、患者試料をアルカリ金属またはア
ルカリ土類金属イオンを含む洗剤溶液で前処理する。こ
の抽出工程の間、内因性抗アナライト抗体は部分的に変
性または撹乱される。しかしながら、一旦、試料溶液が
中和されると、時間の経過と共に、内因性抗体は再生さ
れ、イムノアッセイの間のアナライトの抗体試薬への結
合を妨害してアナライトの認識を阻止する。以下の作用
機構に束縛されるものではないが、該アルキル化剤は、
部分的に変性または撹乱された抗体上の基と反応してイ
ムノアッセイの間、抗体の再生を防止しているものと考
えられる。
【００１０】ＬＰＳのイムノアッセイに特に有用なアル
キル化剤の１つのタイプは、アルカリ性ｐＨ、例えば、
８．０より大きいｐＨにおいてのみ活性であり、中性ま
たは酸性ｐＨで不活性なものである。このタイプのアル
キル化剤には、特に限定するものではないが、グルタル
アルデヒド、ホルムアルデヒド、ｏ−メチルイソウレ
ア、シクロヘキサンジオンおよびブタンジオンが包含さ
れる。典型的なイムノアッセイは中性ｐＨで行われ、検
定の実施を妨げないので、これらの試薬が特に好まし
い。本発明のもう１つ別のタイプのアルキル化剤は中性
ｐＨ（ｐＨ７．０−８．０）で活性で、トリスのような
三級アミンまたはグリシンのような一級アミンのごとき
アミノ基を有する第２の試薬の添加で不活化できるもの
である。このタイプのアルキル化剤には、特に限定する
ものではないが、Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドが包含される。
キル化剤の１つのタイプは、アルカリ性ｐＨ、例えば、
８．０より大きいｐＨにおいてのみ活性であり、中性ま
たは酸性ｐＨで不活性なものである。このタイプのアル
キル化剤には、特に限定するものではないが、グルタル
アルデヒド、ホルムアルデヒド、ｏ−メチルイソウレ
ア、シクロヘキサンジオンおよびブタンジオンが包含さ
れる。典型的なイムノアッセイは中性ｐＨで行われ、検
定の実施を妨げないので、これらの試薬が特に好まし
い。本発明のもう１つ別のタイプのアルキル化剤は中性
ｐＨ（ｐＨ７．０−８．０）で活性で、トリスのような
三級アミンまたはグリシンのような一級アミンのごとき
アミノ基を有する第２の試薬の添加で不活化できるもの
である。このタイプのアルキル化剤には、特に限定する
ものではないが、Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドが包含される。
【００１１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、これらに限定されるものではない。 実施例１ クラミジア・イムノアッセイ 前処理およびイムノアッセイの実施にコールスタット・
パソファインダー（Kallestad Pathfinder、登録商標）
・クラミジア・マイクロプレート・キットを使用した。
コールスタット・パソファインダー・クラミジア・マイ
クロプレート・キットは：０．１Ｎ ＮａＯＨ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍｇ／ｍｌアリザリン・イエロー（２
−ヒドロキシ−５−［（４−ニトロフェニル）アゾ］安
息香酸（１０．２以下の中性ｐＨで黄色、ｐＨ１２で赤
色の染料）および０．０５％の３−［（３−クロルアミ
ドプロピル）ジアメチルアミノ−ｏ］−１−プロパンス
ルホネート（ＣＨＡＰＳ）を含む試料処理溶液Ａ（ＳＴ
Ｓ Ａ）、１．０Ｎ ＨＣｌ、２Ｍトリス塩基、３％Ｈ
2Ｏ2を含む試料処理溶液Ｂ（ＳＴＳ Ｂ）を含んでい
た。
説明するが、これらに限定されるものではない。 実施例１ クラミジア・イムノアッセイ 前処理およびイムノアッセイの実施にコールスタット・
パソファインダー（Kallestad Pathfinder、登録商標）
・クラミジア・マイクロプレート・キットを使用した。
コールスタット・パソファインダー・クラミジア・マイ
クロプレート・キットは：０．１Ｎ ＮａＯＨ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍｇ／ｍｌアリザリン・イエロー（２
−ヒドロキシ−５−［（４−ニトロフェニル）アゾ］安
息香酸（１０．２以下の中性ｐＨで黄色、ｐＨ１２で赤
色の染料）および０．０５％の３−［（３−クロルアミ
ドプロピル）ジアメチルアミノ−ｏ］−１−プロパンス
ルホネート（ＣＨＡＰＳ）を含む試料処理溶液Ａ（ＳＴ
Ｓ Ａ）、１．０Ｎ ＨＣｌ、２Ｍトリス塩基、３％Ｈ
2Ｏ2を含む試料処理溶液Ｂ（ＳＴＳ Ｂ）を含んでい
た。
【００１２】以下に記載するイムノアッセイの前に行う
抽出方法は、ＳＴＳ Ａ１．０ｍｌを試料０．１ｍｌに
添加し、１０分間インキュベートし、３０秒撹拌する工
程を含んでいた。ついで、本発明のアルキル化剤の効果
を測定するため、アルキル化剤または緩衝液０．１ｍｌ
を添加し、１０秒間撹拌し、１０分間インキュベートし
た。イムノアッセイを行う前に、ＳＴＳ Ｂ０．１ｍｌ
を加え、試料溶液を１０秒間撹拌した。抽出後、以下の
とおり、コールスタット・パソファインダー・マイクロ
プレート・キットを用いてイムノアッセイを行った。抽
出試料１００μｌずつを、クラミジア抗体に体するモノ
クローナル抗体の結合した各パソファインダー・マイク
ロプレート・ウエルに加えた。プレートを、ＳＴＡＴ−
ＦＡＸ振盪インキュベーター（Awareness Technologies
製）で２６℃にて３０分間インキュベートした。各ウエ
ルに、ポリクローナル・ウサギ抗クラミジア抗体試薬５
０μｌを加え、プレートをＳＴＡＴ−ＦＡＸ２２００で
２６℃にて３０分間インキュベートした。ついで、ヤギ
抗ウサギと複合した西洋ワサビ・パーオキシダーゼ５０
μｌを各ウエルに加え、プレートをＳＴＡＴ−ＦＡＸ２
２００で２６℃にて３０分間インキュベートした。ＬＰ
−３５マイクロプレート・ウォシャー（フランス、Diag
nostics Pasteur製）でプレートのウエルを５回洗浄
し、各ウエルに緩衝液中ｏ−フェニレンジアミン１００
μｌを加え、プレートを暗所で３０分間インキュベート
した。４ＮＨ2ＳＯ4からなる停止溶液１００μｌを加
え、ＬＰ−４００マイクロプレート・リーダー（フラン
ス、Diagnostics Pasteur製）でＯＤ４９２／６２０に
てマイクロプレートを読み取った。
抽出方法は、ＳＴＳ Ａ１．０ｍｌを試料０．１ｍｌに
添加し、１０分間インキュベートし、３０秒撹拌する工
程を含んでいた。ついで、本発明のアルキル化剤の効果
を測定するため、アルキル化剤または緩衝液０．１ｍｌ
を添加し、１０秒間撹拌し、１０分間インキュベートし
た。イムノアッセイを行う前に、ＳＴＳ Ｂ０．１ｍｌ
を加え、試料溶液を１０秒間撹拌した。抽出後、以下の
とおり、コールスタット・パソファインダー・マイクロ
プレート・キットを用いてイムノアッセイを行った。抽
出試料１００μｌずつを、クラミジア抗体に体するモノ
クローナル抗体の結合した各パソファインダー・マイク
ロプレート・ウエルに加えた。プレートを、ＳＴＡＴ−
ＦＡＸ振盪インキュベーター（Awareness Technologies
製）で２６℃にて３０分間インキュベートした。各ウエ
ルに、ポリクローナル・ウサギ抗クラミジア抗体試薬５
０μｌを加え、プレートをＳＴＡＴ−ＦＡＸ２２００で
２６℃にて３０分間インキュベートした。ついで、ヤギ
抗ウサギと複合した西洋ワサビ・パーオキシダーゼ５０
μｌを各ウエルに加え、プレートをＳＴＡＴ−ＦＡＸ２
２００で２６℃にて３０分間インキュベートした。ＬＰ
−３５マイクロプレート・ウォシャー（フランス、Diag
nostics Pasteur製）でプレートのウエルを５回洗浄
し、各ウエルに緩衝液中ｏ−フェニレンジアミン１００
μｌを加え、プレートを暗所で３０分間インキュベート
した。４ＮＨ2ＳＯ4からなる停止溶液１００μｌを加
え、ＬＰ−４００マイクロプレート・リーダー（フラン
ス、Diagnostics Pasteur製）でＯＤ４９２／６２０に
てマイクロプレートを読み取った。
【００１３】実施例２ 酸感受性アナライト 上記のごとく、前処理法はリポ多糖類のような酸感受性
アナライトに特に好ましい。本発明者らは、試料を酸で
処理した場合にＬＰＳの抗原性が影響されるが、塩基で
処理した場合には影響されなかったことを証明した。 酸処理：ＳＴＳ Ａ：ＳＴＳ Ｂ（１０：１）中のクラ
ミジア抗原１ｍｌを４Ｍ Ｈ3ＰＯ4 ３０ｍｌ（ｐＨ
２．３）で処理し、９０分間反応させ、ついで２Ｎ Ｎ
ａＯＨ ７．０μｌ（ｐＨ８．１）で中和した。 塩基処理：ＳＴＳ Ａ：ＳＴＳ Ｂ（１０：１）中のク
ラミジア抗原１ｍｌを２Ｎ ＮａＯＨ ７０μｌ（ｐＨ
１２．５）で処理し、９０分間反応させ、ついで４Ｍ
Ｈ3ＰＯ4 ３０μｌ（ｐＨ２．３）で中和した。 酸および塩基処理の結果を表１に示す。
アナライトに特に好ましい。本発明者らは、試料を酸で
処理した場合にＬＰＳの抗原性が影響されるが、塩基で
処理した場合には影響されなかったことを証明した。 酸処理：ＳＴＳ Ａ：ＳＴＳ Ｂ（１０：１）中のクラ
ミジア抗原１ｍｌを４Ｍ Ｈ3ＰＯ4 ３０ｍｌ（ｐＨ
２．３）で処理し、９０分間反応させ、ついで２Ｎ Ｎ
ａＯＨ ７．０μｌ（ｐＨ８．１）で中和した。 塩基処理：ＳＴＳ Ａ：ＳＴＳ Ｂ（１０：１）中のク
ラミジア抗原１ｍｌを２Ｎ ＮａＯＨ ７０μｌ（ｐＨ
１２．５）で処理し、９０分間反応させ、ついで４Ｍ
Ｈ3ＰＯ4 ３０μｌ（ｐＨ２．３）で中和した。 酸および塩基処理の結果を表１に示す。
【００１４】
【表１】 プレインキュ 臨床プール1 臨床プール2 EB3.4×105 EB1.72×105 ベーション条件 OD492/620 OD492/620 OD492/620 OD492/620 未処理 0.135 2.775 0.361 0.254 酸処理 ０．０８７ ０．４０
１ ０．２４７ ０．１６８ 塩基処理 ０．３０３ １．８７３
０．４３１ ０．２１３
１ ０．２４７ ０．１６８ 塩基処理 ０．３０３ １．８７３
０．４３１ ０．２１３
【００１５】ＥＢ：基本小体（elementary body） 実施例３ アルキル化剤 内因性抗体の修飾およびＥＩＡシグナルの増強における
種々のアルキル化剤の効果を、血清陽性血漿（血漿中の
ヒト抗クラミジア）およびウマ抗クラミジアモデルで証
明した。ヒト抗クラミジア血清陽性血漿または免疫親和
性精製ウマ抗クラミジアを、クラミジア・トラコマティ
スの基本小体（血液型亜型Ｌ２、通常１．５×１０6Ｅ
Ｂ／ｍｌ最終）と混合し、実施例１と同様にして抽出し
た。各アルキル化剤の効果を緩衝液のみで処理した試料
との比較で評価した。表２に示すごとく、ＳＴＳ Ｂ中
の中和剤を添加してアルキル化剤を不活化した後、緩衝
液のみでの処理と比較して、アルキル化剤であるグルタ
ルアルデヒドおよびシクロヘキサンジオンを用いると、
０時間においてアナライト検出の即時促進が認められ
た。
種々のアルキル化剤の効果を、血清陽性血漿（血漿中の
ヒト抗クラミジア）およびウマ抗クラミジアモデルで証
明した。ヒト抗クラミジア血清陽性血漿または免疫親和
性精製ウマ抗クラミジアを、クラミジア・トラコマティ
スの基本小体（血液型亜型Ｌ２、通常１．５×１０6Ｅ
Ｂ／ｍｌ最終）と混合し、実施例１と同様にして抽出し
た。各アルキル化剤の効果を緩衝液のみで処理した試料
との比較で評価した。表２に示すごとく、ＳＴＳ Ｂ中
の中和剤を添加してアルキル化剤を不活化した後、緩衝
液のみでの処理と比較して、アルキル化剤であるグルタ
ルアルデヒドおよびシクロヘキサンジオンを用いると、
０時間においてアナライト検出の即時促進が認められ
た。
【００１６】
【表２】 処 理 抽出後０時間 抽出後１２０時間 ％変化 OD492/620 OD492/620 緩衝液 1.479±0.086 0.938±0.048 37%低下 1%グルタルアルデヒド 1.821±0.035 1.734±0.073 4%低下 1%グルタルアルデヒド/25mMDTT 1.895±0.078 1.975±0.129 4%増加 50mMシクロヘキサンジオン 1.851±0.031 1.546±0.009 17%低下 50mMシクロヘキサンジオン/25mM 2.379±0.137 2.488±0.059 4%増加 DTT 25mMDTT 1.977±0.051 2.241±0.059 13%増加
【００１７】表２に示した結果は、アルキル化剤なしで
のアルカリ性抽出のみでも抗クラミジア抗体を撹乱し、
アナライト検出の干渉を少なくできることを示してい
る。しかし、緩衝液のみでは、経時により、アルカリに
より撹乱された抗体が試料中で再生し、パソファインダ
ー・フォーマット中の抗原の捕獲または検出を干渉して
ＥＩＡシグナルを中和する。表２に示すとおり、抽出
後、０時間で、緩衝液処理試料は、ＤＴＴと併用および
併用せずの１％グルタルアルデヒド存在下で抽出した試
料のＯＤより、各々、２０％および２２％低いＯＤを有
する。抽出後、１２０時間で、緩衝液のみの存在下で抽
出した試料は、１％グルタルアルデヒドおよび、わずか
に低下した５０ｍＭシクロヘキサンジオンでの抽出と比
較して３７％低下している。２５ｍＭＤＴＴをグルタル
アルデヒドおよびシクロヘキサンジオンと組み合わせる
と、０時から、わずかにシグナルが増加する。
のアルカリ性抽出のみでも抗クラミジア抗体を撹乱し、
アナライト検出の干渉を少なくできることを示してい
る。しかし、緩衝液のみでは、経時により、アルカリに
より撹乱された抗体が試料中で再生し、パソファインダ
ー・フォーマット中の抗原の捕獲または検出を干渉して
ＥＩＡシグナルを中和する。表２に示すとおり、抽出
後、０時間で、緩衝液処理試料は、ＤＴＴと併用および
併用せずの１％グルタルアルデヒド存在下で抽出した試
料のＯＤより、各々、２０％および２２％低いＯＤを有
する。抽出後、１２０時間で、緩衝液のみの存在下で抽
出した試料は、１％グルタルアルデヒドおよび、わずか
に低下した５０ｍＭシクロヘキサンジオンでの抽出と比
較して３７％低下している。２５ｍＭＤＴＴをグルタル
アルデヒドおよびシクロヘキサンジオンと組み合わせる
と、０時から、わずかにシグナルが増加する。
【００１８】実施例４ グルタルアルデヒド クラミジア基本小体調製物を種々の濃度のウマ抗クラミ
ジア（Ｅｑ Ｘ Ｃ）と混合し、洗剤で抽出後、１％グル
タルアルデヒド／２５ｍＭ ＤＴＴまたは緩衝液で前処
理し、上記のＥＩＡ法を実施した。図１に示すごとく、
アルキル化／架橋グルタルアルデヒドで前処理した試料
（＋ＲＧＮＴ）は０時（抽出後）、中和活性の限界に近
い０．２μｇ／ｍｌを除き、ウマ抗クラミジアの全ての
濃度で著しいシグナルの増加を示す。ヒト抗クラミジア
（ＰＬ）は、グルタルアルデヒド不存在下（−ＲＧＮ
Ｔ）で１．６μｇ／ｍｌのウマ抗クラミジアとほぼ同等
の中和効果を示す。ウマまたはヒト抗クラミジアのＥＩ
Ａ示シグナル発生に対する影響を抽出後の幾つかの時点
で評価した。図２のＯＤ増加から明らかなように、グル
タルアルデヒドの不存在下、抽出後０時における検定感
度は、抽出後２４または４８時間より非常に大きい。図
３に示すごとく、グルタルアルデヒド／ＤＴＴの存在
下、長時間に亙って該差異は増大せず、クラミジア抗原
の全検出はウマ抗クラミジアによって阻止されなかっ
た。尿生殖器臨床検体中のヒト抗クラミジア（ＰＬ：Ｈ
ｕ Ｘ Ｃ）の存在および該試料のグルタルアルデヒド／
ＤＴＴによる前処理効果は、さらにウエスタン・ブロッ
ト・イムノアッセイ法によって証明された。臨床検体を
グルタルアルデヒド／ＤＴＴの存在下または不存在下で
上記と同様に前処理し、Ｈｕ Ｘ Ｃの存在を表すＥＩＡ
シグナルの損失をモニターした。図４に示すごとく、Ｅ
ＩＡシグナルの最大損失を伴う試料はＨｕ Ｘ クラミジ
ア（ＭＯＭＰ：Major Outer MembraneProtein）と免疫
反応性である。グルタルアルデヒドを含有する対応する
試料では、免疫反応性ヒト抗ＭＯＭＰ（Ｈｕ Ｘ ＭＯＭ
Ｐ）は検出できなかった。
ジア（Ｅｑ Ｘ Ｃ）と混合し、洗剤で抽出後、１％グル
タルアルデヒド／２５ｍＭ ＤＴＴまたは緩衝液で前処
理し、上記のＥＩＡ法を実施した。図１に示すごとく、
アルキル化／架橋グルタルアルデヒドで前処理した試料
（＋ＲＧＮＴ）は０時（抽出後）、中和活性の限界に近
い０．２μｇ／ｍｌを除き、ウマ抗クラミジアの全ての
濃度で著しいシグナルの増加を示す。ヒト抗クラミジア
（ＰＬ）は、グルタルアルデヒド不存在下（−ＲＧＮ
Ｔ）で１．６μｇ／ｍｌのウマ抗クラミジアとほぼ同等
の中和効果を示す。ウマまたはヒト抗クラミジアのＥＩ
Ａ示シグナル発生に対する影響を抽出後の幾つかの時点
で評価した。図２のＯＤ増加から明らかなように、グル
タルアルデヒドの不存在下、抽出後０時における検定感
度は、抽出後２４または４８時間より非常に大きい。図
３に示すごとく、グルタルアルデヒド／ＤＴＴの存在
下、長時間に亙って該差異は増大せず、クラミジア抗原
の全検出はウマ抗クラミジアによって阻止されなかっ
た。尿生殖器臨床検体中のヒト抗クラミジア（ＰＬ：Ｈ
ｕ Ｘ Ｃ）の存在および該試料のグルタルアルデヒド／
ＤＴＴによる前処理効果は、さらにウエスタン・ブロッ
ト・イムノアッセイ法によって証明された。臨床検体を
グルタルアルデヒド／ＤＴＴの存在下または不存在下で
上記と同様に前処理し、Ｈｕ Ｘ Ｃの存在を表すＥＩＡ
シグナルの損失をモニターした。図４に示すごとく、Ｅ
ＩＡシグナルの最大損失を伴う試料はＨｕ Ｘ クラミジ
ア（ＭＯＭＰ：Major Outer MembraneProtein）と免疫
反応性である。グルタルアルデヒドを含有する対応する
試料では、免疫反応性ヒト抗ＭＯＭＰ（Ｈｕ Ｘ ＭＯＭ
Ｐ）は検出できなかった。
【００１９】実施例５ アルカリ性ｐＨにおけるアルキル化剤による前処理 種々のアルキル化剤を種々の濃度で使用した場合のアナ
ライト検出結果を表３に示す。クラミジア抗原０．１ｍ
ｌを血清陽性血漿に添加し、ＳＴＳ Ａと混合し、１０
秒間撹拌し、１０分間インキュベートした。ついで、ア
ルキル化剤または緩衝液を添加し、この溶液を１０秒間
撹拌し、１０分間インキュベートした。イムノアッセイ
を行う前に、ＳＴＳ Ｂ０．１ｍｌを添加し、試料溶液
を１０秒間撹拌した。表３から明らかなごとく、低濃度
のアルキル化剤は、内因性抗体の干渉除去について、抽
出後４８時間では有効ではないが、抽出後０時および２
４時間では、緩衝液のみよりも有効であった。
ライト検出結果を表３に示す。クラミジア抗原０．１ｍ
ｌを血清陽性血漿に添加し、ＳＴＳ Ａと混合し、１０
秒間撹拌し、１０分間インキュベートした。ついで、ア
ルキル化剤または緩衝液を添加し、この溶液を１０秒間
撹拌し、１０分間インキュベートした。イムノアッセイ
を行う前に、ＳＴＳ Ｂ０．１ｍｌを添加し、試料溶液
を１０秒間撹拌した。表３から明らかなごとく、低濃度
のアルキル化剤は、内因性抗体の干渉除去について、抽
出後４８時間では有効ではないが、抽出後０時および２
４時間では、緩衝液のみよりも有効であった。
【００２０】
【表３】 処 理 抽出後０時 抽出後２４時間 抽出後４８時間 血清陽性血漿 血清陽性血漿 血清陽性血漿 1%グルタルアルデヒド 1.385±0.062 1.598±0.049 1.311±0.076 0.5%グルタルアルデヒド 1.520±0.080 1.615±0.072 0.425±0.063 1%ホルムアルデヒド 1.549±0.230 1.512±0.025 1.321±0.084 0.5%ホルムアルデヒド 1.506±0.115 1.254±0.116 0.989±0.217 25mMブタンジオン 1.439±0.006 1.277±0.086 0.944±0.123 12.5mMブタンジオン 1.351±0.120 1.145±0.113 0.726±0.173 緩衝液 1.238±0.120 0.825±0.044 0.694±0.036
【００２１】アルカリ性ｐＨにおけるグルタルアルデヒ
ド（ＧＡ）での前処理に加えて、ＳＴＳ Ａの抽出後に
５０ｍＭ Ｏ−メチルイソウレア（ＯＭＩＵ）および５
０ｍＭシクロヘキサンジオン（ＣＨＤ）を試料に添加
し、上記実施例１と同様にイムノアッセイを行った。両
試薬とも長時間に亙って向上したイムノアッセイ結果を
与え、これらのアルキル化剤をＤＴＴと組み合わせると
イムノアッセイ効率はさらに増強された。抽出後５日間
に亙るこれらの実験結果を表４に示す。
ド（ＧＡ）での前処理に加えて、ＳＴＳ Ａの抽出後に
５０ｍＭ Ｏ−メチルイソウレア（ＯＭＩＵ）および５
０ｍＭシクロヘキサンジオン（ＣＨＤ）を試料に添加
し、上記実施例１と同様にイムノアッセイを行った。両
試薬とも長時間に亙って向上したイムノアッセイ結果を
与え、これらのアルキル化剤をＤＴＴと組み合わせると
イムノアッセイ効率はさらに増強された。抽出後５日間
に亙るこれらの実験結果を表４に示す。
【００２２】
【表４】 時 間 処 理 抽出後０日 抽出後３日 抽出後５日 血清陽性血漿 血清陽性血漿 血清陽性血漿 OD 492/620 OD 492/620 OD 492/620 緩衝液 1.479±0.230 0.685±0.040 0.938±0.048 １％ＧＡ 1.821±0.035 1.109±0.051 1.743±0.073 ＧＡ／ＤＴＴ 1.895±0.078 1.337±0.036 1.975±0.129 ５０ｍＭ ＯＭＩＵ 1.540±0.169 0.694±0.048 0.957±0.043 ＯＭＩＵ／ＤＴＴ 2.192±0.057 1.773±0.167 2.228±0.194 ２５０ｍＭ ＣＨＤ 1.851±0.031 1.205±0.016 1.546±0.009 ＣＨＤ／ＤＴＴ 2.379±0.137 1.908±0.056 2.488±0.026 ５０ｍＭ ＤＴＴ 1.977±0.051 1.702±0.036 2.241±0.059
【００２３】実施例６ 中性ｐＨにおけるアルキル化剤での前処理 アルカリ性ｐＨで活性なアルキル化剤がＬＰＳのイムノ
アッセイに好適であるが、中性ｐＨで活性なアルキル化
剤も使用できる。ＥＢ（１：１６、３．１２×１０6）
２ｍｌをウマ抗クラミジア（１００μｇ／ｍｌ、最終２
μｇ／ｍｌ）４０μｌと混合し、その０．１ｍｌずつを
試料として使用した。各試料を８つの試験管に入れ、Ｓ
ＴＳ Ａ１ｍｌで抽出し、撹拌し、室温で１０分間イン
キュベートし、ＨＣｌ／リン酸緩衝液（そのｐＨを、試
料−ＳＴＳ Ａ溶液と合したときにｐＨ８．０となるよ
うにあらかじめ調整した）を添加した。Ｓ−アセチルチ
オグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＡＴ
Ａ）５０ｍＭを添加し、この溶液を室温で６０分間イン
キュベートした。３級アミンである１Ｍ トリス（ｐＨ
８）０．１ｍｌを添加したアルキル化剤を不活性化し
た。実施例１に記載のクラミジア・イムノアッセイ法を
用いて試料を検定した。緩衝液のみの場合は４７２／６
２０において、わずか０．３６５±０．２１ＯＤしか示
さなかった。中性ｐＨにおけるＳＡＴＡでの試料処理は
２．２６±０．７５の向上したイムノアッセイ結果をも
たらし、これはウマ抗クラミジアの不存在したのＥＢ試
料ＯＤと近似していた。以上、本発明の好ましい具体例
を記載したが、本発明の精神を逸脱しない範囲において
種々の変形、適合および修飾が可能であり、それらも本
発明範囲のものである。
アッセイに好適であるが、中性ｐＨで活性なアルキル化
剤も使用できる。ＥＢ（１：１６、３．１２×１０6）
２ｍｌをウマ抗クラミジア（１００μｇ／ｍｌ、最終２
μｇ／ｍｌ）４０μｌと混合し、その０．１ｍｌずつを
試料として使用した。各試料を８つの試験管に入れ、Ｓ
ＴＳ Ａ１ｍｌで抽出し、撹拌し、室温で１０分間イン
キュベートし、ＨＣｌ／リン酸緩衝液（そのｐＨを、試
料−ＳＴＳ Ａ溶液と合したときにｐＨ８．０となるよ
うにあらかじめ調整した）を添加した。Ｓ−アセチルチ
オグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＡＴ
Ａ）５０ｍＭを添加し、この溶液を室温で６０分間イン
キュベートした。３級アミンである１Ｍ トリス（ｐＨ
８）０．１ｍｌを添加したアルキル化剤を不活性化し
た。実施例１に記載のクラミジア・イムノアッセイ法を
用いて試料を検定した。緩衝液のみの場合は４７２／６
２０において、わずか０．３６５±０．２１ＯＤしか示
さなかった。中性ｐＨにおけるＳＡＴＡでの試料処理は
２．２６±０．７５の向上したイムノアッセイ結果をも
たらし、これはウマ抗クラミジアの不存在したのＥＢ試
料ＯＤと近似していた。以上、本発明の好ましい具体例
を記載したが、本発明の精神を逸脱しない範囲において
種々の変形、適合および修飾が可能であり、それらも本
発明範囲のものである。
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、中性またはアルカリ性
ｐＨで活性なアルキル化剤による前処理を行うことによ
り、アナライトの検出を妨害する内因性抗体を含有する
試料における該アナライトのイムノアッセイによる検定
を迅速に、高感度で行うことができ、従前の検定におけ
るような、厳しい酸加水分解も必要としない。
ｐＨで活性なアルキル化剤による前処理を行うことによ
り、アナライトの検出を妨害する内因性抗体を含有する
試料における該アナライトのイムノアッセイによる検定
を迅速に、高感度で行うことができ、従前の検定におけ
るような、厳しい酸加水分解も必要としない。
【図１】 抽出直後のアナライト検出に対する本発明の
前処理の効果を示すグラフ。
前処理の効果を示すグラフ。
【図２】 本発明の前処理を適用しない場合の、抽出後
の種々の時間におけるアナライト検出妨害を示すグラ
フ。
の種々の時間におけるアナライト検出妨害を示すグラ
フ。
【図３】 抽出後の種々の時間におけるアナライト検出
に対する本発明の前処理の効果を示すグラフ。
に対する本発明の前処理の効果を示すグラフ。
【図４】 患者試料中の抗クラミジア抗体のアナライト
への結合能に対する本発明のアルキル化剤の影響を示す
ウエスタン・ブロット・ストリップの模写図。
への結合能に対する本発明のアルキル化剤の影響を示す
ウエスタン・ブロット・ストリップの模写図。
Claims (14)
- 【請求項１】 アナライトが抗原性であり、アナライト
検出を妨害する抗体を含有する患者の試料中のアナライ
ト分析用の改良されたイムノアッセイであって、 ａ）ｐＨ７．０以上において、アナライトの抗原性に影
響を及ぼさず、かつ抗アナライト抗体の基をアルキル化
してアナライト検出を妨害できないように修飾する能力
を有するアルキル化剤を試料と接触させ、 ｂ）アルキル化剤を不活化し、ついで ｃ）修飾された抗体の存在下で、試料のイムノアッセイ
を行い、アナライトを分析する工程からなることを特徴
とするイムノアッセイ。 - 【請求項２】 アナライトが酸感受性である請求項１記
載のイムノアッセイ。 - 【請求項３】 アナライトがリポ多糖類抗原である請求
項２記載のイムノアッセイ。 - 【請求項４】 リポ多糖類抗原が、クラミジア・トラコ
マティス（Chlamydia trachomatis）、クラミジア・プ
シッタチ（Chlamydia psittaci）、サルモネラ・チフィ
ムリウム（Salmonella typhimurium）、ナイセリア・ゴ
ーノローエア（Neisseria gonorrhoeae）およびエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）からなる群から選ば
れる微生物からのものである請求項３記載のイムノアッ
セイ。 - 【請求項５】 アルキル化剤が、グルタルアルデヒド、
ホルムアルデヒド、ｏ−メチルイソウレア、シクロヘキ
サンジオン、ブタンジオンまたはＳ−アセチルチオグリ
コール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである請求項１
記載のイムノアッセイ。 - 【請求項６】 アルキル化剤が、抗体の基を架橋する能
力も有する請求項１記載のイムノアッセイ。 - 【請求項７】 アルキル化剤がアルカリｐＨで活性化さ
れ、中性ｐＨで不活化され、不活化工程が試料ｐＨの中
和からなる請求項１記載のイムノアッセイ。 - 【請求項８】 試料をアルキル化剤と接触させる前また
は同時に、アルカリｐＨで試料を適宜の抽出洗剤と接触
させてリポ多糖類抗原を遊離させる工程を含む請求項３
記載のイムノアッセイ。 - 【請求項９】 アナライトの検出を妨害する内因性抗体
を含有する患者の試料中のアナライト分析用のイムノア
ッセイ・キットであって、試料のイムノアッセイを行
い、アナライトを分析するためのイムノアッセイ試薬
と、ｐＨ７．０以上で抗体の基をアルキル化し、内因性
抗体を修飾してアナライトとの結合を防止する能力を有
するアルキル化剤と、アルキル化剤を不活化する不活化
剤とからなり、該イムノアッセイ試薬が不活化剤および
不活化アルキル化剤の存在下でも使用可能であることを
特徴とするイムノアッセイ・キット。 - 【請求項１０】 アルキル化剤が、グルタルアルデヒ
ド、ホルムアルデヒド、ｏ−メチルイソウレア、グリセ
ルアルデヒドまたはＳ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドである請求項９記載のイムノ
アッセイ・キット。 - 【請求項１１】 アルキル化剤がアルカリｐＨで活性で
あり、中性ｐＨで不活化され、不活化剤が中和剤である
請求項９記載のイムノアッセイ・キット。 - 【請求項１２】 アナライトがリポ多糖類抗原であり、
試料からアナライトを抽出するための洗剤およびアルカ
リ土類金属試薬をさらに含む請求項１１記載のイムノア
ッセイ・キット。 - 【請求項１３】 アナライトが抗原性であり、アナライ
ト検出を妨害する抗体を含有する患者の試料中のアナラ
イト分析用の改良されたイムノアッセイであって、 ａ）試料をアルカリ抽出処理してアナライトを遊離させ
た後、ｐＨ７．０以上において、アナライトの抗原性に
影響を及ぼさず、かつ抗アナライト抗体の基をアルキル
化してアナライト検出を妨害できないように修飾する能
力を有するアルキル化剤を試料と接触させ、 ｂ）アルキル化剤を不活化し、ついで ｃ）修飾された抗体の存在下で、試料のイムノアッセイ
を行い、アナライトを分析する工程からなることを特徴
とするイムノアッセイ。 - 【請求項１４】 アナライトが抗原性であり、アナライ
ト検出を妨害する抗体を含有する患者の試料中のリポ多
糖類抗原アナライト分析用の改良されたイムノアッセイ
であって、 ａ）試料をアルカリ洗剤抽出してリポ多糖類抗原を遊離
させ、ｐＨ７．０以上において、リポ多糖類抗原の抗原
性に影響を及ぼさず、かつ抗アナライト抗体の基をアル
キル化してアナライト検出を妨害できないように修飾す
る能力を有するアルキル化剤を試料と接触させ、 ｂ）アルキル化剤を不活化し、ついで ｃ）修飾された抗体の存在下で、試料イムノアッセイを
行い、リポ多糖類抗原を分析する工程からなることを特
徴とするイムノアッセイ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/065,019 US5484706A (en) | 1993-05-19 | 1993-05-19 | Immunoassay for analytes in samples using alkylating agents |
| US065019 | 1993-05-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06347460A true JPH06347460A (ja) | 1994-12-22 |
| JP3335760B2 JP3335760B2 (ja) | 2002-10-21 |
Family
ID=22059810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10370594A Expired - Fee Related JP3335760B2 (ja) | 1993-05-19 | 1994-05-18 | アルキル化剤を用いる試料中のアナライトのイムノアッセイ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5484706A (ja) |
| JP (1) | JP3335760B2 (ja) |
| CN (1) | CN1082663C (ja) |
| CA (1) | CA2123069C (ja) |
| DE (1) | DE4416144A1 (ja) |
| ES (1) | ES2066739B1 (ja) |
| FR (1) | FR2705463B1 (ja) |
| GB (1) | GB2278195B (ja) |
| IT (1) | IT1274006B (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9403215D0 (en) * | 1994-02-19 | 1994-04-13 | Kodak Ltd | Chemical modification of antibodies and antigens |
| US5478729A (en) * | 1994-04-28 | 1995-12-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Immunoassay for homocysteine |
| US5773234A (en) * | 1995-08-07 | 1998-06-30 | Quidel Corporation | Method and device for chlamydia detection |
| JP2010503854A (ja) * | 2006-09-14 | 2010-02-04 | バイアコア アーベー | 分析物濃度を求める方法 |
| EP3470840B1 (en) * | 2014-06-12 | 2021-03-03 | Hyglos Invest GmbH | Unmasking endotoxins in solution |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2047889A (en) * | 1979-04-02 | 1980-12-03 | Research Corp | Detection of antibodies to chlormydia trachomatis having an immunofluorescence test |
| US4276050A (en) * | 1980-01-10 | 1981-06-30 | Abbott Laboratories | Method for systemic endotoxin detection |
| US4427782A (en) * | 1981-03-03 | 1984-01-24 | Caldwell Harlan D | Isolation of principal outer membrane protein and antigen of Chlamydia trachomatis |
| US4497899A (en) * | 1982-04-12 | 1985-02-05 | Abbott Laboratories | Immunoassay for Chlamydia trachomatis antigens |
| FI69639C (fi) * | 1982-07-02 | 1986-03-10 | Orion Yhtymae Oy | Preparat foer anvaendning vid klamydia-diagnostik |
| US4617264A (en) * | 1983-11-04 | 1986-10-14 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Pretreatment method and composition |
| US4657851A (en) * | 1984-01-03 | 1987-04-14 | Georgetown University | Breast cancer diagnostic blood test |
| US4536478A (en) * | 1984-04-05 | 1985-08-20 | Seragan Diagnostics, Inc. | Method for reducing non-specific interferences in agglutination immunoassays |
| US4663291A (en) * | 1984-07-06 | 1987-05-05 | Becton, Dickinson And Company | Method for solubilizing microbial protein obtained from Chlamydia trachomatis |
| US4766065A (en) * | 1984-08-23 | 1988-08-23 | Becton Dickinson And Company | Detection of cell membrane protein |
| GB8427006D0 (en) * | 1984-10-25 | 1984-11-28 | Iq Bio Ltd | Determination of chlamydia trachomatis |
| US4703001A (en) * | 1985-10-23 | 1987-10-27 | Synbiotics, Corporation | Immunoassay for the detection of serum analytes using pH dependent chastropic acids |
| DE3889479T2 (de) * | 1987-02-27 | 1994-12-22 | Eastman Kodak Co | Mit Nieder-pI-Protein beschichtete Membranstruktur und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung. |
| US4950612A (en) * | 1987-12-16 | 1990-08-21 | Microgenics Corporation | Peroxy acid pretreatment in vitamin B12 assay |
| US4916057A (en) * | 1988-02-29 | 1990-04-10 | Kallestad Diagnostics, Inc. | Chlamydia assay employing base treatment |
| US5075221A (en) * | 1988-10-07 | 1991-12-24 | Eastman Kodak Company | Stabilized extraction composition containing a sulfhydryl-containing reducing agent and its use in chlamydial and gonococcal determinations |
| US4978632A (en) * | 1988-12-15 | 1990-12-18 | Kallestad Diagnostics, Inc. | Method of pre-treating samples in peroxidase-catalyzed enzyme assays |
| US5219890A (en) * | 1989-07-11 | 1993-06-15 | Wave Energy Systems, Inc. | Odorless Mycobactericidal compositions |
| US5187066A (en) * | 1990-02-14 | 1993-02-16 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Methods for detecting amphiphilic antigens |
| US5187107A (en) * | 1991-06-27 | 1993-02-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | B12 enzyme imunoassay and sample pretreatment |
| US5384240A (en) * | 1992-11-25 | 1995-01-24 | Akzo Nobel, N.V. | Base dissociation assay |
-
1993
- 1993-05-19 US US08/065,019 patent/US5484706A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-05-06 CA CA002123069A patent/CA2123069C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-06 DE DE4416144A patent/DE4416144A1/de not_active Ceased
- 1994-05-16 FR FR9405945A patent/FR2705463B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-18 CN CN94105532A patent/CN1082663C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-18 JP JP10370594A patent/JP3335760B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-18 IT ITTO940399A patent/IT1274006B/it active IP Right Grant
- 1994-05-18 ES ES09401086A patent/ES2066739B1/es not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-19 GB GB9410054A patent/GB2278195B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3335760B2 (ja) | 2002-10-21 |
| GB2278195B (en) | 1997-03-05 |
| ES2066739A1 (es) | 1995-03-01 |
| DE4416144A1 (de) | 1994-11-24 |
| FR2705463B1 (fr) | 1997-04-11 |
| ITTO940399A1 (it) | 1995-11-18 |
| ES2066739B1 (es) | 1995-11-01 |
| FR2705463A1 (fr) | 1994-11-25 |
| ITTO940399A0 (it) | 1994-05-18 |
| CN1104773A (zh) | 1995-07-05 |
| GB2278195A (en) | 1994-11-23 |
| GB9410054D0 (en) | 1994-07-06 |
| CN1082663C (zh) | 2002-04-10 |
| US5484706A (en) | 1996-01-16 |
| IT1274006B (it) | 1997-07-14 |
| CA2123069C (en) | 2006-07-04 |
| CA2123069A1 (en) | 1994-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5051356A (en) | Specific binding composition comprising a low pI protein or carbohydrate and a diagnostic test kit and method of use | |
| US8426125B2 (en) | Method of pretreating specimen and immunoassay using the same | |
| US5200312A (en) | Membrane based dot immunoassay and method of use | |
| KR100326619B1 (ko) | 염기해리분석법 | |
| US5132205A (en) | High ph extraction composition and its use to determine a chlamydial, gonococcal or herpes antigen | |
| US4978632A (en) | Method of pre-treating samples in peroxidase-catalyzed enzyme assays | |
| US4916057A (en) | Chlamydia assay employing base treatment | |
| JP3335760B2 (ja) | アルキル化剤を用いる試料中のアナライトのイムノアッセイ | |
| US5248595A (en) | Wash composition, test kit and method for determination of microorganisms associated with periodontal diseases | |
| CA2053299A1 (en) | Immunoassay | |
| JP3487642B2 (ja) | Ｈａｖ抗原及びその抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法 | |
| AU628239B2 (en) | Detection of chlamydia by flow-through assay | |
| WO1990010232A1 (en) | Composition containing labeled streptococcal antibody, test kit and assay using same | |
| WO1990002336A1 (en) | Immunoassay for determining a chlamydial antigen comprising pretreatment of the sample with a chelating agent | |
| WO1995034812A1 (fr) | Procede de dosage d'un anticorps d'une immunoglobuline m specifique et reactif approprie | |
| JP4470014B2 (ja) | 赤血球抗原の検査方法 | |
| JP3227689B2 (ja) | 抗好中球細胞質抗体の測定方法 | |
| CS252222B1 (cs) | Stanovení proteinů enzymimunologickou metodou | |
| JPH07146293A (ja) | 免疫測定法 | |
| UA66096A (en) | IMMUNOENZYME ASSAY KIT FOR DETECTING IgG AGAINST TOXOPLASMA GONDII IN HUMAN BLOOD SERUM (DIA-TOXO-IgG) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |