ITTO940399A1

ITTO940399A1 - Saggio immunologico per analiti in campioni, che utilizza agenti alchi lanti.

Info

Publication number: ITTO940399A1
Application number: IT94TO000399A
Authority: IT
Inventors: Jon E Peterson; Jeffrey W Staeffens
Original assignee: Pasteur Sanofi Diagnostics
Priority date: 1993-05-19
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1995-11-18
Also published as: JP3335760B2; GB2278195B; JPH06347460A; ES2066739A1; DE4416144A1; FR2705463B1; ES2066739B1; FR2705463A1; ITTO940399A0; CN1104773A; GB2278195A; GB9410054D0; CN1082663C; US5484706A; IT1274006B; CA2123069C; CA2123069A1

Abstract

Sono stati sviluppati un procedimento per saggio immunologico migliorato ed un kit che comprendono un procedimento di pretrattamento del campione ed un kit che utilizza un agente alchilante che modifica gli anticorpi nel campione per rendere gli anticorpi incapaci di interferire con la rilevazione dell'analita. Prima di eseguire il saggio immunologico, l'agente alchilante viene inattivato in modo che non modifichi i reagenti dell'anticorpo usati nel saggio immunologico.

Description

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo: "Saggio immunologico per aneliti in campioni, che utilizza agenti alchilanti",

DESCRIZIONE

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un saggio immunologico migliorato per rilevare la presenza o la quantità di un analita in un campione di un paziente. Più particolarmente, l’invenzione si riferisce all’utilizzo di agenti alchilanti a pH neutro o alcalino in un procedimento di saggio immunologico migliorato-per rilevare aneliti in un campione contenente anticorpi endogeni.

SFONDO DELL'INVENZIONE

Nel corso dei due decenni scorsi, sono stati sviluppati procedimenti di saggio immunologico o saggio immunocitochimico utili per determinare se un particolare analita è presente in un campione di un paziente.

Iviun tìpico saggio irnrnunologico, un reagente di saggio viene mancato con un composto che è in grado di produrre un segnale rilevatoile e questo reagente viene unito con il campione del paziente che si pensa contenga un particolare analìta. Il reagente di saggio marcato si legherà all*analita in una quantità in relazione alla quantità di analita nel campione. ;E’ stato trovato che gli anticorpi endogeni antianalita e gli imrnunocomplessi di anticorpi e analita circolanti in campioni di siero interferiscono con i saggi immunologiei di rilevazione dell'analita. Il Brevetto U.S. 4.703.001, descrive un procedimento di pretrattamento per dissociare imrnunocomplessi e denaturare gli anti-aneliti per saggi immunologie! per aneliti stabili all’acido in un campione di siero consistente nel porre a contatto il campione di siero ad un caotropo dipendente dal pH, ad un pH acido. Analogamente, P. Nishanian, et al. in J. Infect. Dis. 162:21-28 (1990), descrivono un procedimento di pretrattamento con idrolisi acida di un campione di siero, che viene usato per disassociare imrnunocomplessi di anticorpi anti-HIV-analita e denaturare gli anticorpi enti-HIV. Tuttavia, per ottenere una denaturazione completa degli anticorpi anti-HIV il siero di prova viene trattato a 37°C per &0 minuti con una soluzione 0,5 N di HC1. ;Mentre l’idrolisi acida, come eseguita per aritigeni di proteina o peptide, come suddetto, può dare risultati accurati, è sempre desiderabile ottenere quei risultati più rapidamente e con sensibilità migliorata. Inoltre, con alcuni analiti, non è possibile eseguire questa idrolisi acida rigorosa. Per esempio, gli zuccheri dell’acido S-cheto-3-desossiottulosonico (KDO) di antigeni di lipopolisaccaridi (LPS) formati da certi microorganismi verrebberro idrolizzati da questo trattamento, distruggendo così la loro attività antigenica. Potrebbe pertanto essere desiderabile avere un procedimento di saggio immunologico in cui gli anticorpi endogeni presenti in un campione di un paziente possono essere irreversibilmente denaturati a pH maggiore di 7,0 e desiderabilmente ad un pH alcalino, senza influenzare l’antigenicità dell’analita. ;;SOMMARIO DELL’INVENZIONE ;Le prestazioni di saggi irnmunologici per l’analisi di analiti in un campione di un paziente possono essere significativamente migliorati dal pretrattamento del campione per modificare gli anticorpi endogeni onde ridurre o prevenire l’interferenza degli anticorpi nella rilevazione dell’analita. Come suddetto, questi anticorpi e imrnunocornplessi possono interferire, in molti saggi immunologici, con le fasi di legame ad un analita specifico. La fase di pretrattamento del campione secondo l'inversione utilizza agenti alchilanti che sono attivi a phlmaggiore di 7,0, preferibilrnente ad un pH alcalino, maggiore di 8,0. Gli agenti alchilanti secondo l’invenzione sono attivi ad un pH neutro o alcalino e non interferiscono con l’antigenicità del1’analita. Desiderabilmente, l’agente alchilante agisce sulla lisina, arginine o gruppi ammirici primari degli anticorpi per modificare i gruppi sugli anticorpi per prevenire la loro interferenza con la rilevazione dell’analita e comprendono, senza essere limitati a questi, glutaraldeide, O—metilisourea, formaldeide, butandione, cicloesandione e N—idrossi succinimmide dell’acido S-acetil tiog1icolico. ;Prima di eseguire il saggio immunologico, detto agente alchilante viene inattivato in modo che non influenzi i reagenti del saggio imrnunologico. I mezzi per inattivare l’agente alchilante varieranno in base all’agente alchilante usato. Un tipo di agente alchilante utile con l'invenzione è attivo a pH alcalino e inattivo a pH neutro. Questo tipo di agente alchilante è particolarmente utile per rilevare analiti che sono presenti in un campione in una forma tale da richiedere che il campione venga pretrattato con una soluzione detergente alcalina per estrarre l’analita. ;In una realizzazione, il campione viene pretrattato con un agente alchilante seguito da estrazione con un detergente alcalino eseguita prima di un saggio im— rnunologico per LPS clamidiale o antigeni simili. L’agente alchilante può essere aggiunto prima della neutralizzazione del campione in soluzione. In una realizzazione preferita, un agente alchilante attivo solo a pH alcalino viene aggiunto dopo l’estrazione alcalina ed incubato con la soluzione di campione per un tempo sufficiente a permettere che gli anticorpi endogeni siano modificati, così che gli anticorpi non saranno in grado di interferire con il rilevamento dell’analita. durante il saggio immunologico. L’agente alchilante deve essere scelto in modo che sia compatibile con gli altri reagenti usati per estrarre l’analita. In seguito all’incubazione, l'agente alchilante viene inattivato mediante neutralizzazione della soluzione di campione, quindi si esegue il saggio immunologico. ;In una reaiizzazione, l’analita che deve essere determinato è sensibile all’acido. Per gli scopi dell’invenzione, "sensibile all’acido" indica un analita che perde la sua attività antigenica quando viene incubato in una soluzione con pH inferiore a 3,0. Per gli scopi di questa domanda, gli analiti sensibili all’acido comprendono, senza essere limitati a questi, siero, plasma, urina e simili. I reagenti ed il procedimento di pretrattamento possono essere usati in qualsiasi saggio irnmunologico in cui la presenza di anticorpi endogeni irtterferisca con la rilevazione dell'analita, ma sono particolarmente utili con analiti che non sono stabili a pH basso. ;Molti saggi irnmunologici differenti possono ottenere prestazioni migliorate usando il procedimento di pretrattamento secondo l’invenzione. I saggi radioimrnunologici e saggi immunologici che impiegano procedimenti ELISA e saggi immunologici che utilizzano vari traccianti isotopici, compresi traccianti fluorescenti e chemiluminescenti. Uno di questi saggi irnmunologici comprende le fasi di porre in contatto la soluzione di campione estratto neutralizzato con un anticorpo monoclonale con l’analita immobilizzato su una fase solida, come un pozzetto di micropiastra, letto, particelle, provette o simili, incubare, aggiungere un anticorpo policlonale marcato che si lega alla fase solida in una quantità correlata alla quantità di analita nel campione, incubare e rilevare l’indicatore isotopico. ;La quantità e la concentrazione dell’agente alchilante utile in un particolare saggio irnmunologico dipenderanno dal tipo di campione, per esempio siero o tampone urogenitale, concentrazione degli altri reaantigeni LPS aventi una parte KDO, da Chlarnydia tracho— matis, Chlarnydia psittaci, Salmonella typhirnurium, Meisseria gonorrhoeae ed Escherichia coli. ;In una realizzazione partico1arrnente preferita, viene eseguito un saggio immunologico per l’antigene LPS e dopo la fase di estrazione dell’antigene, si aggiunge l’agente alchilante unito con ditiotreitolo (DTT). Il DTT è un agente mucolitico, come anche un modificatore chimico che si lega alla cisteina. L’uso del DTT in combinazione con un agente alchilante aumenta nel tempo la stabilità del segnale ed aumenta la sensibilità del saggio. ;Un’altra reaiizzazione dell’invenzione comprende un kit per saggio immunologico utilizzabile per saggiare un analita in un campione di un paziente contenente anticorpi endogeni che interferiscono con la rilevazione dell’analita, che comprende i reagenti per il saggio immunologico per eseguire un saggio immunologico sul campione per saggiare l’analita, un agente alchi— lante in grado di alchilare gruppi sugli ariticorpi a pH non inferiore a 7,0 ed evitare che gli anticorpi endogeni interferiscano corila rilevazione dell’analita. Il kit comprende inoltre un agente inattivante che è in grado di inattivare l’agente alchilante in modo che non modifichi troppo gli anticorpi. In una reaiizzazione, in cui l’agente alchilante è attivo solo a pH alcalino, l’agente inattivante è un agente neutralizzante. ;;BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI ;La Fig. 1 è un grafico che rappresenta l’effetto di un procedimento di pretrattamento secondo l’invenzione sulla rilevazione dell’analita, immediatamente dopo l’estrazione. ;La Fig. 2 è un grafico che rappresenta 1’interferenza con la rilevazione dell’analita per vari periodi dopo 1’estrazione, senza utilizzo del procedimento di pretrattamento secondo l’invenzione. ;La Fig. 3 è un grafico che rappresenta gli effetti del procedimento di pretrattamento secondo l’invenzione sulla rilevazione dell’analita a vari periodi dopo l'estrazione. ;La Fig. 4 rappresenta corsie di Western Blot che dimostrano l’effetto degli agenti alchilanti secondo l’invenzione sulla capacità degli anticorpi anti-clamidia in campioni di un paziente di legarsi all’analita. ;DESCRIZIONE DETTOGLIflTfl DELL’INVENZIONE ;I reagenti ed i procedimenti secondo l’invenzione possono essere usati con campioni di un paziente ottenuti con procedimenti convenzionali dall’occhio, dalle narici in corrispondenza della parte posteriore del naso, cervice, vagina, uretra, retto, gola, sangue, genti del saggio immunologico, dal tipo di analita e dalla temperatura alla quale viene eseguito il pretrattamento. ;In alcuni saggi immunologici per rilevare la presenza di microorganismi, l’analita viene rilevato con un lipopolisaccaride (LPS) sensibile all’acido, come l’antigene della clamidia. Tipicamente, in saggi per gli antigeni della clamidia e antigeni simili, il campione del paziente viene pretrattato con una soluzione detergente che comprende ioni di un metallo alcalino o alcalino terroso. Durante la fase di estrazione, gli anticorpi endogeni ariti-analita vengono parzialmente denaturati o perturbati. Tuttavia, con il tempo, una volta che la soluzione di campione è neutralizzata gli anticorpi endogeni si rinaturano e bloccheranno la rilevazione dell'analita interferendo con il legame fra reagente dell’anticorpo e analita, durante il saggio immunologico. ;Senza considerarsi vincolati a quanto che segue, si ritiene che gli agenti alchilanti reagiscono con i gruppi sugli anticerpi che sono stati parzialmente denaturati o perturbati, per prevenire la rinaturazione degli anticorpi durante il saggio immunologico. ;Un tipo di agente alchilante, particolarmente utile in un saggio immunologico per la determinazione Pathfinder*^ Chlamydia Microplate comprende: - una soluzione fi di trattamento del campione (STS P) che comprende NaOH 0,1 N, EDTR 5 rnM, SO mg/ml di giallo alizarina, acido (2—idrossi-5—E(4-nitrofe— nil)azo]benzoico, un colorante che è giallo a pH neutro inferiore a 10,E e rosso a pH 1£ e lo 0,05?t di solforato di 3[(3-colammidopropi1)dimetilammonio]-l~propano (CHRPS).

- una soluzione di trattamento del campione B (STS B) che comprende HC1 1 N, base Tris 2 M, il 3% di H2D2.

Il procedimento di estrazione eseguito prima del saggio immunologico descritto in seguito, consiste nell'aggiungere 1,0 mi di STS P a 0,1 mi di campione e incubare per 10 minuti, quindi vortexare per 30 secondi. Successivamente, per determinare l’efficacia degli agenti alchilanti secondo l’invenzione, si aggiungono 0,1 mi di un agente alchilante o tampone, si vortexa per 10 secondi e si incuba per 10 minuti. Prima di eseguire il saggio immunologico, si aggiungono 0,1 mi di STS B e si vortexa la soluzione di campione per 10 secondi.

Dopo l’estrazione, si esegue un saggio immunologico usando il kit a Kallestad Pathfinder<(R) >Microplate, come descritto in seguito.

Pliquote di 100 μΐ di campione estratto vengono di LPS, è un agente che è attivo solo a pH alcalino, per esempio maggiore di 3,0, e .inattivo a pH neutro o acido. Gli agenti alchilanti di questo tipo comprendono, senza essere limitati a questi, glutaraldeide, formaldeide, o-metilisourea, butandione e cicloesandione. Questi agenti sono particolarmente preferiti poiché i saggi immunologie! vengono tipicamente eseguiti a pH neutro, così da non interferire con le prestazioni del saggio.

Un altro tipo di agente alehilante secondo l’invenzione è attivo a pH neutro (fra pH 7,0 e pH 3,0), e può essere inattivato con aggiunta di un secondo reagente avente gruppi ammirici, come una ammina terziaria come Tris, oppure una ammina primaria come la glieina. Gli agenti alchilanti di questo tipo comprendono, senza essere limitati a questo, N-idrossisuccinimmide dell’acido S-acetil tioglicolico.

Il procedimento secondo la presente invenzione potrà essere compreso più facilmente facendo riferimento ai seguenti esempi, che sono illustrativi e non limitativi.

Esempio 1 - Sanoio immunologico per la Chlamydia

Per eseguire il procedimento di pretrattamento ed il saggio immunologico viene usato un kit Hallestad Pathfinder<(R) >Chlamydia Microplate. Il kit Kallestad aggiunte a ciascun pozzetto del Pathfinder^ Microplate nel quale un anticorpo monoclonale è legato all’anticorpo della chlamydia. Il piatto viene incubato per 30 minuti a in una incubatrice ad agitazione ST0T-F0X (Awareness Technologies). Si aggiungono 50 μl di reagente di anticorpo policlonale di coniglio antichiamydia a ciascun pozzetto, quindi la piastra viene incubata per 30 minuti a 26°C in una incubatrice STOT— FOX 2200.

Si aggiungono quindi in ciascun pozzetto, 50 μΐ di perossidasi di barbaforte coniugata ad anticorpo di capra anti-coniglio e la piastra viene incubata per 30 minuti a 26°C in una incubatrice STOT-FOX 2200.

I pozzetti delle piastre vengono quindi lavati 5 volte con il Microplate Washer LP-35 (Diagnostics Pasteur, Francia), quindi si aggiungono 100 μΐ di o—fenilendiammina in tampone a ciascun pozzetto, e si incuba la piastra per 30 minuti al buio. Si aggiungono 100 μl di soluzione di arresto comprendente H2SO4 4 N e le micropiastre vengono lette con un lettore di micropia— stre LP—400 (Diagnostics Pasteur, Francia) a OD 492/620.

Esempio 2 — Qualita sensibile all’acido

Come suddetto, il procedimento di pretrattamento è particolarmente preferito per analiti sensibili all'acido come un lipopoiisaccaride. Abbiamo dimostrato che l'antigenicità di LPS viene influenzata quando il campione viene trattato con un acido, ma non con una base.

Trattamento con acido: 1 mi di antigene di chlamydia in STS A: STS B (10:1) viene trattato con 30 μl di H3PO4 4 M (pH 2,3) e la reazione viene lasciata proseguire per SO minuti e quindi neutralizzata con 70 μl di NaOH 2 IM (pH 3,1),

Trattamento con base: 1 mi di aritigene di chlamydia in STS A: STS B (10:1) viene trattato con 70 μl di NaOH 2 N (pH 12,5) e la reazione viene lasciata proseguire per SO minuti prima della neutralizzazione con 30 μ1 di H3PO4 4 M (pH 2,3).

I risultati del trattamento con l'acido e con la base sono riportati nella Tabella 1.

TABELLA 1

Esempio 3 - Agenti alchilanti L’efficacia dei vari agenti alchilanti nel modificare gli anticorpi endogeni e l’aumento del segnale EIA viene dimostrata con plasma sieropositivo (anti-chlarnydia umano in plasma) e in modelli di anti-chlamydia equino. Il plasma anti-chlamydia umano sieropositivo oppure l’immunoaffinità purificata equina anti-chlamy— dia, vengono miscelati con corpi elementari di Chlamydia trachomatis (serovar L2, normalmente 1,5 x 10<6 >EB/rnl finale) ed estratti come descritto nell’Esempio 1

L’efficacia di ciascun agente alchilante viene valutata confrontando il campione trattato con solo tampone. Come riportato nella Tabella 2, dopo aver inattivato gli agenti alchilanti aggiungendo un agente neutralizzante in STS B, si nota un immediato aumento della rilevazione dell’analita al tempo zero con gli agenti alchilanti glutaraldeide e cicloesandione, rispetto al trattamento con solo tampone.

TABELLA

I risultati riportati nella Tabella 2 dimostrano che la sola estrazione alcalina senza un agente alchilante perturberà l’ariticorpo anti-chlaroydia rendendolo meno in grado di interferire con la rilevazione dell’analita. Tuttavia, con il tempo, gli anticorpi alcalini perturbati si rinaturano nel campione con il solo tampone e neutralizzeranno efficacemente il segnale EIA interferendo con la cattura o la rilevazione dell’antigene nel formato Pathf'inder.

0 ore dopo l’estrazione, (Tabella 2)., il campione trattato con il tampone ha QD rispettivamente del 20% e del 22% inferiori a quelli dei campioni estratti in presenza dell’1% di glutaraldeide con e senza DTT. 120 ore dopo l’estrazione, i campioni estratti in presenza del solo tampone diminuiscono del 37% rispetto all'estrazione con l'1% di glutaraldeide e cicloesandione 50 mM che diminuiscono lentamente. Unendo DTT 25 rnM con glutaraldeide e cicloesandione si ottiene un leggero aumento del segnale dal tempo zero.

Esempio 4 - glutaraldeide Le preparazioni di Chlamydia Elernentary Body vengono miscelate con varie concentrazioni di anti-chlamydia equino, pretrattato dopo estrazione con detergente con l'1% di glutaraldeide/DTT 25 mM oppure tampone, quindi si esegue il procedimento EIA suddetto. 1 campioni pretrattati con la glutaraldeide alchi— lante/reticolante, presentano un marcato aumento del segnale, riportato nella Fig. 1, proporzionale ai campioni trattati con tampone al tempo zero (dopo l’estrazione) a tutte le concentrazioni di anti-chlamydia equina, tranne 0,2 μg/ml, che si avvicina ai limiti dell’attività di neutralizzazione. L’anti-chlarnydia umana (PI) dimostra un effetto di neutralizzazione quasi equivalente a 1,6 pg/ml di anti-chlamydia equina, in assenza di glutaraldeide.

L’influenza dell’anti-chlamydia umana o equina sulla generazione del segnale EIA viene valutata in vari tempi diversi dopo l’estrazione. In assenza di glutaraldeide, la sensibilità del saggio a zero ore dopo l’estrazione è molto maggiore rispetto a 24 e 48 ore dopo l’estrazione, come si nota dalla diminuzione di OD riportata nella Fig. 2. In presenza di glutaraldeide/DTT, come riportato nella Fig. 3, le differenze non sono cosi pronunciate nel tempo e tutte le rilevazioni del1’antigene della chlamydia non vengono bloccate dalla anti-chlamydia equina.

La presenza di anti-chlamydia umana (Hu x C) in campioni clinici urogenitali, e l’effetto del pretrattamento del campione con glutaraldeide/DTT, viene ulteriormente dimostrato con procedimenti di saggio immunologie! Western Blot. I campioni clinici vengono pretrattati come suddetto, in presenza o assenza di glutaraldeide/DTT e controllati per valutare la perdita di segnale EIA, indicativa della presenza di Hu x C. Si nota che quei campioni in cui la perdita di segnale EIA è maggiore presentano Hu x Chlamydia immunoreattiva (MOMP, proteina principale della membrana esterna) come rappresentato nella Fig. 4. Nei campioni trattati con— tenenti glutaraldeide, non viene rilevata ariti-MOMP umana (Hu x MOMP).

Esempio 5 - Pretrattamento con agenti alchilanti a pH alcalino

La Tabella 3 riporta i risultati di rilevamento di un analita con differenti concentrazioni dei vari agenti alchilanti usati. 0,1 mi di antigene chlamydia vengono aggiunti a plasma sieropositivo e miscelati con STS fi, vortexati per 10 secondi e quindi incubati per 10 minuti. Si aggiungono poi 0,1 ml di agente alchi— lante o tampone, si vortexa la soluzione per 10 secondi e si incuba per 10 minuti. Prima di eseguire il saggio immunologico, si aggiungono 0,1 mi di 5ΤS B al campione in soluzione, vortexando per 10 secondi. Come si può notare dalla Tabella 3, le concentrazioni piò basse di agenti alchilanti non sono così efficaci 46 ore dopo l’estrazione per eliminare l’interferenza di anticorpi endogeni, ma sono più efficaci rispetto al solo tampone 0 ore e 24 ore dopo l’estrazione.

TABELLA 3

Oltre al pretrattamento a pH alcalino con glutaraldeide, si aggiungono al campione in soluzione O-met ilisourea 50 mM ((UMILI) e cicloesandione 50 mM (CHD), seguita da estrazione in STS A ed esecuzione di un saggio immunologico, come descritto nell’Esempio 1. Entrambi gli agenti danno risultati del saggio immunologico migliorati nel tempo e le prestazioni del saggio immunologi co vengono ulteriormente migliorate quando gli agenti alchilanti vengono uniti con DTT.

I risultati di questi esperimenti per un periodo di 5 giorni dopo l’estrazione sono riportati nella Tabella 4.

TABELLA 4

Esempio 6 - Pretrattamento con agenti alchilanti a pH neutro

Sebbene gli agenti alchilariti ohe sono attivi ad un pH alcalino siano preferiti nei saggi immunologici per LPS, possono anche essere usati agenti alchilanti attivi a pH neutro. Si mescolano 2 ml di EBs (1:16, 3,12 x 10<6>) e 40 μl di anti-chlamydia equino (100 pg/ml, finale 2 pg/ml) e si usano come campione aliquote di 0,1 ml della miscela anticorpo-EB. Le aliquote vengono poste in 3 provette ed estratte con 1 mi di STS A, vortexate ed incubate per 10 minuti a temperatura ambiente. Si aggiungono 100 μΐ di tampone fosfato/HCl, il pH del quale é stato portato ad un valore tale che quando viene mescolato con la soluzione STS A campione, il pH sia 8,0. Si aggiunge N-idrossi succinimmide dell’acido S—acetil tioglicolico 50 mM (SATA) e si incuba la soluzione per 80 minuti a temperatura ambiente. Si aggiungono 0,1 mi di Tris 1 M ipH 3) che è una ammina terziaria, per inattivare l’agente alchilante.

I campioni vengono saggiati usando il procedimento di saggio immunologico per la chlamydia descritto nell’Esempio 1. Con il solo tampone si ottiene solo 0,385 ± 0,21 OD a 472/620. Il trattamento del campione con SATA a pH neutro porta ad un miglioramento dei risultati del saggio immunologico di 2,26 ± 0,75, che sono prossimi al valore di OD in un campione EB, in assenza di anti-chlamydia equina.

Sebbene sia stata descritta una reaiizzazione preferita della presente invenzione, si comprende che possono essere apportati cambiamenti, adattamenti e modificazioni, senza fuoriuscire dallo spirito dell’invenzione e dallo scopo delle rivendicazioni allegate

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Saggio immunologico migliorato per determinare un analita in un campione di un paziente contenente anticerpi che interferiscono con la rilevazione dell'analita, l’analita essendo antigenico e comprendente le seguenti fasi: a) porre in contatto il campione con un agente alchilante in grado di alchilare i gruppi sugli anticorpi anti-analita a pM non inferiore a 7,0 per modificare gli anticorpi e renderli incapaci di interferire con la determinazione dell'analita, l'agente alchilante essendo uno che non interferisce con l'antigenicità dell’analita; b) inattivare l’agente alchilante, e quindi c) eseguire il saggio immunologico sul campione pet' determinare l’arialita in presenza dell’anticorpo modificato.
2. Saggio immunologico migliorato secondo la rivendicazione 1, in cui l’analita è sensibile all’acido.
3. Saggio immunologico migliorato secondo la rivendicazione 2, in cui l’analita è un antigene lipopo— lisaccaridico.
4. Saggio immunologico migliorato secondo la rivendicazione 3, in cui l’antigene lipopolisaccaridico proviene da un microorganismo del gruppo formato da Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Salmonella typhimuriuni, Neisseria gonorrhoeae ed Escherichia coli.
5. 'Saggio imrnunologico migliorato secondo la rivendicazione 1, in cui l'agente alchilante è glutaral— deide, formaldeide, o-metilisourea, cicloesandione, butandione oppure N—idrossi succinimmide dell'acido S— acetil tioglicolico.
6. Saggio immunologico migliorato secondo la rivendicazione 1, in cui.l'agente alchilante è anche in grado di formare gruppi trasversali sugli anticorpi.
7. Saggio immunologico migliorato secondo la rivendicazione 1, in cui l'agente alchilante viene attivato ad un phl alcalino e viene inattivato a pH neutro ed in cui la fase di inattivazione comprende la neutralizzazione del pH del campione.
8. Saggio imrnunologico migliorato secondo la rivendicazione 3, comprendente inoltre le fasi di porre in contatto il campione con un detergente di estrazione appropriato a pH alcalino per rilasciare l'antigene li— popolisaccaride prima o simultaneamente al porre in contatto il campione con l’agente alchilante.
9. Kit per saggio immunologico per determinare un analita in un campione di un paziente, comprendente anticorpi endogeni che interferiscono con la rilevazione dell’analita, il kit per saggio immunologico comprende reagenti per saggio immunologico per eseguire un saggio irnmunologico sul campione per determinare l’analita, un agente alchilante in grado di alehilare gruppi sugli anticorpi a pH non inferiore a 7,0 per modificare gli anticorpi endogeni e impedire che si leghino all’analita ed un agente inattivante pei' inattivare l'agente alchilalite, i reagenti per il saggio irnmunologico essendo utilizzabili in presenza dell’agente inattivante ed agente alchilante inattivato.
10. Kit per saggio irnmunologico secondo la rivendicazione 9, in cui l’agente alchilante è glutarai— deide, formaldeide, o—metilisourea, gliceraldeide oppure N-idrossi succinimmide dell’acido S-acetiltiogli— colico.
11. Kit per saggio immunologico secondo la rivendicazione 9, in cui l’agente alchilante viene attivato a pH alcalino e inattivato a pH neutro e l’agente inattivante è un agente di neutralizzazione.
12. Kit per saggio immunologico secondo la rivendicazione 11, comprendente anche un detergente ed un reagente di metallo alcalino terroso per estrarre l’analita dal campione, ed in cui l’analita è un anti— gene lipolisaccaridico.
13. Saggio immunologico migliorato per determinare un analita sensibile all’acido in un campione di un paziente contenente anticerpi che interferiscono con la rilevazione dell’analita, l’analita essendo aritigenico e comprendente le fasi seguenti: a) dopo aver trattato il campione con estrazione alcalina per rilasciare l’analita a contatto con il campione con un agente alchilante in grado di alchilare gruppi sugli anticorpi anti-analita a pH non inferiore a 7,0 per modificare gli anticorpi e renderli incapaci di interferire con la determinazione dell’analita, l’agente alchilante essendo uno che in influenza l’antigenicità dell'analita; b) inattivare l’agente alchilante, e quindi c) eseguire un saggio immunologico sul campione per determinare l’analita in presenza dell’anticorpo modificato.
14. Saggio immunologico migliorato per determi— nare un antigene lipopolisaccaridico in un campione di un paziente contenente anticorpi che interferiscono con la rilevazione dell’analita, l’analita essendo antige— nico e comprendente le fasi seguenti: a) dopo l’estrazione con detergente alcalino del campione per rilasciare l’antigene lipopolisaccaridico a contatto con il campione con un agente alchilante in grado di alchilare gruppi sugli anticorpi anti-analita a pH non inferiore a 7,0 per modificare gli anticorpi e renderli incapaci di interferire con la rilevazione dell'analita, l’agente alchilante essendo uno che non influenza l’antigenicità dell’antigene lipopolisaccaridico; b) inattivare l’agente alchilante, e quindi c) eseguire un saggio immunologico sul campione per determinare l’aritigene lipopolisaccaridico in presenza dell’anticorpo modificato.