DE3124384C2 - Dermatanpolysulfat, Verfahren zu dessen Herstellung und dieses enthaltendes virushemmendes Mittel - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Dermatanpolysulfat, ein Verfahren zu dessen Herstellung und ein dieses Dermatanpolysulfat enthaltendes virushemmendes Mittel. Das erfindungsgemäße Dermatanpolysulfat weist einen Schwefelgehalt von etwa 7 bis 15 Gewichtsprozent und ein Molekulargewicht von etwa 2000 bis 35000 auf und hat einen gegenüber anderen untersuchten bisher bekannten, hochsulfatierten Polyanionen weitaus stärkeren virustatischen Effekt.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Dermatanpolysulfat, ein Verfahren zu dessen Herstellung und ein dieses Dermatanpolysulfat enthaltendes virushemmendes Mittel.

Dermatansulfate sind Glycosamlnoglycane, die charakteristischerweise aus sich wiederholenden Disaccharideinheiten bestehen, die ihrerseits aus Iduronsäure und N-AcetyIgalactosamin-4-sulfat sowie Glucuronsäure und N-Acetylgalati )samin-4-sulfat zusammengesetzt sind.

Dcrrnaiansuii'at wurde in verschiedenen tierischen Geweben, beispielsweise Haut. Lunge. Sehne. Herzklappe.. Aorta, Milz, Hirn, Nackenligament, Blutgefäßen sowie im Urin entdeckt. Das Dermatansulfat kann von anderen, ebenfalls in diesen Geweben enthaltenen Glycosaminoglycanen durch verschiedene Fraktionierungsmethoden getrennt werden. Dermatansulfat und Verfahren zu seiner Herstellung sind bei H. W. Stuhlsatz und H. Greillng, »The Methodology of Connective Tissue Research«, 1976, S. Ί37 und W. F. Long et al, »Thrombosis Research 18«, Pergamon Press Ltd., 1980, S. 493 beschrieben.

In einer Reihe von Veröffentlichungen, von denen stellvertretend die im »Ai hang« aufgeführten Veröffentlichungen genannt selen, wird die Virushemmung durch polyanionlsche Verbindungen beschrieben, wobei die stärksten bekannten Effekte von sulfatlerten Polyanionen ausgehen. Bei den in der Literatur untersuchten Substanzen handelt es sich dabei um den Einfluß von Heparin auf Herpes slmplex-Viren (Vaheri, 1964, siehe Anhang), Chor "roitinsulfat auf Herpes slmplex-Viren (Takemoto, 1964, s. A), Keratosulfat auf Herpes-simplex-Vlren (Nahmlas. Kibrick und Bernfeld. 1964, s. A.) und Dextransulfat auf Poilomyelltls-Viren (Pagano. 1965. s. A.). Weitere Untersuchungen oefassen sich mit der Picornavirus-Gruppe (kleine RNS-Viren), Poliomyelltis- und Echo-iEntero-Cytopathojenic Human OrphanJVlren (s. A.: Voß. 1964¹"¹; Voß, Mündler, Plötze, 1964; Voß, 1965; Voß, 1970). Bei den In diesen Versuchen verwendeten Substanzen handelte es sich um Agarmucopolysaccharld. Heparin, Chondroitinsulfat und Dextransulfat mit Molekulargewichten von 10 000 bis 2 Millionen.

Andere Untersuchungen befaßten sich mit der Wirkung von Chondroitinsulfat, Chondroitlnpolysulfat und Heparin auf den Gelbfiebervirus-Impfstamm 17 D (s A.: Voß et al. 1969; Voß. Sensch. Pan.se. 1974) sowie auf Herpes simplex- und Influenza-Ylren (s. A.: Voß. Sensch, Panse. 1974). Die lokale Anwendur-j von Chondro-Itlnpolysulfat bei Patienten mit Gürtelrose beschreiben die Arbeiten Voß, Pohle und Museteanu, 1977 sowie Voß. 1980 (siehe Anhang)

In der DD-PS I 36 572 Ist weiterhin ein Verfahren Tür Herstellung eines therapeutisch wirksamen Mucopolysaccharldpolyschwefelsäureesters aus Rinder-Trachea und dessen Eignung zur Behandlung von Gelenkerkrankungen sowie dessen blutgerinnungshemmende und/oder llpolytische (antillpänilsche) Wirkung beschrieben Für die beschriebenen Produkte gibt es keinerlei Hinwels auf eine virushemmende Wirkung.

Anno et al [Blochemica et Blophyslca Acta 237. 173 (1971)] beschreiben ein Dermatanpolysulfat. das aus Hexenfisch Isoliert wurde und einen Sulfatgehalt von 28,1% aufweist In dieser Substanz kann eine Sulfatierung des N-Acetylgalaktosamln-Anteils In 4- und 6-Stellung nachgewiesen werden Die aus dem Hexenfisch Isolierte, polysulfatierte Substanz wird durch Chondroltinsulfat-Lyase AC abgebaut

Die Autoren Anno et al erwähnen nicht, daß die beschriebene, polysulfatierte Verblr !ung In irgendeiner Weise als virushemmendes Mittel geeignet sein könnte

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue polyanionlsche Verbindung zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung Ist es. eine neue Verbindung mit überlegenen virushemmenden Eigenschaften zu schaffen

Weiterhin Hegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung zur Verfügung zu stellen

Gegenstand der Erfindung Ist ein neues Dermatanpolysulfat mn einem Schwefelgehalt von etwa 10 bis 15 Gew-%, wobei auch der Iduronsäureantell sulfatiert Ist. und einem Molekulargewicht von etwa 5000 bis 35 000. erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2 Im Unterschied zu dem Dermatanpolysulfai aus Hcicnflsch. Wie es be! An.no et ai. beschrieben 1st, Ist die chemisch sulfatlerte, erflndungsgemaße Substanz neben der Sullatlerung des N-Acetylgalaklosamin-Antells in 4- und 6-Stellung auch an seinem Iduronsäureantell sulfatiert. Dies konnte über IR-spektroskoplsche Untersuchungen und Experimente über den Abbau des erflndüngsgemäßcn, chemisch sulfatlerten Dermatanpolysulfats nachgewiesen werden. Es Ist aus sterlschen Gründen eine Sulfatlcrung der Iduronsäure In 2-Stellung anzunehmen.

Im Unterschied zum Dermatanpolysulfat, wie es bei Anno et al. beschrieben wurde, enthält das erflndungsgcmilße Dermatanpolysulfat eine Dlsaccharldelnhclt, die bis zu drei Sulfalgruppcn aufweist.

IiIn weiterer, wesentlicher Unterschied zwischen dem aus Hcxcnllsch Isolierten, natürlichen Dcrmatanpolysulfat und der vorliegenden, chemisch sulfatierten, polyanionlschen Verbindung liegt darin, daß das erflndungsge-

müße Dermatanpolysulfat nicht durch Chondroitinsulfat-Lyase AC abgebaut wird.

Experimentelle Ergebnisse zeigen daher, daß das aus dem Notochord des Hexenfisches nach Anno et al. isolierte Dermatanpolysuifat sowohl chemisch als auch in seinem enzymatischen Verhalten verschieden ist von Dermatanpolysulfat, das durch chemische Sulfatierung von Dermatansulfat, das aus Rinderaorta, Rindersehnen, Rinderhaut oder Schweinehaut gewonnen wurde.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Dermatanpolysulfat, wobei man Dermatansulfat, das aus Rinderaorta, Rindersehnen, Rinderhaut oder Schweinehaut gewonnen worden ist, in an sich bekannter Weise mit Chlorsulfonsäure in Gegenwart von Pyridin sulfatiert und das so hergestellte Dermalanpolysulfat 'n an sich bekannter Weise reinigt.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Dermatanpolysulfats im einzelnen kann wie nachstehend beschrieben erfolgen:

Dermatansulfat wird aus Rinderaorta, Rindersehnen, Rinderhaut oder Schweinehaut nach bekannten Verfahren, z. B. Stuhlsatz und Greiling, 1976, siehe Anhang, isoliert.

Das so gewonnene rune Dermatansulfat wird anschließend mit Chlorsulfonsäure in Pyridin sulfatiert. Das Reinigen und Entsalzen des Endprodukts erfolgt säulenchromatographisch. Aus der wäßrigen Lösung wird das Endprodukt wiederum gefällt und mit absolutem Alkohol, der mit Natriumacetat gesättigt ist, gewaschen. Danach erfolgt die Reinigung des Dermatanpolysulfats wiederum durch chromatographische Trennung an Cellulose und darauffolgendes fraktioniertes Eluieren mit verschieden molaren MgCU-Lösungen und anschließendes säulenchromatographisches Entsalzen. Abschließend wird das Endprodukt getrocknet.

Aufgrund der hervorragenden virushemmenden Wirkung des erfindungsgemäßen Dermatanpolysulfats betrifft die Eiftadur.g weiterhin, ein virushesnmendes Mittel, da« gekennzeichnet ist durch einen Geh* r an Dermatanpolysurfat als Wirkstoff.

Bei vergleichenden Versuchen des erfindungsgemäßen Dermatanpolysulfats mit bekannten Glycosamlnoglycanpolysulfaten zeigte sich nun völlig überraschend, daß das erfindungsgemäße Dermatanpolysulfat mindestens vier- bis zehnmal besser war als die Vergleichssubstanzen und stets ein gleichbleibend gutes Ergebnis lieferte.

Nachstehend werden die virushemmenden Wirkungen der bekannten polysulfatierten Glycosaminoglycansulfate Heparin, Chondroitinpolysulfat und Keratanpolysulfat mit der virushemmenden Wirkung von Dermatanpolysulfal verglichen.

Bei den Untersuchungen wurde das erfindungsgemäße Dermatanpolysulfat mit den im folgenden genauer beschriebenen Substanzen vergleichend untersucht.

Heparin-Natrium aus Rlnderiunge
S-Gehalt: 10.0%

Hexosamln: 152 μΜοΙ/100 mg (Glucosamin: 145 μΜοΙ/100 mg, Galactosamin: 0,05 μΜοΙ/100 mg) Uronsäure: 132 μΜοΙ/100 mg

Chondroitinpolysulfat

Polysulfatlertes Chondroitin aus

Rinderknorpel

D>saccharldeinheiten bestehend aus D-Glucuronsäure und N-Acetylgalactosamln

S-Gehalt: 13.2%

Hexosamln: 103 μΜοΙ/100 mg, davon ca. 98% Galactosamin

Glucuronsäure: 97.3 μΜοΙ/100 mg

45 Kcratanpuiysulfal

Polysulfatlertes Keratan-SCX aus Rinder-Cornea

Dlsaccharldelnheiten bestehend aus

N-Acci ν !glucosamin und D-Galactose

S-Gehalt I4.0-* Glucosamin: 141 μΜοΙ/lOOmg

Galactose 148 μΜοΙ/100 mg

Diese bekannten polysulfatierten Glycosaminoglycane wurden verglichen mit dem folgenden

Dermatanpolysulfat

Polysulfatlertes Dermatansulfat aus

Rinderaorten. Schweine- und Rinderhaut

sowie Rindersehnen

Dlsactharldelnheiten bestehend aus Iduronsäure und N-Acetylgalactosamln^-sulfat sowie

Glucuronsäure und N-Acetylgalactosamin^-sulfat

S-Gehalt: 14,61%

Sulfat-Gehalt: (-SO,H): 36,5%

Acetyl-üehalt (-CO-CH₁): 5,5% N-Gehall: 1.95%

Hexuronsäure. 94,5 μΜοΙ/100 mg

Galactosamin: 111 uMoI/100 mg

Mol.-Gewicht: 5000 bis 15 000, Hauplfraktlon bei 8000

Die Hemmwirkung der untersuchten Substanzen wurde Im Plaque-Test ermittelt. Dabei werden geeignete Zellsysteme mit abgestuften Virusverdünnungen beimpft. Nach einer typischen Adsorptionszeit wird das Impfmaterial abgenommen und die Kultur mit einem halbfesten Medium Uberschlchtet. Dieses hemmt die uneingeschränkte Ausbreitung der Viruspartikel. So entstehen durch Zerstörung von Zellgruppen Löcher In der Zellkultur, deren Zahl und Größe ermittelt werden kann (Beispiel: Gelbfiebervirus). Andere Virusarien verursachen unregelmäßig gestaltete geschädigte Zellgruppen (Beispiel: Herpes simplex-Virus). Die Hemmwirkung geeigneter Substanzen ist erkennbar an der Verringerung der Plaquezahl und/oder an der Einschränkung der Größe (des Durchmessers) der entstehenden Löcher (Plaques). Für die Untersuchungen mit Gelbfiebervirus 17 D wurde das Verfahren von De Madrid und Porterfleld, 1969 (siehe Anhang) benutzt Einschichtkulturen der stabilen Schwelnenlerenllnle PS werden Infiziert und nach einstündiger Adsorption mit l%lger Methylzellulose überschichtet, welche die Hemmstoffe In abgestuften Konzentrationen enthält. Nach 5 Tagen wird die Überschichtung entfernt und der Intakte Zellrasen mit Naphtholschwarz gefärbt. Die Stellen der Virusvermehrung bleiben als helle Flecken ausgespart. Bei Kontrollen und Inhibitorverdünnungen werden die Plaquc-Löcher gezahlt und die Durchmesser auf 0,1 mm genau ausgemessen. Die Bewertung ergibt sich aus dem Hemmquotienten

^ Geometrisches Mittel d. Plaque-Durchm.Quadrate mit GAGPS *)

Geometrisches Mittel d. Plaque-Durchm.Quadrate ohne GAGPS ·)
*) Glycosamlnoglyeanpolysulfat

nach Voß, Sensch, Panse, 1974 (siehe Anhang). Bei Hemmung liegen die Werte unter 1. Die von der Weltgcsundheltsorganlsatlon London überlassenen PS-Zellen sind japanischen Ursprungs.

Für die Experimente mit Herpes simplex-Virus erwies sich eine menschliche Hautzelllnle NCTC-2544 als geeignet (Bakken, Evans, Earle, Stevenson, 1961 (siehe Anhang)] von der Lieferfirma Flow Laboratories. Das Herpes simplex-Virus vermehrt sich nur Im direkten Übergang de' Viruspartikel von Zelle zu Zelle Im engen Kontakt Die geschädigten Zellen runden sich ab. Gruppen dieser Infizierten, veränderten Zellen (Plaques) sind mikroskopisch erk -nnbar und auszählbar (Farnham, 1958, s. A). HSV-lnflzIerie NCTC-2544-Zellen lösen sich unter geeigneten Bedingungen nicht vom Boden der Kulturflasche ab. Sie können nach der Methode von Fuerst, 1961 (siehe Anhang) durch direkte Anfärbung mit Safranin O deutlich gemacht werden, wobei die Intakten Zellen nur einen leicht gefärbten, homogenen Untergrund bilden. Die Intensiv rot gefärbten HSV-Plaqucs werden bei schwacher Vergrößerung unter dem Lupenmikroskop ausgezählt. Das Verfahren wurde für die vorliegenden Untersuchungen neu entwickelt.

Das erfindungsgemäße Dermaianpolysulfat hat einen gegenüber anderen untersuchten und bisher bekannten hochsuifaUerten Po!yan!onen weitaus «stärkeren virusstatischen Effekt. Das Dermatanpolysulfat unterscheidet sich daher in seiner Wirkungsweise grundlegend von anderen sulfatierten Polyanlonen und ermöglicht eine therapeutische Anwendung aufgrund der stark erhöhten virustatlschen Wirksamkeit bereits bei Konzentrationen zwischen 1 und 10 μg/ml. Die Wirkung Im Konzentrationsbereich um 5 Mg/ml öffnet gegebenenfalls weiterhin die Möglichkeit, den systemischen virushemmenden Effekt nach parenteraler Anwendung zu realisieren, da Polyanionenblutsplegel (Beispiel: Heparin) in dieser Größenordnung nach Subcutan- und Intramuskulärlnjektlonen bekannt sind.

Mit dem erfindungsgemäßen Dermatanpolysulfat wird somit ein MIttel zur Virushemmung zur Verfügung _4J gestellt, das völlig unerwartet allen bekannten polysulfatlerten Mucopolysacchariden weit überlegen 1st.

Die Ergebnisse dieser vergleichenden Untersuchungen sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Es zeigt

Flg. 1 vergleichende Virushemmung von Heparln-Natrlum, Chondroltlnpolysulfat, Keratanpolysulfat und Dermatanpolysulfat beim Gelbfieberimpfvirus 17 D, wobei Q den Hemmquotienten gemäß obiger Definition bedeutet.

Fig. 2 vergleichende Virushemmung von Heparin-Natrium, Chondroltlnpolysulfat, Keratanpolysulfat und Dermatanpolysuiiat beim Herpes simplex-Virus.

Die In den Flg. 1 und 2 dargestellten Kurven zeigen überzeugend den, verglichen mit den bekannten Substanzen, überraschend besseren Virushemmeffekt des erfindungsgemäßen Dermatanpolysulfats.

In dem folgenden Beispiel wird die Herstellung des Dermatanpolysulfats beschrieben.

Beispiel

Die Isolierung und Fraktionierung von Dermatansulfat aus dem vorstehend genannten tierischen Gewebe erfolgt nach den Angaben von Stuhlsatz und Greiling, 1976 (siehe Anhang).

Sulfatierung:

500 mg Dermatansulfat werden in 20 ml Formamid gelöst und mit 20 ml Pyridlnchlorsulfonsäure versetzt. Die Veresterung erfolgt bei einer Temperatur zwischen 60 und 90° C über mehrere Stunden. Nach dem Abkühlen , wird mit aqua dest. verdünnt, die wäßrige Lösung zur Entsalzung über eine Molekularfilter-Säule gegeben. Als

Elutionsmltte! wird Äthanol verwendet. Die elulerten Fraktionen werden Im Rotationsverdampfer auf ein kleineres Volumen eingeengt. Danach wird mit Natriumacetat gesättigtem Alkohol das Polysulfat ausgefällt, sorgfältig mit Äthanol und Äther gewaschen und anschließend getrocknet. Die Ausbeute beträgt etwa 70%.

Anno el al.

Λ new Dermatanpolysulfat/Chondoltlnsulfat
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1. Mitt- Wirkung von sulfatierten Glycosaminoglycanen im Plaque-Hemmtest bei verschiedenen Vlrus-Wirts-Systemen
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Voß H., Pohle H. D. und Museteanu C. Sulfatlerte Glycosamlnoglycane als Virusinhibitoren

4. Mitt. Zur Klinik der Zoster-Erkrankung mit einem neuen Therapievorschlag ZbI. Bakt. Hyg., I. Abt. OrIg. A 237, 1-34 (1977)

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1. Dermatanpolysulfat mit einem Schwefelgehalt von etwa 10 bis 15 Gew.-%, wobei auch der Iduronsäureanteil sulfatiert ist, und einem Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 35 000, erhältlich nach dem Verfah-

   j 5 ren gemäß Anspruch 2.

   2. Verfahren zur Herstellung von Dermatanpolysulfat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Dermatansulfat, das aus Rinderaorta, Rindersehnen, Rinderhaut oder Schweinehaut gewonnen worden Ist, in an sich bekannter Weise mit Chlorsulfonsäure in Gegenwar: von Pyridin sulfatiert und das so hergestellte Dermatanpolysulfat in an sich bekannter Weise reinigt.

   10 3. Virushemmendes Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Dermatanpolysulfat gemäß Anspruch I

   als Wirkstoff.