DE2105189A1

DE2105189A1 - Verfahren zur Herstellung von L Methionin auf mikrobiologischem Wege Arfm: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd., Tokio

Info

Publication number: DE2105189A1
Application number: DE19712105189
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara Kanagawa; Araki Kazumi Machida Tokio; Nakayama (Japan). B21b 19 02
Priority date: 1970-02-06
Filing date: 1971-02-04
Publication date: 1971-08-12
Also published as: US3729381A; DE2105189C3; FR2078171A5; GB1338434A; DE2105189B2; CA952050A; JPS5540240B1

Description

" Verfahren zur Herstellung von L-Methionin auf mikrobiologischem Wege "

Priorität: 6. Februar 1970, Japan, Hr. 10 005/70

L-Methionin ist eine schwefelhaltige, für Tiere essentielle Aminosäure, die häufig als Futterzusatz, z.'ri. in Rinderfutter, verwendet wird. Das L-Methionin wird ferner als lipotropes Mittel und zur Behandlung von Leberkrankheiten bei Tieren verwendet. Es wurde deshalb intensiv nach einem Verfahren zur bilDigen Herstellung von L-Methionin gesucht.

Bisher bestanden nur beschränkte Möglichkeiten zur Herstellung von L-Methionin. So wird z.B. nach einem bekannten Verfahren eine Racemattrennung von synthetisch hergestelltem DL-Methionin in die optischen Antipoden durchgeführt. Nach einem anderen Ver-

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fahren wird L-Kethionin durch Hydrolyse von I ro leinen hergestellt. L-Kethionin kann ferner auf niikrobioü ogi.schem 7/ege durch Fermentation von Mikroorganismen der Gattungen Microbacterium.und Streptorayces in einem kohlenwasser:;. toffhaltigen . Nährmedium (USA.-Patentschrift !»r. 3 219 543) hergestellt werden. In der bekanntgemachter., japanischen Patentanmeldung Kr. 19 150/64 ist ein Verfahren zur Herstellung von L-I-Iethionin beschrieben, bei dem ^-Kethylmercapto-cO-hydroxybuttersäure auf mikrobiologischem Wege in L-Kethionin umgewandelt wird. Da?; Substrat ^-Methylmercapto-ck-hydroxybuttersäure ist ein 'Zwischenprodukt zur synthetischen Herstellung von DL-Methionin. Die beiden letztgenannten Verfahren, sind jedoch nicht zufriedenstellend, da teure Ausgangsmaterialien benötigt werden und die Ausbeute an L-Methionin gering ist. Daher wurde bisher synthetisch hergestelltes, relativ billiges DL-Methionin in grossem Umfang verwendet. Synthetisch hergestelltes DL-Methionin kann zwar als Futterzusatz in Rinderfutter verwendet werden, weist aber gegenüber der Verwendung von L-Methionin Nachteile auf und kann für human- und veterinärmedizinische Zwecke nicht anstelle von L-Methionin verwendet werden.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von L-Methionin auf mikrobiologischem V/ege zur Verfugung zu stellen, das mit hoher Ausbeute abläuft. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-Methionin auf mikrobiologischem V/ege, das dadurch gekenn-

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zeichnet int, dai; man eine gegen Kethionin-analoge Verbindungen resistente Lutante coryiiCformer L-GIutaninsäure liefernder. Bakterien der Art Corynebacterium glutanicum unter aeroben Bedinguxigen in (diieni wässrigen Ilührmedium fermentiert und das L-Hethionin aus der von den Zellen befreiten Kulturbrühe nach üblichen Methoden isoliert.

Mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung gelingt es, L-Kethionin in hoher Ausbeute herzustellen.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß Mutanten corjmeformer !-Glutaminsäure liefernder Bakterien der Art Corynebacterium glutamicum, die gegen Methionin-analoge Verbindungen z.B. cC-Methylmethionin, S-lthylhomocystein, liorleucin, K-Acetylnorleucin, S-Trifluormethylhomocystein, 2-Amino-5-heptensäuren, 2-Amino-4-hexensäure, Seleiiomethionin, llethioninsulfoximin, ^-Amino-v*--methoxybuttersäure und 1 -Amino-cyclopentancarbonsäure, resistent sind, ausgezeichnete L-Methionin-Produzenten sind. Der Begriff "gegen Methionin-analoge Verbindungen resistente Mutanten" bezeichnet in der vorliegenden Beschreibung Mutanten, deren Y>^rachstum im Gegensatz zum Wachstum der meisten Stämme durch Methdonin-analoge Verbindungen nicht gehemmt v/ird. Zur Peststellung einer solchen Resistenz prüft man, ob die betreffende Hut ar. te in eijiem eine Hethionin-analoge Verbindung enthaltenden Kährmediurn wächst, üie verwendete Konzentration der Kethioinr.-analogan Verbindung hängt von der Verbindung und vom zu prüfenden Mi ;u-OGr-:ai; lanuy ab; im allgemeinen arbeitet man mit einer Konzentration der Methionin-analogen Verbindung von

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BAD ORIGINAL

500 V"/ml Nährmedium.

Die im Verfahren der Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind gegen Methionin-analoge Verbindungen resistente Mutanten coryneformer L-Glutaminsäure liefernder Bakterien der Art Corynebacterium glutamicum. Vorzugsweise wird im Verfahren der Erfindung, wie im nachstehenden Beispiel beschrieben, die gegen <*/-Methylmethionin resistente Mutante Corynebacterium glutamicum ATCC 216O8 verwendet. Es können aber auch die folgenden L-Glutaminsäure liefernden Mikroorganismen Brevibacterium glutamigenum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium thiogenitalis, Brevibacterium sp., Corynebacterium sp., Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium melassecola, Microbacterium flavum var. glutamicum und Arthrobacter sp. verwendet werden. Diese Mikroorganismen geben während der Fermentation L-Methionin in die Kulturbrühe ab und das L-Methionin kann nach bekannten Methoden aus der Kulturbrühe 'isoliert werden.

Die im Verfahren der Erfindung verwendeten L-Glutaminsäure liefernden Bakterien bilden eine taxonomisch eng verwandte Gruppe (vgl. Abe et al., J. General and Applied Microbiology, Band 13 (1967), Seite 279 - 301), die in die Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter oder Microbacterium eingeordnet werden können.

Brevibacterium gehört zur Familie Brevibacteriaceae und zur Ordnung Eubacteriales und wird im allgemeinen durch folgende

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Merkmale charakterisiert: kurze, unverzweigte Stäbchen; im allgemeinen unbeweglich; die Begeißelung beweglicher Formen ist peritrich oder unbestimmt; die Zellen enthalten manchmal wasserunlösliche, rötliche, rötlich-orange, gelbe oder braune Pigmente; Nitrat wird von manchen Arten reduziert, während andere dazu nicht in der Lage sind; ein glucosehaltiges Nährmedium reagiert im allgemeinen nach einiger Zeit sauer; Lactose wird nicht gespalten; die proteolytische Aktivität verschiedener Arten ist verschieden; aerob und fakultativ anaerob, selten mikroaerophil.

Corynebacterium gehört zur Familie Corynebacteriaceae und zur Ordnung Eubacteriales und wird im allgemeinen durch folgende Merkmale charakterisiert: gerade bis leicht gekrümmte Stäbchen mit unregelmäßig gefärbten, manchmal körnchenartigen Segmenten; die Zellen zeigen häufig keulenförmige Verdickungen; durch das "Schnappen" der Zellen während der Teilung entstehen gewinkelte oder palisadenförnlige Anordnungen von Zellen; unbeweglich mit Ausnahmen unter den pflanzenpathogeiien Arten; grampositiv, wobei manchmal junge· und manchmal alte Zellen den Farbstoff schnell verlieren; körnchenartige Körper sind gram-positiv j im allgemeinen aerob, es existieren jedoch auch mikroaerophile und anaerobe Arten; Katalase-positiv; manche Arten verflüssigen Gelatine während andere dazu nicht in der Lage sind; manche Arten reduzieren Nitrat zu ITitrit während andere dazu nicht in der Lage sind; manche Arten bauen Zucker ab während andere dazu nicht in der Lage sind; beim Abbau von Zuckern tritt sehr selten eine starke Säurebildung auf; manche Arten oxidieren

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Glucose vollständig zn C0_? und Wasser, wobei keine sichtbaren Gasmengen auftreten.

Arthrobacter gehört zur Familie Corynebacteriaceao und zur Ordnung Subacteriales und wird im allgemeinen durch folgende Merkmale charakterisiert: in jungen Zellkulturen liegen Stäbchen verschiedener Gestalt und Größe vor, wobei gerade, leicht oder stark gekrümmte, verdickte oder keulenförmige Formen vorkommen; durch das "Schnappen" der Zellen während der Teilung entstehen winkelförmige Anordnungen von Zellen; die Bildung kurzer Filamente mit rudimentären Knospungen kann besonders in nährstoffreichen flüssigen Medien auftreten; gram-negativ oder gramvariabel, charakteristisch ist das Auftreten kugelförmiger Zellen in ein oder mehrere Tage alten Kulturen, diese kugelförmigen Zellen sind die vorherrschenden Zellformen in älteren Kulturen und. sind gram-negativ bis gram-positiv; es treten auch größere kugelförmige Zellen auf, aus denen beim Überimpfen auf frisches Nährmedium eine oder mehrere stäbchenförmige Zellen entstehen; im allgemeinen unbeweglich; auf festen Nährböden weicher oder viskoser Bakterienrasen; in flüssigen Nährmedien im allgemeinen kein üppiges Wachstum; die meisten Arten verflüssigen Gelatine; aus Kohlenhydraten wrlrd keine oder nur wenig Säure gebildet; Nitrat wird im allgemeinen zu Nitrit reduziert; keine Indolbildung; aerob; die meisten Arten wachsen bei 37°C nur schwach oder gar nicht.

Microbacterium gehört zur Familie Corynebacteriaceae und zur Ordnung Eubacteriales und wird durch folgende Merkmale charak-

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terirviert: kleine Stäbchen mi't f:b ge rund et en Enden; die Länge der Stäbchen beträgt 0,5 bis 30 u; unbeweglich; körnchenartige Körper Bind mit der Methylenblau-Färbung nachweisbar; gram-posi- " tiv; gutes Oborflächenwachstum auf Medien, die Milch oder Hefeextrakt enthalten; schwache Säurebildung aus Kohlenhydraten, wobei immer L(-*-)-Milchsäure entsteht; Katalase-positiv; das Temperatur opt i raum liegt bei 32⁰C.

Die Herstellung von !-Methionin erfolgt im Verfahren der Erfindung durch Fermentation eines der genannten Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Kährmediura in Schüttel- oder Submerskultur. Die Fermentationstemperatur und der pH-Wert des Nährmediums werden so gewählt, daß man bei den für den fermentierten Mikroorganismus optimalen Bedingungen arbeitet. Das Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise bei Fermentationstemperaturen vor. etwa 20 bis etwa 40⁰C und bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchgeführt.

Im Verfahren"der Erfindung können sowohl synthetische als auchkomplexe Nährmedien verwendet werden, vorausgesetzt, daß das Nährmedium eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und geringe Mengen zusätzlicher Nährstoffe enthält, die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus erforderlich sind. Als Kohlenstoffquelle können z.B. Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructuose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, flüssiges Stärkehydrolysat und Melasse, mehrwertige Alkohole, wie Glycerin, und Carbonsäuren, wie Brenztraubensäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure verwendet

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werden. Wenn der Mikroorganismus Kohlenwasserstoff und Alkohole abzubauen vermag, können auch diese Verbindungen als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Als Stickstoffquelle können z.B. Ammoniak, Harnstoff, anorganische oder organische Ammoniumverbindungen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, und stickstoffhaltige organische Verbindungen, wie Pepton, enzymatisch abgebautes Kasein, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Kaseinhydrolysat, Fischmehl und abgebautes Fischmehl, entfetteter' Sojabohnenpreßkuchen und dessen Abbauprodukte und Schmetterlingspuppenhydrolysat, verwendet werden. Als anorganische Verbindungen können z.B. Dika-liumhydro— genphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen-(ll)-sulfat, Mangansulfat und Calciurncarbonat verwendet werden. Gegebenenfalls wird das Kährmedium-mit geringen Mengen von Nährstoffen versetzt, die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus erforderlich sind. Solche Nährstoffe sind z.B. Vitamine, Aminosäuren und organische Basen.

Vorzugsweise züchtet man zuerst eine Vorkultur des Mikroorganismus in einem Anzuchtmedium. Das beimpfte Anzuchtmedium wird unter günstigen Wachstumsbedingungen inkubiert, bis eine zur Beimpfung des zur Fermentation verwendeten Nährmediums geeignete Population gewachsen ist. Im allgemeinen sind dazu Inkubationszeiten von etwa 24 Stunden ausreichend. Das mit der Vorkultur beimpfte Kährmedium wird anschließend fermentiert bis beträchtliche Mengen von L-Methionin in dor Kulturbrüho vorliegen. Im allgemeinen fermentiert man 1 bis \, Τα_;το. Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen der- Mikroorganismus

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von der Kulturbrühe abgetrennt. Das L-Methionin läßt sich leicht aus der Kulturbrühe nach üblichen Methoden, z.B. mit Hilfe eines Ionenaustauschverfahrens, isolieren.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Zur Fermentation wird die. gegen Φ-Methy!methionin resistente Mutante Corynebacterium glutamicum (ATCC 21608) verwendet. Diese Mutante wurde nach üblichen Methoden aus Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) isoliert.

Ein 2 fj Glucose, 1 $ Pepton, 1 °/o Hefe extrakt und 0,3 ^c/> Natrium-' chlorid enthaltendes Anzuchtmedium wird beimpft und 24 Stunden bei 30⁰C schüttelnd inkubiert.

Es wird ein Nährmedium hergestellt, das 10 ^ Glucose, 0,05 f° K₂HPO₄, 0,05 $> KH₂PO₄, 2 i> QjH₄ ^SO₄, 0,025 ^c/* MgSO₄ χ 7H₂O, 0,001 io FeSO₄ χ 7H₉O, 0,001 $> MnSO₄ χ ^H₂0, 0,5 $ enzymatisch abgebautes Kasein, 20 ug Biotin/Liter, 2 mg Thiamin-hydrochlorid/Liter und 2 ^c/a CaCO^ enthält. Der pH-Wert des Nährmediums wird gegebenenfalls auf 7,2 eingestellt. 10 ml dieses Nährmediums werden nach der Sterilisation in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mit 1 ml der gezüchteten· Vorkultur beimpft. Die Fermentation wird 72 Stunden bei 30 C unter Schütteln durchgeführt. Nach dieser Zeit enthält die Kulturbrühe 3,4 mg L-Methionin/ml. Nach Entfernen der Zeller des Mikroorganismus und der übrigen Feststoffe wird das L-Methionin aus der Kultur-

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brühe mit Hilfe eines Ionen-'iustauüchverf ahrens isoliert. Die Ausbeute an L-Methionin beträgt 1,9 g/Liter Kulturbriiho.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von L-Methionin auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man eine gegen Methionin-analoge Verbindungen resistente Mutante eoryneformer L-Glutaminsäure liefernder Bakterien der Art Corynebacterium glutamicum unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium fermentiert und das L-Methionin aus der von den Zellen befreiten Kulturbrühe nach üblichen'Methoden isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium glutamicum (ATCC 21608) fermentiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei Temperaturen von etwa 20 bis etwa 40°C und bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchführt.

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