DE2164170A1

DE2164170A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Arginin

Info

Publication number: DE2164170A1
Application number: DE19712164170
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita; Kisumi Masahiko Higashi; Kato Jyoji Sakai; Sugiura Masaki Kobe; Chibata (Japan). P
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1970-12-25
Filing date: 1971-12-23
Publication date: 1972-07-13
Also published as: DE2164170B2; JPS516754B1; CH560759A5; DE2164170C3; US3734829A; FR2119755A5; GB1380936A

Description

DR. MÜLLER-BORE DIPL-PHYS. DR. MANlTZ DIPL-CHEM. DR. DEUFEL DIPL-ING. t=INSTERWALD DIPL-ING. GRÄMKOW

PATENTANWÄLTE

23. 0E2. 1871

D/Dek/Sh - T 1162

Tanabe Seiyaku Co.₅ Ltd«.

21, Doshomachi 3-chome₅

Higashi-ku, Osaka, Japan.

Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Arginin

Priorität: Japan vom 25. Dezember 1970, Ir. 125917/70

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Ii-Arginin,·

In den letzten Jahren wurde festgestellt, daß L-Arginin eine wichtige Aminosäure als aktiver Bestandteil in medizinischen Präparationen ist. Die bekannten Methoden zu ihrer Herstellung können in zwei Gruppen eingeteilt werden» Bei der einen Methode wird die Extraktion aus Proteinhydrolysat angewandt. Bei der zweiten Methode wird die chemische Synthese aus L-Ornithin angewandt. Seit langem besteht ein Bedürfnis für ein direktes Fermentierungsverfahren zur Herstellung von L-Arp;inin, ein solches Verfahren war jedoch für die Anwendung einer Herstellung im technischen Maßstab bislang nicht einsatzbereit.

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Als Ergebnis umfangreicher Untersuchungen wurde nun gefunden, daß eine gegenüber Argininhydroxamat resistente Mutante von Bacillus subtilis eine ausgezeichnete Ergiebigkeit an L-Arginin in einem Nährmedium besitzt. Zusätzlich wurde noch gefunden, daß die L-Argininergiebigkeit der Mutante zusätzlich gesteigert werden kann, indem die Fermentierung in Anwesenheit von Glutaminsäure durchgeführt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß L-Arginin durch Kultivierung einer argininhydroxamatresistenten Mutante von Bacillus subtilis in einem Hährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert wird.

Die argininhydroxamatresistente Mutante der Erfindung kann durch Ultraviolettbestrahlung eines wilden Stammes von Bacillus subtilis oder durch Behandlung eines solchen wildstammes mit einem Mutagen erhalten werden. Beispielsweise wird ein wilder Stamm von Bacillus subtilis mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt und dann 2 bis 3 Tage bei 30 C auf Agarplatten kultiviert, welche folgende Zusammensetzung aufweisen: K₂HPO₄ = 1,4 Gew./Vol.%; KB₂PO₄ = 0,6 Gew./Vol.%; MgS0₄'7H₂0 = 0,02 Gew./Vol.%; (UH₄)₂S0₄ » 0,2 Gew./Vol.%j Glucose 0,5 Gew./Vol.%\ Fatriumcitrat =«0,1 Gew./Vol.%j L-Argininhydroxamat = 0,5 mg/ml. Die .argininhydroxamatresistente Mutante von Bacillus subtilis kann in Form großer Kolonien isoliert werden. Eine lebensfähige Kultur dieser Mutante wurde unter Nr. 21742 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt.

Die Fermentierung einer argininhydroxamatresistenten Mutante von Becillus subtilis kann entweder durch Schüttelkultivierung oder durch Tauchfermentierung unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden. Bevorzugt wird die Fermentierung bei 25 ° bis 37 ⁰C durchgeführt. Das Fermentiermigsmedium enthält eine Kohlenstoffquelle, ein Stickstoffquelle und andere Elemente«

_ p —

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Geeignete Kohlenstoffquellen für die Fermentierung schließen Glucose und Stärkehydrolysate ein. Beispiele von geeigneten Stickstoffquellen sind Harnstoff, Ammoniumsalze von anorganischen Säuren, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat. Die bevorzugte Menge der Kohlenstoffquelle und der Stickstoffquelle liegen innerhalb des Bereiches von 5 bis 15 Gewo/Vol.% bzw. 0,1 bis 2 Gew./Vol.%. Darüberhinaus können dem Medium 0,2 bis 3 Gew./Vol.% organischer Nährstoffe, z. B. Maisquellwasser, Gaseinhydrolysat, Pepton, !-Asparaginsäure und 0,01 bis 2 Gew./Vol.% an anorganischen Elementen, z. B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, zugesetzt werden. Vorzugsweise wird die Fermentierung bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt. Kalziumcarbonat und Ammoniak können zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums verwendet werden.

Bei der Durchführung der Fermentierung gemäß der Erfindung kann die L-Argininpmäuktivität der zuvor genannten Mutante noch weiter durch Zugabe von etwa 1 bis 5 Gew./Vol.% von L- oder DL-Glutaminsäure gesteigert werden. Die Fermentierung gemäß der Erfindung kann in etwa 24 bis 96 Stunden erreicht werden. L-Arginin wird in der Fermentierungsbruhe angesammelt.

Nach dem Abschluß der Fermentierung werden Zellen und andere feste Bestandteile der Kultur von der Fermentierungsbrühe durch konventionelle Arbeitsweisen wie durch Erhitzen, gefolgt von Filtration oder Zentrifugierung entfernt. Bekannte Arbeitsweisen können bei der Gewinnung und/oder Reinigung von L-Arginin aus dem Filtrat oder der überstehenden Lösung angewandt werden. Beispielsweise wird die filtrierte Fermentierungsbrühe durch ein Harz eines starken KatIonenaustauschers durchgeschickt ■ oder hiermit behandelt. Dann wird das Harz mit verdünnter, alkalischer Lösung, z. B. wäßrigem Ammoniak, eluiert. Die L-Arginin enthaltenden Eluate werden vereinigt. Nach der Konzentrierung wird die Lösung mit Halogenwasserstoffsäure angesäuert, dann wird ein Alkanol wie Methanol oder Äthanol zu der Lösung hinzugegeben. Die ausgefällten Kristalle werden aus

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einem wäßrigen Alkanol, z. B. wäßrigem Methanol oder wäßrigem Äthanol, umkristallisiert, um reine Kristall von L-Argininhydrohalogenid zu erhalten.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert. Beispiel 1

Ein wäßriges Nährmedium wird hergestellt, welches die folgenden Bestandteile enthält:

L-Glutaminsäure	2	Gew.Aol.%
Glucose	8	ti
Harnstoff	0,5	ti
Ammoniumchlorid	0,3	ti
Maisquellwasser	0,7	It
Caseinhydrolysat	1,0	ti
dibasisches Kaliumphosphat	0,2	It
Magnesiumsulfat	0,01	Il

Dieses Medium wird pH = 7jO eingestellt. 30 ml des Mediums werden in eine 500 ml Schüttelflasche gegeben und deren Bestandteile durch Autoklavenbehandlung sterilisiert. Der Inhalt der Schleife einer Impfnadel an argininhydroxamatresistenter Mut anti e ATCC Nr. 21742 von Bacillus subtilis wird aseptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird das Medium 72 Stunden bei 30 ⁰C unter Schütteln kultiviert. Das so erhaltene Fermentierungsmedium enthält 5>4- mg/ml L-Arginin.

1000 ml des Fermentierungsmediums werden 10 min auf 100 ⁰C erhitzt und dann filtriert. Das Filtrat wird in eine Säule (3 cm χ 45 cm) eines Harzes eines starken Kationenaustauschers in der Η-Form (hergestellt von Röhm & Haas Company unter der Warenbezeichung Amberlite IR-120) eingeführt. Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 5 %igem wäßrigem Ammoriak eluiert. Die L-Arginin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und auf etwa 20 ml konzentriert. Die Lösung wird mit Chlorwasserstoff-

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säure angesäuert. Dann werden 20 ml Methanol zu der Lösung
hinzugegeben. Die ausfallenden Kristalle werden durch Filtration gesammelt und aus wäßrigem Methanol umkristallisiert,
Es werden 4,9 g L-ArgininhydrοChlorid erhalten; j£Jr a +22,6 ° (G =* 8; 6N-HCl).

Beispiel 2

Es wurde ein wäßriges Nährmedium hergestellt, welches folgende Bestandteile umfaßt:

Glucose	8	Gew./Vo1.%
Harnstoff	1	Il
.Ammoniumsulfat	0,5	Il
Haisquellwasser	0,7	Il
Pepton	1	Il
dibasisches Kaliumphosphat	- 0,2	Il
Magnesiumsulfat	0,01	Il
Kaliumcarbonat	2	Il

Dieses Medium wird auf pH = 7»0 eingestellt. 30 ml des Mediums werden in eine 500 ml Schüttelflasche eingefüllt und deren Inhalt durch Autoklavenbehandlung sterilisiert. Der Inhalt einer Schleife einer Impfnadel an ärgininhydroxamatresistenter Mutante ATCC Nr. 21742 von Bacillus subtilis wird aseptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird das Medium 72 Stunden bei 30 ⁰C unter Schütteln kultiviert. Das so erhaltene J?ermentierungsmedium enthält 3,5 mg/ml L-Arginin.

Beispiel 3

Es wM ein wäßriges Fährmedium hergestellt;, welches folgende
Bestandteile umfaßt:

Glucose 8 Gew./Vol.%

L-Glutaminsäure 2,5 "

Aramoniumchlo rid 2,5 "

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<0	dibasisches Kaliumphosphat	0,35	2164170
monobasisches Kaliumphosphat	0,15	Gew./Vol.%
Magne siumsulfat	0,05	Il
Eisen(II)-sulfat	0,001	Il
Mangansulfat	0,001	Il
Kaiζiumcarbonat	2	Il
Biotin	20	Il
	uk/1 %

Dieses Medium wird auf pH =« 7,0 eingestellt. 30 ml des Mediums werden in eine 500 ml Schüttelflasche eingefüllt und deren Inhalt durch Autoklavenbehandlung sterilisiert. Der Inhalt einer Schleife einer Impfnadel an argininhydroxamatresistenter Mutante ATCC Nr. 21742 von Bacillus subtilis wird aseptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird das Medium 48 Stunden bei 30 ⁰C unter Schütteln kultiviert. Das so erhaltene Fermentierungsmedium enthält 12,3 mg/ml Ir-Arginin.

Patentansprüche i

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Claims

Patent anspräche

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Arginin, dadurch gekennzeichnet , daß eine argininhydroxamatresistente Mutante von Bacillus subtilis in einem nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und das angesammelte L-Arginin aus der Fermentierungsbrühe gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutante Bacillus subtilis ATCC Nr. 21742 verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in Anwesenheit von 1 bis 5 Gew./Vol.% L- oder DL-G-lutaminsäure durchgeführt wird.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die K
durchgeführt wird.

net, daß die Kultivierung bei etwa 25 ° bis etwa 37

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt wird.

6. L-Arginin, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5.

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