DE2413961C2 - Biotechnische Herstellung von Citronensäure - Google Patents

Biotechnische Herstellung von Citronensäure

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Description

Es sind verschiedene Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure unter Verwendung von Hefen bekannt. Dabei wird im allgemeinen in der Gärmaische eine beträchtliche Menge Isocitronensäure als Nebenprodukt gebildet. Die wirtschaftliche Bedeutung von Isocitronensäure ist jedoch so gering, daß ihre Bildung nicht erwünscht ist. Außerdem wird durch die gleichzeitige Bildung von Isocitronensäure die Isolierung und Reinigung der Citronensäure aus der Gärmaische stark erschwert.
Ferner ist ein biotechnisches Verfahren bekannt, bei dem die Bildung von Isocitronensäure durch die Gegenwart von Eisenionen oder Eisen enthaltenden Ionen, wie Fe(CN)6~4, beschleunigt wird; vgl. Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, Bd. 44 (1970), S. 562 und US-PS 37 73 620. Um die Bildung von Isocitronensäure als Nebenprodukt zu verhindern, ist es also notwendig, Eisenionen oder Eisen enthaltende Ionen vom Nährmedium fernzuhalten. Jedoch ist bei großtechnischen Verfahren die Verunreinigung des Nährmediums durch Eisenionen unvermeidlich, da diese durch die Fermentationsrohstoffe und die Fermentationseinrichtungen eingeschleppt werden. Beispielsweise werden zur großtechnischen Herstellung von Citronensäure im allgemeinen Vorrichtungen aus korrosionsbeständigem Stahl oder unter Verwendung von Glas hergestellte Vorrichtungen verwendet. In beiden Fällen ist die Verunreinigung des Nährmediums mit Eisenionen unvermeidlich. Auch eine geringfügige Verunreinigung des Nährmediums durch die Fermentationsvorrichtung wird als ausreichend betrachtet, die Bildung einer signifikanten Menge von Isocitronensäure zu verursachen und dadurch das Verfahren zu erschweren.
In der US-PS 36 89 359 (entspricht DE-OS 20 02 048) ist ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure mit Hilfe von speziellen Hefen der Gattung Candida beschrieben, die nicht in der Lage sind, Citronensäure zu verwerten und die Bildung von Isocitronensäure auf ein Mindestmaß zu beschränken. Dieses Verfahren weist jedoch verschiedene Nachteile auf. Versuche haben ergeben (vgl. das nachstehende Beispiel 4), daß bei Verwendung des Stammes Candida sp. H-22 ATCC Nr. 20238, der gemäß Beispiel 2 der US-PS 36 89 359 Citronensäure in einer Menge von 112 mg/ml bilden soll, erheblich weniger Citronensäure anfällt, nämlich nur 10,1 mg/ml.
Aus der FR-PS 20 35 420 (entspricht DE-OS ίο 20 05 848) ist die Herstellung von Citronensäure und Isocitronensäure unter Verwendung von Candida zeylanoides ATCC 15585 beschrieben. Nach den Beispielen dieser Patentschrift wird Citronensäure und Isocitronensäure in nahezu gleichen Mengen gebildet, mit Ausnahme von Beispiel 5, bei dem dem Nährmedium 2% Methanol zugesetzt werden. In diesem Fall beträgt das Mengenverhältnis von Citronensäure zu Isocitronensäure noch 85 :10 mg/ml. Der Zusatz von Methanol zum Nährmedium ist jedoch unerwünscht, da er das Verfahren verteuert und restliches Methanol bei der Aufarbeitung abgetrennt werden muß.
Schließlich ist in der US-PS 31 18 821 ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure unter Verwendung von Aspergillus niger beschrieben. Es wird ein Zucker enthaltendes Medium mit einem Gehalt von 10 bis 400xl0~6g/ml Ferrocyanid verwendet. Die höchste Ausbeute an Citronensäure beträgt 18,51 y/ml. Das Verfahren liefert zu geringe Ausbeuten.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein großtechnisch durchführbares Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure unter Verwendung bestimmter, aus Candida zeylanoides ATCC 20347 nach üblichen Mutationsbehandlungen erhaltener Mutanten zur Verfügung zu stellen, bei dem die Bildung von Isocitronensäure unterdrückt wird, während Citronensäure in ebenso guten oder größeren Ausbeuten als bei den entsprechenden Verfahren unter Bildung von Isocitronensäure als Nebenprodukt erhalten wird und die bisher nötige Reinigung der Citronensäure im wesentlichen entfallen kann.
Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß bestimmte Mutanten von C. zeylanoides ATCC 20347, die für ein ebenso gutes Wachstum, wie es der Ausgangsstamm aufweist, größere Mengen an Eisenionen als letzterer benötigen, im wesentlichen die Bildung von Isocitronensäure als Nebenprodukt unterdrücken und Citronensäure im Vergleich zum Ausgangsstamm in gleich guten oder sogar größeren Ausbeuten bilden.
Die Erfindung betrifft somit den im Patentanspruch 1 genannten Gegenstand. Die Patentansprüche 2 und 3 beinhalten Ausgestaltungen der Erfindung.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Hefemutanten haben also einen bestimmten Nährstoffbedarf an Eisen.
Derartige Mutanten werden gelegentlich auch als auxotrophe Mutanten bezeichnet. Auxotrophe Mutanten sind solche, die Wachstumsfaktoren benötigen, für die bei den Ausgangsstämmen kein Bedarf vorliegt.
Der Eisenbedarf der erfindungsgemäß verwendeten Mutanten wird durch die Gegenwart von Eisenionen oder Eisen enthaltenden Ionen befriedigt. In der Praxis werden dazu dem Nährmedium Verbindungen zugesetzt, die Eisenionen oder Eisen enthaltende Ionen aufweisen.
Es ist schwierig festzustellen, ob die Ausgangsstämme der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mutanten einen Eisenbedarf aufweisen oder nicht, da es
praktisch unmöglich ist, einen Stamm in absoluter Abwesenheit von Eisenionen zu züchten. Wie bereits erwähnt, ist die Verunreinigung des Nährmediums durch Eisenionen, die durch Fermentationsrohstoffe und Glasapparaturen eingeschleppt werden, unvermeidlich. Daher werden solche Stämme als Ausgangsstämme ohne Eisenbedarf definiert, die in einem Nährmedium, das nicht absichtlich mit Eisenquellen versetzt ist, ein ausreichendes Wachstum zeigen. Die Ausgangsstämme benötigen also allenfalls Spurenmengen an Eisen. Demgegenüber zeigen die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Mutanten in einem Nährmedium, das nicht absichtlich mit Eisenquellen versetzt ist, ein schlechteres Wachstum als die Ausgangsstämme. Andererseits ist das Wachstum der Mutanten in mit Eisenquellen versetzten Nährmedien vergleichbar mit dem der Ausgangsstämme. Exakt ausgedrückt weisen die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mutanten also nicht einen »Eisenbedarf« sondern einen »erhöhten Eisenbedarf« auf.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mutanten weisen in Gegenwart von mindestens 0,1 mg/LiUr und zweckmäßig mindestens 0,2 mg/Liter Eisen ein Wachstum auf, das mit dem des Ausgangsstammes vergleichbar ist. Im Verfahren der Erfindung werden folgende durch Mutation von Candida zeylanoides ATCC 20347 erhaltene Mutanten eingesetzt: Candida zeylanoides ATCC 20391, Candida zeylanoides ATCC 20392, Candida zeylanoides ATCC 20393 und Candida zeylanoides ATCC 20367. Diese Mutanten sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A. hinterlegt und der Öffentlichkeit frei zugänglich. Die vorgenannten Mutantenstämme weisen einen höheren Eisenbedarf als der Ausgangsstamm auf. Candida zeylanoides ATCC 20367 benötigt neben Eisen zusätzlich noch Glycerin.
Zur Erläuterung ihres Nährstoffbedarfs werden die Stämme Candida zeylanoides ATCC 20391, ATCC 20392, ATCC 20393 und ATCC 20367 sowie der Ausgangsstamm Candida zeylanoides ATCC 20347 in einem Grundnährmedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:
Glucose 30 g/Liter
NH4Cl 3 g/Liter
KH2PO4 0,5 g/Liter
MgSO4 ■ 7 H2O 0,5 g/Liter
MnSO4 · 4 H2O 2 mg/Liter
ZnSO4 · 7 H2O 2 mg/Liter
CuSO4 · 5 H2O 50 μg/Liter
Thiamin hydrochlorid 100 μg/Liter
CaCO3 10 g/Liter
Glycerin (nur beim Stamm
ATCC 20367) 0,5 g/Liter
pH-Wert 7,0
Dieses Grundmedium wird mit FeSO4 · 7 H2O in folgenden Konzentrationen versetzt: 0,25 mg/Liter (etwa 0,05 mg/Liter Eisenionen), 0,5 mg/Liter (etwa 0,1 mg/Liter Eisenionen), 1 mg/Liter (etwa 0,2 mg/Liter Eisenionen) 2,5 mg/Liter (etwa 0,5 mg/Liter Eisenionen) und 5 mg/Liter (etwa 1,0 mg/Liter Eisenionen). Jeder der zu untersuchenden Stämme wird auf einem Malzextrakt-Schrägagar, der durch Lösen von 4 g Glucose, 4 g Hefeextrakt und 10 g Malzextrakt in Wasser bei einem Gesamtvolumen von 1 Liter und durch Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 hergestellt ist, 24 Stunden bei 30° C angezüchtet. Die erhaltenen Kulturen werden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspensionen werden auf 10 ml des Grundmediums, bzw. auf die mit den Zusatzstoffen versetzten Nährmedien überimpft. Die Züchtung wird in einem großen Reagensglas bei einer Zellenkonzentration von 107 Zellen/ml 48 Stunden unter Schütteln bei 30°C durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird das Wachstum durch Messung der optischen Dichte der Gärmaische bei 660 πιμ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I Wachstum 5,2 an Eisenionen 0,1 mg/Liter 0,2 mg/Liter 0,5 mg/Liter 1,0 mg/Liter
Stämme Konzentration 5,1 0,05 mg/Liter 12,0 12,8 13,0 14,0
0 5,0 8,0 12,2 12,9 13,0 13,8
4,5 8,5 12,4 13,0 13,2 14,0
ATCC 20 391 13,3 9,0 12,2 12,5 13,0 13,8
ATCC 20 392 7,0 — 13,5 14,2 14,4
ATCC 20 393 —
ATCC 20 367
ATCC 20 347
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß^die Mutantenstämme Candida zeylanoides ATCC 20391, ATCC 20392, ATCC 20393 und ATCC 20367 in Gegenwart von 0,1 mg/Liter Eisen etwa 90 Prozent des Wachstums des Ausgangsstammes Candida zeylanoides ATCC 20347 aufweisen, während sie in Gegenwart von 0,2 mg/Liter Eisen oder mehr ein ebenso gutes Wachstum wie der Ausgangsstamm zeigen.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Mutanten mit einem erhöhten Eisenbedarf können nach zur Herstellung von Stämmen mit einem Nährstoffbedarf üblichen Verfahren hergestellt werden. Diese mutagene Behandlung kann beispielsweise durch Bestrahlung mit Röntgen- oder UV-Strahlen oder durch Behandlung mit Stickstofflost oder Nitrosoguanidin erfolgen. Beispielsweise werden Hefezellen in einem Tris-Maleat-Puffer vom pH-Wert 9,0 suspendiert, der bei einer Zellenkonzentration von 108 Zellen pro 1 ml 200 y/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin enthält. Die Suspension wird 15 Minuten stehengelassen. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert, mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, auf eine Agarplatte überimpft und inkubiert. Aus den erhaltenen Kolonien werden nach üblichen Verfahren Reinkolonien herge-
stellt. Die Reinkolonien werden nach dem vorgenannten Verfahren im Vergleich zum Ausgangsstamm untersucht. Stämme, die den gewünschten Eisenbedarf aufweisen, im Vergleich zum Ausgangsstamm Citronensäure in größeren Ausbeuten bilden und die Bildung von Isocitronensäure im wesentlichen unterdrücken, werden für das erfindungsgemäße Verfahren ausgewählt.
Die Züchtung der Hefen wird in hierfür üblichen Nährmedien durchgeführt. Diese Nährmedien enthalten verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls je nach dem Bedürfnis des verwendeten Hefestamms andere Wachstumsfaktoren.
Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffine und Kerosin, Kohlenhydrate, wie Glucose und Rohrzuckermelasse und Essigsäure. Beispiele für Stickstoffquellen sind anorganische Verbindungen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Harnstoff und natürliche stickstoffhaltige Materialien, wie Pepton, Fleischextrakt und Maisquellwasser. Gegebenenfalls können zusätzlich anorganische Salze, wie Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-chlorid und Zinksulfat verwendet werden.
Eisen(II)-sulfat und Eisen(III)-chlorid werden zwar dem Nährmedium am besten als Quellen für Eisenionen zugesetzt, es können aber auch alle anderen löslichen Eisensalze verwendet werden, die keine toxische Wirkung auf die Mikroorganismen ausüben.
Beispiele für Eisen enthaltende Ionen sind Kaliumferrocyanid, Natriumferrocyanid, Kaliumferricyanid, Natriumferricyanid und Eisenalaun.
Die Züchtung wird zweckmäßig unter aeroben Bedingungen bei 20 bis 400C bei leicht saurem bis neutralem pH-Wert von etwa 3 bis 7 durchgeführt. Nach etwa 2- bis 5tägiger Züchtung reichern sich beträchtliche Citronensäuremengen in der Gärmaische an. Der pH-Wert wird gegebenenfalls durch Zusatz von Calciumcarbonat, Natriumhydroxid oder Ammoniaklösung eingestellt.
Nach beendeter Züchtung werden die Mikroorganismenzellen aus der Gärmaische, beispielsweise durch Filtrieren, entfernt, anschließend wird das Filtrat eingeengt. Durch Zusatz von Calciumhydroxid zum Filtrat läßt sich die Citronensäure leicht als Calciumcitrat gewinnen. Das Calciumcitrat wird durch Zusatz von Schwefelsäure unter Ausfällung von Calciumsulfat in Citronensäure übergeführt. Selbstverständlich kann die Citronensäure auch nach anderen üblichen Reinigungsverfahren gewonnen werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. einem mit Prallplatten ausgerüsteten 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben.
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n- Paraffine 30 ml/Liter
NH4Cl 5 g/Liter
KH2PO4 0,5 g/Liter
MgSO4 · 7 H2O 0,5 g/Liter
MnSO4 · 4 H2O 2 mg/Liter
ZnSO4 · 7 H2O 2 mg/Liter
FeSO4 · 7 H2O 1 mg/Liter
CuSO4 · 5 H2O 50 μg/Liter
Thiamin-hydrochlorid 100μg/Liter
CaCO3
(getrennt sterilisiert) 10 g/Liter
pH-Wert 6,0
Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30° C unter einer Schüttelbewegung von 200 U/min durchgeführt. Jeweils 2 ml dieser Anzuchtkulturen werden sodann auf 20 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung, das sich in einem 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben befindet, überimpft.
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n-Paraffine 100 ml/Liter
NH4Cl 5 g/Liter
KH2PO4 0,5 g/Liter
MgSO4 · 7 H2O 0,5 g/Liter
MnSO4 ■ 4 H2O 2 mg/Liter
ZnSO4 · 7 H2O 2 mg/Liter
FeSO4 ■ 7 H2O 10 mg/Liter
CuSO4 ■ 5 H2O 50 μg/Liter
Thiamin-hydrochlorid 100 μg/Liter
CaCO3
(getrennt sterilisiert) 80 g/Liter
pH-Wert 6,0
Die Züchtung wird 96 Stunden bei 30° C unter einer Schüttelbewegung von 200 U/min durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
Tabelle II
Stämme
Citronensäure (mg/ml)
Isocitronensäure
(mg/ml)
ATCC 20 391
ATCC 20.392
ATCC 20 393
ATCC 20 347
77 84 77 48
2,0
3,7
2,9
30,0
Beispiel 1
Es werden Candida zeylanoides ATCC 20391, ATCC 20392 und ATCC 20393, die jeweils mindestens 0,1 mg/Liter Eisen benötigen, verwendet. Als Vergleichsstamm wird Candida zeylanoides ATCC 20347 verwendet, der diesen Eisenbedarf nicht aufweist. Die Stämme werden jeweils in einem Malextrakt-Schrägagar, das durch Lösen von 4 g Glucose, 4 g Hefeextrakt und 10 g Malzextrakt in Wasser bei einem Gesamtvolumen von 1 Liter und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 hergestellt ist, 24 Stunden bei 30° C gezüchtet. Die erhaltenen Kulturen werden auf 20 ml eines Anzuchtnährmediums der folgenden Zusammensetzung überimpft. Dieses Anzuchtnährmedium befindet sich in
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Beispiel 2
Es werden die Stämme Candida zeylanoides ATCC 20367, der mindestens 0,1 mg/Liter Eisen benötigt, und Candida zeylanoides ATCC 20347, jeweils 24 Stunden bei 30° C auf einem gemäß Beispiel 1 hergestellten Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet. Die erhaltenen Kulturen werden auf jeweils 20 ml des in Beispiel 1 angegebenen Anzuchtmediums gegeben, das aber zusätzlich 5 g/Liter Glycerin enthält. Dieses Anzuchtmedium befindet sich in 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben. Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30° C unter einer Schüttelbewegung von 200 U/min durchgeführt. Jeweils 2 ml der erhaltenen Anzuchtkulturen werden anschlie-
ßend auf 20 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung, das sich in 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben befindet, überimpft.
n-Parafhne lOOml/Liter
Glycerin 1 g/Liter
NH4Cl 5 g/Liter
KH2PO4 0,5 g/Liter
MgSO4 · 7 H2O 0,5 g/Liter
MnSO4 · 4 H2O 2 mg/Liter
ZnSO4 · 7 H2O 2 mg/Liter
FeSO4 · 7 H2O O- -100 mg/Liter*)
CuSO4 · 5 H2O 50 μg/Liter
Thiamin-hydrochlorid 100 μg/Liter
CaCO3
(getrennt sterilisiert) 80 g/Liter
pH-Wert 6,0
*) FeSO4 · 7 H2O wird in verschiedenen, in Tabelle III
angegebenen Mengen zugegeben.
Stämme FeSO4 · Citronen Isocitronen-
7H2O säure säure
(mg/Liter) (mg/ml) (mg/ml)
ATCC 20 367 O 65 0,8
0,2 68 0,8
1 70 2,0
10 73 3,2
20 71 4,5
100 70 8,0
ATCC 20 347 0 58 12,0
1 52 18,0
10 42 26,0
100 40 30,5
Beispiel 3
Tabelle IV
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Die Züchtung wird 96 Stunden bei 30° C unter einer Schüttelbewegung von 200 U/min durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.
Tabelle III
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Stämme Citronensäure
(mg/ml)
Isocitronensäure (mg/ml)
ATCC 20 367
ATCC 20 347
105,0
84,0
3,0
18,0
3 Liter der vorstehenden, durch Züchtung von ATCC 20367 erhaltenen Gärmaische, die 315 g Citronensäure enthält, werden zur Entfernung der Mikroorganismenzellen abfiltriert. Das zellfreie Filtrat wird mit 200 g Calciumhydroxid versetzt. Man erhält 350 g Calciumnitrat.
Beispiel 4
Es werden Candida zeylanoides ATCC 20367 und ATCC 20347 verwendet. Außerdem werden die aus der US-PS 36 89 359 bekannten, Citronensäure bildenden Stämme Candida lipolytica ATCC 20237, Candida sp. ATCC 20238, Candida sp. ATCC 20239, Candida sp. ATCC 20241 und Candida tropicalis ATCC 20240 verwendet. Diese Stämme werden jeweils 24 Stunden bei 30° C auf einem Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet. Proben der erhaltenen Kulturen werden auf jeweils 20 ml eines Anzuchtmediums, das sich in 250 ml fassenden, mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben befindet, überimpft. Das Anzuchtmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 2, mit der Ausnahme, daß es 50 μg/Liter Thiamin-hydrochlorid und 20 g/Liter CaCO3 enthält. Die Anzucht wird 24 Stunden bei 300C unter einer Schüttelbewegung von 200 U/min durchgeführt. Anschließend werden 2 ml der erhaltenen Anzuchtkulturflüssigkeiten auf 20 ml Nährmedium, das sich in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben befindet, überimpft. Das Medium hat die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 1, enthält aber 500 mg/Liter FeSO4 · 7 H2O. Die Züchtung wird 120 Stunden bei 30° C unter einer Schüttelbewegung von 200 U/min durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle V zusammengestellt.
Tabelle V
45
Die Stämme Candida zeylanoides ATCC 20367 und Nr. 19-5 ATCC 20347 werden 24 Stunden bei 30° C auf einem gemäß Beispiel 1 hergestellten Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet. Von den erhaltenen Kulturen werden jeweils drei ösen voll auf 200 ml eines Anzuchtmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 2 auf 2 Liter fassende, mit Prallplatten ausgerüstete Erlenmeyerkolben überimpft und unter Schütteln 24 Stunden bei 30° C gezüchtet. Jeweils 300 ml der erhaltenen Kulturflüssigkeit (entsprechend dem Volumen von I1/2 Kolben) werden auf 3 Liter Nährmedium, das sich in 5 Liter fassenden Glasfermentern befindet, überimpft. Das Nährmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 2 mit einem Gehalt an 1 mg/Liter FeSO4 · 7 H2O. Jedoch enthält dieses Nährmedium kein CaCO3. Die Züchtung wird unter Einhaltung einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min 90 Stunden bei 30° C durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert des Nährmediums mit wäßriger Ammoniaklösung auf 6,0 eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Stämme FeSO4 -7 H2O: 500 mg/Liter
Citronensäure Isocitronensäure
(mg/ml) (mg/ml)
ATCC 20 367 95,5 13,8
ATCC 20 347 36,7 32,2
ATCC 20 237 59,4 21,0
ATCC 20 238 10,1 7,4
ATCC 20 239 6,2 7,7
ATCC 20 240 25,8 17,0
ATCC 20 241 37,0 46,2
Aus dieser Tabelle ist folgendes ersichtlich:
In Gegenwart von 500 mg/Liter FeSO4 · 7 H2O sind die Mengen an Citronensäure, die durch C. lipolytica ATCC 20237 und C. sp. ATCC 20241 gebildet werden, verringert, während die durch C. zeylanoides ATCC 20367 erzeugte Menge an Citronensäure erhöht ist.
C. zeylanoides ATCC 20367 ist deshalb den bekannten Stämmen ATCC 20237 bis 20241 hinsichtlich der Erzeugung von Citronensäure bei Verwendung
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eines Mediums mit beträchtlichen Mengen Eisenionen überlegen. Aus technischen Gründen ist die Verunreinigung des Mediums durch Eisenionen unvermeidbar aufgrund der eingesetzten Ausgangsmaterialien und der verwendeten Vorrichtungen. Also sind die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen, die in Gegenwart von mindestens 0,1 mg/Liter Eisenionen große Mengen Citronensäure bilden, für die technische Herstellung von Citronensäure wertvoller als die aus der US-PS 36 89 359 bekannten Mikroorganismen.
Beispiel 5
Es werden Candida zeylanoides ATCC 20367 und Candida lipolytica ATCC 20237 (beschrieben in der US-PS 36 89 359) jeweils auf 20 ml eines ersten Anzuchtmediums der folgenden Zusammensetzung, das sich in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben befindet, überimpft.
überimpft und darin 48 Stunden bei 300C gezüchtet. Die zweiten Anzuchtkulturen werden sodann auf jeweils 3 Liter eines dritten Anzuchtmediums der gleichen Zusammensetzung, das sich in 5 Liter fassenden
1S Glasfermentern befindet, überimpft und darin 24 Stunden bei 30° C gezüchtet. Jeweils 300 ml der dritten Anzuchtkulturen werden sodann auf jeweils 3 Liter der Nährmedien C und D, die sich in 5 Liter fassenden Glasfermentern befinden, überimpft. Die Medien C und
ι ο D haben die folgende Zusammensetzung:
20
n-Paraffine
KH2PO4
(NHt)2SO4
MgSO4 · 7 H2O
KCl
NaCl
FeSO4 · 7 H2O
Thiamin-hydrochlorid
CaCO3
Glycerin (nur beim Stamm
ATCC 20367)
pH-Wert
30 ml/Liter
1 g/Liter
4 g/Liter
5 g/Liter
0,1 g/Liter
1 g/Liter
10 mg/Liter
300 μg/Liter
10 g/Liter
5 g/Liter
6,0 Medium C
Medium D
n-Paraffine
KH2PO4
(NH4)2SO4
NH4Cl
MgSO4
KCl
NaCl
ZnSO4 25 CuSO4 FeSO4
MnSO4
7H7O
7H2O
5H2O
7H2O
4H2O
Thiamin-hydrochlorid
CaCO3
100 ml/Liter 0,25 g/Liter 4 g/Liter
0,5 g/Liter
0,5 g/Liter
0,1 g/Liter
1 mg/Liter
100 [ig/Liter
100 mg/Liter
50 ;j.g/Liter 1 g/Liter
100 ml/Liter 0,5 g/Liter
5 g/Liter 0,5 g/Liter
2 mg/Liter
50 [ag/Liter
100 mg/Liter
2 mg/Liter
50 ,Hg/Liter
Die Züchtung wird 48 Stunden bei 30°C unter Schütteln durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltenen ersten Anzuchtkulturen werden auf jeweils 300 ml eines zweiten Anzuchtmediums, das sich in 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben befindet und die gleiche Zusammensetzung wie das erste Anzuchtmedium aufweist,
Tabelle VII
Die Züchtung wird 96 Stunden bei 300C unter Einhaltung einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min durchgeführt, wobei der pH-Wert mit wäßriger Ammoniaklösung auf 6,0 eingestellt wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt:
Stämme
Medium Züchtungsdauer
(Std.)
Citronensäure
(mg/ml)
Isocitronensäure (mg/ml)
ATCC 20 367
ATCC 20 237
C 72 85,9 12,2
96 87,7 11,4
D 72 88,6 6,8
96 101,9 4,2
C 72 76,0 17,3
96 71,7 17,3
D 72 66,7 12,8
96 69,9 12,4
Beispiel6
Es werden Candida zeylanoides ATCC 20367 und ATCC 20347 jeweils 24 Stunden bei 300C auf einem gemäß Beispiel 1 hergestellten Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet. Die erhaltenen Kulturen werden auf jeweils 20 ml. eines Anzuchtnährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 2, das sich in 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben befindet, überimpft und darin 24 Stunden bei 3O0C unter einer Schüttelbewegung von 200 U/min gezüchtet. Jeweils 2 ml der so erhaltenen Anzuchtkulturen werden auf 20 ml eines in 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben befindlichen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung überimpft.
Glucose
Calciumacetat-monohydrat Glycerin
NH4Cl
KH2PO4
MgSO4 ■ 7 H2O
MnSO4 ■ 4 H2O
ZnSO4 ■ 7 H2O
FeSO4 · 7 H2O
CuSO4 · 5 H2O
Thiamin-hydrochlorid
CaCO3
(getrennt sterilisiert)
pH-Wert
20 g/Liter 7,5 g/Liter
1 g/Liter 5 g/Liter 0,5 g/Liter 0,5 g/Liter
2 mg/Liter 2 mg/Liter 1 mg/Liter
50 μg/Liter 100 μg/Liter
10 g/Liter 6,0
IO 12
Die Züchtung wird 96 Stunden bei 30° C unter einer Schüttelbewegung von 200 U/min durchgeführt. Dabei werden dem Medium nach Ablauf von 24, 48 und 72 Stunden jeweils 29,4 g/Liter Calciumacetat-monohydrat zugesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengestellt.
Tabelle VIII
Stämme
ATCC 20 ATCC 20 Citronensäure
(mg/ml)
Isocitronensäure (mg/ml)
32,0
27,0
0,7
7,5
Beispiel 8
von 200 U/min. Die
zusammengestellt.
Tabelle IX
Es werden Candida zeylanoides ATCC 20367 und ATCC 20347 24 Stunden bei 30°C auf einem gemäß Beispiel 1 hergestellten Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet. Von den erhaltenen Kulturen wird jeweils eine Öse voll aaf jeweils 20 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung überimpft: 150 g/Liter (berechnet als Zucker) mit Invertase behandelte Rohrzuckermelasse,
g/Liter NH4Cl, 0,5 g/Liter MgSO4 ■ 7 H2O, 1 g/Liter
Glycerin und 60 g/Liter CaCO3 (pH-Wert 6,0). Dieses Medium befindet sich in 250 ml fassenden, mit ATCC 20 Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben. Man ATCC 20 züchtet 120 Stunden bei 30° C unter Schüttelbewegung Ergebnisse sind in Tabelle IX
Stämme Citronensäure Isocitronensäure
(mg/ml)
(mg/ml)
85,0
70,0
1,5 8,2

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure durch Züchtung von Stämmen der Art Candida zeylanoides in einem Nährmedium mit einem Gehalt, an verwertbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Eisenionen oder Eisen enthaltenden Ionen und Isolieren der in der Gärmaische angereicherten Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von Candida zeylanoides ATCC 20391, Candida zeylanoides ATCC 20392, Candida zeylanoides ATCC 20393 oder Candida zeylanoides ATCC 20367 und mindestens 0,1 mg/Liter Eisenionen oder Eisen enthaltenden Ionen durchführt, wobei bei Verwendung von Candida zeylanoides ATCC 20367 die Züchtung in Gegenwart von Glycerin durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei 20 bis 40° C durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Quelle für Eisenionen FeSO4 · 7 H2O verwendet.
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