DE1695318C3 - Verfahren zur Herstellung von 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophosphat - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophosphat

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DE1695318C3
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Kiyoshi Kamitsuruma Sagamihara Nakayama
Zenroku Minami-Oya Machida Sato
Haruo Setagaya Tokio Tanaka
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von o-Mercaptopurinribosyl-S'-monophosphat. Dieser Verbindung entspricht die Formel
HO—P—O—CH:
OH OH
Aus.J.Biol.Chem.236(1961),S. 1158 bis 1162. ist es bekannt, o-Mercaptopurinribosyl-S'-monophosphat auf chemischem Wege herzustellen.
In J. Biol. Chem. 231 (!958), S. 467 bis 480, ist ferner die Herstellung dieser Verbindung auf enzymatischem Wege unter Verknüpfung des 6-Mercaptopurinresis mit dem 5-Ribosylphosphatrest beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von 6-MercaplopurinribosyI-5'-monophosphat zur Verfügung zu stellen, das in wirtschaftlicher Weise und im industriellen Maßstab durchführbar ist.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß man Brevibacterium ammoniagenfs ATCC Nr. 6871, Brevibaelerium ammoniagenes ATCC Nr. 6872, Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 15 750 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 15 751 in einem Fermentationsmedium, das außer den üblichen Bestandteilen 6-Mcrcaptopurin in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 g je Liter Medium enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 40 C und einem nH-Wert von 5,5 bis 9 züchtet und das im Kulturmedium angereicherte 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophosphat nach üblichen Methoden isoliert.
Während des Züchtens der genannter. Mikroorganismen unter den angegebenen Bedingungen sammeln sich erhebliche Mengen 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophosphat in dem Medium an.
Als Nährmedium kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jedes Medium verwendet werden. d„s eine Kohlenstoffquelle, wie z. B. Kohlenhydrate (r -:. GIukose, Stärkehydrolyseprodukte und Melassen), eine Stickstoffquelle (z.B. Harnstoff, Ammoniumdilorid und Ammoniumnitrat), anorganische Substanzen (z. B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid) und stickstoffhaltige Naturprodukte (z. B. Mais-,5 quellflüssigkeit, Hefeextrakt, Pepton und Fischmehl) in geeignetem Mengenverhältnis enthält. Derartige Nährmedien sind für die Bakterienzüchtung bekannt. Wenn einer der genannten Stämme von einem bestimmten Nährstoff abhängig ist, so muß natürlich dieser Nährstoff in dem Medium enthalten sein.
Das 6-Mercaptopurin kann vom Anfang der Fermentation an in dem Medium enthalten sein oder dem Fermentationsmedium während des Verlaufs der Fermentation zugegeben werden. Wenn das 6-Mercaptopurin während des Verlaufs der Fermentation zugegeben wird, kann die Zugabe auf einmal oder in mehreren Anteilen erfolgen.
Das 6-Mercaptopurin kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch in Form eines Derivats eingesetzt werden, das in dem Medium 6-Mercaptopurin in situ bildet. Als solche Derivate des 6-Mercaptopurins kommen z. B. Salze, wie z. B. das Sulfat, des 6-Mercaptopurins in Betracht.
Die Konzer.tralion des 6-Mercaptopurins in dem Medium beträgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie oben angegeben ist, 0,1 bis IO g je Liter Medium. Ein bevorzugter Konzentrationsbercich liegt bei 1 bis 5 g je Liter Medium.
Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, wie z. B. in einer Schüttelkultur oder einer Submerskultur unter Belüften und Rühren, bei einer Temperatur von 20 bis 40 C und einem pH-Wert von 5.5 bis 9.0 durchgeführt. Die Züchtungsdaucr beträgt im allgemeinen 2 bis 8 Tage. Die bei der Züchtung gcbildeten erheblichen Mengen 6-Mcrcaptopurinribosvl-5'-monophosphat sammeln sich in dem Medium und in den Zellen an.
Das 6 - Mercaptopurinribosyl - 5' - monophosphat kann nach Beendigung der Züchtung nach an sich bekannten Methoden, wie z. B. durch Behandeln mn lonenaustauscheihar/eii, durch Adsorption, durch Fällen oder Extrahieren, aus dem Medium isoliert werden.
In den folgenden Beispielen bc/ichen sich die Pnventangaben. wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.
Beispiel 1
F.s wird eine Inipfkiilliir hcrgesielll. indem Brevibaclerium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 in einem Medium, das 2% Glukose. 1% Pepton. 1% llefcextrakt, 0,3% NaCl und 30 u.g/Liler Biotin einhält. 24 Stunden bei 30 C yigezüchtet wird. Das Fermen-Uitioiismedium wird mit 10 Volumpro/ert dieser Impfkultur angeimpft. Beide Medien wurden verwendet, nachdem 20-ccm-Anteile in 250-ccm-Frlenme>crkolben gebracht und sodann sterilisiert worden waren.
.3
Die Züchtung wird bei 300C in einer Schütteikultur durchgeführt. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Glukose K)Og
Harnstoff 6 g
KH2PO4 lüg
K2HPO4 10 g
MgSO4-TH2O Ii) g
CaCl2 2H2O 0,1g
Hefeextrakt IO g "
Biotin 30 rig
Die obigen Bestandteile werden in Wasser unter Auffüllen auf 11 gelöst. Sodann werden die obengenannten Anteile der hergestellten Lösung nach Einstellen des pH-Wertes auf 8,0 — was mit Hilfe von NaOH erfolgt — in die Kolben gegeben und in einem Autoklav unter einem Druck von I kg/cm2 IO Minuten sterilisiert.
Wenn nach 72stündiger Züchtung dem Fermentationsmedium o-Mercaptopurinsulfat in einer Menge von 2 mg/ml Fermentationsmedium zugesetzt und weitere 24 Stunden gezüchtet wird, haben sich 3,3 mg/ml o-Mercaptopurinribosyl-S'-monophosphat gebildet und in dem Fermentationsmedium angesammelt.
Das gebildete 5'-Ribosylphosphat des 6-Mercaptopurins wird in der folgenden Weise isoliert: Das durch Entfernen der Zellen aus der Züchtungsflüssigkeit erhaltene Filtrat (1,21) wird mit Aktivkohle behandelt, das an der Aktivkohle adsorbierte 5'-Ribosylphosphat des 6-Mercaptopurins wird mit 50%igem wäßrigem Äthanol, das 3% Ammoniak enthält, eluiert. Das im Eluat enthaltene Ammoniak wird durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Die erhaltene Lösung wird durch eine Säule gegeben, die mit einem stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscherharz beschickt ist. Die Harzsäule, die das 5'-Ribcsylphosphat des 6-Mercaptopurins adsorbiert enthält, wird mit Wasser gewaschen und sodann gradientenmäßig in der angegebenen Reihenfolge mit 0,01 n-HCl, 0,05 n-HCl, 0,1 n-HCI und 0,5 n-HCl eluiert. Die Eluatfraktionen, die das o-Mercaptopurinribosyl-S'-phosphat enthalten, werden eingeengt und nach der Zugabe von Äthanol
ίο gekühlt. Das abgeschiedene 5'-Ribosylphosphat des 6-Mercaptopurins wird durch Abzentrifugieren gewonnen und getrocknet. Die Ausbeute an 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophosphat beträgt 1,6 g.
'5 Beispiel 2
Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet mit der Abwandlung, daß die in der Tabelle aufgeführten Stämme verwendet werden, wobei die in der Tabelle angegebenen Mengen an 6-Mercaptopurinribosyl-5'-phosphat gebildet und im Züchtungsmedium angereichert werden.
Tabelle
Mikroorganismen
Brevibacterium ammoniagenes
ATCC Nr. 6871
Brevibacterium ammoniagenes
ATCCNr. 15 750
Brevibacterium ammoniagenes
ATCCNr. 15 751
6-Mercaptopurin-
ribosyl-S'-phosphal
(mg/ml)
0,6
2,1 3,4

Claims (1)

  1. Patentanspruch :
    Verfahren zur Herstellung von 6-Mercaptopurinribosy]-5'-monophosphat, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6871, Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872, Brevibacterium ammoniagenesATCC Nr. 15 750 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 15 751 in einem Fermentationsmedium, das außer den üblichen Bestandteilen 6-Mercaptopurin in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 g je Liter Medium enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 5,5 bis 9 züchtet und das im Kulturmedium angereicherte 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophosphat nach üblichen Methoden isoliert.
DE1695318A 1963-11-27 1964-11-24 Verfahren zur Herstellung von 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophosphat Expired DE1695318C3 (de)

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