DE3123001A1 - Verfahren zur herstellung von l-tryptophan, das bei dem verfahren erhaltene l-tryptophan und eine reine kultur eines stammes eines mikroorganismus - Google Patents

Verfahren zur herstellung von l-tryptophan, das bei dem verfahren erhaltene l-tryptophan und eine reine kultur eines stammes eines mikroorganismus

Info

Publication number
DE3123001A1
DE3123001A1 DE19813123001 DE3123001A DE3123001A1 DE 3123001 A1 DE3123001 A1 DE 3123001A1 DE 19813123001 DE19813123001 DE 19813123001 DE 3123001 A DE3123001 A DE 3123001A DE 3123001 A1 DE3123001 A1 DE 3123001A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
tryptophan
strain
bacillus subtilis
mutant
anthranilic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19813123001
Other languages
English (en)
Other versions
DE3123001C2 (de
Inventor
Takeo Musashine Tokyo Akashiba
Atsuhiko Tokyo Murata
Akira Kawasaki Kanagawa Nakayama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Resonac Holdings Corp
Original Assignee
Showa Denko KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Showa Denko KK filed Critical Showa Denko KK
Publication of DE3123001A1 publication Critical patent/DE3123001A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3123001C2 publication Critical patent/DE3123001C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y10S435/839—Bacillus subtilis

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von L-Tryptophan gemäß einem Fermentationsverfahren, bei dem man L-Tryptophan in erhöhter Ausbeute erhält. Sje botrifft weiterhin das bei dem Verfahren erhaltene L-Tryptophan und eine reine Kultur eines neuen Stammes eines Mikroorganismus, welcher bei dem Verfahren verwendet wird.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, bei dem eine L-Tryptophan liefernde Mutante von Bacillus subtilis unter aeroben Bedingungen in einem Nährkulturmedium, welches Anthranilsäure, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle enthält, gezüchtet wird und bei dem das gebildete L-Tryptophan aus der Kulturbrühe isoliert wird. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante einen Stamm verwendet, der gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist.
Es ist bekannt, daß Bacillus subtilis die Fähigkeit besitzt, L-Tryptophan zu erzeugen (vgl. beispielsweise US-PS'en 3 801 und 3 700 558). Seine Fähigkeit ist jedoch relativ niedrig. Es wurden viele Vorschläge gemacht, die Ausbeute zu verbessern, und man hat versucht, verschiedene L-Tryptophan erzeugende Mutanten von Bacillus subtilis zu verwenden oder zu dem Näherkulturmedium eine Vorstufe zuzugeben. Beispielsweise wird in der JA-OS 20391/19 74 ein Verfahren für die Herstellung von L-Tryptophan beschrieben, bei dem eine L-Tryptophan erzeugende Mutante von Bacillus subtilis in einem Nährkulturmedium verwendet wird, welches Anthranilsäure, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle enthält und bei dem das entstehende L-Tryptophan aus der Kulturbrühe isoliert wird. Als Mutante Wird ein Stamm verwendet, der gegenüber 5-Fluortryptophan resistent ist, wie ein Bacillus-subtilis-SD-9-Stamm (FERM-P 1483, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan).
Die Anmelderin hat Untersuchungen durchgeführt, um ein verbessertes Verfahren zur Erzeugung von L-Tryptophan durch Fermentation zu finden. Die Anmelderin hat gefunden, daß ein Stamm, der gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist.und der in der Literatur nicht beschrieben wird, aus Bacillus subtilis erhalten werden kann und daß diese neue Mutante die Fähigkeit besitzt, L-Tryptophan in gesteigerter Geschwindigkeit bei der L-Tryptophanakkumulierung und in erhöhter Ausbeute, bezogen auf die verbrauchte Kohlenstoff que He (Kohlenhydrat) , zu bilden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, '.ein verbessertes Verfahren für die Erzeugung von L-Tryptophan durch Fermentation zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß soll weiter L-Tryptophan, das nach dem verbesserten Verfahren hergestellt worden ist, zur Verfügung gestellt werden.
Weiterhin soll erfindungsgemäß eine reine Kultur des Stammes des Mikroorganismus zur Verfügung gestellt werden, der bei dem zuvor erwähnten Verfahren verwendet werden kann.
Die neue L-Tryptophan erzeugende Mutante von Bacillus subtilis, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin-resistenter Stamm, welcher sich von bekannten und frei verfügbaren Stämmen von Bacillus subtilis ableitet.
Beispiele des obigen Mutterstamms sind Bacillus subtilis IAM-1026 (Institute of Applied Microbiology, Japan);Bacillus subtilis ATCC 9 466 (American Type Culture Collection, USA); und verschiedene andere Stämme, beispielsweise ATCC 4925, ATCC 6051 und ATCC 6633, die in dem Agriculture Handbook Nr. 42 7 Tie Genus Bacillus (Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Oktober 1973), Seiten 182 bis 183 beschrieben werden.
Der Stamm Bacillus subtilis SD-10, nämlich der erfindungsgemäße 5-Fluortryptophan- und 8-Azaguanin-resistente Stamm, ist im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4 als international hinterlegter Stamm, entsprechend dem Budapest-Vertrag, hinterlegt.
Der 5-Fluortryptophan- und 8-Azaguanin-resistente Stamm, der bei. der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann leicht aus dem obigen als Beispielen aufgeführten bekannten und frei verfügbaren Mutterstamm Bacillus subtilis nach bekannten künstlichen Mutationen induzierenden Verfahren, beispielsweise gemäß bekannten Verfahren, bei denen Mutagene verwendet werden, d.h. mutationsinduzierende Substanzen, oder durch Bestrahlung, wie mit UV-Strahlen und Röntgenstrahlen, hergestellt werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Stammes aus Bacillus subtilis, der L-Tryptophan bilden kann und der gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
(i) Bacillus subtilis einer künstlichen mutationsinduzierenden Behandlung unterwirft,
(ii) den behandelten Stamm in einem Kulturmedium, welches 5-Fluortryptophan in einer Menge enthält, die größer ist als die minimale Wachstumsinhibitorkonzentration des Stammes, züchtet,
(iii) den gezüchteten Stamm in einem Kulturmedium, welches 8-Azaguanin in einer Menge enthält, die größer ist als die minimale Wachstumsinhibitorkonzentration des Stammes, weiter züchtet, und
(iv) den entstehenden Stamm mit verbesserter Fähigkeit, L-Tryptophan zu bilden, isoliert.
Die Stufen (i) bis (iv) des obigen Verfahrens können so oft wie erforderlich wiederholt werden.
Gemäß einer Ausführungsform des obigen Verfahrens wird der Mutterstamm, wie Bacillus subtilis IAM-1026, einer künstlichen mutationsinduzierenden Behandlung utnerworfen. Beispielsweise bestrahlt man mit einer mutationsinduzierenden Dosis einer künstlichen mutationsinduzierenden Bestrahlung, wie UV-Strahlen und Röntgenstrahlen, oder man züchtet in einem Kulturmedium, welches eine mutationsinduzierende Menge eines Mutagens enthält, wie Acridinorange oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Der so gewonnene Stamm wird dann in einem Kulturmedium gezüchtet, welches 5-Fluortryptophan in einer Menge enthält, die größer ist als die minimalen Wachstumshemmkonzentration bzw. Wachsturnsinnibitorkonzentration (MIC) des Stammes, und die gewachsenen bzw. gezüchteten Kolonien werden dann gesammelt. Die L-Tryptophan erzeugende Fähigkeit der gezüchteten Kolonien wird geprüft, und die Kolonie des Stammes mit erhöhter Fähigkeit, L-Trypophan zu bilden, wird ausgewählt. Normalerweise wird diese Züchtung mehrere Male wiederholt, bis man einen 5-Fluortryptophan-resistenten Stamm von Bacillus subtilis erhält, der eine erhöhte Fähigkeit aufweist, L-Tryptophan zu bilden. Die L-Tryptophan erzeugende Mutante von Bacillus subtilis, die auf die zuvor erwähnte Weise erhalten wird, ist bekannt und wird beispielsweise in der JA-OS 20391/19 74, die bereits oben erwähnt wurde, beschrieben. Die Mutante ist beispielsweise unter der Nummer FERM-P 1483 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan hinterlegt.
Zur Herstellung der Mutante, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird und die die Fähigkeit besitzt,L-Tryptophan zu erzeugen, und gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist, wird der 5-Fluortryptophan-resistente Stamm, der wie oben beschrieben erhalten wurde, in einem Kulturmedium gezüchtet, welches 8-Azaguanin in einer Menge enthält, die größer ist als die MIC des Stammes, und die gewachsenen Kolonien werden gesammelt.
Die L-Tryptophan erzeugenden Fähigkeiten der gewachsenen Kolonien werden geprüft, und eine Kolonie des Stammes mit erhöhter Fähigkeit, L-Tryptophan zu bilden, wird gesammelt. Im allgemeinen wird diese Züchtung mehrere Male wiederholt, und ein Stamm mit einer erhöhten L-Tryptophan erzeugenden Fähigkeit, der gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist, wird
erhalten.
Die Mutante, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird und die leicht aus Bacillus subtilis oder dem 5-Fluortryptophanresistenten Stamm von Bacillus subtilis erhalten wird, ist bevorzugt gegen mindestens etwa 5000 ppm 5-Fluortryptophan und
mindestens etwa 1000 ppm 8-Azaguanin resistent.
Die Dosis an ultravioletter Strahlung, die oben erwähnt wurde,
2
beträgt beispielsweise etwa 300 bis etwa 800 erg/mm , und die
Dosis an Röntgenstrahlen beträgt z.B. etwa 150 000 bis etwa
200 000 Röntgen. Die Menge an Mutagen beträgt beispielsweise
0,1 bis 0,5 Gew.-%, und die Behandlungszeit liegt beispielsweise innerhalb einer Stunde.
Bei der obigen Aus füh rungs form kann die Züchtung bei aeroben
Bedingungen in dem gleichen Kulturmedium und bei den gleichen
Temperatur-, und pH-Bedingungen wie im folgenden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren für die L-Tryptophan-Herstellung durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß wird eine biologisch reine Kultur von dem Stamm Bacillus subtilis SD-10 zur Verfügung gestellt. Dieser besitzt die Eigenschaften, die bei FERM BP-4 beschrieben werden. Dieser Mikroorganismus wurde unter dem Budapester Vertrag hinterlegt, und er besitzt die Fähigkeit, L-Tryptophan durch Fermentation
in einem Kulturnährmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle enthält, unter aeroben Bedingungen zu bilden.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete L-Tryptophan erzeugende Mutante, die gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist, besitzt im wesentlichen die gleichen morphologischen Eigenschaften wie der Mutterstamm oder der 5-Fluortryptophan-resistente Stamm selbst und unterscheidet sich nur, daß ihre Fähigkeit, L-Tryptophan zu bilden, wesentlich verbessert ist, und daß sie Anthranilsäure (Vitamin L1) für die Bildung von L-Tryptophan benötigt.
Genauer ausgedrückt, werden die morphologischen Eigenschaften der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Mutante in dem oben erwähnten Agriculture Handbook Nr. 427, The Genus Bacillus, Seiten 182 bis 183 beschrieben.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der L-Tryptophan erzeugende Stamm, der gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist, bei aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium gezüchtet, welches Anthranilsäure, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle enthält, und das entstehende L-Tryptophan wird aus der Kulturbrühe isoliert.
Die Kohlenstoffquelle kann irgendeins der Kohlenstoff enthaltenden Materialien sein, welche von dem Stamm assimiliert werden kann. Beispiele sind Kohlehydrate, wie Glucose, Melassen, Saccharose, Stärke, verzuckerte Stärkelösung und .Zersetzungsprodukte von Cellulose, organische Säuren, wie Essigsäure, und Alkohole, wie Äthanol. Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat, Harnstoff und Nitratsalze. Beispiele für eine Mineralquelle sind Salze von P, Na, K, Mg, Fe und Mn, beispielsweise anorganische Salze, wie Ammoniumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Kaliumsulfat, Kaliumhydroxid, Magnesiumsulfat, Eisen-II-sulfat und Mangansulfat. Anorganische Salze von Ca, Zn, B, Cu, Co, Mo usw. können ebenfalls als Spurenelementkomponenten zugegeben werden. Weiterhin können Spuren or-
ganischer Nährstoffe, wie Vitamine und Aminosäuren, die für das Wachstum des Stammes besonders erforderlich sind, und andere? organische Materialien, wie Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt und Pepton, zugegeben werden.
Anthranilsäure kann in Form einer wäßrigen Lösung aus Natrium-, Kalium- oder Ammoniumanthranilat oder als Lösung der freien Anthranilsäure in Äthanol oder Aceton zugegeben werden.
Die Züchtung erfolgt bei aeroben Bedingungen, beispielsweise werden Schüttelkulturverfahren, Züchtungsverfahren mit Durchperlen und Rühren oder andere Züchtungsverfahren bei aeroben Bedingungen verwendet.
Die Züchtung kann bei einer Temperatur von 25 bis 45°C und einem pH-Wert von 5 bis 9, bevorzugt 6 bis 8, durchgeführt werden. Die Züchtungszeit kann auf geeignete Weise ausgewählt werden und beträgt beispielsweise etwa 15 bis etwa 60 Stunden.
Die geeignete Konzentration der Anthranilsäure, die in dem Nährkulturmedium vorhanden ist, beträgt bis zu der minimalen Wachstumshemmkonzentration (MIC) des Stammes, beispielsweise bis zu etwa 0,1 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 300 ppm, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums. Vorzugsweise wird die Anthranilsäure zu einem frühen Zeitpunkt der Züchtung zugegeben. Sie kann periodisch oder kontinuierlich zu dem Züchtungsmedium zugegeben werden, so daß ihre Konzentration in dem Züchtungsmedium die minimale Wachstuitishemmkonzentration des Stammes nicht übersteigt. Etwas höhere Konzentrationen an Anthranilsäure als die minimale Wachstumshemmkonzentration des Stammes beeinflussen das Wachstum des Stammes selbst nicht so stark, sie inhibieren aber die Erzeugung von L-Tryptophan. Dementsprechend wird Anthranilsäure bevorzugt periodisch oder kontinuierlich entsprechend der Geschwindigkeit ihres Verbrauchs zugegeben, damit die Akkumulierung im Kulturmedium oder eine zeitweilige Erhöhung ihrer Konzentration darin vermieden wird. Wird keine Anthranilsäure zu dem KuI-
turmedium zugegeben, zeigt der obige erfindungsgemäße Mutantenstairan ein normales Wachstum der Zellen, aber eine Akkumulation von L-Tryptophan wird kaum festgestellt.
Das entstehende L-Tryptophan wird in an sich bekannter Weise aus der Kulturbrühe nach der Züchtung isoliert. Beispielsweise wird die Kulturbrühe bei 8O0C während 30 Minuten sterilisiert und zentrifugiert, und dann wird zur Erniedrigung des pH-Werts der überstehenden Flüssigkeit auf 2 oder weniger eine Säure zugegeben. Sie wird dann auf eine Säule gegeben, die mit einem star* sauren Kationenaustauschharz gefüllt ist, um eine Adsorption des L-Tryptophan zu bewirken. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit verdünnter Ammoniaklösung zur Abtrennung von L-Tryptophan eluiert. Das Eluat wird dann mit Ammoniak bei verringertem Druck abgestreift, um rohe Kristalle des entstehenden L-Tryptophans zu sammeln. Die rohen Kristalle werden in einem 70%igen Äthanol bei erhöhter Temperatur gesammelt. Eine geringe Menge an Aktivkohle wird verwendet, und die Lösung wird heiß filtriert. Das Filtrat wird abgekühlt, und die entstehenden L-Tryptophankristalle werden abfiltriert.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel· 1
2 1 eines flüssigen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung :
10% Glucose, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,5% Na2HPO4-12H.0, 0,2% KH2PO4X-H3O, 0,1% MgSO4-7H2O, 0,5 mg% FeSO4-TH2O und 0,1 mg% MnSO,■4-6Ho0, werden in den 5-Liter-Koiben einer Fermentationsvorrichtung gegeben und bei 115 C während 15 min sterilisiert. Bacillus subtilis SD-10 (FERM BP-4) , der unter Schüttet bei 300C während 12 h in einem Nährmedium kuitiviert wurde, wird in einer Menge von 5% zur Inokul·ation des Mediums in der obigen Fermentations vor richtung verwendet, und dann wird bei 350C unter Belüftung durch Rühren kultiviert, während die Menge an gelöstem Sauerstoff bei 0,5 ppm oder höher gehalten wird. Eine 5%ige wäßrige Lösung von Natriumanthranilat wird kontinuierlich so zugegeben,
3i23ooi
daß . seine Konzentration in dem Kulturmedium unterhalb der minimalen Wachstumshemmkonzentration des obigen Mutterstamms des Mikroorganismus gehalten wird. Die Züchtung wird während 30 h weitergeführt, während der pH-Wert der Kulturbrühe bei 7,0 gehalten wird. Es bildet sich L-Tryptophan, und dies wird in einer Konzentration von 14,6 g/l angesammelt. Die Ausbeute an L-Tryptophan beträgt 16,5%, bezogen auf die verbrauchte Glucose, und 99 Mol,-%, bezogen auf die Anthranilsäure.
Zum Vergleich wird das obige Verfahren wiederholt, ausgenommen, daß die wäßrige Lösung von Natriumanthranilat nicht verwendet wird.(Vergleichsbeispiel 1). Die Menge an L-Tryptophan, die sich gegen Ende der 30stündigen Züchtung gebildet und akkumuliert hat, beträgt 250 mg/1.
Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2
Bacillus subtilis SD-10 wird während 20 h in dem gleichen Kulturmedium, wie es in Beispiel 1 verwendet wird, in eine Fermentationsvorrichtung mit einem 5-Liter-Kolben gezüchtet. Dann werden 750 ml der entstehenden Kulturbrühe in 15 1 des gleichen Kulturmediums in einer Fermentationsvorrichtung mit einem 30-Liter-Kolben inokkuliert, und züchtet man bei 35°C unter Belüftung durch Rühren, während die Menge an gelöstem Sauerstoff bei 0,5 ppm oder höher gehalten wird. Eine 10%ige wäßrige Lösung aus Natriumanthranilat wird kontinuierlich zugegeben, so daß die Konzentration an Anthranilsäure im Kulturmedium unterhalb der minimalen Wachstumshemmkonzentration des Mikroorganismusstamms gehalten wird. Die Züchtung wird während 24 h weitergeführt, während der pH-Wert der Kulturbrühe bei 7,0 gehalten wird. L-Tryptophan bildet und sammelt sich in einer Konezntration von 15,6 g/l an. Die Ausbeute an L-Tryptophan beträgt 17,4%, bezogen auf die verbrauchte Glucose, und 99 Mol-%, bezogen auf die Anthranilsäure.
Zum Vergleich wird das obige Verfahren wiederholt, ausgenommen,
daß Bacillus subtilis SD-9 (FERM-P 1483, beschrieben in der JA-OS 20391/19 74) als Impfstamm verwendet wird. L-Tryptophan wird gebildet und akkumuliert sich in einer Konzentration von 4,8 g/l. Die Ausbeute an L-Tryptophan beträgt 5,2%, bezogen aif die verbrauchte Glucose, und 92 Mol-%, bezogen auf die Anthranilsäure.
Beispiel 3
Herstellung einer biologisch reinen Kultur von Bacillus subtilis:
Bacillus subtilis IAM-1026 (Institute of Applied Microbiology) wird zur Bildungeiner künstlichen Mutante aus dem Mutterstamm in einem Nähermedium in an sich bekannter Weise der ultravioletten Bestrahlung unterworfen. Die entstehende Mutante wird zur Inkubation eines Nähragars , welcher 5-Fluortryptophan enthält, verwendet. Mehrere hundert Kolonien, die auf der Agarplatte gezüchtet wurden, wurden auf ihre Fähigkeit, L-Tryptophan durch Fermentation zu bilden, geprüft. Die Kolonie des Stammes, die die beste Fähigkeit aufwies, L-Tryptophan zu erzeugen, wurde ausgewählt. Der ausgewählte Stamm wurde gemäß-'.dem oben beschriebenen künstlichen Mutationsverfahren behandelt, und die Auswahl der 5-Fluortryptophan-resistenten Mutante folgte darauf. Die obige Behandlung und Selektion wurde mehrere Male wiederholt, wobei man eine Mutante erhielt, die im wesentlichen gegenüber bis zu 5000 ppm 5-Fluortryptophan resistent ist.
Danach wurde diese 5-Fluortryptophan-resistente Mutante erneut gemäß dem gleichen künstlichen Mutationsverfahren, wie oben beschrieben, behandelt, und die Auswahl der 8-Azaguanin-resistenten Mutante erfolgte auf gleiche Weise wie die Auswahl der 5-Fluortryptophan-resistenten Mutante. Die letztlich erhaltene Mutante ist schließlich gegenüber 5-Fluortryptophan resistent. Sie ist weiterhin gegenüber bis zu 1000 ppm 8-Azaguanin resistent.

Claims (7)

  1. PATENTANWÄLTE
    UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT
    DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER OR-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 0 8 9/79 70 77-79 70 78 · TE LEX O5-21 2 15 6 kpat d
    TELEGRAMM KRAUSPATENT
    2952 AW/an
    SlIOWA DENKO K.K.
    Tokyo, Japan
    Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, das bei dem Verfahren erhaltene L-Tryptophan und eine reine Kultur eines Stammes eines Mikroorganismus
    PATENTANSPRÜCHE
    1 <, Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, bei dem eine L-Tryptophan erzeugende Mutante von Bacillus subtilis unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, welches Anthranilsäure, eine Kohlenstoffguelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralienquelle enthält, gezüchtet wird und das entstehende L-Tryptophan aus der Kulturbrühe isoliert wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutante ein gegenüber 5-Fluortxyptophan und 8-Azaguanin resistenter Stamm verwendet wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutante der Stamm Bacillus subtilis SD-IO verwendet wird.
  3. 3„ Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur von 25 bis"45°C und einem pH-Wert von 5 bis 9 durchgeführt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Anthranilsäure in dem Kulturmedium bis zu der minimalen Wachstumshemmkonzentration des Stammes liegt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Anthranilsäure bis zu etwa 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums, beträgt.
  6. 6. L-Tryptophan, dadurch gekennzeichnet , daß es nach dem Verfahren nach Anspruch 1 erhalten worden ist.
  7. 7. Eine biologisch reine Kultur des Stammes Bacillus subtilis SD-1O, die Eigenschaften hat, wie sie als FERM BP-4, hinterlegt unter dem Budapester Vertrag, identifiziert sind, und die die Fähigkeit besitzt, L-Tryptophan durch Fermentation in einem Anthranilsäure, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle enthaltenden Nährkulturmedium unter aeroben Bedingungen zu bilden.
DE19813123001 1980-06-10 1981-06-10 Verfahren zur herstellung von l-tryptophan, das bei dem verfahren erhaltene l-tryptophan und eine reine kultur eines stammes eines mikroorganismus Granted DE3123001A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP7713080A JPS575694A (en) 1980-06-10 1980-06-10 Production of l-tryptophane

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3123001A1 true DE3123001A1 (de) 1982-07-08
DE3123001C2 DE3123001C2 (de) 1988-01-28

Family

ID=13625206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19813123001 Granted DE3123001A1 (de) 1980-06-10 1981-06-10 Verfahren zur herstellung von l-tryptophan, das bei dem verfahren erhaltene l-tryptophan und eine reine kultur eines stammes eines mikroorganismus

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4363875A (de)
JP (1) JPS575694A (de)
DE (1) DE3123001A1 (de)
FR (1) FR2483947A1 (de)
GB (1) GB2078731B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6180373B1 (en) 1992-09-28 2001-01-30 Consortium f{umlaut over (u)}r elektrochemische Industrie GmbH Microorganisms for the production of tryptophan and process for the preparation thereof

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5889194A (ja) * 1981-11-24 1983-05-27 Ajinomoto Co Inc 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法
JPS5894391A (ja) * 1981-11-27 1983-06-04 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法
JPS58107195A (ja) * 1981-12-22 1983-06-25 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法
DE4031854A1 (de) * 1990-10-08 1992-04-09 Basf Ag Mikroorganismus und verfahren zur gewinnung von anthranilsaeure

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700558A (en) * 1967-11-20 1972-10-24 Lepetit Spa Production of l-tryptophan by fermentation
JPS4920391A (de) * 1972-06-17 1974-02-22
US3801457A (en) * 1971-03-09 1974-04-02 Takedo Chem Ind Ltd Method for producing l-tryptophan

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4818828B1 (de) * 1969-08-28 1973-06-08
JPS5119037B2 (de) * 1972-11-16 1976-06-14

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700558A (en) * 1967-11-20 1972-10-24 Lepetit Spa Production of l-tryptophan by fermentation
US3801457A (en) * 1971-03-09 1974-04-02 Takedo Chem Ind Ltd Method for producing l-tryptophan
JPS4920391A (de) * 1972-06-17 1974-02-22

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Agriculture Handbook Nr.427, the Genus Bacillus, 1973, S.182-183 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6180373B1 (en) 1992-09-28 2001-01-30 Consortium f{umlaut over (u)}r elektrochemische Industrie GmbH Microorganisms for the production of tryptophan and process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US4363875A (en) 1982-12-14
GB2078731A (en) 1982-01-13
JPS6262156B2 (de) 1987-12-24
FR2483947A1 (fr) 1981-12-11
FR2483947B1 (de) 1984-02-10
DE3123001C2 (de) 1988-01-28
GB2078731B (en) 1984-06-13
JPS575694A (en) 1982-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2417337C3 (de)
DE60033941T2 (de) Neuartiges verfahren zur herstellung von l-epi-2-inosose und neuartiges verfahren zur herstellung von epi-inositol
DE3304468A1 (de) Mikroorganismenzellen die s-adenosylmethionin enthalten verfahren zu deren herstellung
DE3110789C2 (de)
DE3123001A1 (de) Verfahren zur herstellung von l-tryptophan, das bei dem verfahren erhaltene l-tryptophan und eine reine kultur eines stammes eines mikroorganismus
DE1695318C3 (de) Verfahren zur Herstellung von 6-Mercaptopurinribosyl-5&#39;-monophosphat
DE2413961C2 (de) Biotechnische Herstellung von Citronensäure
DE3036413C2 (de) Aerobes mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure
DE2157847C3 (de) Verfahren zur Erzeugung von Citronensäure
AT392799B (de) Verfahren zur fermentativen herstellung von zitronensaeure aus kohlehydraten
DE1570027C3 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von Flavin-adenin-dinucleotid
DE2115514C2 (de) Herstellung von Citronensäure
DE3877685T2 (de) Verfahren zur herstellung von d(-)-tartarsaeure.
DE3878379T2 (de) Verfahren zur herstellung von d-alanin.
DE3022723A1 (de) Verfahren zur herstellung von mildiomycin
DE3044969A1 (de) Verfahren zur herstellung von coproporphyrin iii
DE3111607A1 (de) Verfahren zur abtrennung und gewinnung von coproporphyrin und uroporphyrin aus einer sie enthaltenden kulturbruehe
DE2429068C3 (de) Fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Histidin
DE2017374C3 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure
DE2357100C3 (de) Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan
DE2753422A1 (de) Verfahren zur herstellung von l-serin auf mikrobiologischem wege
DE1792403C (de) Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L Lysin
DE1900492C (de)
DE4405244B4 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin sowie Bakterienstamm zur Durchführung desselben
DE2429068A1 (de) Fermentatives verfahren zur herstellung von l-histidin

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee