DE3044969A1

DE3044969A1 - Verfahren zur herstellung von coproporphyrin iii

Info

Publication number: DE3044969A1
Application number: DE19803044969
Authority: DE
Inventors: Yasuo Tokyo Fujiwara; Ichiro Yokosuka Kojima; Kenji Yokohama Maruhashi
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1979-11-29
Filing date: 1980-11-28
Publication date: 1981-09-17
Also published as: US4334021A; FR2470797A1; FR2470797B1; JPS6319156B2; JPS5678595A; DE3044969C2

Description

Beschreibung;

Es ist bekannt, daß Protoporphyrin IX mit einer Porphyrinstruktur bei pharmazeutischen Anwendungen nützlich ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Coproporphyrin III, welches eine Porphyrinstruktur aufweist und welches auf vielen Gebieten nützlich 1st, wie bei Pharmazeutika, Zwischenprodukten für Pharmazeutika oder roten Farbstoffen für Getränke und Nahrungsmittel.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Coproporphyrin III, bei dem ein Coproporphyrin III liefernder Mikroorganismus des Genus Arthrobacter in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Mineral enthält, und wobei Coproporphyrin III aus der entstehenden Kulturbrühe gewonnen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium mindestens 0,1 g L-Cystin pro 1 Kulturmedium, mindestens 0,5 g Mg⁺⁺ pro 1 Kulturmedium oder beide Verbindungen enthält.

In der JA-OS 7492/77 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem ein Mikroorganismus, der Coproporphyrin III der folgenden Formel:

CH₀CH₀COOH
^{2 2}

-CH₂CH₂COOH

CH₀ CH₀CH₀COOH ι £- c. c.

COOH

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erzeugen kann, gezüchtet wird, der ausgewählt wird unter Mikroorganismen der Arten Arthrobacter und Brevibacterium, und bei dem Coproporphyrin III aus der Kulturbrühe isoliert wird. Gemäß diesem Verfahren kann Coproporphyrin III in wesentlich höherer Ausbeute erhalten werden, als bei den Verfahren, bei denen Coproporphyrin III liefernde Mikroorganismen anderer Arten verwendet werden.

Die Anmelderin hat Untersuchungen unternommen, um ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von Coproporphyrin III in verbesserten Ausbeuten zu entwickeln. Es wurde gefunden, daß Coproporphyrin III in wesentlich verbesserten Ausbeuten mit guter Reproduzierbarkeit erhalten werden kann, wenn man die Züchtung in einem Kulturmedium durchführt, welches eine geeignete Menge, bevorzugt mindestens 0,1 g pro 1 Kulturmedium, L-Cystin enthält, welches als Bestandteil des Kulturmediums in der oben erwähnten JA-OS 7492/77 nicht spezifisch beschrieben wird.

Es wurde weiterhin gefunden, daß Coproporphyrin III in wesentlich verbesserter Ausbeute mit guter Reproduzierbarkeit gebildet wird, wenn man die Züchtung in einem Kulturmedium durchführt, welches eine Verbindung enthält, welche Mg⁺⁺ ergibt, wie ein Magnesiumsalz, ein Beispiel für die in der oben genannten JA-OS 7492/77 beschriebenen anorganischen Salze in einer Menge, die in der obengenannten JA-OS nicht spezifisch genannt wird, insbesondere in einer Menge von mindestens 0,5 g pro 1 Kulturmedium, berechnet als Mg⁺⁺.

Es wurde weiterhin gefunden, daß es möglich ist, Mutanten oder Varianten mit wesentlich verbesserter Fähigkeit, Coproporphyrin III zu erzeugen, herzustellen, die aber im wesentlichen die gleichen mikrobiologischen Eigenschaften besitzen

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wie die Mutterstamme, die in der oben erwähnten JA-OS 7492/77 beschrieben werden. Züchtet man eine solche Mutante oder Variante in einem Kulturmedium, das das zuvor erwähnte L-Cystin und/oder Mg⁺⁺ enthält, kann Coproporphyrin III in wesentlich verbesserter Ausbeute mit besserer Reproduzierbarkeit erhalten werden, verglichen mit dem Verfahren, bei dem der Mutter stamm verwendet wird.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Coproporphyrin III mit verbesserter Ausbeute bei niedrigen Kosten zur Verfugung zu stellen, welches industriell leicht durchführbar ist.

Spezifische Beispiele von Coproporphyrin III liefernden bekannten Stämmen des Genus Arthrobacter, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden im folgenden angeführt:

(1) Arthrobacter hyalinus

FERM-P Nr. 3125 [Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (FRI, Japan)]; ATCC 31263 (American Type Culture Collection); DSM 867 (German Collection of Microorganisms; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) .

(2) Arthrobacter globiformls

IFO 12137 (Institute for Fermentation, Osaka, Japan); ATCC 8010.

(3) Arthrobacter aurescens
IFO 12136; ATCC 13344.

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_ 7-

(4) Arthrobacter pascens
IFO 12139; ATCC 14358.

(5) Arthrobacter ramosus
IFO 12958; ATCC 13727.

(6) Arthrobacter cremeus
FERM-P Nr. 3126.

(7) Arthrobacter resinosus
FERM-P Nr. 3131.

(8) Arthrobacter isopropanolophila FERM-P Nr. 3129.

(9) Arthrobacter flavidus
I-P Nr. 3130.

Die mikrobiologischen Eigenschaften der obigen bekannten Stämme (1) und (6) bis (9) werden in Einzelheiten beispiels weise in der JA-OS 7492/77 beschrieben. Die mikrobiologischen Eigenschaften der bekannten Stämme (2), (3), (4) und (5) werden beispielsweise in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage, beschrieben.

Diese bekannten Stämme können von den obigen Hinterlegungsstellen leicht erhalten werden.

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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur diese Coproporphyrin III liefernden Stämme des Genus Arthrobacter, sondern ebenfalls ihre Mutanten oder Varianten verwendet werden.

Diese Varianten oder Mutanten unterscheiden sich von den Mutterstämmen nur dadurch, daß sie eine erhöhte Fähigkeit besitzen, Coproporphyrin III zu erzeugen, und daß ihre mikrobiologischen Eigenschaften im wesentlichen gleich sind wie die der Mutterstämme. Diese Varianten oder Mutanten können leicht aus den obigen bekannten und leicht verfügbaren Mutterstämmen nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren erhalten werden.

Beispielsweise können solche Varianten oder Mutanten nach bekannten Mutationsbehandlungen, wie Ultraviolettbestrahlung, Co -Isotopenbestrahlung oder Behandlung mit einem mutanteninduzierenden Mittel, wie N-MethylrN'-nitro-N-nitrosoguanidin, hergestellt werden. Entsprechend einer Ausführungsform wird der Mutterstamm der obigen lestrahlungsbehandlung oder einer Behandlung mit dem obigen mutanteninduzierenden Mittel unterworfen und der behandelte Stamm wird in einem Mineral-Agar-Medium, welches ein Mittel enthält, das die Bildung von Coproporphyrin III inhibieren kann, kultiviert. Je nach Bedarf, werden die obige Bestrahlungsbehandlung oder die Behandlung mit dem mutanteninduzierenden Mittel und die Züchtungsbehandlung wiederholt und der Stamm mit erhöhter Fähigkeit, Coproporphyrin III zu erzeugen, wird isoliert. Die Züchtung kann bei den gleichen Züchtungsbedingungen (Temperatur, pH-Wert) durchgeführt werden, wie sie bei der Züchtung des MutterStamms verwendet werden. Die obigen Inhibitoren sind bekannte, wie Coproporphyrin III, L-Tryptophan und 5-Methyl-DL-tryptophan.

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Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren
zur Herstellung einer Variante oder Mutante der Coproporphyrin III liefernden Mikroorganismen, bei dem ein Coproporphyrin III liefernder Mikroorganismus des Genus Arthrobacter einer Bestrahlung oder Behandlung mit einem mutanteninduzierenden Mittel unterworfen wird, der so behandelte Mikroorganismus in einem Kulturmedium, welches eine Substanz, die die Bildung von Coproporphyrln III inhibieren kann, enthält, gezüchtet wird und ein Stamm, der eine verstärkte Fähigkeit besitzt, Coproporphyrin III aus der Kulturbrühe zu bilden, gewonnen wird.

Spezifische Beispiele für solche Varianten oder Mutanten sind ein 5-methyl-DL-tryptophan-resistenter Stamm von Arthrobacter hyalinus NOC 11001(FERM-P Nr.5256,ATCC Nr.31736,DSM Nr.1?32), ein coproporphyrin-III-resistenter Stamm von Arthrobacter
hyalinus NOC 11002 (FERM-P Nr. 5259, ATCC Nr. 31739*, ein
L-tryptophan-resistenter Stamm von Arthrobacter globiformis NOC 11004 (FERM-P Nr. 5258, ATCC 31738**und ein L-tryptophanresistenter Stamm von Arthrobacter pascens NOC 11003 (FERM-P Nr. 5257, ATCC Nr. 31737,DSM Nr. 1934)

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die obigen, als Beispiele aufgeführten Coproporphyrin III erzeugenden Mikroorganismen des Genus Arthrobacter in einem Kulturmedium gezüchtet und Coproporphyrin III wird aus der Kulturbrühe direkt oder indirekt gewonnen.

Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturmedium enthält eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine Mineralquelle, Vitamine, ein Antischäumungsmittel usw. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, Alkohole,
Kohlenwasserstoffe und Kleie. Beispiele für Stickstoffquellen

* DSM Nr. 1933)
** DSM Nr. 1935)

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sind Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Ammoniumsalze, Proteinzersetzungsprodukte, Aminosäuren (insbesondere L-Cystin), Nitratsalze und Harnstoff. Beispiele für anorganische Salze sind Phosphate, Mg⁺⁺-erzeugende Magnesiumverbindungen, wie Magnesiumsalze, Zinksalze, Calciumsalze, Mangansalze, Molybdänsalze und Kupfersalze.

Die Zusammensetzung des Kulturmediums kann auf geeignete Weise geändert werden und während der Züchtung können die verschiedenen oben erwähnten Bestandteile zusätzlich zu dem Kulturmedium zugegeben werden. Beispielsweise kann man, wenn ein Alkohol als Kohlenstoffquelle verwendet wird, zusätzlich zu dem Kulturmedium, wenn die Konzentration des verbleibenden Alkohols über einen vorher bestimmten Wert abnimmt, noch Alkohol zufügen oder man kann zu Beginn der Coproporphyrin-III-Erzeugung Alkohol zugeben. Dadurch kann die Erzeugung von Coproporphyrin III erhöht werden. Günstige Ergebnisse werden erhalten, wenn Eisensalze in dem Kulturmedium abwesend sind.

Bei der Züchtung der oben als Beispiele aufgeführten Coproporphyrin III erzeugenden Stämme des Genus Arthrobacter werden mindestens 0,1 g L-Cystin pro 1 Kulturmedium und/oder mindestens 0,5 g Mg⁺⁺ pro 1 Kulturmedium, bevorzugt 0,1 bis 5 g L-Cystin und/oder 0,5 bis 10 g, mehr bevorzugt 1 bis 10 g, besonde:
wendet.

besonders bevorzugt 3 bis 5 g Mg⁺⁺ in dem Kulturmedium ver-

Bei der Ausübung des verbesserten erfindungsgemäßen Verfahrens kann Coproporphyrin III in wesentlich verbesserter Ausbeute erhalten werden, die mindestens etwa das Zweifache und häufig etwa das Dreifache der Ausbeute beträgt, die in der oben erwähnten JA-OS 7492/77 beschrieben wird.

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Γ:

Die Züchtung erfolgt bei aeroben Bedingungen durch Schütteln oder durch Bewegen oder Rühren durch Luftzufuhr; es ist bevorzugt, Luft so durchfließen zu lassen, daß die Menge an gelöstem Sauerstoff in dem Züchtungssystem bei einem so niedrigen Wert wie möglich gehalten wird. Die Züchtungstemperatur beträgt im allgemeinen etwa 20 bis etwa 40⁰C und der pH-Wert des Kulturmediums wird bei etwa 4 bis etwa 9,5 gehalten. Die Züchtungszeit beträgt üblicherweise etwa 2 bis 30 Tage und sie kann in Abhängigkeit von den anderen Züchtungsbedingungen variiert werden.

Da sich Coproporphyrin III in höherer Menge in dem entsprechenden Züchtungsprodukt ansammelt, beispielsweise in der Kulturbrühe, kann es in guter Ausbeute aus dem Züchtungsprodukt, beispielsweise unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsmittels, wie Äthylacetat, das mit Essigsäure in an sich bekannter Weise angesäuert wurde, extrahiert werden. Die Extraktion erfolgt normalerweise, nachdem die Mikrobenzellen und andere Feststoffe von dem Züchtungsprodukt abgetrennt worden sind. Das Extraktionsmittel wird mit HCl/Methanol behandelt, um das Coproporphyrin methylzuverestern, und gegebenenfalls wird der Ester durch Säulenchromatographie an einer Aluminiumoxidsäule gereinigt, um Coproporphyrin III in Form des Methylesters zu gewinnen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann Coproporphyrin III ebenfalls aus dem Reaktionsprodukt mit einem Coproporphyrin III erzeugenden Substrat der Mikrobenzellen, das von dem Züchtungsprodukt, abgetrennt wurde, isoliert werden. Bevorzugt werden die Mikrobenzellen von dem Züchtungsprodukt abgetrennt, welches man erhält, indem man einen Coproporphyrin III erzeugenden Stamm des Genus Arthrobacter bei Coproporphyrin III bildenden Bedingungen züchtet, die für das Wachstum der Mikrobenzellen geeignet sind, oder sie werden aus einem rohen Enzymextrakt der Mikrobenzellen isoliert.

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Beispiele für Coproporphyrin III bildenden Substrate sind Glycin, Fumarsäure, a-Ketoglutarsäure, Bernsteinsäure, J-Aminolävulinsäure, Salze dieser Säuren und Substanzen, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele für Salze sind die Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze. Der rohe Enzymextrakt kann beispielsweise erhalten werden, indem man die Mikrobenzellen durch Zermahlen zerkleinert, die Mikrobenzellen durch Ultraschallbehandlung zerstört, die Mikrobenzellen unter Verwendung eines plötzlichen Druckunterschieds zerstört oder indem man die Mikrobenzellen unter Verwendung einer zellularen Membran, die das Enzym auflöst, zerstört.

Die Reaktion der Mikrobenzellen oder des rohen Enzymextrakts aus den Mikrobenzellen mit dem Coproporphyrin III bildenden Substrat wird beispielsweise durchgeführt, indem man das Reaktionsgemisch schüttelt oder rührt oder stehen läßt, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9,5 während etwa 5 b bis etwa 5 Tagen.

Die Abtrennung des Coproporphyrin III aus dem Reaktionsprodukt kann auf gleiche Weise erfolgen wie bei dem Verfahren, bei dem Coproporphyrin III aus der Kulturbrühe gewonnen wird. Erfindungsgemäß kann Coproporphyrin III in hoher Ausbeute aus der Kulturbrühe entweder direkt oder indirekt^ nachdem eine bestimmte Zeit vergangen ist, gewonnen werden.

Das Coproporphyrin III wird in der Kulturbrühe wie folgt bestimmt. 0,5 ml KuItürbrühe oder ihrer Verdünnung werden mit 10 ml O,1N-Acetatpuffer (pH 4,7) und 10 ml Äthylacetat extrahiert. Coproporphyrin III wird in die Äthylacetatschicht extrahiert und in 10 ml einer 5%igen Chlorwasserstoffsäure gelöst. Die Absorption der Chlorwasserstoffsäure bei 401,5 mn wird gemessen. Die Konzentration an Coproporphyrin III in

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dem Kultivierungsprodukt wird aus einer getrennt hergestellten Eichkurve bestimmt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Ein Reagenzglas mit einem Außendurchmesser von 21 mm, welches 15 ml sterilisiertes Kulturmedium enthält, das pro 1 entionisiertem reinen Wasser 10 g Glucose, 1,0 g Hefeextrakt, 3,0 g Pepton, 3_f0 g Ammoniumnitrat, 0,4g Monokaliumphosphat, 1,5 g Dinatriumphosphat, 5,0 g Magnesiumsulfat, 10 mg Mangansulfat, 10 mg Zinksulfat, 200 ng Kupfersulfat, 10 ug Molybdän tr ioxid, 5,0 g Calciumcarbonat und 0,2 g L-Cystin enthält, wird mit Arthrobacter globiformis (ATCC 8010) inokuliert und unter Schütteln bei 30⁰C während 3 Tagen kultiviert. Eine 50?oige wäßrige Lösung von Glucose wird jeweils 2 bis 3 Tage danach zugegeben und 75 g Gesamtglucose werden pro 1 der Kulturbrühe im Verlauf einer Züchtungszeit von Tagen zugegeben.

Die sich während dieser Zeit ansammelnde Konzentration an Coproporphyrin in der Kulturbrühe beträgt 250 mg/1.

Beispiel 2

Es wird die gleiche Züchtung wie im Beispiel 1 während 15 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß das Kulturmedium nicht L-Cystin enthält. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 132 mg/l.

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Vergleichsbeispiel 1

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 1 beschrieben, während 15 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß das Kulturmedium nicht L-Cystin enthält. Die Menge an Magnesiumsulfat wird auf 0,5 g pro 1 Kulturmedium reduziert. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der KuItürbrühe zu diesem Zeitpunkt ansammelt, beträgt 91 mg/1.

Beispiel 3

250 ml des gleichen sterilisierten Kulturmediums, wie es im Beispiel 1 verwendet wurde, werden in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben mit Arthrobacter globiformis (ATCC 8010) inokuliert. Während 3 Tagen wird bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Eine 50%ige wäßrige Lösung von Glucose wird alle

3 bis 4 Tage danach zugegeben und im Verlauf von 18 Tagen werden insgesamt 54 g Glucose pro 1 Kulturbrühe zugegeben. Zu diesem Zeitpunkt beträgt die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe angesammelt hat, 225 mg/1.

4 1 der entstehenden Kulturbrühe werden während 10 min bei 10000 G zur Entfernung der unlöslichen Materialien, wie der Mikrobenzellen, zentrifugiert. Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wird auf 3,6 eingestellt und dann wird während 10 min bei 1000 G zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert. Methanol und Schwefelsäure werden zu dem Präzipitat zugegeben und das Gemisch wird über Nacht in einem Kühlschrank stehen gelassen und dann mit Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethanschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen, bis die Schwefelsäure daraus entfernt ist. Die Dichlormethanschicht wird dann konzentriert und dann

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wird durch Chromatographieren auf einer Aluminiumoxidsäule gereinigt. Man erhält 680 mg Coproporphyrin III, Tetramethylester, als Kristalle.

Beispiel 4

15 nil eines sterilisierten Kulturmediums, welches pro 1 entionisiertem Wasser 10 ml Isopropylalkohol, 1,0 g Hefeextrakt, 3,0 g Pepton, 3,0 g Ammoniumsulfat, 0,4 g Monokaliumphosphat, 1,5 g Dinatriumphosphat, 5,0 g Magnesiumsulfat, 10 ml Mangansulfat, 10 mg Zinksulfat, 200 ug Kupfersulfat, 10 iig Molybdän trioxid, 5,0 g Calciumcarbonat und 0,2 g L-Cystin enthält, werden in einem Reagenzglas mit einem Durchmesser von 21 mm mit Arthrobacter hyalinus (PERM-P Nr. 3125) inokuliert. Dann wird unter Schütteln bei 30⁰C während 3 Tagen kultiviert. Alle 2 bis 3 Tage danach wird Isopropylalkohol zugegeben und insgesamt werden 85 ml Isopropanol pro 1 KuItürbrühe im Verlauf von 17 Tagen zugegeben.

Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 330 mg/1.

Beispiel 5

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 4 beschrieben, während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß das Kulturmedium kein L-Cystin enthält. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 230 mg/l.

Beispiel 6

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 4 beschrieben,

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während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß die Menge an Magne s ixamsulf at in dem Kulturmedium auf 0,5 g pro 1 Kulturmedium abgenommen hat. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu -diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 220 mg/1.

Vergleichsbeispiel 2

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 4 beschrieben, während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß das Kulturmedium nicht L-Cystin enthält. Die Menge an Magnesiumsulfat wurde auf 0,5 g erniedrigt. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe angesammelt hat, beträgt 150 mg/l.

Beispiel 7

Arthrobacter aurescens (IFO 12136), Arthrobacter pascens (IFO 12139) und Arthrobacter ramosus (IFO 12958) werden auf die gleiche Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Stamm Züchtungs- Menge an gebil-

zeit detem Copropor-

phyrin III (mg/1)

Arthrobacter aurescens (IFO
12136)

Arthrobacter pascens (IFO 12139) Arthrobacter ramosus (IFO 12958)

17	110
15	210
15	82

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Beispiel 8

Die gleiche Züchtung wie im Beispiel 4 beschrieben, wird während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen,~daß der 5-methyl-DL-tryptophan-resistente Stamm von Arthrobacter hyalinus (FERM-P Nr. 5256) als Coproporphyrin III erzeugender Mikroorganismus verwendet wird. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe angesammelt hat, beträgt zu diesem Zeitpunkt 420 mg/1.

Beispiel 9

Die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 4 beschrieben, wird während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß der coproporphyrin-III-resistente Stamm (FERM-P Nr. 5259) von Arthrobacter hyalinus als Coproporphyrin III erzeugender Mikroorganismus verwendet wird. Die Konzentration von Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 450 mg/1.

Beispiel 10

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 1 beschrieben, während 15 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß der L-tryptophan-resistente Stamm (FERM-P Nr. 5258) von Arthrobacter globiformis als Coproporphyrin III erzeugender Mikroorganismus verwendet wurde. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 320 mg/1.

Beispiel 11

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 1 beschrieben, während 15 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß der L-trypto-

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phan-resistente Stamm (FERM-P Nr. 5257) von Arthrobacter pascens als Coproporphyrin III erzeugender Mikroorganismus verwendet wird. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der KuItürbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 260 mg/1.

Beispiel 12

Herstellung des 5-methyl-DL-tryptophan-resistenten Stammes (FERM-P Nr. 5256) von Arthrobacter hyalinus:

Arthrobacter hyalinus (FERM-P Nr. 3125) wird zum Inokulieren von 15 ml eines sterilisierten Kulturmediums, das im Beispiel 4 beschrieben wird und das als P-Medium bezeichnet wird, das sich in einem Reagenzglas mit 21 mm Außendurchmesser befindet, verwendet. Unter Schütteln wird bei 30⁰C während 3 Tagen gezüchtet. Die Kulturbrühe wird in eine Petrischale gegeben und einer Ultraviolettbestrahlung während 2 min unterworfen. Es befinden sich zwei 15W-Lampen 40 cm über der Petrischale. Die behandelte Flüssigkeit wird während 10 Tagen in einem Reagenzglas mit einem Außendurchmesser von 21 mm kultiviert, wobei das Reagenzglas 15 ml sterilisiertes P-Medium, das 5-Methyl-DL-tryptophan enthält, aufweist. Die KuItürbrühe wird zum Inokulieren einer Platte verwendet, die P-Medium aufweist, welches 5-Methyl-DL-tryptophan und Agar enthält, und dann wird bei 30°C kultiviert. Aus den entstehenden Kolonien v/erden die, die eine hohe Fähigkeit aufweisen, Coproporphyrin III zu bilden, als 5-methyl-DL-tryptophan-resistenter Stamm von Arthrobacter hyalinus abgetrennt.

Beispiel 13

Herstellung eines coproporphyrin-III-resistenten Stamms (FERM-P Nr. 5259) von Arthrobacter hyalinus:

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Beispiel 12 wird wiederholt, ausgenommen, daß Coproporphyrin III zu dem Kulturmedium anstelle von 5-Methyl-DL-tryptophan zugegeben wird. Aus den erhaltenen Kolonien wird die, die eine hohe Fähigkeit aufweist, Coproporphyrin III zu erzeugen, als coproporphyrin-III-resistenter Stamm von Arthrobacter hyalinus abgetrennt.

Beispiel 14-

Herstellung eines L-tryptophan-resistenten Stammes (FERM-P Nr. 5258) von Arthrobacter globiformis:

15 ml eines sterilisierten Kulturmediums, das im Beispiel 1 beschrieben wird und das als G-Medium bezeichnet wird, werden in einem Reagenzglas mit einem Außendurchmesser von 21 mm mit Arthrobacter globiformis (ATCC 8010) inokuliert und dann wird unter Schütteln bei 30°C während 3 Tagen kultiviert. Die Kulturbrühe wird in eine Petrischale gegeben und einer Ultraviolettbestrahlung während 3 min unterworfen (es befinden sich zwei 15W-Lampen 40 cm über der Petrischale). Die behandelte Flüssigkeit wird 10 Tage in einem Reagenzglas mit einem Außendurchmesser von 21 mm, welches 15 ml sterilisiertes G-Medium, das L-Tryptophan enthält, aufweist, gezüchtet. Die Kulturbrühe wird zum Inokulieren einer Platte verwendet, die G-Medium mit L-Tryptophan und Agar enthält, und dann wird bei 30°C gezüchtet. Aus den erhaltenen Kolonien werden die, die eine erhöhte Fähigkeit, Coproporphyrin III zu bilden, aufweisen, als L-tryptophan-resistenter Stamm von Arthrobacter globiformis abgetrennt.

Beispiel 15

Herstellung eines L-tryptophan-resistenten Stammes (FERM-P Nr. 5257) von Arthrobacter pascens:

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Beispiel 14 wird wiederholt, ausgenommen, daß Arthrobacter pascens (IFO 12139) anstelle von Arthrobacter globiformis verwendet wird. Aus den erhaltenen Kolonien werden die, die eine erhöhte Fähigkeit, Coproporphyrin III zu bilden, aufweisen, als L-tryptophan-resistenter Stamm von Arthrobacter pascens abgetrennt.

Ende der Beschreibung.

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Claims

KRAUS & WEiSERT g PATENTANWÄLTE DR WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKATE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 · TELEX O5-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 2759 AW/rm NIPPON OIL COMPANY, LTD. Tokyo / Japan Verfahren zur Herstellung von Coproporphyrin III Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Coproporphyrin III durch Züchten eines Coproporphyrin III erzeugenden Mikroorganismus des Genus Arthrobacter in einem eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Mineral enthaltenden Kulturmedium und Gewinnung des Coproporphyrin III aus der
Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet , daß das Kulturmedium mindestens 0,1 g L-Cystin pro 1 Kulturmedium, mindestens 0,5 g Mg⁺⁺ pro 1 Kulturmedium oder beide
enthält.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die Menge an L-Cystin 0,1 bis 5 g pro 1 Kulturbrühe und
Kulturmedium beträgt.

pro 1 Kulturbrühe und die Menge an Mg⁺⁺ 0,5 bis 10 g pro 1

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9,5 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Mikrobenzellen, die aus der Kulturbrühe abgetrennt werden, oder ein roher Enzymextrakt der Mikrobenzellen mit einem Coproporphyrin .III erzeugenden Substrat umgesetzt wird und daß Coproporphyrin III aus dem Reaktionsprodukt isoliert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Coproporphyrin III erzeugende Mikroorganismus Arthrobacter hyalinus, Arthrobacter globiformis, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter pascens, Arthrobacter ramosus, Arthrobacter eremeus, Arthrobacter resinosus, Arthrobacter isopropanolophila, Arthrobacter flavidus oder eine Variante oder Mutante davon ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Coproporphyrin III liefernde Mikroorganismus Arthrobacter hyalinus FERM-P Nr. 3125, Arthrobacter hyalinus ATCC 31263, Arthrobacter hyalinus DSM 867, Arthrobacter globiformis ATCC 8010, Arthrobacter globiformis IFO 12137, Arthrobacter aurescens ATCC 13344, Arthrobacter aurescens IFO 12136, Arthrobacter pascens ATCC 14358, Arthrobacter pascens IFO 12139, Arthrobacter

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ramosus ATCC 13727, Arthrobacter ramosus IFO 12958, Arthrobacter cremeus FEiM-P Nr. 3126, Arthrobacter resinosus FERM-P Nr. 3131, Arthrobacter isopropanolophila FERM-P Nr. 3129, Arthrobacter flavidus FERM-P Nr. 3130, ein 5-methyl-DL-tryptophan-resistenter Stamm FERM-P Nr. 5256 von Arthrobacter hyalinus, ein coproporphyrin-III-resistenter Stamm FERM-P Nr. 5259 von Arthrobacter hyalinus, ein L-tryptophanresistenter Stamm FERM-P Nr. 5258 von Arthrobacter globiformis oder ein L-tryptophan-resistenter Stamm FERM-P Nr. 5257 von Arthrobacter pascens ist.

7. Coproporphyrin III, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 erhalten worden ist.

8. Coproporphyrin III, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren gemäß Anspruch 4 erhalten worden ist.

9. Verfahren zur Erzeugung einer Variante oder Mutante eines Coproporphyrin III erzeugenden Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Coproporphyrin III erzeugenden Mikroorganismus des Genus Arthrobacter einer Bestrahlungsbehandlung oder einer Behandlung mit einem mutanteninduzierenden Mittel unterwirft, den behandelten Mikroorganismus in einem Kulturmedium, welches eine Verbindung enthält, die die Produktion von Coproporphyrin III inhibieren kann, züchtet und den Stamm, der eine erhöhte Fähigkeit besitzt, Coproporphyrin III zu erzeugen, aus dem Züchtungsprodukt isoliert.

130038/0624