DE2417642C3 - Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu FructoseInfo
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Description
15
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen
Isomerisierung von Glucose zu Fructose, d. h. ein Verfahren solcher Art, bei denen die Eigenschaften der
Enzyme, die dtiHi bestimmte Mikroorganismen erzeugt
werden, wenn sie in einem Xylose enthaltendem Medium gezüchtet werden, es diesen Mikroorganismen
erlauben. Glucose zu Fructose zu isomerisieren, wenn jie mit Glucose kontaktiert werden.
Es ist bekannt, daß bestimmte Mikroorganismen, die den Familien Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus und
Streptomyces angehören, in der Lage sind, die vorstehenden Isomerisierungsenzyme zu erzeugen.
Es ist ebenfalls bekannt, daß die Mehrzahl der Mikroorganismen, von denen die Rede sein wird, trotz
der Tatsache, daß sie dazu befähigt sind, Enzyme zu produzieren, die Glucose isomerisieren, schwerwiegende
Nachteile aufweist, wie insbes ndere Schwierigkeilen bei der Filtration nach der Isomerisierung und bei
der Reinigung der erhaltenen isornt isierten Sirupe, auf π
Grund der Anwesenheit von kolloidalen Substanzen, die Trübung oder Färbungen (Pigmente, die durch den
Mikroorganismus abgesondert werden und die nicht vollständig vom Mycelium bei seinem Waschen entfernt
werden) hervorrufen (Agr. Biol. Chem. 30, 1966. 1247-53).
Die vorstehenden bekannten Mikroorganismen besitzen auch andere Nachteile, wie Schwierigkeiten bei der
Rückgewinnung des Maceliums bzw. Mycels am Ende •ines Isomerisierungszyklus. schnellen Abbau der ti
•nzymatischen Aktivität des genannten Myceliums, was
verhindert, daß es durch Re/yklisierung auf eine Mehrzahl aufeinanderfolgender Chargen aus zu isomerisicrendem
Glucosesirup einwirkt.
Es wurde nunmehr in überraschender Weise ein \a
besonderer Mikroorganismus gefunden, und /war ein Stamm der Gattung Streptomyces violaceoniger. der
Bicht nur in der Lage ist. ein Enzym /ur Isomerisierung
von Glucose /u Fructose /11 erzeugen, sondern auch
ausät/lich die vorstehenden Na< hteile nicht mehr ·,->
■ufweist.
Dieser Mikroorganismus, dessen Ziiordmingseigenlchaflen
nachstehend beschrieben werden, wurde beim C'entralbureau voor Schimmel Cultures dc Baarn
(Niederlange) unter der Nr CBS 4097 5 hinterlegt. mi
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur
tnzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Isomerisieriingscnzym
erzeugenden Mikroorganismus einen Stamm von Stfeplomyces violacconiger, hinterlegt 6$
beim Ceniralbtireau voor Schimmel Cultures de Baarn
(Niederlande) unter der Nr. CBS 409-73, oder Mutanten davon cinset/(.
Weitere Charakteristika des Verfahrens gehen aus der nachstehenden Beschreibung hervor, die durch die
Beispiele und die entsprechenden Figuren, die sich auf vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
beziehen, veranschaulicht werden.
In den Figuren beziehen sich die Fig. 1, 2 und 3 auf das Beispiel 1 und zeigen die Entwicklung einerseits des
pH-Werts (Kurve C1, Fig. 1), andererseits der Menge Q
der im Milieu anwesenden reduzierenden Zucker, ausgedrückt in g/I, (Kurve Ci, F i g. 2) und weiterhin des
Verhältnisses γ des Volumens Vj des Mikroorganismus
zum Volumen Vj der Kultur (Kurve C3, Fig. 3) in
Abhängigkeit von der Zeit t, ausgedrückt in Stunden, und
die F i g. 4 bezieht sich ebenfalls auf das Beispiel I und zeigt die Entwicklung des absoluten Drehwerts cca
ausgedrückt in Grad, (Kurve Q) und des wahren Fructosegehaltes des Milieus, ausgedrückt in %, (Kurve
C5) in Abhängigkeit von der Zeit /. ausgedrückt in
Stunden.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm von Streptomyces violaceoniger wird unter aeroben Bedingungen
in untergetauchter Kultur in einem die geeigneten Nährstoffe sowie Xylose und Kohlenhydrat enthaltenden
Milieu gezüchtet. Das so gebildete Mycellium wird gesammtelt und kann bei Glucosesirupen eingesetzt
werden.
Die Kulturmedien, die zur Herstellung eines Myceliums von Streptomyces violaceoniger, das gemäß der
vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, verwendet werden, enthalten 5 bis 15 g Xylose pro 1 sowie
5 bis 50 g Stickstoffverbindungen pro 1, wie z. B. Soja, Maiswasser, Rückstände des Vegetationswasser von
Kartoffeln und Hefeectrakte.
Die pH-, Temperatur- und Zeitdauer-Bedingungen dieser Kultur bzw. Züchtung sind im übrigen:
5,0 < pH < 8,5. vorzugsweise 5.5
< pH < 7,5,
25°C<i<40°C. vorzugsweise 300C . '<35°C,
Zeitdauer 24 bis 48 Stunden.
25°C<i<40°C. vorzugsweise 300C . '<35°C,
Zeitdauer 24 bis 48 Stunden.
Es zeigt sich, daß dieses Verfahren der Kultur e*>
ermöglicht, unter diesen Bedingungen ein leicht filtrierbares ausgiebiges Mycelium bzw. ein leicht
filtrierbares Mycelium im Überfluß zu erhalten, das eine gute Isomierisierungsaktivität aufweist
Im Hinblick auf seinen Einsatz an einem Glucosesirup filtriert man das so erhaltene Mycelium, wäscht es durch
Versprühen bzw. Pulverisation mit Wasser und sammelt es in Pastenform. Es kann in dieser Form in der Kälte
(im allgemeinen bei einer Temperatur in der Größenordnung von -20"C) aufbewahrt werden oder durch
Lyophilisierung getrocknet werden, wodurch seine
Aufbewahrung ebenfalls ermöglicht wird, jedoch verwendet man es im allgemeinen sofort, indem man es
in dem /ti isomerisierenden Sirup dispergiert
Das filtrierte Myuellium wird gewaschen und unter
den folgenden allgemeinen Isomensieningsbedirigungen
cingeset/l:
Temperatur: | '.() is 75 C |
pH:' | 6 bis 8 |
Konzentration des Milieus | |
an Glucose: | 25 bis 60% |
CoCI2: | 0.0 bis 0,50 g/I |
MgSO4: | 0,0 bis 2,4 g/l |
Die Zeitdauer hiitigt von den Bedingungen und der
Menge des eingesetzten Myceliums ab.
von Glucose zu Fructose durch Einsatz des erfindungsgemäßen
Mikroorganismus für eine Myceüum-Menge bzw. -Konzentration von 1 Volumen Kulturbrühe auf 1
Volumen einer 50%igen Dextroselösung innerhalb 24 Stunden in der Größenordnung von 45% liegt.
Die Klassifizierungseigenschaften bzw. die taxonomischen
Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes von Streptomyces violaceouiger sind wie folgt:
Aussehen der Sporen: kugelförmig, mit einer Dimension von 0,9 bis 1,2 μ und mit glatten oder wenig
rauhen Wandungen;
Aussehen des aerialen Myceliums bzw. Luftmyceliums: Sporen tragend und bildend, graubräunlich, das
sich zu schwarzen feuchten Flecken verflüssigt und das Verzweigungen von monopodialen Sporophoren bzw.
Sporenträgern aufweist;
Aussehen der Spiralen: sie sind kurz, agglomeriert, mit 1 oder 2 Ranken (viticula);
Aussehen des vegetativen Myceliums: es ist weißlich bis gelblich (bis gemsfarben).
Es ist möglich, ein lösliches Pigment zu extrahieren, das schwachrosa und das in der abgerahmten Milch
erzeugt wird.
Kultur auf einen »Eisen-Pepton-Agar«-Medium: keine melanoiden Pigmente (die auch bei der Kultur auf
einem Tyrosin-Agar-Medium nicht auftreten).
Diastase-Aktivität: Agar +; Stärke + Proteolytische Aktivität:
Milchkoagulation
gute Peptonisierung
Gelatineverflüssigung
Durch den Stamm assimilierte Zucker:
Saccharose
Inosit
Rhamnose
Raffinose
Die Gesamtheit der vorstehenden Eigenschaften erlaubt es, zu bestätigen, daß der in Rede stehende
Stamm der Cattung Streptomyces violaceoniger (Kataloge Waksman & Curtis und Waksman & Henrici)
»ngehört. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß das Kohlenstoff-Assimilationsspektrum sich etwas untericheidet.
Das umfaßt erfindungsgemäße Verfahren den Einsatz von Mutarten des genannten Stammes, die z. B.
natürliche oder künstliche Mutanten sein können, welch letztere z. B. durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen
oder durch Behandlung des Ausgangsstammes mit mutagenen Chemikalien, wie z. B. Nitrosoguanidin und
Methansulfonsäureälhylester. erhalten werden können.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung
Beispiel 1 a) Herstellung des Myceliums
In ein Kermentiergefäß von 201, das 151 Wasser
enthält, bringt man 525 g Maiswasser mit 50% Trockenextraklen. 1050 g Xylose und 15 g Magnesiumsulfat
ein, wobei alles sterilisiert wird.
Man stellt den pH-Wert vor der Sterilisation mit Ammoniak auf 6,8 ein und gibt 10 g Maisöl hinzu, um ein
übermäßiges Schäumen bzw, Sprudeln zu verhindern.
Nach einer 10 niinütigen Sterilisation bei I2O°C wird
das Milieu mil 400 ml einer 48stündigen Vorkultur von Streptomyces violaceonigcr. vom Stamm CBS 409-73
enthalten in einem Erlcnmeyer-Kolben von 21, an-BcimDft.
Das Fermentiergefäß ist mit einem System zum mechanischen Rühren, eingestellt auf 600 LJpM,
versehen, und die Belüftung ist auf 8 I sterilisierte Luf» pro Minute eingestellt.
Die Kurven der Fig. 1, 2 und 3 zeigen die Entwicklung des pH-Werts (Fig. 1, Kurve Q), der
Menge der anwesenden reduzierenden Zucker (Fig.2,
Kurve Cj) und des Mikroorganismus-Volumens pro Kultur-Volumen (F i g. 3, Kurve C3) in Abhängigkeit von
der Zeit, wobei die letztere Größe durch die Höhe des Bodensatzes nach dem Zentrifugieren in einem
graduierten Meßzylinder bzw. Reagensglas unter Standardbedingungen, d.h. 5000 UpM, während 10
Minuten gemessen wird.
Aus F i g. 3 ergibt sich, daß nach 24 Stunden Kultur die erhaltene Streptomyces-Menge ein Maximum erreicht
und nicht mehr ansteigt.
Die 15 1 der Kultur werden auf einem Büchner-Filter,
der mit einer Vorschicht aus Filtererde versehen ist, filtriert. Der gesammelte Streptomyces wird mit
Trinkwasser gewaschen.
Man sammelt auf diese Weise ohne Schwierigkeiten 800 g feuchte Zellen auf
b) Glucose-Isomerisierung
Die .orstehend erhaltenen 800 g Streptomyces werden in 15 1 einer Dextroselösung mit 500 g/kg der
Lösung, die Spuren von Magnesium- und Kobaltsalzen, nämlich 2.4 g/l MgSO4 und 0,24 g/l CoCI2. enthält,
suspendiert.
Der pH-Wert wird mit Hilfe einer Lösung von
Natriumhydroxyd und Natriumsulfit auf 6,8 eingestellt, anschließend wird die Temperatur eer Suspension auf
65°C gebracht und der pH mit Hilfe eines automatisehen pH-Meßgeräts auf dem Wert von 6,8 gehalten.
In der nachstehenden Tabelle I sind die fortschreitenden Werte des absoluten Drehwerts a/jund des wahren
Fructosegehalts des Mediums und des pH in Abhängigkeit von der Zeit zusammengefaßt.
Mit Hilfe der in Tabelle I zusammengefaßten Werte wurden die entsprechenden Kurven G («o) und G (%
Fructose) des Diagramms der Fig.4 erstellt, was auf
ei ie vvesuntliche Isomerisierungsaktivität schließen läßt,
wobei innerhalb von 20 Stunden Isomerisierungszeit 47,5% D-Fructose gebildet werden.
Beispiel 2
a) He! stellung des Myceliums
a) He! stellung des Myceliums
Die Herstellung erfolgte unter denselben Bedingungen wie in Beispiel I1 mit dem Unterschied, duß die
Maiswasser durch 300 g Proteine ersetzt wurden, die der Ausflockung der Vegetationswasser von Kartoffeln
entstammten, wobei der pH-Wert immer mit Ammoniak auf 6,8 eingestellt wurde.
Nach 26stiindiger Fermentation (Ruhren hei
600 UpM. Luftzufuhr 8 l/Min.) sammelt man nach ilci
Zeit in Stunden | +40°5 | % Fructose | pH |
2 | +29°1 | 8,5 | 6,9 |
4 | + 12°2 | 16.5 | 6,3 |
6 | -13°1 | 28,0 | 6,9 |
16 | -15°2 | 45,5 | 7.0 |
20 | 47.5 | 7.1 | |
Filtration 750 g feuchte Zellen von Streptomyces violaceoniger.
b) Isomerisierung von Glucose
Der vorstehend erhaltene Streptomyces-Kuchen wird in 151 einer 50gewichtsprozentigen Dextroselösung
unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen dispergiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle Il
zusammengefaßt.
in einer ammoniakalischen Lösung durch die alkalische Protease während 8 Stunden hydrolysiert)ersetzt.
Nach 24slündiger Fermentation und praktisch vollständigem
Verschwinden von reduzierenden Substan-■>
zen erhält man nach lOminüligem Zentrifugieren bei 5Ö0O UpM ein Strcptimyces-Volumen von 0,6 ecm/
10 ml Kultur.
Die Filtration dieser Kulturmedien ergibt 580 bzw. 560 g feuchte Streplotriyces-Zellen.
Tabelle II | "O | % Fructose | PH |
Zeit in Stunden | 52°5 +18°1 —15°6 |
0 27,5 46,5 |
6,8 7,0 6,9 |
0 5 2i |
|||
Dieses Beispiel veranschaulicht die Leichtigkeit der Filtration des Stamms und die Möglichkeit, ihn zu
rezyklisieren.
a) Herstellung des Myceliums
Zwei Fermentierungsgefäße von 151 werden unter
den in Beispiel I beschriebenen allgemeinen Bedingungen vorbereitet.
Die Maiswasser wurden durch ein proteolytisches Hydrolysat von Casein (1% Casein, d. h. 150 g, wurden
b) Isomerisierung mil Rezyklisierung des Enzyms
Man führt sieben aufeinanderfolgende Isomcrisierungen an 151 einer 50%igen Dextrosclösung unter
denselben Bedingungen wie Beispiel Ib durch. Die erste
Isomerisierung wird mit 560 g Streptomyccs-Zellen, die dem zweiten Fermentiergefäß entstammen, durchgeführt.
Die zweite isomerisierung wird mii einer neuen
Charge von 151 50%igem Glueosesirup mit dem nach
der Filtration des der 1. Operation entstammenden Reaklionsmediums wiedergewonnenen Streptomyces
durchgeführt.
Die Isomerisierungen 3,4,5 und 6 werden an anderen
Chargen von 15 1 des Sirups durchgeführt, indem man dem Mycelium, das nach der Filtration aus der
vorangegangenen Operation wiedergewonnen wurde. 145 g frische Zellen aus dem Fermentiergefäß 1
zusetzte.
Eine 7. und letzte Isomerisierung wird ohne Zugabe von frischen Streptomyces-Zellen durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser ganzen Operationen sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt.
Sieben aufeinanderfolgende Isomerisierungen, durchgeführt mit demselben Mycelium
1. | 0/. Cn.» | 2. | 0/. ΙΓη.η | 3. | 11. Cr..-. | 4. | 0/. Cn.» | 5. | 0/. EV..,* | 6. | 0/. C„,„ | 7. | 0/. Er. ■- |
tose | tose | tose | tose | tose | tose | tose | |||||||
Isomerisierung | 42,0 | Isomerisierung | 33,0 | Isomerisierung | 28,5 | Isomerisierung | Isomerisierung | Isomerisierung | Isomerisierung | ||||
7»:. | 7.:i | 7o,·. | 7»:. | 7«:» | 21,0 | ||||||||
39,0 | 42,5 | 42,0 | 42,5 | 40,0 | |||||||||
14 Std. |
20 Std. |
14 Std. |
41,0 | ||||||||||
20 Std. |
|||||||||||||
27 Std. |
38 Std. |
27 Std. |
38 Std. |
45 Std. |
|||||||||
68 Std. |
Dieses Vorgehen erlaubt es, 107 1 50%igen Glukosesirups zu isomerisieren, wobei das Mycelium 301
Kulturbrühe entstammt, während es ohne Rezyklisierung notwendig wäre, das 107 1 Kulturbrühe entstammende
Mycelium zu verwenden.
Des weiteren erlauben es die Zahlen der Tabelle III, festzustellen, daß, während der durchschnittliche Fructosegehalt
der sieben Sirupe etwa 42% betrug, die gute Beibehaltung der isomerisierenden Aktivität des Myceliums
während seines ganzen Einsatzes klar bewiesen wurde.
Mutation durch Ultraviolettbestrahlung
Man läßt eine Kultur von Streptomyces violaceoniger
CBS 409-73 auf einem geneigten Agar-Agar auf der Grundlage von Maismehl von 60 g/l bei einem pH 7
sporulieren.
Die Sporen werden gesammelt, indem man die Oberfläche der Kultur in Anwesenheit einer kleinen
Menge einer sterilen Trypton-Kochsalzlösung abkratzt
und sie in Suspension in 10 mi des Verdünnungsmittels
Trypton-Kochsalz bringt
Die so erhaltene Suspension wird in einen sterilen Kristallisator plaziert und einer langsamen Rührung mit
Hilfe eines Magnetrührers unterworfen.
Man bestrahlt die Suspension unter Verwendung einer Ultraviolettlampe (z.B. Philips® 125 W black
light), die in einer Entfernung von 20 cm angebracht ist Alle 10 min innerhalb 1 Std. entnimmt man 0,1 bis 0,2 ml
der Suspension, die man auf der Oberfläche eines
Agar-Agar-Milieus, enthaltend 0,5% Xylose und 1%
Hefeextrakt, untergebracht in Pelrischalen. aufträgt. Nach einer Kultur bei 30° bringt man die isolierten
Kolonien auf geneigtes Agar-Agar auf der Grundlage von Maismehl.
Ausgehend von so hergestellten geneigten Agar-Ktilturen
nimmt man 10 ml einer Bouillon, die 1% Dextrose
und Ι'*/ο Hefeextrakt in einem konischen Fläschchcn von
50 ml enthält. Man kultiviert unter Kühren bei 3O0C
während 2 Tagen. Mit Hilfe von 5 ml der so erhaltenen
Vorkultur beimpft man 50 ml einer Produktionsbouillon, die 1,2% Xylose und 1% Hefeextrakt in einem
konischen Fläschchcn von 500 ml enthält.
Man kultiviert unter Rühren bei 30° Während 3 Tagen. Man entnimmt dann 5 ml der so gewonnenen
Kultur, die man in ein Proberöhrchen enthaltend 25 ml einer bei pH 7,5 gehaltenen Lösung und 36 g/l Dextrose
Und 5 g/l Magnesiumsulfat enthält. Die Proberöhrchen werden dann in ein Wasserbad bei 65"C während 7
Stdn. placiert.
Nach Abkühlung werden die Mikroorganismus-Zellen durch Filtration oder Zenlrifugierung abgetrennt
Und man bestimmt die in der Lösung gebildete Fructose mittels einer kolorimetrischcn Technik mit Resorcin auf
einem Auto-Analysatof.
Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhaltenen Konzentrationen an Fructose:
Fructose | Stamm A-6 | Fructose | I | |
g/l | Λ-7 | g/l | 2,6 | |
CBS 409 / 73 | 3 | Λ-8 | 3 | |
CBS 409 / 73 | 3,4 | Λ-9 | 3,5 | |
CBS 409 / 73 | 3,2 | Λ-Ι0 | 4,8 | |
Stamm Λ-1 | 2,3 | Λ-1Ι | 4,3 | |
A-2 | 3,8 | A-12 | 2,7 | |
Λ-3 | 4,5 | Λ-Ι3 | 2,9 | |
A-4 | 3,5 | |||
Λ-5 | 4,0 | |||
Eine Variante der Herstellung der Mutanten des Stammes violaceonigcr CBS 409-73 besteht in einer
Bestrahlung mit ultraviolettem Licht, wobei die Sporensuspension wie oben hergestellt wurde, aber
ι wobei man während 16 bis 24 Stdn. inkubiert, um die
Keimung der Sporen anzuregen.
Mutation mit Hilfe von Nilroso-melhylguanidin
Zu einer wie vorausgehend angegeben hergestellten
ίο Sporensiispension fügt man Nilroso-rnethylguanidin in
solcher Menge zu, um eine Konzentration von I bis 3 mg/ml zu erhalten. Man beläßt den Kontakt bei 30°C
Während 30 bis 120 Min. Man entnimmt alle 30 Min. 0,5 ml der Suspension, die man in 0,5 ml einer sterilen
i-, Glykokoll-Lösung von 1% einführt. Nach I Std.
Kontakt isoliert man auf die Oberfläche eines Agar-Milieus enthaltend 0,5% Xylose und 1% Hefeextrakt,
die in Petrischalen enthalten sind. Nach einer Kultur bei 30°C bringt man die isolierten Kolonien auf
>ii geneigten Agar-Agar auf Grundlage von Maismehl.
Ausgehend von den so hergestellten geneigten Agar-Proben beimpft man 10 ml einer Boullin enthaltend
1% Dextrose und 1% Hefccxtrakt in einem konischen Mäschchcn von 50 ml. Man kultiviert unter
>-. Rühren bei 30° während 2 Tagen. Mit Hilfe von 5 ml der
so erhaltenen Vorkultur beimpft man 50 ml einer Produktionsbouillon enthaltend 1,2% Xylose und 1%
Hefeextrakt in einem konischen Fläschchen von 500 ml. Man kultiviert unter Rühren bei 30° während 3 Tagen.
»ι Man entnimmt dann 5 ml der so erhaltenen Kultur, die man in ein Proberührchen einführt, das 25 ml einer beim
pH von 7,5 gehaltenen Lösung und 36 g/l Dextrose und 5 g/l Magnesiumsulfat enthält. Die Proberöhrchen
werden dann in ein Wasserbad bei 65" während 7 Stdn.
υ placiert.
Nach Abkühlen werden die Mikroorganismus-Zellen durch Filtration und Zentrifugieren abgetrennt und man
bestimmt die in der Lösung gebildete Fructose durch eine colorimctrischc Technik mit Resorcin auf einem
-in Aiilo-Analysator.
Hierzu 2 Blatt Zcicliniiimen
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zur Fructose bei einer Temperatur von 50 bis 75°C, einem pH-Wert von 6 bis 8, einer Konzentration an Glucose von 25 bis 60%, an CoCb von 0 bis 0,50 g/l und an MgSO4 von 0 bis 2,4 g/I, gekennzeichnet durch den Einsatz eines Stammes von Streptomyces violaceoniger mit der Hinterlegungsnummer CBS 409-73 oder eines Mutantenstammes dieses Stammes.
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