DE3022681C2

DE3022681C2 -

Info

Publication number: DE3022681C2
Application number: DE3022681A
Authority: DE
Inventors: George R. Dr. Brookline Mass. Us Siber
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1979-06-19
Filing date: 1980-06-18
Publication date: 1992-07-30
Also published as: JPH0256633B2; SE448577B; DE3022681A1; GB2052059B; US4310508A; FI68468B; NO801830L; DK166234C; SE8004542L; JPS5631648A; DK258080A; NL191323B; NO153910B; GB2052059A; BE883905A; DK166234B; FI68468C; CA1138331A; IT1129088B; AU538062B2

Description

Die Erfindung betrifft ein direktes Agglutinationsverfahren, dessen Ziel die Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antigenen in Körperflüssigkeiten, z. B. Serum, Urin, cerebrospinaler Flüssigkeit o. dgl., als Hilfsmittel bei der Diagnose gewisser physiologischer oder pathologischer Zusätze bei Mensch und Tier ist, und insbesondere ein Verfahren zum Nachweis von Polyribophosphat in einer Probe einer Körperflüssigkeit.

Die US-PS 36 00 494 offenbart einen serologischen Test für Syphilis mittels einer Agglutationsreaktion. Hierbei wird eine Probe einer Körperflüssigkeit mit einer Lösung behandelt, die nicht pathogene Erreger von Treponema pallidum-Zellbestandteilen enthält sowie normale Kaninchen-testis-Verbindungen zur Absorption heterogener Antikörper. Die behandelte Serumprobe wird daraufhin mit einer neuen Antigenzubereitung umgesetzt, die eine Suspension eines sensibilisierten Trägers von Treponema pallidum in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung enthält. Die phosphatgepufferte Kochsalzlösung kann beispielsweise außerdem geringe Mengen des Netzmittels Polysorbat 80 und des Polysaccharids Gummi arabicum enthalten.

Der Nachweis von mikrobiellen Antigenen in Körperflüssigkeiten kann bei der schnellen Diagnose einer zunehmenden Zahl von Infektionen nützlich und vorteilhaft sein. Ein größeres Problem liegt jedoch darin, daß die zur Zeit verfügbaren Methoden nicht genügend empfindlich sind (Immundiffusion, CIE) und daher nicht die Anwesenheit von Antigenen in einem wesentlichen Teil von infizierten Patienten anzeigen, oder für eine schnelle Diagnose (RIA, ELISA) zu zeitraubend sind. In gewissen Fällen ist der Antigen-Antikörper-Komplex langsam zu bilden, und/oder die gebildeten Partikel sind zu klein, um mit Sicherheit beobachtet zu werden. Die Nachweisbarkeit wurde durch Anwendung von Agglutinationstests verbessert, bei denen Partikel als Träger, an dessen Oberfläche das Antigen- oder Antikörpermolekül adsorbiert oder gebunden wird, verwendet werden.

Diese Agglutinationstests können nach der indirekten Methode durchgeführt werden, bei der die klinische Probe mit dem Antikörper bei einer ganz bestimmten Verdünnung gemischt und nach geeigneter Inkubationszeit ein Indikatorsystem, das aus einem Komplex des an einen feinteiligen Träger gebundenen Antigens besteht, dem Gemisch zugesetzt wird. Wenn Antigen in der klinischen Probe vorhanden ist, ist der Antikörper nicht verfügbar, um mit dem Antigen-Träger-Komplex zu reagieren, so daß keine Agglutination stattfindet, d. h. fehlende Agglutination ist ein positiver Test für das Antigen. Wenn umgekehrt das Antigen in der klinischen Probe nicht vorhanden ist, reagiert der Antikörper mit dem Antigen- Träger-Komplex, wobei es zu Agglutination der Indikatorprobe kommt. Die Theorie, nach der solche Agglutinationstests arbeiten, ist bekannt, beispielsweise aus den US-PSen 38 73 683 und 40 45 384.

Es ist seit langem bekannt, daß die einzige aussagekräftige Diagnosemethode auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten der frühzeitige schnelle Nachweis der mit dem infektiösen Agens assoziierten Antigene ist, wobei eine sofortige Anweisung zur wirksamen Behandlung gegeben ist.

Die US-PS 38 73 693 offenbart ein Reagenz zur Auffindung von Chlorion-Gonadotrophin des Menschen, das aus einer wäßrigen Suspension aus Polystyrenlatex-Partikeln besteht, an die anti- Chorion Gonadotrophin-Antikörper adsorbiert sind.

Die mit einem solchen Reagenz verbundene hohe nicht spezifische Agglutination kann nicht zufriedenstellen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die nicht spezifische Agglutination zu reduzieren und damit verbunden die Testempfindlichkeit zum Nachweis von Antigen in Körperflüssigkeit zu erhöhen.

Diese Aufgabe wird bei einem direkten Agglutinationsverfahren zum Nachweis von Antigenen in Körperflüssigkeiten, bei dem man ein Testserum dieser Körperflüssigkeiten mit einem flüssigen Reagenz kombiniert, welches Trägerteilchen enthält, die mit tierischem Antiserum oder seinem Immunoglobulin-Anteil gegen diese Antigene umhüllt sind und in einem verträglichen physiologischen Puffersystem suspendiert sind, dadurch gelöst, daß man zur Vermeidung einer positiven nicht-spezifischen Reaktion zu der Reaktionsmischung ein Serumpuffersystem hinzufügt, das ein Polyanion, das die Wirkung von wärmelabilen Bestandteilen im Testserum vermindert, und ein Reduktionsmittel, das die Wirkung von wärmestabilen Bestandteilen im Testserum vermindert, enthält.

Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert.

Gemäß der Erfindung wurde nun ein äußerst empfindlicher Agglutinationstest für den Nachweis von Antigenen, z. B. Proteinen und den Polysacchariden der verschiedensten Mikroorganismen einschließlich Bakterien, Protozoen und Fungi in niedrigen Konzentrationen in Körperflüssigkeiten entwickelt. Ein erfindungsgemäßer Test wird beschrieben, durch den routinemäßig bereits 0,2 ng/ml der in Verbindung mit pathogenen Bakterien auftretenden kapsulären Polysaccharide nachgewiesen werden. Dies stellt eine Empfindlichkeit dar, die 25- bis 250mal größer ist als bei den weitgehend angewandten Gegenstrom- Immunelektrophoresemethoden (CIE), und wenigstens die gleiche Empfindlichkeit wie beim Radioimmuntest (RIA). Außerdem ist zwar der CIE-Test schnell, jedoch erfordert er geschultes Laboratoriumspersonal und mäßig kostspielige Reagentien und Apparaturen und ergibt eine begrenzte Empfindlichkeit von 10 bis 50 ng/ml bei den meisten bakteriellen Polysacchariden. Da in Körperflüssigkeiten häufig niedrigere Konzentrationen des Antigens auftreten, werden häufig bei Patienten mit durch Kulturen belegten Bakterieninfektionen falsche negative CIE- Tests beobachtet. Der Radioimmuntest andererseits ist 10- bis 100mal empfindlicher als der CIE-Test, jedoch viel zeitraubender und teurer.

Besonders bevorzugt ist ein empfindlicher Partikelagglutinationstest, der den Nachweis von mikrobiellen Antigenen in Körperflüssigkeiten bei Konzentrationen bis hinab zu 0,2 ng/ml Körperflüssigkeit ermöglicht und durch eine Rate von nicht-spezifischer Agglutination bei menschlichen Sera von 2% oder weniger gekennzeichnet ist. Mit der Erfindung ist insbesondere der Nachweis von Polyribophosphat (PRP) in einer Probe einer Körperflüssigkeit möglich, indem man

- ein wäßriges Reagenz, das eine wäßrige Suspension feinverteilter Partikel, an die PRP-spezifische Antikörper adsorbiert sind, wobei diese Antikörper aus Pferde(equinus)-Spezies stammen, die mit PRP immunisiert worden sind, mit einer Probe einer Körperflüssigkeit und einem Serumpuffersystem, welches aus einer Mischung eines Polyanions und eines Reduktionsmittels besteht, mischt,
- die Mischung inkubiert und
- daraufhin das Vorliegen einer Agglutination bestimmt, eine Agglutinationsreaktion, die die Gegenwart von PRP in Körperflüssigkeits-Proben anzeigt,

gerichtet.

Begrenzte Empfindlichkeit ist das Hauptproblem bei den bisher beschriebenen Methoden zum Nachweis des Antigens von Mikroorganismen. Als Folge kann bakterielles Antigen nicht bei allen Patienten mit belegten Infektionen nachgewiesen werden. Beispielsweise haben Versuche ergeben, daß 7 bis 22% der Patienten mit H.i.b.-Meningitis, 38% mit H.i.b. Epiglottitis, 20 bis 39% mit bakteriämischer Pneumonia mit Pneumokokken als Erreger und 50 bis 90% mit nicht-bakteriämischer Pneumonia mit Pneumokokken als Erreger kein nachweisbares Antigen im Serum oder in der cerebrospinalen Flüssigkeit aufweisen, wenn der Test mit Hilfe verfügbarer Gegenstrom-Immunelektrophorese oder Partikelagglutinationstests durchgeführt wird. Ein Radioimmuntest, der 0,5 ng/ml oder weniger nachzuweisen vermag, ermöglicht jedoch die Diagnose wirklich aller Fälle von H.i.B.-Meningitis, wenn sie erstmals dem Arzt vorgeführt werden. Die Testergebnisse zeigen ferner, daß die Konzentration des Antigens bei 37% der Patienten geringer war als 10 ng/ml und daher unter der Empfindlichkeit der meisten verfügbaren Gegenstrom-Immunelektrophorese- Methoden lag.

Der im Rahmen der Erfindung gebrauchte Ausdruck "Partikel" bedeutet Teilchen oder Partikel, die gegenüber den anderen Komponenten inert und neutral sind und Antisera in irreversibler Weise zu adsorbieren vermögen. Diese Partikel können Glasperlen, Polybutadien, Polystyrol, Butadien-Styrol-Copolymerisate usw. mit einer mittleren Teilchengröße von etwa 0,15 bis 0,9 µm sein. Vorzugsweise werden Polystyrol-Latexpartikel mit einem gleichmäßigen Durchmesser von etwa 0,81 µm als 10%ige (Gew./Vol.) Suspension in destilliertem Wasser mit den vorstehend genannten Antisera wie folgt sensibilisiert.

Gemäß der Erfindung wurde die Häufigkeit von nicht-spezifischer Agglutination bei Humansera auf 2% oder weniger verringert durch Zusatz eines Serumpuffers, der ein Polyanion und ein Reduktionsmittel enthält, direkt zum Inkubationsgemisch.

100 frische Sera von Erwachsenen wurden mit einem Serumpuffer getestet, der sowohl ME (wie oben) als auch SPS in einer Konzentration von 0,05% enthielt. Nur eines der 100 Sera ergab eine nicht-spezifische Agglutination mit Anti-PRP und Kontroll-LP. Nicht-spezifische Agglutination bei diesem Serum wurde durch Erhitzen ausgeschaltet.

Der Serumpuffer wird wie folgt hergestellt:
Man verdünnt 14-molares 2-Mercaptoäthanol (Standardlösung von voller Stärke) im Verhältnis von 1 : 40 in glycingepufferter Kochsalzlösung (GBS) (0,1 M Glycin, 0,9% Natriumchlorid, pH 8,2). Man verdünnt 5%ige wäßrige Lösung von Polyanetholsulfonat im Verhältnis von 1 : 100 in der gleichen glycingepufferten Kochsalzlösung.

An Stelle von 2-Mercaptoäthanol kann der Serumpuffer auch andere Reduktionsmittel enthalten, z. B. Dithiothreit, Glutathion und Cystein. Darüber hinaus können andere Polyanionen wie Dextransulfat, Heparin und Carrageenin u. dgl. verwendet werden, solange sie die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht stören.

In der folgenden Tabelle 1 ist die optimale Konzentration der Reagentien im Serumpuffer genannt. Durch höhere Konzentrationen der Reduktionsmittel oder Polyanionen wurde die Empfindlichkeit des Tests verschlechtert, und durch niedrigere Konzentrationen wurde eine nicht-spezifische Agglutination nicht ausgeschaltet. Dies gilt für alle Sera.

Tabelle 1

Optimale Konzentrationen der Reagentien im "Serumpuffer"

Die effektive Konzentration von tierischem Nicht-Immunserum in der Latexsuspension wurde im Testsystem unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Serumpuffers überprüft.

Konzentrationen von tierischem Nicht-Immunserum von weniger als 0,25% in der Partikelsuspension (weniger als 0,035% im endgültigen Testgemisch) ergaben gelegentliche nicht-spezifische Agglutination trotz der Verwendung des Serumpuffers.

Konzentrationen von tierischem Nicht-Immunserum bis etwa 25% in der Latexsuspension (3,5% im endgültigen Testgemisch) sind wirksam hinsichtlich der Verringerung des Auftretens von nicht-spezifischer Agglutination, jedoch wurde durch die höchste Konzentration, nämlich 25%, die Empfindlichkeit des Tests für Polyribophosphat um das 2-fache verringert.

Um den Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber bekannten Verfahren zu demonstrieren, wurden folgende Vergleichsversuche durchgeführt.

Das Auftreten nicht-spezifischer Agglutination wurde an Sera bestimmt, die von stationär im Krankenhaus befindlichen Kindern und erwachsenen Patienten, die nicht an Haemophilus influenza Typ b litten, entnommen wurden. Alle Sera wurden mit Latex-Partikeln, die mit Burro- Antiserum (Anti-PRP-LP) und mit Latex-Partikeln, die mit Nicht-Immun-Burroserum (Kontroll-Latex-Partikel) sensibilisiert waren, getestet.

Bei Vorversuchen wurden Sera, die wärmebeständige Agglutinine enthielten, mit Zusatz von 10 µl eines Reduktionsmittels wie 1,4-Dithiothreit (DTT) oder 2-Mercaptoäthanol (ME), das dem Inkubationsgemisch zu Beginn der Inkubation zugesetzt wurde, getestet. Optimal waren Konzentrationen von 0,018 M für DTT und 0,35 M für ME (die Endkonzentrationen im Inkubationsgemisch betrugen 0,0026 M bei DTT und 0,05 M bei ME).

In der folgenden Tabelle 2 sind die Ergebnisse zusammengestellt, die mit 104 pediatrischen Sera, die vor dem Test wenigstens 24 Stunden bei 4°C gehalten worden waren, erhalten wurden.

Tabelle 2

Auftreten von nicht-spezifischer Agglutination bei gelagerten Sera¹) von Kindern mit stationärem Krankenhausaufenthalt ohne die Krankheit Haemophilus influenzae Typ b

69% der Sera riefen eine nicht-spezifische Agglutination mit Anti-PRP hervor, und alle mit Ausnahme von 4% wurden durch Kontroll-LP identifiziert.

Durch Inaktivierung durch Wärme (15 Minuten bei 60°C) wurde das Auftreten der nicht-spezifischen Agglutination nur geringfügig auf 53% verringert, und durch Zusatz von Nicht-Immunburroserum sowohl zu Anti-PRP als auch Kontroll-LP wurde die nicht-spezifische Agglutination auf 31% verringert. Der Zusatz von 10 µl eines Reduktionsmittels, nämlich Dithiothreit ohne Zusatz des Polyanions, verringerte das Auftreten von nicht-spezifischen Reaktionen auf 2%. Die Ergebnisse, die bei 52 gelagerten Sera von Erwachsenen erhalten wurden, waren ähnlich. Nur ein Serum ergab eine nicht-spezifische Agglutination (positiv bei Anti- PRP-LP und Kontroll-LP), wenn 2,5 N-Burroserum den Latex-Partikeln und DTT dem Inkubationsgemisch zugesetzt wurde.

In einem weiteren Vergleichsversuch zur Demonstration des Vorteils des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber bekannten Verfahren wurden 100 Sera mit und ohne Reduktionsmittel (ME) und mit und ohne Inaktivierung durch Wärme (5 Minuten bei 60°C) getestet. Die Agglutination wurde mit Anti-PRP-LP und Kontroll-LP, die je 2,5% normales Burro-Serum enthielten und in allen Fällen korrespondierten, getestet. Die Muster der Agglutination sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Nicht-spezifische Agglutination mit frischen Sera von 100 Erwachsenen ohne die Krankheit Haemophilus influenza Typ b¹)

42% der unbehandelten Sera (keine Wärme, kein Reduktionsmittel) ergaben eine nicht-spezifische Agglutination. Bei Zusatz eines Reduktionsmittels (ME) wurden 28 der Sera negativ (Muster 2), ein Zeichen für die Anwesenheit von Antiglobulinen. 14 Sera, die anfänglich negativ waren, wurden positiv (Muster 4), ein Zeichen, daß ein wärmelabiles Agglutinin durch Mercaptoäthanol reaktiviert war. Die reine Wirkung von ME allein bestand in der Verminderung nicht-spezifischer Agglutination auf 38%. Eine ähnliche Rate der nicht-spezifischen Agglutination wird durch Inaktivierung durch Wärme allein erreicht. Die Kombination von Inaktivierung der Sera durch Wärme und des Zusatzes eines Reduktionsmittels zum Inkubationsgemisch verringerte jedoch das Auftreten von nicht-spezifischer Agglutination auf eine Größenordnung von 2% oder weniger.

Die Inaktivierung durch Wärme ist jedoch zeitraubend. Außerdem erhöhen wärmelabile Serumfaktoren die nicht- spezifische Agglutination.

Der durch den Test gemäß der Erfindung erreichte hohe Empfindlichkeitsgrad kann noch weiter optimiert werden durch Modifikationen von bisher bekannten Partikelagglutinationstests, nämlich aus der Auswahl eines spezifischen H.i.b.-Antiserums, aus der Verwendung einer Globulinfraktion des Antiserums, dem Waschen des sensibilisierten Partikels und der Verlängerung der Inkubationszeit des Partikelagglutinationstests von den üblichen 5 Minuten auf etwa 45 Minuten oder mehr.

Z. B. hat eine Verlängerung der Inbubationszeit von 5 Minuten auf 45 Minuten oder länger eine 10- bis 20-fache Steigerung der Empfindlichkeit zur Folge. Für praktische klinische Zwecke wurde eine Inkubationszeit von 45 Minuten, bei der normalerweise in Abständen von 5 bis 15 Minuten abgelesen wurde, bei Verwendung von Latex-Partikeln gewählt, die mit einem Equinus-Antiserum umhüllt waren. Diese Latex-Partikel hatten eine Empfindlichkeit von 0,2 ng Antigen/ml Flüssigkeit.

Es wurde erwartet, daß die Steigerung der Empfindlichkeit der Partikel-Agglutinationstests auch zu vermehrtem Auftreten von nicht-spezifischen Agglutinationen führen würde, und tatsächlich agglutinierten im Falle von Serumproben 69% der Sera von Kindern, die sich stationär im Krankenhaus befanden, diese Latex-Partikel. Dieser große Nachteil begrenzte bisher die weit verbreitete Anwendung dieser Bestimmung. Faktoren, die bei der Agglutination von mit Gammaglobulinen umhüllten Latex-Partikeln eine Rolle spielen, sind wärmelabile Serumkomponenten (vermutlich Komplement) und wärmestabile Antiglobuline, die in niedrigen Konzentrationen gewöhnlich in Humansera insbesondere von Patienten mit chronischen Entzündungskrankheiten zu finden sind.

Eine nicht-spezifische Agglutination wurde durch Agglutination von Kontrollatex-Partikeln erkannt, die mit ganzem tierischem Nicht-Immunserum sensibilisiert waren. Bei Verwendung von mit Makroglobulin umhüllten Latex- Partikeln werden die Kontroll-Latex-Partikel mit der Makroglobulinfraktion von Nicht-Immunserum umhüllt.

Die meisten Urinproben ergeben nicht-spezifische Agglutination mit Anti-PRP und Kontroll-LP. Dies kann entweder durch Erhitzen (5 Minuten bei 100°C) oder durch Filtration des Urins ausgeschaltet werden.

Z. B. kann ein 0,45 µm-Filter verwendet werden.

Bei Proben der cerebrospinalen Flüssigkeit tritt sehr selten nicht-spezifische Agglutination ein, die durch Erhitzen (5 Minuten bei 100°C) ausgeschaltet wird. Das PRP-Antigen ist gegenüber den vorstehend genannten Maßnahmen des Erhitzens und der Filtration beständig.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird durch das folgende Beispiel beschrieben.

a) Umhüllen oder Beladen von Latex-Partikeln

Zur Herstellung von Anti-PRP-Latexpartikeln wird ganzes Burro-Antiserum gegen H. Influenzae Typ b im Verhältnis von 1 : 500 in glycingepufferter Kochsalzlösung (GBS) verdünnt und 30 Minuten auf 56°C erhitzt. 1 Teil Latexsuspension (eine 10%ige Suspension von Partikeln von 0,81 µm Durchmesser in destilliertem Wasser) wird zu 80 Teilen verdünntem Antiserum bis zu einer Endkonzentration der Latexpartikel von 0,125% gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und 10 Minuten bei 12 000 G zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Das Pellet wird erneut in dem gleichen Volumen der glycingepufferten Kochsalzlösung, die 0,1% Nicht-Immunburroserum enthält, suspendiert, in der vorstehend beschriebenen Weise erneut zentrifugiert und dann erneut in einem gleichen Volumen von glycingepufferter Kochsalzlösung, die 2,5% Nicht-Immunburroserum enthält, suspendiert. Kontroll-Latexpartikel werden in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt, wobei jedoch Nicht-Immunburroserum, das mit glycingepufferter Kochsalzlösung im Verhältnis von 1 : 500 verdünnt worden ist, verwendet wird, um die Latexteilchen erstmals zu umhüllen. Das in jedem Fall verwendete Nicht-Immunburroserum sollte ein Serum sein, das vor der Immunisierung vom gleichen Tier, das immunisiert wurde, gewonnen wurde.

Wenn die Makroglobulinfraktion zu verwenden ist, werden das ganze Nicht-Immunserum und das Immunburroserum an einer Gelfiltrationssäule der Handelsbezeichnung "Sephacryl®G-200" chromatographiert, und die im Zwischenraumvolumen der Säule eluierenden Fraktionen werden zusammengegossen. Die zusammengegossenen Fraktionen des Zwischenkornvolumens werden dann nach Verdünnung auf eine Proteinkonzentration von 50 µg Protein pro ml in glycingepufferter Kochsalzlösung für verdünntes ganzes Serum bei der vorstehend beschriebenen Methode substituiert.

b) Herstellung von Serumpuffer

Man verdünnt 14-molares 2-Mercaptoäthanol (Standardlösung von voller Stärke) mit GBS im Verhältnis von 1 : 40. Man gibt Natriumpolyanetholsulfonat bis zu einer Endkonzentration von 0,05% zu.

c) Bestimmungsmethode

Die Bestimmungsmethode gemäß der Erfindung wird wie folgt durchgeführt:
Je 50 µl positives Kontrollserum, negatives Kontrollserum und jeweils Proben jedes Serums, jeder cerebrospinalen Flüssigkeit und Urinproben, die zu testen sind, gibt man in jedes von zwei Zuführungsgefäßen eines sauberen, trockenen serologischen Objektträgers gemäß dem nachstehenden Schema. Das positive Kontrollserum enthält 2 ng PRP Antigen/ml. Das negative Kontrollserum enthält Antiglobuline, die sowohl Anti-PRP-LP und Kontroll-LP agglutinieren, wenn kein SB zugesetzt wird, so daß eine Überprüfung der Aktivität des Serumpuffers gegeben ist. Urinproben werden mit einem 0,45 µm-Filter vorfiltriert.

Man gibt 10 µl Serumpuffer zu jedem Zuführungsgefäß, das positives Kontrollserum, negatives Kontrollserum oder eine Serumprobe enthält. Die Latexsuspensionen werden ohne Schaumbildung sachte gemischt, und 10 µl Anti-PRP- Latexpartikel werden zu einem Zuführungsgefäß jedes Paares (Reihe A) gegeben, worauf die Reagentien gut gemischt werden.

10 µl Kontroll-Latexpartikel werden zum zweiten Zuführungsgefäß jedes Paares gegeben, worauf die Reagentien gut gemischt werden. Der Objektträger wird auf eine serologische Schüttelvorrichtung gelegt und etwa 45 Minuten gedreht. Die Kammer sollte durch Schwämme, die mit heißem Wasser getränkt sind, so befeuchtet werden, daß Kondensation während des gesamten Versuchs sichtbar ist. Der Objektträger wird aus der Kammer genommen. Kondensat wird abgewischt, und die Agglutination wird ermittelt, während der Objektträger in schräg einfallendem Licht nach hinten und vorn über einem schwarzen Hintergrund gekippt wird. Die folgende Bewertung wird vorgenommen:

4+
große Klumpen - klarer Hintergrund
3+	große Klumpen - milchiger Hintergrund
2+	kleine Klumpen
1+	feinkörnig
0	milchig

Die Reaktionen 3+ und 4+ müssen leicht von den Kontrollen unterscheidbar sein, wenn der Objektträger auf Armlänge betrachtet wird. Reaktionen mit der Bewertung 2+ erfordern genauere Untersuchung und Betrachtung.

Auswertung der Ergebnisse

Positive Agglutination mit der Bewertung 2+ sollte als "schwach positiv" angegeben werden.

Die hier genannten Zeiten und Temperaturen, die während der Wärmebehandlung und Inkubation angewandt werden, sind optimal, wobei zu bemerken ist, daß die gleichen Ergebnisse bei höheren Temperaturen in kürzerer Zeit oder umgekehrt bei niedrigeren Temperaturen in längerer Zeit erhalten werden können.

Claims

1. Direktes Agglutinationsverfahren zum Nachweis von Antigenen in Körperflüssigkeiten bei dem man ein Testserum dieser Körperflüssigkeiten mit einem flüssigen Reagenz kombiniert, welches Trägerteilchen enthält, die mit tierischem Antiserum oder seinem Immunoglobulin-Anteil gegen diese Antigene umhüllt sind und in einem verträglichen physiologischen Puffersystem suspendiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Vermeidung einer positiven, nicht-spezifischen Reaktion zu der Reaktionsmischung ein Serumpuffersystem hinzufügt, das ein Polyanion, das die Wirkung von wärmelabilen Bestandteilen im Testserum vermindert, und ein Reduktionsmittel, das die Wirkung von wärmestabilen Bestandteilen im Testserum vermindert, enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyanion aus der aus Natriumpolyanetholsulfonat, Dextransulfat, Carrageenin und Heparin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reduktionsmittel 2-Mercaptoäthanol, Dithiothreit, Glutathion und/oder Cystein verwendet.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serumpuffersystem zur Reaktionsmischung gibt, die das Testserum und das flüssige Reagenz enthält.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man normales tierisches Serum zu dem flüssigen Reagenz hinzufügt, ehe man das Testserum, das Serumpuffersystem und das flüssige Reagenz kombiniert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis von Polyribophosphat (PRP) in einer Probe einer Körperflüssigkeit dadurch gekennzeichnet, daß man

- ein wäßriges Reagenz, das eine wäßrige Suspension feinverteilter Partikel, an die PRP-spezifische Antikörper adsorbiert sind, wobei diese Antikörper aus Pferde(equinus)-Spezies stammen, die mit PRP immunisiert worden sind, mit einer Probe einer Körperflüssigkeit und einem Serumpuffersystem, welches aus einer Mischung eines Polyanions und eines Reduktionsmittels besteht, mischt,
- die Mischung inkubiert und
- daraufhin das Vorliegen einer Agglutination bestimmt, eine Agglutinationsreaktion, die die Gegenwart von PRP in Körperflüssigkeits-Proben anzeigt.