DE1598898A1 - Reagenz und Verfahren zur Bestimmung des Rheumatoidfaktors - Google Patents

Reagenz und Verfahren zur Bestimmung des Rheumatoidfaktors

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Description

PATENTANWALT DR.HANS-GUNTHER EGGERT, 5 KDLN-LINDENTHAL PETER-KINTGKN-STRASSE 2 ·
Köln,den5.6.1967 Eg/Ax/St
Ortho Pharmaceutloal Corporation^Raritan^NeW Jersey,USA
Reagenz und Verfahren zur Bestimmung des Rheumatoidfaktors
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur serologischen Bestimmung von Agglutinationsfaktoren, gewöhnlich als Rheumatoidfaktoren bezeichnet, die sich im Serum von Patienten finden, die von Arthritis rheumatioa (rheumatoide Arthritis) befallen sind. Die Erfindung ist insbesondere auf ein stabiles Reagenz zur quantitativen Bestimmung der Rheumatoidfaktoren und ein Verfahren zu seiner Herstellung gerichtet.
Das Serum vieler Patienten, die an Arthritis rheumatioa leiden, enthält hoohmolekulare γ-Olobuline, die eine Sedimentationskonstante von 19 S haben. Diese Proteinbestandteil· sind als Rheumatoidfaktoren bezeichnet worden, und der Nachweis von Rheumatoidfaktoren im Serum ist eine einfache Methode zur Frühdiagnose von rheumatoider Arthritis.
Zum Nachweis des Rheumatoldfaktors sind bereits niohtbiologische Teilchen, z.B. Polystyrole-Latex, Acrylharze und Bentonit, die mit menschlichem γ-GHobulin sensibllislert worden sind, verwendet worden» Ein solohes diagnostisches Reagenz ist in der U.S.A.-Patentschrift 3 088 875 beschrieben«
10 98U/036 0
Biese Tests werden zwar weitgehend angewendet, jedoch können sie am besten als allgemeine Auswahltests eingestuft werden, da sie zwar äußerst empfindlich sind, aber gleichzeitig zu einer erheblichen Zahl von falschen positiven Ergebnissen führen, wie von Heiner und Rudd in Arth. & Bheumat., 5, 110, (1962) beschrieben worden ist.
Versuche, den Rheumatoidfaktor im Serum durch Reagenzglasmethoden unter Verwendung dieser sensibilisierten Teilchen quantitativ zu bestimmen, führen häufig zu astronomisch hohen Titern, die weniger Beziehung zum klinischen Zustand des Patienten haben als zum jeweiligen Präparat des für die Sensibilisierung verwendeten menschlichen y-Globulins.
Biologische Teilchen werden auch als Träger für die scheinbaren Antigene des Rheumatoidfaktors verwendet. Wenn menschliche rote Blutkörperchen verwendet werden, wird entweder ausgewähltes menschliches γ-Globulin, das spezifisches nicht agglutinierendes Anti-D (Hh0) enthält, für die Sensibilisierung verwendet, oder die roten Blutkörperchen werden zuerst mit einem Reagenz, wie Gerbsäure behandelt, das die Oberflächeneigenschaften so verändert, daß das Protein leioht, aber nicht spezifisch adsorbiert wird. Keine dieser beiden Methoden erhielt die weit verbreitete Annahme Wie der Differential-Agglutinations-Test, der erstmals von Waaler (Acta Path. Miorobiol. Scand., 17, 172 (194O)) und später von Rose und Mitarbeitern (Proc. Soe. Exper. Biol. &Med., 68, (1948)) beschrieben wurde.
Die Gründe für die Spezifität des Waaler-Rose-Tests sind nicht bekannt, jedoch wurde seine Spezifität in großem Umfange duroh kllnisohe Beobachtung von Patienten bewiesen, deren Seren positive Testreaktionen zeigten. Reagenzglastiter gehen selten über 1)5000 hinaus und stehen im Gegensatz zu den Titern, die entweder mit ge-
10981 A/0360
gerbten und sensibilisierten roten Blutkörperchen oder mit sensibilisiertem latex erhalten werden und über 1s100.000 hinausgehen können.
Trotz der Zuverlässigkeit des Waaler-Rose-Tests wird seine Anwendung durch die Instabilität der als Träger dienenden roten Blutkörperchen erschwert. Die Standardisierung und Sensibilisierung von roten Blutkörperchen sind zeitraubende Maßnahmen, die in häufigen Abständen durchgeführt werden müssen.
Gegenstand der Erfindung ist ein stabiles nicht-biologisches Teilchen, das durch γ-Globulin von Kaninchen sensibilisiert ist und ein empfindliches, spezifisches Reagenz für den Hheumatoidfaktor ergibt. Die Erfindung betrifft ferner ein Bestätigungsreagenz für einen Reagenzglastest, das überall dort angewendet wird, wo positive Reaktionen bei einem Schnellauswähltest erhalten werden· Dieses Testreagenz ergibt die gleichen Titer, die beim Differential-Agglutinations-Test erhalten werden.
Beim erfindungsgemäßen Test bestehen die Reagentien aus Latex, der mit γ-Globulin von Kaninchen sensibilisiert ist, und einem Puffersystem. Der Test wird wie folgt durchgeführtϊ Zunächst werden jeweils doppelte Verdünnungen des Blutserums in einer Reihe von Reagenzgläsern hergestellt, wobei der Puffer als Verdünnungsmittel verwendet und ein gleiches Volumen dee Latexreagenz zugesetzt wird. Die Reagenzgläser, die das Serum-Latex-Gemisoh enthalten, werden dann 2 Stunden bei 560O und über Nacht bei +40C gehalten. Wenn Rheumatoidfaktoren im Testserum vorhanden sind, wird «ine direkte Reaktion durch Agglutination der Teilchen des Latexreagens erkennbar. Wenn kein Rheumatoidfaktor vorhanden ist, bleibt das Latexreagenz im gesamten flüssigen Medium glatt suspendiert. Die Reaktionen können nach dem Grad der vorliegenden Agglutination eingestuft werden·
Zur Herstellung des Latexsystene werden Polyetyrolteilohen 109814/0360
verwendet, die einen mittleren Durchmesser von 0,15 bis 14/U, vorzugsweise von 0,81 yu haben. Acrylharzteilchen können ebenfalls verwendet werden.
Der Test ist mit gewöhnlichem γ-Globulin von Kaninchen nicht ordnungsgemäß durchführbar. Wesentlich für den Test ist eine Behandlung des Kaninchen-γ -Globulins zur Änderung seiner antigenen Eigenschaften. Die Änderung, die sich als am wirksamsten erweist, wird durch eine Enzymbehandlung des Kaninchen-y-Globulins vor der Sensibilisieruiig der Latexteilchen erreicht. Das Latexreagenz wird dann einer Wärmebehandlung unterworfen, um die Veränderung des Kaninchen-γ-Globulins zu vollenden. Eine Wärmebehandlung bei 500C für eine Dauer von 7 bis 10 Tagen erwies sich als am wirksamsten. Höhere Temperaturen bei kürzerer Behandlungsdauer sind ebenfalls wirksam. Durch Erhitzen des Latexreagenz ohne vorherige Enzymbehandlung wird jeloch kein geeignetes Reagenz erhalten.
Verschiedene Enzyme wurden geprüft und erweisen sich als geeignet für die Veränderung des Kaninchen-γ-Globulins, nämlich rohes und kristallines Trypsin, Chymotrypsin und Papain. Fungale Proteasen und Pepsin erwiesen sich als nur teilweise wirksam· Die Natur der Veränderung des Kanlnchen-γ-Globulins ist zwar noch nicht vollständig geklärt, jedoch hängt vermutlich die Reaktionsfähigkeit des Rheumatoidfaktore mit Kaninchenglobulin von den Stellen ab, die nach der Adsorption des Kaninchenglobuline am Latex nicht verfügbar sind. Ein Abbau der Globulinmoleküle durch verschiedene proteorytisohe Enzyme ist eine Maßnahme, durch <H* jsmmimmaeas^ Teile der Struktur Verfügbar werden. Es ist zu erwarten, daß durch Erhitzen des fragmentierten Materials ein weiterer Zerfall der nativen Struktur stattfindet, der die gewünschten reaktionsfähigen Stellen freilegt.
Im Gegensatz hierzu wird menschliches γ-Globulin, da* auf die vorstehend beschriebene Weise behandelt worden
1098U/0360 BADOWÖiNÄ-
ist, stark unspezifiaoh und ungeeignet für Reagenzzwecke· Eine Vorbehandlung von menschlichem γ-Globulin vor der Seneibilisierung des Latex ergibt keine Steigerung der Reaktionsfähigkeit bei Aufrechterhaltung der Spezifität der Reaktion»
Ein weiterer Unterschied zwischen den Reagentien, die aus γ-Globulin von Menschen und Kaninchen bestehen, kann in den erforderlichen Puffersystemen gesehen werden. Während Natriumchlorid in einem Boratpuffersystem die Reaktionsgeschwindigkeit von mit menschlichem Globulin seneibilisiertem Latex steigert, hebt eine Konzentration von mehr ale 0,1 Hol Natriumchlorid im Boratpuffer die Reaktion des γ-Globuline von Kaninchen auf. Eine Salzkonzentration von 0,025 aolar im Boratpuffer ergibt optimale Reaktionen.
Sie folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung des Reagenz.
Beispiel 1
100 mg γ-Globulin von Kaninchen werden in 5 ml eines 0,1-molaren Boratpuffers von p„ 8,6 gelöst. Rohes Trypsin in einer Menge von 1/10 des Gewiohts des Kaninchen- γ-Globulin· wird der Globulin-Pufftr-Löeung zugesetzt,*»* die auf eine Temperatur von 570O gebracht und 1 Stund· bei
wird
dieser Temperatur gehalten^ I5a« duroh das Enzym resorbiert« γ-Gllbulin wird dann mit einem 0,1-molaren Boratpuffer von P^ 8,6 auf 50 ml verdünnt und dann langsam unter ständigem Rühren zu 50 ml einer 2 Gew.-^ PoIy-•tyrolteilohen enthaltenden Suspension gegeben, in der die Teilchen einen mittleren Durchmesser von 0,81 ai haben« Thimerosal wird in einer Endkonzentration von 1tSOOO zugesetzt. Da· erhaltene Material wird langsam auf «in· Temperatur von 500O gebracht und 10 Tage bei dieser Temperstur gehalten· Salefreite Rinderserum-Albumin wird bis su einer Sndkonsentration von 0,1 Ji für Stabilistorung·- iweoke zugesetzt. Da· so hergestellte Material wird bei +40O aufbewahrt.
1 0 9 8 U / 0 36 0 BAD ORIGINAL
Beispiel 2
100 mg y-Globulin von Kaninchen werden in 5 ml eines 0,1 -molaren Boratpuffers von ΡΗ8,6 gelöst· Hohes Trypsin in einer Menge von 1/10 des Gfewichts des Kaninchen-γ-Globulins wird zur Globulin-Puffer-Iösung gegeben, die auf eine Temperatur von 370C gebracht und 1 Stunde bei dieser Temperatur gehalten wird. Das durch das Enzym abgebaute y-Globulin wird dann mit 0,1-molarem Boratpuffer von pjj 8,6 auf 50 ml verdünnt und dann langsam unter ständigem Rühren zu 50 ml einer 2 (Jew·-# Polystyrolteilchen enthaltenden Suspension gegeben, in der die Teilchen einen mittleren Durchmesser von 0,81 yu enthalten. Thimerosal wird in einer Endkonzentration von 1:5000 zugesetzt. Bas erhaltene Material wird auf eine Temperatur von 930C gebracht und 10 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Das so hergestellte Material wird bei +40C aufbewahrt.
Beispiel 3
100 mg KaninoKenglobulin werden in 5 ml 0,05-molarem Phosphatpuffer von pH 7,1 gelöst· Papain in einer Menge von 1/5 des Gewichts des Kaninchen-γ-Globuline wird der Globulin-Puffer-lösung zugesetzt, die auf eine Temperatur von 370C gebracht und 1 Stunde bei dieser Temperatur gehalten wird. Das Präparat wird dann gegen einen Boratpuffer von P1J 8,6 dialysiert, mit dem gleichen Puffer auf 50 ml verdünnt und langsam unter ständigem Rühren zu 50 ml einer 2 Gew.-f> Polyatyrolteilohen enthaltenden Suspension gegeben, in der die Teilchen einen mittleren Durchmesser von 0,81 /u haben· Thimerosal wird in einer Endkonzentration von 1t5000 zugesetzt· Das erhaltene Material wird langsam auf eine Temperatur von 500G gebracht und 10 Tage bei dieser Temperatur gehalten· Das so hergestellte Material wird bti +40Q aufbewahrt.
Der optimale pH-Wert der mit Kaninchen-γ-Globulin umhüllten Latexteilohen beträgt 8,6, jedoch ist ein pH-Wert im Bereich von 8 bis S geeignet.
1 Q 9 8 1 h / 0 3 G 0 - BAb
Bei der Durchführung des Bestätigungstestes auf den Rheumatoidfaktor unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenz wird das Serum des Patienten, der beim Auswahltest zur Ermittlung des Hheumatoidfaktors positiv reagiert hat, verwendet· Das gemäß einem der Beispiele 1 bis 3 hergestellte Reagenz wird mit 0,025-molarem Boratpuffer 20-fach verdünnt. Zehn Reagenzgläser von 12x75 mm werden in ein Gestell gegeben. Jeweils doppelte Verdünnungen des Serums werden wie folgt hergestellt«
0,1 mm des Serums werden in das Glas Nr. 1 pipettiert. 1,9 ml des 0,025-molaren Boratpuffers werden in das Glas Nr. 1 gegeben, und je 1,0 ml Puffer wird in die übrigen neun Gläser gegeben. Der Inhalt des Reagenzglases Nr. 1 wird gemischt, und 1,0 ml des Inhalts des Glases Nr. 1 wird in das Reagenzglas Nr. 2 überführt. Der Inhalt des Reagenzglases Nr. 2 wird gemischt, und 1,0 ml des Inhalts wird in das Reagenzglas Nr. 3 gegeben. Die Überführung von einem Reagenzglas in das nächste wird weiter bis zum Reagenzglas Nr. 9 fortgesetzt, und 1,0 ml des endgültigen Inhalts des Reagenzglases Nr. 9 wird verworfen. Das Reagenzglas Nr. 10 enthält die Kontrollprobe.
Je 1,0 ml des verdünnten Reagenz wird dann in die zehn Reagenzgläser gegeben. Der Inhalt der Gläser wird gut gemischt und 2 Stunden bei 560C gehalten. Die Reagenzgläser werden dann über Nacht bei 40C gehalten. Die Reaktionen werden■/Agglutination von Teilchen und Klarheit der obenstehenden Flüssigkeit festgestellt. Die Ergebnisse werden als negativ (gleichmäßige Suspension, die mit der Kontrollprobe vergleichbar ist), ;+, 1+, 2+, 3+ oder 4+ notiert.
Die folgenden Tabellen zeigen die Ergebnisse von Bestätigungstests, bei denen eine positive Reaktion bei einem Latex-Objektträger-Auswahltest erhalten worden war· Die Verdünnung, bei der die Agglutination mit dem erfindungsgemäßen Reagenz stattfand, wird mit der entsprechenden Verdünnung beim Waaler-Rose-Test verglichen.
BAD ORiGiNAL 1098 U/0360
159889g
Tabelle 1
Patienten unter klinischer Beobachtung mit feststehender Diagnose auf Arthritis rheumatica.
Serum Nr. Waaler-Rose-Test Latex, Objektträger-Test
Latex, Reagenzglastest
101 2560
102 nd
103 1280
104 640
105 1280
106 2560
107 nd
108 5120
109 5120
110 320
111 40
112 320
113 5120
114 5120
115 1280
116 nd
11? 32o
118 40
119 320
12o 1280
121 160
122 nd
123 640
640 nd 320 320 640 2560 nd 1280 2560 160 <20 1280 2560 5120 640 nd 160 160 160 320 160 nd 160
nd bedeutet "nicht durchgeführt". Bin Bestätigungstest wird nicht durchgeführt» w®na der Objektträgertest negativ ist.
BAD
1098U/03S0
_ 9 -Tabelle 2
Patienten, deren Seren zur Untersuchung auf Arthritis rheumatica eingeschickt wurden· Klinische Daten unsicher«
Serum Nr. Waaler-Rose-Test Latex, Objekt- latex, Rea-
trägertest genzglastest
124 160 +++ 320
125 320 +++ 80
126 160 +++ 320
127 1280 +++ 320
128 320 ++++ 160
129 2560 +++ 160
130 1280 +++ 320
131 320 ++ 160
132 1280 ++++ 2560
133 1280 +++ 2560
134 320 +++ 160
135 160 +++ 20
136 20 + 80
137 >5120 +++ 160
138 320 +++ 320
139 320 +++ 160
140 6|0 ++ 80
141 UO * 80
142 5120 +■♦■++ 160
143 80 ■»- 160
109814/0360
Tabelle 3
Patienten, deren Seren zur untersuchung auf Syphilis eingeschickt wurden. Klinische Daten unbekannt.
Serum Nr. Waaler-Rose-Test Latex, Objekt- latex, Rea-
trägertest genzglastest
nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 320 nd nd nd nd
■ nd
nd nd ad nd nd nd nd
nd
153 nd
154 nd
155 nd
156 nd
157 nd
158 nd
159 nd
160 nd
161 nd
162 nd
163 md
164 320
165 nd
166 nd
167 nd
168 nd
169 nd
170 nd
171 nd
172 nd
173 nd
174 nd
Ϊ75 nd
t76 nd
177 nd
178 ttd
m nd
160 40
IfI ad
182 nd
1090U/0360

Claims (7)

Patentansprüche
1. Reagenz zur Bestimmung des Rheumatoidfaktors, bestehend aus einer Suspension fester, nicht biologischer Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,15 /U bis etwa 14 ,Xi3 an die Kaninehen-γ-Globulin adsorbiert ist, in einem flüssigen, polaren Medium.
2. Reagenz nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, dass die festen Teilchen aus Polystyrol bestehen und einen mittleren Durchmesser von etwa 0,8l* ,u besitzen.
3. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige, polare Medium ein Puffersystem enthält,
4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis J, dadurch gekennzeichnet, dass das Kaninchen-y-Globulin durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym und Hitzebehandlung teilweise abgebaut ist.
5. Verfahren zur Herstellung eines"Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Kaninchen-γ-Globulin mit einem proteolytischen Enzym behandelt, dann mit festen, nicht biologischeil Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,15 /u bis etwa
/U zusammenbringt und das erhaltene Reagenz einer Hitzebehandlung unterwirft.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass
. man die Hitzebehandlung etwa 7 bis 10 Tage lang bei einer Temperatur von etwa 500C durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass als proteolytisches Enzym Trypsin, Chymotrypsin oder Papain verwendet wird.
109814/0360 °R'GINAL
8, Verfahren zur Bestimmung des Rheum^tsidfaktoiF in einer. Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet* dass man. in einer Reihe von Testgefässen eine Lösunggreihe des Blutserums herstellt, in der die Konzentration xm den Faktor 1/2 abnimmt, den Lösungen eine Suspension feinverteilter, fester, nicht biologischer Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von etwa CU15 bis etwa IK /U zusetzt, an die Kanlnehen-y^iJlobulin adsorbiert ist, die so erhaltenen Gemische bei etwa ζ>6Ω0 inkubiert, dann die Temperatur auf 4°C einstellt und die Agglutination beobachtet,
9, Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dasxs die Lösungsreihe durch Verdünnung mit einer Lösung von Natriumchlorid in einem Boratpuffer hergestellt wird.
109814/0360-
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